特許 6339737 神経幹細胞とＩＬ１２ｐ４０を使用して神経再生を促進するための組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6339737

(24)【登録日】2018年5月18日

(45)【発行日】2018年6月6日

(54)【発明の名称】神経幹細胞とＩＬ１２ｐ４０を使用して神経再生を促進するための組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/20 20060101AFI20180528BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20180528BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180528BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20180528BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20180528BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20180528BHJP

   A61K 35/35 20150101ALI20180528BHJP

   A61K 35/50 20150101ALI20180528BHJP

   C12N 5/0797 20100101ALN20180528BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20180528BHJP

   C12N 5/077 20100101ALN20180528BHJP

   C12N 5/074 20100101ALN20180528BHJP

   C07K 14/54 20060101ALN20180528BHJP

   C07K 14/475 20060101ALN20180528BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/20

   A61K35/30

   A61P25/00

   A61P43/00 121

   A61K35/28

   A61K35/545

   A61K38/18

   A61K35/35

   A61K35/50

   !C12N5/0797

   !C12N5/071

   !C12N5/077

   !C12N5/074

   !C07K14/54

   !C07K14/475

【請求項の数】10

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2017-508088(P2017-508088)

(86)(22)【出願日】2015年8月14日

(65)【公表番号】特表2017-529329(P2017-529329A)

(43)【公表日】2017年10月5日

(86)【国際出願番号】CA2015050775

(87)【国際公開番号】WO2016023130

(87)【国際公開日】20160218

【審査請求日】2017年2月24日

(31)【優先権主張番号】62/037,612

(32)【優先日】2014年8月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512261517

【氏名又は名称】ナショナル ヘルス リサーチ インスティテュートス

(74)【代理人】

【識別番号】100082418

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 朔生

(72)【発明者】

【氏名】チウ、イン−ミン

(72)【発明者】

【氏名】チ、ヤー−フイ

(72)【発明者】

【氏名】リー、ドン−チン

【審査官】 山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−０７８７９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第０２／０７２１４４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 JOUNRNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，２０１０年，Vol.285,No.10，p.6960-6969

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／２０

Ａ６１Ｋ ３５／２８

Ａ６１Ｋ ３５／３０

Ａ６１Ｋ ３５／３５

Ａ６１Ｋ ３５／５０

Ａ６１Ｋ ３５／５４５

Ａ６１Ｋ ３８／１８

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｃ０７Ｋ １４／４７５

Ｃ０７Ｋ １４／５４

Ｃ１２Ｎ ５／０７１

Ｃ１２Ｎ ５／０７４

Ｃ１２Ｎ ５／０７７

Ｃ１２Ｎ ５／０７９７

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

神経幹細胞と、
少なくとも１つのサブユニットとしてのＩＬ１２ｐ４０により構築される神経栄養因子を含み、
前記神経栄養因子はＩＬ１２ｐ４０の単量体またはＩＬ１２ｐ８０であることを特徴とする、
神経再生のための組成物。

【請求項2】

ＩＬ１２ｐ４０はＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿００８３５２（マウス）または１Ｆ４２＿Ａ（ヒト）として示されるタンパク質配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記神経幹細胞はＣＤ１３３およびＧＦＡＰ陽性の脳細胞として特徴付けられることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記神経幹細胞はＦ１ＢＧＦＰ^＋細胞として特徴付けられることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

神経再生促進要素をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記神経再生促進要素は細胞、増殖因子、およびそれらの組合せを含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記神経再生促進要素はシュワン細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、羊水幹細胞（ＡＦＳＣ）、誘導ニューロン（ｉＮ）、誘導神経幹細胞（ｉＮＳＣ）、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する細胞を含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。

【請求項8】

前記神経再生促進要素は線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、およびそれらの任意の組合せを含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。

【請求項9】

神経幹細胞と神経栄養因子のうち少なくとも１つを担持するための神経コンジットをさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

経幹細胞、神経栄養因子、および神経再生促進要素のうち少なくとも１つを担持するための神経コンジットをさらに含む、請求項５に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０３７，６１２号の優先権を主張するものであり、その開示は参照によりその全内容が本明細書に援用される。

【0002】

発明の背景
１．発明の分野
本出願は、神経幹細胞およびＩＬ１２ｐ４０を用いて神経再生を促進するための組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0003】

２．関連技術の説明
重篤な末梢神経損傷は、運動および感覚ニューロンの活動の低下、ならびに神経線維および周囲組織の変性を引き起こす。損傷を受けた末梢神経の再生は複合的なプロセスであり、ワーラー変性（Ｗａｌｌｅｒｉａｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＷＤ）が最も基本的な反応であり、シュワン細胞が重要な役割を果たす（Ｒｅｎ Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２，２３：１３５−１４３）。
ＷＤは、生き残っているニューロンの再生のための微小環境を作り出し、機能回復に利益をもたらす（Ｎａｖａｒｒｏ Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００７，８２：１６３−２０１）。ＷＤの制御には、シュワン細胞の存在、神経栄養因子の分泌、および神経細胞の足場として働く特殊な細胞外マトリックスが関わる（Ｇａｕｄｅｔ Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ２０１１，８：１１０；Ｋｅｈｏｅ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｊｕｒｙ ２０１２，４３：５５３−５７２）。

【0004】

神経コンジット（ｎｅｒｖｅ ｃｏｎｄｕｉｔ）は、損傷を受けた神経断端間に機械的支持を与え、軸策発芽を指示する。コンジットは、傷害細胞から分泌される、または傷害細胞により動員される神経栄養因子を保持し（Ｋｅｈｏｅ Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎｊｕｒｙ ２０１２，４３：５５３−５７２）、損傷部位において線維組織の内部への伸長を防ぐことが示されている。最近の研究によれば、コンジット内に神経幹細胞（ＮＳＣ）を移植すると損傷を受けた末梢神経の再生が促進されることが明らかである（Ｚｈａｎｇ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００８，６：６７；Ｓｈｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｏｔｏ−Ｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｉｃａ ２００９，１２９：９０６−９１４）。

