特許 6339995 多機能性抗体複合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6339995

(24)【登録日】2018年5月18日

(45)【発行日】2018年6月6日

(54)【発明の名称】多機能性抗体複合体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20180528BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20180528BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20180528BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20180528BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20180528BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180528BHJP

   C12N 15/02 20060101ALN20180528BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20180528BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   C07K19/00

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61K47/34

   A61K47/42

   A61P35/00

   !C12N15/00 C

   !C12P21/08

【請求項の数】75

【外国語出願】

【全頁数】143

(21)【出願番号】特願2015-248537(P2015-248537)

(22)【出願日】2015年12月21日

(62)【分割の表示】特願2013-519199(P2013-519199)の分割

【原出願日】2011年7月11日

(65)【公開番号】特開2016-94455(P2016-94455A)

(43)【公開日】2016年5月26日

【審査請求日】2016年1月19日

(31)【優先権主張番号】61/363,507

(32)【優先日】2010年7月12日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509129244

【氏名又は名称】コヴェックス・テクノロジーズ・アイルランド・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱 明子

(72)【発明者】

【氏名】バト，アディジト・スレシュ

(72)【発明者】

【氏名】ブラッドショー，カート・ウィリアム

(72)【発明者】

【氏名】ローラン，オリヴィエ・アレクサンドル

(72)【発明者】

【氏名】リー，アリス

(72)【発明者】

【氏名】プレストン，リチャード・ライアン

(72)【発明者】

【氏名】タメルティ，デーヴィッド

(72)【発明者】

【氏名】ウッド，ローレン・ダイアン

(72)【発明者】

【氏名】ユ，ウェイ・ホン

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５０９３１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０１１５１６５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１３６３５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Protein Science，２００５年，Vol.14，p.2436-2446

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／１８

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ４７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

多機能性抗体複合体（ＭＡＣ）、又はそれらの医薬的に受容可能な塩、立体異性体、互変異性体、若しくは溶媒和物を含んでなる医薬組成物を調製するための方法であって、
ＭＡＣは以下の(i)(ii)：
（ｉ）少なくともＫａｂａｔ番号によるＫ^１８８を含んでなる軽鎖定常カッパ領域（ＣＬκ）の断片を含んでなる、抗体又はその抗原結合部位；及び
（ｉｉ）式Ｘ−Ｙ−Ｚを含んでなるリンカーであって、式中、Ｚは以下の式：

【化1】

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の基であり、Ｋ^１８８の側鎖のε−アミノ基によって抗体に共有結合的に接続しており、Ｙは直鎖又は分枝鎖の生物学的に適合性の接続鎖であり、そしてＸは少なくとも一つのエフェクター分子に共有結合的に接続された基である、リンカー；
を含んでなり、
組成物中のエフェクター分子の少なくとも５０％が、Ｋ^１８８−ＣＬκに結合しており、
前記医薬組成物を調製するための方法が、
エフェクター分子を、以下の式：

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

の脱離基Ｚ^＊を持つ活性化されたエステルで終結するリンカーに共有的に接続することを含む結合反応（式中、Ｒ^１はＦであり、ｈ＝４又は５である）、及びこのように形成されたエフェクター分子−リンカー−Ｚ^＊複合体を、抗体と反応させることを含んでなる、方法。

【請求項2】

Ｚ^＊が：

【化3-1】

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【化3-2】

[この文献は図面を表示できません]

【化3-3】

[この文献は図面を表示できません]

及び

【化3-4】

[この文献は図面を表示できません]

からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

Ｚ^＊が：

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

の式のものである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

ＭＡＣが、更にＨ^１８９−ＣＬκを含んでなる、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ＭＡＣが、更にＤ^１５１−ＣＬκを含んでなる、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＣＬκ領域が、少なくとも配列番号１５、配列番号４５、配列番号４６又は配列番号４７の残基６２−１０３を含んでなる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＣＬκ領域が、少なくとも配列番号１５、配列番号４５、配列番号４６又は配列番号４７の残基１−１０６を含んでなる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記エフェクター分子が、Ｋ^１８８ＣＬκにおいてのみＭＡＣに結合している、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記エフェクター分子が、少なくとも一つの軽鎖上のＫ^１８８ＣＬκにおいて、そして抗体上の一つの他の位置においてＭＡＣに結合している、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記エフェクター分子が、少なくとも一つの軽鎖上のＫ^１８８ＣＬκにおいて、そして抗体上の二つの他の位置においてＭＡＣに結合している、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記エフェクター分子が、両方の軽鎖上のＣＬκＫ^１８８に結合している、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記エフェクター分子が、一つのみの軽鎖上のＣＬκＫ^１８８に結合している、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記エフェクター分子が、治療剤、タンパク質、ペプチド、核酸、アプタマー、小分子、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝制御物質、ホルモン、毒素、成長因子、又は診断剤である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記少なくとも一つのエフェクター分子が、タンパク質又はペプチドである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記リンカーのＸ基が、タンパク質又はペプチド中のペプチド連結残基のアミノ末端、カルボキシル末端、又は側鎖に共有結合的に接続している、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ペプチド連結残基が、Ｋ、Ｒ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｓ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｋ（ＳＨ）、並びにＫ及びＣの同族体からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記連結残基が、Ｋである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

Ｙ、Ｘ−Ｙ、Ｙ−Ｚ、又はＸ−Ｙ−Ｚが：

【化5】

[この文献は図面を表示できません]

からなる群から選択され、式中、ｍ、ｎ及びｊは、それぞれ独立に、その下限が、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてその上限が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される範囲であり、そしてここにおいて、リンカーの全長が、２００個の原子を超えない、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

ＭＡＣが以下の式を含んでなる、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法：

【化6】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｋ^１８８−ＣＬκは、前記Ｋ^１８８−ＣＬκの側鎖への共有結合的な連結であり、エフェクター分子−ＬＲは、エフェクター分子への共有結合的連結であり、そしてｍ、ｎ及びｊは、それぞれ独立に、その下限が、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてその上限が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される範囲であり、そしてここにおいて、リンカーの全長が、２００個の原子を超えない。

【請求項20】

前記リンカーの全長が、１５０個の原子を超えない、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記リンカーの全長が、１００個の原子を超えない、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記リンカーの全長が、６０個の原子を超えない、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記抗体が、リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、ラニビズマブ、及びパリビズマブからなる群から選択される、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記抗体が、触媒性アルドラーゼ抗体である、請求項１−２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記抗体が、全長の抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ_ｖ、ｄｓＦ_ｖ、ｓｃＦ_ｖ、Ｖ_Ｈ、二特異性抗体、又はｈ３８ｃ２からのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含んでなるミニボディーである、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記抗体が、配列番号５１及び配列番号５２、又は配列番号５３及び配列番号５４を含んでなる、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

前記抗体が、配列番号５を含んでなるＨＣ領域、配列番号６を含んでなるＶＨ領域、配列番号１６を含んでなるＶＬ領域、及び配列番号１５、配列番号４５、配列番号４６又は配列番号４７の一つを含んでなるＣＬ領域を含んでなる、請求項１−２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記抗体が、配列番号３及び配列番号４を含んでなる、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記エフェクター分子が、Ａｎｇ２結合ペプチドである、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記Ａｎｇ２結合ペプチドが、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項１から２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記Ａｎｇ２結合ペプチドが、配列番号２７を含んでなる、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記ペプチド連結残基が、配列番号２７のＫ^１１である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

ＭＡＣが以下の構造：

【化7】

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を含んでなり、式中、Ｋ^１８８−ＣＬκは、前記Ｋ^１８８−ＣＬκの側鎖への共有連結であり、そして前記抗体が、配列番号３及び配列番号４を含んでなる、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記組成物又は試料中のエフェクター分子の少なくとも６０％が、Ｋ^１８８−ＣＬκに共役している、請求項１から３３のいずれか1項に記載の方法。

