特許 6339980 内分泌前駆細胞、膵臓ホルモン発現細胞及びそれらの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6339980

(24)【登録日】2018年5月18日

(45)【発行日】2018年6月6日

(54)【発明の名称】内分泌前駆細胞、膵臓ホルモン発現細胞及びそれらの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20180528BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20180528BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/071

   C12N5/0735

【請求項の数】5

【全頁数】129

(21)【出願番号】特願2015-153742(P2015-153742)

(22)【出願日】2015年8月3日

(62)【分割の表示】特願2013-242867(P2013-242867)の分割

【原出願日】2007年3月2日

(65)【公開番号】特開2015-192677(P2015-192677A)

(43)【公開日】2015年11月5日

【審査請求日】2015年9月2日

(31)【優先権主張番号】60/778,649

(32)【優先日】2006年3月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/833,633

(32)【優先日】2006年7月26日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/852,878

(32)【優先日】2006年10月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503431792

【氏名又は名称】ヴィアサイト，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(72)【発明者】

【氏名】ダムール，ケヴィン

(72)【発明者】

【氏名】カーペンター，メリッサ

(72)【発明者】

【氏名】バン，アンネ

(72)【発明者】

【氏名】ムーアマン，マーク

(72)【発明者】

【氏名】ケリー，オリビア ジー．

(72)【発明者】

【氏名】ベートゲ，エマニュエル イー．

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０１６９９９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００４−５３１２６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５０３７５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５００００３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／１１６０７３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 Stem Cells，２００４年，Vol.22，p.265-274

【文献】 Stem Cells，２００５年，Vol.23，p.656-662

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

移植用の、ＰＤＸ１陽性膵臓上皮細胞を含む細胞集団を製造する方法であって、以下のステップを含む、方法。
ａ．ＳＯＸ１７を発現するＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含むインビトロ細胞集団をレチノイドと接触させること；および
ｂ．ステップａからの細胞をＮ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）と接触させ、ＰＤＸ１陽性膵臓上皮細胞を含む細胞集団を製造すること。

【請求項2】

前記ステップａからの細胞をノギンに接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ステップａからの細胞が膵臓内胚葉である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記膵臓上皮細胞が、ＮＫＸ６．１又はＰＴＦ１Ａをさらに発現する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記膵臓上皮細胞がインスリン又はグルカゴンを発現しない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医学及び細胞生物学の分野に関する。特に、本発明は、哺乳類内分泌前駆細胞を含む組成物、及び膵臓ホルモン発現細胞を含む組成物、並びにこのような細胞を製造及び使用する方法に関する。

【0002】

［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許仮出願第６０／８５２，８７８号（表題「ＮＣＡＭを使用する、内分泌前駆細胞、未熟膵島細胞及び成熟膵島細胞の濃縮（ENRICHMENT OF ENDOCRINE PRECURSOR CELLS, IMMATURE PANCREATIC ISLET CELLS AND MATURE PANCREATIC ISLET CELLS USING NCAM）」、２００６年１０月１８日出願）に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基
づく優先権を主張し、且つ米国特許仮出願第６０／８３３，６３３号（表題「インスリン産生細胞及び産生方法（INSULIN-PRODUCING CELLS AND METHOD OF PRODUCTION）」、２００６年７月２６日出願）に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張し、且つ米国特許仮出願第６０／７７８，６４９号（表題「インスリン産生細胞及び産生方法（INSULIN-PRODUCING CELLS AND METHOD OF PRODUCTION）」、２００６年３月２日出願）に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張する正規の出願である。上に列記した優先権出願それぞれの開示内容全体が、参照により本明細書中に援用される。

【背景技術】

【0003】

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、ヒト体細胞組織及び器官を全て包含する分化細胞型を産生する能力がある。インスリン依存性糖尿病の細胞療法による治療に最も重要なことは、グルコース刺激インスリン放出に対して膵島と同様に機能する膵臓内分泌細胞の非制限産生である。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚性幹細胞から誘導されるグルコース応答性インスリン産生細胞、並びにこのような細胞を産生する確かな方法が必要である。

【発明の開示】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明の幾つかの実施の形態は、例えばヒト膵島ホルモン発現細胞細胞を含む細胞培養物等の組成物に関する。このような実施の形態において、ヒト膵島ホルモン発現細胞の量は細胞培養物に存在するヒト細胞の約２％〜約８０％の範囲であり得る。本発明の幾つかの実施の形態において、膵島ホルモン発現細胞は、成熟膵島ホルモン発現細胞、未熟膵島ホルモン発現細胞、又は成熟及び未熟膵島ホルモン発現細胞の組合せのいずれかであり得る。或る特定の実施の形態において、ヒト膵島ホルモン発現細胞はグレリン、インスリン、ソマトスタチン及びグルカゴンから成る群から選択される１つ又は複数のホルモンを発現する。幾つかの実施の形態において、膵島ホルモン発現細胞は、グルコース刺激に応じてインスリンを発現する。

【0005】

他の実施の形態は、ヒト膵島ホルモン発現細胞及びヒト内分泌前駆細胞の両方を含む細胞培養物に関する。このような実施の形態において、ヒト内分泌前駆細胞の量は細胞培養物に存在する細胞の約５％〜約８０％の範囲であり得る。幾つかの実施の形態において、細胞培養物は主に、未熟膵島ホルモン発現細胞及び内分泌前駆細胞を含む。他の実施の形態において、細胞培養物は、成熟及び未熟膵島ホルモン発現細胞の両方、並びに内分泌前駆細胞を含む。

【0006】

本明細書に記載される幾つかの実施の形態は、ヒト内分泌前駆細胞を含むが、ヒト膵島ホルモン発現細胞細胞をほとんど含んでいない細胞培養物等の組成物を含む。このような実施の形態において、ヒト内分泌前駆細胞の量は細胞培養物に存在するヒト細胞の約５％
〜約８０％の範囲であり得る。或る特定の実施の形態において、ヒト内分泌前駆細胞は、ニューロゲニン３（ＮＥＵＲＯＧ３又はＮＧＮ３）、ペアードボックス４（ＰＡＸ４）及びＮＫＸ２転写因子関連遺伝子座２（ＮＫＸ２．２）から成る群から選択されるマーカーを発現する。

【0007】

他の実施の形態は、ヒト内分泌前駆細胞及びヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞）（ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は、腸管の前部から誘導される、細胞、組織又は器官に分化することができるＰＤＸ１発現多能性細胞である）の両方を含む細胞培養物に関する。このような実施の形態において、ヒト内分泌前駆細胞は当該細胞培養物に存在する細胞の約５％〜約９５％の範囲であり得る。幾つかの実施の形態において、ヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の量は当該細胞培養物に存在する細胞の約５％〜約９５％の範囲であり得る。

【0008】

本発明のまたさらなる実施の形態は、ヒト成熟膵島ホルモン発現細胞、ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞、及びヒト内分泌前駆細胞を産生する方法に関する。幾つかの実施の形態において、ヒト成熟膵島ホルモン発現細胞が、ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞から産生される。幾つかの実施の形態において、ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が、ヒト内分泌前駆細胞から産生される。幾つかの実施の形態において、ヒト内分泌前駆細胞が、ヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞から産生される。

【0009】

本発明の他の実施の形態は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）又は他のヒト多能性細胞からヒト膵島ホルモン発現細胞を産生する方法に関する。このような実施の形態において、初めにｈＥＳＣ又は他のヒト多能性細胞がヒト胚体内胚葉細胞に分化する。胚体内胚葉細胞は、腸管の細胞又はそれから誘導される器官に分化することができる多能性細胞である。ヒト胚体内胚葉細胞及びその産生は、２００４年１２月２３日に提出された米国特許出願第１１／０２１６１８号（その開示内容全体が参照により援用される）に記載されている。それから、胚体内胚葉細胞は前腸内胚葉に分化する。ヒト前腸内胚葉細胞は、腸管の前部から誘導される、細胞、組織又は器官に分化することができる多能性細胞である。前腸内胚葉細胞及びその産生は、２００５年１０月２７日に提出された米国特許仮出願第６０／７３０９１７号（その開示内容全体が参照により援用される）に記載されている。それから、前腸内胚葉細胞はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）に分化する。ヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は、腸管の前部から誘導される、細胞、組織又は器官に分化することができる多能性細胞である。ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞及びその産生は、２００５年４月２６日に提出された米国特許出願第１１／１１５８６８号及び２００５年１０月２７日に提出された米国特許仮出願第６０／７３０９１７号（それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。２００６年７月２６日に提出された米国特許仮出願第６０／８３３，６３３号（その開示内容全体が参照により本明細書に援用される）並びに本明細書で記載の方法に記載されるように、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は、内分泌前駆細胞に分化し、未熟、それから最終的に成熟膵島ホルモン発現細胞に分化する。

【0010】

本明細書に記載の他の実施の形態は、ヒト内分泌前駆細胞が濃縮された細胞集団を産生する方法と、ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が濃縮された細胞集団を産生する方法とに関する。幾つかの実施の形態において、内分泌前駆細胞が濃縮された細胞集団を産生する方法は、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）と結合する試薬を、ヒト内分泌前駆細胞を含む細胞集団に供給すること、及び試薬と結合したヒト内分泌前駆細胞を試薬と結合しない細胞から分離することを伴う。同様に、幾つかの実施の形態において、ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が濃縮された細胞集団を産生する方法は、ＮＣＡＭと結合する試薬を、ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞集団に供給すること、及び試薬と結合したヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を試薬と結合しない細胞から分離することを伴う。幾つかの実施の形態に
おいて、未熟膵島ホルモン発現細胞のさらなる濃縮は、ＮＣＡＭ陽性細胞集団をＣＤ１３３と結合する第２の試薬に接触させること、及びそれから第２の試薬と結合する細胞を細胞集団から除去することによって達成することができる。

【0011】

本発明の幾つかの実施の形態において、本明細書に記載の方法によって産生されるヒト膵島ホルモン発現細胞を含む細胞集団は、ヒト内分泌前駆細胞から誘導することができる。ヒト内分泌前駆細胞が濃縮された細胞集団を産生する方法の或る特定の実施の形態において、内分泌前駆細胞は、ヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞から誘導することができる。またさらなる実施の形態において、ヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞はヒト前腸内胚葉細胞から誘導される。なおさらなる実施の形態において、ヒト前腸内胚葉細胞はヒト胚体内胚葉細胞から誘導される。またさらなる実施の形態において、ヒト胚体内胚葉細胞はヒト胚性幹細胞から誘導される。

【0012】

本発明の他の実施の形態は、ヒト内分泌前駆細胞が濃縮された細胞集団に関する。或る特定の実施の形態において、ヒト内分泌前駆細胞が濃縮された細胞集団は、ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）を発現するが、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ及びＧＨＲＬから成る群から選択されるマーカーを実質的に発現しない約５％を超えるヒト内分泌前駆細胞を含む。幾つかの実施の形態において、ヒト内分泌前駆細胞が濃縮された細胞集団は、ヒト内分泌前駆細胞が濃縮された細胞集団の産生に本明細書に記載の方法を用いて得られる。

【0013】

本発明のさらに他の実施の形態は、ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が濃縮された細胞集団に関する。濃縮された細胞集団は本明細書に記載の方法によって得ることができ、ＮＣＡＭと結合する試薬を、未熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞集団に供給すること、及び当該試薬と結合した細胞を試薬と結合しない細胞から分離することを含む。或る特定の実施の形態において、細胞集団は、ＭＡＦＢを発現するが、ＭＡＦＡ及び／又はＮＧＮ３を実質的に発現しない未熟膵臓ホルモン発現細胞を少なくとも約２５％〜少なくとも約９０％含む。幾つかの実施の形態において、濃縮された細胞集団は、ＭＡＦＢを発現するが、ＭＡＦＡ及び／又はＮＧＮ３を実質的に発現しない未熟膵島ホルモン発現細胞を少なくとも約５０％含む。

【0014】

本発明のさらに他の実施の形態は、ヒト多能性細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されるヒト成熟膵島ホルモン発現細胞が濃縮された細胞集団に関する。濃縮された細胞集団は、本明細書に記載の方法によって、例えばＮＣＡＭと結合する試薬をヒト多能性細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する膵島ホルモン発現細胞を含む細胞集団に供給すること、及び当該試薬と結合する細胞を試薬と結合しない細胞から分離することによって得ることができる。或る特定の実施の形態において、細胞集団は、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ及びＰＰから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現するが、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ及びＮＦＭから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを実質的に発現しない膵臓ホルモン発現細胞を少なくとも約２５％〜少なくとも約９０％含む。幾つかの実施の形態において、濃縮された細胞集団は、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ及びＰＰを発現するが、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ及びＮＦＭから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを実質的に発現しない未熟膵島ホルモン発現細胞を少なくとも約５０％含む。

【0015】

本発明のさらなる実施の形態は、ＮＣＡＭ結合試薬と、ＮＣＡＭを発現するヒト内分泌前駆細胞、ＮＣＡＭを発現するヒト未熟膵島ホルモン発現細胞、又はＮＣＡＭを発現するヒト成熟膵島ホルモン発現細胞を含むｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体に関する。或る特定の実施の形態において、内分泌前駆細胞、未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞は、ヒト多能性細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導される。試薬−細胞
複合体の試薬は、抗ＮＣＡＭ抗体、及び抗ＮＣＡＭ抗体断片、又はＮＣＡＭリガンド等の分子を含み得る。

【0016】

本発明の他の態様は、それらの発生のいずれかの段階の間で酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下では分化しなかった、本明細書に記載のようなｉｎ
ｖｉｔｒｏ細胞培養物及びｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団に関する。本明細書に包含される他の態様は、酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の非存在下で内分泌前駆細胞培養物若しくは細胞集団、及び／又は膵臓ホルモン発現細胞培養物若しくは細胞集団を産生する方法に関する。このような態様において、ｈＥＳＣは、酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の非存在下で胚体内胚葉細胞、並びに胚体内胚葉、例えば内分泌前駆細胞及び膵臓ホルモン発現細胞から誘導される細胞型に分化する。

【0017】

本発明のさらに他の態様は、非組み換え型又は非遺伝子操作型のヒト内分泌前駆細胞及び／又はヒト膵臓ホルモン発現細胞を含む細胞培養物及び細胞集団に関する。幾つかの実施の形態において、細胞培養物及び／又は細胞集団の非組み換えヒト内分泌前駆細胞及び／又はヒト膵臓ホルモン発現細胞は、非組み換えｈＥＳＣから分化する。幾つかの実施の形態において、非組み換えｈＥＳＣは、胚体内胚葉細胞、並びに胚体内胚葉、例えば内分泌前駆細胞及び膵臓ホルモン発現細胞から誘導される細胞型に分化する。

【0018】

或る特定の権限において、「含む」という用語の一般的に許容された定義は何もあり得ない。本明細書に記載されるように、「含む」という用語は、任意のさらなる要素の含入を可能にする「オープンな」言語を表すことが意図される。このことに留意して、本発明のさらなる実施の形態を、以下の番号を付した段落を参照しながら説明する。

【0019】

１．ヒト細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物であって、該ヒト細胞の少なくとも約２％が、グレリン、インスリン、ソマトスタチン及びグルカゴンから成る群から選択される少なくとも１つの膵臓ホルモンを発現する膵島ホルモン発現細胞であり、当該膵島ホルモン発現細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト多能性細胞から誘導される、細胞培養物。

【0020】

２．前記ヒト細胞の少なくとも約５％が膵島ホルモン発現細胞である、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0021】

３．前記ヒト細胞の少なくとも約１０％が膵島ホルモン発現細胞である、段落１のｉｎ
ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0022】

４．前記ヒト細胞の少なくとも約１０％がニューロゲニン３（ＮＥＵＲＯＧ３）を発現するヒト内分泌前駆細胞である、段落１〜３のいずれかのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0023】

５．前記ヒト内分泌前駆細胞が、ペアードボックス４（ＰＡＸ４）及びＮＫＸ２転写因子関連遺伝子座２（ＮＫＸ２．２）から成る群から選択されるマーカーを発現する、段落４のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0024】

６．前記ヒト細胞の少なくとも約５０％が、ニューロゲニン３（ＮＥＵＲＯＧ３）を発現するヒト内分泌前駆細胞である、段落１〜３のいずれかのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0025】

７．前記ヒト内分泌前駆細胞が、ペアードボックス４（ＰＡＸ４）及びＮＫＸ２転写因子関連遺伝子座２（ＮＫＸ２．２）から成る群から選択されるマーカーを発現する、段落６のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0026】

８．前記膵島ホルモン発現細胞が、グレリン、インスリン、ソマトスタチン及びグルカゴンから成る群から選択される少なくとも２つのホルモンを発現する、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0027】

９．前記膵島ホルモン発現細胞がグレリン、インスリン、ソマトスタチン及びグルカゴンを発現する、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0028】

１０．前記膵島ホルモン発現細胞の少なくとも約５％がインスリンを発現するが、グレリン、ソマトスタチン及びグルカゴンを有意に発現しない、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0029】

１１．前記膵島ホルモン発現細胞の少なくとも約１０％がインスリンを発現するが、グレリン、ソマトスタチン及びグルカゴンを有意に発現しない、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0030】

１２．前記膵島ホルモン発現細胞の少なくとも約２０％がインスリンを発現するが、グレリン、ソマトスタチン及びグルカゴンを有意に発現しない、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0031】

１３．前記膵島ホルモン発現細胞の少なくとも約３０％がインスリンを発現するが、グレリン、ソマトスタチン及びグルカゴンを有意に発現しない、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0032】

１４．インスリンがグルコース刺激に応じて分泌される、段落１０〜１３のいずれか１つのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0033】

１５．Ｃ−ペプチドがグルコース刺激に応じて分泌される、段落１０〜１３のいずれか１つのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0034】

１６．前記膵島細胞の少なくとも１０％が膵島細胞クラスターに存在する、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0035】

１７．前記膵島ホルモン発現細胞が、膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、ＩＳＬ１転写因子（ＩＳＬ１）、ＮＫＸ６転写因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）及びペアードボックス６（ＰＡＸ６）から成る群から選択されるマーカーをさらに発現する、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0036】

１８．前記膵島ホルモン発現細胞が、ニューロゲニン３（ＮＥＵＲＯＧ３）及びペアードボックス遺伝子４（ＰＡＸ４）から成る群から選択されるマーカーを実質的に発現しない、段落１７のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0037】

１９．少なくとも約１つの膵島ホルモン発現細胞が、前記細胞培養物において約１０個の内分泌前駆細胞毎に存在する、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0038】

２０．少なくとも約１つの膵島ホルモン発現細胞が、前記細胞培養物において約５個の内分泌前駆細胞毎に存在する、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0039】

２１．少なくとも約１つの膵島ホルモン発現細胞が、前記細胞培養物において約２個の内分泌前駆細胞毎に存在する、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0040】

２２．前記膵島ホルモン発現細胞が非組み換え細胞である、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0041】

２３．ニコチンアミド（ＮＩＣ）、エキセンジン４（Ｅｘ４）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）及びそれらの組合せから成る群から選択される因子を含む培地をさらに含む、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0042】

２４．エキセンジン４（Ｅｘ４）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）及びそれらの組合せから成る群から選択される因子を含む培地をさらに含む、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0043】

２５．約１０ｍＭの濃度でニコチンアミド（ＮＩＣ）を含む培地をさらに含む、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0044】

２６．約４０ｎｇ／ｍｌの濃度でエキセンジン４（Ｅｘ４）を含む培地をさらに含む、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0045】

２７．約２５ｎｇ／ｍｌの濃度で肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含む培地をさらに含む、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0046】

２８．約５０ｎｇ／ｍｌの濃度でインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）を含む培地をさらに含む、段落１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0047】

２９．ヒト細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物であって、当該ヒト細胞の少なくとも約５％がニューロゲニン３（ＮＥＵＲＯＧ３）を発現する内分泌前駆細胞であり、当該内分泌前駆細胞がインスリン、ソマトスタチン及びグルカゴンから成る群から選択される少なくとも１つの膵臓ホルモンを発現する膵島ホルモン発現細胞に分化することができる多能性細胞である、ヒト細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0048】

３０．前記ヒト細胞の少なくとも約１０％が内分泌前駆細胞である、段落２９のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0049】

３１．前記ヒト細胞の少なくとも約２５％が内分泌前駆細胞である、段落２９のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0050】

３２．前記ヒト細胞の少なくとも約５０％が内分泌前駆細胞である、段落２９のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0051】

３３．前記ヒト細胞の少なくとも約１０％が、ヒト膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）陽性膵臓内胚葉細胞である、段落２９〜３２のいずれかのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0052】

３４．前記ヒト細胞の少なくとも約２５％が、ヒト膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）陽性膵臓内胚葉細胞である、段落２９〜３２のいずれかのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0053】

３５．前記ヒト細胞の少なくとも約５０％が、ヒト膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）陽性膵臓内胚葉細胞である、段落２９〜３２のいずれかのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0054】

３６．ヒト膵島ホルモン発現細胞を実質的に欠いている、段落２９〜３２のいずれかのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0055】

３７．前記ヒト細胞の少なくとも約１０％が、ヒト膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）陽性膵臓内胚葉細胞である、段落３６のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0056】

３８．前記ヒト細胞の少なくとも約２５％が、ヒト膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）陽性膵臓内胚葉細胞である、段落３６のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0057】

３９．前記ヒト細胞の少なくとも約５０％が、ヒト膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）陽性膵臓内胚葉細胞である、段落３６のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0058】

４０．前記内分泌前駆細胞がペアードボックス４（ＰＡＸ４）及びＮＫＸ２転写因子関連遺伝子座２（ＮＫＸ２．２）から成る群から選択されるマーカーを発現する、段落２９のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0059】

４１．少なくとも約１個の内分泌前駆細胞が、前記細胞培養物において約１０個のＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に存在する、段落２９のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0060】

４２．少なくとも約１個の内分泌前駆細胞が、前記細胞培養物において約５個のＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に存在する、段落２９のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0061】

４３．少なくとも約１個の内分泌前駆細胞が、前記細胞培養物において約２個のＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に存在する、段落２９のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0062】

４４．前記内分泌前駆細胞が非組み換え細胞である、段落２９のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0063】

４５．Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）を含む培地をさらに含む、段落２９のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0064】

４６．前記ＤＡＰＴの濃度が少なくとも約１μＭである、段落４５のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0065】

４７．前記ＤＡＰＴの濃度が約３μＭである、段落４５のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0066】

４８．レチノイン酸（ＲＡ）及びエキセンジン４（Ｅｘ４）から選択される因子をさらに含む、段落４５のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0067】

４９．前記培地がＣＭＲＬである、段落４５のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

【0068】

５０．ヒト膵島ホルモン発現細胞に分化することができる多能性細胞であるヒト内分泌前駆細胞を含む細胞集団を得る工程と、前期細胞集団においてヒト膵臓ホルモン発現細胞の存在を検出することによって求められる、ヒト膵島ホルモン発現細胞が形成されるのに十分な時間、培養培地で該ヒト内分泌前駆細胞をインキュベートする工程とを含む、ヒト膵島ホルモン発現細胞を製造する方法。

【0069】

５１．前記細胞集団におけるヒト細胞の少なくとも約２％が、ヒト膵島ホルモン発現細胞に分化する、段落５０の方法。

【0070】

５２．前記細胞集団におけるヒト細胞の少なくとも約５％が、ヒト膵島ホルモン発現細胞に分化する、段落５０の方法。

【0071】

５３．前記細胞集団におけるヒト細胞の少なくとも約１０％が、ヒト膵島ホルモン発現細胞に分化する、段落５０の方法。

【0072】

５４．前記ヒト内分泌前駆細胞のヒト膵島ホルモン発現細胞への分化をさらに促進するのに十分な量で、ニコチンアミド（ＮＩＣ）、エキセンジン４（Ｅｘ４）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１）及びそれらの組合せから成る群から選択される因子を前記ヒト膵臓内分泌細胞に供給することをさらに含み、当該ヒト膵島ホルモン発現細胞が、インスリン、ソマトスタチン及びグルカゴンから成る群から選択される少なくとも１つの膵臓ホルモンを発現する、段落５０の方法。

【0073】

５５．前記因子がＥｘ４、ＨＧＦ及びＩＧＦ１から成る群から選択される、段落５４の方法。

【0074】

５６．Ｅｘ４が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落５４の方法。

【0075】

５７．Ｅｘ４が、約４０ｎｇ／ｍｌの濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落５４の方法。

【0076】

５８．前記因子がＩＧＦ１である、段落５４の方法。

【0077】

５９．ＩＧＦ１が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落５８の方法。

【0078】

６０．ＩＧＦ１が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落５８の方法。

【0079】

６１．ＩＧＦ１が、約２５ｎｇ／ｍｌ〜約７５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落５８の方法。

【0080】

６２．ＩＧＦ１が、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落５８の方法。

【0081】

６３．前記細胞集団におけるヒト膵島ホルモン発現細胞の存在を検出することが、当該細胞集団の細胞において膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、グレリン（ＧＨＲＬ）、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、ＩＳＬ１転写因子（ＩＳＬ１）、ＮＫＸ６転写因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）及びペアードボックス６（ＰＡＸ６）から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を検出することを含む、段落５０の方法。

【0082】

６４．少なくとも１つの前記マーカーの発現がＱ−ＰＣＲによって求められる、段落６３の方法。

【0083】

６５．少なくとも１つの前記マーカーの発現が免疫細胞化学法によって求められる、段
落６３の方法。

【0084】

６６．ヒト内分泌前駆細胞を含む細胞集団を得る工程が、
腸管の前部から誘導される、細胞、組織又は器官に分化することができる多能性細胞であるヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を得る工程と、
γ−セクレターゼ阻害剤をヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒト内分泌前駆細胞の集団を産生する工程を含む、段落５０の方法。

【0085】

６７．前記γ−セクレターゼ阻害剤が、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）を含む、段落６６の方法。

【0086】

６８．ＤＡＰＴが、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落６７の方法。

【0087】

６９．ＤＡＰＴが、約３μＭの濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落６７の方法。

【0088】

７０．エキセンジン４（Ｅｘ４）をヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給することをさらに含む、段落６６の方法。

【0089】

７１．Ｅｘ４が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落７０の方法。

【0090】

７２．Ｅｘ４が、約４０ｎｇ／ｍｌの濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落７０の方法。

【0091】

７３．ヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を得る工程が、
腸管の前部から誘導される、細胞、組織又は器官に分化することができるＰＤＸ１陰性多能性細胞であるヒト前腸内胚葉細胞の集団を得る工程と、
レチノイドをヒト前腸内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を産生する工程を含む、段落７０の方法。

【0092】

７４．前記レチノイドがレチノイン酸（ＲＡ）である、段落７３の方法。

【0093】

７５．ＲＡが、約１ｎＭ〜約１０μＭの範囲の濃度でヒト前腸内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落７４の方法。

【0094】

７６．ヒト前腸内胚葉細胞の集団を得る工程が、
腸管の細胞又はそれから誘導される器官に分化することができる多能性細胞であるヒト胚体内胚葉細胞の集団を得る工程と、
線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ−１０）及びヘッジホッグ経路阻害剤をヒト胚体内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒト前腸内胚葉細胞の集団を産生する工程を含む、段落７３の方法。

【0095】

７７．胚体内胚葉細胞の前記集団に存在し得る前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの任意の増殖因子を回収することをさらに含む、段落７６の方法。

【0096】

７８．前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの前記増殖因子が、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びそれらの組合せから成る群から選択される、段落７７の方法。

【0097】

７９．前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの前記増殖因子がアクチビンＡである、段落７７の方法。

【0098】

８０．前記ヘッジホッグ阻害剤がＫＡＡＤ−シクロパミンを含む、段落７６の方法。

【0099】

８１．ＫＡＡＤ−シクロパミンが、約０．０１μＭ〜約１μＭの範囲の濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落８０の方法。

【0100】

８２．ＫＡＡＤ−シクロパミンが、約０．２μＭの濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落８０の方法。

【0101】

８３．ＦＧＦ−１０が、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落７６の方法。

【0102】

８４．ＦＧＦ−１０が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落７６の方法。

【0103】

８５．ＦＧＦ−１０が、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落７６の方法。

【0104】

８６．ヒト胚体内胚葉細胞の集団を得る工程が、多能性ヒト胚性幹細胞の集団を得る工程と、前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子を多能性ヒト胚性幹細胞の当該集団に供給する工程とを含む、段落７６の方法。

【0105】

８７．前記少なくとも１つの増殖因子がノーダルである、段落８６の方法。

【0106】

８８．前記少なくとも１つの増殖因子がアクチビンＡである、段落８６の方法。

【0107】

８９．前記少なくとも１つの増殖因子がアクチビンＢである、段落８６の方法。

【0108】

９０．ウィングレス型ＭＭＴＶ組込部位ファミリー成員３Ａ（Ｗｎｔ３Ａ）を多能性ヒト胚性幹細胞の前記集団に供給することをさらに含む、段落８６の方法。

【0109】

９１．前記ＴＧＦβスーパーファミリーの複数の増殖因子が供給される、段落８６の方法。

【0110】

９２．Ｗｎｔ３Ａも供給される、段落９１の方法。

【0111】

９３．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落８６の方法。

【0112】

９４．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落８６の方法。

【0113】

９５．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落８６の方法。

【0114】

９６．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落８６の方法。

【0115】

９７．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落８６の方法。

【0116】

９８．前記多能性ヒト胚性幹細胞が、約２％未満の血清を含む培地でヒト胚体内胚葉細胞に分化する、段落８６の方法。

【0117】

９９．前記多能性ヒト胚性幹細胞が、桑実胚、胚のＩＣＭ及び胚の生殖隆起から成る群から選択される組織から誘導される、段落８６の方法。

【0118】

１００．段落８６の方法によって産生されるヒト膵島ホルモン発現細胞。

【0119】

１０１．ヒト膵島ホルモン発現細胞を製造する方法であって、
（ａ）多能性ヒト胚性幹細胞の集団を得る工程と、
（ｂ）前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子を多能性ヒト胚性幹細胞の前記集団に供給し、それによりヒト胚体内胚葉細胞の集団を産生する工程と、
（ｃ）少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子をヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給し、それによりヒト前腸内胚葉細胞の集団を産生する工程と、
（ｄ）レチノイドをヒト前腸内胚葉細胞の前記集団に供給し、それによりヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を産生する工程と、
（ｅ）γ−セクレターゼ阻害剤をヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給し、それによりヒト内分泌前駆細胞を含む集団を産生する工程と、
（ｆ）ヒト膵島ホルモン発現細胞が形成されるのに十分な時間、培養培地でヒト内分泌前駆細胞の前記集団をインキュベートする工程を含む、
ヒト膵島ホルモン発現細胞を製造する方法。

【0120】

１０２．工程（ｂ）が、ヘッジホッグ経路阻害剤を供給することをさらに含む、段落１０１の方法。

【0121】

１０３．前記線維芽細胞増殖因子が、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２及びＦＧＦ２３から成る群から選択される、段落１０１の方法。

【0122】

１０４．前記線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ１０を含む、段落１０１の方法。

【0123】

１０５．工程（ｄ）が、インスリン又はインスリン様増殖因子を供給することをさらに含む、段落１０１の方法。

【0124】

１０６．前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの前記少なくとも１つの増殖因子を実質的に回収することをさらに含む、段落１０１の方法。

【0125】

１０７．前記レチノイド及び前記γ−セクレターゼ阻害剤が、ほとんど同じ時間で供給される、段落１０１の方法。

【0126】

１０８．前記前腸内胚葉細胞が、膵臓細胞にさらに分化する能力がある、段落１０１の方法。

【0127】

１０９．ヒト膵島ホルモン発現細胞を製造する方法であって、
（ａ）多能性ヒト胚性幹細胞の集団を得る工程と、
（ｂ）前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子を多能性ヒト胚性幹細胞の前記集団に供給し、それによりヒト胚体内胚葉細胞の集団を産生する工程と、
（ｃ）レチノイドをヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給し、それによりヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を産生する工程と、
（ｄ）ヒト膵島ホルモン発現細胞が形成されるのに十分な時間、レチノイドの存在下でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団をインキュベートする工程を含む、ヒト膵島ホルモン発現細胞を製造する方法。

【0128】

１１０．線維芽細胞ファミリー増殖因子をヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給する工程をさらに含む、段落１０９の方法。

【0129】

１１１．前記線維芽細胞ファミリー増殖因子がＦＧＦ１０又はＦＧＦ７を含む、段落１１０の方法。

【0130】

１１２．ヘッジホッグ経路阻害剤をヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給する工程をさらに含む、段落１０９の方法。

【0131】

１１３．前記ヘッジホッグ経路阻害剤がＫＡＡＤ−シクロパミンである、段落１１２の方法。

【0132】

１１４．前記レチノイドがレチノイン酸である、段落１０９の方法。

【0133】

１１５．γ−セクレターゼ阻害剤をヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給する工程をさらに含む、段落１０９の方法。

【0134】

１１６．前記γ−セクレターゼ阻害剤が、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）を含む、段落１１５の方法。

【0135】

１１７．ヒト内分泌前駆細胞が濃縮された細胞集団を製造する方法であって、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）と結合する試薬を、ヒト内分泌前駆細胞を含む細胞集団に供給する工程と、当該試薬と結合するヒト内分泌前駆細胞を当該試薬と結合しない細胞から分離し、それによりヒト内分泌前駆細胞が濃縮された細胞集団を産生する工程とを含む、ヒト内分泌前駆細胞が濃縮された細胞集団を製造する方法。

【0136】

１１８．前記ヒト内分泌前駆細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト多能性細胞から誘導される、段落１１７の方法。

【0137】

１１９．前記ヒト内分泌前駆細胞が、ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）を発現し、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）及びグレリン（ＧＨＲＬ）から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを実質的に発現しない、段落１１７の方法。

【0138】

１２０．前記ヒト内分泌前駆細胞がペアードボックス遺伝子４（ＰＡＸ４）を発現する、段落１１９の方法。

【0139】

１２１．前記ヒト内分泌前駆細胞がペアードボックス６転写因子（ＰＡＸ６）を実質的に発現しない、段落１１９の方法。

【0140】

１２２．前記試薬が、抗ＮＣＡＭ抗体、抗ＮＣＡＭ抗体断片及びＮＣＡＭリガンドから成る群から選択される分子を含む、段落１１７の方法。

【0141】

１２３．前記ＮＣＡＭリガンドがＮＣＡＭ結合タンパク質１０（ＮＢＰ１０）である、段落１２２の方法。

【0142】

１２４．前記抗ＮＣＡＭ抗体が標識される、段落１２２の方法。

【0143】

１２５．前記抗ＮＣＡＭ抗体が蛍光標識される、段落１２４の方法。

【0144】

１２６．前記試薬と結合する二次試薬を前記細胞集団及び当該試薬に供給することをさらに含む、段落１１７の方法。

【0145】

１２７．前記試薬が抗ＮＣＡＭ抗体を含み、前記二次試薬が蛍光標識される、段落１２６の方法。

【0146】

１２８．前記分離する工程が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、前記抗ＮＣＡＭ抗体と結合する前記内分泌前駆細胞を当該抗ＮＣＡＭ抗体と結合しない当該細胞から分離することを含む、段落１２５又は１２７の方法。

【0147】

１２９．ＮＣＡＭと結合する前記試薬を前記細胞集団に供給する前に、ヒト内分泌前駆細胞を含む当該細胞集団において前記細胞を脱集塊化する工程をさらに含む、段落１１７の方法。

【0148】

１３０．腸管の前部から誘導される、細胞、組織又は器官に分化することができる多能性細胞であるヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を含む細胞集団を得る工程と、γ−セクレターゼ阻害剤をヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒト内分泌前駆細胞の集団を産生する工程とをさらに含む、段落１１７の方法。

【0149】

１３１．前記γ−セクレターゼ阻害剤が、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）を含む、段落１３０の方法。

【0150】

１３２．前記ＤＡＰＴが、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落１３１の方法。

【0151】

１３３．前記ＤＡＰＴが、約３μＭの濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落１３１の方法。

【0152】

１３４．エキセンジン４（Ｅｘ４）をヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給することをさらに含む、段落１３０の方法。

【0153】

１３５．前記Ｅｘ４が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落１３４の方法。

【0154】

１３６．前記Ｅｘ４が、約４０ｎｇ／ｍｌの濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落１３４の方法。

【0155】

１３７．ヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を得る工程が、ヒト前腸内胚葉細胞の集団を得る工程（当該ヒト前腸内胚葉細胞が、腸管の前部から誘導される、細胞、組織又
は器官に分化することができるＰＤＸ１陰性多能性細胞である）と、レチノイドをヒト前腸内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を産生する工程とを含む、段落１３０の方法。

【0156】

１３８．前記レチノイドがレチノイン酸（ＲＡ）である、段落１３７の方法。

【0157】

１３９．ＲＡが、約１ｎＭ〜約１０μＭの範囲の濃度でヒト前腸内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落１３８の方法。

【0158】

１４０．ヒト前腸内胚葉細胞の集団を得る工程が、ヒト胚体内胚葉細胞の集団を得る工程（当該ヒト胚体内胚葉細胞が、腸管の細胞又はそれから誘導される器官に分化することができる多能性細胞である）と、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ−１０）及びヘッジホッグ経路阻害剤をヒト胚体内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒト前腸内胚葉細胞の集団を産生する工程とを含む、段落１３７の方法。

【0159】

１４１．胚体内胚葉細胞の前記集団に存在し得る前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの外から加えられた因子を回収することをさらに含む、段落１４０の方法。

【0160】

１４２．前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの前記増殖因子が、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びそれらの組合せから成る群から選択される、段落１４１の方法。

【0161】

１４３．前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの前記増殖因子がアクチビンＡである、段落１４２の方法。

【0162】

１４４．前記ヘッジホッグ阻害剤がＫＡＡＤ−シクロパミンを含む、段落１４０の方法。

【0163】

１４５．ＫＡＡＤ−シクロパミンが、約０．０１μＭ〜約１μＭの範囲の濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落１４４の方法。

【0164】

１４６．ＫＡＡＤ−シクロパミンが、約０．２μＭの濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落１４５の方法。

【0165】

１４７．ＦＧＦ−１０が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落１４０の方法。

【0166】

１４８．ＦＧＦ−１０が、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落１４０の方法。

【0167】

１４９．ＦＧＦ−１０が、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落１４０の方法。

【0168】

１５０．ヒト胚体内胚葉細胞の集団を得る工程が、ヒト多能性細胞の集団を得る工程と、前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子をヒト多能性細胞の当該集団に供給する工程とを含む、段落１４０の方法。

【0169】

１５１．前記少なくとも１つの増殖因子がノーダルである、段落１５０の方法。

【0170】

１５２．前記少なくとも１つの増殖因子がアクチビンＡである、段落１５０の方法。

【0171】

１５３．前記少なくとも１つの増殖因子がアクチビンＢである、段落１５０の方法。

【0172】

１５４．ウィングレス型ＭＭＴＶ組込部位ファミリー成員３Ａ（Ｗｎｔ３Ａ）をヒト多能性細胞の前記集団に供給することをさらに含む、段落１５０の方法。

【0173】

１５５．前記ＴＧＦβスーパーファミリーの複数の増殖因子が供給される、段落１５０の方法。

【0174】

１５６．Ｗｎｔ３Ａも供給される、段落１５５の方法。

【0175】

１５７．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落１５０の方法。

【0176】

１５８．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落１５０の方法。

【0177】

１５９．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落１５０の方法。

【0178】

１６０．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落１５０の方法。

【0179】

１６１．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落１５０の方法。

【0180】

１６２．前記ヒト多能性細胞が、約２％未満の血清を含む培地でヒト胚体内胚葉細胞に分化する、段落１５０の方法。

【0181】

１６３．前記ヒト多能性細胞が、桑実胚、胚のＩＣＭ及び胚の生殖隆起から成る群から選択される組織から誘導されるヒト胚性幹細胞である、段落１５０の方法。

【0182】

１６４．濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト内分泌前駆細胞集団であって、当該ヒト内分泌前駆細胞がＮＧＮ３を発現し、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ及びＧＨＲＬから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを実質的に発現しない、濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト内分泌前駆細胞集団。

【0183】

１６５．ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト多能性細胞から誘導される、段落１６４の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト内分泌前駆細胞集団。

【0184】

１６６．段落１１７の方法によって産生される、段落１６４の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト内分泌前駆細胞集団。

【0185】

１６７．段落１５０の方法によって産生される、段落１６４の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト内分泌前駆細胞集団。

【0186】

１６８．前記濃縮されたヒト細胞集団の少なくとも約５％が、ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）を発現し、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ及びＧＨＲＬから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを実質的に発現しないヒト内分泌前駆細胞を含む、段落１６４の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト内分泌前駆細胞集団。

【0187】

１６９．前記ヒト内分泌前駆細胞がＰＡＸ４を発現する、段落１６８の濃縮されたｉｎ
ｖｉｔｒｏヒト内分泌前駆細胞集団。

【0188】

１７０．前記内分泌前駆細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉から誘導される、段落１６４の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト内分泌前駆細胞集団。

【0189】

１７１．前記ヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト前腸内胚葉細胞から誘導される、段落１７０の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト内分泌前駆細胞集団。

【0190】

１７２．前記ヒト前腸内胚葉細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉細胞から誘導される、段落１７１の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト内分泌前駆細胞集団。