【0005】

神経再生の促進は、移植されたＮＳＣの、シュワン細胞に分化し、それ自体が神経栄養因子を分泌するか、または環境から神経栄養因子を濃縮するための微小環境を作り出し、有髄化を補助する能力に依存するものであり得る（Ｒｅｎ Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２，２３：１３５−１４３）。しかしながら、この過程に関与するサイトカインまたは増殖因子の性質は明らかでない。移植されたＮＳＣの、新たに再生された軸策へのシュワン細胞分化の分子機構もまた十分に確立されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本研究では、ＮＳＣを介した神経再生および機能回復に関与する因子を同定することを目的とする。本発明者らは、タンパク質抗体アレイを用い、ＮＳＣを含むまたは含まないコンジットを使用するマウス坐骨神経損傷モデルにおいてタンパク質レベルでの違いを調べた。これらのコンジット内のＩＬ１２ｐ８０（ＩＬ１２ｐ４０の生理活性ホモ二量体型）（Ｈｅｉｎｚｅｌ Ｆ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９７，１５８：４３８１−４３８８）のレベルは、ＮＳＣを含まないコンジット内のレベルのほぼ２倍であった。ＮＳＣを神経コンジットおよびＩＬ１２ｐ８０とともに移植すると、坐骨神経損傷マウスモデルにおいて運動機能が改善した。

【0007】

ＩＬ１２ｐ８０の投与は、再生した神経の直径の増大により示されるように、再生した神経の中央部でコンジット単独群の最大４．５倍まで神経再生をさらに促進し、神経伝導を改善した。このことは、ＩＬ１２ｐ８０がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてシグナル伝達兼転写活性化因子３（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３）（Ｓｔａｔ３）のリン酸化を介してマウスＮＳＣのグリア細胞分化を誘導したことを示す。Ｋｅｔｔｅｎｍａｎｎ ａｎｄ Ｖｅｒｋｈｒａｔｓｋｙ （Ｋｅｔｔｅｎｍａｎｎ Ｈ，Ｖｅｒｋｈｒａｔｓｋｙ Ａ，Ｆｏｒｔｓｃｈｒｉｔｔｅ ｄｅｒ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｅ−Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｅ ２０１１，７９：５８８−５９７）により報告されているように、グリア細胞は、星状グリア細胞、乏突起グリア細胞、およびシュワン細胞を含む。

【課題を解決するための手段】

【0008】

概要
本出願は、神経幹細胞と、少なくとも１つのサブユニットとしてのＩＬ１２ｐ４０により構築される神経栄養因子とを含む、神経再生のための組成物を提供する。

【0009】

本出願は、神経幹細胞と、少なくとも１つのサブユニットとしてのＩＬ１２ｐ４０により構築される神経栄養因子と、神経再生促進要素とを含む、神経再生のための組成物を提供する。

【0010】

本出願はさらに、神経幹細胞と、少なくとも１つのサブユニットとしてのＩＬ１２ｐ４０により構築される神経栄養因子と、前記神経幹細胞および前記神経栄養因子のうち少なくとも１つを担持するための神経コンジットとを含む、神経再生のための組成物を提供する。

【0011】

本出願は、少なくとも１つのサブユニットとしてのＩＬ１２ｐ４０を含有する神経栄養因子を含む神経生成組成物を対象に提供することを含む、神経再生のための方法を提供する。

【0012】

本出願はさらに、神経幹細胞と、少なくとも１つのサブユニットとしてのＩＬ１２ｐ４０を含有する神経栄養因子とを含む神経再生組成物を対象に提供することを含む、神経再生のための方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ＮＳＣと神経コンジットの移植が、コンジット単独よりもマウスにおける坐骨神経損傷の機能回復を改善したことを示す概略図である。（Ａ）ＳＦＩを用いて第１週から第８週まで毎週機能回復を評価した。統計分析は、コンジット＋ＮＳＣ群がコンジット単独群よりも有意により良好な回復を有したことを示した。（Ｂ）術後第４週と第８週にロータロッドテストを行った。コンジット単独群は、ロータロッド上で対照群およびコンジット＋ＮＳＣ群よりも有意に不良なバランスおよび歩行を示した。コンジット＋ＮＳＣ群はより良好な運動回復を示し、対照群と異ならなかった。データは全て平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す（偽手術対照群はｎ＝３、コンジット単独群はｎ＝８、コンジット＋ＮＳＣ群はｎ＝８、および対照群の第４週はｎ＝８、および第８週はｎ＝８）。統計的差異は^＊ｐ＜０．０５および^＊＊ｐ＜０．０１により示す。

【図2】ＮＳＣとともにまたは伴わずに移植されたコンジットからの細胞抽出液の抗体アレイを示す表および写真である。コンジット＋ＮＳＣ群から採取された細胞抽出液に存在したＩＬ１２ｐ４０のシグナル（赤い点の四角で示す）は、コンジット単独群の１．８９倍であった（コンジット単独群とコンジット＋ＮＳＣ群の両方でｎ＝４）。これらの試験は３回繰り返し、コンジット＋ＮＳＣ群のＩＬ１２ｐ４０レベルはコンジット単独群よりも大幅に発現が高かった。

【図3】ＩＬ１２ｐ８０を伴う場合または伴わない場合のＮＳＣ移植物における、ＳＦＩおよびロータロッドテストを用いた機能評価の比較分析を示す概略図である。術後第８週に、コンジット＋ＮＳＣ群およびコンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群のマウスは、コンジット単独群よりも有意に高いＳＦＩスコアを示した（Ａ）。ロータロッドテストにおいて、コンジット＋ＮＳＣ群およびコンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群のマウスは、コンジット単独群よりも高い歩行およびバランス能を示した（Ｂ）。これらのデータは、コンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群はＳＦＩおよびロータロッドの両分析の機能評価においてＩＬ−１２ｐ８０を用いない群（^＊ｐ＜０．０５）よりも統計的により有意な結果（^＊＊ｐ＜０．０１）を示した。データは平均±ＳＥＭとして表す（ＳＦＩでは、コンジット単独群はｎ＝３、コンジット＋ＮＳＣ群はｎ＝３、コンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群はｎ＝４。ロータロッドテストでは、コンジット単独群はｎ＝７、コンジット＋ＮＳＣ群はｎ＝５、コンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群はｎ＝８）。