【請求項35】

前記組成物又は試料中のエフェクター分子の少なくとも７０％が、Ｋ^１８８−ＣＬκに共役している、請求項１から３３のいずれか1項に記載の組成物。

【請求項36】

前記組成物又は試料中のエフェクター分子の少なくとも８０％が、Ｋ^１８８−ＣＬκに共役している、請求項１から３３のいずれか1項に記載の方法。

【請求項37】

前記抗体の少なくとも５０％が、Ｋ^１８８−ＣＬκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる、請求項１−３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記抗体の少なくとも６０％が、Ｋ^１８８−ＣＬκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記抗体の少なくとも７０％が、Ｋ^１８８−ＣＬκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

前記抗体の少なくとも８０％が、Ｋ^１８８−ＣＬκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる、請求項３７に記載の方法。

【請求項41】

戦記重鎖分子の少なくとも７０％が、エフェクター分子と複合体形成していない、請求項１−３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記重鎖分子の少なくとも８０％が、エフェクター分子と複合体形成していない、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記重鎖分子の少なくとも９０％が、エフェクター分子と複合体形成していない、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

前記エフェクター分子に対して一つの結合部位を含んでなる個々の軽鎖断片の量が、２５から９５％間である、請求項１−３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記抗体当たりの結合の数が、０．５から５個間である、請求項１−３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記抗体当たりの結合の数が、０．５から３個間である、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記抗体当たりの結合の数が、０．５から１．５個間である、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

前記抗体当たりの結合の数が、１．５から５．０個間である、請求項４５に記載の方法。

【請求項49】

前記抗体当たりの結合の数が、１．５から３．０個間である、請求項４５に記載の方法。

【請求項50】

前記抗体当たりの結合の数が、１．５から２．５個間である、請求項４５に記載の方法。

【請求項51】

前記抗体当たりの結合の数が、１．７から２．３個間である、請求項４５に記載の方法。

【請求項52】

医薬組成物が更に受容可能な担体を含んでなる、請求項１−５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

医薬組成物が更に５−フルオロウラシル、イリノテカン、オキシラプラチン、セツキシマブ、スニチニブ、及びリツキシマブからなる群から選択される一つ又はそれより多い化合物を含んでなる、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

医薬組成物が血管新生を阻害又は減少する、或いは血管新生性疾患に伴う疾病又は徴候を治療若しくは予防するために使用される、請求項５２又は５３に記載の方法。

【請求項55】

前記疾病が、癌である、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記癌が、肺（ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ）、頭頸部、卵巣、大腸、直腸、前立腺、肛門領域、胃、乳房、腎臓又は尿管、腎盂、甲状腺、膀胱、脳の癌、腎細胞細胞腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍の細胞腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンスリンパ腫、脊髄軸腫瘍、中咽頭、下咽頭、食道、膵臓、肝臓、胆嚢及び胆管、小腸、尿管の細胞腫；又はリンパ腫、肺癌（ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、大腸癌、直腸癌、前立腺癌、肛門領域の癌、或いは一つ又はそれより多い前述の癌の組合せである、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

多機能性抗体複合体（ＭＡＣ）を含んでなる医薬組成物であって、
ＭＡＣは以下の(i)(ii)：
（ｉ）抗体又はその抗原結合部位であって、少なくともＫａｂａｔ番号によるＫ^１８８を含んでなる軽鎖定常カッパ領域（ＣＬκ）の断片を含んでなる抗体又はその抗原結合部位；
（ｉｉ）式Ｘ−Ｙ−Ｚを含んでなるリンカーであって、式中、Ｚは以下の式：

【化8】

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の基であり、Ｋ^１８８の側鎖のε−アミノ基によって抗体に共有結合的に接続しており、Ｙは直鎖又は分枝鎖の生物学的に適合性の接続鎖であり、そしてＸは少なくとも一つのエフェクター分子に共有結合的に接続された基である、リンカー；並びに
その医薬的に受容可能な塩、立体異性体、互変異性体、及び溶媒和物を含んでなり、
組成物中のエフェクター分子の少なくとも５０％が、Ｋ^１８８−ＣＬκに結合している、前記組成物。

【請求項58】

更にＨ^１８９−ＣＬκを含んでなる、請求項５７に記載の組成物。

【請求項59】

更にＤ^１５１−ＣＬκを含んでなる、請求項５７又は５８に記載の組成物。

【請求項60】

前記ＣＬκ領域が、
(i)少なくとも配列番号１５、配列番号４５、配列番号４６又は配列番号４７の残基６２−１０３；または
(ii)少なくとも配列番号１５、配列番号４５、配列番号４６又は配列番号４７の残基１−１０６
を含んでなる、請求項５７に記載の組成物。

【請求項61】

(i)前記エフェクター分子が、Ｋ^１８８ＣＬκにおいてのみＭＡＣに結合している；
(ii) 前記エフェクター分子が、少なくとも一つの軽鎖上のＫ^１８８ＣＬκにおいて、そして抗体上の一つの他の位置においてＭＡＣに結合している；
(iii) 前記エフェクター分子が、少なくとも一つの軽鎖上のＫ^１８８ＣＬκにおいて、そして抗体上の二つの他の位置においてＭＡＣに結合している；
(iv) 前記エフェクター分子が、両方の軽鎖上のＣＬκＫ^１８８に結合している；または
(v) 前記エフェクター分子が、一つのみの軽鎖上のＣＬκＫ^１８８に結合している
請求項５７に記載の組成物。

【請求項62】

前記エフェクター分子が、治療剤、タンパク質、ペプチド、核酸、アプタマー、小分子、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝制御物質、ホルモン、毒素、成長因子、又は診断剤である、請求項５７に記載の組成物。

【請求項63】

前記少なくとも一つのエフェクター分子が、タンパク質又はペプチドであり、前記リンカーのＸ基が、タンパク質又はペプチド中のペプチド連結残基のアミノ末端、カルボキシル末端、又は側鎖に共有結合的に接続しており、前記ペプチド連結残基が、Ｋ、Ｒ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｓ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｋ（ＳＨ）、並びにＫ及びＣの同族体からなる群から選択される、請求項５７に記載の組成物。

【請求項64】

前記連結残基が、Ｋである、請求項６３に記載の組成物。

【請求項65】

Ｙ、Ｘ−Ｙ、Ｙ−Ｚ、又はＸ−Ｙ−Ｚが：

【化9】

[この文献は図面を表示できません]

からなる群から選択され、式中、ｍ、ｎ及びｊは、それぞれ独立に、その下限が、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてその上限が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される範囲であり、そしてここにおいて、リンカーの全長が、２００個の原子を超えない、請求項５７に記載の組成物。

【請求項66】

以下の式を含んでなる、請求項５７に記載の組成物：

【化10】

[この文献は図面を表示できません]

式中、Ｋ^１８８−ＣＬκは、前記Ｋ^１８８−ＣＬκの側鎖への共有結合的な連結であり、エフェクター分子−ＬＲは、エフェクター分子への共有結合的連結であり、そしてｍ、ｎ及びｊは、それぞれ独立に、その下限が、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてその上限が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される範囲であり、そしてここにおいて、リンカーの全長が、２００個の原子を超えない。

【請求項67】

（ｉ）前記リンカーの全長が、１５０個の原子を超えない；
（ｉｉ）前記リンカーの全長が、１００個の原子を超えない；または
（ｉｉｉ）前記リンカーの全長が、６０個の原子を超えない、
請求項５７に記載の組成物。

【請求項68】

前記抗体が、リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、ラニビズマブ、パリビズマブ、触媒性アルドラーゼ抗体、及びその全長のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ_ｖ、ｄｓＦ_ｖ、ｓｃＦ_ｖ、Ｖ_Ｈ、二特異性抗体、又はミニボディー形態からなる群から選択される、請求項５７に記載の組成物。

【請求項69】

（ｉ）前記抗体が、配列番号５１及び配列番号５２、又は配列番号５３及び配列番号５４を含んでなる；
（ｉｉ）前記抗体が、配列番号５を含んでなるＨＣ領域、配列番号６を含んでなるＶＨ領域、配列番号１６を含んでなるＶＬ領域、及び配列番号１５、配列番号４５、配列番号４６又は配列番号４７の一つを含んでなるＣＬ領域を含んでなる；又は
（ｉｉｉ）前記抗体が、配列番号３及び配列番号４を含んでなる、
請求項５７に記載の組成物。