【0191】

１７３．前記胚体内胚葉細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から誘導される、段落１７２の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト内分泌前駆細胞集団。

【0192】

１７４．ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が濃縮された細胞集団を製造する方法であって、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）と結合する試薬を、ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞集団に供給する工程と、当該試薬と結合するヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を当該試薬と結合しない細胞から分離し、それによりヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が濃縮された細胞集団を産生する工程とを含む、ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が濃縮された細胞集団を製造する方法。

【0193】

１７５．前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト多能性細胞から誘導される、段落１７４の方法。

【0194】

１７６．前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞がＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３及びＭＡＦＡから成る群から選択されるマーカーを実質的に発現しない、段落１７４の方法。

【0195】

１７７．前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及びＮＦＭから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを実質的に発現しない、段落１７６の方法。

【0196】

１７８．前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が、シナプトフィジン（ＳＹＰ）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＮＫＸ２．２、Ｉｓｌｅｔ１（ＩＳＬ１）、ペアードボックス遺伝子６（ＰＡＸ６）、及び神経発生分化１（ＮＥＵＲＯＤ）、ＰＤＸ１及びＨＢ９から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、段落１７６の方法。

【0197】

１７９．前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が、前記未熟膵島ホルモン発現細胞によって産生されたインスリンの約９８％未満をプロセシングする、段落１７４の方法。

【0198】

１８０．前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が、前記未熟膵島ホルモン発現細胞によって産生されたインスリンの約７０％未満をプロセシングする、段落１７４の方法。

【0199】

１８１．前記インスリンのプロセシングが、Ｃ−ペプチド放出によって測定される、段落１７９又は１８０の方法。

【0200】

１８２．前記試薬が、抗ＮＣＡＭ抗体、抗ＮＣＡＭ抗体断片及びＮＣＡＭリガンドから成る群から選択される分子を含む、段落１７４の方法。

【0201】

１８３．前記ＮＣＡＭリガンドがＮＣＡＭ結合タンパク質１０（ＮＢＰ１０）である、段落１８２の方法。

【0202】

１８４．前記抗ＮＣＡＭ抗体が標識される、段落１８２の方法。

【0203】

１８５．前記抗ＮＣＡＭ抗体が蛍光標識される、段落１８４の方法。

【0204】

１８６．前記試薬と結合する二次試薬を前記細胞集団に供給することをさらに含む、段落１７４の方法。

【0205】

１８７．前記試薬が抗ＮＣＡＭ抗体を含み、当該抗ＮＣＡＭ抗体と結合する前記二次試薬が蛍光標識される、段落１８６の方法。

【0206】

１８８．前記分離する工程が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、抗ＮＣＡＭ抗体と結合する前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を当該抗ＮＣＡＭ抗体と結合しない当該細胞から分離することを含む、段落１８５又は１８７の方法。

【0207】

１８９．ＣＤ１３３と結合する第２の試薬を前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞に供給する工程と、当該ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を当該第２の試薬と結合する細胞から分離する工程とをさらに含む、段落１７４の方法。

【0208】

１９０．ＮＣＡＭと結合する前記試薬を前記細胞集団に供給する前に当該細胞集団を解離する工程をさらに含む、段落１７４の方法。

【0209】

１９１．ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞に分化することができる多能性細胞であるヒト内分泌前駆細胞を含む細胞集団を得ること、及びヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が形成されるのに十分な時間、培養培地で当該ヒト内分泌前駆細胞をインキュベートすることをさらに含む、段落１７４の方法。

【0210】

１９２．前記ヒト内分泌前駆細胞のヒト未熟膵島ホルモン発現細胞への分化をさらに促進するのに十分な量で、ニコチンアミド（ＮＩＣ）、エキセンジン４（Ｅｘ４）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１）、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド（ＧＩＰ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びそれらの組合せから成る群から選択される因子を前記ヒト内分泌前駆細胞に供給することをさらに含む、段落１９１の方法。

【0211】

１９３．前記因子がＥｘ４、ＨＧＦ及びＩＧＦ１から成る群から選択される、段落１９２の方法。

【0212】

１９４．前記因子がＥｘ４である、段落１９３の方法。

【0213】

１９５．Ｅｘ４が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落１９４の方法。

【0214】

１９６．Ｅｘ４が、約４０ｎｇ／ｍｌの濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落１９４の方法。

【0215】

１９７．前記因子がＩＧＦ１である、段落１９３の方法。

【0216】

１９８．ＩＧＦ１が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で内分泌
前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落１９７の方法。

【0217】

１９９．ＩＧＦ１が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落１９７の方法。

【0218】

２００．ＩＧＦ１が、約２５ｎｇ／ｍｌ〜約７５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落１９７の方法。

【0219】

２０１．ＩＧＦ１が、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落１９７の方法。

【0220】

２０２．腸管の前部から誘導される、細胞、組織又は器官に分化することができる多能性細胞であるヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を含む細胞集団を得る工程と、γ−セクレターゼ阻害剤をヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒト内分泌前駆細胞の集団を産生する工程とをさらに含む、段落１９１の方法。

【0221】

２０３．前記γ−セクレターゼ阻害剤が、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）を含む、段落２０２の方法。

【0222】

２０４．前記ＤＡＰＴが、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２０３の方法。

【0223】

２０５．前記ＤＡＰＴが、約３μＭの濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２０３の方法。

【0224】

２０６．エキセンジン４（Ｅｘ４）をヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給することをさらに含む、段落２０２の方法。

【0225】

２０７．前記Ｅｘ４が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２０６の方法。

【0226】

２０８．前記Ｅｘ４が、約４０ｎｇ／ｍｌの濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２０６の方法。

【0227】

２０９．ヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を得る工程が、腸管の前部から誘導される、細胞、組織又は器官に分化することができるＰＤＸ１陰性多能性細胞であるヒト前腸内胚葉細胞の集団を得る工程と、レチノイドをヒト前腸内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を産生する工程とを含む、段落２０２の方法。

【0228】

２１０．前記レチノイドがレチノイン酸（ＲＡ）である、段落２０９の方法。

【0229】

２１１．ＲＡが、約１ｎＭ〜約１０μＭの範囲の濃度でヒト前腸内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２１０の方法。

【0230】

２１２．ヒト前腸内胚葉細胞の集団を得る工程が、腸管の細胞又はそれから誘導される器官に分化することができる多能性細胞であるヒト胚体内胚葉細胞の集団を得る工程と、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ−１０）及びヘッジホッグ経路阻害剤をヒト胚体内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒト前腸内胚葉細胞の集団を産生する工程とを含む
、段落２０９の方法。

【0231】

２１３．胚体内胚葉細胞の前記集団に存在し得る前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの外から加えられた因子を回収することをさらに含む、段落２１２の方法。

【0232】

２１４．前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの前記増殖因子が、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びそれらの組合せから成る群から選択される、段落２１３の方法。

【0233】

２１５．前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの前記増殖因子がアクチビンＡである、段落２１４の方法。

【0234】

２１６．前記ヘッジホッグ阻害剤がＫＡＡＤ−シクロパミンを含む、段落２１２の方法。

【0235】

２１７．ＫＡＡＤ−シクロパミンが、約０．０１μＭ〜約１μＭの範囲の濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２１６の方法。

【0236】

２１８．ＫＡＡＤ−シクロパミンが、約０．２μＭの濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２１６の方法。

【0237】

２１９．ＦＧＦ−１０が、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２１２の方法。

【0238】

２２０．ＦＧＦ−１０が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２１２の方法。

【0239】

２２１．ＦＧＦ−１０が、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２１２の方法。

【0240】

２２２．ヒト胚体内胚葉細胞の集団を得る工程が、ヒト多能性細胞の集団を得る工程と、前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子をヒト多能性細胞の当該集団に供給する工程とを含む、段落２１２の方法。

【0241】

２２３．前記少なくとも１つの増殖因子がノーダルである、段落２２２の方法。

【0242】

２２４．前記少なくとも１つの増殖因子がアクチビンＡである、段落２２２の方法。

【0243】

２２５．前記少なくとも１つの増殖因子がアクチビンＢである、段落２２２の方法。

【0244】

２２６．ウィングレス型ＭＭＴＶ組込部位ファミリー成員３Ａ（Ｗｎｔ３Ａ）をヒト多能性細胞の前記集団に供給することをさらに含む、段落２２２の方法。

【0245】

２２７．前記ＴＧＦβスーパーファミリーの複数の増殖因子が供給される、段落２２２の方法。

【0246】

２２８．Ｗｎｔ３Ａも供給される、段落２２７の方法。

【0247】

２２９．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落２２２の方法。

【0248】

２３０．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落２２２の方法。

【0249】

２３１．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落２２２の方法。

【0250】

２３２．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落２２２の方法。

【0251】

２３３．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落２２２の方法。

【0252】

２３４．前記ヒト多能性細胞が、約２％未満の血清を含む培地でヒト胚体内胚葉細胞に分化する、段落２２２の方法。

【0253】

２３５．前記ヒト多能性細胞が、桑実胚、胚のＩＣＭ及び胚の生殖隆起から成る群から選択される組織から誘導されるヒト胚性幹細胞である、段落２２２の方法。

【0254】

２３６．濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団であって、当該ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞がＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３及びＭＡＦＡを実質的に発現しない、濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0255】

２３７．ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト多能性細胞から誘導される、段落２３６の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0256】

２３８．段落１７４の方法によって産生される、段落２３６の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0257】

２３９．段落２２２の方法によって産生される、段落２３６の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0258】

２４０．前記濃縮されたヒト細胞集団の少なくとも約２５％が、ＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３及びＭＡＦＡを実質的に発現しないヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含む、段落２３８又は２３９の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0259】

２４１．前記濃縮されたヒト細胞集団の少なくとも約５０％が、ＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３及びＭＡＦＡを実質的に発現しないヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含む、段落２３８又は２３９の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0260】

２４２．前記濃縮されたヒト細胞集団の少なくとも約７０％が、ＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３及びＭＡＦＡを実質的に発現しないヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含む、段落２３８又は２３９の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0261】

２４３．前記濃縮されたヒト細胞集団の少なくとも約９０％が、ＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３及びＭＡＦＡを実質的に発現しないヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含む、段落２３８又は２３９の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0262】

２４４．前記濃縮されたヒト細胞集団の少なくとも約２５％が、ＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３及びＭＡＦＡを実質的に発現しないヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含む、段落２３６の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0263】

２４５．前記濃縮されたヒト細胞集団の少なくとも約５０％が、ＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３及びＭＡＦＡを実質的に発現しないヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含む、段落２３６の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0264】

２４６．前記濃縮されたヒト細胞集団の少なくとも約７０％が、ＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３及びＭＡＦＡを実質的に発現しないヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含む、段落２３６の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0265】

２４７．前記濃縮されたヒト細胞集団の少なくとも約９０％が、ＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３及びＭＡＦＡを実質的に発現しないヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含む、段落２３６の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0266】

２４８．前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及びＮＦＭから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを実質的に発現しない、段落２３６の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0267】

２４９．前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が、シナプトフィジン（ＳＹＰ）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＮＫＸ２．２、Ｉｓｌｅｔ１（ＩＳＬ１）、ペアードボックス遺伝子６（ＰＡＸ６）、及び神経発生分化１（ＮＥＵＲＯＤ）、ＰＤＸ１及びＨＢ９から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、段落２３６の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0268】

２５０．前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が、前記未熟膵島ホルモン発現細胞によって産生されたインスリンの約９８％未満をプロセシングする、段落２３６の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0269】

２５１．前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が、前記未熟膵島ホルモン発現細胞によって産生されたインスリンの約７０％未満をプロセシングする、段落２３６の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0270】

２５２．前記インスリンのプロセシングが、Ｃ−ペプチド放出によって測定される、段落２５０又は２５１の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト未熟膵島ホルモン発現細胞集団。

【0271】

２５３．ヒト膵島ホルモン発現細胞が濃縮された細胞集団を製造する方法であって、当該ヒト膵島ホルモン発現細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト多能性細胞から誘導され、当該方法が神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）と結合する試薬を、ヒト膵島ホルモン発現細胞を含む細胞集団に供給する工程と、当該試薬と結合するヒト内分泌前駆細胞を当該試薬と結合しない細胞から分離し、それによりヒト膵島ホルモン発現細胞が濃縮された細胞集団を産生する工程とを含む、ヒト膵島ホルモン発現細胞が濃縮された細胞集団を製造する方法。

【0272】

２５４．前記試薬が、抗ＮＣＡＭ抗体、抗ＮＣＡＭ抗体断片及びＮＣＡＭリガンドから成る群から選択される分子を含む、段落２５３の方法。

【0273】

２５５．前記ＮＣＡＭリガンドがＮＣＡＭ結合タンパク質１０（ＮＢＰ１０）である、段落２５４の方法。

【0274】

２５６．前記抗ＮＣＡＭ抗体が標識される、段落２５４の方法。

【0275】

２５７．前記抗ＮＣＡＭ抗体が蛍光標識される、段落２５６の方法。

【0276】

２５８．前記試薬と結合する二次試薬を前記細胞集団に供給することをさらに含む、段落２５４の方法。

【0277】

２５９．前記試薬が抗ＮＣＡＭ抗体を含み、当該抗ＮＣＡＭ抗体と結合する前記二次試薬が蛍光標識される、段落２５８の方法。

【0278】

２６０．前記分離する工程が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、前記抗ＮＣＡＭ抗体と結合する前記膵島ホルモン発現細胞を当該抗ＮＣＡＭ抗体と結合しない当該細胞から分離することを含む、段落２５７又は２５９の方法。

【0279】

２６１．ＣＤ１３３と結合する第２の試薬を前記ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞に供給する工程と、当該ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を当該第２の試薬と結合する細胞から分離する工程とをさらに含む、段落２５３の方法。

【0280】

２６２．ＮＣＡＭと結合する前記試薬を前記細胞集団に供給する前に当該細胞集団を解離する工程をさらに含む、段落２５３の方法。

【0281】

２６３．ヒト膵島ホルモン発現細胞に分化することができる多能性細胞であるヒト内分泌前駆細胞を含む細胞集団を得ること、及びヒト膵島ホルモン発現細胞が形成されるのに十分な時間、培養培地で当該ヒト内分泌前駆細胞をインキュベートすることをさらに含む、段落２５３の方法。

【0282】

２６４．前記ヒト内分泌前駆細胞のヒト膵島ホルモン発現細胞への分化をさらに促進するのに十分な量で、ニコチンアミド（ＮＩＣ）、エキセンジン４（Ｅｘ４）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１）、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド（ＧＩＰ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びそれらの組合せから成る群から選択される因子を前記ヒト内分泌前駆細胞に供給することをさらに含み、当該ヒト膵島ホルモン発現細胞がインスリン、ソマトスタチン及びグルカゴンから成る群から選択される少なくとも１つの膵臓ホルモンを発現する、段落２６３の方法。

【0283】

２６５．前記因子がＥｘ４、ＨＧＦ及びＩＧＦ１から成る群から選択される、段落２６４の方法。

【0284】

２６６．前記因子がＥｘ４である、段落２６５の方法。

【0285】

２６７．Ｅｘ４が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落２６６の方法。

【0286】

２６８．Ｅｘ４が、約４０ｎｇ／ｍｌの濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落２６６の方法。

【0287】

２６９．前記因子がＩＧＦ１である、段落２６５の方法。

【0288】

２７０．ＩＧＦ１が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落２６９の方法。

【0289】

２７１．ＩＧＦ１が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で内分泌前
駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落２６９の方法。

【0290】

２７２．ＩＧＦ１が、約２５ｎｇ／ｍｌ〜約７５ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落２６９の方法。

【0291】

２７３．ＩＧＦ１が、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で内分泌前駆細胞の前記細胞集団に供給される、段落２６９の方法。

【0292】

２７４．腸管の前部から誘導される、細胞、組織又は器官に分化することができる多能性細胞であるヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を含む細胞集団を得る工程と、γ−セクレターゼ阻害剤をヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒト内分泌前駆細胞の集団を産生する工程とをさらに含む、段落２６３の方法。

【0293】

２７５．前記γ−セクレターゼ阻害剤が、Ｎ−［Ｎ−（３，５，−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）を含む、段落２７４の方法。

【0294】

２７６．前記ＤＡＰＴが、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２７５の方法。

【0295】

２７７．前記ＤＡＰＴが、約３μＭの濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２７５の方法。

【0296】

２７８．エキセンジン４（Ｅｘ４）をヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給することをさらに含む、段落２７４の方法。

【0297】

２７９．前記Ｅｘ４が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２７８の方法。

【0298】

２８０．前記Ｅｘ４が、約４０ｎｇ／ｍｌの濃度でヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２７８の方法。

【0299】

２８１．ヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を得る工程が、腸管の前部から誘導される、細胞、組織又は器官に分化することができるＰＤＸ１陰性多能性細胞であるヒト前腸内胚葉細胞の集団を得る工程と、レチノイドをヒト前腸内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を産生する工程とを含む、段落２７４の方法。

【0300】

２８２．前記レチノイドがレチノイン酸（ＲＡ）である、段落２８１の方法。

【0301】

２８３．ＲＡが、約１ｎＭ〜約１０μＭの範囲の濃度でヒト前腸内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２８２の方法。

【0302】

２８４．ヒト前腸内胚葉細胞の集団を得る工程が、腸管の細胞又はそれから誘導される器官に分化することができる多能性細胞であるヒト胚体内胚葉細胞の集団を得る工程と、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ−１０）及びヘッジホッグ経路阻害剤をヒト胚体内胚葉細胞の当該集団に供給し、それによりヒト前腸内胚葉細胞の集団を産生する工程とを含む、段落２８１の方法。

【0303】

２８５．胚体内胚葉細胞の前記集団に存在し得る前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの
外から加えられた因子を回収することをさらに含む、段落２８４の方法。

【0304】

２８６．前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの前記増殖因子が、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びそれらの組合せから成る群から選択される、段落２８５の方法。

【0305】

２８７．前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの前記増殖因子がアクチビンＡである、段落２８６の方法。

【0306】

２８８．前記ヘッジホッグ阻害剤がＫＡＡＤ−シクロパミンを含む、段落２８４の方法。

【0307】

２８９．ＫＡＡＤ−シクロパミンが、約０．０１μＭ〜約１μＭの範囲の濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２８８の方法。

【0308】

２９０．ＫＡＡＤ−シクロパミンが、約０．２μＭの濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２８８の方法。

【0309】

２９１．ＦＧＦ−１０が、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２８４の方法。

【0310】

２９２．ＦＧＦ−１０が、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２８４の方法。

【0311】

２９３．ＦＧＦ−１０が、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度でヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給される、段落２８４の方法。

【0312】

２９４．ヒト胚体内胚葉細胞の集団を得る工程が、ヒト多能性細胞の集団を得る工程と、前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子をヒト多能性細胞の当該集団に供給する工程とを含む、段落２８４の方法。

【0313】

２９５．前記少なくとも１つの増殖因子がノーダルである、段落２９４の方法。

【0314】

２９６．前記少なくとも１つの増殖因子がアクチビンＡである、段落２９４の方法。

【0315】

２９７．前記少なくとも１つの増殖因子がアクチビンＢである、段落２９４の方法。

【0316】

２９８．ウィングレス型ＭＭＴＶ組込部位ファミリー成員３Ａ（Ｗｎｔ３Ａ）をヒト多能性細胞の前記集団に供給することをさらに含む、段落２９４の方法。

【0317】

２９９．前記ＴＧＦβスーパーファミリーの複数の増殖因子が供給される、段落２９４の方法。

【0318】

３００．Ｗｎｔ３Ａも供給される、段落２９９の方法。

【0319】

３０１．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落２９４の方法。

【0320】

３０２．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落２９４の方法。

【0321】

３０３．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落２９４の方法。

【0322】

３０４．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落２９４の方法。

【0323】

３０５．前記少なくとも１つの増殖因子が、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落２９４の方法。

【0324】

３０６．前記ヒト多能性細胞が、約２％未満の血清を含む培地でヒト胚体内胚葉細胞に分化する、段落２９４の方法。

【0325】

３０７．前記ヒト多能性細胞が、桑実胚、胚のＩＣＭ及び胚の生殖隆起から成る群から選択される組織から誘導されるヒト胚性幹細胞である、段落２９４の方法。

【0326】

３０８．ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト多能性細胞から誘導される濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト膵島ホルモン発現細胞集団。

【0327】

３０９．段落２５３の方法によって産生される、段落３０８の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト膵島ホルモン発現細胞集団。

【0328】

３１０．段落２９４の方法によって産生される、段落３０８の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト膵島ホルモン発現細胞集団。

【0329】

３１１．前記濃縮されたヒト細胞集団の少なくとも約２５％が、グレリン、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ＮＫＸ６転写因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）、ソマトスタチン（ＳＯＭ）、及び膵臓ポリペプチド（ＰＰ）から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現し、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及びＮＦＭから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを実質的に発現しないヒト膵島ホルモン発現細胞を含む、段落３０９又は３１０の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト膵島ホルモン発現細胞集団。

【0330】

３１２．前記濃縮されたヒト細胞集団の少なくとも約５０％が、グレリン、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ＮＫＸ６転写因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）、ソマトスタチン（ＳＯＭ）、及び膵臓ポリペプチド（ＰＰ）から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現し、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及びＮＦＭから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを実質的に発現しないヒト膵島ホルモン発現細胞を含む、段落３１１の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト膵島ホルモン発現細胞集団。

【0331】

３１３．前記濃縮されたヒト細胞集団の少なくとも約９０％が、グレリン、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ＮＫＸ６転写因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）、ソマトスタチン（ＳＯＭ）、及び膵臓ポリペプチド（ＰＰ）から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現し、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及びＮＦＭから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーを実質的に発現しないヒト膵島ホルモン発現細胞を含む、段落３１１の濃縮されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒト膵島ホルモン発現細胞集団。

【0332】

３１４．ＮＣＡＭを発現するヒト内分泌前駆細胞を含むｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体であって、当該内分泌前駆細胞が、ヒト膵島ホルモン発現細胞に分化することができる
多能性細胞、及び当該ＮＣＡＭと結合する試薬である、ＮＣＡＭを発現するヒト内分泌前駆細胞を含むｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0333】

３１５．前記試薬が抗ＮＣＡＭ抗体、抗ＮＣＡＭ抗体断片及びＮＣＡＭリガンドから成る群から選択される分子を含む、段落３１４のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0334】

３１６．前記ＮＣＡＭリガンドがＮＣＡＭ結合タンパク質１０（ＮＢＰ１０）である、段落３１５のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0335】

３１７．前記試薬が抗ＮＣＡＭ抗体である、段落３１５のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0336】

３１８．前記抗ＮＣＡＭ抗体が標識される、段落３１７のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0337】

３１９．前記抗ＮＣＡＭ抗体が蛍光標識される、段落３１８のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0338】

３２０．前記試薬と結合する二次試薬をさらに含む、段落３１４のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0339】

３２１．前記試薬が抗ＮＣＡＭ抗体を含み、当該抗ＮＣＡＭ抗体と結合する前記二次試薬が蛍光標識される、段落３２０のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0340】

３２２．ＮＣＡＭを発現するヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含むｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体であって、当該ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞が、ヒト膵島ホルモン発現細胞に分化することができる多能性細胞、及び当該ＮＣＡＭと結合する試薬である、ＮＣＡＭを発現するヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含むｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0341】

３２３．前記試薬が抗ＮＣＡＭ抗体、抗ＮＣＡＭ抗体断片及びＮＣＡＭリガンドから成る群から選択される分子を含む、段落３２２のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0342】

３２４．前記ＮＣＡＭリガンドがＮＣＡＭ結合タンパク質１０（ＮＢＰ１０）である、段落３２３のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0343】

３２５．前記試薬が抗ＮＣＡＭ抗体である、段落３２３のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0344】

３２６．前記抗ＮＣＡＭ抗体が標識される、段落３２５のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0345】

３２７．前記抗ＮＣＡＭ抗体が蛍光標識される、段落３２６のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0346】

３２８．前記試薬と結合する二次試薬をさらに含む、段落３２２のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0347】

３２９．前記試薬が抗ＮＣＡＭ抗体を含み、当該抗ＮＣＡＭ抗体と結合する前記二次試薬が蛍光標識される、段落３２８のｅｘ ｖｉｖｏ試薬−細胞複合体。

【0348】

３３０．前記ヒト多能性細胞が、着床前胚から誘導されるヒト胚性幹細胞である、段落８６、１５０、２２２又は２９４のいずれかの方法。

【0349】

３３１．ヒト膵臓ホルモン発現細胞を製造する方法であって、
（ａ）前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子を多能性ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の集団に供給し、それによりヒト胚体内胚葉細胞の集団を産生する工程と、（ｂ）少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子をヒト胚体内胚葉細胞の前記集団に供給し、それによりヒト前腸内胚葉細胞の集団を産生する工程と、（ｃ）ノギンをヒト前腸内胚葉細胞の前記集団に供給し、それによりヒト内分泌前駆細胞を含む集団を産生する工程と、（ｄ）ヒト膵島ホルモン発現細胞が形成されるのに十分な時間、培養培地でヒト内分泌前駆細胞の前記集団をインキュベートする工程（当該ヒト膵島ホルモン発現細胞が形成されるのに十分な時間は、前記細胞集団におけるヒト膵臓ホルモン発現細胞の存在を検出することによって求められている）とを含む、ヒト膵臓ホルモン発現細胞を製造する方法。

【0350】

３３２．前記細胞集団において前記ヒト細胞の少なくとも約２％がヒト膵臓ホルモン発現細胞に分化する、段落３３１の方法。

【0351】

３３３．前記細胞集団において前記ヒト細胞の少なくとも約５％がヒト膵臓ホルモン発現細胞に分化する、段落３３１の方法。

【0352】

３３４．前記細胞集団において前記ヒト細胞の少なくとも約１０％がヒト膵臓ホルモン発現細胞に分化する、段落３３１の方法。

【0353】

３３５．前記細胞集団において前記ヒト細胞の少なくとも約２０％がヒト膵臓ホルモン発現細胞に分化する、段落３３１の方法。

【0354】

３３６．前記細胞集団において前記ヒト細胞の少なくとも約４０％がヒト膵臓ホルモン発現細胞に分化する、段落３３１の方法。

【0355】

３３７．前記細胞集団において前記ヒト細胞の少なくとも約５０％がヒト膵臓ホルモン発現細胞に分化する、段落３３１の方法。

【0356】

３３８．前記細胞集団において前記ヒト細胞の少なくとも約７０％がヒト膵臓ホルモン発現細胞に分化する、段落３３１の方法。

【0357】

３３９．前記細胞集団において前記ヒト細胞の少なくとも約９０％がヒト膵臓ホルモン発現細胞に分化する、段落３３１の方法。

【0358】

３４０．前記細胞集団におけるヒト膵島ホルモン発現細胞の存在を検出することが、当該細胞集団の細胞において膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、グレリン（ＧＨＲＬ）、インスリン（ＩＮＳ）、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、ＩＳＬ１転写因子（ＩＳＬ１）、ＮＫＸ６転写因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）及びペアードボックス６（ＰＡＸ６）から成る群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を検出することを含む、段落３３１の方法。

【0359】

３４１．少なくとも１つの前記マーカーの発現がＱ−ＰＣＲによって求められる、段落３４０の方法。

【0360】

３４２．少なくとも１つの前記マーカーの発現が免疫細胞化学法によって求められる、
段落３４０の方法。

【0361】

３４３．γ−セクレターゼ阻害剤を前記細胞集団に供給することをさらに含む、段落３３１の方法。

【0362】

３４４．前記γ−セクレターゼ阻害剤が、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）を含む、段落３４３の方法。

【0363】

３４５．前記γ−セクレターゼ阻害剤が、ノギンを供給するのとほぼ同時又はノギンを供給した後に、前記細胞集団に供給される、段落３４３の方法。

【0364】

３４６．前記γ−セクレターゼ阻害剤が、約０．１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で前記細胞集団に供給される、段落３４４の方法。

【0365】

３４７．前記少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子が線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ−７）である、段落３３１の方法。

【0366】

３４８．前記ＦＧＦ−７が、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で前記細胞培養物に供給される、段落３４７の方法。

【0367】

３４９．前記少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子を添加するのとほぼ同時に、ヘッジホッグ阻害剤を前記細胞集団に供給することをさらに含む、段落３３１の方法。

【0368】

３５０．前記ヘッジホッグ阻害剤がＫＡＡＤ−シクロパミンを含む、段落３４９の方法。

【0369】

３５１．前記ＫＡＡＤ−シクロパミンが、約０．０１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で前記細胞集団に供給される、段落３５０の方法。

【0370】

３５２．胚体内胚葉細胞の前記集団に存在し得る前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの任意の増殖因子を回収することをさらに含む、段落３３１の方法。

【0371】

３５３．前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの前記増殖因子が、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びそれらの組合せから成る群から選択される、段落３３１の方法。

【0372】

３５４．前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーの前記増殖因子がアクチビンＡを含む、段落３５３の方法。

【0373】

３５５．前記アクチビンＡが、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で前記ｈＥＳＣに供給される、段落３５４の方法。

【0374】

３５６．ウィングレス型ＭＭＴＶ組込部位ファミリー成員３Ａ（Ｗｎｔ３Ａ）を前記ｈＥＳＣに供給することをさらに含む、段落３３１の方法。

【0375】

３５７．前記Ｗｎｔ３Ａが、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で供給される、段落３５６の方法。

【0376】

３５８．前記ｈＥＳＣが、約２％未満の血清を含む培地においてヒト胚体内胚葉細胞に分化する、段落３３１の方法。

【0377】

３５９．前記ｈＥＳＣが、桑実胚、胚のＩＣＭ及び胚の生殖隆起から成る群から選択される組織から誘導される、段落３３１の方法。

【0378】

３６０．ノギンを供給するのとほぼ同時に、レチノイドを前記細胞集団に供給することをさらに含む、段落３３１の方法。

【0379】

３６１．少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子を添加するのとほぼ同時又は添加した後に、レチノイドを前記細胞集団に供給することをさらに含む、段落３３１の方法。

【0380】

３６２．前記レチノイドがレチノールである、段落３６０又は３６１の方法。

【0381】

３６３．前記レチノイドがレチノイン酸である、段落３６０又は３６１の方法。

【0382】

３６４．前記レチノイン酸が、約０．０１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で供給される、段落３６３の方法。

【0383】

３６５．少なくとも幾つかの前記細胞が非組み換え細胞である、段落１〜４９、１６４〜１７３、２３６〜２５２又は３０８〜３１３のいずれかの細胞培養物又は細胞集団。

【0384】

３６６．前記細胞が非組み換え細胞である、段落１〜４９、１６４〜１７３、２３６〜２５２又は３０８〜３１３のいずれかの細胞培養物又は細胞集団。

【0385】

３６７．前記細胞がヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下では培養されていない、段落１〜４９、１６４〜１７３、２３６〜２５２又は３０８〜３１３のいずれかの細胞培養物又は細胞集団。

【0386】

３６８．前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が酪酸ナトリウムを含む、段落３６７の細胞培養物又は細胞集団。

【0387】

３６９．少なくとも幾つかの前記細胞が非組み換え細胞である、段落５０〜１６３、１７４〜２３５、２５３〜３０７又は３３１〜３６４のいずれかの方法。

【0388】

３７０．前記細胞が非組み換え細胞である、段落５０〜１６３、１７４〜２３５、２５３〜３０７又は３３１〜３６４のいずれかの方法。

【0389】

３７１．前記細胞がヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下では培養されていない、段落５０〜１６３、１７４〜２３５、２５３〜３０７又は３３１〜３６４のいずれかの方法。

【0390】

３７２．前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が酪酸ナトリウムを含む、段落３７１の方法。

【0391】

前記の方法及び組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞に関することが理解される。しかしながら、前記のｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞組成物は、細胞置換療法等、ｉｎ ｖｉｖｏでの用途に使用され得る。

【0392】

本発明のさらなる実施の形態は、米国特許仮出願第６０／５３２，００４号（表題「胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）」、２００３年１２月２３日出願）、米国特許仮出願
第６０／５６６，２９３号（表題「ＰＤＸ１発現内胚葉（PDX1 EXPRESSING ENDODERM）」
、２００４年４月２７日出願）、米国特許仮出願第６０／５８６，５６６号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体（CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM）」、２００４年７月９日出願）、米国特許仮出願第６０／５８７，９４２号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体（CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM）」、２００４年７月１４日出願）、米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）」、２００４年１２月２３日出願）、米国特許出願第１
１／１１５，８６８号（表題「ＰＤＸ１発現内胚葉（PDX1 EXPRESSING ENDODERM）」、２００５年４月２６日出願）、米国特許出願第１１／１６５，３０５号（表題「胚体内胚葉を分化させるための因子の同定方法（METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERM）」、２００５年６月２３日出願）、米国特許仮出願第６０
／７３０，９１７号（表題「ＰＤＸ１を発現する背側及び腹側の前腸内胚葉（PDX1−EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM）」、２００５年１０月２７日出願）、米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号（表題「胚体内胚葉のマーカー（MARKERS OF DEFINITIVE ENDODERM）」、２００５年１１月１４日出願）、米国特許仮出願第６０／７７８，６４９号（表題「インスリン産生細胞及び産生方法（INSULIN-PRODUCING CELLS AND METHOD OF PRODUCTION）」、２００６年３月２日出願）、米国特許仮出願第６０／８３３，６３３号（表題「インスリン産生細胞及び産生方法（INSULIN-PRODUCING CELLS AND METHOD OF PRODUCTION）」、２００６年７月２６日出願）、及び米国特許仮出願第６０／８５２，８７８号（表題「ＮＣＡＭを使用する、内分泌前駆細胞、未熟膵島細胞及び成熟膵島細胞の濃縮（ENRICHMENT OF ENDOCRINE PRECURSOR CELLS, IMMATURE PANCREATIC ISLET CELLS AND MATURE PANCREATIC ISLET CELLS USING NCAM）」、２００６年１０月１８日出
願）（これらの開示内容全体が、参照により本明細書中に援用される）にも見出され得る。

【図面の簡単な説明】

【0393】

【図1】ｉｎ ｖｉｖｏでの膵臓の発生中に観察される中間段階に対応するｈＥＳＣの膵島細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化における段階を示す模式図である。様々な増殖因子／培地の組合せ（それぞれの中間体を介したｈＥＳＣのこの段階的な分化を誘起するのに用いられる）による連続処理が示される。条件及び細胞特性は四角の欄の中に示される。四角の欄の下は、時間（ｈ）又は日数（ｄ）を時間単位で示しており、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から膵島ホルモン発現細胞への典型的な分化を示す例示的な時系列となっている。それぞれの中間体の下は、発現がこの中間体に特有であるが、必ずしも限定的ではない遺伝子の一覧である。この発達に沿ったそれぞれの中間体に関する１つ又は複数の遺伝子の発現のモニタリングによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのそれぞれの移行の発生が強く示される。略称は以下の通りである：ＥＳＣ − 胚性幹細胞、ＭＥ − 中胚葉、Ａｎｔ．ＤＥ − 前胚体内胚葉。

【図2-1】２１日の分化プロトコル中の様々なマーカーの相対的発現を示す棒グラフである。分化の工程１で用いられる３つの条件の結果として分化に実質的な差異が生じたマーカーは、（Ａ）ＳＯＸ１７、（Ｂ）ＣＸＣＲ４、（Ｃ）ＳＯＸ７、（Ｄ）ＩＳＬ１、（Ｅ）ＳＯＸ１及び（Ｆ）ＰＡＸ６である。

【図2-2】２１日の分化プロトコル中の様々なマーカーの相対的発現を示す棒グラフである。パネル（Ｇ）ＰＤＸ１、（Ｈ）ＮＧＮ３、（Ｉ）ＮＫＸ２．２及び（Ｊ）ＮＫＸ６．１は、ｈＥＳＣの膵臓内胚葉及び内分泌前駆細胞への分化に関連したマーカーの相対発現を示す。パネル（Ｋ）インスリン、（Ｌ）グルカゴン、（Ｍ）グレリン及び（Ｎ）ＳＯＭは、分化プロセスの終結間近の膵島ホルモンであるインスリン、グルカゴン、グレリン、及びソマトスタチンの相対発現を示す。

【図3】分化プロトコルの０〜１６日目の（Ａ）ＦＯＸＡ１、（Ｂ）ＨＮＦ１ｂ、（Ｃ）ＨＮＦ６、（Ｄ）ＰＤＸ１、（Ｅ）ＮＧＮ３、（Ｆ）ＰＡＸ４、（Ｇ）ＮＫＸ２．２、（Ｈ）ＮＫＸ６．１、（Ｉ）グレリン、（Ｊ）グルカゴン、（Ｋ）インスリン及び（Ｌ）ＩＡＰＰの相対発現を示す棒グラフである。

【図4】図４Ａは、様々な培地条件に供した細胞におけるＰＤＸ１タンパク質発現のウェスタンブロット分析を示す図である。略称：ＭＳ１−ＰＤＸ１ − ＰＤＸ１でトランスフェクトしたＭＳ１細胞由来のタンパク質溶解物（陽性対照）、Ａ１００ − １００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、Ａ２５Ｒ２ − ２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び２μＭのＲＡ、ＲＰ − ＲＰＭＩ培地、ＣＭ − ＣＭＲＬ培地、Ｅｘ − ４０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン４。図４Ｂは、図４Ａで記載された７日目、８日目及び９日目の培養物におけるＰＤＸ１のｍＲＮＡの相対発現を示す棒グラフである。

【図5】レチノイン酸の存在下又は非存在下での分化の１３日後の（Ａ）ＨＢ９、（B）ＰＤＸ１、（Ｃ）ＮＧＮ３、及び（Ｄ）ＮＫＸ２．２、並びに分化の１７日後の（Ｅ）ＰＤＸ１、（Ｆ）ＮＫＸ２．２、（Ｇ）インスリン及び（Ｈ）グルカゴンの相対発現を示す棒グラフである。

【図6】３つの異なる濃度のγ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴに曝されたか、又は全くＤＡＰＴに曝されない分化の１９日後の（Ａ）ＮＧＮ３、（Ｂ）ＮＫＸ２．２、（Ｃ）インスリン、（Ｄ）グルカゴン、（Ｅ）グレリン、及び（Ｆ）ソマトスタチン（ＳＯＭ）の相対発現を示す棒グラフである。

【図7】（Ａ）インスリン、（Ｂ）グルカゴン及び（Ｃ）ソマトスタチン（ＳＯＭ）の免疫反応細胞の顕微鏡写真である。これらの３つの画像を合わせたものを（Ｄ）に示し、３重に標識された細胞を矢印で示す。

【図8】（Ａ）インスリン及び（Ｂ）ＰＡＸ６に対する免疫反応性を示す顕微鏡写真である。これらの顕微鏡写真は、インスリン陽性細胞がＰＡＸ６陽性でもあることを示す。（Ｃ）インスリン及び（Ｄ）ＩＳＬ１に対する免疫反応性を示す顕微鏡写真は、インスリン陽性細胞がＩＳＬ１陽性でもあることを示す。インスリン免疫反応性に関して陰性であるＩＳＬ１細胞も多く存在する（ＣとＤとの比較）。

【図9】インスリンのｍＲＮＡ検出（パネルＡ）が、培養培地に放出されたＣ−ペプチド（パネルＢ）を測定する能力と相関があることを示す棒グラフである。略称は以下の通りである：Ａ１００ − １００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、２ＮＦ − ２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び因子なし、Ｆｓｔｎｏｇ − ５０ｎｇ／ｍｌのホルスタチン及び１００ｎｇ／ｍｌのノギン、「Ｂ」 − １〜５日でＡ１００を受ける培養物、「Ｃ」 − １〜５日で２％ＦＢＳを受け、因子がない培養物、並びに「Ｄ」 − １〜５日で５０ｎｇ／ｍｌのホルスタチン及び１００ｎｇ／ｍｌのノギンを受ける培養物。

【図10】強いインスリンのｍＲＮＡ検出（パネルＡ）を示す条件が、グルコースで刺激されたＣ−ペプチド分泌（パネルＢ）を示す棒グラフである。略記は以下の通りである：ｇ５０ − １．６ｍＭのグルコース、ｇ４００ − １６ｍＭのグルコース。

【図11】ｈＥＳＣ株ＢＧ０１及びＢＧ０２が膵島ホルモン発現細胞に分化することができることを示す棒グラフである。パネルＡ及びパネルＢは、ＢＧ０１（Ａ）及びＢＧ０２（Ｂ）に対するＰＤＸ１のｍＲＮＡの上方調節を示し、パネルＣ及びパネルＤは、ＢＧ０１（Ｃ）及びＢＧ０２（Ｄ）に対するＮＧＮ３のｍＲＮＡの上方調節を示し、パネルＥ及びパネルＦは、ＢＧ０１（Ｅ）及びＢＧ０２（Ｆ）に対するインスリンのｍＲＮＡの上方調節を示す。

【図12】ＮＣＡＭ（図１２Ｃ）及びＮＫＸ２．２（図１２Ｂ）に対して初期膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞の免疫反応性を示す顕微鏡写真である。全細胞集団をＤＡＰＩで染色する（図１２Ａ）。これらの顕微鏡写真は、ＮＫＸ２．２陽性細胞がＮＣＡＭ陽性でもあることを示す（図１２Ｄ）。