【図4】再生した坐骨神経切片のＨ＆Ｅ染色および免疫組織化学を示す。（Ａ〜Ｃ）新たに再生した軸策の切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色し、「Ｐ」および「Ｄ」は残存神経の断端を示す（「Ｐ」はコンジットの近位端から１．０ｍｍであり、「Ｄ」は「Ｐ」から３．０ｍｍ遠位である）。コンジット単独群（Ａ）は、再生した軸策の完成度がコンジット＋ＮＳＣ群（Ｂ）およびコンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群（Ｃ）よりも低いことを示した。さらに、本発明者らは、抗神経フィラメント２００抗体（神経線維のマーカーであるＮＦ２００）および抗タンパク質ゼロ抗体（有髄シュワン細胞のマーカーであるＰＺＯ）による免疫組織化学染色を用いて、再生中の神経の特徴を確認した。これらの染色結果は、コンジット単独群（Ｄ）における軸策再生の失敗を示した。本発明者らは、有髄シュワン細胞（ＰＺＯ陽性細胞）連関神経線維（ＮＦ２００陽性細胞）がコンジット＋ＮＳＣ群（Ｅ）でコンジットの中央領域に存在し、コンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群ではそれがより顕著であった（Ｆ）ことを観察することができた。Ｄ、Ｅ、およびＦの関連場所は、それぞれＡ、Ｂ、およびＣで点線の四角で示される。種々の部位における再生神経の直径の定量結果を（Ｇ）に示し、示されている近位部位はコンジットの近位端から１．０ｍｍであり、示されている遠位部位はその近位部位から３．０ｍｍであり、示されている中央部位は近位部位と遠位部位の間の中央である（コンジット単独群はｎ＝３、コンジット＋ＮＳＣ群はｎ＝４、コンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群はｎ＝３）。種々の処理群の再生の概略図を（Ｈ）に示す。スケールバーは、（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）では１ｍｍであり、（Ｄ）、（Ｅ）、および（Ｆ）では１００μｍである。統計的差異は^＊ｐ＜０．０５および^＊＊ｐ＜０．０１として示す。

【図5】複合筋活動電位において測定された回復坐骨神経損傷を示す概略図である。損傷肢および反対側の正常肢のＣＭＡＰを測定した。ＣＭＡＰの回復は、損傷肢を正常肢で割った商として計算した。種々の群のＣＭＡＰの回復を示した（コンジット単独群はｎ＝４、コンジット＋ＮＳＣ群はｎ＝４、コンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群はｎ＝６、偽手術対照はｎ＝３）。

【図6】ＩＬ１２ｐ８０はマウスＮＳＣの乏突起グリア細胞分化を誘導するためにＣＮＴＦ＋Ｔ３に取って代わり得ることを示す免疫細胞化学結果を示す。（Ａ）マウスＮＳＣは、ＣＮＴＦ＋Ｔ３またはＩＬ１２ｐ８０（Ｙ軸に列挙）を用いて乏突起グリア細胞へと分化誘導された。分化細胞は乏突起グリア細胞マーカー：抗Ｇａｌｃ抗体および抗ＯＳＰ抗体、または有髄シュワン細胞マーカー：抗ＰＺＯ抗体（Ｘ軸に列挙）で染色された。マーカー陽性細胞の倍率を定量化し、（Ｂ）にまとめた。各グラフのスケールバーは１００μｍである。統計的差異は^＊ｐ＜０．０５および^＊＊ｐ＜０．０１として示す。

【図7】ＩＬ１２ｐ８０がマウスＮＳＣを乏突起グリア細胞およびシュワン細胞に分化させることができたことを示すウエスタンブロット結果を示す。マウスＮＳＣは、ＣＮＴＦ＋Ｔ３またはＩＬ１２ｐ８０を用いて乏突起グリア細胞へと分化誘導された。分化群は種々のサイトカイン処理条件によって呼称した。細胞分化は、星状グリア細胞マーカーＧＦＡＰ、乏突起グリア細胞マーカーＯＳＰ、および有髄シュワン細胞マーカーＰＺＯに対する系譜特異的抗体によるウエスタンブロット法を用いて同定した（Ａ）。定量結果を（Ｂ）に示す。統計的差異は^＊ｐ＜０．０５および^＊＊ｐ＜０．０１として示す。

【図8】ＩＬ１２ｐ８０がＮＳＣにおいてＳｔａｔ３のリン酸化を誘導することを示す。種々の時点（スフェア、０分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、および８時間）における対照培地（対照）またはヒトＩＬ１２ｐ８０（ｈＩＬ１２）またはマウスＩＬ１２ｐ７０（ｍＩＬ１２）を含有する分化培地での、Ｙ７０５およびＳ７２７部位におけるＳｔａｔ３のリン酸化（ｐＳｔａｔ３）のレベルをウエスタンブロット分析により決定した。結果は、ｐＳｔａｔ３のレベルは、ＩＬ１２ｐ８０を用いて培養した場合に１５分でピークに達したことを示す。全Ｓｔａｔ３およびα−チューブリンを対照として用いた。

【発明を実施するための形態】

【0014】

実施形態の詳細な説明
本出願では、神経再生のための組成物は、ＮＳＣと、少なくとも１つのサブユニットとしてのＩＬ１２ｐ４０により構築される神経栄養因子とを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２ｐ４０は、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿００８３５２（マウス）または１Ｆ４２＿Ａ（ヒト）として示されるタンパク質配列を有する。

【0015】

神経栄養因子は、ＩＬ１２ｐ４０の単量体、またはホモ二量体もしくはヘテロ二量体であり得、ここで、少なくとも１つのサブユニットがＩＬ１２ｐ４０である。実施形態では、神経栄養因子は、ＩＬ１２ｐ４０のヘテロ二量体、ＩＬ１２ｐ４０のホモ二量体、ＩＬ１２ｐ４０の三量体、ＩＬ１２ｐ４０の四量体またはそれらの任意の組合せであり得る。一実施形態では、ホモ二量体はＩＬ１２ｐ８０であり得る。実施形態では、ヘテロ二量体はＩＬ１２ｐ７０であり得る。

【0016】

本出願では、神経再生のための組成物のＮＳＣは、ＣＤ１３３およびＧＦＡＰ陽性の脳細胞として特徴付けることができ、またはＦ１Ｂ−ＧＦＰ^＋細胞として特徴付けることができる。

【0017】

本出願は、神経再生促進要素をさらに含む組成物を提供する。神経再生促進要素は、細胞、増殖因子、およびそれらの任意の組合せを含む。実施形態では、神経再生促進要素は、シュワン細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、羊水幹細胞（ＡＦＳＣ）、誘導ニューロン（ｉＮ）、誘導神経幹細胞（ｉＮＳＣ）、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の細胞であり得る。

【0018】

いくつかの実施形態では、神経再生促進要素は、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、およびそれらの任意の組合せであり得る。

【0019】

一実施形態では、組成物は、ＮＳＣおよび神経栄養因子のうち少なくとも１つを担持するための神経コンジットをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、神経コンジットは、神経再生促進要素をさらに担持する。

【0020】

本出願はまた、神経幹細胞と、少なくとも１つのサブユニットとしてのＩＬ１２ｐ４０を含有する神経栄養因子とを含む神経生成組成物を対象に提供することを含む、神経再生のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、神経再生組成物はＮＳＣをさらに含み得る。実施形態では、神経再生組成物は神経コンジット内に含まれ得る。実施形態では、神経コンジットは標的神経または標的神経周囲の組織に移植される。

