6339741 抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータ抗体＋ＢＡＣＥ阻害剤を用いたアルツハイマー病の併用療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6339741

(24)【登録日】2018年5月18日

(45)【発行日】2018年6月6日

(54)【発明の名称】抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータ抗体＋ＢＡＣＥ阻害剤を用いたアルツハイマー病の併用療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/542 20060101AFI20180528BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20180528BHJP

   C07D 513/04 20060101ALN20180528BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/542

   A61K39/395 N

   A61P43/00 121

   A61P25/28

   !C07D513/04 375

   !C07D513/04CSP

【請求項の数】15

【全頁数】64

(21)【出願番号】特願2017-514623(P2017-514623)

(86)(22)【出願日】2015年9月8日

(65)【公表番号】特表2017-529348(P2017-529348A)

(43)【公表日】2017年10月5日

(86)【国際出願番号】US2015048807

(87)【国際公開番号】WO2016043997

(87)【国際公開日】20160324

【審査請求日】2017年3月31日

(31)【優先権主張番号】62/050,967

(32)【優先日】2014年9月16日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100176094

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 満

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】メイ，パトリック コルネリウス

(72)【発明者】

【氏名】メルゴット，ダスティン ジェームズ

【審査官】 参鍋 祐子

(56)【参考文献】

【文献】 特許第６０９５８４４（ＪＰ，Ｂ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／５４２

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ２５／２８

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｃ０７Ｄ ５１３／０４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者におけるアルツハイマー病を処置するための医薬組成物であって、式：

【化1】

で示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含み、抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用して、そのような処置を必要とする患者に投与される、医薬組成物。

【請求項2】

前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、Ｂ１２Ｌ又はＲ１７Ｌである、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、Ｂ１２Ｌである、請求項１又は請求項２のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記化合物が、Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記化合物が、結晶形態２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記結晶形態２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドが、０．２°の回折角に対する公差で、回折角２θが１１．８°のＸ線回折スペクトルの実質的ピークと、１８．６°、１９．３°及び２６．７°からなる群から選択される１つ又は複数のピークにより特徴づけられる、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記化合物と前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、同時に投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記化合物が、前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体の投与前に投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、前記化合物の投与前に投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

１種又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を有する抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体の医薬組成物と併用される、１種又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を有する式：

【化2】

で示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物。

【請求項11】

前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、Ｂ１２Ｌ又はＲ１７Ｌである、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、Ｂ１２Ｌである、請求項１０又は請求項１１のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記化合物が、Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記化合物が、結晶形態２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記結晶形態２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドが、０．２°の回折角に対する公差で、回折角２θが１１．８°のＸ線回折スペクトルの実質的ピークと、１８．６°、１９．３°及び２６．７°からなる群から選択される１つ又は複数のピークにより特徴づけられる、請求項１４に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（併用療法）
本発明は、ＢＡＣＥ阻害剤と抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体との併用、及びアルツハイマー病などの特定の神経障害を処置するために該併用を用いる方法に関する。

【0002】

本発明は、アルツハイマー病、並びにアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の神経毒性で高凝集性のペプチドセグメントであるアミロイドβ（Ａベータ）ペプチドを含む他の疾患及び障害の処置の分野にある。アルツハイマー病は、世界全体で数百万人の患者が罹患する破壊的な神経変性障害である。現在認可された市販薬は患者に一時的な症状効果を与えるに過ぎず、アルツハイマー病の処置には未だ適えられていない少なからぬ要件が存在する。

【背景技術】

【0003】

アルツハイマー病は、脳内のＡベータの生成、凝集、及び沈着を特徴とする。ベータセクレターゼ（ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素；ＢＡＣＥ）の完全又は部分的阻害が、マウスモデルにおいてプラーク関連及びプラーク依存性の病理に対して有意な影響を有することが示されている。このことは、Ａベータペプチドレベルの小さな低下でさえもプラーク量及びシナプス欠陥の長期にわたる有意な低減をもたらし得、これにより特にアルツハイマー病の処置において、有意な治療効果を提供し得ることが示唆される。

【0004】

その上、Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータを特異的に標的化する抗体が、インビボでプラークレベルを低下させることが示された（米国特許出願公開第２０１３／０１４２８０６号）。Ｎ３ｐＧｌｕ ＡベータはＮ３ｐＥ又はＡベータ_{ｐ３−４２}とも称され、プラーク内のみで見出されるＡベータペプチドのトランケート化形態である。Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータペプチドは、脳内に沈着したＡベータの微量成分であるが、Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータペプチドが凝集特性を有し、沈着カスケードの早期に蓄積することは、研究によって実証されている。

【0005】

ＢＡＣＥ阻害剤とＮ３ｐＧｌｕ Ａベータペプチドに結合する抗体との併用は、アルツハイマー病などのＡベータペプチド媒介性障害の処置を提供するのに望ましく、いずれか一方の薬物単独よりも効果的になり得る。例えばそのような併用での処置は、単独で用いられる各薬物と比較して、いずれか一方又は両方の薬物をより低用量で使用させることができ、有効性を維持しながら副作用を低減する可能性がある。Ｎ３ｐＧ抗体及びＢＡＣＥ阻害剤によって沈着形態のＡベータの除去をターゲットにすることで、既存のプラーク沈着の食細胞除去が促進され、同時にＡベータ産生を阻害することによってＡベータのさらなる沈着が低減又は阻害されるであろうと考えられる。

【0006】

米国特許出願公開第２００９／０２０９７５５号には、ＢＡＣＥ阻害活性を有し、さらにアルツハイマー型認知症などのＡβペプチドによる神経変性疾患のための有用な治療薬として開示された、融合アミノジヒドロチアジン誘導体が開示されている。加えて、J. Neuroscience, 31(46), pages 16507-16516 (2011)には、経口投与されるＣＮＳ活性ＢＡＣＥ阻害剤（Ｓ）−４−（２，４−ジフルオロ−５−ピリミジン−５−イル−フェニル）−４−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−［１，３］チアジン−２−イルアミンが開示されている。米国特許第８，２７８，３３４号には、置換された環状アミンＢＡＣＥ−１阻害剤を抗アミロイド抗体と共に投与することを含む、認知性又は神経変性疾患を処置する方法が開示されている。さらにJ. Neuroscience, 34(35), pages 11621-11630 (2014)には、ＢＡＣＥ阻害剤及び抗Ａベータ抗体ガンテネルマブ（Gentenermab）との併用処置がＡＰＰ_Londonマウスのアミロイド減少を増進することが開示されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって本発明は、認知性又は神経変性疾患を処置する方法であって、有効量のＢＡＣＥ阻害剤を有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用して、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

より具体的には本発明は、認知性又は神経変性疾患を処置する方法であって、有効量の式I：

【化1】

（式中、Ｒは、Ｈ又はＦであり；
Ａは、

【化2】

である）で示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用して、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0009】

本発明はまた、Ａベータの形成及び沈着を特徴とする疾患を処置する方法であって、有効量の式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用して、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0010】

本発明はさらに、アルツハイマー病を処置する方法であって、有効量の式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用して、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0011】

本発明はまた、軽度アルツハイマー病を処置する方法であって、有効量の式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用して、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0012】

本発明はさらに、軽度認知障害を処置する方法であって、有効量の式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用して、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0013】

本発明はさらに、前駆期アルツハイマー病を処置する方法であって、有効量の式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用して、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0014】

加えて本発明は、軽度認知障害からアルツハイマー病への進行を予防する方法であって、有効量の式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用して、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0015】

本発明はさらに、脳アミロイドアンギオパチー（ＣＡＡ）を処置する方法であって、有効量の式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用して、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0016】

さらに本発明は、治療における使用のため、特にアルツハイマー病、軽度アルツハイマー病、前駆期アルツハイマー病の処置のため、又は軽度認知障害からアルツハイマー病への進行を予防するための、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用される、式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。

【0017】

本発明はさらに、１種又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を有する抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体の医薬組成物と併用される、１種又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を有する式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物を提供する。

【0018】

加えて本発明は、式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩と、抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と、を含むキットを提供する。本発明はさらに、式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を１種又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と共に含む医薬組成物と、抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体を１種又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と共に含む医薬組成物と、を含むキットを提供する。本明細書で用いられる「キット」は、一方の成分が式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、もう一方の成分が抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体である、各成分の分離した容器を、単一包装の中に含む。「キット」はまた、一方の成分が式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、もう一方の成分が抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体である、各成分の分離した容器を、各成分を併用物として投与するための取扱説明書と共に分離した包装の中に含む場合がある。

【0019】

本発明はさらに、アルツハイマー病、軽度アルツハイマー病、前駆期アルツハイマー病の処置のため、又は軽度認知障害からアルツハイマー病への進行を予防するための医薬の製造のための、式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩と、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体との併用を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0020】

当業者は、「抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体」並びにその特異的抗体「Ｂ１２Ｌ」及び「Ｒ１７Ｌ」が、２０１４年３月２５日発行の表題「Anti-N3pGlu Amyloid Beta Peptide Antibodies and Uses Thereof」（ＵＳＳＮ１３／８１０，８９５）の米国特許第８，６７９，４９８ Ｂ２号において、当業者によって前記抗体を作製及び使用する方法と共に同定及び開示されていることを認識及び認知しているであろう。例えば米国特許第８，６７９，４９８ Ｂ２号の表１を参照されたい。

【0021】

加えて、本発明において用いられる特定の抗体のアミノ酸配列を、以下の表Ａに示す：

【表1】

【0022】

認知性又は神経変性疾患としては、アルツハイマー病、軽度アルツハイマー病、軽度認知障害、前駆期アルツハイマー病、脳アミロイドアンギオパチー（ＣＡＡ）、ダウン症候群などが挙げられる。

【0023】

本明細書で用いられる用語「処置する」、「処置すること」、又は「処置」は、既存の症状、障害、状態又は疾患の進行又は重症度を抑止、緩徐化、停止、低減、又は回復させることを含む。

【0024】

本明細書で用いられる用語「患者」は、ヒトを指す。

【0025】

用語「Ａベータペプチド産生の阻害」は、患者におけるＡベータペプチドのインビボレベルの低下を意味する解釈される。

【0026】

本明細書で用いられる用語「有効量」は、患者への単回又は反復投与によって、診断又は処置の下で患者において所望の効果を提供する、式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩の量又は用量、及び抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体の量又は用量を指す。本発明の併用療法が、体内において式Iで示される化合物及び抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体の有効なレベルを提供する任意の手法で、式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と共に投与することによって実施されることは、理解されよう。

【0027】

有効量は、当業者である担当の診断医によって、公知技術の使用によって、そして類似状況下で得られた結果を観察することによって、即座に決定され得る。患者への有効量を決定する上で、非限定的に患者の種；患者のサイズ、年齢、及び一般的健康状態；関与する具体的疾患又は障害；該疾患又は障害の度合い又は関与又は重症度；各患者の応答；投与される個々の化合物；投与方式；投与される調製物の生物学的利用性；選択される用量レジメン；随伴する薬剤の使用；並びに他の関連の状況をはじめとし、複数の因子が担当の診断医によって判断される。

【0028】

式Ｉで示される化合物及びその薬学的に許容可能な塩は一般に、本発明の併用において広い投与量範囲にわたって効果的である。例えば日用量は通常、約０．１ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日、好ましくは約０．１ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、最も好ましくは約０．１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日の範囲内に含まれる。加えて、抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体は一般に、本発明の併用において広い投与量範囲にわたって効果的である。例えば、週あたりの投与量は通常、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／週、好ましくは約０．３〜約６ｍｇ／ｋｇ／週、最も好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ／週〜約３ｍｇ／ｋｇ／週の範囲内に含まれる。一部の例において、前述の範囲内の下限未満の投与レベルは、十二分に適し得るが、他の例において、より大きな用量を、許容可能な副作用を伴って用いることができ、それゆえ上記投与範囲は、本発明の範囲を限定するものではない。

【0029】

本発明のＢＡＣＥ阻害剤及び抗体は、好ましくは該化合物を生物学的利用性にする任意の経路によって投与される医薬組成物として配合される。投与経路は、多少なりとも変動し得、薬物の物理的性質、並びに患者及び看護者の簡便性によって限定され得る。好ましくは抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体組成物は、静脈内又は皮下投与などの非経口投与用である。加えて、式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩などのＢＡＣＥ阻害剤は、静脈内又は皮下投与をはじめとする、経口、非経口、又は経皮投与用である。そのような医薬組成物及びそれを調製するプロセスは、当該技術分野で周知である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006参照）。

【0030】

本明細書で用いられる語句「併用して」は、式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩などのＢＡＣＥ阻害剤と、抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体などの抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体との、同時の、若しくは任意の順序で連続した投与、又はそれらの任意の組み合わせを指す。該２種の分子は、同じ医薬組成物の一部として、又は別の医薬組成物中で、投与され得る。ＢＡＣＥ阻害剤は、抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体の投与の前に、それと同時に、若しくはそれに続いて、又はその幾つかの組み合わせで投与され得る。抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、何度かの間隔をおいて（例えば、標準の処置経過の間に）投与される場合、ＢＡＣＥ阻害剤は、抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体の各投与の前に、それと同時に、若しくはそれに続いて、又はその幾つかの組み合わせで、又は抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体での処置に関して異なる間隔で、又は抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体での処置経過の前に、その間のいずれかの時間に、若しくはそれに続いて、単回若しくは反復で連続して投与され得る。

【0031】

以下の段落は、本発明の好ましい基、置換基、及び配置を記載する。

【0032】

好ましい化合物は、
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド；及び
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−３，５−ジフルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド; 並びにそれらの薬学的に許容可能な塩である。

【0033】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド、又はその薬学的に許容可能な塩が、特に好ましい。

【0034】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド が、最も好ましい。

【0035】

さらに、結晶形態２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドは、好ましい化合物であり、０．２°の回折角に対する公差で、回折角２θが１１．８°のＸ線回折スペクトルの実質的ピークと、１８．６°、１９．３°及び２６．７°からなる群から選択される１つ又は複数のピークにより特徴づけられる結晶形態２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドが、特に好ましい。

【0036】

好ましい抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体は、米国特許第８，６７９，４９８ Ｂ２号において同定されたＢ１２Ｌ及びＲ１７Ｌであり（例えば、その中の表１参照）、Ｂ１２Ｌが特に好ましい。

【0037】

当業者は、式Iで示される化合物がスキームＡに示される通り互変異性体形態で存在し得ることを認識しているであろう。本出願において、式Ｉで示される化合物の特定の互変異性体の１つの任意の参照が与えられる場合、互変異性体形態とそれらの全ての混合物の両方を包含することは理解されよう。

【化3】

【0038】

明瞭にするために以下のスキームでは、特定の立体化学中心が明記されないままであり、特定の置換基が除去されているが、それらのスキームの教示を限定するものではない。さらに個々の異性体、鏡像異性体、及びジアステレオマーは、選択的結晶化技術又はキラルクロマトグラフィーなどの方法によって、式Ｉで示される化合物の合成の任意の簡便なポイントで当業者により分離又は分解され得る（例えば、J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981、及びE.L. Eliel and S.H. Wilen,” Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994参照）。称号「異性体１」及び「異性体２」は、キラルクロマトグラフィーからそれぞれ最初及び２番目に溶出する化合物を指し、キラルクロマトグラフィーが合成の初期に開始される場合、同じ称号が次の中間体及び実施例に適用されている。

【0039】

当業者は、本発明の化合物が少なくとも２つのキラル中心を含むコアで構成されることを認識しているであろう：

【化4】

【0040】

本発明は、個々の鏡像異性体及びラセミ体をはじめとする前記化合物の鏡像異性体混合物の全てを企図するが、スキームＢに示された１及び２と標識された炭素原子での絶対配置を有する化合物が、本発明の好ましい化合物である。

【0041】

加えて、以下のスキームに記載された特定の中間体は、１つ又は複数の窒素保護基を含有し得る。可変的な保護基は、実施される特定の反応条件及び特定の転位に応じて各出現において同一又は異なり得る。保護及び脱保護条件は、当業者に周知であり、文献に記載されている（例えば、Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene による“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”, Fourth Edition, John Wiley and Sons, Inc. 2007参照）。

【0042】

式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野で公知の種々の手順によって調製され得、その幾つかは、以下の調製及び実施例において示されている。記載された経路それぞれの具体的合成ステップを、異なる方法で組み合わせて、又は異なる手順からのステップと一緒にして、式Ｉで示される化合物又はその塩を調製することができる。各ステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、ろ過、研和、及び結晶化をはじめとする当該技術分野で周知の従来法によって回収され得る。加えて、他に断りがなければ、全ての置換基がこれまで定義された通りである。試薬及び出発原料は、当業者に即座に入手され得る。