【請求項70】

前記エフェクター分子が、Ａｎｇ２結合ペプチドである、請求項５７に記載の組成物。

【請求項71】

前記Ａｎｇ２結合ペプチドが、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項７０に記載の組成物。

【請求項72】

前記Ａｎｇ２結合ペプチドが、配列番号２７を含んでなる、請求項７１に記載の組成物。

【請求項73】

前記ペプチド連結残基が、配列番号２７のＫ^１１である、請求項７２に記載の組成物。

【請求項74】

以下の構造：

【化11】

[この文献は図面を表示できません]

を含んでなり、式中、Ｋ^１８８−ＣＬκは、前記Ｋ^１８８−ＣＬκの側鎖への共有連結であり、そして前記抗体が、配列番号３及び配列番号４を含んでなる、請求項７３に記載の組成物。

【請求項75】

前記組成物中のエフェクター分子の少なくとも８０％が、Ｋ^１８８−ＣＬκに共役している、請求項５７に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多機能性抗体複合体（Multifunctional Antibody Conjugates）に関する。

【背景技術】

【0002】

二機能性治療剤の開発は、併用療法の戦略を増大するために大きな潜在性を有する。二機能性治療剤は、一つの治療成分で二つの異なった経路を調節することによる併用療法の利益を提供することができる。更に、二機能性治療剤は、更に経路間の相乗作用からの利益を得て、そして単機能性薬剤と比較して増加した活性を示すことができる。更に、二機能性治療剤は、減少された製造、保存及び運搬費用、並びに患者に与える治療剤の数を減少し、そして投与管理を簡略化することに関して利益を提供することができる。

【0003】

ＩＧＦ１Ｒは、膜貫通型ヘテロ四量体タンパク質であり、これは、ジスルフィド結合中の二つの細胞外α鎖及び二つの膜貫通β鎖（β−α−α−β）配置を有する。ＩＧＦ１Ｒは、ＩＧＦ１と高い親和性で結合する。ＩＧＦ１は、７０アミノ酸のペプチドであり、これは、主として成長ホルモンの刺激に反応して肝臓によって産生されるが、しかし身体中の殆どいずれもの組織によって合成することができ、そして１００−２００ｎｇ／ｍＬの濃度まで血清中で循環する。ＩＧＦ１Ｒのシグナル伝達は、多数の腫瘍種において役割を演じることができ、そして特に肺癌に関係する。例えば、ＩＧＦ１の上昇した血漿レベルは、増加した肺癌の危険性を伴う。更に、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、及びＩＧＦ１Ｒは、正常な肺細胞によって発現されるが、しかし肺癌細胞によって過剰発現される。ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達は、更に、乳癌、前立腺癌、大腸直腸癌、肉腫、多発性骨髄腫、及び他の悪性腫瘍に関係している。ＷＯ０２０５３５９６、ＷＯ２００５０１６９６７、ＷＯ２００５００５６３５、及びＷＯ２００９０３２１４５は、ＩＧＦ１Ｒ抗体及びその抗原結合部位を開示している。

【0004】

アンジオポイエチン−１（Ａｎｇ１）及びアンジオポイエチン−２（Ａｎｇ２）は、ＶＥＧＦ及び他の血管新生制御因子と共に内皮細胞受容体Ｔｉｅ２のリガンドとして血管新生過程を媒介する。Ａｎｇ１は、Ｔｉｅ２のリン酸化を刺激し、新しく形成された血管に周皮細胞を補充し、そしてその成熟を促進する。Ａｎｇ２は、血管形成誘導性であり、そして多くの癌において過剰発現することが知られている。Ａｎｇ２は、Ｔｉｅ２の結合に対してＡｎｇ１と競合し、周皮細胞の解離を促進し、そして不安定な血管をもたらす。ＶＥＦＧ及び他の血管新生誘導性因子の存在中で、これらの不安定な血管の内皮細胞は、増殖し、そして遊走して、新しい血管を形成する。

【0005】

固形腫瘍を持つ患者の約５０％は、Ａｎｇ２の増加した発現を有するが、しかし癌組織中のＡｎｇ２のレベルは、高度に可変性である。より高いＡｎｇ２の発現は、不良な生存率、後期疾病及び更に浸潤性の癌と明確に相関している。Ａｎｇ１及びＡｎｇ２間のより低い比は、更に卵巣癌の不良な予後と相関している。Ｔｉｅ２発現は、肝細胞腫、星状細胞種、カポジ肉腫、皮膚血管肉腫、及び非小細胞肺癌中で上方制御されることが報告されている。Ｔｉｅ２は、多くの腫瘍の血管において過剰発現する。Ｔｉｅ２を発現している単球は、腫瘍性血管の形成に寄与する。新しく公開されたデータは、特異的に隔離するＡｎｇ２が、腫瘍の成長を阻害し、そして段階分けされた腫瘍の退行を起こすことを示している。ＷＯ２００８０５６３４６は、Ａｎｇ２結合ペプチドを開示している。

【0006】

同一療法中でＩＧＦ１Ｒ及びＡｎｇ２の両方を標的とすることは、多剤治療設定において使用する腫瘍学者のために有効な道具であることを証明することができる。このような方法は、想定されている（例えば、ＷＯ２００９０８８８０５及びＷＯ２０１００４０５
０８）が、今日までどれも認可されていない。従って、ＩＧＲ−１Ｒ及びＡｎｇ２の両方を標的とする別の腫瘍学治療剤を提供する必要性が存在する。

【0007】

本明細書中のいずれもの技術に対する言及は、言及された技術が普通の一般的知識の一部を形成することのいずれもの形態の確認又は示唆ではなく、そしてそのように解釈されるべきではない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際特許出願公開ＷＯ０２０５３５９６；

【特許文献2】ＷＯ２００５０１６９６７；

【特許文献2】ＷＯ２００５００５６３５；

【特許文献2】ＷＯ２００９０３２１４５；

【特許文献2】ＷＯ２００８０５６３４６；

【特許文献2】ＷＯ２００９０８８８０５；

【特許文献2】ＷＯ２０１００４０５。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、少なくとも一つのエフェクター分子に結合（conjugate, 共役、複合体化）
した抗体又はその抗原結合部位を含んでなる、多機能性抗体複合体（Multifunctional Antibody Conjugates：ＭＡＣ）、並びにその医薬的に受容可能な塩、立体異性体、互変異
性体、溶媒和物、及びプロドラッグを提供する。本発明は、更に本発明のＭＡＣを含んでなる医薬組成物及び試料を提供する。

【0010】

本発明は、更に少なくとも一つのＡｎｇ２結合ペプチドに共役（結合）した抗体又はその抗原結合部位を含んでなる多機能性抗体複合体（ＭＡＣ）を提供する。
本発明は、少なくとも一つのＡｎｇ２結合ペプチドに共役した抗ＩＧＦ１Ｒ抗体又はその抗原結合部位を含んでなる多機能性抗体複合体（ＭＡＣ）を提供する。

【0011】

幾つかの態様において、少なくとも一つのＡｎｇ２結合ペプチドは、抗体の、共役する残渣の側鎖にリンカーを経由して共役する。
幾つかの態様において、エフェクター分子は、抗体又はその抗原結合部位のＦａｂ領域中のリシン残基の側鎖に共有的に接続される。幾つかの態様において、エフェクター分子は、定常重鎖（ＣＨ）又は定常軽鎖（ＣＬ）領域中のリシン残基の側鎖に共有的に接続される。抗体のＣＬドメインとのエフェクター分子の反応は、抗体のＦｃ部分のＦｃ受容体（ＦｃγＲ及びＦｃＲｎのような）への結合、或いはそのそれぞれの標的への抗体の結合によるいずれもの干渉を、最小化、又は防止するために特に好ましい。対照的に、抗体のＦｃ部分へのそれぞれのエフェクター分子の共役は、抗体のｉｎ ｖｉｖｏの半減期及び／又は免疫系との相互作用するその能力（エフェクター機能）を減少することができる。抗体の可変重鎖（ＶＨ）又は可変軽鎖（ＶＬ）領域中のエフェクター分子の共役は、抗体のその同族への結合を減少する危険を保有する。