【図13】ＮＣＡＭ（図１３Ｃ）及びインスリン（図１３Ｂ）に対して未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞の免疫反応性を示す顕微鏡写真である。全細胞集団をＤＡＰＩで染色する（図１３Ａ）。これらの顕微鏡写真は、インスリン陽性細胞がＮＣＡＭ陽性でもあることを示す（図１３Ｄ）。

【図14】ＮＣＡＭ（図１４Ｅ）、ＩＮＳ（１４Ｆ）及びＰＡＸ６（図１４Ｄ）に対して未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞の免疫反応性を示す顕微鏡写真である。全細胞集団をＤＡＰＩで染色する（図１４Ａ）。これらの顕微鏡写真は、ＰＡＸ６陽性細胞がＮＣＡＭ陽性でもあり（図１４Ｂ）、ＩＮＳ陽性細胞がＮＣＡＭ陽性でもあることを示す（図１４Ｃ）。

【図15】ＮＫＸ２．２及びシナプトフィジンに対して未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞の免疫反応性を示す顕微鏡写真である。これらの顕微鏡写真は、シナプトフィジン陽性細胞がＮＫＸ２．２陽性でもあることを示す（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。

【図16】ＭＡＦＢ及びＩＮＳに対して内分泌前駆細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞の免疫反応性を示す顕微鏡写真である。図１６Ａ及び図１６Ｂは、ＭＡＦＢ及びＩＮＳはｈＥＳＣ由来内分泌前駆細胞で同時に発現することを示す。図１６Ｃ及び図１６Ｄは、ＭＡＦＢ及びＩＮＳに対する１３．５週齢のヒト胎児膵臓の免疫反応性を示す。ＭＡＦＢ及びＩＮＳは胎児膵臓で同時に発現する。

【図17】シナプトフィジン及びＮＣＡＭを発現する未熟膵島ホルモン発現細胞の同時分離（図１７Ａ）、並びにＩＮＳ及びＮＣＡＭを発現する未熟膵島ホルモン発現細胞の同時分離（図１７Ｂ）を示すフローサイトメトリドットプロットである。

【図18】未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞のフローサイトメトリドットプロットである。図１８Ａは、抗ＮＣＡＭ抗体による、未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞の標識化を示すフローサイトメトリドットプロットである。図１８Ｂは、ＮＣＡＭ及びＳＹＰに関して陽性又は陰性であるｈＥＳＣ由来細胞の分布を示すフローサイトメトリドットプロットである。図１８Ｃは、ＮＣＡＭ及びＳＹＰの両方に関して、ＦＡＣＳで再び分析した図１８ＡのｈＥＳＣ由来ＮＣＡＭ陽性細胞の分布を示すフローサイトメトリドットプロットである。このドットプロットは、ＮＣＡＭ及びＳＹＰの両方に関して陽性又は陰性であるこれらの細胞の分布を示す。図１８Ｄは、ＮＣＡＭ及びＳＹＰの両方に関して、ＦＡＣＳで再び分析した図１８ＡのｈＥＳＣ由来ＮＣＡＭ陰性細胞の分布を示すフローサイトメトリドットプロットである。このドットプロットは、ＮＣＡＭ及びＳＹＰの両方に関して陽性又は陰性であるこれらの細胞の分布を示す。

【図19】未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞のフローサイトメトリドットプロットである。処理細胞は、ＮＣＡＭ陽性細胞に関して選別したか（図１９Ｂ、図１９Ｄ）、又は選別しなかった（図１９Ａ、図１９Ｃ）。図１９Ａ及び図１９Ｂは、ＮＣＡＭ及びＳＹＰの両方に関して陽性及び陰性である細胞の分布を示す。図１９Ｃ及び図１９Ｄは、ＮＣＡＭ及びＩＮＳの両方に関して陽性及び陰性である細胞の分布を示す。

【図20】未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞のフローサイトメトリドットプロットである。図２０Ａは、ＮＣＡＭに関して蛍光を示した細胞株の小集団を示す。図２０Ｂは、ＳＹＰに関して蛍光を示した細胞株の小集団を示す。図２０Ｃは、図２０ＡのＮＣＡＭ蛍光細胞が回収され、ＳＹＰに関して解析される場合、非常に高い割合のｈＥＳＣ由来細胞がＳＹＰ陽性であることを示す。

【図21】未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞のフローサイトメトリドットプロットである。図２１Ａは、ＮＣＡＭに関して染色したｈＥＳＣ由来細胞の分布を示す。図２１Ｂは、未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ細胞の小集団が、ＮＣＡＭ陽性及びＣＤ１３３陰性であることを示す。図２１Ｃは、ＳＹＰ陽性及びＳＹＰ陰性であるＮＣＡＭ陽性／ＣＤ１３３陰性細胞の分布を示す。

【図22-1】内分泌前駆細胞（「初期」）に分化するように処理された、又は未熟膵島ホルモン発現細胞（「中期」及び「後期」）に分化するように処理されたｈＥＳＣ由来細胞においてＱＰＣＲで検出されるように、或る特定のマーカーのｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。「選別前」で標識されたデータは、ＦＡＣＳ装置によって処理及び選別されていない細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す。「ＮＣＡＭ蛍光」で標識されたデータは、ＮＣＡＭ陽性である細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す。「ＮＣＡＭ非蛍光（dim）」で標識されたデータは、ＮＣＡＭ陰性である細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す。具体的には、ＮＧＮ３（図２２Ａ）、ＰＡＸ４（図２２Ｂ）、ＩＮＳ（図２２Ｃ）、膵臓ポリペプチド（図２２Ｄ）、ＰＡＸ６（図２２Ｅ）、ＧＣＧ（図２２Ｆ）、のｍＲＮＡレベルが示される。

【図22-2】内分泌前駆細胞（「初期」）に分化するように処理された、又は未熟膵島ホルモン発現細胞（「中期」及び「後期」）に分化するように処理されたｈＥＳＣ由来細胞においてＱＰＣＲで検出されるように、或る特定のマーカーのｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。「選別前」で標識されたデータは、ＦＡＣＳ装置によって処理及び選別されていない細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す。「ＮＣＡＭ蛍光」で標識されたデータは、ＮＣＡＭ陽性である細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す。「ＮＣＡＭ非蛍光（dim）」で標識されたデータは、ＮＣＡＭ陰性である細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す。具体的には、ＧＨＲＬ（図２２Ｇ）、ＧＣＫ（図２２Ｈ）、ＳＳＴ（図２２Ｉ）、ＮＸＫ２．２（図２２Ｊ）及びＳＹＰ（図２２Ｋ）のｍＲＮＡレベルが示される。

【図23】未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞においてＱＰＣＲで検出されるように、或る特定のマーカーのｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである（１９日目）。「選別前」で標識されたデータは、ＦＡＣＳ装置によって処理及び選別されていない細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す。「ＮＣＡＭ蛍光」で標識されたデータは、ＮＣＡＭ陽性である細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す。「ＮＣＡＭ非蛍光」で標識されたデータは、ＮＣＡＭ陰性である細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す。具体的には、ＮＥＵＲＯＤ（図２３Ａ）、ＩＳＬ１（図２３Ｂ）、ＧＡＳ（図２３Ｃ）、ＫＩＲ６．２（図２３Ｄ）、及びＳＵＲ１（図２３Ｅ）のｍＲＮＡレベルが示される。

【図24-1】未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞においてＱＰＣＲで検出されるように、或る特定のマーカーのｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである（１９日目）。「選別前」で標識されたデータは、ＦＡＣＳ装置によって処理及び選別されていない細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す（ゲート化した生存細胞）。「ＮＣＡＭ蛍光」で標識されたデータは、ＮＣＡＭ陽性である細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す。具体的には、ＮＣＡＭ１（図２４Ａ）、ＮＫＸ２．２（図２４Ｂ）、ＳＹＰ（図２４Ｃ）、ＰＡＸ６（図２４Ｄ）、ＮＥＵＲＯＤ（図２４Ｅ）、ＩＳＬ１（図２４Ｆ）のｍＲＮＡレベルが示される。

【図24-2】未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞においてＱＰＣＲで検出されるように、或る特定のマーカーのｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである（１９日目）。「選別前」で標識されたデータは、ＦＡＣＳ装置によって処理及び選別されていない細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す（ゲート化した生存細胞）。「ＮＣＡＭ蛍光」で標識されたデータは、ＮＣＡＭ陽性である細胞におけるマーカーのｍＲＮＡレベルを表す。具体的には、ＩＮＳ（図２４Ｇ）、ＧＣＧ（図２４Ｈ）、ＧＨＲＬ（図２４Ｉ）、ＳＳＴ（図２４Ｊ）及びＰＰ（図２４Ｋ）のｍＲＮＡレベルが示される。

【図25】未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞のフローサイトメトリドットプロットである。図２５Ａ、図２５Ｃ及び図２５Ｅは、ＮＣＡＭ陽性細胞に関して細胞集団を選別する前に、細胞集団においてそれぞれＳＹＰ、ＣＨＧＡ、及びＩＮＳ陽性であるＮＣＡＭ陽性細胞の割合を示す。図２５Ｂ、図２５Ｄ、及び図２５Ｆは、ＮＣＡＭ発現に関して陽性である細胞に関して細胞を選別した後に、それぞれＳＹＰ、ＣＨＧＡ及びＩＮＳ陽性である細胞の割合を示す。

【図26】未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞のフローサイトメトリドットプロットである。図２６Ａは、ＳＹＰ陽性であるＮＣＡＭ陽性細胞の割合を示す。図２６Ｂは、ＣＤ１３３陰性であるＮＣＡＭ陽性細胞の割合を示す。図２６Ｃは、ＳＹＰ陽性であり、ＮＣＡＭ陽性／ＣＤ１３３陰性細胞に関して選別した細胞の割合を示す。

【図27】ＩＮＳ（図２７Ｄ）、ＰＡＸ６（図２７Ｃ）に関して、未熟膵島ホルモン発現細胞の免疫反応性を示す顕微鏡写真である。全細胞集団は、ＤＡＰＩで染色される（図２７Ｂ）。この細胞は、未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理し、蛍光活性化細胞選別技術を用いて選別されたｈＥＳＣ由来幹細胞である。この顕微鏡写真で表される細胞は、ＮＣＡＭに関しても蛍光的に染色された。一部のＮＣＡＭ陽性ｈＥＳＣ由来細胞が、ＰＡＸ６及びＩＮＳを同時に発現する（図２７Ａ）。

【図28】ＩＮＳ（図２８Ｃ）又はＧＣＧ（図２８Ｄ）を発現する未熟膵島ホルモン発現細胞の免疫反応性を示す顕微鏡写真である。この細胞は、未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理し、蛍光活性化細胞選別技術を用いて選別されたｈＥＳＣ由来幹細胞である。この顕微鏡写真で表される細胞は、ＮＣＡＭに関しても蛍光的に染色された。図２８Ａは、ＩＮＳ及びＧＣＧの両方を発現する細胞の重複を示す。

【図29】膵臓インスリン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞においてＱＰＣＲで検出されるように、或る特定のマーカーのｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである（１９日目）。具体的には、ＰＤＸ１（図２９Ａ）、ＮＧＮ３（図２９Ｂ）、ＩＮＳ（図２９Ｃ）、ＳＳＴ（図２９Ｄ）、ＧＣＧ（図２９Ｅ）及びＧＨＲＬ（図２９Ｆ）のｍＲＮＡレベルが示される。略称は以下のように示される：Ａ１００ − １００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、ＫＣ − ５０ｎｇ／ｍｌのＫＧＦ及び０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミン、及びｎｏｇ − ノギン。

【図30】ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞においてＱＰＣＲで検出されるように、或る特定のマーカーのｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである（１１日目）。具体的には、ＰＤＸ１（図３０Ａ）、ＮＧＮ３（図３０Ｂ）、ＰＴＦ１Ａ（図３０Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図３０Ｄ）、ＩＮＳ（図３０Ｅ）及びＧＣＧ（図３０Ｆ）のｍＲＮＡレベルが示される。略称は以下のように示される：Ａ１００ − １００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、ＫＣ − ５０ｎｇ／ｍｌのＫＧＦ及び０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミン、Ｎ − ノギン、ＣＲ０．１ − ０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミン及び０．１μＭのレチノイン酸、ＣＲ２ − ０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミン及び２μＭのレチノイン酸、「Ａ」 − ０ｎｇ／ｍｌのノギン及び０．１μＭのレチノイン酸、「Ｂ」 − ３０ｎｇ／ｍｌのノギン及び０．１μＭのレチノイン酸、「Ｃ」 − １００ｎｇ／ｍｌのノギン及び０．１μＭのレチノイン酸、「Ｄ」 − ０ｎｇ／ｍｌのノギン及び２μＭのレチノイン酸、「Ｅ」 − ３０ｎｇ／ｍｌのノギン及び２μＭのレチノイン酸、並びに「Ｆ」 − １００ｎｇ／ｍｌのノギン及び２μＭのレチノイン酸。

【発明を実施するための形態】

【0394】

未分化ｈＥＳＣを内分泌前駆細胞及び未熟膵島ホルモン発現細胞に、並びに最終的にｉｎ ｖｉｔｒｏでインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、ＰＰＹ及びグレリンを合成することができる成熟膵臓内分泌細胞（成熟膵島ホルモン発現細胞）に変換する工程の進行が本明細書に記載される。この工程の進行は、ｉｎ ｖｉｖｏで膵臓発生中に生じることが現在分かっている中間体を経たｈＥＳＣの逐次分化に関する。ｈＥＳＣ由来の膵臓内分泌細胞を産生する一般的な方法は、胚体内胚葉（ＤＥ）の産生から始まり、その後のＤＥパターン形成工程でＴＧＦ−βシグナル伝達が変更され、線維芽細胞増殖因子又は線維芽細胞増殖因子２受容体ＩＩＩｂ（ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ）を刺激若しくはそうでなければ相互作用するリガンドが供給される。ＰＤＸ１陽性の予めパターン形成された内胚葉は、レチノイン酸及びγ−セクレターゼ阻害剤に一次的に曝されることによって膵臓の内分泌系統にさらに補充され、その後膵臓内分泌ホルモン産生細胞が発生する。

【0395】

米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）
」、２００４年１２月２３日提出）及びD'Amour et al. Nat. Biotech. 23, 1534-1541, （2005）（その開示内容全体が参照により本明細書に援用される）で以前に示されたように、本発明者らは、体細胞の胚葉の胚体内胚葉（ＤＥ）を産生させる確固たる方法を開発
している。ｉｎ ｖｉｖｏで、原始線条と呼ばれる領域で生じた胚発生の原腸胚形成段階中にＤＥ系統が発生する。ＤＥの発生は、小腸、胃、肺、胸腺、膵臓内分泌腺、副甲状腺、甲状腺及び膵臓等の組織及び器官の後期特異化（specification：発生運命決定）の必
要条件である。

【0396】

ヒト及びほとんどの他の脊椎動物において、膵臓は、腹側膵芽及び背側膵芽の両方として前腸−中腸接合部で前腸内胚葉から誘導される。ヒトでは、腹側膵芽及び背側膵芽が、受胎後（post conception）（ｐ．ｃ．）約４１日〜４５日で膵頭後部及び鉤状突起と呼
ばれる領域を形成するより小さい腹側芽と融合する（Bocian-Sobkowska, J., et al. Histochem. Cell Biol. 112, 147-153, （1999））。ヒトのこの領域は主に、島細胞を産生
する膵臓ポリペプチドから成る（Rahier J., et al., Cell Tissue Res. 200 （3）, 359-366,（1979）、Malaisse-Langae F., et al., Diabetologia 17（6）, 361-365,（1979
）、Fiocca R., et al., Histochemistry 77（4）, 511-523,（1983）、Stefan Y., et al., Diabetologica 23（2）, 141-142,（1982））。背側膵芽は、ヒトにおいては膵頭前
部、膵体及び膵尾を形成する。このことによって、全ての膵臓ホルモン産生細胞が作製される。カエル（アフリカツメガエル（Xenopus））及びサカナ（ゼブラフィッシュ（zebrafish））では、背側芽細胞だけが、インスリン産生島細胞を作製する（Kelly, O.G. and Melton, D. A., Dev. Dyn. 218, 615-627,（2000）、Chen, Y., et al., Dev. Biol. 271（1）, 144-160,（2004）、Field, H. A., et al., Dev. Biol. 263, 197- 208（2003）
）。同様に、ヒトでは腹側芽は主に、インスリンの排除のために、膵臓ポリペプチド発現島細胞を作製すると考えられる（Rahier J., et al., Cell Tissue Res. 200 （3）, 359-366,（1979）、Malaisse-Langae F., et al., Diabetologia 17（6）, 361-365,（1979
）、Fiocca R., et al., Histochemistry 77（4）, 511-523, （1983）、Stefan Y., et al., Diabetologica 23（2）, 141-142, （1982））。これに対して、ウサギ及びマウス
では、腹側芽及び背側芽の両方がインスリン産生細胞を作製する（Spooner, B. S., et al., J. Cell Biology, 47, 235- 246,（1970）、Li, H., et al., Nature 23, 67-70,（1999））。

【0397】

図１で示されるように、膵臓内分泌細胞は、一連の発生段階でｈＥＳＣから効率的に産生することができる。第１段階は、Ｔボックス遺伝子ブラキュリの移行発現を特徴とする内胚葉系中胚葉（ＭＥ）の形成である。ｈＥＳＣはＤＥに分化するにつれ、Ｅ−カドヘリン及び、上皮性外胚葉状態から間葉性ＤＥ細胞への移行を下方調節する（D 'Amour et al. Nat. Biotech. 23, 1534-1541,（2005））。初期ＤＥ細胞を規定する主なマーカーは、ＦＯＸＡ２、ＧＳＣ、Ｎ−カドヘリン、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７である。本発明者らの以前の米国特許出願第１１／０２１，６１８号で説明されたように、ＤＥはさらに、或る特定の他のマーカー、例えばＳＯＸ１、ＳＯＸ７、トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＳＰＡＲＣ及びαフェトプロテイン（ＡＦＰ）の有意な発現の欠如を特徴とする。新生ＤＥは、アクチビンのシグナル伝達の除去によって、その強い前部特徴からより後部へさらにパターン形成されるが、依然として前腸内胚葉である。このような前腸内胚葉は、ＨＮＦ１ｂ及びＦＯＸＡ１遺伝子マーカーの発現を特徴とする。この内胚葉は展開し（expands）、
ＦＧＦ１０、レチノイン酸及びシクロパミン（ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）阻害剤）に曝されることによってより背部の表現型になると考えられる。前腸胚後部（前腸胚の後部領域）パターン形成細胞は、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ１ｂ、Ｏｎｅｃｕｔ１／２及びＨＢ９を発現する。内分泌前駆細胞を示すこれらの膵臓内胚葉細胞は、ＮＧＮ３の一時的発現によって示されるように（潜在的にノッチ経路シグナル伝達の阻害による）γ−セクレターゼシグナル伝達の調節によって内分泌系統に優先的に補充される。ｈＥＳＣ由来内分泌前駆細胞は、ペアードボックス遺伝子４（ＰＡＸ４）及びＮＫＸ２．２も発現する。内分泌前駆細胞のさらなるインキュベートによって、未熟膵島ホルモン発現細胞が発生する。未熟膵島ホルモン発現細胞は、Ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＢ（ＭＡＦＢ）並びにＮＫＸ２．２を発現し、膵島ホルモン発現細胞はＮＫＸ２．２を発現す
る。最終的に、未熟膵島ホルモン発現細胞のさらなるインキュベートによって、未熟細胞から、内分泌ホルモンである、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、−ＰＰＹ、グレリン及び膵臓転写因子ＮＫＸ２．２／６．１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ１、ＰＤＸ１、ＩＳＬ１の他に、Ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＡ（ＭＡＦＡ）を発現することができる成熟膵島ホルモン発現細胞に移行される。

【0398】

定義
本明細書で表される数値域は記載された端点を含み、規定の数値域の端点間の全整数を記載することが理解される。

【0399】

本明細書で用いられるように、「膵島ホルモン発現細胞」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト多能性細胞から誘導されており、１つ又は複数の膵臓ホルモンを発現し、ヒト膵島細胞の機能の少なくとも幾つかを有している細胞を表す。膵島ホルモン発現細胞は、成熟であっても未熟であってもよい。未熟膵島ホルモン発現細胞は、或る特定のマーカーの差次的発現に基づいて、成熟膵島ホルモン発現細胞と区別することができる。本発明で用いられるように、「膵臓ホルモン発現細胞」は、「膵島ホルモン発現細胞」と交換可能に用いられる。

【0400】

本明細書で用いられるように、「内分泌前駆細胞」は、ニューロゲニン３（ＮＥＵＲＯＧ３）を発現し、さらに膵島ホルモン発現細胞を含む（が、これに限定されない）内分泌系の細胞に分化することができる胚体内胚葉系統の多能性細胞を表す。内分泌前駆細胞は、あまり明確に分化しない胚体内胚葉系統細胞、例えばＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞ほど多くの種類の様々な細胞、組織及び／又は器官に分化することはできない。

【0401】

本明細書で用いられるように、「ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞」及び「ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞」は、膵臓及び十二指腸ホメオボックス遺伝子１（ＰＤＸ１）を発現し、さらに内分泌前駆体及び膵島ホルモン発現細胞を含む（が、これに限定されない）前腸から誘導された細胞に分化することができる胚体内胚葉系統の多能性細胞を表す。ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞ほど多くの種類の様々な細胞、組織及び／又は器官に分化することはできない。

【0402】

本明細書で用いられるように、「複能性」又は「多能性細胞」は、他の特定の細胞型を限られた数、発生することができる細胞型を表す。多能性細胞は、１つ又は複数の胚性細胞の運命に関わっており、したがって多能性細胞とは対照的に、３つの胚性細胞系統のそれぞれ、及び胚体外細胞を発生させることはできない。

【0403】

幾つかの実施形態において、「多能性細胞」は、膵島ホルモン発現細胞の分化のための出発材料として用いられる。「多能性」とは、細胞が３つの胚性細胞系統のそれぞれ及び胚体外細胞を発生することができることを意味している。しかし、多能性細胞は、全生物体（organism）を産生することができるわけではない。

【0404】

或る特定の実施形態において、出発材料として用いられる多能性細胞は、ヒト胚性幹細胞を含む幹細胞である。本発明で用いられるように、「胚性」は、単一の接合体から始まり、発生した配偶子細胞以外の多能性細胞又は全能性細胞を既に含んでいない多細胞構造で終結する生物体の一連の発生段階を表す。配偶子融合によって誘導された胚に加えて、「胚性」という用語は、体細胞の核移植によって誘導された胚を表す。

【0405】

「条件培地」とは、基本培地に比べて変更した培地を意味する。例えば、培地の条件付けによって、分子、例えば栄養分及び／又は増殖因子が、基本培地で見られる元々のレベルから付加又は枯渇され得る。幾つかの実施形態において、或る特定の種類の細胞を培地
中で或る特定期間、或る特定の条件下で培養又は維持させることによって、培地は条件付けされる。例えば、ｈＥＳＣを規定の組成物の培地で規定時間、規定温度で増殖、分化又は維持させることによって、培地を条件付けることができる。当業者によって理解されるように、細胞、培地の種類、期間及び環境条件の数多くの組合せを用いて、条件培地の無限に近い配列を作製することができる。

【0406】

細胞培養物及び／又は細胞集団に関連して使用される場合、「部（portion）」という
用語は、０ではない任意量の細胞培養物又は細胞集団を意味し、これは単一の細胞から細胞培養物又は細胞集団全体の範囲である。好ましい実施形態において、「部」という用語は、細胞培養物及び細胞集団の、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％又は少なくとも９５％を意味する。

【0407】

細胞培養物又は細胞集団中の細胞に関して、「実質的に含まない（substantially free
of）」という用語は、細胞培養物又は細胞集団が含まない特定の細胞型の存在量が、細
胞培養物又は細胞集団中に存在する全細胞数の、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満であることを意味する。

【0408】

本明細書で用いられるように、培養物又は条件培地において「外から加えられた」増殖因子及び分化因子等の化合物は、培養物又は培地に既に存在し得る任意の化合物又は増殖因子を補充するために培養物又は培地に添加される増殖因子を表す。例えば、本発明の幾つかの実施形態において、細胞培養物及び／又は細胞集団は外から加えられたレチノイドを含まない。

【0409】

本明細書で用いられるように、「ｈＥＳＣから産生された」、「ｈＥＳＣから誘導された」、「ｈＥＳＣから分化した」及び同等表現は、ｉｎ ｖｉｖｏよりむしろｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈＥＳＣからの分化細胞型の産生を表す。

【0410】

幾つかの実施形態において、ｈＥＳＣは、「着床前胚」から誘導することができる。本明細書で用いられるように、「着床前胚」は、受精段階と着床段階との間の胚を表す。したがって、着床前胚は典型的に胚盤胞段階を超えて進行することはない。着床は通常、受
精後７〜８日で起こる。しかし、着床は受精後約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日又は約１４日超で起こる可能性もある。

【0411】

本発明で用いられるように、「ヘッジホッグ阻害剤」又は「ヘッジホッグ経路阻害剤」は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の任意の成員を阻害する任意の分子を表す。例示的なヘッジホッグ経路阻害剤としては、ＫＡＡＤ−シクロパミン、シクロパミン類似体、ジェルビン、ジェルビン類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体及び当業者に既知のヘッジホッグ経路機能の任意の他の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0412】

本明細書で用いられるように、「γ−セクレターゼ阻害剤」は、γ−セクレターゼ、又はγ−セクレターゼの活性によって引き起こされるシグナル伝達事象を阻害する任意の分子を表す。例示的なγ−セクレターゼ阻害剤としては、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル（Diflurophenacetyl）−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブ
チルエステル（ＤＡＰＴ）、Ｆボックスタンパク質ＳＥＬ−１０、γ−セクレターゼ遮断抗体及び当業者に既知のγ−セクレターゼ機能の任意の他の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤はノッチシグナル伝達経路を阻害する。幾つかの実施形態において、ノッチ経路阻害剤又はノッチ特異的阻害剤は、γ−セクレターゼ阻害剤の代わりに用いることができる。

【0413】

本明細書で用いられるように、「レチノイド」は、レチノール、レチナール又はレチノイン酸、並びに任意のこれらの化合物の誘導体を表す。好ましい実施形態において、レチノイドはレチノイン酸である。

【0414】

「ＦＧＦファミリー増殖因子」、「線維芽細胞増殖因子」又は「線維芽細胞増殖因子ファミリーの成員」とは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２及びＦＧＦ２３から成る群から選択されるＦＧＦを意味する。幾つかの実施形態において、「ＦＧＦファミリー増殖因子」、「線維芽細胞増殖因子」又は「線維芽細胞増殖因子ファミリーの成員」とは、既知の線維芽細胞増殖因子ファミリーの成員と類似した相同性及び／又は機能を有する任意の増殖因子を意味する。

【0415】

本明細書に記載されるように、「発現」とは、材料又は物質の産生、及び材料又は物質の産生のレベル又は量を指す。したがって、特定マーカーの発現の判定とは、発現するマーカーの相対量若しくは絶対量を検出すること、又は単にマーカーの有無を検出することのいずれかを指す。

【0416】

本明細書に記載されるように、「マーカー」とは、観察又は検出され得る任意の分子を指す。例えばマーカーとしては、核酸、例えば、特定遺伝子の転写産物、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質又は小分子（例えば、分子量が１００００ａｍｕ未満の分子）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0417】

本明細書で記載されたほとんどのマーカーに関して、公的なヒト遺伝子解析機構（ＨＵＧＯ）の遺伝子記号が与えられる。ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会によって作製されたこのような記号には、名前が付けられたヒトの遺伝子及び遺伝子産物に対して特有の略称が与えられる。これらの遺伝子記号は当業者によって容易に認識され、対応する特有のヒト遺伝子及び／又はタンパク質配列に容易に関連付けることができる。

【0418】

ＨＵＧＯの命名により、以下の遺伝子記号は、以下の通り定義される：ＧＨＲＬ − グレリン；ＩＡＰＰ − 膵島アミロイドポリペプチド；ＩＮＳ − インスリン；ＧＣＧ − グルカゴン；ＩＳＬ１ − ＩＳＬ１転写因子；ＰＡＸ６ − ペアードボックス遺伝子６；ＰＡＸ４ − ペアードボックス遺伝子４；ＮＥＵＲＯＧ３ − ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）；ＮＫＸ２−２ − ＮＫＸ２転写因子関連、遺伝子座２（ＮＫＸ２．２）；ＮＫＸ６−１ − ＮＫＸ６転写因子関連、遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）；ＩＰＦ１ − インスリンプロモータ因子１（ＰＤＸ１）；ＯＮＥＣＵＴ１ − ワンカットドメイン、ファミリー成員１（ＨＮＦ６）；ＨＬＸＢ９ − ホメオボックスＢ９（ＨＢ９）；ＴＣＦ２ − 転写因子２、肝臓（ＨＮＦ１ｂ）；ＦＯＸＡ１ − フォークヘッドボックスＡ１；ＨＧＦ − 肝細胞増殖因子；ＩＧＦ１ − インスリン様増殖因子１；ＰＯＵ５Ｆ１ − ＰＯＵドメイン、５群、転写因子１（ＯＣＴ４）；ＮＡＮＯＧ − Ｎａｎｏｇホメオボックス；ＳＯＸ２ − ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２；ＣＤＨ１ − カドヘリン１、１型、Ｅ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）；Ｔ − ブラキュリホモログ（ＢＲＡＣＨ）；ＦＧＦ４ − 線維芽細胞増殖因子４；ＷＮＴ３ − ウイングレス型ＭＭＴＶ組込部位ファミリー、成員３；ＳＯＸ１７ − ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス１７；ＧＳＣ − グースコイド；ＣＥＲ１ − （ケルベロス１、システインノットスーパーファミリー、ホモログ（ＣＥＲ）；ＣＸＣＲ４ − ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４；ＦＧＦ１７ − 線維芽細胞増殖因子１７；ＦＯＸＡ２ − フォークヘッドボックスＡ２；ＳＯＸ７ − ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス７；ＳＯＸ１ − ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス１；ＡＦＰ − α−フェトプロテイン；ＳＰＡＲＣ − 分泌タンパク質、酸性、システインリッチ（オステオネクチン）；及びＴＨＢＤ − トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＮＣＡＭ − 神経細胞接着分子；ＳＹＰ − シナプトフィジン；ＺＩＣ１ − Ｚｉｃファミリー成員１；ＮＥＦ３ −
神経フィラメント３（ＮＦＭ）；ＳＳＴ − ソマトスタチン；ＭＡＦＡ − ｖ−ｍａｆ筋腱膜繊維肉腫癌遺伝子ホモログＡ；ＭＡＦＢ − ｖ−ｍａｆ筋腱膜繊維肉腫癌遺伝子ホモログＢ；ＳＹＰ − シナプトフィジン；ＣＨＧＡ − クロモグラニンＡ（副甲状腺分泌タンパク質１）。

【0419】

以下、本明細書中で使用され得る、非ＨＵＧＯ遺伝子シンボル及び他の省略表現に対応する完全な遺伝子名を示す：ＳＳ − ソマトスタチン（ＳＯＭ）；ＰＰ − 膵臓ポリペプチド；Ｃ−ペプチド − 結合ペプチド；Ｅｘ４ − エキセンジン４；ＮＩＣ −
ニコチンアミド及びＤＡＰＴ − Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル；ＲＡ − レチノイン酸；ＲＰＭＩ − ロズウェルパーク記念研究所（Roswell Park Memorial Institute）培地
；ＣＭＲＬ − コノート医学研究所（Connaught Medical Research Labs）培地；ＦＢ
Ｓ − ウシ胎児血清；ＮＢＰ１０ − ＮＣＡＭ結合タンパク質１０；ＰＴＦ１ａ −
膵臓特異的転写因子１ａ。

【0420】

線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）及びケラチノサイト増殖因子（keritinocyte growth factor）（ＫＧＦ）という用語は同義語である。

【0421】

本明細書で用いられるように、「標識」という用語は、例えば当該技術分野で標準的に用いられる放射活性、蛍光、生物学的又は酵素的なタグ又は標識を表す。標識は、核酸、ポリペプチド、例えば抗体、又は小分子と接合又はそうでなければ結合することができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、ビオチン化ｄＮＴＰ又はｒＮＴＰに組み込むこと、又は幾つかの同様な手段（例えば、ビオチンのソラーレン誘導体をＲＮＡと光架橋すること）、その後の標識化ストレプトアビジン（例えば、フィコエリトリン接合ストレプトアビジン）若しくは同等物の添加によって、合成の後に標識することができる。代替的に、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる場合、フルオレセイン、リサミン（lissamine）、フィコエリトリン（phycoerythirin）、ローダミン（Perkin Elmer Cetus
）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、及びＦｌｕｏｒＸ（Amersham）等を核酸に付着させることができる。抗体等のポリペプチドと接合し得る検出可能な標識の比限定的な例としては、放射性標識、例えば^３Ｈ、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^６４Ｃｕ、^７６Ｂｒ、^８６Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、又は^１７７Ｌｕ、酵素、例えばホースラディシュペルオキシダーゼ、フルオロフェア、クロモフォア、化学発光剤、キレート複合体、染料、コロイド金又はラテックス粒子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0422】

ヒト胚性幹細胞
胚体内胚葉細胞、最終的には、内分泌前駆細胞及び／又は膵島ホルモン発現細胞を誘導させる好ましい方法は、ヒト胚性幹細胞を出発材料として利用する。このような多能性細胞は、桑実胚に由来する細胞、胚の内部細胞塊又は胚の生殖隆起から得られる細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野において既知の方法を使用して、実質的な分化なしに多能性状態で培養物中で維持され得る。このような方法は、例えば、米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，６７０，３７２号、同第５，６９０，９２６号、同第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号及び同第６，２５１，６７１号（これらの開示内容全体が、参照により本明細書中に援用される）に記載されている。

【0423】

幾つかのプロセスにおいて、ｈＥＳＣはフィーダー層上に維持される。このようなプロセスでは、ｈＥＳＣを多能性状態で維持させる任意のフィーダー層が使用され得る。ヒト胚性幹細胞の培養に一般的に使用される１つのフィーダー層は、マウス線維芽細胞の層である。つい最近になって、ヒト線維芽細胞フィーダー層が、ｈＥＳＣの培養で使用するために開発された（米国特許出願第２００２／００７２１１７号（この開示内容全体が、参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）。代替的なプロセスは、フィーダー層を使用せずに多能性ｈＥＳＣの維持を可能にする。フィーダー層のない条件下で多能性ｈＥＳＣを維持する方法は、米国特許出願第２００３／０１７５９５６号（この開示内容全体が、参照により本明細書中に援用される）に記載されている。

【0424】

本明細書中で使用されるヒト胚性幹細胞は、血清を含有するか又は含有しないかのいずれかの培養物中に維持され得る。幾つかの胚性幹細胞維持手順では、血清代替物が使用される。他では、無血清培養技法、例えば米国特許出願第２００３／０１９０７４８号（この開示内容全体が、参照により本明細書中に援用される）に記載されている技法が使用される。

【0425】

幹細胞は、胚体内胚葉、その後最終的に内分泌前駆細胞及び／又は膵島ホルモン発現細胞に分化することが要求されるまで、培養物中において多能性状態で定期的な継代培養により（by routine passage）維持される。

【0426】

胚体内胚葉の産生
幾つかのプロセスにおいて、胚体内胚葉への分化は、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量で、ＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子を幹細胞培養物に供給することによって達成される。胚体内胚葉の産生に有用であるＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子は、ノーダル／アクチビン又はＢＭＰサブグループから選択される。幾つかの好ましい分化プロセスにおいて、増殖因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰ４から成る群から選択される。また、増殖因子Ｗｎｔ３ａ及び他のＷｎｔファミリー成員は、胚体内胚葉細胞の産生に有用である。或る特定の分化プロセスでは、上述の増殖因子のいずれかの組合せが使用され得る。

【0427】

多能性幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化のためのプロセスの幾つかに関しては、幹細胞の少なくとも一部の胚体内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な濃度で増殖因子が培養
物中に存在するように、上述の増殖因子が細胞に供給される。幾つかのプロセスにおいて、上述の増殖因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で細胞培養物中に存在する。

【0428】

多能性幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための或る特定のプロセスにおいて、上述の増殖因子は、それらの添加後、細胞培養物から除去される。例えば増殖因子は、それらの添加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、又は約１０日以内に除去され得る。好ましいプロセスにおいて、増殖因子は、それらの添加後約４日で除去される。

【0429】

胚体内胚葉細胞の培養物は、低血清又は無血清の培地中で胚性幹細胞から産生され得る。或る特定の培養条件下、血清濃度は約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えば、幾つかの分化プロセスにおいて、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満、又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。幾つかのプロセスにおいて、胚体内胚葉細胞を、血清を用いずに、又は血清代替物を用いずに増殖させる。さらに他のプロセスにおいて、胚体内胚葉細胞はＢ２７の存在下で増殖する。このようなプロセスにおいて、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。他の実施形態において、胚体内胚葉細胞はＢ２７の非存在下で増殖する。

【0430】

ｈＥＳＣからヒト胚体内胚葉細胞を分化する幾つかのプロセスにおいて、分化は血清の非存在下で、及びインスリン及び／又はインスリン様増殖因子の非存在下で開始される。分化中に、適切な細胞生存を促進させるために、血清濃度を徐々に増加させることができる。好ましい実施形態において、ｈＥＳＣの胚体内胚葉細胞への分化は、血清の非存在下で、及びインスリン又はインスリン様増殖因子を含む任意のサプリメントの非存在下で開始される。血清の非存在及びインスリン又はインスリン様増殖因子を含むサプリメントの非存在が約１日〜約２日間維持され、その後分化の間に分化される細胞培養物に血清を徐々に添加する。好ましい実施形態において、血清濃度は、分化中には約２％を超えない。

【0431】

胚体内胚葉の細胞培養物及び細胞集団、並びに胚性幹細胞から胚体内胚葉を産生する詳細なプロセスは、米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）」、２００４年１２月２３日提出）（その開示内容全体が参照により本明
細書に援用される）でさらに記載される。

【0432】

胚体内胚葉の濃縮、単離及び／又は精製
本明細書に記載されたプロセスの幾つかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、さらなる分離の前に濃縮、単離及び／又は精製される。このような実施形態において、胚体内胚葉細胞は、任意の既知の方法を用いて濃縮、単離及び／又は精製することができる。好ましい実施形態において、胚体内胚葉細胞は、米国特許出願第１１／０２１，６１８号（
表題「胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）」、２００４年１２月２３日提出）及び米国
特許仮出願第６０／７３６，５９８号（表題「胚体内胚葉のマーカー（MARKERS OF DEFINITIVE ENDODERM）」、２００５年１１月１４日提出）（それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）で記載された１つ又は複数の方法を用いて濃縮、単離及び／又は精製される。

【0433】

胚体内胚葉細胞を含む組成物
前記の方法によって産生された細胞組成物には、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物、及び胚体内胚葉細胞が濃縮された細胞集団が含まれる。例えば、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生することができ、細胞培養物及び／又は細胞集団における細胞の少なくとも約５０％〜９９％が胚体内胚葉細胞である。分化プロセスの効率が、細胞増殖条件、増殖因子の濃度及び培養工程のタイミングを含む（が、これらに限定されない）或る特定のパラメータを変更することによって調節することができるので、本明細書に記載された分化手順によって、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％又は約９９％超の多能性細胞が胚体内胚葉に変換され得る。胚体内胚葉細胞の単離が利用されるプロセスでは、例えばＣＸＣＲ４受容体と結合する親和性試薬を用いることによって、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団を回収することができる。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態において、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに、前記の割合が算出される。

【0434】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生
胚体内胚葉細胞は、これらの細胞のさらなる分化によって膵臓分化へと特異化し、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を産生し得る。本明細書に記載された幾つかの分化プロセスでは、胚体内胚葉細胞を含む、細胞培養物及び濃縮又は精製された細胞集団は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む、細胞培養物及び／又は濃縮された細胞集団へのさらなる分化に用いることができる。

【0435】

典型的に、胚体内胚葉細胞は、レチノイド、例えばレチノイン酸（ＲＡ）を、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に供給することによって、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化される。また、幾つかの分化プロセスでは、ＲＡ添加の前又はＲＡの添加とほぼ同時に、線維芽細胞増殖因子ファミリーの成員を培地中の胚体内胚葉細胞に供給する。好ましい線維芽細胞増殖因子はＦＧＦ−１０である。別の好ましいプロセスでは、線維芽細胞増殖因子は任意の線維芽細胞増殖因子又は線維芽細胞増殖因子２受容体ＩＩＩｂ（ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ））を刺激する、又はそうでなければそれと相互作用するリガンドを含む。さらにより好ましいプロセスでは、ＦＧＦファミリー増殖因子が、ヘッジホッグ経路阻害剤と併せて用いられる。好ましいヘッジホッグ経路阻害剤はＫＡＡＤ−シクロパミンである。特に好ましい分化プロセスでは、ＦＧＦ−１０及び／又はＫＡＡＤ−シクロパミンが、ＲＡの存在下でＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に供給される。或る特定のプロセスでは、ＢＭＰ４は、ＲＡの存在下でＦＧＦ−１０及び／又はＫＡＡＤ−シクロパミンと共に含まれ得る。幾つかのプロセスでは、レチノイドは、増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの成員、及び／又はコンノート医学研究所（Connaught Medical Research Labs）培地（ＣＲＭＬ培地）（Invitrogen, Carlsbad, CA）と併せて用いら
れる。