【0043】

本明細書で用いられる「ＡＰＰ」は、アミロイド前駆体タンパク質を指し；「ＢＯＣ」は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを指し、「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを指し；「ＣＳＦ」は、脳脊髄液を指し；「ＤＣＣ」は、１，３−ジクロロヘキシルカルボジイミドを指し；「ＤＩＣ」は、ジイソプロピルカルボジイミドを指し；「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを指し；「ＤＩＰＥＡ」は、ジイソプロピルエチルアミンを指し；「ＤＭＡＰ」は、ジメチルアミノピリジンを指し；「ＤＭＥＭ」は、ダルベッコ改変イーグル培地を指し；「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指し；「ＥＤＣＩ」は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を指し；「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を指し；「ｅｅ」は、鏡像異性体過剰を指し；「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルを指し；「Ｅｘ」は、例を指し；「Ｆ１２」は、ハムＦ１２培地を指し；「ＦＢＳ」は、ウシ胎児血清を指し；「ＦＲＥＴ」は、蛍光共鳴エネルギー移動を指し；「ＨＡＴＵ」は、（ジメチルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル（３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イルオキシ）メタニミニウムヘキサフルオロホスファートを指し；「ＨＥＫ」は、ヒト胚性腎臓を指し；「ｈｒ」は、１時間又は数時間を指し；「ＨＯＡｃ」は、酢酸を指し；「ＨＯＡｔ」は、１−ヒドロキシ−７−アゾベンゾトリアゾールを指し；「ＨＯＢｔ」は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物を指し；「ＨＢＴＵ」は、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートを指し；「ＨＲＰ」は、西洋わさびペルオキシダーゼを指し；「ＩＣ_５０」は、薬剤に関して可能な最大阻害性応答の５０％を生じるその薬剤の濃度を指し；「ｉＰｒ」は、イソプロピルを指し；「ｍｉｎ」は、１分又は数分を指し；「ＭＴＢＥ」は、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを指し；「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を指し；「ＰＤＡＰＰ」は、血小板由来アミロイド前駆体タンパク質を指し；「Ｐｒｅｐ」は、調製を指し；「ｐｓｉ」は、ポンド／インチ^２を指し；「ＰｙＢＯＰ」は、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスファートを指し；「ＰｙＢｒｏｐ」は、ブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファートを指し；「ＲＦＵ」は、相対的蛍光単位を指し；「Ｒ_ｔ」は、保持時間を指し；「ＳＣＸ」は、強陽イオン交換クロマトグラフィーを指し；「ＳＦＣ」は、超臨界液体クロマトグラフィーを指し；「ＳＥＭ」は、平均の標準誤差を指し；「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを指し；「ＴＭＢ」は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを指す。

【0044】

以下の調製及び実施例は、本発明をさらに示している。

【0045】

以下のスキームにおいて、他に断りがなければ、全ての置換基が、過去に定義された通りである。試薬及び出発原料は一般に、当業者に即座に利用され得る。他のものは、任意の新規手順を含む以下の調製及び実施例に記載された手順を利用して有機及び複素環化学の標準技術によって作製され得る。

【化5】

【0046】

スキーム１は、オキシム（ステップ２の生成物）及び（ステップ５の生成物）の形成を表す。オキシムは、それぞれ二環式イソオキサゾール（ステップ３又は７の生成物）を形成するために用いられ得る。置換された芳香族基は、スキーム１のステップ１及びステップ７に示される通り、合成の異なるポイントで挿入され得る。「ＰＧ」は、カルバマート及びアリルなどのアミノ基のために開発された保護基である。そのような基は、当該技術分野で周知であり、認識されている。

【0047】

二段階反応において、ベータハロゲンを有するケトンが、炭酸カリウムなどの無機塩基を用いて、保護されたアリルアミンでアルキル化され（ステップ１）、その後、エタノールなどの極性プロトン性溶媒中、ヒドロキシルアミン塩酸塩及びピリジンなどの有機塩基で処理して、オキシムを与えることができる（ステップ２）。ステップ２のオキシム生成物は、その後、トルエン又はキシレンなどの非極性溶媒中でステップ２のオキシムを加熱して二環式イソオキサゾールを形成させるなど、複数の方法によって３＋２環化において二環式イソオキサゾールに変換することができる（ステップ３）。或いはジメチルアセタールから出発してオキシムを形成させ、それをギ酸などの酸で処理し、アルデヒド（ステップ４の生成物）を形成させることができる。ステップ５において、その後、ヒドロキシルアミン塩酸塩及び酢酸ナトリウム三水和物などの塩基を用いて、ステップ４のアルデヒドをステップ５のオキシム生成物に変換することができる。ステップ６の二環式イソオキサゾール生成物は、次亜塩素酸ナトリウム水溶液を用いて、ステップ６に示された通りオキシムから形成され得る。ステップ７において、保護された二環式イソオキサゾールを、その後、芳香族有機リチウム試薬又はGrignard試薬と反応させて、ステップ７の保護された二環式イソオキサゾール生成物を与える。

【化6】

【0048】

スキーム２は、ステップ１０又はステップ１２の保護されたピロロチアジン生成物までの異なる経度を示している。保護された二環式イソオキサゾールを、高圧水素化条件下、酢酸中の粉末Ｚｎ又はエタノールなどの極性溶媒中のRaneyニッケルで処理して、アミノピロリジンメタノール（ステップ１１の生成物）を与えることができる。ステップ１１のアミノピロリジンメタノール生成物を、その後、ＴＨＦなどの極性溶媒中でベンゾイルイソチオシアナートと反応させた後、１，１−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を添加して保護されたピロリジンチアジンの融合物（ステップ１２の生成物）を与える。或いは、二環式イソオキサゾールのアミンをベンゾイルイソチオシアナートと反応させてチオ尿素（ステップ８の生成物）を与えることができ、その後、ステップ９においてイソオキサゾール環を酢酸中の粉末亜鉛で開環して、ステップ９のヒドロキシル化合物の生成物を与えることができる。ヒドロキシル化合物を、その後、ＴＨＦなどの極性非プロトン性溶媒中のＣＤＩ又はＤＣＭ中の１−クロロ−Ｎ，Ｎ，２−トリメチルプロペニルアミンで処理して、保護されたピロリジンチアジンの融合物（ステップ１０の生成物）を形成させることができる。ピロリジンチアジンの融合物は、トリフェニルホスフィン及びジイソプロピルアゾジカルボキシラート（ＤＩＡＤ）を用いるなど、Mitsunobu反応から形成させることもできる。

【化7】

【0049】

スキーム３は、ピロロチアジンからアニリン（ステップ１３の生成物）への変換を表し、その後、アニリンをアシル化し、続いてピロリジンの脱保護及びヘテロアリール化を行うことができる。アニリン窒素のアシル化及びチアジンアミンの脱保護により、式Iで示される化合物が得られる。

【0050】

アジド脱ハロゲン化を、アジ化ナトリウムなどのアジド供給源の存在下、適切なピロロチアジン上で実施する。そのようなアジド脱ハロゲン化反応は、当該技術分野で周知であり、認識されている。得られたアジド中間体からアニリン（ステップ１３の生成物）への還元は、当該技術分野で周知であり記載されている水素化条件によって、又は当該技術分野で周知の還元剤、例えばＬｉＡｌＨ_４、ＮａＢＨ_４、及びＰＰｈ_３によって実行され得る。

【0051】

ＢＯＣ保護されたピロリジンを、当該技術分野で周知の酸性条件下で脱保護し得る（ステップ１４のステップ１）。その後、脱保護されたピロリジンを、求核芳香族置換（ＳＮＡｒ）において、ｄｉｐｅａ、トリエチルアミン、又はＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’−テトラメチルグアニジンなどの有機塩基を用いて置換芳香族ピリミジンでヘテロアリール化して、ステップ１４のステップ２の生成物を与えることができる。ステップ１４のアニリン生成物を、カップリング条件下でヘテロ芳香族カルボン酸とカップリングすることができる（ステップ１５のステップ１の生成物）。当業者は、カルボン酸とアミンとの反応から得られるアミド形成のための方法及び試薬が複数存在することを認知しているであろう。例えば、カップリング試薬及びＤＩＰＥＡ又はトリエチルアミンなどのアミン塩基の存在下での適切なアニリンと適切な酸との反応は、チアジンアミンの脱保護の後、式Ｉで示される化合物を与えることになる。カップリング試薬としては、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣＩなどのカルボジイミド、並びにＨＯＢｔ及びＨＯＡｔなどの芳香族オキシムが挙げられる。加えて、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、及びＰｙＢｒＯＰなどの非求核性アニオンのウロニウム又はホスホニウム塩を、より伝統的なカップリング試薬の代わりに用いることができる。ＤＭＡＰなどの添加剤を用いて、反応を促進することができる。或いは、トリエチルアミン又はピリジンなどの塩基の存在下で置換された塩化ベンゾイルを用いて、保護されたアニリンアミンをアシル化することができる。その後、保護されたチアジンアミンを、エタノールなどの極性非プロトン性溶媒中のピリジン及びメチルヒドロキシルアミンなどの有機塩基で、又はメタノール中の水酸化リチウムなどの無機塩基で脱保護して、式Iで示される化合物を与えることができる。

【0052】

選択可能なステップにおいて、標準条件下、適切な溶媒中で、式Iで示される適切な遊離塩基と適切な薬学的に許容可能な酸との反応によって、式Iで示される化合物の薬学的に許容可能な塩を形成させることができる。追加として、そのような塩の形成は、窒素保護基の脱保護の際に同時に起こり得る。そのような塩の形成は、周知であり、当該技術分野で認識されている。例えば、Gould, P.L., “Salt selection for basic drugs,” International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. “Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities,” Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000);及びBerge, S.M., et al., “Pharmaceutical Salts,” Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)を参照されたい。当業者は、式Iで示される化合物が即座に変換されて、塩酸塩などの薬学的に許容可能な塩として単離され得ることは認識しているであろう。

【実施例】

【0053】

調製及び実施例
以下の調製及び実施例は、本発明をさらに示している。

【0054】

調製１
１−（３−ブロモフェニル）−２−（ジアリルアミノ）エタノン

【化8】

炭酸カリウム（３８．８ｇ、２８１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４３０ｍＬ）中で臭化３−ブロモフェナシル（６０ｇ、２１６ｍｍｏｌ）に添加して、混合物を窒素下で０℃に冷却する。ジアリルアミン（３４．６ｍＬ、２８０．６３ｍｍｏｌ）を１時間にわたって滴加し、反応物を一晩放置して２２℃まで昇温させる。粗反応混合物を濃縮し、残渣を水（３００ｍＬ）及びＭＴＢＥ（３００ｍＬ）に分配する。水層を廃棄し、有機層を水（１００ｍＬ、２回）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで脱水してろ過し、一定重量まで溶媒を蒸発させて、表題化合物を与える（６２ｇ、９８％）。ES/MS (m/e): 294 (M+1)。

【0055】

調製２
ベンジルＮ−（２，２−ジメトキシエチル）カルバマート

【化9】

トルエン（１２０ｍＬ）中のアミノアセトアルデヒドジメチルアセタール（２５ｍＬ、２２９ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃で４．８５Ｍ水酸化ナトリウム溶液（７０．８ｍＬ、３４３．５ｍｍｏｌ）で処理する。混合物を０℃で１０分間撹拌し、クロロギ酸ベンジル（３３．８ｍＬ、２２９ｍｍｏｌ）を添加するが、添加の際は２０℃未満の内部温度を保持する。混合物を４時間かけて室温まで昇温させる。有機層を分離し、ブラインで洗浄して、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮乾固して、表題化合物を与える（５４ｇ、９８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）： ２４０（Ｍ＋Ｈ）。

【0056】

調製３
ベンジルＮ−アリル−Ｎ−（２，２−ジメトキシエチル）カルバマート

【化10】

トルエン（１８０ｍＬ）中のベンジルＮ−（２，２−ジメトキシエチル）カルバマート（５０ｇ、２０８．９ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素下、固体水酸化カリウム（５１．６ｇ、９１９．６９ｍｍｏｌ）で処理する。１０分後に、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム（０．８ｇ、３．１ｍｍｏｌ）を添加する。１０分後に、トルエン（５０ｍＬ）中の臭化アリル（３３ｇ、２７２．８ｍｍｏｌ）の溶液を、１０分間かけて滴加する。得られた混合物を、５０℃で４８時間撹拌する。混合物を室温まで冷却し、水でクエンチする。有機層を分離し、ブラインで洗浄して、硫酸マグネシウムで脱水し、濃縮乾固して表題化合物を与える（４４ｇ、７５％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２８０（Ｍ＋Ｈ）。

【0057】

調製４
ベンジルＮ−アリル−Ｎ−（２−オキソエチル）カルバマート

【化11】

ギ酸（３６．８ｍＬ、８６０ｍｍｏｌ）及び水（４．８４ｍＬ）中のベンジルＮ−アリル−Ｎ−（２，２−ジメトキシエチル）カルバマート（３０ｇ、１０７ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で一晩撹拌する。混合物を濃縮して、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１：２）及び水で希釈する。有機層を分離し、ｐＨ＝６になるまでブライン溶液で洗浄して、硫酸ナトリウムで脱水する。溶媒を蒸発させて、表題化合物を与える（２５ｇ、９９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２３４（Ｍ＋Ｈ）。

【0058】

調製５
１−（３−ブロモフェニル）−２−（ジアリルアミノ）エタノンオキシム

【化12】

エタノール（７２０ｍＬ）及びピリジン（２４．８ｍＬ、３０７ｍｍｏｌ）中の１−（３−ブロモフェニル）−２−（ジアリルアミノ）エタノン（６０ｇ、２０４．７ｍｍｏｌ）の溶液を、２２℃で１５分間撹拌する。ヒドロキシルアミン塩酸塩（１７ｇ、２４６ｍｍｏｌ）を、その溶液に１時間かけて少しずつ添加する。反応物を２時間の間５０℃に昇温させ、その後、１６時間の間、７０℃に加熱する。溶媒を蒸発させ、残渣を水（３００ｍＬ）及びＭＴＢＥ（３００ｍＬ）に分配する。有機層を分離し、水（１００ｍＬ、２回）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して蒸発乾固し、表題化合物を与える（７５．５ｇ、７９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３０９（Ｍ＋１）。

【0059】

調製６
２−（ジアリルアミノ）−１−（２−フルオロフェニル）エタノンオキシム

【化13】

内部温度を３０℃未満に保持しながら、ジアリルアミン（１．５６Ｌ、１２．２ｍｏｌ）を、エタノール（１２．９Ｌ）中の２−ブロモ−１−（２−フルオロフェニル）エタノン（１２９１ｇ、５．８ｍｏｌ）の溶液に添加する。反応混合物を２２℃で４時間撹拌する。ヒドロキシルアミン塩酸塩（５４３ｇ、７．５８ｍｏｌ）をその溶液に少しずつ添加し、その後、７０℃で１６時間加熱する。反応物を室温まで冷却し、溶媒を蒸発させて、残渣を水（５．１Ｌ）及びＭＴＢＥ（６．４Ｌ）に分配する。炭酸ナトリウムを添加して水層をｐＨ＝５．５に調整し、水層をさらなるＭＴＢＥ（１．２Ｌ）で抽出する。有機層をひとまとめにして、水及びブラインで洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して蒸発乾固し、粗製の表題化合物を与え（１．４５ｋｇ、１０４％）、さらに生成せずに使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２４９（Ｍ＋１）。

【0060】

調製７
ベンジルＮ−アリル−Ｎ−［２−ヒドロキシイミノエチル］カルバマート

【化14】

アセトニトリル（１５０ｍＬ）中のベンジルＮ−アリル−Ｎ−（２−オキソエチル）カルバマート（２５ｇ、１０７ｍｍｏｌ）の溶液をヒドロキシルアミン塩酸塩（９．６８ｇ、１３９ｍｍｏｌ）、及び水（７５ｍＬ）中の酢酸ナトリウム三水和物（１６ｇ、１１７．９ｍｍｏｌ）の溶液で処理する。混合物を室温で一晩撹拌する。アセトニトリルを蒸発させ、水溶液をＥｔＯＡｃで抽出する。有機層を分離し、硫酸マグネシウムで脱水して真空濃縮し、表題化合物を与える（２４ｇ、９０％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２４９（Ｍ＋Ｈ）。

【0061】

調製８
２−ブロモ−１−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）エタン−１−オン

【化15】

Ｎ−ブロモスクシンイミド（９８４ｇ、５．５３ｍｏｌ）を、３５℃でＤＣＭ（７Ｌ）中の１−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）エタン−１−オン（１０００ｇ、４．６ｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸（１３１５ｇ、７．６４ｍｏｌ）の溶液に少しずつ添加する。混合物を撹拌して、４０℃に加熱する。混合物を２４℃に冷却し、７％ＮａＨＣＯ_３（５Ｌ）を添加する。層を分離して、有機層を１０％Ｎａ_２ＳＯ_３（５Ｌ）及び水（５Ｌ）で洗浄する。有機層を２〜３倍（2-3 volumes）に濃縮して表題化合物を与え、さらに精製せずに使用する。

【0062】

調製９
５−アリル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−１−（４−メトキシベンジル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソオキサオゾール

【化16】

トルエン（１０Ｌ）中の２−ブロモ−１−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）エタン−１−オン（１３６３ｇ、４．６１ｍｏｌ）の溶液に、ジアリルアミン（５３７ｇ，５．５３ｍｏｌ）及びｄｉｐｅａ（２３８１ｇ、１８．４２ｍｏｌ）を添加する。混合物を４０℃で４時間撹拌して、１−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−２−（ジアリルアミノ）エタン−１−オンを与え、単離しない。Ｎ−（４−メトキシベンジル）ヒドロキシルアミン（８４７ｇ、５．５３ｍｏｌ）及びＴｉ（ＯｉＰｒ）_４（１９６５ｇ、６．９１ｍｏｌ）を、粗製の１−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−２−（ジアリルアミノ）エタン−１−オンを含む混合物に添加する。混合物を９０℃で２時間撹拌する。混合物を２０℃に冷却して、５０％クエン酸一水和物（４Ｌ）及び飽和Ｎａ_２ＣＯ３（４Ｌ）を添加する。層を分離して、水層をＭＴＢＥ（５Ｌ）で抽出する。有機抽出物を水（５Ｌ）で洗浄し、珪藻土でろ過して、濃縮乾固する。ＥｔＯＡｃ（１０Ｌ）及びシュウ酸（５８０ｇ）を残渣に添加して、固体をろ過し、１Ｎ ＮａＯＨ（１３Ｌ）に添加する。ＭＴＢＥ（５Ｌ）を添加して、混合物を珪藻土でろ過する。層を分離して、有機層を２倍に濃縮する。ヘプタン（３Ｌ）を添加して、溶液を１０℃に冷却する。得られた固体をろ過して、表題化合物を与える（１３３０ｇ、６４％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：２．５１−２．４９（ｍ， ３Ｈ）， ３．０９−３．０４（ｍ， ３Ｈ）， ３．７８−３．４１（ｍ， ６Ｈ）， ４．０１（ｍ， １Ｈ）， ５．２４−５．０１（ｍ， ２Ｈ）， ５．８９−５．８５（ｍ， １Ｈ）， ６．８２−６．８０（ｍ， ２Ｈ）， ７．５１−７．１３（ｍ， ３Ｈ）， ７．６３−７．６２（ｍ， １Ｈ）， ７．６５−７．６４（ｍ， １Ｈ）。