【0021】

神経栄養因子は、ＩＬ１２ｐ４０の単量体、ＩＬ１２ｐ４０のヘテロ二量体、ＩＬ１２ｐ４０のホモ二量体、ＩＬ１２ｐ４０の三量体、ＩＬ１２ｐ４０の四量体、またはそれらの任意の組合せであり得る。いくつかの実施形態では、神経栄養因子はＩＬ１２ｐ８０である。

【0022】

対象は哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物はマウスまたはヒトであり得る。本出願では、組成物は、注射、移植、経皮経路、および／または経口投与により提供され得る。

【実施例】

【0023】

材料および方法
ＩＬ１２ｐ４０の配列
ＩＬ１２ｐ４０のタンパク質配列はＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿００８３５２（マウス）または１Ｆ４２＿Ａ（ヒト）として示され、これらは米国国立生物工学情報センターのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手可能である。

【0024】

細胞培養およびＮＳＣ単離
マウスＮＳＣの単離および細胞培養は２つの従前の刊行物（Ｈｓｕ Ｙ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２００９，２３８：３０２−３１４；Ｌｅｅ Ｄ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９，４１：３４８−３６３；これら２つの刊行物は参照によりその全内容が本明細書に援用される）に記載されている通りに行った。

【0025】

ＫＴ９８／Ｆ１Ｂ−ＧＦＰ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）を含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（１：１）中で培養した。ＮＳＣ単離については、ＧＦＰ陽性ＫＴ９８／Ｆ１Ｂ−ＧＦＰ（ＫＴ９８／Ｆ１Ｂ−ＧＦＰ＋）細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて選別し、ニューロスフェア形成培地（１×Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｉｎｃ．）、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｉｎｃ．）、２μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、および５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２）で７日間培養し、これによりＫＴ９８／Ｆ１Ｂ−ＧＦＰ＋ニューロスフェア形成が誘導された。次に、ＫＴ９８／Ｆ１Ｂ−ＧＦＰ＋ニューロスフェア由来単細胞を続いての動物試験および細胞分化アッセイに使用した。細胞は全て、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。

【0026】

動物手術：坐骨神経損傷およびコンジット移植
本出願では、全ての動物試験手順は倫理指針に従い、所内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって承認された（プロトコールＮｏ．ＮＨＲＩ−ＩＡＣＵＣ−１０１０６７Ａ）。ＦＶＢマウス（８〜１０週齢）を動物試験に使用し、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ）（ＮＨＲＩ）動物センターで維持した。
術前に、マウスを５％イソフルラン（ハロ炭素）空気吸入により麻酔し、手術中、２％イソフルラン空気吸入により麻酔を維持した。坐骨神経損傷術では、３ｍｍのマウス坐骨神経セグメントをマイクロシザーズで切り出した。神経コンジットの外科的移植では、従前に記載されているように（Ｈｓｕ Ｓ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｉｆ Ｏｒｇａｎｓ ２００９， ３３：２６−３５；参照によりその全内容が本明細書に援用される）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＡ）コンジットを使用した。

【0027】

ＮＳＣおよび／またはマウスＩＬ１２ｐ８０を含むまたは含まない５ｍｍコンジットを坐骨神経損傷部位に移植した。坐骨神経損傷部位の近位端および遠位端の神経を、６−０ナイロン微小縫合糸を用い、残存神経１ｍｍを用いてコンジットに係留した。坐骨神経損傷を受けなかったマウスを偽手術対照群（ｎ＝３）として定義した。

【0028】

外科的移植群は、コンジット単独群（ｎ＝８）、コンジット＋ＮＳＣ群（ｎ＝８）、およびコンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群（ｎ＝８）を含んだ。コンジット単独群では、コンジットに５μｌマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）混合物（１：１）を充填した。コンジット＋ＮＳＣ群（ｎ＝８）では、コンジットに１×１０^６ ＮＳＣを含む５μｌマトリゲル／ＰＢＳ混合物（１：１）を充填した。コンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群（ｎ＝８）では、コンジットに１×１０^６ ＮＳＣおよび１００ｎｇマウスＩＬ１２ｐ８０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む５μｌマトリゲル／ＰＢＳ混合物（１：１）を充填した。

【0029】

機能評価：歩行軌跡分析およびロータロッドテスト
歩行軌跡分析は、術後毎週、Ｔｒｅａｄｍｉｌｌ／ＴｒｅａｄＳｃａｎシステム（ＣｌｅｖｅｒＳｙｓ）を用いて行い、坐骨神経機能指数（ＳＦＩ）として表した。ＳＦＩの式は次の通りである。

【0030】

【数1】

【0031】

ＳＦＩの計算は、正常（Ｎ）および試験（Ｅ）足に従い、ＰＬは足跡の長さ（最長の足指の先と踵の間の縦断距離）を示し、ＴＳは足指総幅（第１趾と第５趾の間の横断距離）を示し、ＩＴは足指中間幅（第２趾と第４趾の間の横方向の距離）を示した。正常歩行ビデオ（一マウスの全歩行期間内に合計１５００フレームを収集した）を得るために成体ＦＶＢマウスを使用し、これらの画像データを用いてＴｒｅａｄＳｃａｎソフトウエアを較正した（足の位置の特定のためにこのソフトウエアを訓練するためには各ステップで１０〜１２のアウトラインで十分であった）。較正後、十分に確立されたプログラムを用いて、坐骨神経損傷マウスの全歩行期間中に異常な歩行状態および不規則な足指幅を排除する。

【0032】

ロータロッドテストは、術後第４週と第８週にＲＴシリーズＲｏｔａｒｏｄ Ｔｒｅａｄｍｉｌｌ（ＳＩＮＧＡ）によって実行した。対照群では、マウスは神経切断および筋肉損傷なしと定義された（第４週はｎ＝８、第８週はｎ＝８）。正式なデータ収集の前に、前試験過程として各マウスに各１０ｒｐｍ、１２ｒｐｍ、および１５ｒｐｍの３回、回転ロッド上を走らせた。データ収集では、マウスに２０ｒｐｍで６回、回転ロッド上を走らせた。最長記録時間は１２０秒だった。

【0033】

タンパク質アレイ
タンパク質サンプルを移植されたコンジットから、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する１×ＲＩＰＡバッファー［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ β−グリセロホスフェート、０．１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ ＮａＦ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、および０．５％ＮＰ−４０］を用いて抽出した。１００μｇのタンパク質サンプルを、製造者のプロトコールに従ったマウス血管新生タンパク質抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）分析で使用した。タンパク質レベルは化学発光法を用いて検出した。