【0436】

本明細書に記載された分化プロセスの幾つかの実施形態に関して、レチノイド及び／又は前記の分化因子の組合せは、これらの因子が少なくとも一部の胚体内胚葉の細胞培養物又は細胞集団のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物又は細胞集団に存在するように、細胞に供給される。

【0437】

幾つかのプロセスにおいて、レチノイドは、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ、又は少なくとも約５０μＭの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞に供給される。

【0438】

他ののプロセスにおいて、ＦＧＦ−１０は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約2 ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞に供給される。他の実施形態において、単独で、又はＦＧＦ−１０と共に使用する場合、ＫＡＡＤ−シクロパミンは、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ、又は少なくとも約５０μＭの濃度で供給され得る。本発明の幾つかの実施形態において、線維芽細胞増殖因子、又は線維芽細胞増殖因子２受容体ＩＩＩｂ（ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ））を刺激するか、又はそうでなければそれと相互作用するリガンドは、単独又はヘッジホッグ経路阻害剤との併用のいずれかで供給される。

【0439】

胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を産生する好ましいプロセスでは、２μＭのＲＡの存在下でＣＭＲＬ培地において、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−１０及び０．２μＭのＫＡＡＤ−シクロパミンを胚体内胚葉細胞の細胞培養物又は濃縮された細胞集団に供給する。

【0440】

本明細書中に記載される幾つかのプロセスにおいて、アクチビンＡ及び／又はアクチビンＢは、レチノイド及び／又は線維芽細胞増殖因子並びにヘッジホッグ阻害剤と共に、細胞培養物に供給される。例えば、このようなプロセスにおいて、アクチビンＡ及び／又はアクチビンＢは、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも
約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物に供給される。

【0441】

幾つかのプロセスにおいて、分化因子及び／又はＣＲＭＬ培地は、ｈＥＳＣからの分化の開始後、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、又は約日超で、胚体内胚葉細胞に供給される。好ましいプロセスにおいて、分化因子及び／又はＣＲＭＬ培地は、ｈＥＳＣからの分化の開始後約５日目に胚体内胚葉細胞に供給される。

【0442】

本明細書中に記載される或る特定のプロセスにおいて、上述の分化因子は、それらの添加後に細胞培養物から除去される。例えば、上述の分化因子は、それらの添加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、又は約１０日以内に除去され得る。

【0443】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の培養物は、低血清又は無血清の培地中で分化し、さらに増殖し得る。血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。幾つかのプロセスにおいて、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は血清代替物で増殖する。例えば、或る特定のプロセスにおいて、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満、又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。本明細書中に記載される或る特定のプロセスにおいて、分化培地は、血清、血清代替物、又はインスリン若しくはインスリン様増殖因子を含む任意のサプリメントを含まない。

【0444】

或る特定のプロセスにおいて、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞はＢ２７の存在下で増殖する。このような分化プロセスにおいて、Ｂ２７は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で、又は約２０％（ｖ／ｖ）を超える濃度で、培養培地に供給され得る。或る特定のプロセスにおいて、培地中のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）、又は約２０％（ｖ／ｖ）である。代替的には、Ｂ２７サプリメントの添加濃度は、市販されているＢ２７原液の濃度の倍数で測定され得る。例えば、Ｂ２７は５０×原液としてInvitrogen（Carlsbad, CA）から入手可能である。この原液を十分量、十分な容量の増殖培地に添加することで、所望量のＢ２７を補充した培地が得られる。例えば、５０×Ｂ２７原液１０ｍｌを増殖培地９０ｍｌに加えることで、５×Ｂ２７を補充した増殖培地が得られる。培地中のＢ２７サプリメントの濃度は、約０．１×、約０．２×、約０．３×、約０．４×、約０．５×、約０．６×、約０．７×、約０．８×、約０．９×、約１×、約１．１×、約１．２×、約１．３×、約１．４×、約１．５×、約１．６×、約１．７×、約１．８×、約１．９×、約２×、約２．５×、約３×、約３．５×、約４×、約４．５×、約５×、約６×、約７×、約８×、約９×、約１０×、約１１×、約１２×、約１３×、約１４×、約１５×、約１６×、約１７×、約１８×、約１９×、約２０×、及び約２０×超であり得る。

【0445】

胚体内胚葉細胞からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を分化する幾つかのプロセスにおいて、米国特許仮出願第６０／７３０，９１７号（表題「ＰＤＸ１を発現する腹側及び背側の前腸内胚葉（PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM）」、２００５年
１０月２７日提出）（その開示内容全体が参照により本明細書に援用される）に記載されたように、腹側膵芽又は背側膵芽のいずれかへさらなる分化が向かうように、胚体内胚葉細胞が分化される。ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を産生するさらに詳細な方法は、米国特許出願第１１／１１５，８６８号（表題「ＰＤＸ１発現内胚葉（PDX1 EXPRESSING ENDODERM）」、２００５年４月２６日提出）（その開示内容全体が参照により本明細書に援用される）で見出すことができる。

【0446】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の濃縮、単離及び／又は精製
本明細書に記載されたプロセスの幾つかの実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、さらなる分離の前に濃縮、単離及び／又は精製される。このような実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、任意の既知の方法を用いて濃縮、単離及び／又は精製することができる。好ましい実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、米国特許出願第１１／１１５，８６８号（表題「ＰＤＸ１発現内胚葉（PDX1 EXPRESSING ENDODERM）」、２００５年４月２６日提出）及び米国特許仮出願第６０／７３０，９１７号（表題「ＰＤＸ１を発現する腹側及び背側の前腸内胚葉（PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM）」、２００５年１０月２７日提出）（それらの開示内容全体
が参照により本明細書に援用される）で記載された１つ又は複数の方法を用いて濃縮、単離及び／又は精製される。

【0447】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物
前記の方法によって生成された細胞組成物には、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物、及びＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が濃縮された細胞集団が含まれる。例えば、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生することができ、細胞培養物及び／又は細胞集団における細胞の少なくとも約５０％〜９９％がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である。分化プロセスの効率が、細胞増殖条件、増殖因子の濃度及び培養工程のタイミングを含む（が、これらに限定されない）或る特定のパラメータを変更することによって調節することができるので、本明細書に記載された分化手順によって、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％又は約９９％超の多能性細胞がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に変換され得る。ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の単離が利用されるプロセスでは、実質的に純粋なＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞集団を回収することができる。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態において、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに、前記の割合が算出される。

【0448】

内分泌前駆細胞の産生
本発明の幾つかの実施形態は、ｈＥＳＣから始まる内分泌前駆細胞の産生方法に関する。前記のように、内分泌前駆細胞は、初めにｈＥＳＣを分化して、胚体内胚葉細胞を産生した後に、さらに胚体内胚葉細胞を分化して、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を産生することによって産生することができる。このような実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、複能性の内分泌前駆細胞にさらに分化し、これはヒト膵島ホルモン発現細胞に分化することができる。

【0449】

本発明の一実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、内分泌前駆細胞を産生するのに十分な時間、レチノイド、例えばレチノイン酸の存在下でＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞のインキュベートを継続することによって、内分泌前駆細胞に分化される。幾つか
の実施形態において、内分泌前駆細胞を産生するのに十分な時間は、細胞培養物中の一部の細胞におけるＰＤＸ１マーカーの発現後、約１時間〜約１０日の範囲である。幾つかの実施形態において、レチノイドは、細胞培養中の細胞の一部におけるＰＤＸ１マーカーの発現後、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、又は約１０日超、細胞培養物中に維持される。

【0450】

本明細書中に記載される幾つかのプロセスにおいて、細胞培養物又は細胞集団中のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を、内分泌前駆細胞へ分化させるのに使用されるレチノイド濃度は、約１ｎＭ〜約１００μＭの範囲である。幾つかのプロセスにおいて、レチノイドは、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約７５μＭ、又は少なくとも約１００μＭの濃度で存在するように細胞培養物の細胞に供給される。

【0451】

本発明の幾つかの好ましい実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞からの膵臓内分泌前駆細胞への分化は、γ−セクレターゼ阻害剤を、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団に供給することによって媒介される。好ましい実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル（Diflurophenacetyl）−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（
ＤＡＰＴ）である。

【0452】

本発明の他の実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、分化プロセスの開始時に、例えばｈＥＳＣ段階で供給され、膵島ホルモン発現細胞への分化の間、細胞培養物中に残存する。さらに別の実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、分化開始の後ではあるが、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉段階への分化の前に添加される。好ましい実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、胚体内胚葉のＰＤＸ１陽性内胚葉への変換を促進する分化因子が供給されるのとほぼ同時に、細胞培養物又は細胞集団に供給される。他の好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団中の大部分の細胞がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化した後に、γ−セクレターゼ阻害剤が細胞培養物又は細胞集団に供給される。

【0453】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の内分泌前駆細胞への分化における幾つかの実施形態に関して、γ−セクレターゼ阻害剤は、少なくとも一部のＰＤＸ１陽性細胞の内分泌前駆細胞への分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物又は細胞集団に存在するように、細胞に供給される。幾つかの実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、約０．０１μＭ〜約１０００μＭの範囲の濃度で細胞培養物又は細胞集団に存在する。好ましい実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、約０．１μＭ〜約１００μＭの範囲の濃度で細胞培養物又は細胞集団に存在する。より好ましい実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤
は、約１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で細胞培養物又は細胞集団に存在する。他の実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約６０μＭ、少なくとも約７０μＭ、少なくとも約８０μＭ、少なくとも約９０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約２５０μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約７５０μＭ、又は少なくとも約１０００μＭの濃度で細胞培養物又は細胞集団に存在する。

【0454】

本明細書中に記載される内分泌前駆細胞を産生するプロセスの或る特定の実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、予め供給された１つ又は複数の分化因子が細胞培養物から除去された後に供給される。例えば、予め供給された１つ又は複数の分化因子は、γ−セクレターゼ阻害剤添加の、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、又は約１０日より前に除去され得る。他の実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、予め供給されていたか又はγ−セクレターゼ阻害剤とほぼ同時に供給された１つ又は複数の分化因子を含む細胞培養物又は細胞集団に供給される。好ましい実施形態において、予め供給されていたか又はγ−セクレターゼ阻害剤とほぼ同時に供給された分化因子としては、ＦＧＦ−１０、ＫＡＡＤ−シクロパミン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４及び／又はＲＡが挙げられるが、これらに限定されない。

【0455】

本明細書に記載された本発明の幾つかの実施形態において、エキセンジン４は、γ−セクレターゼ阻害剤とほぼ同時に、分化される細胞培養物又は細胞集団に供給される。或る特定の実施形態において、エキセンジン４は、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．３ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．４ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．６ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．７ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．８ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約０．９ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約
９００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９５０ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物又は細胞集団に存在するように供給される。

【0456】

ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞から内分泌前駆細胞を産生する好ましいプロセスにおいて、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の細胞培養物又は細胞集団に３μＭのＤＡＰＴ及び４０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン４を供給する。特に好ましい実施形態において、細胞はＣＭＲＬで分化する。ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞から内分泌前駆細胞を産生する、別の特に好ましいプロセスでは、２μＭのＲＡの存在下でＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の細胞培養物又は細胞集団に３μＭのＤＡＰＴ及び４０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン４を供給する。

【0457】

本明細書に記載されるように、内分泌前駆細胞を産生する或る特定のプロセスにおいて、前記の分化因子が、それらの添加後に細胞培養物又は細胞集団から除去される。例えば、γ−セクレターゼ阻害剤及び／又はエキセンジン４は、それらの添加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日又は約１０日以内に除去することができる。幾つかの実施形態において、分化因子は細胞培養物から除去されない。

【0458】

内分泌前駆細胞の培養物は、低血清又は無血清の培地中で産生され得る。或る特定の培養条件下、血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えば、幾つかの分化プロセスにおいて、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満、又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。幾つかのプロセスにおいて、内分泌前駆細胞を、血清を用いずに、血清代替物を用いずに、且つ／又はインスリン若しくはインスリン様増殖因子を含有する任意のサプリメントを用いずに増殖させる。さらに他のプロセスにおいて、内分泌前駆細胞はＢ２７の存在下で増殖する。このようなプロセスにおいて、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。他の実施形態において、内分泌前駆細胞はＢ２７の非存在下で増殖する。

【0459】

ＰＤＸ１陽性細胞の内分泌前駆細胞への分化のモニタリング
ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞の内分泌前駆細胞への発達は、内分泌前駆細胞に特有のマーカーの発現を求めることによってモニタリングすることができる。幾つかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの有無を検出することによって求められる。代替的に、或る特定のマーカーの発現は、細胞培養物又は細胞集団の細胞に存在するマーカーのレベルを測定することによって求めることができる。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は定性的であっても定量的であってもよい。マーカー遺伝子によって作製されるマーカーの発現を定量する１つの方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を利用するものである。Ｑ−ＰＣＲを行う方法は当該技術分野で既知である。当該技術分野で既知の他の方法を用いても、マーカー遺伝子の発現を定量することができる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、対象のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることによって検出することができる。或る特定のプロセスでは、内分泌前駆細胞に特有のマーカー遺伝子の発現、並びにｈＥＳＣ、胚体内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、胚体外内胚葉、中胚葉、外肺葉、未熟膵島ホルモン発現細胞又は成熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は他の細胞型に特有のマーカー遺伝子の有意な発現の欠失が求められる。

【0460】

下記の実施例でさらに記載されるように、内分泌前駆細胞の信頼できるマーカーはＮＧ
Ｎ３遺伝子である。このように、本明細書で記載されるプロセスで産生される内分泌前駆細胞はＮＧＮ３マーカー遺伝子を発現することによって、ＮＧＮ３遺伝子産物が産生される。内分泌前駆細胞の他のマーカーはＮＫＸ２．２及びＰＡＸ４である。

【0461】

幾つかのプロセスにおいて、ｈＥＳＣ、胚体内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を示す遺伝子の発現もモニタリングされる。例えば、幾つかのプロセスでは、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、及びＮＦＭの発現がモニタリングされる。幾つかのプロセスでは、未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞を示す遺伝子の発現もモニタリングされる。例えば、幾つかの実施形態において、ＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、及びＰＡＸ６の発現がモニタリングされる。

【0462】

ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現が、分化条件によって内分泌前駆細胞において様々なレベルの範囲にわたって誘導されることが理解される。このように、本明細書に記載される幾つかの実施形態において、内分泌前駆細胞又は細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌前駆細胞又は細胞集団、例えば多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞及び／又は外肺葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現の少なくとも約２倍〜少なくとも約１００００倍である。他の実施形態において、内分泌前駆細胞又は細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌前駆細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞及び／又は外胚葉細胞）におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現よりも少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２５００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約７５００倍、又は少なくとも約１００００倍高い。幾つかの実施形態において、内分泌前駆細胞又は細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌前駆細胞又は細胞集団、例えば多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞及び／又は外肺葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現よりもはるかに高い。

【0463】

内分泌前駆細胞の濃縮、単離及び／又は精製
本発明のさらなる態様に関して、内分泌前駆細胞は濃縮、単離及び／又は精製することができる。本発明の幾つかの実施形態において、内分泌前駆細胞に対して濃縮、単離及び／又は精製した細胞集団は、このような細胞を細胞培養物から単離することによって産生される。

【0464】

本明細書に記載されるプロセスのいずれかで産生された内分泌前駆細胞は、このような細胞に特異的な親和性タグを用いることによって、濃縮、単離及び／又は精製することができる。内分泌前駆細胞に特異的な親和性タグの例は、内分泌前駆細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書に記載される方法によって産生された細胞培養物で見出される他の細胞型には実質的に存在していない、抗体、抗体断片、リガンド、又はマーカー分子、例えばポリペプチドに特異的な他の結合剤である。幾つかのプロセスでは、内分泌前駆細胞の濃縮、単離又は精製のために、ＮＣＡＭと結合する抗体を親和性タグとして用いる。他のプロセスでは、ＮＣＡＭリガンドＮＢＰ１０、又は現在知られているか若しくは将来発見
される任意の他のＮＣＡＭリガンドも、親和性タグとして用いることができる。例えばRonn, L.（2002）Eur J Neurosci., 16:1720-30（その開示内容全体が参照により本明細書
に援用される）を参照されたい。このような分子としては、ＮＢＰ１０融合物及びＮＢＰ１０模倣物が挙げられる。

【0465】

抗体を作製し、それを細胞単離に用いる方法は、当該技術分野で既知であり、このような方法は、本明細書に記載される抗体及び内分泌前駆細胞と共に用いるために行うことができる。１つのプロセスでは、ＮＣＡＭと結合する抗体は、電磁ビーズに付着した後、細胞間及び基質の接着を低減するように酵素的に処理された細胞培養物において内分泌前駆細胞と結合される。それから、細胞／抗体／ビースの複合体は、ビーズ結合内分泌前駆細胞を非結合細胞から単離するのに用いられる移動性の磁界（movable magnetic field）に曝される。内分泌前駆細胞が培養物中で他の細胞から物理的に単離されると、抗体結合が破壊され、細胞が適切な組織培養培地に再び平板培養される。必要に応じて、単離細胞組成物は、代替的な親和性に基づいた方法によって、又は内分泌前駆細胞に特異的な同一の若しくは異なるマーカーを用いたさらなる一連の濃縮によってさらに精製することができる。

【0466】

濃縮、単離又は精製された内分泌前駆細胞培養物又は内分泌前駆細胞集団を得るさらなる方法も使用され得る。例えば、幾つかの実施形態において、ＮＣＡＭ抗体を、細胞間及び基質の接着を低減させるように処理した内分泌前駆細胞含有細胞培養物とインキュベートする。（本発明者らは二次抗体を使用しない。ＮＣＡＭ抗体は、ＰＥ、ＡＰＣ、又はＦＩＴＣのいずれかと直接結合する。）次に、細胞を洗浄し、遠心分離し、再懸濁させる。次に、細胞懸濁液を、一次抗体と結合することが可能な、ＦＩＴＣ結合抗体等の二次抗体とインキュベートする。次に、細胞を洗浄し、遠心分離し、緩衝液中で再懸濁させる。次に、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を使用して、細胞懸濁液を分析し、選別する。ＮＣＡＭ陽性細胞を、ＮＣＡＭ陰性細胞と別個に回収することにより、このような細胞型が単離される。必要に応じて、代替的な親和性に基づいた方法を使用することによって、又は内分泌前駆細胞に特異的な同一の若しくは異なるマーカーを使用するさらなる一連の選別によって、単離した細胞組成物をさらに精製し得る。代替的には、内分泌前駆細胞以外の細胞集団中のほとんどの細胞上に存在するマーカーを陰性選別することによって、単離した細胞組成物をさらに精製し得る。

【0467】

さらに別のプロセスにおいて、内分泌前駆細胞は、リガンド又はＮＣＡＭと結合する他の分子を用いて濃縮、単離及び／又は精製される。幾つかのプロセスでは、この分子はＮＢＰ１０若しくはその断片、その融合物、又はその模倣物である。

【0468】

本明細書に記載されるプロセスの幾つかの実施形態において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸、又は発現性の蛍光マーカー遺伝子（例えば、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）又はルシフェラーゼ等）をコードする別の核酸を用いて、ＮＣＡＭ陽性細胞を標識する。例えば、幾つかの実施形態において、ＧＦＰ遺伝子産物又はその生物学的に活性な断片の発現がＮＣＡＭプロモータ、ＮＧＮ３プロモータ、又はＰＡＸ４プロモータの制御下にあるように、ＮＣＡＭプロモータ、ＮＧＮ３プロモータ、ＰＡＸ４プロモータ、又は任意の内分泌前駆細胞に特異的な遺伝子のプロモータの下流にある、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的に活性な断片の少なくとも１つのコピーを多能性細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞に導入する。幾つかの実施形態において、ＮＣＡＭ、ＮＧＮ３、又はＰＡＸ４をコードする、核酸の全コード領域は、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的に活性な断片に置き換えられる。他の実施形態において、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的に活性な断片は、ＮＣＡＭ、ＮＧＮ３、又はＰＡＸ４をコードする核酸の少なくとも一部にフレーム単位で（in frame）融合され、それによって融合タンパク質が生成される。このような実施形態において、融合タンパク質は、ＧＦＰと同程度の蛍光活
性を維持する。

【0469】

蛍光標識細胞、例えば前記の多能性細胞は、本明細書で記載されるように、内分泌前駆細胞に分化する。内分泌前駆細胞が蛍光マーカー遺伝子を発現するのに対し、他の細胞型は発現しないので、内分泌前駆細胞を他の細胞型から単離することができる。幾つかの実施形態において、蛍光標識された内分泌前駆細胞と標識されない非内分泌前駆細胞との混合物を含む細胞懸濁液はＦＡＣＳを用いて選別される。内分泌前駆細胞は非蛍光細胞から別々に回収され、それによって内分泌前駆体が単離される。必要に応じて、単離細胞組成物は、内分泌前駆細胞に特異的な同一の若しくは異なるマーカーを用いたさらなる一連の選別によってさらに精製することができる。

【0470】

好ましいプロセスにおいて、内胚葉細胞培養物が内分泌前駆系統に分化するように誘導された後に、内分泌前駆細胞は他の非内分泌前駆細胞から濃縮、単離及び／又は精製される。前記の濃縮、単離及び精製手順は、任意の分化段階でのこのような培養物で用いることができる。

【0471】

前記の手順に加えて、内分泌前駆細胞は、細胞単離の他の技法によっても単離することができる。さらに、内分泌前駆細胞は、内分泌前駆細胞の選択的生存又は選択的増殖を促進する増殖条件下での連続継代培養法によっても濃縮又は単離され得る。

【0472】

本明細書に記載される方法を用いて、内分泌前駆細胞及び／又は組織の濃縮、単離及び／又は精製された集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、少なくとも何回か分化した、多能性細胞培養物又は細胞集団、例えば幹細胞培養物又は集団から産生することができる。幾つかの方法では、細胞は無作為で分化する。しかし、好ましい方法では、細胞は主として内分泌前駆細胞に分化することに向けられる。幾つかの好ましい濃縮、単離及び／又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの内分泌前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に関する。

【0473】

本明細書中に記載される方法を使用して、細胞集団又は細胞培養物は、未処理の細胞集団又は細胞培養物に比べて、内分泌前駆細胞含量が少なくとも約２倍〜約１０００倍に濃縮され得る。幾つかの実施形態において、内分泌前駆細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物に比べて、少なくとも約５倍〜約５００倍に濃縮され得る。他の実施形態において、内分泌前駆細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物に比べて、少なくとも約１０倍〜約２００倍に濃縮され得る。さらに他の実施形態において、内分泌前駆細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物に比べて、少なくとも約２０倍〜約１００倍に濃縮され得る。さらに他の実施形態において、内分泌前駆細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物に比べて、少なくとも約４０倍〜約８０倍に濃縮され得る。或る特定の実施形態において、内分泌前駆細胞は、未処理の細胞集団又は細胞培養物に比べて、少なくとも約２倍〜約２０倍に濃縮され得る。

【0474】

内分泌前駆細胞を含む組成物
本発明の幾つかの実施形態は、内分泌前駆細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の細胞組成物に関し、この内分泌前駆細胞は、内分泌系の細胞、例えば膵島ホルモン発現細胞に分化することができる多能性細胞である。或る特定の実施形態によれば、内分泌前駆細胞は哺乳類細胞であり、好ましい実施形態において、このような細胞はヒト細胞である。

【0475】

本発明の他の実施形態は、内分泌前駆細胞及び内分泌前駆細胞よりも明確に分化しない細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。このような実施形態において、内分泌前駆細胞よりも明確に分化していない細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３
０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。

【0476】

他の実施形態は、内分泌前駆細胞、並びに未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞等、内分泌前駆細胞よりも明確に分化する細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。このような実施形態において、内分泌前駆細胞よりも明確に分化する細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。

【0477】

本発明の或る特定の他の実施形態は、内分泌前駆細胞、並びにｈＥＳＣ、前原始線条細胞、内胚葉系中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞（ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞）、及び中胚葉細胞から成る群から選択される１つ又は複数の細胞型の細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。幾つかの実施形態において、ｈＥＳＣは、培養物中の全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。或る実施形態において、前原始線条細胞は、培養物中の全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。他の実施形態において、内胚葉系中胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。さらに他の実施形態において、胚体内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。さらに他の実施形態において、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。或る特定の実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。さらに他の実施形態において、中胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。

【0478】

本発明の或る特定の他の実施形態は、内分泌前駆細胞、並びに未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞から成る群から選択される１つ又は複数の細胞型の細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。幾つかの実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、培養物中の全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１
５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。或る特定の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、培養物中の全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満である。

【0479】

本発明のさらなる実施形態は、本明細書中に記載されるプロセスによって産生され、且つ主要（majority）細胞型として内分泌前駆細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、内分泌前駆細胞を少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８７％、少なくとも約８６％、少なくとも約８５％、少なくとも約８４％、少なくとも約８３％、少なくとも約８２％、少なくとも約８１％、少なくとも約８０％、少なくとも約７９％、少なくとも約７８％、少なくとも約７７％、少なくとも約７６％、少なくとも約７５％、少なくとも約７４％、少なくとも約７３％、少なくとも約７２％、少なくとも約７１％、少なくとも約７０％、少なくとも約６９％、少なくとも約６８％、少なくとも約６７％、少なくとも約６６％、少なくとも約６５％、少なくとも約６４％、少なくとも約６３％、少なくとも約６２％、少なくとも約６１％、少なくとも約６０％、少なくとも約５９％、少なくとも約５８％、少なくとも約５７％、少なくとも約５６％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、少なくとも約５１％、又は少なくとも約５０％含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団の細胞はヒト細胞を含む。他の実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、内分泌前駆細胞を少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、又は少なくとも約１％含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団の細胞はヒト細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞培養物又は細胞集団中の内分泌前駆細胞の割合は、培養物中に残存するフィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0480】

本発明のさらに他の実施形態は、内分泌前駆細胞とＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞との混合物を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。例えば、約９５個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約５個の内分泌前駆細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団が産生され得る。他の実施形態において、約５個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約９５個の内分泌前駆細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団が産生され得る。さらに、内分泌前駆細胞とＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞とを他の比率で含む、細胞培養物又は細胞集団が考慮される。例えば、約１００００００個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１０００００個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１００００個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１０００個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約５００個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１００個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１０個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約５個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約４個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前
駆細胞、約２個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約２個の内分泌前駆細胞、約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約４個の内分泌前駆細胞、約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約５個の内分泌前駆細胞、約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１０個の内分泌前駆細胞、約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約２０個の内分泌前駆細胞、約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約５０個の内分泌前駆細胞、約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１００個の内分泌前駆細胞、約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１０００個の内分泌前駆細胞、約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１００００個の内分泌前駆細胞、約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１０００００個の内分泌前駆細胞、及び約１個のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞毎に少なくとも約１００００００個の内分泌前駆細胞を含む組成物が考慮される。

【0481】

本発明のさらに他の実施形態は、内分泌前駆細胞と、未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞との混合物を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。例えば、約９５個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約５個の内分泌前駆細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団が産生され得る。他の実施形態において、約５個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約９５個の内分泌前駆細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団が産生され得る。さらに、内分泌前駆細胞と未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞とを他の比率で含む、細胞培養物又は細胞集団が考慮される。例えば、約１００００００個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１０００００個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１００００個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１０００個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１００個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１０個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約５個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約４個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約２個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の内分泌前駆細胞、約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約２個の内分泌前駆細胞、約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約４個の内分泌前駆細胞、約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約５個の内分泌前駆細胞、約個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１０個の内分泌前駆細胞、約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約２０個の内分泌前駆細胞、約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約５０個の内分泌前駆細胞、約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１００個の内分泌前駆細胞、約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１０００個の内分泌前駆細胞、約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１００００個の内分泌前駆細胞、約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１０００００
個の内分泌前駆細胞、並びに約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１００００００個の内分泌前駆細胞を含む組成物が考慮される。

【0482】

本発明の幾つかの実施形態において、内分泌前駆細胞が産生されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ヒト多能性細胞、例えばヒト多能性幹細胞から誘導される。或る特定の実施形態において、ヒト多能性細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊、又は胚の生殖隆起から誘導される。或る特定の他の実施形態において、ヒト多能性細胞は、胚形成期後に発生した、多細胞構造を有する生殖腺組織又は胚組織から誘導される。

【0483】

本発明のさらなる実施形態は、ヒト細胞（例えば、ヒト内分泌前駆細胞）を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物であって、ＮＧＮ３マーカーの発現が、ヒト細胞の少なくとも約２％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ及び／又はＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい、組成物に関する。他の実施形態において、ＮＧＮ３マーカーの発現は、ヒト細胞の少なくとも約５％で、ヒト細胞の少なくとも約１０％で、ヒト細胞の少なくとも約１５％で、ヒト細胞の少なくとも約２０％で、ヒト細胞の少なくとも約２５％で、ヒト細胞の少なくとも約３０％で、ヒト細胞の少なくとも約３５％で、ヒト細胞の少なくとも約４０％で、ヒト細胞の少なくとも約４５％で、ヒト細胞の少なくとも約５０％で、ヒト細胞の少なくとも約５５％で、ヒト細胞の少なくとも約６０％で、ヒト細胞の少なくとも約６５％で、ヒト細胞の少なくとも約７０％で、ヒト細胞の少なくとも約７５％で、ヒト細胞の少なくとも約８０％で、ヒト細胞の少なくとも約８５％で、ヒト細胞の少なくとも約９０％で、ヒト細胞の少なくとも約９５％で、又はヒト細胞の少なくとも約９８％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ及び／又はＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい。幾つかの実施形態において、ＮＧＮ３の発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ及び／又はＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい、細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞の割合は、フィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0484】

本発明の幾つかの実施形態は、ヒト内分泌前駆細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物であって、ＮＫＸ２．２及びＰＡＸ４の発現が、ヒト細胞の少なくとも約２％〜約９８％超で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ及び／又はＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい、組成物に関すると理解される。幾つかの実施形態において、ＮＫＸ２．２及び／又はＰＡＸ４の発現は、ヒト細胞の少なくとも約５％で、ヒト細胞の少なくとも約１０％で、ヒト細胞の少なくとも約１５％で、ヒト細胞の少なくとも約２０％で、ヒト細胞の少なくとも約２５％で、ヒト細胞の少なくとも約３０％で、ヒト細胞の少なくとも約３５％で、ヒト細胞の少なくとも約４０％で、ヒト細胞の少なくとも約４５％で、ヒト細胞の少なくとも約５０％で、ヒト細胞の少なくとも約５５％で、ヒト細胞の少なくとも約６０％で、ヒト細胞の少なくとも約６５％で、ヒト細胞の少なくとも約７０％で、ヒト細胞の少なくとも約７５％で、ヒト細胞の少なくとも約８０％で、ヒト細胞の少なくとも約８５％で、ヒト細胞の少なくとも約９０％で、ヒト細胞の少なくとも約９５％で、又はヒト細胞の少なくとも約９８％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ及び／又はＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい。幾つかの実施形態において、ＮＫＸ２．２及び／又はＰＡＸ４の発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ及び／又はＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい、細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞の割合は、フィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0485】

本発明のさらなる実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した哺乳動物細胞、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化したヒト細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物であって、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約２％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ及び／又はＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい、組成物に関する。他の実施形態において、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約１０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約１５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約２０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約２５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約３０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約３５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約４０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約４５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約５０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約５５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約６０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約６５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約７０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約７５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約８０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約８５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約９０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約９５％で、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約９８％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ及び／又はＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい。

【0486】

本発明の好ましい実施形態において、内分泌前駆細胞の細胞培養物及び／又は細胞集団は、非組み換え細胞であるヒト内分泌前駆細胞を含む。このような実施形態において、細胞培養物及び／又は細胞集団は、組み換えヒト内分泌前駆細胞を欠いているか、又は実質的に含まない。

【0487】

本発明の幾つかの実施形態において、内分泌前駆細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団には、γ−セクレターゼ阻害剤を含む培地も含まれる。好ましい実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤はＮ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）である。幾つかの好ましい実施形態において、ＤＡＰＴ濃度は少なくとも約１μＭである。より好ましい実施形態において、ＤＡＰＴ濃度は少なくとも約３μＭである。幾つかの実施形態において、培地はレチノイン酸（ＲＡ）及びエキセンジン４（Ｅｘ４）から選択される因子も含む。幾つかの実施形態において、培地はＣＭＲＬである。

【0488】

本明細書に記載されるプロセスを用いて、他の細胞型を実質的に含まない内分泌前駆細胞を含む組成物を産生することができる。本発明の幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法によって産生された内分泌前駆細胞集団又は細胞培養物は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーを有意に発現する細胞を実質的に含まない。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法によって産生された細胞培養物の内分泌前駆細胞集団は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ及び／又はＰＡＸ６マーカーを有意に発現する細胞を実質的に含まない。

【0489】

本発明の一実施形態において、マーカーの発現に基づく内分泌前駆細胞の記載は、ＮＧＮ３高、ＮＫＸ２．２高、ＰＡＸ４高、ＡＦＰ低、ＳＯＸ７低、ＳＯＸ１低、ＺＩＣ１低、ＮＦＭ低、ＭＡＦＡ低、ＳＹＰ低、ＣＨＧＡ低、ＩＮＳ低、ＧＣＧ低、ＳＳＴ低、ＧＨＲＬ低及び／又はＰＡＸ６低である。

【0490】

膵臓内分泌前駆細胞のスクリーニング
本明細書中に記載される或る特定のスクリーニング方法は、内分泌前駆細胞の分化を促進することが可能な少なくとも１つの分化因子を同定する方法に関する。

【0491】

これらの分化スクリーニング方法の幾つかの実施形態において、内分泌前駆細胞、例えばヒト内分泌前駆細胞を含む、細胞集団が得られる。次に細胞集団に候補分化因子が供給される。候補分化因子の供給前又はそれとほぼ同時である第１の時点で、マーカーの発現が求められる。代替的には、マーカーの発現は、候補分化因子の供給後に求められ得る。第１の時点の後であり、且つ細胞集団に候補分化因子を供給する工程の後である第２の時点で、同一マーカーの発現が再度求められる。候補分化因子が内分泌前駆細胞の分化を促進することが可能かどうかは、第１の時点でのマーカーの発現を第２の時点でのマーカーの発現と比較することによって求められる。第２の時点でのマーカーの発現が、第１の時点でのマーカーの発現と比較して増減する場合、候補分化因子は、内分泌前駆細胞の分化を促進することが可能である。

【0492】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法の幾つかの実施形態は、ヒト内分泌前駆細胞を含む細胞集団又は細胞培養物を利用する。例えば、細胞集団は内分泌前駆細胞を実質的に精製した集団であり得る。代替的には、細胞集団はヒト内分泌前駆細胞を濃縮した集団であり得る。この場合、細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９７％超がヒト内分泌前駆細胞である。本明細書中に記載される他の実施形態において、細胞集団は、ヒト細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約８５％超がヒト内分泌前駆細胞である、ヒト細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞集団は、非ヒト細胞、例えば非ヒトフィーダー細胞を含む。他の実施形態において、細胞集団は、ヒトフィーダー細胞を含む。このような実施形態において、前記フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９５％超がヒト内分泌前駆細胞である。

【0493】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法の実施形態において、細胞集団は候補（試験）化合物と接触されるか、又はそうでなければ候補（試験）化合物を供給される。候補分化因子は、ヒト内分泌前駆細胞の分化を促進する能力を有し得る任意の分子を含み得る。本明細書中に記載される幾つかの実施形態において、候補分化因子は、１つ又は複数の種類の細胞に関する分化因子であることが知られている分子を含む。代替的な実施形態において、候補分化因子は、細胞分化を促進することが知られていない分子を含む。好ましい実施形態において、候補分化因子は、ヒト内分泌前駆細胞の分化を促進することが知られていない分子を含む。

【0494】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法の幾つかの実施形態において、候補分化因子は、小分子を含む。好ましい実施形態において、小分子は、分子量が約１００００ａｍｕ以下の分子である。

【0495】

本明細書中に記載される他の実施形態において、候補分化因子はポリペプチドを含む。ポリペプチドは、任意のポリペプチド、例えば糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外基質タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、インターロイキン、又は増殖因子であり得るが、これらに限定されない。好ましいポリペプチドとしては、増殖因子が挙げられる。

【0496】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法の幾つかの実施形態において、候補分化因子は、アンフィレグリン、Ｂリンパ球刺激因子、ＩＬ−１６、チモポイエチン、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ−２、プレＢ細胞コロニー増強因子、内皮分化関連因子１（ＥＤＦ１）、内皮単球活性化ポリペプチドＩＩ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ナチュラルキラー細胞増強因子（ＮＫＥＦＡ）、骨形成タンパク質２、骨形成タンパク質８（造骨タンパク質（osteogeneic protein）２）、骨形成タンパク質６、骨形成タンパク質７、結合組
織増殖因子（ＣＴＧＦ）、ＣＧＩ−１４９タンパク質（神経内分泌分化因子）、サイトカインＡ３（マクロファージ炎症性タンパク質１−α）、膠芽腫（Gliablastoma）細胞分化関連タンパク質（ＧＢＤＲ１）、肝細胞癌由来増殖因子、ニューロメジンＵ−２５前駆体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、Ｔ細胞特異的ＲＡＮＴＥＳ前駆体、胸腺樹状細胞由来因子１、トランスフェリン、インターロイキン−１（ＩＬ１）、インターロイキン−２（ＩＬ２）、インターロイキン−３（ＩＬ３）、インターロイキン−４（ＩＬ４）、インターロイキン−５（ＩＬ５）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン−７（ＩＬ７）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、インターロイキン−９（ＩＬ９）、インターロイキン−１０（ＩＬ１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ１３）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、ビタミンＤ_３、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺ホルモン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ａＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７／ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来増殖因子−ＢＢ、β神経増殖因子、アクチビンＡ、形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、バースト促進活性（Burst promoting activity）（ＢＰＡ）、赤血球促進活性（ＥＰＡ）、ＰＧＥ_２、インスリン増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−ＩＩ、ニュートロフィン増殖因子（ＮＧＦ）、ニュートロフィン−３、ニュートロフィン４／５、毛様体神経栄養因子、神経膠由来ネキシン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アムホテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩（Ascrorbate）、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオン類、ＴＷＳ１１９、オキシトシン、バソプレシン、メラニン細胞刺激ホルモン、コルチコトロピン（corticortropin）、リポトロピン、チロトロピン、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、コルチコトロピン放出因子、ゴナドトロピン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン阻害因子、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、チロトロピン放出因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド１、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、モチリン、血管活性腸管ペプチド、サブスタンスＰ、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシンチロシン、神経ペプチドチロシン、インスリン、グルカゴン、胎盤性ラクトゲン、リラキシン、アンジオテンシンＩＩ、カルシ
トリオール（calctriol）、心房性ナトリウム利尿ペプチド、及びメラトニン、チロキシ
ン、トリヨードチロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフリン、ノルエピネフリン（norepinepherine）、アンドロステン（androstiene）、カルシトリオール、コラーゲン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アムホテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオン、及びＴＷＳ１１９から成る群から選択される１つ又は複数の増殖因子を含む。

【0497】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法の幾つかの実施形態において、候補分化因子は、１つ又は複数の濃度で細胞集団に供給される。幾つかの実施形態において、候補分化因子は、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度が約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの範囲であるように細胞集団に供給される。幾つかの実施形態において、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲である。他の実施形態において、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの範囲である。さらに他の実施形態において、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲である。好ましい実施形態において、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１７５ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２２５ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２７５ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約３２５ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ、約３７５ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約４２５ｎｇ／ｍｌ、約４５０ｎｇ／ｍｌ、約４７５ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約５２５ｎｇ／ｍｌ、約５５０ｎｇ／ｍｌ、約５７５ｎｇ／ｍｌ、約６００ｎｇ／ｍｌ、約６２５ｎｇ／ｍｌ、約６５０ｎｇ／ｍｌ、約６７５ｎｇ／ｍｌ、約７００ｎｇ／ｍｌ、約７２５ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ、約７７５ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、約８２５ｎｇ／ｍｌ、約８５０ｎｇ／ｍｌ、約８７５ｎｇ／ｍｌ、約９００ｎｇ／ｍｌ、約９２５ｎｇ／ｍｌ、約９５０ｎｇ／ｍｌ、約９７５ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１１μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ、約１４μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約１６μｇ／ｍｌ、約１７μｇ／ｍｌ、約１８μｇ／ｍｌ、約１９μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約５５０μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約６５０μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約８５０μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ、約９５０μｇ／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌ、又は約１０００μｇ／ｍｌ超である。

【0498】

幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるスクリーニング方法の工程は、第１の時点及び第２の時点で少なくとも１つのマーカーの発現を求めることを含む。幾つかのこれらの実施形態において、第１の時点は、候補分化因子を細胞集団に供給する前又は供給するのとほぼ同時であり得る。代替的には、幾つかの実施形態において、第１の時点は候補分化因子を細胞集団に供給した後である。幾つかの実施形態において、複数のマーカーの発現が第１の時点で求められる。