【0063】

調製１０
５−アリル−６ａ−（３−ブロモフェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール

【化17】

粗製の１−（３−ブロモフェニル）−２−（ジアリルアミノ）エタノンオキシム（７５．５ｇ、１９５．３４ｍｍｏｌ）をトルエン（６００ｍＬ）に溶解して、１２時間還流する。溶媒を真空蒸発させて、残渣を水性１Ｎ ＨＣｌ（１Ｌ）とＭＴＢＥ（３００ｍＬ）との混合物に溶解する。混合物を１５時間撹拌し、珪藻土（１０ｇ）を添加する。混合物をさらに２０分間撹拌し、珪藻土でろ過する。ろ過ケーキをさらなる水性１Ｎ ＨＣｌ（２００ｍＬ）及びＭＴＢＥ（２００ｍＬ）で洗浄する。有機層を分離して、１Ｎ ＨＣｌで洗浄する（１００ｍＬで２回）。水層をひとまとめにして、５０％ｗ／ｗのＮａＯＨでｐＨを９に調整する。水性混合物をＭＴＢＥで抽出する（２５０ｍＬで３回）。有機層をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過する。ろ液を蒸発させて、真空乾燥させ、赤色固体を与える（６０ｇ）。赤色固体をヘプタン（６００ｍＬ）で希釈し、混合物を２０分間加熱還流する。木炭（２ｇ）を添加して、混合物を珪藻土でろ過する。ろ液を大気圧下で濃縮し、最終容量を３００ｍＬに調整する。溶液を２２℃に冷却して、３時間撹拌する。淡黄色固体をろ過により回収し、一定重量まで真空乾燥させて、表題化合物を与える（４０ｇ、６０％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３０９（Ｍ＋１）。

【0064】

調製１１
５−アリル−６ａ−（２−フルオロフェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソオキサオゾール

【化18】

フローケミストリー反応ステップ：３４３ｍｌのシームレスステンレス鋼管状反応器（Ｏ．Ｄ＝１／８インチ）を、ＧＣオーブン内に入れて、２０ｍＬ／分でトルエンにより２０分間洗浄する。窒素の背圧を加え（７２０ｐｓｉｇ）、ＧＣの温度を２１０℃に設定する。温度が２１０℃に達したら、保持時間１５分を与える連続モードで運転する一対の高圧シリンジポンプを用いて、トルエン（５．８１Ｌ）中の２−（ジアリルアミノ）−１−（２−フルオロフェニル）エタノンオキシム（４８０．５１ｇ、１．７４ｍｏｌ）の溶液を、２２．８６６ｍＬ／分で反応器に送出す。標準原液が全て消費されたら、反応器を２２．８６６ｍＬ／分でトルエンにより３０分間洗浄する。ＧＣオーブンの温度を２５℃に設定して、全ての溶液を採取し、真空濃縮する。溶媒を蒸発させて、残渣を塩化メチレン（２．５Ｌ）及び水（５Ｌ）に溶解する。塩酸でｐＨを１に調整し、水層を分離して、水酸化ナトリウムで中和して、ｐＨを１０に調整する。水層をＭＴＢＥで抽出する（２．５Ｌで３回）。有機抽出物をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して蒸発乾固し、粗製の表題化合物を与え（２４８ｇ、４７％）、さらに精製せずに使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２４９（Ｍ＋１）。

【0065】

調製１２
５−アリル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソオキサオゾール塩酸塩

【化19】

トリフルオロ酢酸（４Ｌ、５２．９ｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１２Ｌ）中の５−アリル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−１−（４−メトキシベンジル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール（１９９０ｇ、４．４５ｍｏｌ）の溶液に一定速度で滴加して、３５℃未満の温度を保持する。添加が終了したら、混合物を３３〜４３℃に昇温させて、６時間撹拌する。ＮａＯＨ（２０％、１０Ｌ）を一定速度で添加して、３５℃未満の温度を保持する。層を分離して、有機層を水（６Ｌ）で洗浄する。溶液を濃縮し、エタノール（１６Ｌ）を添加して、混合物を珪藻土でろ過する。ろ液を濃縮して、ＥｔＯＡｃ（１０Ｌ）を添加する。ＥｔＯＡｃ（８Ｌ）中の４Ｍ ＨＣｌを添加して、得られた固体をろ過し、乾燥させて、表題化合物を与える（１３８５ｇ、８５．６％）。ＥＳｍ／ｚ３２７．１（Ｍ＋１）。

【0066】

調製１３
ベンジル３，３ａ，４，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−５−カルボキシラート

【化20】

ＤＣＭ（３３８ｍＬ）中のベンジルＮ−アリル−Ｎ−［２−ヒドロキシイミノエチル］カルバマート（２４ｇ、９６．６ｍｍｏｌ）の溶液を、次亜塩素酸ナトリウム（１０６．０８ｍｍｏｌ、１４３．０６ｍＬ）の５％ｗ／ｗ水溶液で１０分間かけて滴加処理する。得られた混合物を室温で一晩撹拌する。反応物を重亜硫酸水素ナトリウム（７ｇ）の４０％水溶液でクエンチする。有機層を分離し、硫酸マグネシウムで脱水して真空濃縮する。粗生成物を、ヘキサン中の５％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルで精製して、表題化合物を与える（１８ｇ、７５％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２４７（Ｍ＋Ｈ）。

【0067】

調製１４
ベンジル６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−５−カルボキシラート

【化21】

ｎ−ブチルリチウム（２５．４ｍＬ、４０．６ｍｍｏｌ）の１．６Ｍヘキサン溶液を、ＴＨＦ（６０ｍＬ）中の４−ブロモ−１−フルオロ−２−インドベンゼン（１２．２２ｇ、４０．６ｍｍｏｌ）の−７８℃溶液に滴加して、黄色溶液を与え、−７８℃で１５分間撹拌する。

【0068】

三フッ化ホウ素エーテラート（５．１４ｍＬ、４０．６ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（６０ｍＬ）中のベンジル３，３ａ，４，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−５−カルボキシラート（５ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）の別の−７８℃溶液に添加し、この混合物を−７８℃で５分間撹拌する。この溶液を以前に調製された−７８℃有機リチウム混合物にカニューレで添加する。ひとまとめにした混合物を、−７８℃で３０分間撹拌する。混合物を飽和水性塩化アンモニウムでクエンチし、室温まで昇温させる。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し（３回）、有機抽出物をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して溶媒を真空除去する。シリカゲルを用いた３５分間の５％−１００％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配により粗生成物を精製して、表題化合物を与える（２．２７ｇ、２７％）。ES/MS (m/e): （^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）４２１／４２３（Ｍ＋Ｈ）。

【0069】

調製１５
ベンジル１−（ベンゾイルカルバモチオイル）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−５−カルボキシラート

【化22】

ベンゾイルイソチオシアナート（２．８７ｍＬ、２１．２８ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（９５ｍＬ）中のベンジル６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−５−カルボキシラート（５．９７７ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）の溶液に滴加し、窒素下で一晩撹拌する。溶媒を真空除去する。シリカゲルを用いた３０分間の５％−１００％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配により粗生成物を精製して、表題化合物を与える（６．０５ｇ、７３％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）５８４／５８６（Ｍ＋Ｈ）。

【0070】

調製１６
ベンジル３−（ベンゾイルカルバモチオイルアミノ）−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル)ピロリジン−１−カルボキシラート

【化23】

ベンジル１−（ベンゾイルカルバモチオイル）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール−５−カルボキシラート（６．０５ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）と、亜鉛（粉塵、＜１０ミクロン）（６．７７ｇ、１０３．５ｍｍｏｌ）と、の混合物を、窒素下の酢酸（５２ｍＬ）中、室温で一晩撹拌する。反応物をＥｔＯＡｃで希釈して、珪藻土でろ過する。溶媒を真空除去し、残渣をＥｔＯＡｃ、水、及び飽和水性重炭酸ナトリウムで希釈する。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し（３回）、ひとまとめにした有機層をまとめて、硫酸ナトリウムで脱水して、ろ過して溶媒を真空除去する。シリカゲルを用いた３０分間の５％−１００％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配により粗生成物を精製して、表題化合物を与える（５．２２２ｇ、８６％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）５８６／５８８（Ｍ＋Ｈ）。

【0071】

調製１７
（１−アリル−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル）メタノール

【化24】

炭酸ナトリウムの飽和水溶液を、ＤＣＭ（７Ｌ）中の５−アリル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール塩酸塩（１４００ｇ、３．８５ｍｏｌ）の溶液に添加して、９を超えるｐＨにする。層を分離して、有機抽出物を１．５倍濃縮する。酢酸（１．３８Ｌ）をその溶液に添加して、２Ｌに濃縮する。酢酸（７Ｌ）及び亜鉛粉（２．５ｋｇ、３８．５ｍｏｌ）を添加して、混合物を４０〜５０℃に加熱し、３時間撹拌する。ＥｔＯＡｃ（９．８Ｌ）を添加し、混合物を珪藻土でろ過する。ろ過ケークをＥｔＯＡｃ（４Ｌ）で洗浄する。ろ液を分離して、ひとまとめにした有機物に水（７Ｌ）を添加する。水酸化アンモニウムを添加して、９を超えるｐＨにする。層を分離して、有機層を２Ｌに濃縮する。エタノール（２．８Ｌ）を添加して、溶液を２Ｌに濃縮する。エタノール（１９Ｌ）を添加して、混合物を珪藻土でろ過し、表題化合物のエタノール溶液を与え、さらに精製せずに使用する。

【0072】

調製１８
［１−アリル−４−アミノ−４−（３−ブロモフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール

【化25】

酢酸（４００ｍＬ）中の５−アリル−６ａ−（３−ブロモフェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール（４０ｇ、１２９．４ｍｍｏｌ）の２２℃溶液を、亜鉛粉塵（４２．３ｇ、６４６．８ｍｍｏｌ）で一度に処理する。反応物を室温で１時間、激しく撹拌する。ＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）を添加して、混合物を珪藻土でろ過する。ろ液を蒸発させて、残渣を真空乾燥する。残渣を水（３００ｍＬ）及びＭＴＢＥ（３００ｍＬ）に分配する。５０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウムでｐＨを８に調整し、有機層を分離して、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過する。ろ液を蒸発させて、残渣を真空濃縮し、表題化合物を与える（４１ｇ、９７％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３１１（Ｍ＋１）。

【0073】

調製１９
１−アリル−４−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール

【化26】

亜鉛粉塵（５９０ｇ、９ｍｏｌ）を、メタノール（２．８５Ｌ）と飽和塩化アンモニウム水溶液（３．５６Ｌ）との混合物中の５−アリル−６ａ−（２−フルオロフェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソオキサゾール（３５５９ｇ、１．２９ｍｏｌ）の溶液に添加して、混合物を７０℃で１６時間加熱する。反応物を６０℃に冷却し、ＴＨＦ（２．８５Ｌ）で希釈して、高温のまま珪藻土でろ過する。ろ液を蒸発して有機溶媒を除去し、水性混合物を１０％ｗ／ｗクエン酸水溶液（４Ｌ）及びＥｔＯＡｃ（３．５Ｌ）で希釈する。有機層を分離して、水層をＥｔＯＡｃで抽出する（２Ｌで２回）。水層を５０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウムで中和してｐＨを１０に調整し、その後、ＥｔＯＡｃで抽出する（１．５Ｌで２回）。有機抽出物をひとまとめにし、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して蒸発乾固し、粗製の表題化合物を与える（２９９ｇ、９２％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２５１（Ｍ＋１）。

【0074】

調製２０
［（３Ｓ，４Ｒ）−１−アリル−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル］アンモニウム；（２Ｓ，３Ｓ）−４−ヒドロキシ−２，３−ビス［（４−メチルベンゾイル）オキシ］−４−オキソ−ブタノアート

【化27】

ジ−ｐ−トルオイル−Ｌ−酒石酸一水和物（１．０４ｋｇ、２．６９ｍｏｌ）を、エタノール（２１Ｌ）中の（１−アリル−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル）メタノール（１２６４ｇ、３．８５ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。混合物を６５〜７５℃に加熱して、３時間撹拌する。混合物を５〜１０℃に冷却し、［（３Ｓ，４Ｒ）−１−アリル−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル］アンモニウム；（２Ｓ，３Ｓ）−４−ヒドロキシ−２，３−ビス［（４−メチルベンゾイル）オキシ］−４−オキソ−ブタノアート（１．０ｇ）の種結晶を添加して、混合物を３時間撹拌する。その固体をろ過し、ろ過ケークを低温エタノール（１．４Ｌ）で洗浄する。ろ過ケークを乾燥させて、表題化合物を白色固体として与える。２番目に溶出する異性体のキラル分析：カラム IC Chiralpak、４．６ｍｍ^＊２５０ｍｍ^＊５μｍ；溶離液 ９０％ヘキサン（０．３％ジエチルアミン）：１０％エタノール（０．３％ジエチルアミン）；流速 ＵＶ２７０ｎｍで１．０ｍＬ／分、によって、Ｒ_ｔ＝７．４分の鏡像異性体に富む(９９％ｅｅ)鏡像異性体が確証される(１０５０ｇ、３８％)。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ： ２．４０（ｓ， ６Ｈ）， ３．０５−３．０４（ｍ， １Ｈ）， ３．５７−３．３１（ｍ， ３Ｈ）， ３．６６−３．５８（ｍ， ４Ｈ）， ３．７５−３．７４（ｍ， ２Ｈ）， ５．３８−５．３６（ｍ， １Ｈ）， ５．５０−５．４６（ｍ， １Ｈ）， ５．８８（ｓ， ２Ｈ）， ５．９７−５．９１（ｍ， １Ｈ）， ７．１０−７．０５（ｍ， １Ｈ）， ７．２９（ｄ， Ｊ＝８．０ Ｈｚ， ４Ｈ）， ７．５３−７．５１（ｍ， １Ｈ）， ７．８０−７．７８（ｍ， １Ｈ）， ８．０１（ｄ， Ｊ＝８．０ Ｈｚ， ４Ｈ）。

【0075】

調製２１
［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール；２，３−ビス［（４−メチルベンゾイル）オキシ］ブタンジオン酸

【化28】

１−メトキシ−２−プロパノール（１．１３Ｌ）中のジ−ｐ−トルオイル−Ｌ−酒石酸（３４８．６ｇ、８８４ｍｍｏｌ）の溶液を、予め４０℃に加熱された１−メトキシ−２−プロパノール（１．１３Ｌ）中の［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール（２２５．９ｇ、９０２ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。反応物を２２℃に冷却し、１８時間撹拌する。白色固体をろ過により回収して、１−メトキシ−２−プロパノール（６００ｍｌ）で洗浄する。回収され固体を乾燥させて、表題化合物を与える（１８３．０１ｇ、３１．８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２５１（Ｍ＋１）。

【0076】

調製２２
［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（３−ブロモフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール；（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ビス［（４−メチルベンゾイル）オキシ］ブタンジオン酸

【化29】

イソプロピルアルコール（９１４ｍＬ）中の［１−アリル−４−アミノ−４−（３−ブロモフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール（７７ｇ、２３５ｍｍｏｌ）の溶液を、７０℃に加熱する。ジ−ｐ−トルオイル−Ｌ−酒石酸（８６．２ｇ、２２３ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を２時間の間に２２℃まで冷却して、一晩撹拌する。スラリーをろ過して、淡黄色固体を回収し、イソプロピルアルコールで洗浄する。その固体を真空乾燥して、表題化合物を与える（６３ｇ、３６％）。ES/MS (m/e): 311 (M+1)。生成物を逆相クロマトグラフィーによって分析する：最初に溶出する異性体の分析（カラム Chiralpak ID-3 ４．６×５０ｍｍ;溶離液 ７０：３０ ２０ｍＭ水性重炭酸アンモニウム：アセトニトリル；流速 ＵＶ２１５ｎｍで１．５ｍＬ／分）によって、Ｒ_ｔ＝１．２６分の鏡像異性体に富む（９６％ｅｅ）鏡像異性体が確証される。