【0034】

神経分化アッセイ
１×ＨｙＱＴａｓｅ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を用い、ニューロスフェアから単細胞を解離させた。２×１０^３細胞を、誘導因子を添加したまたは添加しない神経分化培地（２％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２）とともにポリ−Ｄ−リシン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）コーティングチャンバースライドに播種した。ＣＮＴＦ＋Ｔ３群では、神経分化培地に５０ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦおよび１０ｎｇ／ｍｌ Ｔ３を添加した。ｈＩＬ１２およびｍＩＬ１２群では、神経分化培地にそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ１２ｐ８０およびマウスＩＬ１２ｐ８０を添加した。
ＣＮＴＦ＋Ｔ３＋ｈＩＬ１２群では、神経分化培地に５０ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ、１０ｎｇ／ｍｌ Ｔ３および１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ１２ｐ８０を添加した。ＣＮＴＦ＋Ｔ３＋ｍＩＬ１２群では、神経分化培地に５０ｎｇ／ｍｌ ＣＮＴＦ、１０ｎｇ／ｍｌ Ｔ３および１００ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ１２ｐ８０を添加した。ＣＮＴＦ、Ｔ３、およびヒトＩＬ１２ｐ８０はＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入した。培養培地を３日毎に交換した。

【0035】

免疫蛍光染色
細胞をチャンバースライド（Ｎｕｎｃ、ネーパーヴィル、ＩＬ、ＵＳＡ）上、３７℃、５％ＣＯ_２で増殖させた。免疫蛍光染色では、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中、４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で室温にて１５分間固定した。次に、細胞をＰＢＳ中０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００で室温にて１５分間、透過処理を行った。次いで、細胞をブロッキング溶液（１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）で室温にて１時間ブロッキングした後、特異的一次抗体で室温にて１時間インキュベーションを行った。
本出願では、分化能は、ガラクトセレブロシドに対するマウスモノクローナル抗体（Ｇａｌｃ、１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、乏突起グリア細胞特異的タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体（ＯＳＰ、１：１０００、Ａｂｃａｍ）、およびミエリンタンパク質ゼロに対するニワトリポリクローナル抗体（ＰＺＯ、１：１０００、ＧｅｎｅＴｅｘ）による免疫蛍光染色を使用することによって確認した。次に、これらの細胞をローダミン結合二次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、ＭＡ、ＵＳＡ）とともに室温で１時間インキュベートした。全ての切片を、２−（４−アミジノフェニル）−６−インドールカルバミジン二塩酸塩（ＤＡＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で核染色し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、東京、日本）下で観察した。Ｇａｌｃ／ＤＡＰＩ、ＯＳＰ／ＤＡＰＩおよびＰＺＯ／ＤＡＰＩ二重陽性細胞を計数し、対照群に対して正規化した。

【0036】

ウエスタンブロット法
ニューロスフェアから単離し誘導因子を含むまたは含まない神経分化培地（表１）で７日間培養した分化細胞において、免疫ブロット法により対応するタンパク質レベルを検出するために、グリア線維性酸性タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体（ＧＦＡＰ、１：１０００；Ａｂｃａｍ）、乏突起グリア細胞特異的タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体（ＯＳＰ、１：４０００；Ａｂｃａｍ）、ミエリンタンパク質ゼロに対するニワトリポリクローナル抗体（ＰＺＯ、１：４０００；ＧｅｎｅＴｅｘ）、およびα−チューブリンに対するウサギポリクローナル抗体（α−チューブリン、１：８０００希釈；ＧｅｎｅＴｅｘ）を使用した。分化細胞からのタンパク質サンプルは、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を添加した１×ＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、ＭＡ、ＵＳＡ）により採取した。

【0037】

ＩＬ１２ｐ８０処理後のマウスＮＳＣにおけるＳｔａｔ３のリン酸化状態を分析するために、Ｓｔａｔ３に対するマウスモノクローナル抗体（１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐＳｔａｔ３−Ｙ７０５部位に対するウサギポリクローナル抗体（１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐＳｔａｔ３−Ｓ７２７部位に対するウサギポリクローナル抗体（１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、およびα−チューブリンに対するウサギポリクローナル抗体（α−チューブリン、１：８０００希釈；ＧｅｎｅＴｅｘ）を使用した。単細胞をニューロスフェアから単離し、３分間の遠心分離により試験シグナル細胞を採取し、種々の時点（スフェア、０分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、および８時間）で細胞溶解液を抽出した。従って、「０分」の時点では、遠心分離期間中の３分間、細胞はＩＬ１２ｐ８０の存在下にあった。細胞溶解液はウエスタンブロット法を用いて分析した。

【0038】

各サンプルのタンパク質濃度は、タンパク質アッセイ染色試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により決定した。等量のタンパク質サンプルをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりサイズ分画した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写した。その後、膜を５％ウシ血清アルブミン（Ｂｉｏ Ｂａｓｉｃ、マーカム、オンタリオ州、カナダ）ブロッキングバッファー中、室温で１時間ブロッキングした。次に、これらの膜を５％ウシ血清アルブミンブロッキングバッファー中で特異的一次抗体とともにインキュベートし、その後、対応するＨＲＰ結合二次抗体（１：１００００）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とともにインキュベートした。タンパク質レベルは、α−チューブリンを内部対照とし、ＥＣＬ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＸ線フィルムを用いて明らかにした。３回の個々の試験の免疫反応性バンドをＩｍａｇｅＪソフトウエアにより定量化し、対照群に対して正規化した。

【0039】

複合筋活動電位の測定
複合筋活動電位は、ＢＩＯＰＡＣ ＭＰ３６およびＢＩＯＰＡＣ ＢＳＬ ４．０ソフトウエア（ＢＩＯＰＡＣ ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）で記録および分析した。ステンレス鋼電極は直径０．２２ｍｍであった。刺激電極は坐骨切痕に配置し、記録電極は脾腹筋（坐骨切痕からおよそ２ｃｍ）に配置した。刺激電圧は６ボルトであり、刺激期間は０．１ミリ秒であり、取得長は２００ミリ秒であった。距離はノギスで測定し、皮膚温度は２５℃の一定温度に維持した室内で３６℃に維持した。

【0040】

ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色および免疫組織化学染色
移植したコンジットを術後第８週に回収した。簡単に述べれば、移植したコンジットを４℃にて一晩、４％ＰＦＡで固定した。固定したサンプルを１×ＰＢＳ中３０％スクロースを用い、４℃で一晩脱水した。サンプルをＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．（Ｓａｋｕｒａ、オランダ）中に包埋した後、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。