【0499】

前記の実施形態で用いられる幾つかの好ましいマーカーには、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及びＰＡＸ４から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーが含まれる。

【0500】

第１の時点で少なくとも１つのマーカーの発現を求めることに加えて、本明細書に記載されるスクリーニング方法の幾つかの実施形態は、第１の時点の後であり、候補分化因子を細胞集団に供給した後である第２の時点で少なくとも１つのマーカーの発現を求めることを考慮する。このような実施形態において、同じマーカーの発現は、第１の時点及び第２の時点の両方で求められる。幾つかの実施形態において、複数のマーカーの発現が第１の時点及び第２の時点の両方で求められる。このような実施形態において、同じ複数のマーカーの発現が第１の時点及び第２の時点の両方で求められる。幾つかの実施形態において、マーカー発現は、それぞれが第１の時点の後であり、それぞれが候補分化因子を細胞集団に供給した後である複数の時点で求められる。或る特定の実施形態において、マーカー発現はＱ−ＰＣＲによって求められる。他の実施形態において、マーカー発現は免疫細胞化学法によって求められる。

【0501】

本明細書に記載されるスクリーニング方法の或る特定の実施形態において、第１の時点及び第２の時点でその発現を有するマーカーは、内分泌前駆細胞の膵島組織を作製する最終分化細胞の前駆体である細胞への分化に関連するマーカーである。このような細胞は、未熟膵島ホルモン発現細胞を含み得る。幾つかの実施形態において、マーカーは内分泌前駆細胞を示す。好ましい実施形態において、マーカーは、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＤＸ１、インスリン、グレリン及び／又はグルカゴンである。

【0502】

本明細書に記載されるスクリーニング方法の幾つかの実施形態において、候補分化因子を細胞集団に供給するのと、第２の時点でマーカー発現を求めるのとの間に十分な時間を経過させる。候補分化因子を細胞集団に供給するのと、第２の時点でマーカー発現を求めるのとの間の十分な時間は、最低約１時間〜最大約１０日であり得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのマーカーの発現は、候補分化因子を細胞集団に供給した後に複数回求められる。幾つかの実施形態において、十分な時間は、少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約５４時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約６６時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約７８時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１０２時間、少なくとも約１０８時間、少なくとも約１１４時間、少なくとも約１２０時間、少なくとも約１２６時間、少なくとも約１３２時間、少なくとも約１３８時間、少なくとも約１４４時間、少なくとも約１５０時間、少なくとも約１５６時間、少なくとも約１６２時間、少なくとも約１６８時間、少なくとも約１７４時間、少なくとも約１８０時間、少なくとも約１８６時間、少なくとも約１９２時間、少なくとも約１９８時間、少なくとも約２０４時間、少なくとも約２１０時間、少なくとも約２１６時間、少なくとも約２２２時間、少なくとも約２２８時間、少なくとも約２３４時間、少なくとも約２４０時間、少なくとも約２４６時間、少なくとも約２５２時間、少なくとも約２５８時間、少なくとも約２６４時間、又は少なくとも約２７０時間である。

【0503】

本明細書に記載される方法の幾つかの実施形態において、第２の時点でのマーカーの発現が、第１の時点でのこのマーカーの発現に比べて増減していたか否かがさらに求められる。少なくとも１つのマーカーの発現の増減は、候補分化因子が内分泌前駆細胞の分化を促進することができることを示す。同様に、複数のマーカーの発現が求められる場合、第２の時点での複数のマーカーの発現が、第１の時点でのこの複数のマーカーの発現に比べて増減していたか否かがさらに求められる。マーカー発現の増減は、第１の時点及び第２の時点での細胞集団におけるマーカーの量、レベル又は活性を測定又はそうでなければ評価することによって求めることができる。このような判定は、他のマーカー、例えばハウスキーピング遺伝子の発現に相対的であるか又は絶対的なものであり得る。マーカー発現
が第１の時点と比較して第２の時点で増加する、或る特定の実施形態において、増加量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１００倍超である。幾つかの実施形態において、増加量は２倍未満である。マーカー発現が第１の時点と比較して第２の時点で減少する実施形態において、減少量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１００倍超である。幾つかの実施形態において、減少量は２倍未満である。

【0504】

未熟膵島ホルモン発現細胞の産生
本発明の実施形態は、ｈＥＳＣから始まる未熟膵島ホルモン発現細胞を産生する方法に関する。前記のように、未熟膵島ホルモン発現細胞は、最初にｈＥＳＣを分化し胚体内胚葉細胞を産生して、胚体内胚葉細胞を分化し前腸内胚葉細胞を産生して、前腸内胚葉を分化しＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を産生した後に、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞をさらに分化し内分泌前駆細胞を産生することによって、産生することができる。幾つかの実施形態において、このプロセスは、内分泌前駆細胞を未熟膵島ホルモン発現細胞にさらに分化させることによって継続される。

【0505】

本発明の幾つかの実施形態において、内分泌前駆細胞から未熟膵島ホルモン発現細胞への分化は、細胞がＮＧＮ３の発現を実質的に停止させ、ＰＡＸ６の発現を開始し、細胞が少なくとも１つの膵島細胞ホルモンを発現する能力を有するようになるのに十分な時間、γ−セクレターゼ阻害剤との内分泌前駆細胞の培養物のインキュベートを継続することによって進行する。幾つかの実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、内分泌前駆細胞のインキュベート後約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日又は約１０日超で除去される。好ましい実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤はＮ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル（Diflurophenacetyl
）−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）である。

【0506】

本明細書に開示される未熟膵島ホルモン発現細胞を産生する或る特定のプロセスは、ニコチンアミド、エキセンジン４、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１）から成る群から選択される１つ又は複数の因子を、ヒト内分泌前駆細胞を含む細胞培養物又は細胞集団に供給することによって媒介される。幾つかの実施形態において、４つの前記因子が全て同時に供給される。幾つかの実施形態において、内分泌前駆細胞の分化の前に、１つ又は複数の前記の因子が細胞培養物に供給され、細胞培養物における少なくとも一部の細胞の内分泌前駆細胞への分化の間、細胞培養物に存在したままである。他の実施形態において、大部分の細胞の内分泌前駆細胞への分化とほぼ同時に、１つ又は複数の前記の因子が細胞培養物に供給され、少なくとも大部分の細胞が未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するまで、細胞培養物に存在したままである。本発明の幾つかの実施形態において、１つ又は複数の前記の因子が、分化プロセスの開始時に、例えばｈＥＳＣ段階で供給され、未熟膵島ホルモン発現細胞への分化の間、細胞培養物に維持される。

【0507】

本明細書中に開示される未熟膵島ホルモン発現細胞の幾つかの製造プロセスにおいて、ニコチンアミド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチン酸は、内分泌前駆細胞の少なくとも一部の未熟膵島ホルモン発現細胞への分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在するように細胞に供給される。幾つかの実施形態において、ニコチンアミドは、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、
少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約６ｍＭ、少なくとも約７ｍＭ、少なくとも約８ｍＭ、少なくとも約９ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１１ｍＭ、少なくとも約１２ｍＭ、少なくとも約１３ｍＭ、少なくとも約１４ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約１６ｍＭ、少なくとも約１７ｍＭ、少なくとも約１８ｍＭ、少なくとも約１９ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３５ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約４５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約５５ｍＭ、少なくとも約６０ｍＭ、少なくとも約６５ｍＭ、少なくとも約７０ｍＭ、少なくとも約７５ｍＭ、少なくとも約８０ｍＭ、少なくとも約８５ｍＭ、少なくとも約９０ｍＭ、少なくとも約９５ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約２５０ｍＭ、少なくとも約５００ｍＭ、又は少なくとも約１０００ｍＭの濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在する。

【0508】

本明細書中に開示される未熟膵島ホルモン発現細胞の他の製造プロセスにおいて、エキセンジン４は、内分泌前駆細胞の少なくとも一部の未熟膵島ホルモン発現細胞への分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在するように細胞に供給される。幾つかの実施形態において、エキセンジン４は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６５ｎｇ／ｍｌ．少なくとも約７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在する。

【0509】

本明細書中に開示される未熟膵島ホルモン発現細胞のさらに他の製造プロセスにおいて、ＨＧＦは、内分泌前駆細胞の少なくとも一部の未熟膵島ホルモン発現細胞への分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在するように細胞に供給される。幾つかの実施形態において、ＨＧＦは、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物又は細胞集団中に
存在する。

【0510】

本明細書中に開示される未熟膵島ホルモン発現細胞のさらに他の製造プロセスにおいて、ＩＧＦ１は、内分泌前駆細胞の少なくとも一部の未熟膵島ホルモン発現細胞への分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在するように細胞に供給される。幾つかの実施形態において、ＩＧＦ１は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在する。

【0511】

本発明で記載されるように、未熟膵島ホルモン発現細胞を産生するプロセスの或る特定の実施形態において、１つ又は複数の予め供給された分化因子を細胞培養物から除去した後、１つ又は複数のニコチンアミド、エキセンジン４、ＨＧＦ及びＩＧＦ１が供給される。他の実施形態において、１つ又は複数のニコチンアミド、エキセンジン４、ＨＧＦ及びＩＧＦ１は、予め供給されたか、或いは１つ又は複数のニコチンアミド、エキセンジン４、ＨＧＦ及びＩＧＦ１とほぼ同時に供給された１つ又は複数の分化因子を含む細胞培養物又は細胞集団に供給される。好ましい実施形態において、予め供給されたか、或いは１つ又は複数のニコチンアミド、エキセンジン４、ＨＧＦ及びＩＧＦ１とほぼ同時に供給された分化因子としては、ＤＡＰＴ、ＦＧＦ−１０、ＫＡＡＤ−シクロパミン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４及び／又はＲＡが挙げられるが、これらに限定されない。

【0512】

内分泌前駆細胞から未熟膵島ホルモン発現細胞を産生する１つのプロセスにおいて、１０ｍＭのニコチンアミド、４０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン４、２５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１を内分泌前駆細胞の細胞培養物又は細胞集団に供給する。好ましいプロセスでは、細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で分化する。

【0513】

本明細書に記載されるように、未熟膵島ホルモン発現細胞を産生する或る特定のプロセスにおいて、１つ又は複数の前記の分化因子は、それらの添加後に細胞培養物又は細胞集団から除去される。例えば、ニコチンアミドは、添加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日又は約１０日以内に除去することができる。幾つかの実施形態において、分化因子は細胞培養物から除去されない。

【0514】

未熟膵島ホルモン発現細胞の培養物は、低血清又は無血清の培地中で産生され得る。或る特定の培養条件下、血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えば幾つかの分化プロセスにおいて、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ
）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満、又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。幾つかのプロセスにおいて、未熟膵島ホルモン発現細胞を、血清を用いずに、血清代替物を用いずに、且つ／又はインスリン若しくはインスリン様増殖因子を含有する任意のサプリメントを用いずに増殖させる。

【0515】

さらに他のプロセスにおいて、未熟膵島ホルモン発現細胞はＢ２７の存在下で増殖する。このようなプロセスにおいて、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲、又は約２０％（ｖ／ｖ）超の濃度であり得る。或る特定のプロセスにおいて、培地中のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）又は約２０％（ｖ／ｖ）である。代替的には、Ｂ２７サプリメントの添加濃度は、市販されているＢ２７原液の濃度の倍数で測定され得る。例えば、Ｂ２７は５０×原液としてInvitrogen（Carlsbad, CA）から入手可能である。この原液を十分量、十分な容量の増殖培地に添加することで、所望量のＢ２７を補充した培地が得られる。例えば、５０×Ｂ２７原液１０ｍｌを増殖培地９０ｍｌに加えることで、５×Ｂ２７を補充した増殖培地が得られる。培地中のＢ２７サプリメントの濃度は、約０．１×、約０．２×、約０．３×、約０．４×、約０．５×、約０．６×、約０．７×、約０．８×、約０．９×、約１×、約１．１×、約１．２×、約１．３×、約１．４×、約１．５×、約１．６×、約１．７×、約１．８×、約１．９×、約２×、約２．５×、約３×、約３．５×、約４×、約４．５×、約５×、約６×、約７×、約８×、約９×、約１０×、約１１×、約１２×、約１３×、約１４×、約１５×、約１６×、約１７×、約１８×、約１９×、約２０×、及び約２０×超であり得る。

【0516】

未熟膵島ホルモン発現細胞の産生のモニタリング
内分泌前駆細胞の未熟膵島ホルモン発現細胞への発達は、遺伝子マーカー及び表現型マーカーを含む未熟膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現、例えば膵島ホルモンの発現、並びにプロインスリンのインスリン及びＣペプチドへの過程を求めることによってモニタリングすることができる。幾つかのプロセスでは、マーカーの有無を検出することによって或る特定のマーカーの発現が求められる。代替的には、或る特定のマーカーの発現は、細胞培養物又は細胞集団の細胞に存在するマーカーのレベルを測定することによって求めることができる。或る特定のプロセスでは、未熟膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現、並びにｈＥＳＣ、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、内分泌前駆体、胚体外内胚葉、中胚葉、外肺葉、成熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は他の細胞型に特有のマーカーの有意な発現の欠失が求められる。

【0517】

胚体内胚葉系統の他のあまり分化しない細胞型の産生のモニタリングに関連して記載されるように、定量技法又は半定量技法、例えばブロット転写法（blot transfer methods
）及び免疫細胞化学法を用いて、マーカーの発現を測定することができる。代替的に、マーカーの発現は、Ｑ−ＰＣＲ等の技法の使用によって正確に定量化することができる。さらに、ポリペプチドレベルで、膵島ホルモン発現細胞の多くのマーカーが分泌タンパク質であることが理解される。このように、細胞外のマーカー含有量を測定する技法、例えばＥＬＩＳＡが利用され得る。

【0518】

以下の実施例で記載されるように、未熟膵島ホルモン発現細胞のマーカーとしては、Ｍ
ＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ、及び／又は結合ペプチド（Ｃ−ペプチド）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるプロセスによって産生された未熟膵島ホルモン発現細胞は、１つ又は複数の上で列記されたマーカーを発現することによって、対応する遺伝子産物を産生する。しかし、未熟膵島ホルモン発現細胞が前記のマーカーを全て発現する必要はないことが理解される。例えば、ｈＥＳＣから分化した膵島ホルモン発現細胞は、ＩＮＳとＧＨＲＬとを同時に発現しない。

【0519】

膵島ホルモン発現細胞は内分泌前駆細胞マーカーＮＧＮ３及びＰＡＸ４を実質的に発現しないので、内分泌前駆細胞の未熟膵島ホルモン発現細胞への移行は、ＮＧＮ３及びＰＡＸ４の発現の低減をモニタリングする一方で、１つ又は複数のＭＡＦＢ、ＰＡＸ６、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＣＨＧＡ、ＳＹＰ及び／又はＣ−ペプチドの発現の増大をモニタリングすることによって立証することができる。幾つかのプロセスでは、１つ又は複数の前記のマーカーの発現の増大及び／又は低減をモニタリングすることに加えて、ｈＥＳＣ、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞及び／又は内分泌前駆細胞を示す遺伝子の発現もモニタリングする。

【0520】

ＭＡＦＢ、ＰＡＸ６、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＣＨＧＡ、ＳＹＰ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現が、分化条件によって未熟膵島ホルモン発現細胞において様々なレベルの範囲にわたって誘導されることが理解される。このように、本明細書に記載される幾つかの実施形態において、膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＭＡＦＢ、ＰＡＸ６、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＣＨＧＡ、ＳＹＰ、及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現は、非未熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団、例えば多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、内分泌前駆細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞、及び／又は外肺葉細胞におけるＭＡＦＢ、ＰＡＸ６、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＣＨＧＡ、ＳＹＰ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現の少なくとも約２倍〜少なくとも約１００００倍である。他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＭＡＦＢ、ＰＡＸ６、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＣＨＧＡ、ＳＹＰ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現は、非未熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、内分泌前駆細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞及び／又は外胚葉細胞におけるＭＡＦＢ、ＰＡＸ６、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ２．２、ＳＳＴ、ＰＰ、ＣＨＧＡ、ＳＹＰ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現よりも少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２５００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約７５００倍、又は少なくとも約１００００倍高い。幾つかの実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＭＡＦＢ、ＰＡＸ６、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ２．２、ＳＳＴ、ＰＰ、ＣＨＧＡ、ＳＹＰ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現は、非未熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団、例えば多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、内分泌前駆細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞及び／又は外肺葉細胞におけるＭＡＦＢ、ＰＡＸ６、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ２．２、ＳＳＴ、ＰＰ、ＣＨＧＡ、ＳＹＰ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現よりもはるかに高い。

【0521】

ＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現が、分化条件によって未熟膵島ホルモン発
現細胞において様々なレベルの範囲にわたって低減されることが理解される。このように、本明細書に記載される幾つかの実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現は、内分泌前駆細胞におけるＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現よりも少なくとも約２倍〜少なくとも約１００００倍低い。他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現は、内分泌前駆細胞におけるＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現よりも少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２５００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約７５００倍、又は少なくとも約１００００倍低い。幾つかの実施形態において、ＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーは、未熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団において実質的に発現しない。

【0522】

本明細書に記載されるプロセスの幾つかの実施形態において、細胞及び／又は細胞集団からのホルモン放出量を求めることができる。例えば、インスリン放出、グルカゴン放出、ソマトスタチン放出及び／又はグレリン放出の量をモニタリングすることができる。好ましい実施形態において、グルコース応答性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）の量が測定される。さらに別の実施形態において、分泌の途絶（secreted breakdown）又は未熟膵島ホルモン発現細胞によって産生される副産物、例えばＣ−ペプチド及び膵島アミロイドタンパク質がモニタリングされ得る。

【0523】

分泌タンパク質の発現を測定する方法は当該技術分野で既知であることが理解される。例えば、膵島細胞によって産生される１つ又は複数のホルモンに対する抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイに用いることができる。

【0524】

本発明の幾つかの実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞によるインスリン放出は、Ｃ−ペプチド放出の測定によって測定される。Ｃ−ペプチドは、プロインスリンの成熟化の間、インスリンに対して等モル量で産生される分解産物である。Ｃ−ペプチドの測定が有利なのは、その半減期がインスリンよりも長いからである。Ｃ−ペプチド放出を測定する方法は、当該技術分野において既知である（例えば、抗Ｃペプチドモノクローナル抗体（Linco Research, St. Louis, Missouri）を使用するＥＬＩＳＡ）。本発明の幾つ
かの実施形態において、ｈＥＳＣから産生される未熟膵島ホルモン発現細胞は、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約１００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約２００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン）
少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約３００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約４００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約５００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約６００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約７００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ
１μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約８００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約９００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ
−ペプチド（インスリン） 少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、又はＣ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇを分泌する。好ましい実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、単一種の膵島細胞ホルモンを分泌する細胞（例えば、インスリンのみを分泌する細胞）である。或る特定の好ましい実施形態において、インスリンはグルコースに応答して分泌される。他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、１つ又は複数の膵島細胞ホルモン、例えば、ソマトスタチン、グルカゴン及び／又はグレリンに加えて、インスリンを分泌する細胞である。

【0525】

本発明の幾つかの実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、当該未熟膵島ホルモン発現細胞によって産生されるインスリンの約９８％未満をプロセシングする。他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、当該未熟膵島ホルモン発現細胞によって産生されるインスリンの約９７％未満、約９６％未満、約９５％未満、約９４％未満、約９３％未満、約９２％未満、約９１％未満、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、又は約３０％未満をプロセシングする。

【0526】

本発明の他の実施形態において、ｈＥＳＣから産生される未熟膵島ホルモン発現細胞は、グルカゴン 少なくとも約５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約１００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約２００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約３００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約４００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約５００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約６００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約７００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約８００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約９００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、又はグルカゴン 少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇを分泌する。好ましい実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、単一種の膵島細胞ホルモンを分泌する細胞（例えば、グルカゴンのみを分泌する細胞）である。他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、１つ又は複数の膵島細胞ホルモン、例えば、グレリン、ソマトスタチン及びインスリンに加えて、グルカゴンを分泌する細胞である。

【0527】

本発明のさらに他の実施形態において、ｈＥＳＣから産生される未熟膵島ホルモン発現細胞は、ソマトスタチン 少なくとも約５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約１００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約２００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約３００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約４００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約５００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタ
チン 少なくとも約６００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約７００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約８００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約９００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、又はソマトスタチン 少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇを分泌する。好ましい実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、単一種の膵島細胞ホルモンを分泌する細胞（例えば、ソマトスタチンのみを分泌する細胞）である。他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、１つ又は複数の膵島細胞ホルモン、例えば、グレリン、グルカゴン及びインスリンに加えて、ソマトスタチンを分泌する細胞である。

【0528】

本発明の他の実施形態において、ｈＥＳＣから産生される未熟膵島ホルモン発現細胞は、グレリン 少なくとも約５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約１００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約２００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン
少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約３００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約４００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約５００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約６００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約７００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約８００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約９００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、又はグレリン 少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇを分泌する。好ましい実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、単一種の膵島細胞ホルモンを分泌する細胞（例えば、グレリンのみを分泌する細胞）である。他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、１つ又は複数の膵島細胞ホルモンに加えて、グレリンを分泌する細胞である。

【0529】

未熟膵島ホルモン発現細胞の濃縮、単離及び／又は精製
任意の前記プロセスによって産生される未熟膵島ホルモン発現細胞は、内分泌前駆細胞の濃縮、単離及び／又は精製に関連して記載される方法を用いて、このような細胞に特異的である親和性タグを用いることによって、濃縮、単離及び／又は精製することができる。未熟膵島ホルモン発現細胞に特異的な親和性タグの例は、抗体、リガンド、又は未熟膵島ホルモン発現細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書に記載される方法によって産生される細胞培養物で見出される他の細胞型には実質的に存在しないマーカー分子、例えばポリペプチドに特異的である他の結合剤である。未熟膵島ホルモン発現細胞の濃縮、単離及び／又は精製のための親和性タグの好ましい例は、ＮＣＡＭに対する抗体である。抗ＮＣＡＭ抗体は、例えばAbcam（Cambridge, MA）で市販されている。未熟膵島ホルモン発現細胞の濃縮、単離及び／又は精製のための親和性タグの別の例は、シナプトフィジン（ＳＹＰ）に対する抗体である。抗シナプトフィジン抗体は、Dako（Glostrup, Denmark）で
市販されている。他のプロセスでは、ＮＣＡＭリガンドＮＢＰ１０又は現在知られているか、又は将来発見される任意の他のＮＣＡＭリガンドも、親和性タグと結合させるのに用いることができる（Ronn, L., 2002）。このような分子としては、ＮＢＰ１０融合物及びＮＢＰ１０模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0530】

濃縮、単離又は精製した未熟膵島ホルモン発現細胞培養物又は集団を得るさらなる方法も用いることができる。例えば、幾つかの実施形態において、試薬、例えばＮＣＡＭ抗体は、未熟膵島ホルモン発現細胞を含有する細胞培養物とインキュベートされ、この細胞培養物は細胞間及び基質の接着を低減させるように処理されている。それから細胞を洗浄、遠心分離及び再懸濁する。その後、細胞懸濁液を二次抗体、例えば一次抗体と結合することができるＦＩＴＣ結合抗体とインキュベートする。それから細胞を洗浄、遠心分離及び緩衝液中で再懸濁する。その後、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を用いて、細胞懸濁液を解析及び選別する。抗体結合蛍光細胞を非結合非蛍光細胞とは別に回収し、それによってこのような細胞型が単離される。

【0531】

本明細書に記載されるプロセスの好ましい実施形態において、代替的な親和性に基づいた方法を用いることによって、又は未熟膵島ホルモン発現細胞に特異的である同一の若しくは異なるマーカーを用いたさらなる一連の選別によって、単離細胞組成物をさらに精製することができる。例えば、幾つかの実施形態において、ＦＡＣＳ選別を用いて、初めに未熟膵臓ホルモン発現細胞を含む細胞集団由来のＮＣＡＭ陰性細胞からＮＣＡＭ陽性未熟膵臓ホルモン発現細胞を単離する。当業者は、他の従来のマーカーベースの細胞選別法を本明細書に記載される方法に用いることができることを理解し、この方法としては様々な磁気ビース選別法又はパニング法が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＣＡＭ陽性である細胞を単離するのに再びＦＡＣＳを用いて、ＮＣＡＭ陽性細胞を選別することによって、この細胞型に特有のマーカー（ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、又はＨＢ９を含む）を発現する未熟膵臓ホルモン発現細胞に対して細胞集団を濃縮させる。他の実施形態において、ＦＡＣＳ選別を用いて、未熟膵島ホルモン発現細胞以外の細胞集団におけるほとんどの細胞に存在するマーカーに関して陰性選別することによって細胞を分離する。このような陰性選別の例は、１回目の濃縮の後では、ＮＣＡＭ陽性細胞集団における未熟膵島ホルモン発現細胞の表面上で実質的に発現しないが、この細胞集団における多くの他のＮＣＡＭ陽性細胞では発現するマーカーであるＣＤ１３３の使用である。

【0532】

本明細書に記載されるプロセスの幾つかの実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、抗体を用いずに蛍光標識した後、内分泌前駆細胞の濃縮、単離及び／又は精製に関して記載されたものと類似の蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）法を用いることによって非標識細胞から単離される。例えば、幾つかの実施形態において、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ルシフェラーゼをコードする核酸、その生物学的に活性がある断片は、前記のもののような未熟膵島ホルモン発現細胞の同定に有用なマーカー、例えばＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、又はＨＢ９のプロモータの下流へと多能性細胞に導入することができる。それによって、ＧＦＰ遺伝子産物又はその生物学的に活性な断片の発現は、未熟膵島ホルモン発現細胞マーカーの制御下にある。内分泌前駆細胞の濃縮、単離及び／又は精製に関して記載されるように、蛍光標識細胞は、未熟膵島ホルモン発現細胞に分化し、他の細胞型から分離することができ、それによって未熟膵島ホルモン発現細胞の濃縮又は精製された集団が産生される。

【0533】

前記の手法に加えて、未熟膵島ホルモン発現細胞は、細胞単離に関する他の技法によっても単離され得ることが理解される。さらに、未熟膵島ホルモン発現細胞は、未熟膵島ホルモン発現細胞の選択的生存又は選択的発現を促進する増殖条件での連続継代培養法によっても濃縮又は単離され得る。

【0534】

本明細書に記載される方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、少なくとも幾つかの未熟膵島ホルモン発現細胞を産生するように十分な分化を受けた多能性細胞培養物又は細胞集団、例えば幹細胞培養物又は集団から、未熟膵島ホルモン発現細胞の濃縮、単離及び／又は精製された集団、及び／又は組織を産生することができる。好ましい方法では、主に細胞
は未熟膵島ホルモン発現細胞に分化することに向けられる。幾つかの好ましい濃縮、単離及び／又は精製の方法は、ヒト胚性幹細胞からの未熟膵島ホルモン発現細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に関する。

【0535】

本明細書に記載される方法を用いて、細胞集団又は細胞培養物は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約２倍〜約１０００倍まで未熟膵島ホルモン発現細胞含有量を濃縮させることができる。幾つかの実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約５倍〜約５００倍まで濃縮することができる。他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約１０倍〜約２００倍まで濃縮することができる。さらに別の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約２０倍〜約１００倍まで濃縮することができる。さらに別の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約４０倍〜約８０倍まで濃縮することができる。或る特定の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約２倍〜約２０倍まで濃縮することができる。

【0536】

未熟膵島ホルモン発現細胞を含む組成物
本発明の幾つかの実施形態は、未熟膵島ホルモン発現細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の細胞組成物に関し、この未熟膵島ホルモン発現細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト多能性細胞から誘導され、１つ又は複数の膵臓ホルモンを発現し、ヒト膵島細胞の少なくとも幾つかの機能を有する細胞である。或る特定の実施形態によれば、未熟膵島ホルモン発現細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態において、このような細胞はヒト細胞である。

【0537】

本発明の他の実施形態は、未熟膵島ホルモン発現細胞及び未熟膵島ホルモン発現細胞ほど明確に分化しない細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。このような実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞よりも明確に分化されない細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。

【0538】

本発明の或る特定の他の実施形態は、未熟膵島ホルモン発現細胞、並びにｈＥＳＣ、前原始線条細胞、内胚葉系中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞（ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞）、内分泌前駆細胞、及び中胚葉細胞から成る群から選択される１つ又は複数の細胞型を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。幾つかの実施形態において、ｈＥＳＣは、培養物中の全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。或る特定の実施形態において、前原始線条細胞は、培養物中の全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。他の実施形態において、内胚葉系中胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。さらに他の実施形態において、胚体内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約
３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。さらに他の実施形態において、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。或る特定の実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。他の実施形態において、内分泌前駆細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。さらに他の実施形態において、中胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。

【0539】

本発明のさらなる実施形態は、本明細書中に記載されるプロセスによって産生され、且つ主要細胞型として未熟膵島ホルモン発現細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、未熟膵島ホルモン発現細胞を少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８７％、少なくとも約８６％、少なくとも約８５％、少なくとも約８４％、少なくとも約８３％、少なくとも約８２％、少なくとも約８１％、少なくとも約８０％、少なくとも約７９％、少なくとも約７８％、少なくとも約７７％、少なくとも約７６％、少なくとも約７５％、少なくとも約７４％、少なくとも約７３％、少なくとも約７２％、少なくとも約７１％、少なくとも約７０％、少なくとも約６９％、少なくとも約６８％、少なくとも約６７％、少なくとも約６６％、少なくとも約６５％、少なくとも約６４％、少なくとも約６３％、少なくとも約６２％、少なくとも約６１％、少なくとも約６０％、少なくとも約５９％、少なくとも約５８％、少なくとも約５７％、少なくとも約５６％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、少なくとも約５１％、又は少なくとも約５０％含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団の細胞はヒト細胞を含む。他の実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、未熟膵島ホルモン発現細胞を少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくと
も約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、又は少なくとも約１％含む細胞培養物又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団の細胞はヒト細胞を含む。幾つかの実施形態において、培養物に残存するフィーダー細胞を考慮せずに、細胞培養物又は集団における未熟膵島ホルモン発現細胞の割合が算出される。

【0540】

本発明のさらに別の実施形態は、未熟膵島ホルモン発現細胞と内分泌前駆細胞との混合物を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。例えば、約９５個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約５個の未熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物又は細胞集団を産生することができる。他の実施形態において、約５個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約９５個の未熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物又は細胞集団を産生することができる。さらに、未熟膵島ホルモン発現細胞と内分泌前駆細胞とを他の比率で含む細胞培養物又は細胞集団が考慮される。例えば、約１００００００個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１０００００個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１００００個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１０００個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約５００個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１００個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１０個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約５個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約４個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約２個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約２個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約４個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約５個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１０個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約２０個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約５０個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１００個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１０００個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１００００個の未熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１０００００個の未熟膵島ホルモン発現細胞、及び約１個の内分泌前駆細胞毎に少なくとも約１００００００個の未熟膵島ホルモン発現細胞を含む組成物が考慮される。

【0541】

本発明の幾つかの実施形態において、産生される未熟膵島ホルモン発現細胞は、ヒト多能性細胞、例えばヒト多能性幹細胞から誘導される。或る特定の実施形態において、ヒト多能性細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊又は胚の生殖隆起から誘導される。或る特定の実施形態において、ヒト多能性細胞は、胚形成期を越えて発達した多細胞構造の性腺組織又は胚組織から誘導される。

【0542】

本発明のさらなる実施形態は、ヒト細胞（例えば、ヒト未熟膵島ホルモン発現細胞）を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物であって、ＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現が、ヒト細胞の少なくとも約２％で、ＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい、組成物に関する。他の実施形態において、ＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現は、ヒト細胞の少なくとも約５％で
、ヒト細胞の少なくとも約１０％で、ヒト細胞の少なくとも約１５％で、ヒト細胞の少なくとも約２０％で、ヒト細胞の少なくとも約２５％で、ヒト細胞の少なくとも約３０％で、ヒト細胞の少なくとも約３５％で、ヒト細胞の少なくとも約４０％で、ヒト細胞の少なくとも約４５％で、ヒト細胞の少なくとも約５０％で、ヒト細胞の少なくとも約５５％で、ヒト細胞の少なくとも約６０％で、ヒト細胞の少なくとも約６５％で、ヒト細胞の少なくとも約７０％で、ヒト細胞の少なくとも約７５％で、ヒト細胞の少なくとも約８０％で、ヒト細胞の少なくとも約８５％で、ヒト細胞の少なくとも約９０％で、ヒト細胞の少なくとも約９５％で、又はヒト細胞の少なくとも約９８％で、ＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい。幾つかの実施形態において、ＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現が、ＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい、細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞の割合は、フィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0543】

本発明のさらなる実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した哺乳動物細胞、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化したヒト細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物であって、ＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約２％で、ＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい、組成物に関する。他の実施形態において、ＭＡＦＢ、ＰＡＸ６、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ２．２、ＳＳＴ、ＰＰ、ＣＨＧＡ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約１０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約１５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約２０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約２５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約３０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約３５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約４０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約４５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約５０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約５５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約６０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約６５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約７０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約７５％で、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約８０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約８５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約９０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約９５％で、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約９８％で、ＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい。

【0544】

本発明の好ましい実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞の細胞培養物及び／又は細胞集団は、非組み換え細胞であるヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を含む。このような実施形態において、細胞培養物及び／又は細胞集団は、組み換えヒト未熟膵島ホルモン発現細胞を欠いているか、又は実質的に含まない。

【0545】

本発明の幾つかの実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団には、ニコチンアミド、エキセンジン４、ＨＧＦ及び／又はＩＧＦ１から選択される１つ又は複数の因子を含む培地も含まれる。幾つかの好ましい実施形態において、ニコチンアミド濃度は少なくとも約１０ｍＭであり、エキセンジン４濃度は少なくとも約４０ｎｇ／ｍｌであり、ＨＧＦ濃度は少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌであり、ＩＧＦ１濃度は少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、培地はＤＭＥＭである。

【0546】

本発明の或る特定の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団には、グレリン、インスリン、ソマトスタチン及び／又はグルカゴンから選択される１つ又は複数の分泌ホルモンを含む培地も含まれる。他の実施形態において、培地はＣ−ペプチドを含む。好ましい実施形態において、培地中の１つ又は複数の分泌ホルモン又はＣ−ペプチドの濃度は、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン又はＣ−ペプチド 少なくとも約１ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ〜グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン又はＣ−ペプチド 少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇの範囲である。さらに好ましい実施形態において、培地中の１つ又は複数の分泌ホルモン又はＣ−ペプチドの濃度は、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約１ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約１０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約２５ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約７５ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約１００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約２００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約３００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド
少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約４００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約５００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約６００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド ６５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約７００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約８００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約９００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／細胞Ｄ
ＮＡ １μｇ、又はグレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇである。

【0547】

本明細書に記載される細胞培養物及び／又は細胞集団の幾つかの実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は２つ以上の膵臓ホルモンを分泌する。本明細書に記載される細胞培養物及び／又は細胞集団の他の実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は単一の膵臓ホルモンを分泌する。好ましい実施形態において、このホルモンはインスリンである。さらにより好ましい実施形態において、膵島インスリン発現細胞はグルコースに応答性がある。他の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したヒト膵島インスリン発現細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト膵臓の膵臓β細胞によって分泌されるインスリン量と同程度又はそれを超える量のインスリンを分泌する。

【0548】

本明細書に記載されるプロセスを用いて、他の細胞型を実質的に含まない未熟膵島ホルモン発現細胞を含む組成物を産生することができる。本発明の幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法によって産生された未熟膵島ホルモン発現細胞集団又は細胞培養物は、ＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーを有意に発現する細胞を実質的に含まない。本明細書に記載される方法によって産生された未熟膵島ホルモン発現細胞集団又は細胞培養物の幾つかの実施形態において、ＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ、及び／又はＣ−ペプチドから成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、ＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーから成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現よりも大きい。

【0549】

本発明の一実施形態において、マーカー発現に基づく未熟膵島ホルモン発現細胞の記載は、ＭＡＦＢ高、ＰＡＸ６高、ＮＫＸ２．２高、ＳＹＰ高、ＰＰ高、ＣＨＧＡ高、ＮＧＮ３低、ＰＡＸ４低、及びＭＡＦＡ低である。

【0550】

成熟膵島ホルモン発現細胞の産生
本発明の実施形態は、ｈＥＳＣから始まる成熟膵島ホルモン発現細胞を産生する方法に関する。前記のように、膵島ホルモン発現細胞は、最初にｈＥＳＣを分化し胚体内胚葉細胞を産生して、胚体内胚葉細胞を分化しＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を産生して、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を分化し内分泌前駆細胞を産生した後、さらに内分泌前駆細胞を分化し未熟膵島ホルモン発現細胞を産生することによって産生することができる。幾つかの実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞をさらに成熟膵島ホルモン発現細胞に分化させることによって、このプロセスを終わらせる。

【0551】

本発明の幾つかの実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞からの成熟膵島ホルモン発現細胞への分化は、細胞が少なくとも１つの成熟膵島細胞ホルモンを発現する能力を有するようになるのに十分な時間、γ−セクレターゼ阻害剤との未熟膵島ホルモン発現細胞の培養物のインキュベートを継続することによって進行する。幾つかの実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、内分泌前駆細胞の誘導後約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日又は約１０日超で除去される。好ましい実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル（Diflurophenacetyl）−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−
ブチルエステル（ＤＡＰＴ）である。

【0552】

本明細書に記載される成熟膵島ホルモン発現細胞を産生する或る特定のプロセスは、ニコチンアミド、エキセンジン４、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子−１
（ＩＧＦ１）から成る群から選択される１つ又は複数の因子をヒト内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物又は細胞集団に供給することによって媒介される。幾つかの実施形態において、４つの前記因子が全て同時に供給される。幾つかの実施形態において、内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞の分化の前に、１つ又は複数の前記の因子が細胞培養物に供給され、細胞培養物における少なくとも一部の細胞の成熟膵島ホルモン発現細胞への分化の間、細胞培養物に存在したままである。他の実施形態において、大部分の細胞の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞への分化とほぼ同時に、１つ又は複数の前記の因子が細胞培養物に供給され、少なくとも大部分の細胞が成熟膵島ホルモン発現細胞に分化するまで、細胞培養物に存在したままである。本発明の幾つかの実施形態において、１つ又は複数の前記の因子が、分化プロセスの開始時に、例えばｈＥＳＣ段階で供給され、成熟膵島ホルモン発現細胞への分化の間、細胞培養物に維持される。

【0553】

本明細書中に開示される成熟膵島ホルモン発現細胞の幾つかの製造プロセスにおいて、ニコチンアミドは、内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞の少なくとも一部の成熟膵島ホルモン発現細胞への分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在するように細胞に供給される。幾つかの実施形態において、ニコチンアミドは、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約６ｍＭ、少なくとも約７ｍＭ、少なくとも約８ｍＭ、少なくとも約９ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１１ｍＭ、少なくとも約１２ｍＭ、少なくとも約１３ｍＭ、少なくとも約１４ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約１６ｍＭ、少なくとも約１７ｍＭ、少なくとも約１８ｍＭ、少なくとも約１９ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３５ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約４５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約５５ｍＭ、少なくとも約６０ｍＭ、少なくとも約６５ｍＭ、少なくとも約７０ｍＭ、少なくとも約７５ｍＭ、少なくとも約８０ｍＭ、少なくとも約８５ｍＭ、少なくとも約９０ｍＭ、少なくとも約９５ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約２５０ｍＭ、少なくとも約５００ｍＭ、又は少なくとも約１０００ｍＭの濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在する。

【0554】

本明細書中に開示される成熟膵島ホルモン発現細胞の他の製造プロセスにおいて、エキセンジン４は、内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞の少なくとも一部の膵島ホルモン発現細胞への分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在するように細胞に供給される。幾つかの実施形態において、エキセンジン４は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６５ｎｇ／ｍｌ．少なくとも約７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在する。

【0555】

本明細書中に開示される成熟膵島ホルモン発現細胞のさらに他の製造プロセスにおいて、ＨＧＦは、内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞の少なくとも一部の膵島ホルモン発現細胞への分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在するように細胞に供給される。幾つかの実施形態において、ＨＧＦは、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在する。

【0556】

本明細書中に開示される成熟膵島ホルモン発現細胞のさらに他の製造プロセスにおいて、ＩＧＦ１は、内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞の少なくとも一部の膵島ホルモン発現細胞への分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在するように細胞に供給される。幾つかの実施形態において、ＩＧＦ１は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物又は細胞集団中に存在する。

【0557】

本明細書に記載されるように成熟膵島ホルモン発現細胞を産生するプロセスの或る特定の実施形態において、１つ又は複数のニコチンアミド、エキセンジン４、ＨＧＦ及びＩＧＦ１が、１つ又は複数の予め供給された分化因子が細胞培養物から除去された後に供給される。他の実施形態において、１つ又は複数のニコチンアミド、エキセンジン４、ＨＧＦ及びＩＧＦ１は、予め供給されたか、或いは１つ又は複数のニコチンアミド、エキセンジン４、ＨＧＦ及びＩＧＦ１とほぼ同時に供給された１つ又は複数の分化因子を含む細胞培養物又は細胞集団に供給される。好ましい実施形態において、予め供給されたか、或いは１つ又は複数のニコチンアミド、エキセンジン４、ＨＧＦ及びＩＧＦ１とほぼ同時に供給された分化因子としては、ＤＡＰＴ、ＦＧＦ−１０、ＫＡＡＤ−シクロパミン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４及び／又はＲＡが挙げられるが、これらに限定されない。