【0077】

調製２３
（（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル）メタノール

【化30】

１Ｎ ＨＣｌ（５００ｍＬ、５００ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）中の［（３Ｓ，４Ｒ）−１−アリル−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル］アンモニウム;（２Ｓ，３Ｓ）−４−ヒドロキシ−２，３−ビス［（４−メチルベンゾイル）オキシ］−４−オキソ−ブタノアート（１００ｇ、１３９．４ｍｍｏｌ）の０℃溶液に添加する。混合物を１時間撹拌する。水層を分離して、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを８に調整する。水層をＥｔＯＡｃで抽出する（３５０ｍＬで２回）。有機層をひとまとめにして、水（５００ｍＬ）で洗浄し、濃縮して表題化合物を与える（４０ｇ、８７％）。２番目に溶出する異性体のキラル分析：カラム IC Chiralpak,４．６ｍｍ^＊２５０ｍｍ^＊５μｍ；溶離液 ９０％ヘキサン（０．３％ジエチルアミン):１０％エタノール（０．３％ジエチルアミン）；流速 ＵＶ２７０ｎｍで１．０ｍＬ／分、によって、Ｒ_ｔ＝７．４分の鏡像異性体に富む（９９．７％ｅｅ）鏡像異性体が確証される．^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３ δ： ２．７８−２．７０（ｍ， ５Ｈ）， ３．１６−３．００（ｍ， ３Ｈ）， ３．８７−３．７５（ｍ， １Ｈ）， ３．９０−３．８４（ｍ， １Ｈ）， ５．２４−５．１１（ｍ， ２Ｈ）， ５．９１−５．８７（ｍ， １Ｈ）， ６．９５−６．９１（ｍ， １Ｈ）， ７．３５−７．３２（ｍ， １Ｈ）， ７．６７− ７．６５ （ｍ， １Ｈ）。

【0078】

調製２４
［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール

【化31】

［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール；２，３−ビス［（４−メチルベンゾイル）オキシ］ブタンジオン酸（２１１ｇ、３３１ｍｍｏｌ）を、水（２．１Ｌ）及びＥｔＯＡｃ（２．３Ｌ）に溶解する。３５％ｗ／ｗ塩酸を添加して、ｐＨを１に調整する。水層を分離して、５０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウムでｐＨを１０に調整し、ＥｔＯＡｃで抽出する（２回)。水性ＮａＯＨで水層のｐＨを１０に調整して、水溶液のｐＨをｐＨ＝１０に保持しながら、ＭＴＢＥで抽出する（３回)。有機抽出物をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して蒸発乾固し、粗表題化合物を与える（７３ｇ、８８％、９４．８％ｅｅ）。生成物をキラルクロマトグラフィーによって分析する:カラム ＡＳ−Ｈ、溶離液 １０％イソプロピルアルコール、２％イソプロピルアミン；流速 ＵＶ２２０で３ｍＬ／分；圧力 ３５℃で１００バール、によって、表題化合物を２番目に溶出する異性体Ｒ_ｆ＝２．２６分として与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２５１ （Ｍ＋１）。

【0079】

調製２５
Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−１−アリル−３−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル)カルバモチオイル）ベンズアミド

【化32】

ベンゾイルイソチオシアナート（１５．０ｇ、９１．９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（４００ｍＬ）中の（（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル）メタノール（３０ｇ、９１．１ｍｍｏｌ）の０℃溶液に添加する。溶液を２５℃に昇温させ、１時間撹拌して、表題化合物のＴＨＦ溶液を与え、さらに精製せずに使用する。

【0080】

調製２６
［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（３−ブロモフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール

【化33】

［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（３−ブロモフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール;（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ビス［（４−メチルベンゾイル）オキシ］ブタンジオン酸（６３ｇ、８５．８ｍｍｏｌ）を水性１Ｎ ＨＣｌ（８００ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）と混和して、混合物を２２℃で１５分間撹拌する。層を分離して、水層のｐＨを５０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウムで１０に調整する。水性混合物をＭＴＢＥで抽出する（２５０ｍＬで３回）。ひとまとめにした有機層を、硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過して蒸発乾固し、表題化合物を与える（２７ｇ、９９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３１１（Ｍ＋１）。

【0081】

調製２７
Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（３−ブロモフェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化34】

ＴＨＦ（２７０ｍＬ）中の［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（３−ブロモフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール（２７ｇ；８６．７ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下で−５℃に冷却する。温度を０℃未満に保持しながら、ベンゾイルイソチオシアナート（１２．３ｍＬ、９１ｍｍｏｌ）を滴加する。反応物を１時間放置して２２℃に昇温させる。１，１’−カルボニルジイミダゾール（２８．１ｇ、１７３．５ｍｍｏｌ）を一度に添加して、反応物を２２℃で１時間撹拌し、その後、１６時間、加熱還流する。溶媒を真空除去して、残渣を真空乾燥させる。粗製の材料をＭＴＢＥ（５００ｍＬ）及び水（２５０ｍＬ）に分配する。有機層を分離して、硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過して蒸発乾固する。シリカゲルを用いた９０／１０から６０／４０へのＤＣＭ／ＥｔＯＡｃ勾配により粗製の材料を精製して、表題化合物を与える（２７ｇ、６８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４５６（Ｍ＋１）。

【0082】

調製２８
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル)ベンズアミド二塩酸塩

【化35】

トリフェニルホスフィン（３６．８ｇ、１４０．３ｍｍｏｌ）をＮ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−１−アリル−３−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル）カルバモチオイル）ベンズアミド（９１．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４００ｍＬ）溶液に添加する。ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のジ−ｔ−ブチルアゾジカルボキシラート（３１．６ｇ、１３７．２ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を２０〜３０℃で２時間撹拌する。混合物を濃縮し、ＭＴＢＥ（４００ｍＬ）を添加する。その溶液を珪藻土でろ過し、ケークをＭＴＢＥ（１３０ｍＬ）で洗浄する。ろ液をひとまとめにして、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）中の１Ｎ ＨＣｌを添加する。混合物を２時間撹拌し、その後、５００ｍＬに濃縮する。ＭＴＢＥ（３２０ｍＬ）を添加して、溶液をろ過し、ヘプタン（１３０ｍＬ）で洗浄する。固体をＥｔＯＡｃ（６５０ｍＬ）でスラリーにして、５０〜６０℃で２時間撹拌する。高温のスラリーをろ過して、固体をＥｔＯＡｃ（１３０ｍＬ）及びヘプタン（１３０ｍＬ）で洗浄する。固体をＥｔＯＡｃ（６５０ｍＬ）で再度スラリーにして、５０〜６０℃で２時間撹拌する。高温のスラリーをろ過して、ＥｔＯＡｃ（１３０ｍＬ）及びヘプタン（１３０ｍＬ）で洗浄する。固体を乾燥させて、表題化合物を二塩酸塩として与える（４０ｇ、８０％、９９．５％ｅｅ）。最初に溶出する異性体のキラル分析：カラム IC Chiralpak、４．６ｍｍ^＊２５０ｍｍ^＊５μｍ；溶離液 ８５％ヘキサン（０．１％ジエチルアミン）：１５％イソプロピルアルコール（０．１％ジエチルアミン）；流速 ＵＶ２８２ｎｍで１．０ｍＬ／分、によってＲ_ｔ＝１２．５分の鏡像異性体に富む（９９．５％ｅｅ）鏡像異性体が確証される。

【0083】

調製２９
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（２−フルオロ−５−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）フェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド

【化36】

１５％炭酸ナトリウム（４４０ｍＬ）を、ＥｔＯＡｃ（３Ｌ）及び水（７８４ｍＬ）中のＮ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル)ベンズアミド二塩酸塩（４９５ｇ、７１７．８８ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。混合物を１〜２時間撹拌する。層を分離して、有機層をシリカゲル（４０ｇ）でろ過して、ＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）で洗浄する。ろ液を濃縮乾固し、Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミドを与える。トリフルオロアセトアミド（１３６．７ｇ、１．２１ｍｏｌ）、ＮａＩ（１８２．５ｇ、１．２２ｍｏｌ）、４Ａモレキュラーシーブ（３４２ｇ）、及びＫ_２ＣＯ_３（１７０．９ｇ、１．２４ｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（５２５ｍＬ）及び１，４−ジオキサン（１．０２５Ｌ）中のＮ−（（４ａＲ、７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル)ベンズアミド（３４１ｇ、４９４．５４ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。ＤＭＳＯ（５００ｍＬ）中のトランス−Ｎ，Ｎ’−ジメチルシクロヘキサン（８１．６ｇ、５７３．６６ｍｍｏｌ）及びヨウ化銅（２７．３ｇ、１４３．３４ｍｍｏｌ）を、反応混合物に添加する。混合物を５分間撹拌する。混合物を１００℃に昇温させて、８時間撹拌し、２４℃に冷却する。水（５．９Ｌ）及びＤＣＭ（５．９Ｌ）を添加して混合物をろ過し、層を分離する。有機層を水（５．９Ｌ）で洗浄して、ＤＣＭの溶液中の表題化合物を得て、さらに精製せずに使用する。

【0084】

調製３０
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル)ベンズアミド塩酸塩

【化37】

水酸化ナトリウム（２８．７ｇ）及び水（２．７Ｌ）を、Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（２−フルオロ−５−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド)フェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド（２５０ｇ、４９４．４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液に添加して、混合物を２４℃で６８時間撹拌する。１Ｎ ＨＣｌ（３．５Ｌ）を添加して、１〜３のｐＨを得る。層を分離して、水層を（６８０ｍＬ）で洗浄する。ＤＣＭ（４Ｌ）を水層に添加し、続いて２１％水酸化アンモニウムを添加して、８〜１０のｐＨを得る。層を分離して、有機層をひとまとめにし、シリカゲル（１７０ｇ）でろ過して、ＤＣＭ（１．４Ｌ）で洗浄する。溶媒を濃縮乾固し、ＥｔＯＡｃ（４Ｌ）で希釈する。ＥｔＯＡｃ（７００ｍＬ）中の１Ｎ ＨＣｌを２５℃未満の温度で添加して、混合物を１時間撹拌する。混合物を約７〜８倍に濃縮して、ＥｔＯＡｃ（２．８Ｌ）を添加する。得られた沈殿物をろ過し、ＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）で洗浄する。その固体を乾燥させて、表題化合物を与える（２４６ｇ、５２％）。

【0085】

調製３１
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アセトアミド−２−フルオロフェニル）−６−アリル−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド

【化38】

無水酢酸（２３．５ｇ、０．２３ｍｏｌ）を、ＤＣＭ（８００ｍＬ）中のＮ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド塩酸塩（１００ｇ、０．１５３ｍｏｌ）及びトリエチルアミン（５４．３ｇ、０．５３５ｍｏｌ）の溶液に添加する。２０〜２５℃で１時間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ_３（７００ｍＬ）及び水（６００ｍＬ）を添加する。層を分離して、表題化合物を与え、さらに精製せずにＤＣＭ中の溶液として使用する。

【0086】

調製３２
Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化39】

ＴＨＦ（２、３Ｌ）中の［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール（１２９，７ｇ、４１４ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下で０℃に冷却する。５℃未満の温度に保持しながら、ベンゾイルイソチオシアナート（６１．５ｍＬ、４５６ｍｍｏｌ）を添加する。反応物を３時間かけて室温まで昇温させて、１，１’−カルボニルジイミダゾール（８７．４ｇ、５３８．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を２２℃で１時間撹拌した後、７０℃で１６時間加熱する。反応混合物を２２℃に冷却して、溶媒を蒸発させる。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）及び水（１Ｌ）に分配する。有機層を分離して、水層をＥｔＯＡｃで抽出する（４００ｍＬで２回）。有機層をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して蒸発乾固し、粗製の表題化合物を与える。０−４０％ＤＣＭのＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって粗生成物を精製して、残留溶媒を含む表題化合物を淡黄色固体として与える（１７０ｇ、９９％）。ES/MS (m/e): 396 (M+1)。

【0087】

調製３３
ベンジル２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート

【化40】

１，１’−カルボニルジイミダゾール（２．８７ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５２ｍＬ）中のベンジル３−（ベンゾイルカルバモチオイルアミノ）−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシラート（５．１９８ｇ、８．８６ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。混合物を室温で１．５時間撹拌し、その後、反応物を窒素下で一晩、加熱還流する。反応物を冷却し、水で希釈して、ＥｔＯＡｃで抽出する（３回)。有機層をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して溶媒を真空除去する。シリカゲルを用いた３０分間の５％−１００％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配により粗生成物を精製して、表題化合物を与える（２．９３ｇ、５８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）。５６８／５７０（Ｍ＋Ｈ）。

【0088】

調製３４
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アセトアミド−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド

【化41】

トリフェニルホスフィン（４．０ｇ、０．０１５ｍｏｌ）及び１，３−ジメチルバルビツール酸（１５．２ｇ、０．０９７ｍｏｌ）を、Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アセトアミド−２−フルオロフェニル）−６−アリル−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル)ベンズアミド（０．１５３ｍｏｌ）のＤＣＭ溶液に添加する。酢酸パラジウム（１．７ｇ、７．７ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を２０〜３０℃で１時間撹拌する。２５％水酸化アンモニウムを添加して、層を分離する。有機層をＨＯＡｃ（水５００ｍＬ中３．０当量）で洗浄し、２５％水酸化アルミニウムでｐＨを８〜９に調整する。水層をＤＣＭで抽出する（５００ｍＬで２回）。有機抽出物をひとまとめにして、３〜４倍に濃縮する。ＭＴＢＥ（１Ｌ）を添加して、混合物をろ過する。混合物を濃縮し、ヘプタン（１Ｌ）を添加する。得られた固体をろ過し、回収して乾燥させ、表題化合物を与える（４８ｇ、７６％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ： ２．１５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．８７−２．８３（ｍ， １Ｈ）， ３．４３−３．２３（ｍ， ５Ｈ）， ３．７０−３．６７（ｍ， １Ｈ）， ７．１２−７．０７ （ｍ， １Ｈ）， ７．２８−７．２７ （ｍ， １Ｈ）， ７．５２−７．４１（ｍ， ４Ｈ）， ７．７９（ｍ， １Ｈ）， ８．１８−８．１６（ｍ， ２Ｈ）． ＥＳ ｍ／ｚ ４１３．１ （Ｍ＋１）。

【0089】

調製３５
Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（３−ブロモフェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル]ベンズアミド

【化42】

クロロホルム（２２ｍＬ）中のＮ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（３−ブロモフェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル]ベンズアミド（１ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルバルビツール酸（０．８６８ｇ、５．４８ｍｍｏｌ）の室温混合物を、室温で５分間、得られたスラリーに窒素をバブリングすることによって脱気する。混合物をテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．２６１ｇ、２１９μｍｏｌ）で処理して、窒素下で１．５時間撹拌する。別のフラスコで、クロロホルム（４８６ｍＬ）中のＮ−［（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（３−ブロモフェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル]ベンズアミド（２２．２ｇ、４８．６ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチルバルビツール酸（１９．２８ｇ、１２１．６ｍｍｏｌ）との混合物を、室温で５分間、得られたスラリーを窒素でバブリングすることによって脱気する。混合物をテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（５．７９ｇ、４．８６ｍｍｏｌ）で処理して、窒素下で２時間撹拌する。２種の反応物をひとまとめにして、溶媒を真空除去し、粗生成物を与える。シリカゲルを用いた３０分間の０．５％−１０％ＤＣＭ中メタノール勾配により粗製の材料を精製して、表題化合物を与える（２２．４ｇ、１００％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）４１６／４１８（Ｍ＋Ｈ）。

【0090】

調製３６
Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（２−フルオロフェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化43】

２−メルカプト安息香酸（１２２ｇ、７９３ｍｍｏｌ）、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（４．１５ｇ、７．２１ｍｍｏｌ）、及び１，４−ビス（ジフェニルホシフィノ）ブタン（３．１４ｇ、７．２１ｍｍｏｌ）を、無水２−メチルテトラヒドロフラン（１．９６Ｌ）中のＮ−［（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル]ベンズアミド（１７８．２１ｇ、３６０ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素下で添加する。溶液を３回の真空／窒素サイクルで脱気し、その後１５分間、窒素を反応物にバブリングする。反応物に窒素をバブリングしながら、反応混合物を４０℃に加熱する。反応物が４０℃に達したら、バブリングを除去して、反応混合物を窒素雰囲気下、４０℃で３時間撹拌する。反応物を２２℃に冷却して、水（２Ｌ）で希釈する。ＨＣｌ（５Ｍ）溶液を添加して、ｐＨを１に調整する。水層を分離して、さらなるＥｔＯＡｃで洗浄する（８００ｍＬで２回）。５０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウムで水層のｐＨを１０に調整し、その後、ＥｔＯＡｃ（１０Ｌ）で抽出する。水層をさらなるＥｔＯＡｃで洗浄する（７５０ｍＬで２回）。有機抽出物をひとまとめにして、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水してろ過し、蒸発乾固して、粗製の表題化合物を淡黄色固体として与える（１２４．７ｇ、９７％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３５６（Ｍ＋１）。

【0091】

調製３７
Ｎ−（７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化44】

ヨードトリメチルシラン（２．２１ｍＬ、１５．４６ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（４４ｍＬ）中のベンジル２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート（２．９３ｇ、５．１５ｍｍｏｌ）の室温溶液に滴加する。反応物を室温で２時間撹拌し、溶媒を真空除去する。３：１ ＤＣＭ：メタノールと、その後に２：１ ＤＣＭ：７Ｎメタノール中アンモニアを用いてＳＣＸカラムにより粗生成物を精製し、表題化合物を与える（２．０９８ｇ、９４％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）４３４／４３６（Ｍ＋Ｈ）.