【0012】

幾つかの態様において、エフェクター分子は、定常軽鎖カッパ領域（ＣＬκ）ドメイン中のリシン残基の側鎖に共有的に接続される。ＣＬκドメインへのエフェクター分子の優先的な共役は、抗体へのエフェクター分子の共役部位に影響することなく、抗体のＣＨドメインのアイソタイプスイッチを可能にすることによって、ＭＡＣアイソタイプの作成を簡単にする。

【0013】

エフェクター分子は、軽鎖カッパドメイン定常領域（ＣＬκ）のＫ^８０の側鎖に共有的に接続されることができる（配列番号：１５、配列番号：４５、配列番号：４６：又は配
列番号：４７）（Ｋａｂａｔ番号によりＫ^１８８）。幾つかの態様において、エフェクター分子は、配列番号：１５のＫ^８０に共有的に接続される。配列番号：１５のＫ^８０は、パラトープ領域、ＦｃＲｎ結合ドメイン、ヒンジ、ＦｃＲ結合ドメインのように、それぞれの抗体の重要な領域から離れて位置する；これは、ＭＡＣがエフェクター分子に共役する場合、これらの部位における優先的な結合が、抗体−抗原相互作用への干渉の量を制約する利点を提供する。

【0014】

幾つかの側面において、エフェクター分子は、モチーフＫ^＊ＨＫのＫ^＊に共有的に接続される。Ｋ^＊ＨＫモチーフのＫ^＊は、配列番号：１５のＫ^８０に対応することができる。幾つかの側面において、エフェクター分子は、Ｋｏｂａｔ番号系による、ＣＬκ領域に位置するモチーフＫ^１８８ＨのＫ^１８８に共有的に接続される。幾つかの側面において、ＣＫκ領域は、少なくとも配列番号：１５、４５、４６、又は４７の残基６２−１０３を含んでなる。幾つかの側面において、ＣＫκ領域は、配列番号：１５、４５、４６、又は４７を含んでなる。

【0015】

幾つかの側面において、ＣＬκ領域は、少なくとも配列番号：１５の残基６２−１０３を含んでなる。幾つかの側面において、ＣＫκ領域は、配列番号：１５を含んでなる。幾つかの側面において、ＣＬκ領域は、少なくとも配列番号：４５の残基６２−１０３を含んでなる。幾つかの側面において、ＣＫκ領域は、配列番号：４５を含んでなる。幾つかの側面において、ＣＬκ領域は、少なくとも配列番号：４６の残基６２−１０３を含んでなる。幾つかの側面において、ＣＫκ領域は、配列番号：４６を含んでなる。幾つかの側面において、ＣＬκ領域は、少なくとも配列番号：４７の残基６２−１０３を含んでなる。幾つかの側面において、ＣＫκ領域は、配列番号：４７を含んでなる。

【0016】

幾つかの側面において、ＣＫκ領域は、配列番号：４５又は４７を含んでなる。ＣＫκ領域が、配列番号：４５又は４７を部分的に或いは全体的に含んでなる場合、ｘ^８２は、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｆ、Ｗ又はＹからなる群から選択することができる。幾つかの側面において、ｘ^８２は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、又はＩであることができる。幾つかの側面において、ｘ^８２は、Ｋ、Ｒ、Ｎ、又はＱであることができる。幾つかの側面において、ｘ^８２は、Ｄ、又はＥであることができる。幾つかの側面において、ｘ^８２は、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、又はＱであることができる。幾つかの側面において、ｘ^８２は、Ｄ、又はＥであることができる。幾つかの側面において、ｘ^８２は、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｄ又はＥであることができる。幾つかの側面において、ｘ^８２は、Ｄ、又はＥであることができる。幾つかの側面において、ｘ^８２は、Ｈ、Ｆ、Ｗ又はＹであることができる。幾つかの側面において、ｘ^８２は、プロリンではない。幾つかの側面において、Ｘ^８２（配列番号：１５、４５、４６、及び／又は４７の）は、Ｒである。幾つかの側面において、Ｋ^１９０−ＣＬκは、Ｒである。

【0017】

配列番号：４５及び４７は、ＣＬκ中で確認された多形；Ｖ／Ａ^１５３及びＬ／Ｖ^１９１（Ｋａｂａｔ番号による）を含んでなる。従って、三つの多形は：Ｋｍ（１）：Ｖ^１５３／Ｌ^１９１；Ｋｍ（１，２）：Ａ^１５３／Ｌ^１９１；及びＫｍ（３）Ａ^１５３／Ｖ^１９１である。配列番号：４５及び／又は４７を含んでなる本発明の幾つかの側面において、ｘ^４５は、Ｖであり、そしてｘ^８３は、Ｌ（Ｋｍ（１））である。配列番号：４５及び／又は４７を含んでなる本発明の幾つかの側面において、ｘ^４５は、Ａであり、そしてｘ^８３は、Ｌ（Ｋｍ（１，２））である。配列番号：４５及び／又は４７を含んでなる本発明の幾つかの側面において、ｘ^４５は、Ａであり、そしてｘ^８３は、Ｖ（Ｋｍ（３））である。

【0018】

幾つかの側面において、ＭＡＣは、両方の軽鎖のＣＫκＫ^１８８に共役したエフェクタ
ー分子を含んでなる。幾つかの側面において、ＭＡＣは、一つの軽鎖のみ上のＣＫκＫ^１８８に共役したエフェクター分子を含んでなる。幾つかの側面において、エフェクター分子は、Ｋ^１８８ＣＬκにおいてのみＭＡＣに共役する。幾つかの側面において、エフェクター分子は、一つの軽鎖上のＫ^１８８ＣＬκにおいて、そして抗体上の一つの他の位置でＭＡＣに共役する。幾つかの側面において、エフェクター分子は、一つの軽鎖上のＫ^１８８ＣＬκにおいて、そして抗体上の二つの他の位置でＭＡＣに共役する。幾つかの側面において、エフェクター分子は、一つの軽鎖上のＫ^１８８ＣＬκにおいて、そして抗体上の三つの他の位置でＭＡＣに共役する。幾つかの側面において、エフェクター分子は、両方の軽鎖上のＫ^１８８ＣＬκにおいて、そして一つの他の位置においてＭＡＣに結合する。幾つかの側面において、エフェクター分子は、両方の軽鎖上のＫ^１８８ＣＬκにおいて、そして二つの他の位置においてＭＡＣに共役する。幾つかの側面において、エフェクター分子は、両方の軽鎖上のＫ^１８８ＣＬκにおいて、そして三つの他の位置においてＭＡＣに共役する。

【0019】

本発明の試料及び組成物
幾つかの側面において、本発明は、エフェクター分子に共有的に共役された抗体（又はその抗原結合部位）を含んでなるＭＡＣの組成物又は試料を提供し、ここにおいて、組成物又は試料中のエフェクター分子の少なくとも約５０％は、Ｋ^１８８−ＣＬκに共役している。幾つかの側面において、本発明は、エフェクター分子に共有的に共役された抗体（又はその抗原結合部位）を含んでなるＭＡＣの組成物又は試料を提供し、ここにおいて、組成物又は試料中のエフェクター分子の少なくとも約６０％は、Ｋ^１８８−ＣＬκに共役している。幾つかの側面において、本発明は、エフェクター分子に共有的に共役された抗体（又はその抗原結合部位）を含んでなるＭＡＣの組成物又は試料を提供し、ここにおいて、組成物又は試料中のエフェクター分子の少なくとも約７０％は、Ｋ^１８８−ＣＬκに共役している。幾つかの側面において、本発明は、エフェクター分子に共有的に共役された抗体（又はその抗原結合部位）を含んでなるＭＡＣの組成物又は試料を提供し、ここにおいて、組成物又は試料中のエフェクター分子の少なくとも約８０％は、Ｋ^１８８−ＣＬκに共役している。幾つかの側面において、本発明は、エフェクター分子に共有的に共役された抗体（又はその抗原結合部位）を含んでなるＭＡＣの組成物又は試料を提供し、ここにおいて、組成物又は試料中のエフェクター分子の少なくとも約９０％は、Ｋ^１８８−ＣＬκに共役している。