【0558】

内分泌前駆細胞及び／又は未成熟膵島ホルモン発現細胞から成熟膵島ホルモン発現細胞を産生する１つのプロセスにおいて、１０ｍＭのニコチンアミド、４０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン４、２５ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１を内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞の細胞培養物又は細胞集団に供給する。好ましいプロセスでは、細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で分化する。

【0559】

本明細書に記載されるように、成熟膵島ホルモン発現細胞を産生する或る特定のプロセスにおいて、１つ又は複数の前記の分化因子は、それらの添加後に細胞培養物又は細胞集団から除去される。例えば、ニコチンアミドは、添加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日又は約１０日以内に除去することができる。幾つかの実施形態において、分化因子は細胞培養物から除去されない。

【0560】

成熟膵島ホルモン発現細胞の培養物は、低血清又は無血清の培地中で産生され得る。或る特定の培養条件下、血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えば幾つかの分化プロセスにおいて、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満、又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。幾つかのプロセスにおいて、成熟膵島ホルモン発現細胞を、血清を用いずに、血清代替物を用いずに、且つ／又はインスリン若しくはインスリン様増殖因子を含有する任意のサプリメントを用いずに増殖させる。

【0561】

さらに他のプロセスにおいて、成熟膵島ホルモン発現細胞はＢ２７の存在下で増殖する。このようなプロセスにおいて、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲、又は約２０％（ｖ／ｖ）超の濃度であり得る。或る特定のプロセスにおいて、培地中のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）又は約２０％（ｖ／ｖ）である。代替的には、Ｂ２７サプリメントの添加濃度は、市販されているＢ２７原液の濃度の倍数で測定され得る。例えば、Ｂ２７は５０×原液としてInvitrogen（Carlsbad, CA）から入手可能である。この原液を十分量、十分な容量の増殖培地に添加することで、所望量のＢ２７を補充した培地が得られる。例えば、５０×Ｂ２７原液１０ｍｌを増殖培地９０ｍｌに加えることで、５×Ｂ２７を補充した増殖培地が得られる。培地中のＢ２７サプリメントの濃度は、約０．１×、約０．２×、約０．３×、約０．４×、約０．５×、約０．６×、約０．７×、約０．８×、約０．９×、約１×、約１．１×、約１．２×、約１．３×、約１．４×、約１．５×、約１．６×、約１．７×、約１．８×、約１．９×、約２×、約２．５×、約３×、約３．５×、約４×、約４．５×、約５×、約６×、約７×、約８×、約９×、約１０×、約１１×、約１２×、約１３×、約１４×、約１５×、約１６×、約１７×、約１８×、約１９×、約２０×、及び約２０×超であり得る。

【0562】

成熟膵島ホルモン発現細胞の産生のモニタリング
内分泌前駆細胞及び未熟膵島ホルモン発現細胞の成熟膵島ホルモン発現細胞への発達は
、膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現を求めることによってモニタリングすることができる。幾つかのプロセスでは、マーカーの有無を検出することによって或る特定のマーカーの発現が求められる。代替的には、或る特定のマーカーの発現は、細胞培養物又は細胞集団の細胞に存在するマーカーのレベルを測定することによって求めることができる。或る特定のプロセスでは、成熟膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現、並びにｈＥＳＣ、胚体内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、内分泌前駆細胞、未熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉、中胚葉、外肺葉及び／又は他の細胞型に特有のマーカーの有意な発現の欠失が求められる。

【0563】

胚体内胚葉系統の他のあまり分化しない細胞型の産生のモニタリングに関連して記載されるように、定量技法又は半定量技法、例えばブロット転写法及び免疫細胞化学法を用いて、マーカーの発現を測定することができる。代替的に、マーカーの発現は、Ｑ−ＰＣＲ等の技法の使用によって正確に定量化することができる。さらに、ポリペプチドレベルで、膵島ホルモン発現細胞の多くのマーカーが分泌タンパク質であることが理解される。このように、細胞外のマーカー含有量を測定する技法、例えばＥＬＩＳＡが利用され得る。

【0564】

以下の実施例で記載されるように、成熟膵島ホルモン発現細胞のマーカーとしては、グレリン（ＧＨＲＬ）、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ＮＫＸ６転写因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）、ソマトスタチン（ＳＯＭ、ＳＳＴ）、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、シナプトフィジン（ＳＹＰ）、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、及び／又は結合ペプチド（Ｃ−ペプチド）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるプロセスによって産生された成熟膵島ホルモン発現細胞は、１つ又は複数の上で列記されたマーカーを発現することによって、対応する遺伝子産物を産生する。しかし、成熟膵島ホルモン発現細胞が前記のマーカーを全て発現する必要はないことが理解される。例えば、ｈＥＳＣから分化した膵島ホルモン発現細胞は、ＩＮＳとＧＨＲＬとを同時に発現しない。このパターンの遺伝子発現は、ヒト胎児膵臓におけるこれらの遺伝子の発現に一致する。

【0565】

成熟膵島ホルモン発現細胞は内分泌前駆細胞マーカーＮＧＮ３及びＰＡＸ４を実質的に発現しないので、内分泌前駆細胞の成熟膵島ホルモン発現細胞への移行は、ＮＧＮ３及びＰＡＸ４の発現の低減をモニタリングする一方で、１つ又は複数のＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨＧＡ及び／又はＣ−ペプチドの発現の増大をモニタリングすることによって立証することができる。幾つかのプロセスでは、１つ又は複数の前記のマーカーの発現の増大及び／又は低減をモニタリングすることに加えて、ｈＥＳＣ、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞を示す遺伝子の発現もモニタリングする。

【0566】

ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨＧＡ及びＣ−ペプチドマーカーの発現が、分化条件によって成熟膵島ホルモン発現細胞において様々なレベルの範囲にわたって誘導されることが理解される。このように、本明細書に記載される幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨＧＡ、及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現は、非膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団、例えば多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、内分泌前駆細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞、及び／又は外肺葉細胞におけるＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨＧＡ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現の少なくとも約２倍〜少なくとも約１００００倍である。他の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨ
ＧＡ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現は、非膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、内分泌前駆細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞及び／又は外胚葉細胞におけるＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨＧＡ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現よりも少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２５００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約７５００倍、又は少なくとも約１００００倍高い。幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨＧＡ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現は、非膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団、例えば多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、内分泌前駆細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞及び／又は外肺葉細胞におけるＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳＴ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨＧＡ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現よりもはるかに高い。

【0567】

ＭＡＦＡマーカーの発現が、例えばＩＮＳを同時に発現する細胞で、成熟膵島ホルモン発現細胞において様々なレベルの範囲にわたって増大されることも理解される。分化条件によって、ＭＡＦＡマーカーの発現が成熟膵島ホルモン発現細胞において様々なレベルの範囲にわたって誘導される。このように、本明細書に記載される幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＭＡＦＡマーカーの発現は、未熟膵島ホルモン発現細胞又は非膵島ホルモン発現細胞集団、例えば多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、内分泌前駆細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞及び／又は外肺葉細胞におけるＭＡＦＡマーカーの発現の少なくとも約２倍〜少なくとも約１００００倍である。他の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＭＡＦＡマーカーの発現は、未熟膵島ホルモン発現細胞又は非膵島ホルモン発現細胞、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、内分泌前駆細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞及び／又は外胚葉細胞におけるＭＡＦＡマーカーの発現よりも少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２５００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約７５００倍、又は少なくとも約１００００倍高い。幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＭＡＦＡマーカーの発現は、未熟膵島ホルモン発現細胞又は他の非膵島ホルモン発現細胞、例えば多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、内分泌前駆細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞及び／又は外肺葉細胞におけるＭＡＦＡマーカーの発現よりもはるかに高い。

【0568】

ＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現が、分化条件によって成熟膵島ホルモン発現細胞において様々なレベルの範囲にわたって低減されることが理解される。このように、本明細書に記載される幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現は、内分泌前駆細胞におけるＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現よりも少なくとも約２倍〜少なくとも約１００００倍低い。他の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団におけるＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現は、内分泌前駆細胞におけるＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現よりも少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約
２００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２５００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約７５００倍、又は少なくとも約１００００倍低い。幾つかの実施形態において、ＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーは、成熟膵島ホルモン発現細胞又は細胞集団において実質的に発現しない。

【0569】

本明細書に記載されるプロセスの幾つかの実施形態において、細胞及び／又は細胞集団からのホルモン放出量を求めることができる。例えば、インスリン放出、グルカゴン放出、ソマトスタチン放出及び／又はグレリン放出の量をモニタリングすることができる。好ましい実施形態において、グルコース応答性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）の量が測定される。さらに別の実施形態において、分泌の途絶又は成熟膵島ホルモン発現細胞によって産生される副産物、例えばＣ−ペプチド及び膵島アミロイドタンパク質がモニタリングされ得る。

【0570】

分泌タンパク質の発現を測定する方法は当該技術分野で既知であることが理解される。例えば、膵島細胞によって産生される１つ又は複数のホルモンに対する抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイに用いることができる。

【0571】

本発明の幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞によるインスリン放出は、Ｃ−ペプチド放出の測定によって測定される。Ｃ−ペプチドは、プロインスリンの成熟化の間、インスリンに対して等モル量で産生される分解産物である。Ｃ−ペプチドの測定が有利なのは、その半減期がインスリンよりも長いからである。Ｃ−ペプチド放出を測定する方法は、当該技術分野において知られている（例えば、抗Ｃペプチドモノクローナル抗体（Linco Research, St. Louis, Missouri）を使用するＥＬＩＳＡ）。本発明の幾
つかの実施形態において、ｈＥＳＣから産生される成熟膵島ホルモン発現細胞は、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約１００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約２００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約３００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約４００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約５００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約６００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約７００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約８００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約９００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、Ｃ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、又はＣ−ペプチド（インスリン） 少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇを分泌する。好ましい実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、単一種の膵島細胞ホルモンを分泌する細胞（例えば、インスリンのみを分泌する細胞）である。或る特定の好ましい実施形態において、インスリンはグルコースに応答して分泌される。他の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、１つ又は複数の膵島細胞ホルモン、例えば、ソマトスタチン、グルカゴン及び／又はグレリンに加えて、インスリンを分泌する細胞である。

【0572】

幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、当該成熟膵島ホルモン発現細胞によって産生されるインスリンの約８０％超をプロセシングする。幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、当該成熟膵島ホルモン発現細胞によって産生されるインスリンの約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、又は約９９％超をプロセシングする。

【0573】

本発明の他の実施形態において、ｈＥＳＣから産生される成熟膵島ホルモン発現細胞は、グルカゴン 少なくとも約５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約１００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約２００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約３００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約４００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約５００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約６００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約７００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約８００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約９００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グルカゴン 少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、又はグルカゴン 少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇを分泌する。好ましい実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、単一種の膵島細胞ホルモンを分泌する細胞（例えば、グルカゴンのみを分泌する細胞）である。他の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、１つ又は複数の膵島細胞ホルモン、例えば、グレリン、ソマトスタチン及びインスリンに加えて、グルカゴンを分泌する細胞である。

【0574】

本発明のさらに他の実施形態において、ｈＥＳＣから産生される成熟膵島ホルモン発現細胞は、ソマトスタチン 少なくとも約５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約１００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約２００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約３００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約４００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約５００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約６００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約７００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約８００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約９００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、ソマトスタチン 少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、又はソマトスタチン 少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇを分泌する。好ましい実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、単一種の膵島細胞ホルモンを分泌する細胞（例えば、ソマトスタチンのみを分泌する細胞）である。他の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、１つ又は複数の膵島細胞ホルモン、例えば、グレリン、グルカゴン及びインスリンに加えて、ソマトスタチンを分泌
する細胞である。

【0575】

本発明の他の実施形態において、ｈＥＳＣから産生される成熟膵島ホルモン発現細胞は、グレリン 少なくとも約５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約１００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約２００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン
少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約３００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約４００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約５００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約６００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約７００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約８００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約９００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン 少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、又はグレリン 少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇを分泌する。好ましい実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、単一種の膵島細胞ホルモンを分泌する細胞（例えば、グレリンのみを分泌する細胞）である。他の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、１つ又は複数の膵島細胞ホルモンに加えて、グレリンを分泌する細胞である。

【0576】

成熟膵島ホルモン発現細胞の濃縮、単離及び／又は精製
任意の前記プロセスによって産生される成熟膵島ホルモン発現細胞は、このような細胞に特異的である親和性タグを用いることによって、濃縮、単離及び／又は精製することができる。成熟膵島ホルモン発現細胞に特異的な親和性タグの例は、抗体、リガンド、又は成熟膵島ホルモン発現細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書に記載される方法によって産生される細胞培養物で見出される他の細胞型には実質的に存在しないマーカー分子、例えばポリペプチドに特異的である他の結合剤である。幾つかのプロセスでは、ヒト膵島細胞上で細胞表面の抗原と結合する抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法、例えば本明細書で記載される方法によって産生される成熟膵島ホルモン発現細胞の濃縮、単離又は精製のための親和性タグとして用いられる。このような抗体は既知であり、市販されている。例えば、ヒト膵島細胞で細胞表面マーカーに非常に特異的であるモノクローナル抗体は、USBiological（Swampscott, MA）（カタログ番号Ｐ２９９９−４０）で市販されている。他の例には、Srikanta, et al.,（1987）Endocrinology, 120:2240-2244（その開示内容全体が
参照により本明細書に援用される）で記載されている、膵島細胞の表面上に位置する糖タンパク質に対して非常に特異的なモノクローナル抗体が含まれる。成熟膵島ホルモン発現細胞、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト多能性細胞から誘導されるものに対する親和性タグの好ましい例はＮＣＡＭである。ＮＣＡＭに対する抗体は、例えばAbcam（Cambridge, MA）で市販されている。

【0577】

当業者には、未熟膵島ホルモン発現細胞の濃縮、単離及び／又は精製のための抗体を作製及び使用するプロセスが、膵島ホルモン発現細胞の濃縮、単離及び／又は精製にも容易に適合可能であることが容易に理解される。例えば、幾つかの実施形態において、試薬、例えばＮＣＡＭ抗体は、成熟膵島ホルモン発現細胞を含有する細胞培養物とインキュベートされ、この細胞培養物は細胞間及び基質の接着を低減させるように処理されている。それから細胞を洗浄、遠心分離及び再懸濁する。（本発明者らは二次抗体を用いない。本発明者らは、直接蛍光結合ＮＣＡＭ抗体を用いる。その後、細胞懸濁液を二次抗体、例えば一次抗体と結合することができるＦＩＴＣ結合抗体とインキュベートする。それから細胞を洗浄、遠心分離及び緩衝液中で再懸濁する。その後、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ
）を用いて、細胞懸濁液を解析及び選別する。抗体結合蛍光細胞を非結合非蛍光細胞とは別に回収し、それによってこのような細胞型が単離される。

【0578】

本明細書に記載されるプロセスの好ましい実施形態において、代替的な親和性に基づいた方法を用いることによって、又は成熟膵島ホルモン発現細胞に特異的である同一の若しくは異なるマーカーを用いたさらなる一連の選別によって、単離細胞組成物をさらに精製することができる。例えば、幾つかの実施形態において、ＦＡＣＳ選別を用いて、初めに成熟膵臓ホルモン発現細胞を含む細胞集団由来のＮＣＡＭ陰性細胞からＮＣＡＭ陽性成熟膵臓ホルモン発現細胞を単離する。ＮＣＡＭ陽性である細胞を単離するのに再びＦＡＣＳを用いて、ＮＣＡＭ陽性細胞を選別することによって、この細胞型に特有のマーカー（ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＩＳＬ１又はＰＡＸ６を含む）を発現する成熟膵臓ホルモン発現細胞に対して細胞集団を濃縮させる。他の実施形態において、ＦＡＣＳ選別を用いて、成熟膵島ホルモン発現細胞以外の細胞集団におけるほとんどの細胞に存在するマーカーに関して陰性選別することによって細胞を分離する。このような陰性選別の例は、１回目の濃縮の後では、ＮＣＡＭ陽性細胞集団における成熟膵島ホルモン発現細胞の表面上で実質的に発現しないが、この細胞集団における多くの他のＮＣＡＭ陽性細胞では発現するマーカーであるＣＤ１３３の使用である。

【0579】

本明細書に記載されるプロセスの幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、抗体を用いずに蛍光標識した後、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を用いることによって非標識細胞から単離される。このような実施形態において、ＧＦＰ、ＹＦＰをコードする核酸、又は発現性の蛍光マーカーの遺伝子、例えばルシフェラーゼをコードする遺伝子をコードする別の核酸は、前記の方法を用いて成熟膵島ホルモン発現細胞を標識するのに用いられる。例えば、幾つかの実施形態において、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的に活性な断片の少なくとも１つのコピーが、ＧＦＰ遺伝子産物又はその生物学的に活性な断片の発現がＮＫＸ６．１プロモータの制御下であるように、ＮＫＸ６．１プロモータの下流へと多能性細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞に導入される。幾つかの実施形態において、ＮＫＸ６．１をコードする、核酸の全コード領域は、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的に活性な断片に置き換えられる。他の実施形態において、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的に活性な断片は、ＮＫＸ６．１をコードする核酸の少なくとも一部にフレーム単位で融合され、それによって融合タンパク質が生成される。このような実施形態において、融合タンパク質は、ＧＦＰと同程度の蛍光活性を維持する。

【0580】

プロモータが膵島ホルモン発現細胞で発現されるマーカーと一致していれば、ＮＫＸ６．１プロモータ以外のプロモータを用いることができることが理解される。１つの例示的なマーカーはＮＫＸ２．２である。

【0581】

これまでに前記で記載されたように、蛍光標識細胞、例えば前記の多能性細胞は、成熟膵島ホルモン発現細胞に分化する。成熟膵島ホルモン発現細胞が蛍光マーカー遺伝子を発現するのに対し、他の細胞型は発現しないので、膵島ホルモン発現細胞を他の細胞型から単離することができる。幾つかの実施形態において、蛍光標識された成熟膵島ホルモン発現細胞と標識されない非膵島ホルモン発現細胞との混合物を含む細胞懸濁液はＦＡＣＳを用いて選別される。成熟膵島ホルモン発現細胞は非蛍光細胞から別々に回収され、それによって成熟膵島ホルモン発現細胞が単離される。必要に応じて、単離細胞組成物は、成熟膵島ホルモン発現細胞に特異的な同一の若しくは異なるマーカーを用いたさらなる一連の選別によってさらに精製することができる。

【0582】

好ましいプロセスでは、培養物が成熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように誘導された後、成熟膵島ホルモン発現細胞は、他の非膵島ホルモン発現細胞から濃縮、単離及び／又は精製される。

【0583】

前記の手順に加えて、成熟膵島ホルモン発現細胞は、細胞単離の他の技法によっても単離することができる。さらに、成熟膵島ホルモン発現細胞は、膵島ホルモン発現細胞の選択的生存又は選択的増殖を促進する増殖条件下での連続継代培養法によっても濃縮又は単離され得る。

【0584】

本明細書に記載される方法を用いて、成熟膵島ホルモン発現細胞及び／又は組織の濃縮、単離及び／又は精製された集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、少なくとも幾つかの成熟膵島ホルモン発現細胞を産生するのに十分な分化を受けた、多能性細胞培養物又は細胞集団、例えば幹細胞培養物又は集団から産生することができる。好ましい方法では、主に細胞は成熟膵島ホルモン発現細胞に分化することに向けられる。幾つかの好ましい濃縮、単離及び／又は精製の方法は、ヒト胚性幹細胞からの成熟膵島ホルモン発現細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に関する。

【0585】

本明細書に記載される方法を用いて、細胞集団又は細胞培養物は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約２倍〜約１０００倍まで成熟膵島ホルモン発現細胞含有量を濃縮させることができる。幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約５倍〜約５００倍まで濃縮することができる。他の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約１０倍〜約２００倍まで濃縮することができる。さらに別の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約２０倍〜約１００倍まで濃縮することができる。さらに別の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約４０倍〜約８０倍まで濃縮することができる。或る特定の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は、未処理又はあまり明確に分化しない細胞集団又は細胞培養物に比べて少なくとも約２倍〜約２０倍まで濃縮することができる。

【0586】

成熟膵島ホルモン発現細胞を含む組成物
本発明の幾つかの実施形態は、成熟膵島ホルモン発現細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の細胞組成物に関し、この成熟膵島ホルモン発現細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト多能性細胞から誘導され、１つ又は複数の膵臓ホルモンを発現し、ヒト膵島細胞の少なくとも幾つかの機能を有する細胞である。或る特定の実施形態によれば、膵島ホルモン発現細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態において、このような細胞はヒト細胞である。

【0587】

本発明の他の実施形態は、成熟膵島ホルモン発現細胞、及び成熟膵島ホルモン発現細胞よりも明確に分化されない細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。このような実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞よりも明確に分化されない細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。

【0588】

本発明の或る特定の他の実施形態は、成熟膵島ホルモン発現細胞、並びにｈＥＳＣ、前原始線条細胞、内胚葉系中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞（ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞）、内分泌前駆細胞、及び中胚葉細胞から成る群から選択される１つ又は複数の細胞型を含む、細胞培養物又は細胞集団
等の組成物に関する。幾つかの実施形態において、ｈＥＳＣは、培養物中の全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。或る特定の実施形態において、前原始線条細胞は、培養物中の全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。他の実施形態において、内胚葉系中胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。さらに他の実施形態において、胚体内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。さらに他の実施形態において、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。或る特定の実施形態において、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。他の実施形態において、内分泌前駆細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。さらに他の実施形態において、中胚葉細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。

【0589】

本発明の他の実施形態は、成熟膵島ホルモン発現細胞及び未熟膵島ホルモン発現細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。このような実施形態において、未熟膵島ホルモン発現細胞は、培養物中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満である。

【0590】

本発明のさらなる実施形態は、本明細書中に記載されるプロセスによって産生され、且つ主要細胞型として成熟膵島ホルモン発現細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、成熟膵島ホルモン発現細胞を少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８７％、少なくとも約８６％、少なくとも約８５％、少
なくとも約８４％、少なくとも約８３％、少なくとも約８２％、少なくとも約８１％、少なくとも約８０％、少なくとも約７９％、少なくとも約７８％、少なくとも約７７％、少なくとも約７６％、少なくとも約７５％、少なくとも約７４％、少なくとも約７３％、少なくとも約７２％、少なくとも約７１％、少なくとも約７０％、少なくとも約６９％、少なくとも約６８％、少なくとも約６７％、少なくとも約６６％、少なくとも約６５％、少なくとも約６４％、少なくとも約６３％、少なくとも約６２％、少なくとも約６１％、少なくとも約６０％、少なくとも約５９％、少なくとも約５８％、少なくとも約５７％、少なくとも約５６％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、少なくとも約５１％、又は少なくとも約５０％含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団の細胞はヒト細胞を含む。他の実施形態において、本明細書中に記載されるプロセスは、成熟膵島ホルモン発現細胞を少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、又は少なくとも約１％含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団の細胞はヒト細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞培養物又は細胞集団中の成熟膵島ホルモン発現細胞の割合は、培養物中に残存するフィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0591】

本発明のさらに他の実施形態は、成熟膵島ホルモン発現細胞と、内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞との混合物を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物に関する。例えば、約９５個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約５個の成熟膵島ホルモン発現細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団が産生され得る。他の実施形態において、約５個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約９５個の成熟膵島ホルモン発現細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団が産生され得る。さらに、成熟膵島ホルモン発現細胞と内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞とを他の比率で含む、細胞培養物又は細胞集団が考慮される。例えば、約１００００００個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１０００００個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１００００個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１０００個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約５００個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１００個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１０個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約５個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約４個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約２個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約２個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約４個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約５個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌
前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１０個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約２０個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約５０個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１００個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１０００個の成熟膵島ホルモン発現細胞、約１個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１００００個の成熟膵島ホルモン発現細胞、１個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１０００００個の成熟膵島ホルモン発現細胞、並びに約１個の内分泌前駆細胞及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞毎に少なくとも約１００００００個の成熟膵島ホルモン発現細胞を含む組成物が考慮される。

【0592】

本発明の幾つかの実施形態において、産生される成熟膵島ホルモン発現細胞は、ヒト多能性細胞、例えばヒト多能性幹細胞から誘導される。或る特定の実施形態において、ヒト多能性細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊、又は胚の生殖隆起から誘導される。或る特定の他の実施形態において、ヒト多能性細胞は、胚形成期後に発生した、多細胞構造を有する生殖腺組織又は胚組織から誘導される。

【0593】

本発明のさらなる実施形態は、ヒト細胞（例えば、ヒト成熟膵島ホルモン発現細胞）を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物であって、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨＧＡ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現が、ヒト細胞の少なくとも約２％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい、組成物に関する。他の実施形態において、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨＧＡ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現は、ヒト細胞の少なくとも約５％で、ヒト細胞の少なくとも約１０％で、ヒト細胞の少なくとも約１５％で、ヒト細胞の少なくとも約２０％で、ヒト細胞の少なくとも約２５％で、ヒト細胞の少なくとも約３０％で、ヒト細胞の少なくとも約３５％で、ヒト細胞の少なくとも約４０％で、ヒト細胞の少なくとも約４５％で、ヒト細胞の少なくとも約５０％で、ヒト細胞の少なくとも約５５％で、ヒト細胞の少なくとも約６０％で、ヒト細胞の少なくとも約６５％で、ヒト細胞の少なくとも約７０％で、ヒト細胞の少なくとも約７５％で、ヒト細胞の少なくとも約８０％で、ヒト細胞の少なくとも約８５％で、ヒト細胞の少なくとも約９０％で、ヒト細胞の少なくとも約９５％で、又はヒト細胞の少なくとも約９８％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現よりも大きい。幾つかの実施形態において、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨＧＡ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現よりも大きい、細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞の割合は、フィーダー細胞を考慮せずに算出される。

【0594】

本発明のさらなる実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した哺乳動物細胞、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化したヒト細胞を含む、細胞培養物又は細胞集団等の組成物であって、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨＧＡ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約２％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現よりも大きい、組成物に関する。他の実施形態において、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＳＳ、ＰＰ、ＳＹＰ、ＧＣＫ、ＣＨＧＡ及び／又はＣ−ペプチドマーカーの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約５％で、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約１０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約１５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約２０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約２５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約３０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約３５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約４０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約４５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約５０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約５５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約６０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約６５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約７０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約７５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約８０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約８５％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約９０％で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約９５％で、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約９８％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＮＧＮ３及び／又はＰＡＸ４マーカーの発現よりも大きい。

【0595】

本発明の好ましい実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞の細胞培養物及び／又は細胞集団は、非組み換え細胞であるヒト成熟膵島ホルモン発現細胞を含む。このような実施形態において、細胞培養物及び／又は細胞集団は、組み換えヒト成熟膵島ホルモン発現細胞を欠いているか、又は実質的に含まない。

【0596】

本発明の幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団には、ニコチンアミド、エキセンジン４、ＨＧＦ及び／又はＩＧＦ１から選択される１つ又は複数の因子を含む培地も含まれる。幾つかの好ましい実施形態において、ニコチンアミド濃度は少なくとも約１０ｍＭであり、エキセンジン４濃度は少なくとも約４０ｎｇ／ｍｌであり、ＨＧＦ濃度は少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌであり、ＩＧＦ１濃度は少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、培地はＤＭＥＭである。

【0597】

本発明の或る特定の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団には、グレリン、インスリン、ソマトスタチン及び／又はグルカゴンから選択される１つ又は複数の分泌ホルモンを含む培地も含まれる。他の実施形態において、培地はＣ−ペプチドを含む。好ましい実施形態において、培地中の１つ又は複数の分泌ホルモン又はＣ−ペプチドの濃度は、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン又はＣ−ペプチド 少なくとも約１ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ〜グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン又はＣ−ペプチド 少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇの範囲である。さらに好ましい実施形態において、培地中の１つ又は複数の分泌ホルモン又はＣ−ペプチドの濃度は、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約１ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約１０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約２５ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約７５ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約１００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−
ペプチド 少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約２００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約３００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド
少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約４００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約５００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約６００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約７００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約８００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約９００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、グレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇ、又はグレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン若しくはＣ−ペプチド 少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／細胞ＤＮＡ １μｇである。

【0598】

本明細書に記載される細胞培養物及び／又は細胞集団の幾つかの実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は２つ以上の膵臓ホルモンを分泌する。本明細書に記載される細胞培養物及び／又は細胞集団の他の実施形態において、成熟膵島ホルモン発現細胞は単一の膵臓ホルモンを分泌する。好ましい実施形態において、このホルモンはインスリンである。さらにより好ましい実施形態において、成熟膵島インスリン発現細胞はグルコースに応答性がある。他の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したヒト成熟膵島インスリン発現細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト膵臓の膵臓β細胞によって分泌されるインスリン量と同程度又はそれを超える量のインスリンを分泌する。

【0599】

本明細書に記載されるプロセスを用いて、他の細胞型を実質的に含まない成熟膵島ホルモン発現細胞を含む組成物を産生することができる。本発明の幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法によって産生された成熟膵島ホルモン発現細胞集団又は細胞培養物は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーを有意に発現する細胞を実質的に含まない。

【0600】

本発明の一実施形態において、成熟膵島インスリン発現細胞のマーカーの発現に基づく記載は、ＮＫＸ６．１高、ＮＫＸ２．２高、ＩＮＳ高、ＩＡＰＰ高、ＳＹＰ高、ＧＣＫ高、ＣＨＧＡ高、ＮＧＮ３低、ＰＡＸ４低、及びＭＡＦＢ低である。成熟膵島グルカゴン（glucogon）発現細胞については、マーカー発現に基づく記載は、ＮＫＸ６．１高、ＮＫＸ２．２高、ＧＬＣ高、ＳＹＰ高、ＧＣＫ高、ＣＨＧＡ高、ＮＧＮ３低、ＰＡＸ４低、及びＭＡＦＢ高である。

【0601】

膵島ホルモン発現細胞のスクリーニング
本明細書に記載される或る特定のスクリーニング方法は、未熟及び／又は成熟膵島ホルモン発現細胞（共に膵島ホルモン発現細胞と称される）の少なくとも１つの膵臓機能に影響を与えることができる少なくとも１つの化合物を同定する方法に関する。

【0602】

これらのスクリーニング方法の幾つかの実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで多能性細胞から分化した膵島ホルモン発現細胞、例えばヒト膵島ホルモン発現細胞を含む細胞集団が得られる。それから、細胞集団に候補化合物を供給する。候補化合物を供給する前又は供給するのとほぼ同時である第１の時点で、所望の膵臓機能の活性が求められる。代替的に、候補化合物を供給した後に、所望の膵臓機能の活性を求めることができる。第１の時点の後であり、候補化合物を細胞集団に供給する工程の後である第２の時点で再び、所望の膵臓機能の活性が求められる。候補化合物が膵島ホルモン発現細胞の少なくとも１つの膵臓機能に影響を与えることができるか否かは、第１の時点での所望の膵臓機能の活性を第２の時点での所望の膵臓機能の活性と比較することによって求められる。第２の時点での所望の膵臓機能の活性が第１の時点での所望の膵臓機能の活性に比べて増減する場合、候補化合物は膵島ホルモン発現細胞の膵臓機能の活性に影響を与えることができる。

【0603】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法の幾つかの実施形態は、ヒト膵島ホルモン発現細胞を含む細胞集団又は細胞培養物を利用する。例えば細胞集団は、膵島ホルモン発現細胞を実質的に精製した集団であり得る。代替的には、細胞集団はヒト膵島ホルモン発現細胞を濃縮した集団であり得る。この場合、細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９７％超がヒト膵島ホルモン発現細胞である。本明細書中に記載される他の実施形態において、細胞集団は、ヒト細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約８５％超がヒト膵島ホルモン発現細胞である、ヒト細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞集団は、非ヒト細胞、例えば非ヒトフィーダー細胞を含む。他の実施形態において、細胞集団は、ヒトフィーダー細胞を含む。このような実施形態において、前記フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９５％超がヒト膵島ホルモン発現細胞である。

【0604】

本明細書に記載されるスクリーニング方法の実施形態において、細胞集団は候補（試験）化合物と接触されるか、又はそうでなければ候補（試験）化合物を提供される。候補化合物は、ヒト膵島ホルモン発現細胞の１つ又は複数の膵臓機能の活性に影響を与える可能性を有し得る任意の分子を含むことができる。本明細書に記載される幾つかの実施形態において、候補化合物は、１つ又は複数の細胞機能に影響を与える化合物であることが知られている分子を含む。代替的な実施形態において、候補化合物は、任意の細胞機能に影響を与えることが知られていない分子を含む。好ましい実施形態において、候補化合物は、ヒト膵島ホルモン発現細胞の膵臓機能の活性に影響を与えることが知られていない分子を含む。

【0605】

本明細書に記載されるスクリーニング方法の幾つかの実施形態において、候補化合物は小分子を含む。好ましい実施形態において、小分子は分子量が約１００００ａｍｕ以下の
分子である。

【0606】

本明細書に記載される他の実施形態において、候補化合物はポリペプチドを含む。このポリペプチドは、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外基質タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、インターロイキン又は増殖因子を含む（が、これらに限定されない）任意のポリペプチドであり得る。

【0607】

本明細書中に記載されるスクリーニング方法の幾つかの実施形態において、候補化合物は、１つ又は複数の濃度で細胞集団に供給される。幾つかの実施形態において、候補化合物は、細胞周囲の培地中の候補化合物の濃度が約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの範囲であるように細胞集団に供給される。幾つかの実施形態において、細胞周囲の培地中の候補化合物の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲である。他の実施形態において、細胞周囲の培地中の候補化合物の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの範囲である。さらに他の実施形態において、細胞周囲の培地中の候補化合物の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲である。好ましい実施形態において、細胞周囲の培地中の候補化合物の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１７５ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２２５ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２７５ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約３２５ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ、約３７５ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約４２５ｎｇ／ｍｌ、約４５０ｎｇ／ｍｌ、約４７５ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約５２５ｎｇ／ｍｌ、約５５０ｎｇ／ｍｌ、約５７５ｎｇ／ｍｌ、約６００ｎｇ／ｍｌ、約６２５ｎｇ／ｍｌ、約６５０ｎｇ／ｍｌ、約６７５ｎｇ／ｍｌ、約７００ｎｇ／ｍｌ、約７２５ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ、約７７５ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、約８２５ｎｇ／ｍｌ、約８５０ｎｇ／ｍｌ、約８７５ｎｇ／ｍｌ、約９００ｎｇ／ｍｌ、約９２５ｎｇ／ｍｌ、約９５０ｎｇ／ｍｌ、約９７５ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１１μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ、約１４μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約１６μｇ／ｍｌ、約１７μｇ／ｍｌ、約１８μｇ／ｍｌ、約１９μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約５５０μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約６５０μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約８５０μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ、約９５０μｇ／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌ、又は約１０００μｇ／ｍｌ超である。

【0608】

幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるスクリーニング方法の工程は、第１の時点及び第２の時点で所望の膵臓機能の活性を求めることを含む。幾つかのこれらの実施形態において、第１の時点は、候補化合物を細胞集団に供給する前又は供給するのとほぼ同時であり得る。代替的には、幾つかの実施形態において、第１の時点は候補分化因子を細胞集団に供給した後である。幾つかの実施形態において、幾つかの膵臓機能の活性が第１の時点で求められる。

【0609】

前記の実施形態で求められる幾つかの好ましい膵臓機能には、グレリン分泌、インスリン分泌、グルカゴン分泌及びソマトスタチン分泌から成る群から選択される１つ又は複数の膵臓機能が含まれる。

【0610】

第１の時点で所望の膵臓機能の活性を求めることに加えて、本明細書に記載されるスクリーニング方法の幾つかの実施形態は、第１の時点の後であり、候補化合物を細胞集団に
供給した後である第２の時点で少なくとも１つのマーカーの所望の膵臓機能の活性を求めることを考慮する。このような実施形態において、同じ所望の膵臓機能の活性は、第１の時点及び第２の時点の両方で求められる。幾つかの実施形態において、複数の所望の膵臓機能の活性が第１の時点及び第２の時点の両方で求められる。このような実施形態において、同じ複数の所望の膵臓機能の活性が第１の時点及び第２の時点の両方で求められる。幾つかの実施形態において、複数の所望の膵臓機能の活性は、それぞれが第１の時点の後であり、それぞれが候補化合物を細胞集団に供給した後である複数の時点で求められる。或る特定の実施形態において、所望の膵臓機能の活性はＱ−ＰＣＲによって求められる。他の実施形態において、所望の膵臓機能の活性は免疫細胞化学法によって求められる。

【0611】

本明細書に記載されるスクリーニング方法の或る特定の実施形態において、第１の時点及び第２の時点で求められる所望の膵臓機能の活性は、膵臓機能、例えばホルモン分泌の活性である。幾つかの実施形態において、このホルモンはインスリン、グレリン、ソマトスタチン又はグルカゴンである。

【0612】

本明細書に記載されるスクリーニング方法の幾つかの実施形態において、候補化合物を細胞集団に供給するのと、第２の時点で所望の膵臓機能の活性を求めるのとの間に十分な時間を経過させる。候補化合物を細胞集団に供給するのと、第２の時点で所望の膵臓機能の活性を求めるのとの間の十分な時間は、最低約１時間〜最大約１０日であり得る。幾つかの実施形態において、所望の膵臓機能の活性は、候補化合物を細胞集団に供給した後に、複数回求められる。幾つかの実施形態において、十分な時間は、少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約５４時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約６６時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約７８時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１０２時間、少なくとも約１０８時間、少なくとも約１１４時間、少なくとも約１２０時間、少なくとも約１２６時間、少なくとも約１３２時間、少なくとも約１３８時間、少なくとも約１４４時間、少なくとも約１５０時間、少なくとも約１５６時間、少なくとも約１６２時間、少なくとも約１６８時間、少なくとも約１７４時間、少なくとも約１８０時間、少なくとも約１８６時間、少なくとも約１９２時間、少なくとも約１９８時間、少なくとも約２０４時間、少なくとも約２１０時間、少なくとも約２１６時間、少なくとも約２２２時間、少なくとも約２２８時間、少なくとも約２３４時間、少なくとも約２４０時間、少なくとも約２４６時間、少なくとも約２５２時間、少なくとも約２５８時間、少なくとも約２６４時間、又は少なくとも約２７０時間である。

【0613】

本明細書に記載される幾つかの実施形態において、第２の時点での所望の膵臓機能の活性が第１の時点での所望の膵臓機能の活性に比べて増減していたか否かがさらに求められる。所望の膵臓機能の活性の増減によって、候補化合物が膵島ホルモン発現細胞において所望の膵臓機能の活性に影響を与えることができることが示される。同様に、複数の膵臓機能の活性が求められる場合、第２の時点での複数の膵臓機能の活性が第１の時点での複数の膵臓機能の活性に比べて増減していたか否かがさらに求められる。所望の膵臓機能の活性が第１の時点と比較して第２の時点で増加する、或る特定の実施形態において、増加量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１００倍超である。幾つかの実施形態において、増加量は２倍未満である。所望の膵臓機能の活性が第１の時点と比較して第２の時点で減少する実施形態において、減少量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なく
とも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１００倍超である。幾つかの実施形態において、減少量は２倍未満である。

【0614】

ｈＥＳＣの膵島ホルモン発現細胞への分化のための例示的な因子
表１は、ｈＥＳＣ培養物から少なくとも幾つかの膵島ホルモン発現細胞を産生するのに用いることができる因子の８つの例示的な組合せを示す。特に、分化プロセスで用いられるそれぞれの因子の濃度、分化プロセス中のそれぞれの因子の添加及び／又は除去のタイミング、分化プロセス中の分化培地、例えば血清中の成分濃度は、胚体細胞系統を経て、最終的に膵島ホルモン発現細胞に分化するｈＥＳＣの集団に有意に影響を与えることが理解される。

【0615】

表１の１番左側の列は実施例番号を与える。以降の６つの列は、列の見出しに記載された細胞型を産生するか、又は産生を潜在的に高めるのに用いられ得る因子を列記している。例えば、表１は、ｈＥＳＣ（０段階）をＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子とインキュベートすることによって、ｈＥＳＣを胚体内胚葉（１段階）に胚体内胚葉に分化させることを示す。表１から、適切な回数でのＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子及びレチノイドの適用は、ｈＥＳＣから少なくとも検出可能な量の膵島ホルモン産生細胞を産生するのに十分であると思われ得る。

【0616】

【表1】

【0617】

試薬−細胞複合体
本発明の幾つかの態様は、１つ又は複数の試薬と結合した１つ又は複数の内分泌前駆細胞又は未熟膵島ホルモン発現細胞の複合体（試薬−細胞複合体）を含む、細胞培養物及び／又は細胞集団等の組成物に関する。例えば、試薬−細胞複合体を含む、細胞培養物及び／又は細胞集団であって、培養物中の内分泌前駆細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約１００％が試薬−細胞複合体の形態である、細胞培養物及び／又は細胞集団が産生され得る。他の実施形態において、試薬−細胞複合体を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％
、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％含む細胞培養物及び／又は細胞集団が産生され得る。幾つかの実施形態において、試薬−細胞複合体は、ＮＣＡＭと結合する１つ又は複数の抗体と結合した１つ又は複数の内分泌前駆細胞を含む。さらに他の実施形態において、試薬−細胞複合体は、ＮＢＰ１０等の、ＮＣＡＭと結合する１つ又は複数のリガンドと結合した１つ又は複数の内分泌前駆細胞を含む。