【0092】

調製３８
ｔｅｒｔ−ブチル（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−（３−ブロモフェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート

【化45】

ＤＣＭ（３６７ｍＬ）中のＮ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（３−ブロモフェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（２２．４ｇ、３６．６９ｍｍｏｌ）の室温溶液を、ジ−ｔ−ブチルジカルボナート（８．８１ｇ、４０．３６ｍｍｏｌ）と、その後のトリエチルアミン（７．６７ｍＬ、５５．０４ｍｍｏｌ）で処理し、反応物を窒素下、室温で１時間撹拌する。溶媒を真空除去し、シリカゲルを用いた２５分間の５％−１００％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配により粗生成物を精製して、表題化合物を与える（２０．２２ｇ、１００％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）５１６／５１８（Ｍ＋Ｈ）。

【0093】

調製３９
ｔｅｒｔ−ブチル２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート

【化46】

ジ−ｔ−ブチルジカルボナート（１．１６ｇ、５．３１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．０１ｍＬ、７．２５ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（４８ｍＬ）中のＮ−［７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル]ベンズアミド（２．０９８ｇ、４．８３ｍｍｏｌ）溶液に添加する。反応物を窒素下、室温で１時間撹拌する。溶媒を真空除去し、シリカゲルを用いた３０分間の５％−１００％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配により粗生成物を精製して、表題化合物を与える（２．５５６ｇ、９９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）５３４／５３６（Ｍ＋Ｈ）。

【0094】

調製４０
ｔｅｒｔ−ブチル（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（３−アミノフェニル）−２−ベンズアミド−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート

【化47】

エタノール（１００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−（３−ブロモフェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート（５ｇ、９．７ｍｍｏｌ）及びｔｒａｎｓ−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，２−シクロヘキサンジアミン（２２０．３ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）の溶液を、アジ化ナトリウム（１．３０ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）で処理する。Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム塩（０．６６Ｍ、３．２ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ）及び水（１０ｍＬ）の水溶液を添加して、フラスコの最上部に窒素をパージする。混合物を硫酸銅（ＩＩ）五水和物（０．３３Ｍ、３．２ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ）の水溶液で処理して、混合物を直ちに、８０℃に予熱されたホットプレート上、窒素下で１．５時間加熱する。均質混合物を加熱によって得る。反応物を冷却して、氷水を添加する。混合物をＥｔＯＡｃで抽出する（３回）。有機層をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して溶媒を真空除去し、粗製のアジ化生成物を与える。粗製のアジ化生成物を低温エタノール（１５０ｍＬ）中の１０％パラジウム／炭素（２ｇ）と混和して、真空／窒素と、その後に真空／水を用いて、混合物をパージする。混合物を３０ｐｓｉの水素の下、室温で２時間撹拌する。反応物を通気して、ＤＣＭを用いて混合物を珪藻土でろ過し、ろ過ケークをすすぐ。ろ液から溶媒を真空除去して、シリカゲルを用いた５０％のＤＣＭ中ＥｔＯＡｃによって粗生成物を精製して、表題化合物を与える（４ｇ、９１％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４５３（Ｍ＋Ｈ）。

【0095】

調製４１
ｔｅｒｔ−ブチル７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−２−ベンズアミド−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート

【化48】

エタノール（５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート（２．５５６ｇ、４．８ｍｍｏｌ）及びｔｒａｎｓ−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，２−シクロヘキサンジアミン（１５０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液を、アジ化ナトリウム（９３３ｍｇ、１４．３ｍｍｏｌ）で処理する。Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム塩（０．６６Ｍ、３．２ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ）及び水（１ｍＬ）の水溶液を添加して、フラスコの最上部に窒素をパージする。混合物を硫酸銅（ＩＩ）五水和物（０．３３Ｍ、３．２ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ）の水溶液で処理して、混合物を直ちに、８０℃に予熱されたホットプレート上、窒素下で１．５時間加熱する。均質混合物を加熱によって得る。反応物を冷却して、氷水を添加し、混合物をＥｔＯＡｃで抽出する（３回）。有機層をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して溶媒を真空除去し、粗製のアジ化生成物を与える。粗製のアジ化生成物を低温エタノール（１５０ｍＬ）中の１０％パラジウム／炭素（１ｇ）と混和して、混合物を真空／窒素と、その後に真空／水を用いてパージする。混合物を３０ｐｓｉの水素の下、室温で５時間撹拌する。反応物を通気して、珪藻土でろ過し、ろ過ケークをＤＣＭですすぐ。ろ液から溶媒を真空除去して、シリカゲルを用いて５０％のＤＣＭ中ＥｔＯＡｃによって粗生成物を精製して、表題化合物を与える（２．０１４ｇ、８９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４７１（Ｍ＋Ｈ）。

【0096】

調製４２
ｔｅｒｔ−ブチル（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−［３−［（５−フルオロピリジン−２−カルボニル）アミノ]フェニル］−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート

【化49】

ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）を含有するＤＣＭ（４ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（３−アミノフェニル）−２−ベンズアミド−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート（９３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、５−フルオロピリジン−２−カルボン酸（３１．９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（５６．７ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（４０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）のスラリーを、ＤＩＰＥＡ（１７９．２μＬ、１．０３ｍｍｏｌ）で処理して、得られた混合物を室温で一晩撹拌する。反応混合物をＤＣＭ（５ｍＬ）及び飽和水性重炭酸ナトリウム（１５ｍＬ）で希釈する。有機層を分離して、飽和水性塩化ナトリウム（１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水して、ろ過して溶媒を真空除去し、粗製の表題化合物を与える（１０５ｍｇ、８９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：５７６（Ｍ＋Ｈ）。

【0097】

調製４３
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−５−フルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド;２，２，２−トリフルオロ酢酸

【化50】

ｔｅｒｔ−ブチル（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−７ａ−［３−［（５−フルオロピリジン−２−カルボニル）アミノ］フェニル］−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート（１０５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解して、トリフルオロ酢酸（５００μＬ、６．６ｍｍｏｌ）で処理する。得られた黄色溶液を室温で４時間撹拌し、溶媒を真空除去して、粗製の表題生成物を与える（１９０ｍｇ、１００％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４７６（Ｍ＋Ｈ）。

【0098】

調製４４
Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（３−アミノフェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル]ベンズアミド

【化51】

トリフルオロ酢酸（２５ｍＬ）を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（３−アミノフェニル）−２−ベンズアミド−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート（４ｇ、８．８４ｍｍｏｌ）の溶液に添加して、混合物を窒素下で４時間撹拌する。溶媒を真空除去して、粗生成物を３：１ ＤＣＭ：メタノールと、その後に２：１ ＤＣＭ：７Ｎのメタノール中アンモニアを用いてＳＣＸカラムにより精製し、表題化合物を与える（２．４９ｇ、８０％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３５３（Ｍ＋Ｈ）。

【0099】

調製４５
Ｎ−［７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化52】

トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を、ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−２−ベンズアミド−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボキシラート（２．０１３ｇ、４．２８ｍｍｏｌ）の溶液に添加して、混合物を窒素下、室温で４時間撹拌する。溶媒を真空除去して、粗生成物を３：１ ＤＣＭ：メタノールと、その後に２：１ ＤＣＭ：７Ｎのメタノール中アンモニアを用いてＳＣＸカラムにより精製し、表題化合物を与える（１．５５５ｇ、９８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３７１（Ｍ＋Ｈ）。

【0100】

調製４６
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（３−アミノフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル]ベンズアミド

【化53】

１，４−ジオキサン（６０ｍＬ）中のＮ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（３−アミノフェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（２．４９ｇ、７．０６ｍｍｏｌ）、５−フルオロ−２−クロロピリミジン（３．７４ｇ、２８．２６ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（６．１６ｍＬ、３５．３２ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素下で４時間、加熱還流する。反応物を冷却し、水で希釈して、ＥｔＯＡｃで抽出する（３回）。ひとまとめにした有機抽出物を硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して溶媒を真空除去し、粗生成物を与える。シリカゲルを用いた２５分間の５％−１００％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配により粗生成物を精製して、表題化合物を与える（２．５１ｇ、７９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４４９（Ｍ＋Ｈ）。

【0101】

調製４７
Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化54】

Ｎ−メチルピロリジン（９９７ｍＬ）中のＮ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（２−フルオロフェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル]ベンズアミド（１２４．７ｇ、２５６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（６７ｍＬ）、５−フルオロ−２−クロロピリミジン（２９．３ｍｌ、３０７ｍｍｏｌ）の溶液を、１６時間の間、１００℃まで加熱する。反応物を２２℃に冷却して、温度を１５℃未満に保持しならが、１０℃の冷却水（１０Ｌ）に注ぐ。淡いクローム色の固体をろ過により回収して、さらなる水で洗浄する。湿性固体をＥｔＯＡｃ（２Ｌ）に溶解して、分液漏斗に移す。５％ｗ／ｗ塩化ナトリウム水溶液（１Ｌ）を添加して、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで脱水してろ過し、ろ液を減圧下で蒸発させる。０−４０％のＥｔＯＡｃ／イソヘキサン勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって生成物を精製して、表題化合物を淡黄色固体として与える（１１６ｇ、７０％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４５２（Ｍ＋１）。

【0102】

調製４８
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アセトアミド−２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド

【化55】

２−クロロ−５−フルオロピリミジン（２８．９ｇ、２１８ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（３３．４６ｇ、２４２．１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１００ｍＬ）中のＮ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アセトアミド−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド（５０ｇ、１２１．２２ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。混合物を８時間の間、８０〜８５℃に加熱する。混合物を２４℃まで冷却してろ過し、ＤＭＦ（１００ｍＬ）で洗浄する。固体を水（２Ｌ）でスラリーにしてろ過し、表題化合物を得る（６８．５ｇ、９８％）。ＬＣ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝５０９．２ （Ｍ＋１）＋，^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δｐｐｍ １．２２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２８ Ｈｚ， ２ Ｈ） １．９２ − ２．０７ （ｍ， ６ Ｈ） ２．８９ − ３．２０ （ｍ， ２ Ｈ） ３．３６ − ３．４４ （ｍ， １ Ｈ） ３．６７ （ｔ， Ｊ＝９．５４ Ｈｚ， １ Ｈ） ３．８４ （ｂｒ． ｓ．， １ Ｈ） ４．１６ （ｂｒ． ｓ．， ２ Ｈ） ７．２３ （ｂｒ． ｓ．， ２ Ｈ） ７．３５ − ７．６１ （ｍ， ８ Ｈ） ７．７７ （ｂｒ． ｓ．， ２ Ｈ） ７．８５ − ８．１８ （ｍ， ４ Ｈ） ８．４８ （ｓ， ４ Ｈ） １０．１５ （ｂｒ． ｓ．， １ Ｈ） １０．４６ − １０．５９ （ｍ， １ Ｈ）。

【0103】

調製４９
（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン

【化56】

水酸化リチウム（８．６ｇ、２０４．９ｍｍｏｌ）を、メタノール（４００ｍＬ）中のＮ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アセトアミド−２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル)ベンズアミド（８０ｇ、１５７．３ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。混合物を４時間の間、６０〜７０℃に加熱する。濃ＨＣｌ（１３２ｇ）を添加して、混合物を５５℃で１８時間撹拌する。混合物を３０℃に冷却して、濃縮してメタノールを除去する。水を添加し、水層をＤＣＭで抽出し（３回)、総重量の５．６％が表題化合物となる水溶液９２０ｇとして表題化合物を得て、さらに精製せずに使用する。

【0104】

調製５０
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−５−フルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド

【化57】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−５−フルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド；２，２，２−トリフルオロ酢酸（１５０ｍｇ、２５４μｍｏｌ）、５−フルオロ−２−クロロピリミジン（６８ｍｇ、５１μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（９８μＬ、５６μｍｏｌ）の溶液を、ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中、４０℃で一晩加熱する。追加の５−フルオロ−２−クロロピリミジン（６８ｍｇ、５１μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（９８μＬ、５６μｍｏｌ）を添加して、混合物を５０℃で一晩加熱する。追加の５−フルオロ−２−クロロピリミジン（６８ｍｇ、５１μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（９８μＬ、５６μｍｏｌ）を添加して、混合物を５０℃で三晩目に一晩、加熱する。反応物を冷却し、飽和水性炭酸ナトリウム（５０ｍＬ）で希釈して、スラリーを与え、それをろ過して５０℃の真空オーブンで４時間乾燥させて、表題化合物を与える（６０ｍｇ、４１％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４４９（Ｍ＋Ｈ）。

【0105】

別の調製５０
Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（３−アミノフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（２８２ｍｇ、６２８．７３μｍｏｌ）及び５−フルオロピリジン−２−カルボン酸（１０６．４６ｍｇ、７５４．４７μｍｏｌ）を、ＤＣＭ（３ｍＬ）及びジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中で混和する。ＨＯＢＴ（１１２．７０ｍｇ、８１７．３５μｍｏｌ）と、その後、ＥＤＣＩ（１５９．０７ｍｇ、８１７．３５μｍｏｌ）を添加して、得られた混合物を窒素下、室温で５時間撹拌する。反応混合物を水で希釈して、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを約１２に調整する。混合物をＥｔＯＡｃで抽出する（３回）。有機抽出物をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して溶媒を真空除去し、粗生成物を与える。シリカゲルを用いた２０分間の５％−１００％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配によって粗生成物を精製して、表題化合物を与える（３２７ｍｇ、９１％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：５７１（Ｍ＋Ｈ）。

【0106】

調製５１
Ｎ−［７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化58】

Ｎ−［７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル]ベンズアミド（７０５ｍｇ、１．９０ｍｍｏｌ）、５−フルオロ−２−クロロピリミジン（１．０１ｇ、７．６１ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（１．６６ｍＬ、９．５２ｍｍｏｌ）の溶液を、１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）中で窒素下、４時間加熱還流する。反応物を冷却して、水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出する（３回）。有機層をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して溶媒を真空除去し、粗生成物を与える。シリカゲルを用いた２５分間の５％−１００％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配により粗生成物を精製して、表題化合物を与える（５９０ｍｇ、６６％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４６７（Ｍ＋Ｈ）。

【0107】

調製５２
Ｎ−（３−（（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド

【化59】

Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（３−アミノフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（４００ｍｇ、８９１．８１μモル）及び５−メトキシピラジン−２−カルボン酸（１６５ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４ｍＬ）及びジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中で混和する。ＨＯＢｔ（１６０ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）と、その後、ＥＤＣＩ（２２６ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を添加して、得られた混合物を窒素下、室温で５時間撹拌する。反応混合物を水で希釈して、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを約１２に調整する。混合物をＥｔＯＡｃで抽出する（３回）。ひとまとめにした有機抽出物を硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して溶媒を真空除去する。シリカゲルを用いた２０分間の５％−１００％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配により粗生成物を精製して、表題化合物を与える（４８２ｍｇ、９２％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：５８５（Ｍ＋Ｈ）。

【0108】

調製５３
Ｎ−［３−［２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−フルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド

【化60】

Ｎ−［７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（３０２ｍｇ、６４７μｍｏｌ）及び５−フルオロピリジン−２−カルボン酸（１１０ｍｇ、７７７μｍｏｌ）を、ＤＣＭ（３ｍＬ）及びジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中で混和する。ＨＯＢＴ（１１６ｍｇ、８４２μｍｏｌ）と、その後、ＥＤＣＩ（１６４ｍｇ、８４２μｍｏｌ）を添加して、混合物を窒素下、室温で一晩撹拌する。反応混合物を水で希釈して、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを約１２に調整し、その後、ＥｔＯＡｃで抽出する（３回）。有機層をひとまとめにし、ろ過して不溶性材料を回収する。その固体を水及びＥｔＯＡｃで洗浄して、真空乾燥し、表題化合物を与える。ろ液からの有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して溶媒を真空除去する。シリカゲルを用いた２０分間の５％−１００％ヘキサン中ＥｔＯＡｃ勾配により残渣を精製して、さらなる表題化合物をまとめた収量（２７５ｍｇ、７２％）で与える。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：５９０（Ｍ＋Ｈ）。

【0109】

調製５４
Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル]ベンズアミド、（異性体１）

【化61】

ラセミ体Ｎ−（７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（１．６９４ｇ、３．６３ｍｍｏｌ）を、キラルＨＰＬＣ（カラム Chiralcel OJ、８×３５ｃｍ；溶離液 ９０％メタノール（０．２％ジメチルエチルアミン）及び１０％アセトニトリル；流速 ＵＶ２８０ｎｍで４００ｍＬ／分）により精製する。最初に溶出する異性体の分析（カラム Chiralcel OJ-H、０．４６×１５ｃｍ；溶離液 １０：９０アセトニトリル：メタノール（０．２％ジメチルエチルアミンを含む）；流速 ＵＶ２８０ｎｍで０．６ｍＬ／分)によって、Ｒ_ｔ＝６．７０分の鏡像異性体に富む（９９％ｅｅ）鏡像異性体が確証される（７２３ｍｇ、４３％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４６７（Ｍ＋Ｈ）。

【0110】

調製５５
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド、（異性体１）

【化62】

Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル]ベンズアミド（０．３６１ｇ、０．７７ｍｍｏｌ、異性体１）を、ＤＣＭ（４ｍＬ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）との混合物に溶解する。５−メトキシピラジン−２−カルボン酸（２４０ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２１０ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（３００ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ）を混合物に添加して、混合物を室温で一晩撹拌する。反応溶液を１２ｇシリカゲルロードカラムに直接添加して、４０ｇシリカゲルカラムを用いて精製し、０−１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で溶出する。生成物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に溶解し、１Ｎ ＮａＯＨ（５０ｍＬで２回）及びブライン（５０ｍＬで１回）で洗浄する。シリカゲル精製を上記の通り再度行い、表題化合物を与える（３５０ｍｇ、７４％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：６０３（Ｍ＋Ｈ）。