【0041】

ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）および免疫組織化学染色では、低温包埋した神経コンジットを、クリオスタットミクロトーム（ＭＩＣＲＯＭ ＨＭ５５０）を用いて、スライド上、１０μｍの切片とした。免疫組織化学染色は特異的抗体：神経フィラメント２００に対するウサギポリクローナル抗体（ＮＦ−２００、１：５００、神経線維のマーカー）およびミエリンタンパク質ゼロに対するニワトリポリクローナル抗体（ＰＺＯ、１：５００、有髄シュワン細胞のマーカー）によって行った。
ＰＢＳ洗浄の後、サンプルを各二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。全てのサンプルをＤＡＰＩ（１：５０００）で室温にて３分間核染色し、ＦｌｕｏｒＳａｖｅ試薬（Ｍｅｒｃｋ）を用いてマウントした。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）および共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて再生した組織の全画像データを観察および収集した。

【0042】

統計学
データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。２群を比較するためにスチューデントのｔ検定を用い、複数の群を比較するためには一元配置ＡＮＯＶＡを用いた。ｐ＜０．０５の場合に統計的有意と見なした。

【0043】

【表1】

【0044】

結果
ＮＳＣと神経コンジットを移植すると、マウスにおける坐骨神経損傷の機能回復がコンジット単独の場合よりも改善する。
左坐骨神経（３ｍｍ）の切断後、全てのマウスが左後肢の運動機能を失い、足先が萎縮した引きずり歩行の表現型を示した。この試験で、本発明者らは、損傷を受けた坐骨神経を修復するためにＮＳＣとコンジットを移植した。機能回復は、再生期間中、非侵襲的方法である歩行軌跡分析およびロータロッドテストを用いて評価した。坐骨神経機能指数（ＳＦＩ）は、足取り分析と歩行中のある足跡と別の足跡の時間的および空間的関係とを組み合わせた歩行軌跡分析からのデータのスコアを計算したものである。ＳＦＩは０〜−１００の尺度で、０は正常な歩行機能に相当し、−１００は完全な機能喪失を意味する。
軌跡分析では、偽手術対照マウスは、坐骨神経の実際の損傷が無いこと以外は同じ手術手順を受けたマウスとして定義した。これらのマウスは、術前のＳＦＩスコアと比べて、術後第１週から第８週までＳＦＩスコアに明らかな差を示さなかった（図１Ａ、偽手術対照）。ＮＳＣとコンジット（図１Ａ、コンジット＋ＮＳＣ群）またはコンジット単独（図１Ａ、コンジット単独群）の移植では、ＳＦＩスコアは、術後第１週に、これらの２群間に有意差はないことを示した（−７３．２±２．５と−７７．０±３．９）。術後第２週から始まり、コンジット＋ＮＳＣ群は、コンジット単独群よりも高いＳＦＩスコアを示した（ｐ＜０．０１）。コンジット単独群よりもコンジット＋ＮＳＣ群におけるこの機能的向上は第８週まで続いた（図１Ａ）。

【0045】

ロータロッドテストもまた、損傷坐骨神経マウスの運動機能およびバランス能の回復を評価するために使用される。ロータロッドテストでは、対照群マウスを神経切断および筋肉損傷の無いものとして定義した。ロータロッドテストにおける対照群、コンジット＋ＮＳＣ群およびコンジット単独群の結果はそれぞれ、第４週で５５±８、４０±７、および１６±１秒であり、第８週で６２±１４、５３±９、および２５±４秒であった（図１Ｂ）。コンジット単独群は、術後第４週および第８週において、対照群およびコンジット＋ＮＳＣ群よりも、ロータロッド上でのバランスおよび歩行の能力に有意な低下を示した。興味深いことに、ロータロッドテストで術後第４週および第８週において対照群とコンジット＋ＮＳＣ群の間に差は見られない。これらの結果は、ＮＳＣとコンジットの移植が坐骨神経損傷マウスにおいて機能回復を促進したことを示した。

【0046】

ＩＬ１２ｐ８０はＮＳＣを介した坐骨神経修復に関与する。
ＮＳＣは、シュワン細胞を含む３種類の神経外胚葉系譜の全てに分化する能力を保持し、また、神経再生のための栄養因子も分泌または動員し得る（Ｒｅｎ Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２，２３：１３５−１４３）。従って、ＮＳＣを介した神経再生に関与した因子を特定するために、マウス抗体アレイを用いて、コンジット単独群とコンジット＋ＮＳＣ群の間のタンパク質発現レベルを検討した。ＮＳＣとともにまたは伴わずに移植した神経コンジットから抽出したタンパク質溶解液を術後第４週にタンパク質抗体アレイ向けに採取した。抗体アレイの定量データによると、コンジット＋ＮＳＣ群から採取した細胞抽出液中のＩＬ１２ｐ４０の発現はコンジット単独群の１．８９倍であり、さらに、コンジット＋ＮＳＣ群のＩＬ１２ｐ３５発現はコンジット単独群と同等（１．０４倍）であった（図２、ＩＬ１２ｐ４０およびＩＬ１２ｐ３５）。ＩＬ１２ｐ４０はＩＬ１２ｐ７０のサブユニットの１つであり、全ＩＬ１２ｐ４０サブユニットの２０％〜４０％がホモ二量体型（ＩＬ１２ｐ８０）として分泌される可能性があり、このホモ二量体型は生物学的機能の誘導においてＩＬ１２ｐ４０単量体の２５〜５０倍の活性であった（Ｈｅｉｎｚｅｌ Ｆ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９７，１５８：４３８１−４３８８；Ｇｉｌｌｅｓｓｅｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９５，２５：２００−２０６；Ｊａｃｏｂｓｏｎ Ｎ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９５，１８１：１７５５−１７６２）。これらの抗体アレイデータでは、コンジット＋ＮＳＣ群はＩＬ１２ｐ４０の発現レベルを増大させたがＩＬ１２ｐ３５はそうではなく、このことは、ＩＬ１２ｐ４０の生理活性型であるＩＬ１２ｐ８０は神経再生に関与する因子であり得ることを示した。
ＩＬ１２ｐ４０はＩＬ１２受容体β１と結合し、Ｓｔａｔ３のリン酸化とＳｔａｔ３下流シグナル伝達の活性化をもたらす（Ｈｅｉｎｚｅｌ Ｆ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９７，１５８：４３８１−４３８８；Ｇｉｌｌｅｓｓｅｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９５，２５：２００−２０６；Ｊａｃｏｂｓｏｎ Ｎ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９５，１８１：１７５５−１７６２）。従前の研究は、Ｓｔａｔ３の活性化は神経前駆細胞の星状グリア細胞系譜への分化を誘導することを示している（Ｗａｎｇ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２００８，３：ｅ１８５６）。これらの結果は、Ｓｔａｔ３下流シグナル伝達の活性化および神経再生への関与におけるＩＬ１２ｐ８０の役割を暗示している。