【0020】

幾つかの側面において、本発明は、抗体（又はその抗原結合部位）を含んでなるＭＡＣの組成物（又は試料）を提供し、ここにおいて、抗体の少なくとも約５０％は、少なくとも一つの軽鎖上のＫ^１８８−ＣＬκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる。幾つかの側面において、本発明は、抗体（又はその抗原結合部位）を含んでなるＭＡＣの組成物（又は試料）を提供し、ここにおいて、抗体の少なくとも約６０％は、少なくとも一つの軽鎖上のＫ^１８８−ＣＬκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる。幾つかの側面において、本発明は、抗体（又はその抗原結合部位）を含んでなるＭＡＣの組成物（又は試料）を提供し、ここにおいて、抗体の少なくとも約７０％は、少なくとも一つの軽鎖上のＫ^１８８−ＣＬκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる。幾つかの側面において、本発明は、抗体（又はその抗原結合部位）を含んでなるＭＡＣの組成物（又は試料）を提供し、ここにおいて、抗体の少なくとも約８０％は、少なくとも一つの軽鎖上のＫ^１８８−ＣＬκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる。幾つかの側面において、本発明は、抗体（又はその抗原結合部位）を含んでなるＭＡＣの組成物（又は試料）を提供し、ここにおいて、抗体の少なくとも約９０％は、少なくとも一つの軽鎖上のＫ^１８８−ＣＬκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる。幾つかの側面において、エフェクター分子は、両方の軽鎖上の両方のＫ^１８８−ＣＬκに共有的に共役している。

【0021】

幾つかの側面において、本発明は、エフェクター分子に共有的に共役された抗体又はその抗原結合部位を含んでなるＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、試料の少なくとも約３０％は、抗体当たり約２か所で共役されたエフェクター分子を含んでなり、そしてここにおいて、少なくとも一つのエフェクター分子共役部位は、Ｋ^１８８−ＣＬκである。幾つかの側面において、この量は、約４０％である。幾つかの側面において、この量は、約５０％である。幾つかの側面において、この量は、約６０％である。幾つかの側面において、この量は、約７０％である。幾つかの側面において、この量は、約８０％である。幾つかの側面において、この量は、約９０％である。幾つかの側面において、この量は、約９５％である。幾つかの側面において、この量は、約９９％である。

【0022】

幾つかの側面において、本発明は、エフェクター分子に共有的に共役された抗体又はその抗原結合部位を含んでなるＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、試料の少なくとも約３０％は、抗体当たり約３か所で共役されたエフェクター分子を含んでなり、そしてここにおいて、少なくとも二つのエフェクター分子共役部位は、それぞれの軽鎖上のＫ^１８８−ＣＬκである。幾つかの側面において、この量は、約４０％である。幾つかの側面において、この量は、約５０％である。幾つかの側面において、この量は、約６０％である。幾つかの側面において、この量は、約７０％である。幾つかの側面において、この量は、約８０％である。幾つかの側面において、この量は、約９０％である。幾つかの側面において、この量は、約９５％である。幾つかの側面において、この量は、約９９％である。

【0023】

幾つかの側面において、本発明は、エフェクター分子に共有的に共役された抗体又はその抗原結合部位を含んでなるＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、試料の少なくとも約３０％は、抗体当たり約４か所で共役されたエフェクター分子を含んでなり、そしてここにおいて、少なくとも二つのエフェクター分子共役部位は、それぞれの軽鎖上のＫ^１８８−ＣＬκである。幾つかの側面において、この量は、約４０％である。幾つかの側面において、この量は、約５０％である。幾つかの側面において、この量は、約６０％である。幾つかの側面において、この量は、約７０％である。幾つかの側面において、この量は、約８０％である。幾つかの側面において、この量は、約９０％である。幾つかの側面において、この量は、約９５％である。幾つかの側面において、この量は、約９９％である。

【0024】

幾つかの側面において、本発明は、エフェクター分子に共有的に共役された抗体又はその抗原結合部位を含んでなるＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、試料の少なくとも約３０％は、抗体当たり約５か所で共役されたエフェクター分子を含んでなり、そしてここにおいて、少なくとも二つのエフェクター分子共役部位は、それぞれの軽鎖上のＫ^１８８−ＣＬκである。幾つかの側面において、この量は、約４０％である。幾つかの側面において、この量は、約５０％である。幾つかの側面において、この量は、約６０％である。幾つかの側面において、この量は、約７０％である。幾つかの側面において、この量は、約８０％である。幾つかの側面において、この量は、約９０％である。幾つかの側面において、この量は、約９５％である。幾つかの側面において、この量は、約９９％である。

【0025】

幾つかの側面において、本発明は、ＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、軽鎖分子の少なくとも５０％は、少なくとも一つのエフェクター分子と共役している。幾つかの側面において、本発明は、ＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、軽鎖分子の少なくとも６０％は、少なくとも一つのエフェクター分子と共役している。幾つかの側面において、本発明は、ＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、軽鎖分子の少なくとも６５％は、少なくとも一つのエフェクター分子と共役している。幾つかの側面において、本発明は、ＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、軽鎖分子の少なくとも７０％は、少なくとも一つのエフェクター分子と共役している。幾つかの側面において、本発明は、ＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、軽鎖分子の少なくとも７５％は、少なくとも一つのエフェクター分子と共役している。幾つかの側面において、本発明は、ＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、
軽鎖分子の少なくとも８０％は、少なくとも一つのエフェクター分子と共役している。幾つかの側面において、本発明は、ＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、軽鎖分子の少なくとも８５％は、少なくとも一つのエフェクター分子と共役している。幾つかの側面において、本発明は、ＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、軽鎖分子の少なくとも９０％は、少なくとも一つのエフェクター分子と共役している。幾つかの側面において、本発明は、ＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、軽鎖分子の少なくとも９５％は、少なくとも一つのエフェクター分子と共役している。

【0026】

幾つかの側面において、本発明は、ＭＡＣの試料を提供し、ここにおいて、重鎖分子の少なくとも７０％は、エフェクター分子と共役していない。幾つかの側面において、この量は、約７５％である。幾つかの側面において、この量は、約８０％である。幾つかの側面において、この量は、約８５％である。幾つかの側面において、この量は、約９０％である。幾つかの側面において、この量は、約９５％である。幾つかの側面において、この量は、約９９％である。幾つかの側面において、重鎖分子の実質的に全ては、エフェクター分子と共役していない。

【0027】

幾つかの側面において、本発明は、リンカーによってエフェクター分子に共有的に共役している抗体、又はその抗原結合部位を含んでなるＭＡＣを提供し、抗体又はその抗原結合部位がモチーフＫＨＫを含んでなり、そしてエフェクター分子がＫ^１８８残基（Ｋｏｂａｔ番号による）の側鎖に共役していることを特徴とする。

【0028】

幾つかの側面において、共役されていない個々の軽鎖断片の量は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、及び５５％からなる群から選択される下限を、そして約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、及び６０％からなる群から選択される上限を有する。幾つかの側面において、一つの位置で共役されている個々の軽鎖断片の量は、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、及び５５％からなる群から選択される下限を、そして約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、及び９５％からなる群から選択される上限を有する。幾つかの側面において、二つの位置で共役されている個々の軽鎖断片の量は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、５、１０、１５、２０、及び２５％からなる群から選択される下限を、そして５、１６、７、８、９、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、及び４０％からなる群から選択される上限を有する。

【0029】

幾つかの側面において、共役されていない個々の重鎖断片の量は、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、及び８０％からなる群から選択される下限を、そして約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５及び９９％からなる群から選択される上限を有する。幾つかの側面において、一つの位置で共役されている個々の重鎖断片の量は、約１、２、５、１０、１５、２０、及び２５％からなる群から選択される下限を、そして約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、及び５０％からなる群から選択される上限を有する。幾つかの側面において、二つの位置で共役されている個々の重鎖断片の量は、約０、１、２、３、４、５、１０、及び１５％からなる群から選択される下限を、そして約２、３、４、５、１０、１５及び２０％からなる群から選択される上限を有する。