【0111】

調製５６
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−５−シアノ−ピリジン−２−カルボキサミド

【化63】

Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（３−アミノフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル]ベンズアミド（０．３０ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び５−シアノピリジン−２−カルボン酸（１２９ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）に溶解して、ＨＯＢｔ（１８５ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（１６９ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を添加する。ＤＩＰＥＡ（０．３５ｍＬ、２ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を室温で一晩撹拌する。０−１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって材料を直接精製して、表題化合物を与える（３６０ｍｇ、８８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：５７９（Ｍ＋Ｈ）。

【0112】

調製５７
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−３，５−ジフルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド

【化64】

Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（３−アミノフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（０．３０ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び３，５−ジフルオロピリジン−２−カルボン酸（１３８ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）に溶解して、ＨＯＢＴ（１８５ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（１６９ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を添加する。Ｄｉｐｅａ（０．３５ｍＬ、２ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を室温で一晩撹拌する。０−１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって反応物を直接精製して、表題化合物を与える（３３０ｍｇ、８４％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：５９０（Ｍ＋Ｈ）。

【0113】

調製５８
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−シアノ−ピリジン−２−カルボキサミド、（異性体１）

【化65】

Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（０．１８０ｇ、０．３９ｍｍｏｌ、異性体１）を、ＤＣＭ（２ｍＬ）とＤＭＦ（０．２５ｍＬ）との混合物に混合する。５−シアノピリジン−２−カルボン酸（１１４ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１０６ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（１５０ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を室温で一晩撹拌する。混合物を水（１０ｍＬ）、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈して、１ Ｎ ＮａＯＨ（１００ｍＬ）の溶液に添加する。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し（１００ｍＬで２回）、有機層をひとまとめにして、ブラインで洗浄する。有機層をＭｇＳＯ_４で脱水し、ろ過して濃縮する。０−１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物を与える（１３３ｍｇ、５７％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：５９７（Ｍ＋Ｈ）。

【0114】

調製５９
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−３，５−ジフルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド、（異性体１）

【化66】

Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（０．１８０ｇ、０．３９ｍｍｏｌ、異性体１）を、ＤＣＭ（２ｍＬ）とＤＭＦ（０．２５ｍＬ）との混合物に溶解する。５−シアノピリジン−２−カルボン酸（１１４ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１０６ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（１５０ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を室温で一晩撹拌する。混合物を水（１０ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、その後、１Ｎ ＮａＯＨ（１００ｍＬ）の溶液に注ぐ。混合物をＥｔＯＡｃで抽出し（１００ｍＬで２回）、有機抽出物をひとまとめにして、ブラインで洗浄する。有機層をＭｇＳＯ_４で脱水し、ろ過して濃縮する。０−１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで残渣を精製して、表題化合物を与える（１９０ｍｇ、８０％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：６０８（Ｍ＋Ｈ）。

【0115】

調製６０
（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン

【化67】

水酸化リチウム（９．２６ｇ、３８６ｍｍｏｌ）を、メタノール（１．６Ｌ）中のＮ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（１５８．６ｇ、３５１．６ｍｍｏｌ）の混合物に添加する。混合物を７０℃で４時間加熱し、その後、２２℃に冷却する。反応混合物を黄色残渣になるまで真空蒸発させる。残渣を水（１Ｌ）及びＥｔＯＡｃ（７５０ｍＬ）に分配する。ＨＣｌ（５Ｍ水溶液）を添加して、ｐＨ１に調整する。水層を分離して、有機層をＥｔＯＡｃで洗浄する（２００ｍＬで２回）。５０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウム水溶液で水層のｐＨをｐＨ＝１０に調整して、ＥｔＯＡｃで抽出する（１Ｌで３回）。有機抽出物をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して減圧蒸発し、粗製の表題化合物を淡黄色固体として与える（１３３．３ｇ、９９％。１２％残留ＥｔＯＡｃを含む)。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３４８（Ｍ＋１）。

【0116】

調製６１
（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン

【化68】

硫酸（３３．４ｍｌ、６２６．６ｍｍｏｌ）を、トリフルオロ酢酸（６２６ｍＬ）中の（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン（４５．８ｇ、１２５．３ｍｍｏｌ）に添加する。混合物を０℃に冷却して、２０分間撹拌する。発煙硝酸（６．２ｍＬ、１４４．１ｍｍｏｌ）を添加して、反応混合物を２２℃に昇温させて、３時間撹拌する。反応混合物を蒸発させて、ＭＴＢＥ（２５０ｍＬ）を添加し、２回蒸発させる。残渣を一定重量まで真空乾燥させ、その後、水（１４７ｍＬ）及びエタノール（８８５ｍＬ）に溶解して、窒素を１５分間バブリングして脱気する。溶液を高圧反応器に移して、１０％ Ｐｄ／Ｃペースト型８７Ｌ（６．６ｇ、６．２７ｍｍｏｌ）を添加する。混合物をさらなるエタノール（７００ｍＬ）で希釈して、８０ｐｓｉの水素で１６時間加圧する。反応混合物をろ過し、その後、第二の触媒充填物１０％ Ｐｄ／Ｃペースト型８７Ｌ（６．６ｇ、６．２７ｍｍｏｌ）を添加して、８０ｐｓｉで加圧し、高圧反応器内で３日間撹拌する。反応混合物を窒素でパージして、珪藻土でろ過する。ろ液を蒸発させて、残渣を水（２００ｍｌ）及びＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）に分配する。水層を分離して、５℃に冷却し、１５％ｗ／ｗ水酸化アルミニウムで中和する。水層をＥｔＯＡｃで抽出する（１５０ｍＬで３回）。有機層をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して減圧蒸発させ、表題化合物を淡褐色固体として与える（４７．７ｇ。残留ＥｔＯＡｃを９９％含有）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３６３（Ｍ＋１）。

【0117】

実施例Ａ
Ｎ−［３−［２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−フルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド

【化69】

Ｎ−［３−［２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−フルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド（２９３ｍｇ、４９７μｍｏｌ）と、Ｏ−メチルヒドロキシル−アミン塩酸塩（４３０ｍｇ、４．９７ｍｍｏｌ）と、ピリジン（４０２μＬ、４．９７ｍｍｏｌ）との混合物を、キャップ付きフラスコにおいてエタノール（１３ｍＬ）中、２．５時間の間、７０℃に加熱する。ＤＭＳＯ（３ｍＬ）を添加して、混合物を７０℃で一晩加熱する。さらなるＤＭＳＯ（１０ｍＬ）を添加して、７０℃で４時間加熱し続ける。さらなるＯ−メチルヒドロキシル−アミン塩酸塩（２０８ｍｇ、２．４８ｍｍｏｌ）及びピリジン（２０１μＬ、２．４８ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を３時間の間、６０℃に加熱し、混合物を室温で３日間撹拌する。別のフラスコにおいて、Ｎ−［３−［２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−フルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド（２７６ｍｇ、４６８μｍｏｌ）と、Ｏ−メチルヒドロキシル−アミン塩酸塩（４０５ｍｇ、４．６８ｍｍｏｌ）と、ピリジン（４７８μＬ、４．６８ｍｍｏｌ）との混合物を、キャップ付きフラスコ内で７０℃のエタノール（１５ｍＬ）及びＤＭＳＯ（４ｍＬ）中で加熱する。さらなるＤＭＳＯ（１０ｍＬ）を添加して、加熱を７０℃で４時間継続する。さらなるＯ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１９５ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）及びピリジン（１８９μＬ、２．３４ｍｍｏｌ）を添加して、加熱を７０℃で３時間継続した後、混合物を室温で３日間撹拌する。２種の反応混合物をひとまとめにして、溶媒のほとんどを真空除去する。３：１ ＤＣＭ：メタノールと、その後２：１ ＤＣＭ：７Ｎメタノール中アンモニアを用いたＳＣＸカラムで、粗生成物を精製する。シリカゲルを用いた２０分間の０．５％−１０％７Ｎ ＤＣＭ中アンモニアメタノール勾配により粗生成物をさらに精製して、表題化合物を与える（４５１ｍｇ、９６％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４８６（Ｍ＋Ｈ）。

【0118】

実施例１
Ｎ−｛３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ４Ｈ）−イル］フェニル｝−５−フルオロピリジン−２−カルボキサミド塩酸塩

【化70】

エタノール（１５ｍＬ）中のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−５−フルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド（３２０ｍｇ、５６０μｍｏｌ）と、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（４８５ｍｇ、５．６０ｍｍｏｌ）と、ピリジン（４５３μＬ、５．６０ｍｍｏｌ）との混合物を、キャップ付きバイアル中、６５℃で５時間加熱する。反応混合物を冷却して、溶媒を真空除去する。シリカゲルを用いた３０分間の０．５％−１０％７ＮメタノールＤＣＭ中アンモニウム勾配により粗生成物を精製して、Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−５−フルオロ−ピリジン−２−カルボキサミドを与える（２１９ｍｇ、８４％）。この材料をＤＣＭ（１ｍＬ）及びメタノール（０．５ｍＬ）に溶解して、１Ｍのジエチルエーテル中塩酸（０．４７ｍＬ、４７０μｍｏｌ）を添加する。溶媒を真空除去して、表題化合物を与える（２２８ｍｇ、８１％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４６８（Ｍ＋Ｈ）。

【0119】

実施例２
Ｎ−｛３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］フェニル）−５−メトキシピラジン−２−カルボキサミド塩酸塩

【化71】

エタノール（２０ｍＬ）中のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４,４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド（４７９ｍｇ、８１９μｍｏｌ）と、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（７０９ｍｇ、８．１９ｍｍｏｌ）と、ピリジン（６６３μＬ、８．１９ｍｍｏｌ）との混合物を、キャップ付きフラスコ内において５０℃で一晩加熱する。ＤＭＳＯ（４ｍＬ）を添加して、混合物を４時間の間、７０℃に加熱して、溶液を得る。反応物を冷却し、溶媒のほとんどを真空除去する。水を添加して、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを約１２に調整する。混合物をＥｔＯＡｃで抽出する（５回）。ひとまとめにした有機抽出物を硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して溶媒を真空除去する。シリカゲルを用いた３０分間の０．５％−１０％の７Ｎ ＤＣＭ中アンモニアメタノール勾配により粗生成物を精製する。混合物を、３：１ ＤＣＭ：メタノールと、その後、２：１ ＤＣＭ：７Ｎメタノール中アンモニアを用いてＳＣＸカラムで再度精製して、残留ＤＭＳＯを除去する。最後の、シリカゲルを用いた２０分間の０．５％−１０％の７Ｎ ＤＣＭ中アンモニアメタノール勾配により混合物を精製して、Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル]フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドを与える。この材料をＤＣＭ（１ｍＬ）及びメタノール（０．５ｍＬ）に溶解して、１Ｍのジエチルエーテル中塩酸（０．６６ｍＬ、６６０μｍｏｌ）を添加する。溶媒を真空除去して、表題化合物を与える（３２９ｍｇ、７８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４８１（Ｍ＋Ｈ）。

【0120】

実施例３
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−フルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド塩酸塩

【化72】

ラセミ体Ｎ−［３−［２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−フルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド（４５１ｍｇ、９２９μｍｏｌ）を、ＳＦＣ（カラム Chiralcel OD-H（５μｍ）、２．１×２５ｃｍ；溶離液 ４０％ＣＯ_２中メタノール（０．２％イソプロピルアミン）；流速 ＵＶ２２５ｎｍで７０ｍＬ／分)によってキラル精製する。最初に溶出する異性体のキラル分析：カラム Chiralcel OD-H（５μｍ）、４．６×１５０ｍｍ;溶離液 ４０％ＣＯ_２中メタノール（０．２％イソプロピルアミン）；流速 ＵＶ２２５ｎｍで５ｍＬ／分、によって、Ｒ_ｔ＝１．０１分で鏡像異性体に富む（＞９９％ｅｅ）鏡像異性体が確証される（１７５ｍｇ、３６０μモル）。この材料（遊離塩基、異性体１）をＤＣＭ（１ｍＬ）及びメタノール（０．５ｍＬ）に溶解して、１Ｍジエチルエーテル中塩化水素（０．３６ｍＬ、３６０μモル）を添加する。溶媒を真空除去して、表題化合物を与える（１８３ｍｇ、３８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４８６（Ｍ＋Ｈ）。

【0121】

実施例４
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド塩酸塩

【化73】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド（０．３５０ｇ、０．５８ｍｍｏｌ、異性体１）をＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解して、その後、メタノール（４ｍＬ）及びエタノール（４ｍＬ）を添加する。Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（４９５ｍｇ、５．８１ｍｍｏｌ）及びピリジン（４７０μＬ、５．８１ｍｍｏｌ）を混合物に添加して、反応物を５０℃に昇温させて、一晩撹拌する。シリカゲル（約１０ｇ）を反応物に添加して、混合物を濃縮する。シリカゲルで乾燥させた試料を空のカートリッジに充填して、０−１０％の７Ｎ ＤＣＭ中アンモニアメタノール勾配で溶出して精製する。２回目に、３：１ ＤＣＭ：メタノールと、その後に２：１ ＤＣＭ：７Ｎメタノール中アンモニアを用いてＳＣＸカラムによって、生成物を精製する。最後に、シリカゲルを用いて、０％−１０％のＤＣＭ中７Ｎアンモニアメタノール勾配によって生成物を精製して、表題化合物の遊離塩基を与える。この材料をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解して、１Ｍジエチルエーテル中塩化水素（０．２０ｍＬ、６６０μｍｏｌ）を添加する。溶媒を真空除去して、表題化合物を与える（７１ｍｇ、２３％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４９８（Ｍ＋Ｈ）。

【0122】

実施例５
結晶形態２ Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド（水和物）
アセトニトリル（５００ｍＬ）を、ジメチルホルムアミド（１９．２ｍＬ、２４８．９ｍｍｏｌ）に添加する。塩化オキサリル（３９．３ｇ、３０９．６３ｍｍｏｌ）と、続いて５−メトキシピラジン−２−カルボン酸（４６．０ｇ、２９８．４ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド溶液に添加する。別のフラスコにおいて、（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン（５６．８ｇ、１５６．７５ｍｍｏｌ）の水溶液をアセトニトリル（５００ｍＬ）に添加して、水酸化アンモニウム（９５ｍＬ）でｐＨを９に調整する。その後、混合物を５０〜５５℃に加熱する。酸塩化物溶液を滴加して、混合物を３時間撹拌する。水酸化アルミニウムで、ｐＨを８〜９に調整する。得られた沈殿をろ過して水で洗浄し、乾燥させて表題化合物を得る（１２３ｇ）。固体をアセトン（２５０ｍＬ）で１．５時間、スラリーにして、ろ過する。湿性ケークをアセトンで洗浄して、表題化合物を得る（１１０ｇ。ＨＰＬＣにより９０．５％純度)。ＴＨＦ（１Ｌ）及び活性炭（９ｇ）をその固体に添加して、混合物を一晩、加熱還流する。混合物を珪藻土でろ過して、ＴＨＦ（１５０ｍＬ）で洗浄する。有機溶液を１０倍に濃縮して、６０℃に加熱する。水（４３０ｍＬ）を添加して、混合物を６０℃で８時間撹拌する。混合物を室温まで冷却し、１０時間撹拌する。得られた固体をろ過し、ＴＨＦ／水（７：６）で洗浄して、表題化合物を与える（６９ｇ、８８％）。ＬＣ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝４９９（Ｍ＋１）、 純度:９８．３％。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ ２．９９ − ３．０７ （ｍ， ２ Ｈ） ３．０７ − ３．１４ （ｍ， １ Ｈ） ３．５８ − ３．６７ （ｍ， １ Ｈ） ３．６８ − ３．７６ （ｍ， １ Ｈ） ３．７６ − ３．８４ （ｍ， １ Ｈ） ４．０２ （ｓ， ３ Ｈ） ４．０７ （ｄ， Ｊ＝１０．９２ Ｈｚ， １ Ｈ） ６．０８ （ｓ， ２ Ｈ） ７．１９ （ｄｄ， Ｊ＝１１．９８， ８．７２ Ｈｚ， １ Ｈ） ７．７８ − ７．８９ （ｍ， ２ Ｈ） ８．４１ （ｓ， １ Ｈ） ８．４４ （ｓ， ２ Ｈ） ８．８８ （ｓ， １ Ｈ） １０．６０ （ｓ， １ Ｈ）。

【0123】

粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）
ＣｕＫα線源（λ＝１．５４０６０Å）及びVantec検出器を備え、３５ｋＶ及び５０ｍＡで操作するBruker D4 Endeavor粉末Ｘ線回折装置で、結晶性固体のＸＲＤパターンを得る。２θのステップサイズ０．００９°及びスキャン速度０．５秒／ステップで、発散スリット０．６ｍｍ、散乱線除去スリット５．２８、及び検出器スリット（detector slits）９．５ｍｍとし、試料を２θで４〜４０°スキャンする。乾燥粉末を水晶試料ホールダに充填して、ガラススライドを用いて平滑面を得る。結晶形態の回折パターンを、周囲温度及び相対湿度で回収する。任意の所与の結晶形態について、回折ピークの相対強度が結晶形態及び習慣などの因子により得られる好ましい方向性によって変動し得ることは、結晶学の技術分野において周知である。好ましい方向性の影響が存在する場合、ピーク強度は改変するが、多形の特徴的ピーク位置は不変である。例えば、The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995を参照されたい。さらに、任意の所与の結晶形態で、角度のピーク位置がわずかに変動し得ることも、結晶学において周知である。例えばピーク位置は、試料が分析される温度若しくは湿度の変動、試料の変位、又は内部標準の有無に応じてシフトし得る。本明細書の場合、２θでのピーク位置の変動性±０．２は、これらの潜在的変動を考慮しており、示された結晶形態の明確な同定を妨げない。識別するピーク（°２θの単位）、典型的にはより顕著なピークの任意の特有の組み合わせに基づいて、結晶形態の確証を行うことができる。周囲温度及び相対湿度で回収された結晶形態の回折パターンを、８．８５３及び２６．７７４°２θでのＮＩＳＴ ６７５標準ピークに基づいて調整した。