【0618】

他の実施形態は、試薬−細胞複合体を含む、細胞培養物及び／又は細胞集団であって、培養物中の未熟膵島ホルモン発現細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約１００％が試薬−細胞複合体の形態である、細胞培養物及び／又は細胞集団を提供する。他の実施形態において、試薬−細胞複合体を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％含む細胞培養物及び／又は細胞集団が産生され得る。幾つかの実施形態において、試薬−細胞複合体は、ＮＣＡＭと結合する１つ又は複数の抗体と結合した１つ又は複数の未熟膵島ホルモン発現細胞を含む。さらに他の実施形態において、試薬−細胞複合体は、ＮＢＰ１０等の、ＮＣＡＭと結合する１つ又は複数のリガンドと結合した１つ又は複数の未熟膵島ホルモン発現細胞を含む。

【0619】

本明細書中に記載される幾つかの実施形態は、少なくとも約５％の試薬−細胞複合体〜少なくとも約９５％の試薬−細胞複合体を含む、細胞培養物及び／又は細胞集団に関する。幾つかの実施形態において、細胞培養物又は細胞集団は哺乳動物細胞を含む。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団はヒト細胞を含む。例えば、或る特定の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約９５％が試薬−細胞複合体の形態の内分泌前駆細胞である、細胞培養物に関する。他の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約９５％が試薬−細胞複合体の形態の未熟膵島ホルモン発現細胞である、細胞培養物に関する。他の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は９０％超が試薬−細胞複合体である、細胞培養物に関する。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態において、前記割合は、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。幾つかの実施形態において、試薬−細胞複合体は、ＮＣＡＭ又はＳＹＰと結合した１つ又は複数の内分泌前駆細胞又は未熟膵島ホルモン発現細胞を含む。

【0620】

幾つかの実施形態において、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、及び／又はＮＫＸ２．２の発現が、前記した試薬−細胞複合体中に存在する内分泌前駆細胞で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＳＹＰ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、ＰＡＸ６、ＭＡＦＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ及び／又はＣＨＧＡの発現と比較して増強される。好ましい実施形態において、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及び／又はＰＡＸ４を発現する内分泌前駆細胞は、有意なレベル又は量のＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＳＹＰ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、ＰＡＸ６、ＭＡＦＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ及び／又はＣＨＧＡを発現しない。

【0621】

幾つかの実施形態において、ＭＡＦＢの発現は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ
１、ＮＦＭ、ＮＧＮ３及び／又はＭＡＦＡの発現に比べて前記された試薬−細胞複合体に存在する未熟膵島ホルモン発現細胞で高められる。好ましい実施形態において、ＭＡＦＢを発現する未熟膵島ホルモン発現細胞は、有意なレベル又は量のＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＮＧＮ３及び／又はＭＡＦＡを発現しない。

【0622】

本明細書に記載されるさらなる実施形態は、多能性細胞、例えば幹細胞及び試薬−細胞複合体の両方を含む、細胞培養物及び／又は細胞集団等の組成物に関する。幾つかの実施形態において、この組成物には、多能性細胞、例えば胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞も含まれる。例えば、本明細書に記載される方法を用いて、ｈＥＳＣ及び／又は胚体内胚葉細胞と、内分泌前駆細胞の試薬−細胞複合体との混合物を含む組成物を産生することができる。さらに、本明細書に記載される方法を用いて、ｈＥＳＣ、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞と、内分泌前駆細胞の試薬−細胞複合体及び／又は未熟膵島ホルモン発現細胞の試薬−細胞複合体との混合物を含む組成物を産生することができる。幾つかの実施形態において、約９５個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約５個の試薬−細胞複合体を含む組成物が提供される。他の実施形態において、約５個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約９５個の試薬−細胞複合体を含む組成物が提供される。さらに、試薬−細胞複合体細胞と多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞とを他の比率で含む組成物が考慮される。例えば、約１００００００個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の試薬−細胞複合体、約１０００００個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の試薬−細胞複合体、約１００００個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の試薬−細胞複合体、約１０００個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の試薬−細胞複合体、約５００個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の試薬−細胞複合体、約１００個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の試薬−細胞複合体、約１０個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の試薬−細胞複合体、約５個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の試薬−細胞複合体、約２個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１個の試薬−細胞複合体、約１個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約個の試薬−細胞複合体、約１個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約５個の試薬−細胞複合体、約１個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１０個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約２０個の試薬−細胞複合体、約１個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約５０個の試薬−細胞複合体、約１個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約個の試薬−細胞複合体、約１個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１０００個の試薬−細胞複合体、約１個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１００００個の試薬−細胞複合体、約１個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１０００００個の試薬−細胞複合体、並びに約１個の多能性細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉細胞及び／又はＰＤ
Ｘ１陽性膵臓内胚葉細胞毎に少なくとも約１００００００個の試薬−細胞複合体を含む組成物が考慮される。本発明の幾つかの実施形態において、多能性細胞はヒト多能性幹細胞である。或る特定の実施形態において、幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊又は胚の生殖隆起から誘導される。或る特定の実施形態において、多能性細胞は、胚形成期を越えて発達した多細胞構造の性腺組織又は胚組織から誘導される。

【0623】

ノギンを用いて、膵臓ホルモン発現細胞を産生する方法
あまり分化しない細胞型から膵臓ホルモン発現細胞を分化する方法が前記されている。これらの方法は、適切な分化段階で分化培地にノギンを添加することによって高めることができる。幾つかの実施形態において、ノギンによって、レチノイドを追加せずに前腸内胚葉細胞の分化を容易にすることができる。しかし、ノギンがレチノイドと併せて用いられる場合、一般的に膵臓ホルモン発現細胞の産生が増大する。ｈＥＳＣ細胞の膵臓ホルモン発現細胞への分化におけるノギンの使用を記載している特定のプロトコルが、以下の実施例１８及び実施例１９に記載される。以下の段落で、どのようにしてノギンを分化プロセスで用いることができるかの一般的な記載が与えられる。以下の開示は、前記で、及び参照により本明細書に援用されている米国特許出願で既に完全に記載された方法を組み込むことを理解するべきである。このように、これまでに既に記載された方法の工程の開示は、以下の段落に適用される。

【0624】

本発明の幾つかの実施形態には、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子を多能性ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の集団に供給し、ヒト胚体内胚葉細胞を得る工程と、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子をヒト胚体内胚葉細胞の集団に供給し、ヒト前腸内胚葉細胞を得る工程と、それからノギンをヒト前腸内胚葉細胞の集団に供給し、ヒト内分泌前駆細胞を得た後にヒト膵島ホルモン発現細胞を形成するのに十分な時間、インキュベートする工程とを含む、ヒト膵臓ホルモン発現細胞を産生する方法が含まれる。幾つかの実施形態において、ヒト膵臓ホルモン発現細胞を形成するのに十分な時間は、細胞集団におけるヒト膵臓ホルモン発現細胞の存在を検出することによって求められた。前記のように、ヒト膵臓ホルモン発現細胞は、或る特定のマーカー発現によって特徴付けられ得る。したがって、このようなマーカー発現を検出する方法、例えばＱ−ＰＣＲ又は免疫細胞化学法を用いて、膵臓ホルモン発現細胞が形成されるのに十分な大体の時間を求めることができる。幾つかの実施形態において、膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、グレリン（ＧＨＲＬ）、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、インスリン（ＩＮＳ）、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、ＩＳＬ１転写因子（ＩＳＬ１）、ＮＫＸ６転写因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）、ペアードボックス６（ＰＡＸ６）、及び膵臓特異的転写因子１ａ（ＰＴＦ１ａ）から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーが検出される。

【0625】

前記方法の幾つかの実施形態において、細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約２％〜少なくとも約９５％がヒト膵臓ホルモン発現細胞に分化する。幾つかの実施形態において、細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約９５％超がヒト膵臓ホルモン発現細胞に分化する。

【0626】

前記の方法の幾つかの実施形態において、セクレターゼ阻害剤、例えばＤＡＰＴで細胞集団を分化させる。或る特定の実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、ノギンを供給するのとほぼ同時に、又はノギンを供給した後で細胞集団に供給される。幾つかの実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、ノギンを供給する直前に供給される。例え
ば、γ−セクレターゼ阻害剤は、ノギン添加の約３日前〜約７日後に供給することができる。好ましい実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、ノギンを細胞培養物又は細胞集団に供給した約１日後〜約４日後に供給される。より好ましい実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、ノギンを細胞培養物又は細胞集団に供給した約３日後に供給される。本発明の幾つかの実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、約０．１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で細胞集団に供給される。好ましい実施形態において、γ−セクレターゼ阻害剤は、約１μＭの濃度で細胞集団に供給される。

【0627】

前記方法の他の実施形態において、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−２２又はＦＧＦ−７（ＫＧＦ）から選択される。好ましい実施形態において、供給される線維芽細胞増殖因子はＫＧＦである。このような実施形態において、ＫＧＦは、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で細胞培養物に供給される。幾つかの実施形態において、ＫＧＦは、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、分化する細胞培養物に供給され得る。前記方法の幾つかの実施形態において、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子は、線維芽細胞増殖因子受容体ＩＩＩｂ（ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ））を刺激するか、又はそうでなければそれと相互作用する、任意の線維芽細胞増殖因子又はリガンドを含む。

【0628】

前記の方法のさらに別の実施形態において、ヘッジホッグ阻害剤は、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子を添加するのとほぼ同時に分化細胞集団に供給される。幾つかの実施形態において、ヘッジホッグ阻害剤は、線維芽細胞増殖因子を供給した直後に供給される。例えば、ヘッジホッグ阻害剤は、線維芽細胞増殖因子の添加の約２日前〜約３日後に供給することができる。好ましい実施形態において、ヘッジホッグ阻害剤は、線維芽細胞増殖因子を細胞培養物又は細胞集団に供給するのとほぼ同時に供給される。好ましい実施形態において、ヘッジホッグ阻害剤はＫＡＡＤ−シクロパミンである。

【0629】

好ましい実施形態において、ヘッジホッグ阻害剤は、約０．０１μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で細胞培養物に供給される。幾つかの実施形態において、ヘッジホッグ阻害剤は、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２
．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ、又は少なくとも約５０μＭの濃度で供給され得る。

【0630】

ｈＥＳＣを胚体内胚葉細胞に分化させる工程において、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの増殖因子が細胞集団に供給される。幾つかの実施形態において、ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、及びそれらの組合せから成る群から選択される。好ましい実施形態において、ＴＧＦ−βスーパーファミリーはアクチビンＡを含む。幾つかの実施形態において、アクチビンＡは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で前記ｈＥＳＣに供給される。幾つかの実施形態において、アクチビンＡは、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞集団に供給される。

【0631】

前記方法の幾つかの実施形態において、ｈＥＳＣには、ウイングレス型ＭＭＴＶ組込部位ファミリー成員３Ａ（Ｗｎｔ３Ａ）も供給される。好ましい実施形態において、Ｗｎｔ３Ａは、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で供給される。幾つかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａは、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞集団に供給される。

【0632】

前記の方法の幾つかの実施形態は、胚体内胚葉細胞の前記細胞集団に存在し得るＴＧＦ−βスーパーファミリーの任意の増殖因子を回収することを含む。このような実施形態において、ＴＧＦ−βスーパーファミリー増殖因子は、細胞培養物に外から供給されたＴＧＦ−βスーパーファミリー増殖因子である。すなわち、回収されるＴＧＦ−βスーパーファミリー増殖因子は、当業者によって調整されるような培地の基礎成分として存在するＴＧＦ−βスーパーファミリー増殖因子ではない。

【0633】

前記の方法のさらなる実施形態は、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子を供給するのとほぼ同時に、又は供給した後で、レチノイドを細胞集団に供給することを含む。或る特定の実施形態において、レチノイドは、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子を供給するのとほぼ同時に、又は少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子を供給した後で、細胞集団に供給される。幾つかの実施形態において、レチノイドは、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子を供給する直前に供給される。他の実施形態において、レチノイドは、ノギンを供給するのとほぼ同時に細胞集団に供給される。例えば、レチノイドは、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子の添加の約３日前〜約７日後に供給することができる。好ましい実施形態において、レチノイドは、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子を細胞培養物又は細胞集団に供給した約１日後〜約４日後に供給される。より好ましい実施形態において、レチノイドは、少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子を細胞培養物又は細胞集団に供給した約３日後に供給される。

【0634】

前記方法の幾つかの実施形態において、レチノイドは、約０．０１μＭ〜約１００μＭの範囲の濃度で、分化する細胞集団に供給される。幾つかの実施形態において、レチノイ
ドは、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約７５μＭ、又は少なくとも約１００μＭの濃度で供給される。好ましい実施形態において、レチノイドはレチノールである。このような実施形態において、レチノールは、Ｂ２７サプリメントに含まれるものであり得る。さらに好ましい実施形態において、レチノイドはレチノイン酸である。

【0635】

前記方法の幾つかの実施形態において、ｈＥＳＣは、約２％未満の血清を含む培地中でヒト胚体内胚葉細胞に分化する。例えば、例えば幾つかの分化プロセスにおいて、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、又は約２％（ｖ／ｖ）未満であり得る。幾つかの実施形態において、分化は、血清非存在下、並びにインスリン及び／又はインスリン様増殖因子非存在下で開始される。分化の間、血清濃度は、適切な細胞生存を促進するために徐々に増加し得る。好ましい実施形態において、ｈＥＳＣの胚体内胚葉細胞への分化は、血清非存在下、及びインスリン又はインスリン様増殖因子を含む任意のサプリメント非存在下で開始される。血清の非存在及びインスリン又はインスリン様増殖因子を含むサプリメントの非存在は、約１日〜約２日間維持され、その後分化の間中、血清を分化細胞培養物に徐々に添加する。好ましい実施形態において、血清の濃度は、分化の間、約２％を超えない。

【0636】

前記の方法に関して、ｈＥＳＣは、桑実胚、胚のＩＣＭ及び胚の生殖隆起から成る群から選択される組織から誘導され得る。好ましい実施形態において、ｈＥＳＣは着床前胚から誘導される。

【0637】

ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を使用しないｈＥＳＣの内分泌前駆細胞及び膵臓ホルモン発現細胞への分化
本明細書に挙げられる本発明の幾つかの実施形態は、任意の発達段階の間の相当期間、相当量の酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養及び／又は分化しなかったと本明細書に記載されたようなｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物及びｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団に関する。酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養及び／又は分化する細胞に関して、「相当量」は、酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、細胞培養物又は細胞集団におけるヒト細胞の約半数でヒストンデアセチラーゼへの阻害効果を媒介するのに十分な任意の量を意味する。酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養及び／又は分化する細胞に関して、「相当期間」は、酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、細胞培養物又は細胞集団におけるヒト細胞の約半数でヒストンデアセチラーゼへの阻害効果を媒介するのに十分な任意の期間を意味する。したがって、酪酸ナトリウム又は他のヒ
ストンデアセチラーゼ阻害剤の濃度、及びそれが細胞培養物に存在する時間の両方が、阻害効果の程度に影響を与える。例えば相当量は、約１ｎＭ〜約１００ｍＭの範囲であり得る。幾つかの実施形態において、相当量は、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約７５ｎＭ、約１００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約１μＭ、約１０μＭ、約２５μＭ、約５０μＭ、約７５μＭ、約１００μＭ、約２５０μＭ、約５００μＭ、約７５０μＭ、約１ｍＭ、約１０ｍＭ、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、又は約１００ｍＭ超である。幾つかの実施形態において、相当期間は、約１０分、約３０分、約１時間、約２時間、約４時間、約８時間、約１２時間、約１６時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、又は約５日超であり得る。例えば、酪酸ナトリウム又は別のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養及び／又は分化しなかった細胞型としては、ｈＥＳＣ、ヒト胚体内胚葉細胞、ヒト前腸内胚葉細胞、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ヒト内分泌前駆細胞、ヒト未熟膵臓ホルモン発現細胞及び成熟膵臓ホルモン発現細胞が挙げられる。本発明の幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物及びｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団が、それらの発達段階の間の１つ又は複数の時点で酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の完全な非存在下で培養及び／又は分化される。

【0638】

本明細書に記載されるさらなる実施形態には、相当量の酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の非存在下で１つ又は複数の前記の細胞培養物又は細胞集団を産生する方法が含まれる。このような実施形態において、相当量の外因性の酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、分化プロセスの任意の段階間の任意の相当期間、細胞培養物又は細胞集団の細胞に供給されない。前記のように、「相当量」は、細胞培養物又は細胞集団におけるヒト細胞の約半数でヒストンデアセチラーゼへの阻害効果を媒介するのに十分な酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の任意の量を意味する。また前記のように、「相当期間」は、酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、細胞培養物又は細胞集団におけるヒト細胞の約半数でヒストンデアセチラーゼへの阻害効果を媒介するのに十分な任意の期間を意味する。或る特定の実施形態において、本明細書に記載される分化方法には、相当量の酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の非存在下で、ｈＥＳＣ、ヒト胚体内胚葉細胞、ヒト前腸内胚葉細胞、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ヒト内分泌前駆細胞、ヒト未熟膵臓ホルモン発現細胞及び成熟膵臓ホルモン発現細胞を分化することが含まれる。本発明の幾つかの実施形態において、ｈＥＳＣ、ヒト胚体内胚葉細胞、ヒト前腸内胚葉細胞、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ヒト内分泌前駆細胞、ヒト未熟膵臓ホルモン発現細胞及び成熟膵臓ホルモン発現細胞が、酪酸ナトリウム又は他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の完全な非存在下で培養及び／又は分化される。

【0639】

非組み換えｈＥＳＣの内分泌前駆細胞及び膵臓ホルモン発現細胞への分化
本発明のさらなる実施形態は、ｈＥＳＣ、ヒト胚体内胚葉細胞、ヒト前腸内胚葉細胞、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ヒト内分泌前駆細胞、ヒト未熟膵臓ホルモン発現細胞及び成熟膵臓ホルモン発現細胞から選択される１つ又は複数の細胞型を含む非組み換え細胞培養物及び非組み換え細胞集団に関する。非組み換え細胞培養物及び非組み換え細胞集団の幾つかの実施形態において、少なくとも１つの細胞型が非組み換え細胞型である。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団における全ての細胞型が非組み換え細胞型である。「非組み換え」とは、細胞が、１つ又は複数の外因性の遺伝子産物、或いは１つ又は複数の外因性の遺伝子、特に選択及び／又はスクリーニングに用いることができる外因性のマーカー遺伝子を含む（が、これらに限定されない）外因性のマーカー遺伝子の機能部分の産物を発現するように遺伝子操作されていないことを意味する。外因性のマーカー遺伝子の具体的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、励起緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ルシフェラーゼ及び細胞選別に有用な任意の他のマーカーをコード
する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的な外因性のマーカー遺伝子には、抗生物質抵抗性遺伝子が含まれる。幾つかの実施形態において、非組み換え細胞には、外因性又は外来の遺伝子を含有するように遺伝子操作されなかった細胞が含まれる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される細胞培養物及び細胞集団は核型的に（kaiyotypically）正常である。

【0640】

本発明のさらなる実施形態は、ｈＥＳＣ、ヒト胚体内胚葉細胞、ヒト前腸内胚葉細胞、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、ヒト内分泌前駆細胞、ヒト未熟膵臓ホルモン発現細胞及び成熟膵臓ホルモン発現細胞から選択される１つ又は複数の細胞型を含む非組み換え細胞培養物及び非組み換え細胞集団を産生する方法に関する。このような実施形態において、細胞培養物又は細胞集団における１つ又は複数の細胞型は非組み換え細胞型である。好ましい実施形態において、細胞培養物又は細胞集団における全ての細胞型が非組み換え細胞型である。本明細書に記載される方法の特に好ましい実施形態において、非組み換えｈＥＳＣは、胚体内胚葉細胞に、及びさらにホルモン発現細胞に分化し、それによって非組み換えホルモン発現細胞を産生する。或る特定の実施形態において、本明細書に記載される方法には、外因性又は外来のマーカー遺伝子産物の発現又は非発現に基づき細胞を選別する工程が含まれない。マーカー遺伝子産物の例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、励起緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ルシフェラーゼ及び細胞選別に有用な任意の他のマーカーである。幾つかの実施形態において、外因性又は外来のマーカータンパク質をコードする遺伝子を含有するように遺伝子操作されなかった、細胞培養物又は細胞集団における非組み換え細胞は、胚体内胚葉細胞、及びさらにホルモン発現細胞に分化する。幾つかの実施形態において、非組み換え細胞には、外因性又は外来の遺伝子を含有するように遺伝子操作されなかった細胞が含まれる。幾つかの実施形態において、核型的に正常な細胞は、胚体内胚葉細胞、及びさらにホルモン発現細胞に分化し、それによって非組み換えホルモン発現細胞を産生する。

【0641】

本発明を包括的に記載してきたが、例示のみを目的として本明細書中に提供され、限定することを意図しない、或る特定の実施例を参照することによりさらなる理解が達成され得る。

【実施例】

【0642】

以下の実施例の多くにより、多能性ヒト細胞の使用について説明する。多能性ヒト細胞を産生する方法は、当該技術分野において既知であり、多数の科学出版物、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，６７０，３７２号、同第５，６９０，９２６号、同第６，０９０，６２２号、同第６，２００，８０６号、及び同第６，２５１，６７１号、並びに米国特許出願公開第２００４／０２２９３５０号（これらの開示内容全体が、参照により本明細書中に援用される）に記載されている。

【0643】

＜実施例１＞
ヒトＥＳ細胞
膵島ホルモン発現細胞の発生についての研究のために、本発明者らは、多能性であり、且つ正常核型を維持しながら培養中に外見上無限に分裂し得るヒト胚性幹細胞を利用した。単離のための免疫学的方法又は機械的方法のいずれかを使用して、５日齢胚内部細胞塊からＥＳ細胞を誘導した。特に、ヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５を、患者によるインフォームドコンセント後に、体外受精周期からの過剰凍結胚から誘導した。解凍の直後に、ＥＳ培地（ＤＭＥＭ、２０％ ＦＢＳ、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、及びＦＧＦ２）中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上で孵化胚盤胞を平板培養した。胚が培養皿に接着し、約２週間後、未分化ｈＥＳＣの領域を、ＭＥＦを含む新たな皿に移した。機械的に切断し、ディスパーゼで簡単に消化した後、細胞クラスターを機械的に採取し出し、洗浄し、再度平板培養することによって移動を達成した。誘導以来、ｈＥＳＣｙ
ｔ−２５を１００回にわたって連続継代した。本発明者らは、内分泌前駆細胞、及びその後膵島ホルモン発現細胞を産生するための出発材料として、ｈＥＳＣｙｔ−２５ヒト胚性幹細胞株を利用した。さらに、本発明者らは、本発明者ら及び他者の両方によって開発された他のｈＥＳＣ株、例えば、限定するものではないが、Ｃｙｔ−４９、Ｃｙｔ−２０３、ＢＧ０１、ＢＧ０２、及びＢＧ０３を使用した。

【0644】

幹細胞又は他の多能性細胞が本明細書中に記載される分化手順のための出発材料としても使用され得ることは当業者によって理解される。例えば、当該技術分野において既知の方法によって単離され得る胚性生殖隆起から得られる細胞は、多能性細胞の出発材料として使用され得る。

【0645】

＜実施例２＞
ｈＥＳＣｙｔ−２５特性化
ヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、培養中１８ヶ月にわたって、正常な形態特性、核型特性、増殖特性及び自己再生特性を維持した。この細胞株は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ−４及びＴＲＡ−１−６０抗原（これらはすべて、未分化ｈＥＳＣに特徴的である）に対して強い免疫反応性を示し、且つアルカリホスファターゼ活性、及び他のｈＥＳＣ株化細胞と同一の形態を示す。さらに、ヒト幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、懸濁液中で培養される場合、胚様体（ＥＢ）も容易に形成する。その多能性の実証として、ｈＥＳＣｙＴ−２５は、３つの主要胚葉を表す各種細胞型に分化する。ＺＩＣ１に関するＱ−ＰＣＲ、並びにネスチン及びより成熟した神経細胞マーカーに関する免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって外胚葉産生を実証した。β−ＩＩＩチューブリンに関する免疫細胞化学染色を、初期ニューロンに特徴的な伸長細胞のクラスターにおいて観察した。予め、レチノイン酸で懸濁液中のＥＢを処理して、多能性幹細胞の胚体外系統である臓側内胚葉（ＶＥ）への分化を誘導した。処理細胞は、５４時間処理することによって、高レベルのα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＳＯＸ７（ＶＥの２つのマーカー）を発現した。単層中で分化した細胞は、免疫細胞化学染色によって実証されるように、散在性パッチ中でＡＦＰを発現した。以下に記載するように、ｈＥＳＣｙＴ−２５細胞株は、ＡＦＰ発現がない場合のＳＯＸ１７に関するリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）及び免疫細胞化学によって立証されるように、胚体内胚葉も形成可能であった。中胚葉への分化を実証するために、分化するＥＢを、幾つかの時点でのブラキュリ遺伝子発現に関して分析した。ブラキュリ発現は、実験を通して漸進的に増加した。前記に鑑みて、３つの胚葉を表す細胞を形成する能力によって示されるように、ｈＥＳＣｙＴ−２５株は多能性である。

【0646】

＜実施例３＞
膵臓ホルモンを発現する細胞の産生における中間体としての胚体内胚葉細胞
ヒト胚性幹細胞を４工程のプロトコルによって２１日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程に関しては３つの異なる条件を使用して、その後はすべてのプレートに同一の処理を施した。第１工程は、下記条件のうち１つの下での５日間の分化を含んだ：ｉ）アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005））、ｉｉ）外
因性増殖因子を含まない２％ ＦＢＳ（それにより中胚葉及び胚体外内胚葉を産生する）、又はｉｉｉ）フォリスタチン（５０ｎｇ／ｍｌ）及びノギン（１００ｎｇ／ｍｌ）（それにより神経外胚葉を産生する）。第２工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（１μＭ）を含有する、２％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中での３日間の分化を含んだ。第３工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（１μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）及びＤＡＰＴ（１μＭ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での５日間の分化を含んだ。第４工程は、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、エキセンジン４（４０ｎｇ／ｍＬ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ−２５ｎｇ／ｍＬ）及びインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−１（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有する
、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭ中での８日間の分化から成っていた。複製試料を複数の時点で各プレートから採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的ＰＣＲによって分析した。

【0647】

図２Ａ〜図２Ｆで示されるように、分化５日目で、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４の発現の上昇によって示されるように、アクチビンＡ処理によって、胚体内胚葉（ＤＥ）が強く産生された。因子（２ＮＦ）なしの処理及びホリスタチン／ノギン処理でのＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４の発現の相対的欠失によって、ほとんど又は少しのＤＥも、これらの条件下では産生されないことが示された。これに対して、因子なしの処理によって、胚体外内胚葉のマーカーであるＳＯＸ７、及び様々な中胚葉集団で発現されるＩＳＬ１の強い発現が誘導された。ホリスタチン及びノギンによる処理によって神経外肺葉への強い分化を示す、ＳＯＸ１及びＰＡＸ６の強い発現が誘導された。図２Ｇ〜図２Ｎで示されるように、本発明者らは、膵臓内胚葉マーカーＰＤＸ１、並びに膵臓内分泌転写因子（ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１）及び内分泌ホルモンの発現がＤＥの産生の後に起こることを見出した。これらの細胞の効率的な産生は、ＤＥの効率的な産生に対応している。胚体外内胚葉／中胚葉又は初期神経外胚葉の系統がＤＥの代わりに誘導される場合、膵臓内胚葉又は膵臓内分泌マーカーは、ＤＥが濃縮された培養物に適用されると膵島ホルモン遺伝子の発現が生じる同一の培養条件による処理の後にこれらの細胞ではあまり発現しない。しかし、ｈＥＳＣのＤＥへの前特異化（pre-specification）は、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３、インス
リン、及びグルカゴンの発現を特徴とする成熟膵臓表現型を達成するのに十分である。

【0648】

＜実施例４＞
インスリン／ＩＧＦシグナル伝達はＰＤＸ１タンパク質の翻訳を促進する
ヒト胚性幹細胞を、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ培地中で５日間分化させた。ＦＢＳ濃度は、０％（最初の２４時間）、続く０．２％（次の２４時間）から、その後２％（残りの３日間）へと変化した。次の４日間、プレートを異なる培地条件に付した。ｉ）２％ ＦＢＳ及びアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ、ｉｉ）２％ ＦＢＳ、アクチビンＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びレチノイン酸を含むＲＰＭＩ、ｉｉｉ）０．２％ ＦＢＳ及びＢ２７サプリメント（１：１００）、アクチビンＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びレチノイン酸を含むＣＭＲＬ、並びにｉｖ）０．２％ ＦＢＳ及びＢ２７サプリメント（１：１００）、アクチビンＡ（２５ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸及びエキセンジン（４０ｎｇ／ｍｌ）を含むＣＭＲＬのいずれかの中でインキュベートした。レチノイン酸の濃度は、２μＭ（４８時間）、続く１μＭ（２４時間）から、０．２μＭ（最後の２４時間）へと変化した。７、８及び９日目に、タンパク質及びｍＲＮＡの分析用に細胞を回収した。

【0649】

ＰＤＸ１タンパク質の発現を促進する別の因子は、インスリン（例えば、約０．２〜２０μｇ／ｍｌの濃度）又はインスリン様増殖因子（例えば、約１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度）である。十分なインスリンシグナル伝達なしにＰＤＸ１のｍＲＮＡは発現したが、ＰＤＸ１タンパク質への有意な翻訳はなかった（図４Ａ、図４Ｂ）。基本培地は、２％ ＦＢＳを含むか又は含まない、ＲＰＭＩ、ＣＭＲＬ、ＯｐｔｉＭＥＭ、又はＤＭＥＭであり得る。基本培地に十分なインスリン／ＩＧＦ及びＦＧＦ１０を補充すると、ＰＤＸ１タンパク質が発現する。

【0650】

＜実施例５＞
レチノイン酸はｈＥＳＣの膵臓インスリン発現表現型への分化を促進する
ヒト胚性幹細胞を４工程のプロトコルによって１７日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程は、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005））中での５日間の分化を含んだ。第２工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＫ
ＡＡＤ−シクロパミン（１μＭ）を含有する、２％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中での２日間の分化、その後ＤＡＰＴ（１μＭ）も含有させてのさらに２日の分化を含んだ。第３工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（１μＭ）、ＤＡＰＴ（１μＭ）を含有し、且つレチノイン酸（１μＭ）添加又は無添加のいずれかで、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での５日間の分化を含んだ。第４工程は、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、エキセンジン４（５０ｎｇ／ｍＬ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ
２５ｎｇ／ｍＬ）及びインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−１（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での４日間の分化を含んだ。複製試料を複数の時点で各プレートから採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的ＰＣＲによって分析した。

【0651】

この初期前腸内胚葉は、レチノイン酸の適用によってさらに特異化され、膵臓ホルモン産生細胞の産生を促進した。重要なことは、レチノイン酸を（約０．１μＭ〜５μＭの濃度で）少なくとも約１日間適用させなければ、膵臓内分泌ホルモンであるインスリンは発現しなかった（図５Ａ〜図５Ｈを参照されたい）。このことは、背側膵芽がインスリン産生β細胞の産生に対して優勢であることを強く示唆している。この結果は、インスリン及びグルカゴンが腹側芽及び背側芽の両方で発現するラット及びマウスと正反対である。この膵臓内胚葉段階は、ＰＤＸ１、ＨＢ９及びＨＮＦ６／ｏｎｅｃｕｔ２のマーカーの発現を特徴とする。

【0652】

＜実施例６＞
γ−セクレターゼ阻害は内分泌前駆細胞及びホルモン発現細胞の効率的な誘導を促進する
ヒト胚性幹細胞を５工程のプロトコルによって１９日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程は、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005））中での５日間の分化を含んだ。第２工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＫ
ＡＡＤ−シクロパミン（０．５μＭ）を含有する、２％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中での２日間の分化を含んだ。第３工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）及びレチノイン酸（１μＭ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での４日間の分化を含んだ。第４工程は、エキセンジン４（４０ｎｇ／ｍＬ）を含有し、且つ各種濃度のγ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（０μＭ、１μＭ、３μＭ、又は１０μＭ）を含む、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬでの２日間の処理を含んだ。最終工程は、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、エキセンジン４（４０ｎｇ／ｍＬ）及びインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−１（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭ中での６日間の分化を含んだ。複製試料を各プレートから採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的ＰＣＲによって分析した。

【0653】

前記の因子及び培地条件の一時的な適用に従った高レベルのＰＤＸ１タンパク質の産生後、内分泌ホルモン産生に対する最終工程は、γ−セクレターゼ阻害剤の添加であった。γ−セクレターゼ阻害剤は、転写因子ＮＧＮ３の一過的な誘導を促進した。γ−セクレターゼ阻害剤は、ノッチ細胞内ドメインの酵素放出を効率的に阻害し、したがってノッチ経路活性の阻害剤（ノッチ阻害剤（inbitior））としても機能することが知られている。ＫＤの範囲における任意の標準的なγ−セクレターゼ阻害剤の適用によって、ＨＥＳ１等のノッチ標的遺伝子の発現の阻害によって測定されるように、ノッチが阻害される。図６Ａ〜図６Ｆで示されるように、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、又は主な膵臓転写因子はＤＡＰＴの非存在下でごくわずかしか又は全く産生されなかった。レチノイン酸の分化工程後、又は分化工程中、短期間でγ−セクレターゼ阻害又はノッチ阻害を与えることが有益である。

【0654】

＜実施例７＞
胚体内胚葉は内分泌ホルモン発現を達成するために一連の連続工程を通じて分化し得る
ヒト胚性幹細胞を４工程又は５工程のプロトコルによって１６日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程は、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005））中での３日間の分化を含んだ。第２工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍ
Ｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）を含有する、２％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中での３日間の分化を含んだ。４工程のプロトコルにおいて、第３工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）及びＤＡＰＴ（１μＭ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での４日間の分化を含んだ。５工程のプロトコルでは、この４日の期間を、同一基本培地中での２つの別個の処理に分けた。２日間は、培地はＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）及びレチノイン酸（２μＭ）を含有した。続く２日間は、ＦＧＦ１０を除去し、γ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（１μＭ）を添加した。両方のプロトコルの最終工程は、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、エキセンジン４（４０ｎｇ／ｍＬ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ ２５ｎｇ／ｍＬ）及びインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−１（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭ中での６日間の分化を含んだ。複製試料を複数の時点で各プレートから採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的ＰＣＲによって分析した。

【0655】

図１で示されるように、膵臓ホルモン産生細胞の産生を引き起こす転写因子の外観の連続的な不変パターンをもたらす時間的に連続した遺伝子発現が存在していた。図３Ａ〜図３Ｌで示されるように、時間的に動的な遺伝子発現によって、ｈＥＳＣが、ｉｎ ｖｉｖｏで膵臓の発達中に発生する同じ中間体を経て移行することが示された。低ＦＢＳでアクチビンを適用する第１工程は、ＤＥを強く産生することがこれまでに特徴付けられている（D 'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541,（2005））。工程２中
の処理の結果、ＤＥ形成後にＦＯＸＡ１及びＨＮＦ１ｂの発現が有意に増大した（図３Ａ、図３Ｂ）。この工程（日数２〜４日）は、内胚葉の後方化（posteriorization）を示すことが多く、アクチビンシグナル伝達の除去によってさらに促進された。さらに、ＦＧＦ１０の添加（５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ）は、前腸細胞を膵臓ドメインにさらに特異化したＫＡＡＤ−シクロパミンの添加（０．１μＭ〜２μＭのソニックヘッジホッグ阻害剤）と同時が有益であった。分化の次の工程は、レチノイン酸（ＲＡ）の適用を伴い、ＨＮＦ６及びＰＤＸ１の発現が強く増大した（図３Ｃ、図３Ｄ）。ＰＤＸ１発現膵臓前駆体の内分泌系統へのさらなる分化を誘起するために、ノッチシグナル伝達を阻害することが有益であった。このことは、γ−セクレターゼ阻害剤の適用によって達成された。この種類の薬剤は、ノッチ分子の膜内切断を阻害し、それによって活性化ノッチ細胞内ドメインの放出が妨げられる。ＲＡ添加の終結日、又はＲＡ回収の直後でのγ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴの２〜４日の適用によって、ＮＧＮ３及びＰＡＸ４発現が一過的に誘導された（図３Ｅ、図３Ｆ）。これらの２つの遺伝子は内分泌前駆細胞では発現したが、成熟内分泌ホルモン産生細胞では発現しなかった。転写因子ＮＫＸ２．２及びＮＫＸ６．１、並びに膵臓ホルモンの発現は、内分泌前駆細胞段階の誘導の後に起こった（図３Ｇ〜図３Ｌ）。

【0656】

＜実施例８＞
膵臓内分泌ホルモンの発現
ヒト胚性幹細胞は、実施例３及び実施例４で示されたように、この実験で分化し、それから免疫細胞化学法で処理して膵島抗原を検出した。室温で１５分間、ＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで培養物を固定し、ＴＢＳで数回洗浄して、ＴＢＳ＋＋（３％正常なロバ血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories）と０．２５％（ｗ／ｖ）
トリトンＸ−１００（Sigma）とを含有するＴＢＳ）で３０分間遮断した。一次抗体及び
二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）をＴＢＳ＋＋中で希釈し、それぞれ
４℃で２４時間又は室温で２時間、インキュベートした。

【0657】

図７Ａ〜図７Ｄで示されるように、インスリン、グルカゴン及びソマトスタチンは、パッチ内の個々の細胞又は単離された群で、及び２つ以上のホルモンを発現する細胞でも発現された。図８Ａ〜図８Ｄで示されるように、ｈＥＳＣからの膵島ホルモン発現細胞への連続分化（ＥＳ／ＭＥ／ＤＥ／ＦＥ／膵臓Ｅ／膵臓内分泌細胞／膵島ホルモン）後に、インスリン、グルカゴン及びソマトスタチン細胞が個々に産生された。さらに、図８Ｄで示されるように、二重及び三重に標識したホルモン含有細胞も産生された。ヒト膵臓の初期の胎児発達中、初めに複数のホルモンを産生する細胞が豊富に存在し、これは時間とともに単一のホルモンを産生する細胞と分離される。本明細書に記載される方法によって産生された典型的な細胞クラスターにおいて、本発明者らは、約３２％インスリン、約２０％ソマトスタチン、約１０％グルカゴン及び約３８％二重陽性細胞の比で、単一、二重及び三重の陽性細胞を同時に観察した。

【0658】

＜実施例９＞
Ｃ−ペプチド／インスリン放出及びグルコース応答性の（stimulated）Ｃ−ペプチド／インスリン分泌（ＧＳＩＳ）
ヒト胚性幹細胞は、初めにＤＥ産生のために、及び最終的には膵島ホルモン発現のために実施例３に記載されたように分化した。細胞には毎日新しい培地を供給し、培地のサンプルは、連日、分化の工程４後にプレートから回収した。これらの培地サンプルにおけるＣ−ペプチドのレベルをＥＬＩＳＡで測定した（図９Ａ、図９Ｂを参照されたい）。

【0659】

ヒト胚性幹細胞は、実施例４に記載されたように分化した。２２日目に、培地をエキセンジン４（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有する１０％ＦＢＳを有するＣＭＲＬに変え、１日おきに交換した。２６日目に、グルコース刺激アッセイを以下の通りに行った。２時間、細胞を１．６ｍＭのグルコース（ｇ５０）を含有する培地に置き、その後培地サンプルを回収した。培地を１６ｍＭのグルコース（ｇ４００）を含有する新しい培地に交換し、２時間超インキュベートさせて、その後サンプルを回収した。それぞれのプレートから二重のサンプルも採取し、リアルタイム定量的ＰＣＲによって遺伝子発現を解析した（図１０Ａ、図１０Ｂを参照されたい）。

【0660】

機能の証明として、膵臓β細胞は、成熟インスリンを合成、貯蔵及び放出する必要がある。インスリンは、初めにプロインスリンとして合成され、その後ジスルフィド結合を折り畳まれる。ゴルジ体内で折り畳まれたプロインスリン分子が、Ｃ（結合）−ペプチドをＡ鎖とＢ鎖とを結び付けたジスルフィドから解離させるプロホルモン変換酵素によって特異的に切断される。成熟インスリンが、Ｃ−ペプチドとともに（Ｚｎと錯体化して）結晶状態で保存され、１：１のモル比で解離した。グルコースレベルの上昇に曝されると、原形質膜との顆粒融合を介して、Ｃａ^２＋媒介性のインスリン及びＣ−ペプチドの放出が引き起こされる。