【0030】

幾つかの側面において、本発明の試料又は組成物中の抗体当たりの共役の数は、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．５５、１．６、１．６５、１．７、１．７５、１．８、１．８５、１．９、１．９５、及び２からなる群から選択される下限を、そして約１．６、１．７、１．７５ １．８、１．８５、１．９、１．９５、２．０、２．０５、２．１、２．１５、２．２、２．２５、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．５、４．０、４．５及び５からなる群から選択される上限を有する。幾つかの側面において、本発
明の試料又は組成物中の抗体当たりの共役の数は、約１．５ないし約２．５の間である。幾つかの側面において、本発明の試料又は組成物中の抗体当たりの共役の数は、約１．６ないし約２．４の間である。幾つかの側面において、本発明の試料又は組成物中の抗体当たりの共役の数は、約１．７ないし約２．３の間である。幾つかの側面において、本発明の試料又は組成物中の抗体当たりの共役の数は、約１．８ないし約２．２の間である。幾つかの側面において、本発明の試料又は組成物中の抗体当たりの共役の数は、約１．５、約１．５５、約１．６、約１．６５、約１．７、約１．７５、約１．８、約１．８５、約１．９、約１．９５、約２．０、約２．０５、約２．１、約２．１５、約２．２、約２．２５、約２．３、約２．４及び約２．５からなる群から選択される。幾つかの側面において、この量は約１．７である。幾つかの側面において、この量は約１．８である。幾つかの側面において、この量は約１．９である。幾つかの側面において、この量は約２である。幾つかの側面において、この量は約２．１である。幾つかの側面において、この量は約２．１である。幾つかの側面において、この量は約２．３である。

【0031】

本発明の幾つかの側面において、抗体当たりの共役の数は、２より小さく、抗体集団の少なくとも５０％は、抗体当たり一つの共役のみを有する。これらの試料は、これらが残りのＣＬκ部位において標的とされる更なる結合（共役）反応を可能にするため、好都合である。幾つかの側面において、本発明の試料又は組成物中の抗体当たりの共役の数は、約０．５ないし約１．５の間である。幾つかの側面において、本発明の試料又は組成物中の抗体当たりの共役の数は、約０．６ないし約１．４の間である。幾つかの側面において、本発明の試料又は組成物中の抗体当たりの共役の数は、約０．７ないし約１．３の間である。幾つかの側面において、本発明の試料又は組成物中の抗体当たりの共役の数は、約０．８ないし約１．２の間である。幾つかの側面において、本発明の試料又は組成物中の抗体当たりの共役の数は、約０．９ないし約１．１の間である。

【0032】

本発明の利点の一つは、試薬及び反応条件（特に脱離基エステル及びリンカー：抗体のモル比）によるが、ＭＡＣの組成物及び試料は、規定された数の抗体に対して規定された数のエフェクター分子を伴って産生することができることである。これは、エフェクター分子及び抗体の相対的反応性及び治療領域を均衡させる場合、特に有用であることができる。更に、幾つかの状況において、ある閾値を超えて抗体当たりのペプチドの数を増加することは、増加した標的結合又は治療効果をもたらさないかもしれない。従って、抗体当たりの共役するペプチドの数を制御することが可能であることは有用であり、そしてそうすることによって、Ｆｃ又は結合部位の干渉を最小化するように、共役の位置を指示する。従って、幾つかの状況において、一つのＫ^１８８−ＣＬκのみを優先的に修飾する減少した共役を可能にする本発明の側面が、好都合であることができる。
幾つかの側面において、ＭＡＣの試料は医薬組成物であることができる。

【0033】

ＩＧＦＲ抗体
幾つかの態様において、少なくとも一つのＡｎｇ２結合ペプチドが、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体上のリシン残基の側鎖によって共役される。幾つかの態様において、少なくとも一つのＡｎｇ２結合ペプチドが、ＣＬドメインに共有的に結合される。幾つかの態様において、少なくとも一つのＡｎｇ２結合ペプチドが、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のＦ（ａｂ）領域に共有的に結合される。幾つかの態様において、少なくとも一つのＡｎｇ２結合ペプチドが、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の軽鎖定常領域に共有的に結合される。幾つかの態様において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、リンカーによってＡｎｇ２結合ペプチドに共有的に接続される。幾つかの態様において、Ａｎｇ２結合ペプチドは、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のＣ’又はＮ’末端に融合されていない。

【0034】

幾つかの態様において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＷＯ０２０５３５９６（米国特許第７，０３７，４９８号）及びＷＯ２００５０１６９６７（米国特許第７，３７１，３７８号）
（そのそれぞれの内容は本明細書中に援用される）中に記載されているものから選択される。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：５を含んでなる重鎖定常ドメインを含んでなる。

【0035】

幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：６、配列番号：１の残基１−１２２、及び配列番号：３の残基１−１２２からなる群から選択される重鎖可変ドメインを含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：３の残基１−１２２を含んでなる重鎖可変ドメインを含んでなる。

【0036】

幾つかの態様において、ＭＡＣの重鎖は、配列番号：７、配列番号：１の残基２６−３５、及び配列番号：３の残基２６−３５からなる群から選択される配列を含んでなるＶＨＣＤＲ１領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：７を含んでなるＶＨＣＤＲ１領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣの重鎖は、配列番号：８、配列番号：３の残基５０−６４、及び配列番号：５の残基５０−６４からなる群から選択される配列を含んでなるＶＨＣＤＲ２領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：８を含んでなるＶＨＣＤＲ２領域を含んでなる。

【0037】

幾つかの態様において、ＭＡＣの重鎖は、配列番号：９、配列番号：１の残基９９−１１４、及び配列番号：３の残基９９−１１４からなる群から選択される配列を含んでなるＶＨＣＤＲ３領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：９を含んでなるＶＨＣＤＲ３領域を含んでなる。

【0038】

幾つかの態様において、ＭＡＣの重鎖は、配列番号：１０、配列番号：１の残基１−２５、配列番号：３の残基１−２５、及び配列番号：１１からなる群から選択される配列を含んでなるＶＨＦＲ１領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：１１を含んでなるＶＨＦＲ１領域を含んでなる。

【0039】

幾つかの態様において、ＭＡＣの重鎖は、配列番号：１２、配列番号：１の残基３６−４９、及び配列番号：３の残基３６−４９からなる群から選択される配列を含んでなるＶＨＦＲ２領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：１２を含んでなるＶＨＦＲ２領域を含んでなる。

【0040】

幾つかの態様において、ＭＡＣの重鎖は、配列番号：１３、配列番号：１の残基６５−９８、及び配列番号：３の残基６５−９８からなる群から選択される配列を含んでなるＶＨＦＲ３領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：１３を含んでなるＶＨＦＲ３領域を含んでなる。

【0041】

幾つかの態様において、ＭＡＣの重鎖は、配列番号：１４、配列番号：１の残基１１５−１２２、及び配列番号：３の残基１１５−１２２からなる群から選択される配列を含んでなるＶＨＦＲ４領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：１４を含んでなるＶＨＦＲ４領域を含んでなる。

【0042】

幾つかの態様において、抗ＩＧＦＲ１抗体のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３領域は、それぞれ、配列番号：３の残基２６−３５、配列番号：３の残基５０−６４、及び配列番号：３の残基９９−１１４を含んでなる。

【0043】

幾つかの態様において、抗ＩＧＦＲ１抗体のＶＨＦＲ１、ＶＨＦＲ２、ＶＨＦＲ３、及びＶＨＦＲ４領域は、それぞれ、配列番号：３の残基１−２５、配列番号：３の残基３６−４９、配列番号：３の残基６５−９８、及び配列番号：３の残基１１５−１２２を含んでなる。

【0044】

幾つかの態様において、抗ＩＧＦＲ１抗体は、配列番号：１及び配列番号：３からなる群から選択される重鎖を含んでなる。幾つかの態様において、抗ＩＧＦＲ１抗体は、配列番号：３を含んでなる重鎖を含んでなる。

【0045】

幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：１５を含んでなる軽鎖定常ドメインを含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：４５、４６又は４７を含んでなる軽鎖定常ドメインを含んでなる。

【0046】

幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：１６、配列番号：２の残基１−１０８、及び配列番号：４の残基１−１０８からなる群から選択される軽鎖可変ドメインを含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：４の残基１−１０８を含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなる。