【0124】

結晶形態２ Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル]−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドの調製試料を、以下の表２に記載された回折ピーク（２θ値）を有するＣｕＫα線を用いたＸＲＤパターンによって特徴づける。具体的には該パターンは、１１．８°にピークを含み、１８．６°、１９．３°、及び２６．７°からなる群から選択される１つ又は複数のピークを有し、回折角の公差は０．２°である。

【表2】

【0125】

実施例６
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−５−シアノ−ピリジン−２−カルボキサミド塩酸塩

【化74】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−５−シアノ−ピリジン−２−カルボキサミド（３６０ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を、エタノール（１０ｍＬ）及びＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解する。Ｏ−メチルヒドロキシル−アミン塩酸塩（５０４ｍｇ、５．９１ｍｍｏｌ）及びピリジン（４７８μＬ、５．９１ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を室温で週末の間（７０時間）、撹拌する。反応物を６０℃まで昇温させて、２４時間撹拌する。反応物を濃縮して、粗生成物を与え、０−１０％の７Ｎ ＤＣＭ中アンモニアメタノール勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物の遊離塩基を与える。この材料をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解して、１Ｍのジエチルエーテル中塩酸（０．５４ｍＬ、５４０μｍｏｌ）を添加する。溶媒を真空除去して、表題化合物を与える（２４０ｍｇ、７５％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４７５（Ｍ＋Ｈ）。

【0126】

実施例７
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−３,５−ジフルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド塩酸塩

【化75】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］フェニル］−３，５−ジフルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド（３３０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解して、エタノール（１０ｍＬ）で希釈する。Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（４５３ｍｇ、５．３２ｍｍｏｌ）及びピリジン（４３０μＬ、５．９１ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を室温で週末の間（７０時間）、撹拌する。反応物を６０℃に昇温させて、２４時間撹拌する。混合物をシリカゲル（約１０ｇ）で濃縮して、０−１０％の７Ｎ ＤＣＭ中アンモニアメタノール勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物の遊離塩基を与える。この材料をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解して、１Ｍのジエチルエーテル中塩酸（０．４９ｍＬ、４９０μｍｏｌ）を添加する。溶媒を真空除去して、表題化合物を与える（１５９ｍｇ、５４％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４８６（Ｍ＋Ｈ）。

【0127】

実施例８
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−シアノ−ピリジン−２−カルボキサミド塩酸塩

【化76】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−シアノ−ピリジン−２−カルボキサミド（１３３ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、異性体１）をＴＨＦ（１ｍＬ）に溶解して、メタノール（３ｍＬ）及びエタノール（３ｍＬ）で希釈する。Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１９０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）及びピリジン（１８０μＬ、２．２ｍｍｏｌ）を添加する。反応物を５０℃に昇温させて、一晩撹拌する。混合物をシリカゲル（約１０ｇ）で濃縮して、０−１０％の７Ｎ ＤＣＭ中アンモニアメタノール勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。２回目に、３：１ ＤＣＭ：メタノールと、その後に２：１ ＤＣＭ：７Ｎメタノール中アンモニアを用いてＳＣＸカラムで、この材料を精製する。最後に、シリカゲルを用いた０％−１０％の７Ｎ ＤＣＭ中アンモニアメタノール勾配により混合物を精製して、表題化合物の遊離塩基を与える。この材料をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解して、１Ｍジエチルエーテル中塩酸（０．２７ｍＬ、２７０μｍｏｌ）を添加する。溶媒を真空除去して、表題化合物を与える（１１４ｍｇ、９７％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４９３（Ｍ＋Ｈ）。

【0128】

実施例９
Ｎ−（３−（（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−３，５−ジフルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド塩酸塩

【化77】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−３，５−ジフルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド（１９０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、異性体１）をＴＨＦ（１ｍＬ）に溶解して、メタノール（３ｍＬ）及びエタノール（３ｍＬ）で希釈する。Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２６７ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）及びピリジン（２５３μＬ、３．１ｍｍｏｌ）を添加して、反応物を５０℃に昇温させて、一晩撹拌する。３：１ ＤＣＭ：メタノールと、その後、２：１ ＤＣＭ：７Ｎメタノール中アンモニアを用いて、ＳＣＸカラムで反応物を精製する。最後の、シリカゲルを用いて０％−１０％の７Ｎ ＤＣＭ中アンモニアメタノール勾配によりその材料を精製して、表題化合物の遊離塩基を与える。この材料をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解して、１Ｍジエチルエーテル中塩酸（０．２０ｍＬ、２００μｍｏｌ）を添加する。溶媒を真空除去して、表題化合物を与える（１０１ｍｇ、６０％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：５０４（Ｍ＋Ｈ）。

【0129】

実施例１０
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−３，５−ジフルオロ−ピリジン−２−カルボキサミド

【化78】

塩化オキサリル（１０．５ｍｌ、１３６，４ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（６１７ｍＬ）及びジメチルホルムアミド（１０．５ｍＬ）中の３，５−ジフルオロピコリン酸（１９．９ｇ、１２５ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。３０分間撹拌した後、その溶液を、予め５０℃に加熱されたエタノール（８２３ｍＬ）／水（８２３ｍＬ）混合物中の（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン（４１．１ｇ、１１３ｍｍｏｌ）の新たに調製された溶液に添加する。反応物を５０℃で１時間保持する。反応混合物を２２℃に冷却して、溶媒を蒸発させる。水溶液をＤＣＭ（１Ｌ）で希釈して、２Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨをｐＨ＝１１に調整する。有機層を分離して、水層をさらなるＤＣＭで洗浄する（４００ｍＬで２回）で洗浄する。有機抽出物をひとまとめにして、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過して蒸発乾固する。０−１０％ＤＣＭの２Ｎアンモニア添加メタノール／ＤＣＭの勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗製の材料を精製して、表題化合物をオフホワイトの固体として与える（４５ｇ、７８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：５０４（Ｍ＋１）。

【0130】

インビトロアッセイの手順：
インビトロ酵素及び細胞アッセイでは、テスト化合物をＤＭＳＯ中で調整して、１０ｍＭ標準原液を作製する。この標準原液をＤＭＳＯで系列希釈して、９６ウェル丸底プレートにおいて最終化合物濃度１０ｍＭ〜０．０５ｎＭの範囲内で１０点希釈曲線を得た後、インビトロ酵素及び全細胞アッセイを実施する。

【0131】

インビトロプロテアーゼ阻害アッセイ：
ヒトＢＡＣＥ１の発現
ヒトＢＡＣＥ1（アクセション番号：ＡＦ１９０７２５）を、ＲＴ−ＰＣＲにより全脳由来ｃＤＮＡからクローニングする。アミノ酸配列番号１〜４６０に対応するヌクレオチド配列を、ヒトＩｇＧ_１（Ｆｃ）ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに挿入する（Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)参照）。ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃと称される、ＢＡＣＥ１（１−４６０）とヒトＦｃとのこの融合タンパク質を、ｐＪＢ０２ベクター内に構築する。ヒトＢＡＣＥ１（１−４６０）：Ｆｃ（ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃ）を、ＨＥＫ２９３細胞内で一過性に発現させる。各構築物のｃＤＮＡ ２５０μｇを、Fugene 6と混合して、ＨＥＫ２９３細胞 １Ｌに添加する。トランスフェクションの４日後に、コンディション培地を精製用に採取する。

【0132】

ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃの精製
ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃを、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製する。その酵素を少量ずつ分取して−８０℃で貯蔵する。

【0133】

ＢＡＣＥ１ ＦＲＥＴアッセイ
テスト化合物の系列希釈を、先に記載された通り調製する。化合物をＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液でさらに２０倍希釈する。各希釈物１０μＬを、反応混合物（５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４ ２５μＬ、ｐＨ４．６、１ｍＭ TRITON（登録商標）X-100、１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、及び１５μＭ ＦＲＥＴ基質）を含む対応する低タンパク質結合黒色プレートのＡ〜Ｈ列の各ウェルに添加する（Yang, et. al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)参照）。内容物をプレートシェーカで１０分間、十分に混合する。ＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液中の２００ｐＭヒトＢＡＣＥ1（１−４６０）：Ｆｃ（Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)参照）１５μＬを、基質及びテスト化合物を含むプレートに添加して、反応を開始させる。プレートシェーカで簡単に混合した後、０時目の混合物のＲＦＵを、励起波長３５５ｎｍ及び発光波長４６０ｎｍで記録する。反応プレートをアルミ箔で覆い、暗色の加湿オーブンにおいて室温で１６〜２４時間保持する。インキュベーション終了時のＲＦＵを、０時目に用いられたものと同じ励起及び発光設定で記録する。０時目とインキュベーション終了時とのＲＦＵの差は、化合物処置の下でのＢＡＣＥ１の活性を表す。ＲＦＵの差を阻害濃度に対してプロットして、曲線を４パラメータロジスティック方程式に適合させて、ＥＣ_５０及びＩＣ_５０値を得る（Sinha, et al., Nature, 402, 537-540 (2000)参照）。

【0134】

以下の模範的化合物を、本質的に先に記載された通りテストすると、以下のＢＡＣＥ1に関する活性を示す：

【表3】

【0135】

これらのデータから、表３の化合物がインビトロで精製組換え体ＢＡＣＥ1酵素活性を阻害することが実証される。

【0136】

ベータセクレターゼ活性の阻害を測定する全細胞アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｓｗe全細胞アッセイ
ベータセクレターゼ活性の阻害を測定する日常的全細胞アッセイでは、一般にスウェーデン変異と呼ばれ、Ａベータを過剰産生することが示されている（Citron, et al., Nature, 360, 672-674 (1992)）、Ｌｙｓ６５１Ｍｅｔ６５２からＡｓｎ６５１Ｌｅｕ６５２への天然に存在する二重変異を含むヒトＡＰＰ７５１ ｃＤＮＡを安定して発現するヒト胚性腎細胞株ＨＥＫ２９３Ｐ（アクセション番号ＣＲＬ−１５７３）（ＨＥＫ２９３Ｓｗｅと表記される）を使用する。インビトロＡベータ還元アッセイが、文献に記載されている（Dovey, et al., Journal of Neurochemistry, 76, 173-181 (2001); Seubert, et al., Nature, 361, 260 (1993);及びJohnson-Wood, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1550-1555 (1997)参照）。

【0137】

細胞（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地２００μＬを含む３．５×１０^４細胞／ウェルのＨＥＫ２９３Ｓｗｅ）を、所望の濃度の阻害剤（ＤＭＳＯで希釈）の存在下／非存在下、３７℃で４〜２４時間インキュベートする。インキュベーションの終了時に、コンディション培地を、例えばＡベータペプチドの分析によって、ベータセクレターゼ活性の証拠について分析する。総Ａベータペプチド（Ａベータ１−ｘ）を、捕捉抗体としてのモノクローナル２６６及びレポーティング抗体（reporting antibody）としてのビオチン化３Ｄ６を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。或いはＡベータ１−４０及びＡベータ１−４２ペプチドを、Ａベータ１−４０のための捕捉抗体としてのモノクローナル２Ｇ３、及びＡベータ１−４２のための捕捉抗体としてのモノクローナル２１Ｆ１２を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。Ａベータ１−４０及びＡベータ１−４２の両ＥＬＩＳＡは、レポーティング抗体としてビオチン化３Ｄ６を使用する。化合物処置に続いてコンディション培地中に遊離されるＡベータの濃度は、そのような条件下でのＢＡＣＥ１の活性に対応する。１０点阻害曲線をプロットして、４パラメータロジスティック方程式に適合させて、Ａベータ低下作用に関するＥＣ_５０及びＩＣ_５０を得る。以下の模範的化合物を、本質的に先に記載された通りテストすると、Ａベータ低下作用に関して以下の活性を示す：

【表4】

【0138】

これらのデータから、表４の化合物が全細胞におけるネイティブＡベータ産生を阻害することが実証される。

【0139】

ＰＤＡＰＰ初代ニューロンアッセイ
確証のための全細胞アッセイを、ＰＤＡＰＰトランスジェニック胚性マウスから産生された初代ニューロン培養物中でも実施する。初代皮質ニューロンを、胎生１６日目のＰＤＡＰＰ胚から調製して、９６ウェルプレートで培養する（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）＋１０％ＦＢＳ中の１５×１０^４細胞／ウェル）。インビトロでの２日後に、培地を、Ｂ２７サプリメント及び２μＭ（最終）Ａｒａ−Ｃ（Sigma、C1768）を含有する無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）と交換する。インビトロでの５日目に、ニューロンを、所望の濃度の阻害剤（ＤＭＳＯで希釈）の存在下／非存在下、３７℃で２４時間インキュベートする。インキュベーションの終了時に、コンディション培地を、例えばＡベータペプチドの分析によって、ベータセクレターゼ活性の証拠について分析する。総Ａベータペプチド（Ａベータ１−ｘ）を、捕捉抗体としてのモノクローナル２６６及びレポーティング抗体としてのビオチン化３Ｄ６を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。或いはＡベータ１−４０及びＡベータ１−４２ペプチドを、Ａベータ１−４０のための捕捉抗体としてのモノクローナル２Ｇ３、及びＡベータ１−４２のための捕捉抗体としてのモノクローナル２１Ｆ１２を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。Ａベータ１−４０及びＡベータ１−４２の両ＥＬＩＳＡは、レポーティング抗体としてビオチン化３Ｄ６を使用する。化合物処置に続いてコンディション培地中に遊離されるＡベータの濃度は、そのような条件下でのＢＡＣＥ１の活性に対応する。１０点阻害曲線をプロットして、４パラメータロジスティック方程式に適合させて、Ａベータ低下作用に関するＥＣ_５０及びＩＣ_５０を得る。以下の模範的化合物を、本質的に先に記載された通りテストすると、Ａベータ低下作用に関して以下の活性を示す：

【表5】

【0140】

これらのデータから、表５の化合物が全細胞におけるＡベータ産生を阻害することが実証される。

【0141】

ベータセクレターゼのインビボ阻害
マウス、モルモット、イヌ、及びサルをはじめとする複数の動物モデルを用いて、化合物処置に続くインビボでのベータセクレターゼ活性の阻害をスクリーニングすることができる。本発明において用いられる動物は、野生型、トランスジェニック、又は遺伝子ノックアウト動物であり得る。例えば、Games et al., Nature 373, 523-527 (1995)に記載された通り調製されたＰＤＡＰＰマウスモデル、及び他のトランスジェニック又は遺伝子ノックアウト動物は、阻害性化合物の存在下でＡベータ及びｓＡＰＰベータ産生のインビボ阻害を分析するのに有用である。一般に２〜１２ヶ月齢ＰＤＡＰＰマウス、遺伝子ノックアウトマウス又は非トランスジェニック動物に、コーン油、シクロデキストラン、リン酸緩衝液、PHARMASOLVE（登録商標）、又は他の適切なビヒクルなどのビヒクル中に配合された化合物を投与する。化合物投与後１〜２４時間目に、動物を殺処分し、脳に加え、脳脊髄液及び血漿をＡベータ、Ｃ９９、及びｓＡＰＰ断片の分析用に取り出す（May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)参照）。

【0142】

標準のインビボ薬理学試験では、動物に様々な濃度の化合物を投与し、同時に投与されたビヒクル処置対照群と比較する。一部の経時的試験では、脳組織、血漿、又は脳脊髄液を選択された動物から得て、０時間目に開始してベースラインを確定する。化合物又は適切なビヒクルを他の群に投与して、投与後の様々な時間に殺処分する。脳組織、血漿、又は脳脊髄液を選択された動物から得て、例えば専用のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによって、Ａベータペプチド、ｓＡＰＰベータ及び他のＡＰＰ断片をはじめとするＡＰＰ切断産物の存在について分析する。テスト期間の終了時に、動物を殺処分して、脳組織、血漿、又は脳脊髄液を適宜、Ａベータペプチド、Ｃ９９、及びｓＡＰＰベータの存在について分析する。ＡＰＰトランスジェニック動物の脳組織はまた、化合物処置後のベータアミロイド斑の量について分析され得る。本明細書で用いられる「Ａベータ１−ｘペプチド」は、残基１で開始し、残基２８よりも大きなＣ末端で終結するＡベータ種の合計を指す。これは、Ａベータ種の大部分を検出し、多くの場合「総Ａベータ」と呼ばれる。

【0143】

阻害性化合物を投与された動物（ＰＤＡＰＰ又は他のＡＰＰトランスジェニック又は非トランスジェニックマウス）は、ビヒクル処置対照又は０時間目対照に比較して、脳組織、血漿又は脳脊髄液におけるＡベータ又はｓＡＰＰベータの低減、及び脳組織におけるベータアミロイド斑の減少を示し得る。若齢雌ＰＤＡＰＰマウスへの実施例１の化合物の１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇ経口用量の投与後３時間目に、Ａベータ１−ｘペプチドレベルは、ビヒクル処置マウスに比較して、それぞれ脳海馬においておよそ３４％、４８％、及び５３％、並びに脳皮質においておよそ４３％、５９％及び６６％低減する。