【0661】

図９Ａ、図９Ｂで示されるように、インスリンの伝達がＱＰＣＲによって確実に示された１日後に、Ｃ−ペプチド／インスリンをＥＬＩＳＡで測定することができる。Ｃ−ペプチドのレベルは、培養物中で経時的に増大し、インスリンのｍＲＮＡが停滞した直後に停滞した。図１０Ａ、図１０Ｂでは、１４個の様々な条件が、インスリン産生に関して評価された。ＱＰＣＲによってインスリン遺伝子の発現が測定可能であった条件２〜４及び１３はＧＳＩＳ（グルコース応答性インスリン分泌）も有していた。これらのデータによって、真の（bona fide）ＧＳＩＳがこれらの細胞で起こり、これらのｈＥＳＣ由来膵臓イ
ンスリン細胞が機能的であるという主張が強く示唆されている。

【0662】

＜実施例１０＞
さらなるヒト胚性幹細胞株の膵島ホルモン発現細胞への分化
２つのさらなるヒト胚性幹細胞株を５工程のプロトコルによって１５日間又は１６日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程は、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005））での３日間の分化を含んだ。第２工程は、ＦＧＦ１
０（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．５μＭ）を含有する、２％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中での３日間の分化を含んだ。第３工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．５μＭ）及びレチノイン酸（２μＭ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での３日間の分化を含んだ。第４工程は、ＤＡＰＴ（１μＭ）及びエキセンジン４（４０ｎｇ／ｍＬ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭ（ＢＧ０２）又はＣＭＲＬ（ＢＧ０１）中での３日間の分化を含んだ。第５工程は、エキセンジン４（４０ｎｇ／ｍＬ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ（ＢＧ０２）又はＤＭＥＭ（ＢＧ０１）中での４日間の分化（ＢＧ０２）又は５日間の分化（ＢＧ０１）を含んだ。複製試料を複数の時点で各プレートから採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的ＰＣＲによって分析した。

【0663】

図１１で示されるように、この分化プロトコルによって、インスリン発現膵島細胞の産生の途中で細胞中間体を経た非常に類似した移行が生じた。工程３中（９日目）、レチノイン酸の適用によってＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉が初めに誘導された。ＮＧＮ３を発現する内分泌前駆体は、１２日目を最大とするノッチシグナル伝達阻害の結果として、工程４中で産生した。続いて、これらの内分泌前駆体が、１２〜１６日目でのインスリン発現の増大によって示されるように、ホルモン発現表現型にさらに分化したので、ＮＧＮ３レベルは低下した。この分化プロトコル及び類似の分化プロトコルは、ｈＥＳＣ株ＢＧ０３、Ｃｙｔ−２５、及びＣｙｔ−４９ＥＳＣ株にも適用されている。所定の分化プロトコルの有効性に関して、細胞株間で量的差異が存在していたが、全ての細胞株は質的に同じ細胞移行を示し、最終的にホルモン発現細胞が得られた。

【0664】

＜実施例１１＞
分化条件の比較
本発明者らは、ｈＥＳＣから膵島ホルモン発現細胞を産生するのに最小限十分であり得る中核となる分化条件を明らかにしている。最も単純な形式では、分化方法は、ＴＧＦβ増殖因子をｈＥＳＣに適用し、胚体内胚葉の分化を誘導した後（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541, （2005））、内胚葉細胞においてレチノイドシグ
ナル伝達を活性化する、適用することを含んでいた。この中核となる条件を構築する際、様々な他の増殖因子が外因的に添加され、ｈＥＳＣとインスリン発現細胞との間の１つ又は複数の工程で分化の有効性が増大した。表２は、中核となる条件（処理番号１）、及びホルモン発現膵島細胞の産生が増大した様々な修飾を記載している。

【0665】

ヒト胚性幹細胞株を５工程のプロトコルによって１７日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程は、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005））での３日間の分化を含んだ。第２工程は、以下のうち１つを含有する、２％ Ｆ
ＢＳを含むＲＰＭＩ中での３日間の分化を含んだ：（ａ）アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）（処理ｉ）、（ｂ）外因性増殖因子なし（処理ｉｉ）又は（ｃ）ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．５μＭ）（処理ｉｉｉ及び処理ｉｖ）。第３工程は、（ａ）レチノイン酸（２μＭ）（処理ｉ〜処理ｉｉｉ）又は（ｂ）レチノイン酸（２μＭ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．５μＭ）（処理ｉｖ）のいずれかを含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での３日間の分化を含んだ。
第４工程及び第５工程は、すべての条件に関して同一であった（処理ｉ〜処理ｉｖ）。第４工程は、ＤＡＰＴ（１μＭ）及びエキセンジン４（４０ｎｇ／ｍＬ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での２日間の分化を含んだ。第５工程は、エキセンジン４（４０ｎｇ／ｍＬ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での５日間の分化を含んだ。複製試料を複数の時点で各プレートから採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的ＰＣＲによって分析した。

【0666】

以下の表は、本実験で最低の条件（処理ｉ）に正規化した場合の１２日目のＮＧＮ３の相対的発現レベル、並びに１７日目のインスリン及びグルカゴンの相対的発現レベルを示す。

【0667】

【表2】

【0668】

工程２（処理ｉｉ）中のＴＧＦＢシグナル伝達の除去によって、ＮＧＮ３及びインスリンの発現が適度に改善され、グルカゴン発現がわずかに低減した。工程２中のアクチビンＡ非存在下でのＦＧＦ１０及びＫＡＡＤ−シクロパミンの添加によって、内分泌分化能が有意に増大した。工程３中レチノイン酸の存在下でＫＡＡＤ−シクロパミンを維持するさらなる修飾によって、レチノイン酸が単独で用いられた処理ｉｉｉに比べてその能力がさらに２倍に増大した。

【0669】

また、ヒト胚性幹細胞株を６工程のプロトコルによって１５日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程は、ｉ）アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はｉｉ）アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍＬ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005））のいずれかでの３日間の分化を含んだ。第２工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ
／ｍｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．５μＭ）を含有する、２％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中での３日間の分化を含んだ。第３工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．５μＭ）及びレチノイン酸（２μＭ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での２日間の分化を含んだ。第４工程は、レチノイン酸（２μＭ）及びＤＡＰＴ（１μＭ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での２日間の分化を含んだ。第５工程は、ＤＡＰＴ（１μＭ）及びエキセンジン４（４０ｎｇ／ｍＬ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での２日間の分化を含んだ。第６工程は、エキセンジン４（４０ｎｇ／ｍＬ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＣＭＲＬ中での３日間の分化を含んだ。複製試料を複数の時点で各プレートから採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的ＰＣＲによって分析した。

【0670】

表３は、Ｗｎｔ３ａを添加しない条件に正規化した場合の８日目及び１２日目のＰＤＸ１、１２日目のＮＧＮ３、並びに１５日目のインスリン及びグルカゴンの相対的発現レベルを示す。

【0671】

【表3】

【0672】

これらのデータは、第１工程中のＷｎｔ３ａの添加によって内分泌細胞分化が著しく増大したことを示している。

【0673】

＜実施例１２＞
ヒト胚性幹細胞に由来する未熟膵島ホルモン発現細胞の産生及び特性化
また、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を５工程のプロトコルによって２５日間分化させることにより、未熟膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程は、無血清培地中のＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）での１日間の分化、その後の０．２％ ＦＢＳを補充した培地中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005
））での２日間の分化を含んだ。第２工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）を含有する、２％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中での３日間の分化を含んだ。第３工程は、外から加えたＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びレチノイン酸（２μＭ）を含む、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭ中での２日間の分化を含んだ。第４工程は、外から加えたＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）及びＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭでの６日間の処理を含んだ。第５工程は、エキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）及びグルカゴン様ペプチド１、アミノ酸１〜３７（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭでの１１日間の処理を含んだ。

【0674】

図１６Ａ及び図１６Ｂで示される実験データに関して、ｈＥＳＣ細胞は、実施例１６で記載されるように分化した。

【0675】

２３日齢の培養物においてヒト未熟膵島ホルモン発現細胞の存在を確認するために、ＮＣＡＭ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、及びＰＡＸ６の発現に関して免疫細胞化学法で細胞を解析した。要するに、培養物は、２４℃で１５分間、ＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドに固定し、ＰＢＳ中で数回洗浄し、５％正常なロバ血清（ＮＤＳ、Jackson ImmunoResearch Laboratories）を含有するＰＢＳＴ（ＴＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）トリト
ンＸ−１００（Sigma））中で３０分間遮断した。それから、細胞をＮＣＡＭ、ＮＫＸ２
．２、ＩＮＳ及び／又はＰＡＸ６に対する一次抗体とインキュベートした。一次抗体をＰＢＳＴ／５％ＮＤＳ中で希釈した。４℃で２４時間又は２４℃で２時間、細胞を一次抗体とインキュベートさせた。それから、細胞を洗浄し、２４℃で１時間、２次抗体とインキュベートさせた。必要に応じて、マウス、ウサギ、及びモルモットに対するＣｙ３及びＣｙ５結合ロバ抗体を１：５００で用いた（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。マ
ウス、ラット、ウサギ、モルモット、及びヤギに対するＡｌｅｘａ−４８８及びＡｌｅｘａ−５５５結合ロバ抗体（Molecular Probes）を１：５００で用いた。

【0676】

図１２Ａ〜図１２Ｄで示されるように、ＮＣＡＭ及びＮＫＸ２．２は、ｈＥＳＣ由来未熟膵島ホルモン発現細胞で同時に発現した。これらのデータによって、ＮＣＡＭ結合のタイミングが、上皮からの新生内分泌細胞の「層間剥離」に対応することが示唆される。

【0677】

図１３Ａ〜図１３Ｄ及び図１４Ａ〜１４Ｆは、ＮＣＡＭ、ＰＡＸ６及びＩＮＳが、未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するように処理したｈＥＳＣ由来細胞で同時に発現したことを示している。これらのデータによって、ＮＣＡＭがｈＥＳＣ由来の未熟膵島ホルモン発現細胞に良好なマーカーであることが示される。

【0678】

図１６Ａ、図１６Ｂは、ＭＡＦＢが、ｈＥＳＣ由来の未熟膵島ホルモン発現細胞においてインスリン発現細胞と同時に発現されたことを示している。図１６Ａ、図１６Ｂで示される細胞は、以下の実施例１５で記載される分化プロトコルを用いて分化し、免疫細胞化学法のために前記のように処理された。図１６Ｃ、図１６Ｄは、１３．５週齢のヒト胎児膵臓から誘導された細胞において同じパターンのＭＡＦＢ及びＩＮＳ発現を示している。

【0679】

＜実施例１３＞
ヒト胚性幹細胞から誘導された膵臓ホルモン発現細胞によるシナプトフィジンの発現
シナプトフィジン（ＳＹＰ）は、ｉｎ ｖｉｖｏ供給源由来の内分泌細胞に対する既知のマーカーである（Protela-Gomez et al, 2004）。ｈＥＳＣからの内分泌細胞の産生を
確認するために、以下のプロトコルを用いて、ｈＥＳＣを分化し、ＳＹＰ及びＮＫＸ２．２の発現に関して免疫細胞化学法で解析した。

【0680】

ヒト胚性幹細胞を６工程のプロトコルによって１８日間分化させることにより、膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程は、無血清培地中のＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）での１日間の分化、その後の０．２％ ＦＢＳを補充した培地中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）単独での１日間の分化、及び２．０％ ＦＢＳを補充した培地中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005））での３
日間の分化を含んだ。第２工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）を含有する、２％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中での３日間の分化を含んだ。第３工程は、Ｂ２７サプリメント（１：１００）及びレチノイン酸（１μＭ）を含むＤＭＥＭ中での１日間の分化を含んだ。第４工程は、外から加えたＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）及びＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びレチノイン酸（１μＭ）を含む、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭでの６日間の処理を含んだ。第５工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭでの１日間の処理を含んだ。第６工程は、Ｂ２７サプリメント（１：１００）及びエキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭでの４日間の処理を含んだ。

【0681】

抗ＳＹＰ、抗ＮＫＸ２．２一次抗体を用いて、前記のように細胞を固定及び処理した。図１５Ａ、図１５Ｂは、ＳＹＰ及びＮＫＸ２．２の同時発現を示し、未熟膵島ホルモン発現細胞の産生を確認する。

【0682】

＜実施例１４＞
フローサイトメトリを使用する、ＮＣＡＭ標識したｈＥＳＣ由来未熟膵島ホルモン発現細胞の分析
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を５工程のプロトコルによって１８日間分化させることにより、未熟膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程は、無血清培地中のＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）での１日間の分化、その後の０．２％
ＦＢＳを補充した培地中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）での１日間の分化、及び２．０％ ＦＢＳを補充した培地中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005））での１日間の分化を含んだ。第２工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＫＡ
ＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）を含有する、２％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中での３
日間の分化を含んだ。第３工程は、外から加えたＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）及びレチノイン酸（２μＭ）を含む、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭ中での４日間の分化を含んだ。第４工程は、外から加えたＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）及びエキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭでの３日間の処理を含んだ。第５工程は、エキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭでの５日間の処理を含んだ。

【0683】

前記のように処理したｈＥＳＣ由来細胞の単一細胞懸濁液が以下の通りに得られた。細胞培養物は、製造業者の取扱説明書に従って、３７℃でトリプレット（商標）（Invitrogen、カタログ番号１２５６３−０１１）又はアクターゼ（商標）酵素（Innovative Cell Technologies、カタログ番号ＡＴ１０４）のいずれかで解離された。それから、細胞をＰＢＳ／１０％ＦＢＳで洗浄し、遠心分離で回収して、ＰＢＳ／３％ＦＢＳで再び懸濁させた。氷上で２０分間、細胞をＰＥと直接結合した抗ＮＣＡＭ抗体とインキュベートさせた後に洗浄した。製造業者の取扱説明書に従って、前記由来のＮＣＡＭ−ＰＥ染色細胞を、ＣＹＴＯＦＩＸ／ＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）固定膜浸透化緩衝液（fixation and permeability buffer）及びＰＥＲＭ／ＷＡＳＨ（商標）洗浄緩衝液（Beckton Dickinson）で処
理することによって、細胞内抗体染色を行なった。氷上で２０分間、細胞を抗インスリン（DakoCytomation、カタログ番号Ａ０５６４）、及び抗シナプトフィジン（DakoCytomation、カタログ番号Ａ００１０）の一次抗体とインキュベートさせた。細胞を洗浄し、製造業者の取扱説明書に従って、ロバ抗モルモットＣｙ５（１：１０００）（Jackson Immunoresearch 706-176-148）、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（１：２０００）（InvitrogenA21206）の二次抗体のいずれかとインキュベートした。

【0684】

フローサイトメトリは、製造業者の取扱説明書に従ってＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）蛍光活性化細胞選別器（Becton Dickinson）で行い、ＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）ＦＡＣＳ解析ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて解析した。

【0685】

図１７Ａで示されるように、記載されたように分化したｈＥＳＣ由来細胞の約１０％がＳＹＰ陽性であった。さらに、ＳＹＰ陽性ｈＥＳＣ由来細胞のほとんど全てがＮＣＡＭに関しても陽性であった。図１７Ｂは、ＮＣＡＭ陽性ｈＥＳＣ由来細胞のほとんど全てがＩＮＳに関しても陽性であったことを示している。これらのデータによって、図１２〜図１６における免疫細胞化学データが確認され、ＮＣＡＭがｈＥＳＣ由来の未熟膵島ホルモン発現細胞に有用なマーカーであることが示される。

【0686】

＜実施例１５＞
ＮＣＡＭ陽性ｈＥＳＣ由来未熟膵島ホルモン発現細胞集団の選別により、未熟膵島ホルモン発現細胞に関する集団が濃縮される
実験の第２セットにおいて、ｈＥＳＣを６工程のプロトコルによって１９日間分化させることにより、未熟膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程は、無血清培地中のＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）での１日間の分化、その後の０．２％ ＦＢＳを補充した培地中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）単独での１日間の分化、及び２．０％ ＦＢＳを補充した培地中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005））での１日間の分化を含んだ。第２工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍ
Ｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）を含有する、２％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中での３日間の分化を含んだ。第３工程は、外から加えたＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）及びレチノイン酸（２μＭ）を含む、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭ中での４日間の分化を含んだ。第４工程は、外から加えたＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）及びグルカゴン様ペプチド１、アミノ酸１〜３７（５０ｎｇ／ｍｌ
）を含む、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭでの１日間の処理を含んだ。第５工程は、外から加えたエキセンジン４（５０ｎｇ／ｍＬ）及びグルカゴン様ペプチド１、アミノ酸１〜３７（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭでの３日間の処理を含んだ。第６工程は、エキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭでの５日間の処理を含んだ。

【0687】

分化プロトコルは、特定の実験について以下のように変更された。図１９で示される実験データに関して、前記のプロトコルの工程３は、ノギンによる処理（１００ｎｇ／ｍｌ）を包含していた。工程４では、グルカゴン様ペプチド１による処理の代わりに、細胞をエキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。工程５は、グルカゴン様ペプチド１が含まれない５日間の処理を包含した。最終的に、工程６は、エキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＢ２７サプリメント（１：１００）によるＣＭＲＬ培地における４日間の処理に置き換えられた。

【0688】

図２０で示される実験データに関して、工程３はノギン（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む３日間の処理に変更された。工程４は、ニコチンアミド（１０ｍＭ）を含むように変更された。工程５は、ニコチンアミド（nicotinamed）（１０ｍＭ）を含み、エキセンジン４を
含まない４日間の処理に変更された。工程６は、グルカゴン様ペプチド１、１〜３７（５０ｎｇ／ｍｌ）及びニコチンアミド（１０ｍＭ）を含む１日間の処理を包含するように変更された。細胞の分化プロトコルは、ＣＭＲＬ培地におけるＢ２７サプリメント（１：１００）、グルカゴン様ペプチド１、１〜３７（５０ｎｇ／ｍｌ）及びニコチンアミド（１０ｍＭ）による４日間の処理を包含する第７工程も含んでいた。

【0689】

図２５で示される実験データに関して、分化プロトコルの工程３は、１μＭのレチノイン酸による処理を包含し、ノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）及びニコチンアミド（１０ｍＭ）による処理を包含するように変更された。工程４は、ニコチンアミド（１０ｍＭ）を含み、グルカゴン様ペプチド１、１〜３７による処理を除くように変更された。工程５は、ニコチンアミド（１０ｍＭ）を含み、グルカゴン様ペプチド１、１〜３７による処理を除き、エキセンジン４を除くように変更された。工程６は、１日間の処理だけで、エキセンジン４を除くように変更された。細胞分化は、Ｂ２７（１：１００）で補充されたＣＭＲＬにおける７日間の処理を包含する第７工程も含んでいた。

【0690】

前記のように、細胞の単一細胞懸濁液が得られた。それから、細胞をＰＢＳ／１０％ＦＢＳで洗浄し、遠心分離で回収して、ＰＢＳ／３％ＦＢＳで再び懸濁させた。氷上で２０分間、細胞をＰＥと直接結合した抗ＮＣＡＭ（ＮＣＡＭ１６．２、Becton Dickinson、カタログ番号３４０３６３）とインキュベートさせた。その後、細胞をＰＢＳ／３％ＦＢＳで洗浄し、遠心分離で回収して、ハンクス平衡化塩溶液（２％ＦＢＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）で再び懸濁させた。細胞をＦＡＣＳ Ａｒｉａ機器（Becton Dickinson）で選別し、１０％ＦＢＳでハンクス平衡化塩溶液中に回収した。製造業者の取扱説明書に従って、細胞の予め選別された集団又は細胞のＮＣＡＭ陽性選別された集団を、ＣＹＴＯＦＩＸ／ＣＹＴＯＰＥＲＭ（商標）固定膜浸透化緩衝液及びＰＥＲＭ／ＷＡＳＨ（商標）洗浄緩衝液（Beckton Dickinson）で処理することによって、細胞内抗体染色を行なった。細胞を
洗浄し、製造業者の取扱説明書に従って、ロバ抗モルモットＣｙ５（１：１０００）（Jackson Immunoresearch 706-176-148）、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（１：２０００）（Invitrogen A21206）の二次抗体のいずれかとインキュベートした。

【0691】

フローサイトメトリは、製造業者の取扱説明書に従ってＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）蛍光活性化細胞選別器（Becton Dickinson）で行い、ＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）ＦＡＣＳ解析ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて解析した。

【0692】

ＮＣＡＭ陽性細胞及びＮＣＡＭ陰性細胞を回収した後、ＮＣＡＭ、ＳＹＰ、ＰＡＸ６及びＣＨＧＡに関して前記のプロトコルを用いたフローサイトメトリによって再び解析した。１つの実験では、選別の後に（図１８Ａで示される）、ＮＣＡＭ陽性細胞は、逆懸滴（inverted hanging drops）において集められた。これらの細胞を回収し、ＰＡＸ６、ＩＮＳ、及びＧＣＧに関して免疫細胞化学法を用いて低温切片で解析した。１つの液滴当たり約７０００個のＮＣＡＭ陽性選別細胞が播種され、１０％ＦＢＳ、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ＨＧＦ及びＥＧＦを含有するＲＰＭＩ培地で培養し、７２時間インキュベートした。細胞集合体を回収し、前記のように免疫細胞化学解析のために処理した。

【0693】

図１８Ｂで示されるように、ＮＣＡＭに関する選別の前にフローサイトメトリによって細胞が解析された場合、細胞集団の約７％が、ＮＣＡＭ陽性及びＳＹＰ陽性であった。ＮＣＡＭ陽性細胞の選別（図１８Ａ、「左側の選別」）によって、選別されなかった細胞（図１８Ｂ）に比べて、ＮＣＡＭ陽性／ＳＹＰ陽性細胞が約４倍に濃縮した。図１８Ｄで示されるように、ＮＣＡＭ陰性細胞の集団は、ＳＹＰ陽性細胞で検出された。図１９Ａ及び図１９Ｄは、前記のように分化し、ＮＣＡＭに関してフローサイトメトリによって解析されたｈＥＳＣ由来細胞集団は、約４％のＮＣＡＭ陽性／ＳＹＰ陽性細胞及び約２％のＮＣＡＭ陽性／ＩＮＳ陽性細胞を含んでいた。図１９Ｂは、ＮＣＡＭ陽性ｈＥＳＣ由来細胞の同一集団の選別によって、ＮＣＡＭ陽性／ＳＹＰ陽性細胞が１０倍を超えて濃縮され、４７％のＮＣＡＭ陽性／ＳＹＰ陽性細胞を含む細胞集団が産生されたことを示している。図１９Ｄは、ｈＥＳＣ由来細胞の同一集団の選別によって、ＮＣＡＭ陽性／ＩＮＳ陽性細胞が８倍を超えて濃縮されたことを示している。図２０Ａ〜図２０Ｃで示されるように、前記のような分化したＮＣＡＭ陽性ｈＥＳＣ由来細胞の選別によって、７２％のＮＣＡＭ陽性／ＳＹＰ陽性細胞を含む濃縮細胞集団が生じた。

【0694】

図２５Ａ〜図２５Ｆは、独立した実験結果を示す。図２５で示されるように、ＮＣＡＭ陽性／ＳＹＰ陽性細胞は、選別前では細胞集団の約７．４％を示す。ＮＣＡＭ陽性細胞の選別によって、５倍超濃縮され、約４２％のＳＹＰ陽性の細胞集団が生じた（図２５Ａ、図２５Ｂ）。同様に、ＮＣＡＭ陽性細胞の選別によって、ＣＨＧＡ発現細胞に関して細胞集団が、細胞集団の約８．７％から細胞集団の約４２％へと濃縮された（図２５Ｃ、図２５Ｄ）。同様に、ＮＣＡＭ選別によって、ＩＮＳ発現細胞に関して細胞集団が、全細胞集団の約６％から細胞集団の約２４％へと濃縮された（図２５Ｅ、図２５Ｆ）。

【0695】

図２７Ａ〜図２７Ｄ及び図２８Ａ〜図２８Ｄは、ＮＣＡＭ陽性選別細胞の懸滴集合体が、ＰＡＸ６及びＩＮＳを同時に発現した細胞をかなりの割合含有していたことを示している。図２８Ａ〜図２８Ｄは、ＮＣＡＭ陽性選別細胞が、ＧＣＧ及びＩＮＳを同時に発現した細胞をかなりの割合含有していたことを示している。

【0696】

このデータによって、ＮＣＡＭがＦＡＣＳを用いて細胞を選別するのに有用であることが示されている。このように、ＮＣＡＭを用いて、ｈＥＳＣ由来未熟膵臓ホルモン発現細胞を濃縮、単離及び／又は精製することができる。

【0697】

＜実施例１６＞
ＣＤ１３３に対する陰性選択を使用する、ＮＣＡＭ陽性／ＳＹＰ陽性ｈＥＳＣ由来未熟膵島ホルモン発現細胞集団の濃縮
実験の第３セットにおいて、ｈＥＳＣを６工程のプロトコルによって１９日間分化させることにより、未熟膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程は、無血清培地中のＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）での１日間の分化、その後の０．２％ ＦＢＳを補充した培地中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）単独での１日間
の分化、及び２．０％ ＦＢＳを補充した培地中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005））での１日間の分化を含んだ。第２工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍ
Ｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）を含有する、２％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中での３日間の分化を含んだ。第３工程は、外から加えたＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）及びエキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭ中での３日間の分化を含んだ。第４工程は、外から加えたＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）及びエキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭでの１日間の処理を含んだ。第５工程は、エキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭでの９日間の処理を含んだ。

【0698】

細胞培養物を、実施例１４に記載したＮＣＡＭ、ＳＹＰ及びＣＤ１３３一次抗体を使用して前記フローサイトメトリ分析用に処理するか、又は実施例１５に記載したＮＣＡＭ及びＣＤ１３３抗体を使用して選別した。

【0699】

図２１Ｂに示すように、実施例１４に記載したように分化したｈＥＳＣ由来細胞集団中の細胞の約７．５％が、ＮＣＡＭ陽性／ＣＤ１３３陰性であった。ＳＹＰに対するこれらの細胞の対比染色により、ＮＣＡＭ陽性／ＣＤ１３３陰性細胞の９３％が、ＳＹＰに対して陽性であることが示された。

【0700】

図２６Ａ及び図２６Ｂで示されるように、前記で示されるように分化した細胞集団の約４．６％が、ＳＹＰに関して陽性で染色し、細胞集団の約５．３％が、ＮＣＡＭに関しては陽性、及びＣＤ１３３に関しては陰性で染色した。これに対して、ＮＣＡＭ陽性／ＣＤ１３３陰性細胞の亜集団の約６６．５％がＳＹＰに関して陽性で染色した（図２６Ｃ）。これらのデータによって、ＮＣＡＭ陽性及びＣＤ１３３陰性細胞の選別を用いて、ｈＥＳＣ由来未熟膵臓ホルモン発現細胞を濃縮、単離及び／又は精製することができることが示されている。

【0701】

＜実施例１７＞
ｈＥＳＣの内分泌前駆細胞及び未熟膵島ホルモン発現細胞への分化
ｈＥＳＣを６工程のプロトコルによって１９日間分化させることにより、未熟膵島ホルモン発現細胞を得た。第１工程は、無血清培地中のＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）での１日間の分化、その後の０．２％ ＦＢＳを補充した培地中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）単独での１日間の分化、及び２．０％ ＦＢＳを補充した培地中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）（それによりＤＥを強く産生する）（D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005））での１日
間の分化を含んだ。第２工程は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）を含有する、２％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中での３日間の分化を含んだ。第３工程は、外から加えたＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２μＭ）、レチノイン酸（２μＭ）、グルカゴン様ペプチド１、アミノ酸１〜３７（５０ｎｇ／ｍｌ）及びノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭ中での４日間の分化を含んだ。第４工程は、Ｂ２７サプリメント（１：１００）及びグルカゴン様ペプチド１、アミノ酸１〜３７（５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭでの３日間の処理を含んだ。第５工程は、エキセンジン４（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する、Ｂ２７サプリメント（１：１００）を含むＤＭＥＭでの６日間の処理を含んだ。１２日目、１５日目及び１９１９日目に、実施例１４に記載のＦＡＣＳを使用して細胞を選別することにより、ＮＣＡＭ陽性細胞とＮＣＡＭ陰性細胞とを分離した。選別前の細胞の複製試料、ＮＣＡＭ陽性細胞及びＮＣＡＭ陰性細胞を各培養物から採取し、遺伝子発現をリアルタイム定量的ＰＣＲによって分析した。

【0702】

図２２−1及び図２２−２で示されるように、細胞が内分泌前駆細胞（「初期」）から
未熟膵島ホルモン発現細胞（「中期」及び「後期」）へと発達する間の時間的に連続した遺伝子発現が存在していた。図２２Ａ及び図２２Ｂは、ＮＣＡＭ陽性細胞がＮＧＮ３及びＰＡＸ４に関して濃縮されたことを示している。ＮＧＮ３及びＰＡＸ４の発現は、ｈＥＳＣが未熟膵島ホルモン発現細胞に分化するにつれて低減した。また、図２２Ｃ〜図２２Ｋで示されるように、ＮＣＡＭ陽性細胞は、未熟膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカー（ＩＮＳ、ＰＰ、ＰＡＸ６、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＧＣＫ、ＳＳＴ、ＮＫＸ２．２、及びＳＹＰを含む）を発現する細胞に関して、ＮＣＡＭ陰性細胞と比べて高度に濃縮された。内分泌前駆細胞がＩＮＳ、ＰＰ、ＰＡＸ６、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＧＣＫ、及びＳＹＰを実質的に発現しなかったのに対して、膵島ホルモン発現細胞へとさらに分化した細胞は、膵臓内分泌細胞に特有の同一マーカーの発現の増大を示した。

【0703】

図２３Ａ〜図２３Ｅは、前記のように１９日目で分化及び選別したｈＥＳＣ細胞のさらなるＱＰＣＲデータを示している。ＮＣＡＭ陽性細胞に関するｈＥＳＣ由来細胞集団の選別によって、ＮＥＵＲＯＤ（図２３Ａ）、ＩＳＬ１（図２３Ｂ）、ＧＡＳ（図２３Ｃ）、ＫＩＲ６．２（図２３Ｄ）、及びＳＵＲ１（図２３Ｅ）等の内分泌マーカーに関して高度に濃縮された細胞の集団が生じた。

【0704】

図２４Ａ〜図２４Ｋは、前記のように１９日目で分化及び選別したｈＥＳＣ由来細胞で行った独立した実験を表す。この実験では、「選別前」で標識されたデータは、ゲートされている（gated）が、ＦＡＣＳを用いて選別されていない前記のように分化したｈＥＳ
Ｃから得られた。図は、ＮＣＡＭに関する細胞集団の選別によって、ＮＣＡＭ（図２４Ａ）、並びに予想したように内分泌細胞に特有の以下のマーカー：ＮＫＸ２．２（図２４Ｂ）、ＳＹＰ（図２４Ｃ）、ＰＡＸ６（図２４Ｄ）、ＮＥＵＲＯＤ（図２４Ｅ）、ＩＳＬ１（図２４Ｆ）、ＩＮＳ（図２４Ｇ）、ＧＣＧ（図２４Ｈ）、ＧＨＲＬ（図２４Ｉ）、ＳＳＴ（図２４Ｊ）、及びＰＰ（図２４Ｋ）に関して高度に濃縮された細胞集団が生じることを示している。これらのデータによって、ＮＣＡＭが未熟内分泌細胞の濃縮、単離及び精製に有用であることが確認される。

【0705】

＜実施例１８＞
外因性レチノイドなしでノギンを用いてインスリン発現細胞を得る方法
この実施例によって、Ｂ２７等の培地サプリメントに存在し得る外因性レチノイド供給源、例えばレチノール（ビタミンＡ）を添加しないでノギン処理を用いて、ｈＥＳＣをインスリン発現細胞に分化する代替方法が示される。

【0706】

ＲＰＭＩ＋０％ ＦＢＳ中でのアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）による処理（１日目）、並びにその後のＲＰＭＩ＋０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ中でのアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）単独による処理（さらに２日間）によって、ヒトＥＳＣを胚体内胚葉細胞へと分化させた。ＲＰＭＩ＋２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ中でのＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）による処理（３日間）によって、胚体内胚葉を前腸内胚葉へと分化させた。その後、ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）を含有する、ＤＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｂ２７サプリメント（１日間）、続けてノギン（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したか、又は添加していない同一物（さらに５日間）中で、分化が進行した。使用したＢ２７サプリメントは、ビタミンＡあり（Ｂ２７＋）又はビタミンＡなし（Ｂ２７−）のいずれかであった。分化の１３日目、１４日目及び１５日目に、ＫＧＦは除去したが、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）及びノギン（使用する場合）は培養培地中に残存した。１６日目〜１９日目の分化培地は、ＣＭＲＬ＋１％（ｖ／ｖ）Ｂ２７（前の条件同様、ビタミンＡあり又はなし）から成り、さらなる因子を含まなかった。培養物を、分化の３日目、
６日目、９日目、１２日目、１５日目及び１９日目に繰り返してサンプリングし、リアルタイムＰＣＲを使用して膵臓マーカーの発現について分析した。

【0707】

ＰＤＸ１遺伝子発現の誘導は、ノギン処理又はＢ２７サプリメントにおけるビタミンＡの有無に依存しなかった（図２９Ａ）。これに対して、１２日目に誘導されたＮＧＮ３発現によって明らかなように、膵臓内分泌分化の誘導は、ノギンの存在に強く依存していた（図２９Ｂ）。ＮＧＮ３発現の誘導後の膵臓ホルモンＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、及びＧＨＲＬの発現も、ノギンの存在に依存していた（図２９Ｃ〜図２９Ｆ）。ノギンが１２日を越えてＮＧＮ３発現を維持する能力は、Ｂ２７サプリメントにおけるビタミンＡの存在によって高められた。さらに、膵臓ホルモン発現の程度も、Ｂ２７サプリメントにおけるビタミンＡの存在によって高められたが、外因性レチノイド適用の完全な欠如下であっても、ノギン処理は、依然としてインスリン発現細胞への分化を誘導するのに十分であった。

【0708】

＜実施例１９＞
ノギンとレチノイン酸との組合せを用いてインスリン発現細胞を得る方法
この実施例によって、ノギン及びレチノイン酸を併せて用いて、ｈＥＳＣをインスリン発現細胞に分化することができること、並びに特にレチノイン酸が低濃度で用いられる場合のレチノイン酸へのノギンの添加がレチノイン酸の作用を促進することが示される。

【0709】

ヒトＥＳＣは、１日目のＲＰＭＩ＋０％ＦＢＳにおけるアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）、それからさらに２日間のＲＰＭＩ＋０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳにおけるアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）単独の処理によって胚体内胚葉に分化した。胚体内胚葉は、３日間のＲＰＭＩ＋２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳにおけるＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＫＡＡＤ−シクロパミン（２５μＭ）の処理によって前腸内胚葉に分化した。それから、ノギンを添加して（０、３０又は１００ｎｇ／ｍｌ）又は添加しないで、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μＭ）及び全てトランス型のレチノイン酸（０．１μＭ又は２μＭ）を含有するＤＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｂ２７サプリメントにおいて３日間、分化を進めた。これに、ＤＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｂ２７で供給されたγ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（１μＭ）による２日の処理期間が続き、その後増殖因子を添加せずに、ＣＭＲＬ＋１％（ｖ／ｖ）Ｂ２７で細胞を培養した。

【0710】

レチノイン酸の濃縮及びノギンの添加は、９日目又は１１日目でのＰＤＸ１の発現レベルにほんのわずかしか影響しなかった（図３０Ａ）。しかし、低用量ＲＡ（０．１μＭ）へのノギンの添加によって、９日目の内分泌前駆マーカーＮＧＮ３の発現（図３０Ｂ）、並びに１１日目のＩＮＳ及びＧＣＧ遺伝子発現の初期発生（図３０Ｅ及び図３０Ｆ）が劇的に高められた。この結果は、特に低濃度のＲＡ（０．１μＭ）及び高濃度のノギン（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いた条件「Ｃ」下での、ＰＴＦ１Ａ（図３０Ｃ）及びＮＫＸ６．１（図３０Ｄ）の発現の増大によって示されるような膵臓上皮への分化の増強によるものであり得る。これらの結果によって、ノギンとレチノイドシグナル伝達との組合せが相乗的に作用し、膵臓上皮を特異化し、最終的にｈＥＳＣから誘導された前腸内胚葉から膵臓内分泌細胞を分化することが示された。

【0711】

＜実施例２０＞
膵臓上皮のｉｎ ｖｉｖｏ成熟
ｈＥＳＣ由来材料が、機能的なインスリン産生細胞にさらに分化する能力をさらに研究するために、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を免疫不全マウス（ＳＣＩＤ／Ｂｇ）に移植した。これを達成するために、改良したマキルベン組織チョッパーを用いて、様々な分化プロセスの段階でのコンフルエント（confluent）細胞を機械的にスコア付け
し（Joannides et al., （2006）. Stem Cells 24:230-235（その開示内容全体が参照に
より本明細書に援用される）を参照されたい）、その後培養のために非接着プレートに移
した。得られた集合体をゼラチンスポンジ足場（Ｇｅｌｆｏａｍ、Pharmacia）上にピペ
ッティングし、マトリゲル（BD）で被覆した。それぞれ直径８ｍｍ×２ｍｍの足場に集合体２５μｌ〜４０μｌを入れた。続いて、２つのこれらの組織構築物をそれぞれのマウスの精巣上体脂肪体に移植した。

【0712】

移植片材料をｉｎ ｖｉｖｏで分化及び成熟させた。２週間毎に、インスリン分泌を誘導するアルギニンを動物に注入することによって、これらの移植片におけるインスリン産生細胞の機能性を試験した。アルギニン注入の４分後に血液を採取し、ヒトＣ−ペプチドに関して試験した。早くも移植の５週間後に動物血清でヒトＣ−ペプチドが検出され、経時的に増加した。移植の１０〜１６週後、２匹の動物が、グルコースに応答性の移植片を含有していた。これらのデータは、おそらく前駆細胞の増殖及び成熟によって、移植片における機能的なインスリン産生細胞の数が経時的に増加することを示唆している。

【0713】

様々な時点で回収した移植片の組織学的検査によって、増殖及び成熟した膵臓上皮の存在が示された。後の時点で回収した移植片は、この上皮をより大量に有していた。膵臓上皮は、形態、並びにＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１等の典型的な発生マーカーの発現によって同定された。ホルモンマーカーの検査によって、膵臓上皮の膵島様細胞クラスターが、正常な膵臓発生に類似した様式で出芽分離することが示された。これらの細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１陽性及びＰＤＸ１陽性でもあるインスリン産生細胞を含む単一陽性ホルモン産生細胞を含有していた。細胞クラスター構造は、正常な胎児膵島の構造と類似していた。

【0714】

本明細書中に記載される方法、組成物及び装置は、現在、好ましい実施形態を代表するものであり、例示であって、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。本発明の精神に包含され、且つ開示内容の範囲によって規定される、その変更及び他の使用が当業者には思い浮かぶであろう。したがって、本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、本明細書中に開示される発明に対する種々の置換形態及び変更形態が作製され得ることは、当業者には明らかであろう。

【0715】

添付の特許請求の範囲において、また本開示内容全体を通して使用される場合、「本質的に〜から成る」という語句は、当該語句の後ろに列記される任意の要素を含むことを意味し、列記した要素に関する開示内容において特定される活性又は作用を妨害しないか又はそれに関与しない他の要素に限定される。したがって、「本質的に〜から成る」という語句は、列記した要素が必要又は必須であるが、他の要素は任意であり、列記した要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かに応じて、存在してもしなくてもよいということを示唆する。

【0716】

多くの文献及び特許参考文献が本明細書中で言及されている。本明細書中で言及されるありとあらゆる参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0717】

幾つかの参考文献に関しては、本明細書の本文で完全に言及される。他の参考文献に関しては、本明細書の本文で著者及び年で言及され、以下で完全に言及される：
D'Amour, K., et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541（2005）、
Bocian-Sobkowska, J., et al. Histochem. Cell Biol. 112, 147-153（1999）、
Rahier J., et al., Cell Tissue Res. 200 (3), 359-366（1979）、
Malaisse-Langae F., et al., Diabetologia 17(6), 361-365（1979）、
Fiocca R., et al., Histochemistry, 77(4), 511-523（1983）、
Stefan Y., et al., Diabetologica, 23(2), 141-142（1982）、
Kelly, O.G. and Melton, D. A., Dev. Dyn. 218, 615-627（2000）、
Chen, Y., et al., Dev. Biol. 271(1), 144-160（2004）、 Field, H.A., et al., D
ev. Biol. 263, 197-208（2003）、
Spooner, B.S., et al., J. Cell Biology, 47, 235-246（1970）、
Li, H., et al., Nature 23, 67-70（1999）、
Stafford, D. and Prince, Curr. Biol., 12, 1-20（2002）、
Moriya, N., et al., Develop. Growth Differ., 42, 175-185（2000）、
Chen, Y., et al., Dev. Biol. 271, 144-160（2004）、
Stafford, D., et al., Development, 133(5), 949-956（2006）、
Martin, M., et al., Dev. Biol.（2005）、
Molotkov, A., Devel. Dyn. 232, 950-957（2005）、
Gao, R. et al., Diabeltologia, 48 :2296-2304（2005）、
Ronn, L. et al., Eur J Neurosci., 16(9):1720-30（2002）。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

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【図19】

【図20】

【図21】

【図22-1】

【図22-2】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】