【0047】

ＮＳＣとコンジットおよびＩＬ１２ｐ８０の移植は機能回復および神経再生を促進する。
神経再生におけるＩＬ１２ｐ８０の機能を調べるために、以下の条件で処置した坐骨神経損傷マウスを比較した：コンジット単独群、コンジットとＮＳＣ（コンジット＋ＮＳＣ群）、およびコンジットとＮＳＣとマウスＩＬ１２ｐ８０（コンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群）。移植後第８週に、歩行軌跡分析およびロータロッドテストにより機能評価を行った。コンジット＋ＮＳＣ群およびコンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群のマウスは、コンジット単独群よりも有意に高いＳＦＩスコアを示した（図３Ａ）。ロータロッドテストでは、コンジット＋ＮＳＣ群およびコンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群のマウスは、コンジット単独群よりも良好な歩行およびバランス能を示した（図３Ｂ）。
さらに、これらのデータは、歩行軌跡およびロータロッドの両分析の機能評価において、コンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群がＩＬ１２ｐ８０無しの群（ｐ＜０．０５）よりも有意な結果（ｐ＜０．０１）を示したことを実証した（図３Ａおよび３Ｂ）。しかしながら、このＩＬ１２ｐ８０の付加的投与の効果（コンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群）はわずかなものであったので、ＩＬ１２ｐ８０無しの場合（コンジット＋ＮＳＣ群）から神経修復能の補助を識別することはできなかった。従って、神経修復におけるＩＬ１２ｐ８０の効果を、組織学的切片評価（図４）および神経伝導試験（図５）によって実証する。

【0048】

神経再生試験では、５ｍｍ神経コンジットを３ｍｍの坐骨神経損傷ギャップを接続するように移植する。コンジットを、損傷を受けた坐骨神経の近位端および遠位端に、各末端で残存神経１ｍｍを用いて縫合した。従って、コンジットの中央領域に存在した軸策は、新たに再生した神経と見なされた。軸策再生はヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色および特定の神経細胞特異的マーカーを認識する抗体を用いた免疫組織化学により観察した。
図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃでは、「Ｐ」および「Ｄ」は残存神経の断端を示す（「Ｐ」は移植したコンジットの近位端から１．０ｍｍであり、「Ｄ」は「Ｐ」から３．０ｍｍ遠位である）。Ｈ＆Ｅ染色では、コンジット＋ＮＳＣ群（図４Ｂ）およびコンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群（図４Ｃ）は、コンジット単独群（図４Ａ）に比べて、再生した軸策の完成度に有意な促進を示した。神経再生の状態を、抗神経フィラメント２００抗体（神経線維のマーカーであるＮＦ２００）および抗タンパク質ゼロ抗体（有髄シュワン細胞のマーカーであるＰＺＯ）を用いた免疫組織化学染色を使用することによってさらに確認する。免疫組織化学染色結果は、コンジット内での有髄シュワン細胞（ＰＺＯ陽性細胞）と再生した神経の神経線維（ＮＦ２００陽性細胞）の連関（それぞれ図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃの点線領域）がコンジット＋ＮＳＣ群（図４Ｅ）およびコンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群（図４Ｆ）では見られたが、コンジット単独群（図４Ｄ）では見られなかったことを示した。さらに、再生神経の直径を、移植した神経コンジットの近位部位、中央部位、および遠位部位においてＨ＆Ｅにより染色された一連のサンプル切片を再構成することにより測定する：近位部位（コンジットの近位端から１．０ｍｍ）、遠位部位（近位部位から３．０ｍｍ）、および中央部位（近位部位と遠位部位の間の中央）。近位部位と遠位部位において、再生神経の直径は、３群の間で有意差が無いことを示した（それぞれ、近位部位では２６２±４４μｍ、２８４±４２μｍ、および３０２±９７μｍ、遠位部位では２７９±５６μｍ、２９８±７５μｍ、および３２２±１２３μｍ）。これに対して、コンジット＋ＮＳＣ群（１８９±１８μｍ）およびコンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群（２９５±４７μｍ）の中央部位の直径は、コンジット単独群（６５±２１μｍ）のそれぞれ２．９倍および４．５倍の厚さであった。注目すべきは、再生坐骨神経の中央部位では、ＩＬ１２ｐ８０の添加がＩＬ１２ｐ８０を含まない群の１．６倍神経直径を増大させたことである（図４Ｇ）。
３群の再生の概略図を図４Ｈに示す。神経伝導は、坐骨神経を電気的に刺激し、個々の筋肉線維の活動電位からの電圧応答の総和である複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）を記録することにより測定される（Ｍａｌｌｉｋ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００５，７６ Ｓｕｐｐｌ ２：ｉｉ２３−３１）。本出願では、損傷肢および反対側の正常肢のＣＭＡＰを測定した。回復パーセンテージは、損傷肢のＣＭＡＰを反対側の正常肢のＣＭＡＰで正規化したものとして計算した（図５）。コンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群は、コンジット＋ＮＳＣまたはコンジット単独のいずれよりも良好な回復状態を示した（それぞれ１７．７±４．３％、８．５±２．１％、および６．６±０．２％）。さらに、コンジット＋ＮＳＣ＋ｍＩＬ１２群は、コンジット単独群よりも低い脾腹筋萎縮を示した（損傷肢／正常肢はそれぞれ０．３９±０．０２および０．２６±０．０７であった、ｐ＜０．０１）。これらのデータは、ＮＳＣとコンジットの移植が機能回復および神経再生を促進したことを実証した。重要なこととして、ＩＬ１２ｐ８０の付加的投与は、ＳＦＩおよびロータロッドの両分析の機能評価、神経伝導の改善、ならびに新たに再生した神経の直径の増大に統計的に有意な結果を示した。