【0047】

幾つかの態様において、ＭＡＣの軽鎖は、配列番号：１７、配列番号：２の残基２４−３４、及び配列番号：４の残基２４−３４からなる群から選択される配列を含んでなるＶＬＣＤＲ１（可変軽鎖相補性決定領域−１）領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：１７を含んでなるＶＬＣＤＲ１領域を含んでなる。

【0048】

幾つかの態様において、ＭＡＣの軽鎖は、配列番号：１８、配列番号：２の残渣４８−５４、及び配列番号：４の残基４８−５４からなる群から選択される配列を含んでなるＶＬＣＤＲ２領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：１８を含んでなるＶＬＣＤＲ２領域を含んでなる。

【0049】

幾つかの態様において、ＭＡＣの軽鎖は、配列番号：１９、配列番号：２の残渣８９−９７、及び配列番号：４の残基８９−９７からなる群から選択される配列を含んでなるＶＬＣＤＲ３領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：１９を含んでなるＶＬＣＤＲ３領域を含んでなる。

【0050】

幾つかの態様において、ＭＡＣの軽鎖は、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２の残渣１−２３、及び配列番号：４の残基１−２３からなる群から選択される配列を含んでなるＶＬＦＲ１領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：２１を含んでなるＶＬＦＲ１領域を含んでなる。

【0051】

幾つかの態様において、ＭＡＣの軽鎖は、配列番号：２２、配列番号：２の残渣３５−４７、及び配列番号：４の残基３５−４７からなる群から選択される配列を含んでなるＶＬＦＲ２領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：２２を含んでなるＶＬＦＲ２領域を含んでなる。

【0052】

幾つかの態様において、ＭＡＣの軽鎖は、配列番号：２３、配列番号：２の残渣５５−８８、及び配列番号：４の残基５５−８８からなる群から選択される配列を含んでなるＶＬＦＲ３領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：２３を含んでなるＶＬＦＲ３領域を含んでなる。

【0053】

幾つかの態様において、ＭＡＣの軽鎖は、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２の残渣９８−１０８、及び配列番号：６の残基９８−１０８からなる群から選択される配列を含んでなるＶＬＦＲ４領域を含んでなる。幾つかの態様において、ＭＡＣは、配列番号：２５を含んでなるＶＬＦＲ４領域を含んでなる。

【0054】

幾つかの態様において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤ
Ｒ３領域は、それぞれ、配列番号：４の残基２４−３４、配列番号：４の残基４８−５４、及び配列番号：４の残基８９−９６を含んでなる。

【0055】

幾つかの態様において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のＶＬＦＲ１、ＶＬＦＲ２、ＶＬＦＲ３、及びＶＬＦＲ４領域は、それぞれ、配列番号：４の残基１−２４、配列番号：４の残基３５−４７、配列番号：４の残基５５−８８、及び配列番号：４の残基９７−１０８を含んでなる。

【0056】

幾つかの態様において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、配列番号：２及び配列番号：４からなる群から選択される軽鎖を含んでなる。幾つかの態様において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、配列番号：４を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0057】

幾つかの態様において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、配列番号：１を含んでなる重鎖及び配列番号：２を含んでなる軽鎖を含んでなる。
幾つかの態様において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、配列番号：３を含んでなる重鎖及び配列番号：４を含んでなる軽鎖を含んでなる。

【0058】

抗体２．１２．１は、ＷＯ０２０５３５９６中に記載されている。ＩＧＦ１Ｒに対して特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ２．１２．１は、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に、２０００年１２月１２日に供託番号ＰＴＡ−２７９２で供託された。

【0059】

幾つかの態様において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、モチーフＫ^１８８Ｈ^１８９ｘ^１９０をＣＬκ領域に含んでなり、ここにおいてｘは、Ｋａｂａｔ番号によるＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｒ又はＫである。幾つかの側面において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、その両方の内容が本明細書中で援用される、ＷＯ２００９０３２１４５（ＵＳ２００９０９２６１４）又はＷＯ２００５００５６３５（米国特許第７，５７９，１５７号）から選択されるものである。幾つかの態様において、本発明のＭＡＣは、抗体のＩＧＦ１Ｒ結合親和性を抑制しないような方法で、少なくとも一つのＡｎｇ２結合ペプチドに共役する抗ＩＦＧ１Ｒ抗体又はその抗原結合部位を含んでなる。

【0060】

幾つかの側面において、抗体は、エフェクター分子と同じ経路内の異なった標的を標的とする。幾つかの側面において、抗体は、エフェクター分子とは異なった標的を標的とする。

【0061】

幾つかの側面において、共役のために使用される抗体は、腫瘍学の分野において有用であることができる。適した抗体は；癌を、そして特に非ホジキンスリンパ腫を、そして更にリウマチ様関節炎を治療するために使用される、キメラのＩｇＧ１_κ抗ＣＤ２０抗体のリツキシマブ（リツキサン^ＴＭ）；癌を、そして特に大腸、頭頸部癌を治療するために使用される、キメラのＩｇＧ１_κ抗ＥＧＦ受容体抗体のセツキシマブ（エルビタックス^ＴＭ）を含む。

【0062】

幾つかの側面において、共役のために使用される抗体は、自己免疫及び他の免疫学的疾患の分野において有用であることができる。適した抗体は、リウマチ様関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、及び強直性脊椎炎を治療するために使用される、キメラのＩｇＧ１_κ抗ＴＮＦα抗体のインフリキシマブ（レミケード^ＴＭ）；リウマチ様関節炎、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎及び強直性脊椎炎を治療するために使用される、ヒトのＩｇＧ１_κ抗ＴＮＦα抗体のアダリムマブ（ヒューミラ^ＴＭ）；多発性硬化症、リウマチ様関節炎、乾癬、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、
強直性脊椎炎、クローン病を治療するために使用される、ヒト化ＩｇＧ４_κ抗α４インテグリン抗体のナタリズマブ（タイサブリＴＭ）；アレルギー性喘息を治療するために使用される、ヒト化ＩｇＧ１_κ抗ＩｇＥ抗体のオマリズマブ（ゾレア^ＴＭ）；滲出型ＡＭＤを治療するために使用される、ヒト化ＩｇＧ１_κ抗ＶＥＧＦ抗体のラニビズマブ（ルセンチス^ＴＭ）；及び呼吸器多核体ウイルスを含む感染性疾病を治療するために使用される、ヒト化ＩｇＧ１_κ抗ＲＳＶ抗体のパリビズマブ（シナジス^ＴＭ）を含む。

【0063】

幾つかの側面において、本発明の化合物及び組成物は、上述の症状を治療するために使用することができる。
エフェクター分子（Effector Moieties）
エフェクター分子は、治療剤、タンパク質、ペプチド、核酸、アプタマー、小分子、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝調節物質、ホルモン、毒素、成長因子又は他の調節性タンパク質であることができ、或いはホースラディッシュペルオキシダーゼのような容易に検出又は可視化可能であることができる酵素のような診断剤であることができる。

【0064】

幾つかの側面において、エフェクター分子は、タンパク質又はペプチドであることができ、そしてペプチド連結残基を経由してリンカーに接続することができる。タンパク質又はペプチドは、アミノ末端キャッピング基Ｒ^１及びカルボキシル末端キャッピング基Ｒ^２の片方又は両方を含んでなることができる。Ｒ^１は、ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）Ｃ_６Ｈ_５、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_１−５Ｍｅ、ジクロロベンゾイル（ＤＣＢ）、ジフルオロベンゾイル（ＤＦＢ）、ピリジニルカルボン酸（ＰｙＣ）又はアミド−２−ＰＥＧ、アミノ保護基、脂質 脂肪酸基又は炭水化物であることができる。Ｒ^２は、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨ（ＣＨ_３）、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、ＮＨＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_３、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、ＮＨＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、ＮＨＣ_６Ｈ_５、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ＮＨＯＣＨ_３、ＮＨＯＣＨ_２ＣＨ_３、カルボキシ保護基、脂質 脂肪酸基又は炭水化物であることができる。