【0144】

実施例３の化合物の１又は３ｍｇ／ｋｇ経口用量の投与後３時間目は、Ａベータ１−ｘペプチドレベルが、ビヒクル処置マウスに比較してそれぞれ脳海馬においておよそ３８％及び５０％、並びに脳皮質においておよそ３４％及び５３％低減する。

【0145】

実施例４において、該化合物の０．３、１、又は３ｍｇ／ｋｇ経口用量の投与後３時間目に、Ａベータ１−ｘペプチドレベルが、ビヒクル処置マウスに比較して、それぞれ脳海馬においておよそ３１％、３９％、及び６１％、並びに脳皮質においておよそ２８％、４２％及び６４％低減する。

【0146】

インビトロでのＢＡＣＥ酵素に対する実施例１、３、及び４の活性を前提にすると、これらのＡベータ低下作用は、インビボでのＢＡＣＥ阻害と一致し、さらに実施例１、３及び４のＣＮＳ透過を実証している。

【0147】

これらの試験から、実施例１〜９の化合物がＢＡＣＥを阻害し、それゆえＡベータレベルを低減するのに有用であることが示される。

【0148】

併用試験
ＢＡＣＥ阻害剤供給パイロット試験
ＢＡＣＥ阻害剤単独による最小〜著しい血漿及び脳Ａベータ低減を提供する用量を定義するために、パイロット薬物動態及び薬力学試験を、式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩などのＢＡＣＥ阻害剤を含有する固形飼料を供給されたＰＤＡＰＰマウスにおいて実施する。若齢ＰＤＡＰＰマウスに、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇの「半量ずつ１日２回」の均等用量でＢＡＣＥ阻害剤を含有する固形飼料を含有する飼料を１４日間、供給する。公認のげっ歯類用飼料#8728CM(Harlan labs)１グラムあたり約０．０５、０．１５、０．５又は１．５ｍｇのＢＡＣＥ阻害剤を、Sorvallミキサーで１０分間混合し、その後、１５分間、Hobartミキサーで混合した後、ペレット化する。若齢雌ＰＤＡＰＰマウス３２匹を、親系統によって、ビヒクル処置群及びＢＡＣＥ阻害剤３用量からなる８匹ずつ４群に無作為化する。マウスは、１４日間の間、自由に飼料に接近でき、その後、殺処分される。マウスにＣＯ_２で麻酔して、心穿刺によって血液をＥＤＴＡコーティング遠沈管に採取して、氷上に貯蔵する。続いて、血液試料を室温にて１４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離することによって血漿を採取し、未処置のマイクロ遠沈管に移し、その後、ドライアイス上で凍結させて、分析まで−８０℃で貯蔵する。マウスを断頭によって殺処分し、脳を迅速に半分に顕微解剖して、ドライアイス上で急速冷凍し、分析まで−８０℃で貯蔵する（Ａベータ分析のための半分と、化合物暴露測定のためのもう半分）。脳実質Ａベータの分析では、脳試料を５．５Ｍグアニジン−ＨＣｌ緩衝液（０．５ｍＬ／脳半分）中で速度５の組織断裂装置（tissue tearer）(model 985-370)で約１分間ホモジナイズする。ホモジナイズされた脳試料を、室温で一晩ニューテーションさせる（nutated）。

【0149】

ＡベータＥＬＩＳＡ分析では、抽出物を回収し、カゼイン緩衝液（０．２５％カゼインを含有する１×ＰＢＳ、０．０５％Tween20、プロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma P9340 ０、０．０１ｍｇ／ｍｌ）を含む１％チメロサール、ｐＨ７．４）に少なくとも１：１０で希釈し、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。血漿Ａベータの分析では、試料を標本緩衝液（ＰＢＳ；０．０５％Triton X-405；０．０４％チメロサール（thimerasol）、０．６％ＢＳＡ）で１：２に希釈した後、ＥＬＩＳＡによって分析する。血漿ヒトＡベータ_１−ｘを、ｍ２６６．２(抗Ａベータ_{１３−２８})及びビオチン化３Ｄ６（抗Ａベータ１−５）をそれぞれ捕捉及びレポータ抗体として用いてサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。未知量を二重測定でアッセイし、８点標準曲線から内挿し、その後、希釈率に適合させることによって（Soft Max Pro v. 5.0.1、Molecular Dynamics；参照曲線の４パラメータフィットを利用）ｐｇ／ｍＬを決定する。脳実質Ａベータを先に記載された通りサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定し、値をタンパク質レベルに正規化して（Bradford Coomassie Plus Protein法によって二重測定で決定）、ｐｇ／ｍｇタンパク質として表す。

【0150】

ＢＡＣＥ阻害剤の組織及び血漿レベルを測定するために、以下の方法を利用した：ＢＡＣＥ阻害剤の０．１ｍｇ／ｍＬ標準原液を、メタノール／水（１：１、ｖ／ｖ）で系列希釈し、標準溶液を調製してその後、それを用い、対照血漿及び脳ホモジネートを添加して、分析物濃度１、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、２０００、４０００、及び５０００ｎｇ／ｍＬを得る。分析の前に、超音波破砕装置を用い、３倍容量のメタノール／水（１：４、ｖ／ｖ）中で、脳試料をホモジナイズする。各試験試料、適切な較正標準及び対照マトリックス試料のアリコットを、９６ウェルプレートに移し、その後、内部標準を含むアセトニトリルと混合する。混合した後、試料を遠心分離して、沈殿したタンパク質をペレット化する。得られた上清のアリコットをその後、清潔な９６ウェルプレートに移して、メタノール／水（１：１、ｖ／ｖ）で希釈し、１０マイクロリットルのアリコットをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析する。検量線標本の重回帰によって決定された応答対濃度関連性を利用して、分析物濃度を計算する。

【0151】

インビボ併用試験
抗Ｎ３ｐＧｌｕ ＡベータモノクローナルＶＩＩ（表１のｍＥ８ｃ−ＩｇＧ２ａ参照；米国特許第８，６７９，４９８ Ｂ２号；ＵＳＳＮ１３／８１０，８９５号に記載された通り）などの抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と、式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩などのＢＡＣＥ阻害剤と、の併用プラーク減少療法を評価するために、ＰＤＡＰＰマウスの大型コホートを最初、１６〜１８ヶ月齢に加齢させる。加齢したＰＤＡＰＰマウスを、性別、親系統、及び月齢に基づく５つの処置群に無作為化する。処置群あたりに２０〜３０匹の加齢したＰＤＡＰＰマウスが存在する。群１は、治療的処置の前に病態のベースラインレベルを決定するために、試験開始時０時目として殺処分される（以下に剖検を記載）。残りの４群は、その後、以下の通り処置される：群２ プラセボ固形試料を受け、対照アイソタイプＩｇＧ２ａ抗体１２．５ｍｇ／ｋｇの注射を週に１回受ける対照動物；群３ 抗Ｎ３ｐＧｌｕ−Ａベータモノクローナル抗体１２．５ｍｇ／ｋｇの注射を週に１回受ける動物；群４ パイロット供給試験で過去に定義されているが、典型的には約３〜３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量のＢＡＣＥ阻害剤固形飼料を受ける動物；群５ ＢＡＣＥ阻害剤固形飼料（約３〜３０ｍｇ／ｋｇ／日）を受け、抗Ｎ３ｐＧｌｕ−Ａベータモノクローナル抗体１２．５ｍｇ／ｋｇの注射を週に１回受ける動物。抗Ｎ３ｐＧｌｕ−Ａベータモノクローナル抗体は、ＰＢＳ中の抗体からなる滅菌標準原液から希釈され、腹腔内注射によって動物に投与される。ＢＡＣＥ阻害剤をばらの固形飼料（所望の用量に応じて飼料１グラムあたり化合物約０．１５〜１．５ｍｇ）と混合して、飼料ペレットに圧縮する。動物の体重を、試験開始時と、続いて処置の一ヶ月目は週に１回、その後の試験期間は月１回記録する。食物摂取量もまた、試験期間の間、規則的間隔でモニタリングする。動物は、計４ヶ月の試験処置を受ける。動物は、最後の抗体注射後１週間目に実施する剖検まで各飼料を継続する。剖検の際、動物を麻酔にかけ、ＥＤＴＡを予めすすいだ１ｍｌシリンジを用いて、心穿刺によって血液を得る。血液試料を氷上で採取し、血漿を標準的な遠心分離によって単離する。次に、動物を低温ヘパリン添加生理食塩水で灌流して、脳を取り出し、左半球と右半球に切断する。一方の脳半球を急速冷凍し、組織学的分析用に貯蔵する。残りの脳半球は、海馬、皮質、小脳、及び中脳からなる組織断片に切断し、次にドライアイス上で凍結させる。血漿及び組織試料を、分析時間まで−８０℃で貯蔵する。

【0152】

薬物動態評価
血漿の薬物動態特性を、剖検の際に得られた血漿試料で測定する。プレートを抗原（Ａベータ_{ｐ３−４２}）でコーティングし、次に、希釈された血漿試料、又はアッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋対照ネズミ血漿）での抗Ｎ３ｐＧｌｕモノクローナル抗体の系列希釈からなる参照標準と共にインキュベートする、抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイで血漿抗体レベルを測定する。プレートを洗浄した後、結合した根ズム抗体を抗ネズミＨＲＰコンジュゲート抗体で検出し、その後、ＴＭＢで発色させた。ＢＡＣＥ阻害剤の組織（中脳）及び血漿レベルを測定するために、以下の方法を用いる：ＢＡＣＥ阻害剤の０．１ｍｇ／ｍｌ標準原液をメタノール／水（１：１、ｖ／ｖ）で系列希釈して、標準溶液を調製し、その後、それを用い、対照血漿及び脳ホモジネートを添加して、分析物濃度１、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、２０００、４０００、及び５０００ｎｇ／ｍＬを得る。分析の前に、超音波破砕装置を用い、３倍容量のメタノール／水（１：４、ｖ／ｖ）中で、脳試料をホモジナイズする。各試験試料、適切な較正標準及び対照マトリックス試料のアリコットを、９６ウェルプレートに移し、その後、内部標準を含むアセトニトリルと混合する。混合した後、試料を遠心分離して、沈殿したタンパク質をペレット化する。得られた上清のアリコットをその後、清潔な９６ウェルプレートに移して、メタノール／水（１：１、ｖ／ｖ）で希釈し、１０マイクロリットルのアリコットをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析する。検量線標本の重回帰によって測定された応答対濃度関連性を利用して、分析物濃度を計算する。

【0153】

薬力学的評価
脳実質Ａベータ濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡによってグアニジン可溶化組織ホモジネート中で測定する。シリコン処理されたガラスビーズ１ｍｌを含有する２ｍｌディープウェルディッシュにおいてｐＨ８．０の５．５Ｍグアニジン／５０ｍＭ Tris／０．５×プロテアーゼインヒビターカクテル１ｍｌに凍結組織を抽出させる、ビードビーター技術によって、組織抽出を実施する（密閉したプレートをそれぞれ３分間からなる２回の間隔の間、振とうさせた）。得られた組織溶解物を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって、Ａベータ_１−４０及びＡベータ_１−４２について分析する：ビードビーター試料を２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔで１：１０に希釈し、試料フィルタープレート（Millipore）でろ過する。試料、ブランク、標準、品質管理試料を、２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中の０．５５Ｍグアニジン／５ｍＭ Trisでさらに希釈した後、試料プレートを加える。参照標準を試料希釈液で希釈する。１５μｇ／ｍｌの捕捉抗体２１Ｆ１２（抗Ａベータ_４２）又は２Ｇ３（抗Ａベータ_４０）でコーティングされたプレートを、試料と共にインキュベートして、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔに希釈されたビオチン化３Ｄ６（抗Ａベータ_１−ｘ）と、続く２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中の１：２０Ｋ希釈NeutrAvidin-HRP(Pierce)で検出を実施して、ＴＭＢ(Pierce)で発色させる。Ａベータレベルを標準曲線から内挿して、最終組織濃度を、組織湿重量１ミリグラムあたりのＡベータのナノグラムとして計算する。沈着したＡベータが占める海馬及び皮質の面積％を、組織学的に測定する。クリオスタットでの連続冠状切片（７〜１０μｍ厚）を、１０μｇ／ｍｌのビオチン化３Ｄ６（抗Ａベータ_１−ｘ）又は陰性対照ネズミＩｇＧ（ビオチン化）と共にインキュベートする。ビオチンに特異的な二次ＨＲＰ試薬を用い、沈着したＡベータをDAB-Plus (DAKO)で視覚化する。獲得した画像をImage Pro plus software (Media Cybernetics)で解析することによって、海馬又は皮質内の画定された該当領域内で、免疫反応性Ａベータ沈着を定量する。

【0154】

これらの試験は、抗Ｎ３ｐＧｌｕ−Ａベータモノクローナル抗体とＢＡＣＥ阻害剤、例えば式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩との併用が、個々の単独療法に比較してＡベータ低減を増進させ得ることを示す可能性がある。

本発明は以下の態様を含む。
［１］
患者におけるアルツハイマー病を処置する方法であって、有効量の式：

【化79】

で示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、有効量の抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用して、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む、方法。
［２］
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、Ｂ１２Ｌ又はＲ１７Ｌである、［１］に記載の方法。
［３］
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、Ｂ１２Ｌである、［１］又は［２］のいずれかに記載の方法。
［４］
前記化合物が、Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
前記化合物が、結晶形態２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
前記結晶形態２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドが、０．２°の回折角に対する公差で、回折角２θが１１．８°のＸ線回折スペクトルの実質的ピークと、１８．６°、１９．３°及び２６．７°からなる群から選択される１つ又は複数のピークにより特徴づけられる、［５］に記載の方法。
［７］
前記化合物と前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、同時に投与される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
前記化合物が、前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体の投与前に投与される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［９］
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、前記化合物の投与前に投与される、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［１０］
１種又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を有する抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体の医薬組成物と併用される、１種又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を有する式：

【化80】

で示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物。
［１１］
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、Ｂ１２Ｌ又はＲ１７Ｌである、［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、Ｂ１２Ｌである、［１０］又は［１１］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１３］
前記化合物が、Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１４］
前記化合物が、結晶形態２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、［１０］〜［１３］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１５］
前記結晶形態２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドが、０．２°の回折角に対する公差で、回折角２θが１１．８°のＸ線回折スペクトルの実質的ピークと、１８．６°、１９．３°及び２６．７°からなる群から選択される１つ又は複数のピークにより特徴づけられる、［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］
アルツハイマー病の処置に用いるための、抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体と併用される、式：

【化81】

で示される化合物、又はその薬学的に許容可能な塩。
［１７］
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、Ｂ１２Ｌ又はＲ１７Ｌである、［１６］に記載の使用。
［１８］
前記抗Ｎ３ｐＧｌｕ Ａベータモノクローナル抗体が、Ｂ１２Ｌである、［１６］又は［１７］のいずれかに記載の使用。
［１９］
前記化合物が、Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、［１６］〜［１８］のいずれかに記載の使用。
［２０］
前記化合物が、結晶形態２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、［１６］〜［１９］のいずれかに記載の使用。
［２１］
前記結晶形態２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ（４Ｈ）−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドが、０．２°の回折角に対する公差で、回折角２θが１１．８°のＸ線回折スペクトルの実質的ピークと、１８．６°、１９．３°及び２６．７°からなる群から選択される１つ又は複数のピークにより特徴づけられる、［２０］に記載の使用。

【0155】

配列表
<SEQ ID NO: 1; PRT1; 人工> (LCDR1- B12L/R17L)
KSSQSLLYSRGKTYLN

<SEQ ID NO: 2; PRT1; 人工> (LCDR2 - B12L/R17L)
AVSKLDS

<SEQ ID NO: 3; PRT1; 人工> (LCDR3 - B12L/R17L)
VQGTHYPFT

<SEQ ID NO: 4; PRT1; 人工> (HCDR1 - B12L)
GYDFTRYYIN

<SEQ ID NO: 5; PRT1; 人工> (HCDR1 - R17L)
GYTFTRYYIN

<SEQ ID NO: 6; PRT1; 人工> (HCDR2 - B12L/R17L)
WINPGSGNTKYNEKFKG

<SEQ ID NO: 7; PRT1; 人工> (HCDR3 - B12L)
EGITVY

<SEQ ID NO: 8; PRT1; 人工> (HCDR3 - R17L)
EGTTVY

<SEQ ID NO: 9; PRT1; 人工> (LCVR - B12L/R17L)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSRGKTYLNWLLQKPGQSPQLLIYAVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHYPFTFGQGTKLEIK

<SEQ ID NO: 10; PRT1; 人工> (HCVR - B12L)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYDFTRYYINWVRQAPGQGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSＥＤＴＡVYYCAREGITVYWGQGTTVTVSS

<SEQ ID NO: 11; PRT1; 人工> (HCVR - R17L)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRYYINWVRQAPGQGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSＥＤＴＡVYYCAREGTTVYWGQGTTVTVSS

<SEQ ID NO: 12; PRT1; 人工> (LC - B12L/R17L)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSRGKTYLNWLLQKPGQSPQLLIYAVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCVQGTHYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

<SEQ ID NO: 13; PRT1; 人工> (HC - B12L)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYDFTRYYINWVRQAPGQGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSＥＤＴＡVYYCAREGITVYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

<SEQ ID NO: 14; PRT1; 人工> (HC - R17L)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTRYYINWVRQAPGQGLEWMGWINPGSGNTKYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSＥＤＴＡVYYCAREGTTVYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]