【0049】

ＩＬ１２ｐ８０はマウスＮＳＣの乏突起グリア細胞およびシュワン細胞系譜への分化を刺激する。
次に、本出願は、マウスＮＳＣにおいて乏突起グリア細胞およびシュワン細胞分化の誘導におけるＩＬ１２ｐ８０の能力を検討した。ニューロスフェアから解離させた細胞を、分化対照培地としての２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（対照群）、および乏突起グリア細胞分化培地（ＣＮＴＦ＋Ｔ３群）でそれぞれ培養した（Ｈｓｕ Ｙ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２００９，２３８：３０２−３１４；Ｌｅｅ Ｄ．Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９，４１：３４８−３６３）。
乏突起グリア細胞およびシュワン細胞分化の誘発におけるＩＬ１２ｐ８０の能力を調べるために、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ１２ｐ８０（ｈＩＬ１２ｐ８０）またはマウスＩＬ１２ｐ８０（ｍＩＬ１２ｐ８０）を対照群またはＣＮＴＦ＋Ｔ３群に添加し、ｈＩＬ１２群、ｍＩＬ１２群、ＣＮＴＦ＋Ｔ３＋ｈＩＬ１２群、およびＣＮＴＦ＋Ｔ３＋ｍＩＬ１２群と呼称した。分化細胞は、特異的細胞マーカー：ガラクトセレブロシド（Ｇａｌｃ；乏突起グリア細胞）、乏突起グリア細胞特異的タンパク質（ＯＳＰ；乏突起グリア細胞）、およびミエリンタンパク質ゼロ（ＰＺＯ；有髄シュワン細胞）を認識する一次抗体ならびに蛍光色素結合二次抗体による免疫蛍光染色を用いて確認した（図６Ａ）。マーカー陽性細胞のパーセンテージを定量化し、図６Ｂにまとめる。
細胞形態および免疫蛍光染色の結果は、ＩＬ１２ｐ８０がマウスＮＳＣにおいて乏突起グリア細胞または有髄シュワン細胞分化を誘導するためにＣＮＴＦ＋Ｔ３に取って代わり得ることを示した。細胞分化および成熟状態は、それぞれグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、星状グリアマーカー）、ＯＳＰ、およびＰＺＯに対する系譜特異的抗体を用いたウエスタンブロット法により確認される（図７Ａ）。定量化結果は、ＧＦＡＰ、ＯＳＰおよびＰＺＯのタンパク質レベルが、ＩＬ１２ｐ８０を含有する分化条件でアップレギュレートされていたことを示した（図７Ｂ）。これらの結果は、ＮＳＣを乏突起グリア細胞および有髄シュワン細胞へ分化誘導可能であることを実証した。

【0050】

ＩＬ１２ｐ８０はＮＳＣにおいてＳｔａｔ３のリン酸化を誘導する。
ＮＳＣにおいて、Ｓｔａｔ３のリン酸化は、乏突起グリア細胞分化過程に関与することが示されている（Ｗａｎｇ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２００８，３：ｅ１８５６）。Ｔ細胞では、ＩＬ１２ｐ４０サブユニットはＩＬ１２受容体β１に結合し、その後、Ｓｔａｔ３のリン酸化および下流シグナル伝達経路を誘導することができる（Ｊａｃｏｂｓｏｎ Ｎ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９５，１８１：１７５５−１７６２）。従って、ＩＬ１２ｐ８０は、ＮＳＣにおいて、Ｓｔａｔ３活性化を介して乏突起グリア細胞の分化を誘発することができる。
ｈＩＬ１２ｐ８０またはｍＩＬ１２ｐ８０処理ＮＳＣにおけるＳｔａｔ３のリン酸化状態は、ウエスタンブロット法により分析される。この研究では、Ｙ７０５とＳ７２７（Ｓｔａｔ３リン酸化部位）の両方のリン酸化状態がニューロスフェアにおいてわずかに発現された（図８、スフェアのレーン）。ヒトおよびマウスＩＬ１２ｐ８０は両方ともＹ７０５におけるＳｔａｔ３のリン酸化を誘導し、その強度は１５分でピークに達し、３０分で低下し始めた。同様に、Ｓ７２７におけるＳｔａｔ３のリン酸化もＩＬ１２ｐ８０によって増大し、８時間持続した（図８、ｈＩＬ１２群およびｍＩＬ１２群）。これらの結果から、Ｓｔａｔ３のリン酸化はＮＳＣにおけるＩＬ１２ｐ８０により誘導される乏突起グリア細胞分化に重要であったことが明らかとなった。

【0051】

結論
本研究では、神経コンジットにてＮＳＣとともにＩＬ１２ｐ８０を移植すると、運動機能の回復が改善され、神経再生が促進され、神経伝導が改善され、新たに再生した神経の直径が増大することが実証される。コンジット＋ＮＳＣ＋ＩＬ１２からの再生神経は、損傷を受けた神経の中央部においてコンジット単独群の最大４．５倍厚い。ＩＬ１２ｐ８０はｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＳＣを乏突起グリア細胞または有髄シュワン細胞へと分化誘導し得る。さらに、この分化誘導はＳｔａｔ３のリン酸化を介するものであり得ることも示される。ＩＬ１２ｐ８０単独の投与でも、ある程度の神経修復を達成することができた。

【0052】

考察
ＩＬ１２ｐ８０はＩＬ１２ｐ４０のホモ二量体であり、ＩＬ１２ｐ７０はＩＬ１２ｐ４０とＩＬ１２ｐ３５のヘテロ二量体である。ＩＬ１２ｐ４０はＩＬ１２受容体β１に結合し、ＩＬ１２ｐ３５はＩＬ１２受容体β２に結合する。また、ＩＬ２３はＩＬ１２ｐ４０とＩＬ２３ｐ１９のヘテロ二量体であり、ＩＬ２３ｐ１９はＩＬ２３受容体に結合することも報告されている。神経コンジット内のＩＬ１２ｐ８０とＮＳＣは神経損傷修復を改善することが示された。ＩＬ１２ｐ８０単独の投与でも、ある程度の神経修復を達成することができた。

【0053】

ＩＬ１２ｐ７０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてマウス交感神経上頚神経節ニューロン神経突起伸長を促進できることが示されている（Ｌｉｎ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２０００，２７８：１２９−１３２）。従って、ＩＬ１２ｐ８０、ＩＬ１２ｐ７０、およびＩＬ２３をはじめとするＩＬ１２ｐ４０サブユニットを含有するタンパク質は全て神経修復に寄与することができた。神経修復の範囲は末梢神経損傷、脊髄損傷および脳卒中などの神経損傷の神経発生だけでなく、アルツハイマー病、パーキンソン病および多発性硬化症などの神経変性疾患も含み得る（Ｂｅｃｋｅｒｖｏｒｄｅｒｓａｎｄｆｏｒｔｈ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４，２：１５３−１６２）。

【0054】

神経幹細胞およびＩＬ１２ｐ４０を用いて神経再生を促進するための組成物および方法の具現化を特定の実施形態に関して記載した。これらの実施形態は例示であって限定されないものとする。多くの変形、修飾、付加、および改良が可能である。これらのおよびその他の変形、修飾、付加、および改良は、以下の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であり得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】