【0065】

タンパク質又はペプチド連結残基は、Ｋ、Ｋ（ＳＨ）、リシン同族体、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｃ、チオール含有残基、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ又はＱであることができる。タンパク質又はペプチドは、Ｎ末端アミノ酸のアミノ末端を経由してリンカーに接続することができる。タンパク質又はペプチドは、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル末端を経由してリンカーに接続することができる。更なるアミノ酸残基を、連結残基として機能させるために、アミノ酸側鎖、或いはアミノ又はカルボキシル末端を経由するかを問わない接続によって、Ｎ又はＣ末端に加えることができる。

【0066】

Ａｎｇ２−結合ペプチド
エフェクター分子は、Ａｎｇ２結合ペプチドであることができる。幾つかの態様において、Ａｎｇ２結合ペプチドは、ＷＯ２００８０５６３４６（ＵＳ２００８１６６３６４）（この内容は本明細書中に援用される）中に記載されているものから選択される配列を含んでなる。幾つかの態様において、Ａｎｇ２結合ペプチドは、配列：
Ｑ^１（ＡｃＫ）^２Ｙ^３Ｑ^４Ｐ^５Ｌ^６Ｄ^７Ｅ^８Ｘ^９Ｄ^１０Ｋ^１１Ｔ^１２Ｌ^１３Ｙ^１４Ｄ^１５Ｑ^１６Ｆ^１７Ｍ^１８Ｌ^１９Ｑ^２０Ｑ^２１Ｇ^２２（：２６）
を含んでなり、ここにおいて、配列番号：２６のＸ^９は、アシル−リシン（ＡｃＫ）又はロイシンであり（本明細書中で以下Ａｎｇ２−Ｘ^９と命名される）、そして
ここにおいて、Ａｎｇ２結合ペプチドのＸ^９、Ｋ^１１、Ｌ^１３、Ｑ^１６、Ｍ^１８、又はＬ^１９は、リンカーに共有的に接続された求核性側鎖を含んでなるＡｎｇ２連結残基によって置換され、連結残基は、Ｋ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｋ（ＳＨ）、ホモシステイン、ホモセリ
ン、Ｄａｐ、及びＤａｂのようなリシンの同族体からなる群から選択される。幾つかの態様において、Ａｎｇ２連結残基は、Ｋ、Ｋ（ＳＨ）、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｄａｐ、及びＤａｂからなる群から選択することができる。幾つかの態様において、Ａｎｇ２連結残基は、Ｋである。Ａｎｇ２連結残基は、Ｋ^１１であることができる。幾つかの態様において、Ａｎｇ２連結残基は、Ｋ（ＳＨ）であることができる。Ａｎｇ２連結残基は、Ｋ（ＳＨ）^１１であることができる。

【0067】

幾つかの態様において、Ａｎｇ２結合ペプチドは、配列：
Ｑ^１（ＡｃＫ）^２Ｙ^３Ｑ^４Ｐ^５Ｌ^６Ｄ^７Ｅ^８（ＡｃＫ）^９Ｄ^１０Ｋ^１１Ｔ^１２Ｌ^１３Ｙ^１４Ｄ^１５Ｑ^１６Ｆ^１７Ｍ^１８Ｌ^１９Ｑ^２０Ｑ^２１Ｇ^２２（配列番号：２７）
を含んでなり、ここにおいて、Ａｎｇ２−Ｋ^１１は、Ａｎｇ２連結残基である。

【0068】

幾つかの態様において、Ａｎｇ２結合ペプチドは、配列：
Ｑ^１（ＡｃＫ）^２Ｙ^３Ｑ^４Ｐ^５Ｌ^６Ｄ^７Ｅ^８Ｌ^９Ｄ^１０Ｋ^１１Ｔ^１２Ｌ^１３Ｙ^１４Ｄ^１５Ｑ^１６Ｆ^１７Ｍ^１８Ｌ^１９Ｑ^２０Ｑ^２１Ｇ^２２（配列番号：２８）
を含んでなり、ここにおいて、Ａｎｇ２−Ｋ^１１は、Ａｎｇ２連結残基である。

【0069】

幾つかの態様において、Ａｎｇ２結合ペプチドは、配列：
配列番号：２９ Ｑ^１（ＡｃＫ）^２Ｙ^３Ｑ^４Ｐ^５Ｌ^６Ｄ^７Ｅ^８Ｋ^９Ｄ^１０（ＡｃＫ）^１１Ｔ^１２Ｌ^１３Ｙ^１４Ｄ^１５Ｑ^１６Ｆ^１７Ｍ^１８Ｌ^１９Ｑ^２０Ｑ^２１Ｇ^２２
を含んでなり、ここにおいて、Ａｎｇ２−Ｋ^９は、Ａｎｇ２連結残基である。

【0070】

幾つかの態様において、Ａｎｇ２結合ペプチドは、配列：
配列番号：３０ Ｑ^１（ＡｃＫ）^２Ｙ^３Ｑ^４Ｐ^５Ｌ^６Ｄ^７Ｅ^８Ｌ^９Ｄ^１０（ＡｃＫ）^１１Ｔ^１２Ｌ^１３Ｙ^１４Ｄ^１５Ｋ^１６Ｆ^１７Ｍ^１８Ｌ^１９Ｑ^２０Ｑ^２１Ｇ^２２
を含んでなり、ここにおいて、Ａｎｇ２−Ｋ^１６は、Ａｎｇ２連結残基である。

【0071】

幾つかの態様において、Ａｎｇ２結合ペプチドは、配列：
配列番号：３１ Ｑ^１（ＡｃＫ）^２Ｙ^３Ｑ^４Ｐ^５Ｌ^６Ｄ^７Ｅ^８Ｌ^９Ｄ^１０（ＡｃＫ）^１１Ｔ^１２Ｌ^１３Ｙ^１４Ｄ^１５Ｑ^１６Ｆ^１７Ｋ^１８Ｌ^１９Ｑ^２０Ｑ^２１Ｇ^２２
を含んでなり、ここにおいて、Ａｎｇ２−Ｋ^１８は、Ａｎｇ２連結残基である。

【0072】

幾つかの態様において、Ａｎｇ２結合ペプチドは、配列：
配列番号：３２ Ｑ^１（ＡｃＫ）^２Ｙ^３Ｑ^４Ｐ^５Ｌ^６Ｄ^７Ｅ^８Ｌ^９Ｄ^１０（ＡｃＫ）^１１Ｔ^１２Ｌ^１３Ｙ^１４Ｄ^１５Ｑ^１６Ｆ^１７Ｍ^１８Ｋ^１９Ｑ^２０Ｑ^２１Ｇ^２２
を含んでなり、ここにおいて、Ａｎｇ２−Ｋ^１９は、Ａｎｇ２連結残基である。

【0073】

幾つかの態様において、Ａｎｇ２結合ペプチドは、更にＮ末端キャッピング基Ｒ^１を含んでなり−ここにおいて、Ｒ^１は、ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、Ｃ（Ｏ）Ｃ_６Ｈ_５、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_１−５Ｍｅ、ジクロロベンゾイル（ＤＣＢ）、ジフルオロベンゾイル（ＤＦＢ）、ピリジニルカルボン酸（ＰｙＣ）又はアミド−２−ＰＥＧ、アミノ保護基、脂質脂肪酸基又は炭水化物である。

【0074】

幾つかの態様において、Ａｎｇ２結合ペプチドは、更にＣ末端キャッピング基−Ｒ^２を含んでなり、ここにおいて、Ｒ^２は、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨ（ＣＨ_３）、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、ＮＨＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_３、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、ＮＨＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３、ＮＨＣ_６Ｈ_５、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ＮＨＯＣＨ_３、ＮＨＯＣＨ_２ＣＨ_３、カルボキシ保護基、脂質脂肪酸基又は炭水化物である。

【0075】

幾つかの態様において、Ｒ^１は、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３であることができる。幾つかの態様において、Ｒ^２は、ＮＨ_２であることができる。
Ｎ末端及びＣ末端キャッピング基と一緒のＡｎｇ２結合ペプチドは、式：［Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３］−［配列番号：２７］−［ＮＨ_２］：［Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３］−Ｑ^１（Ａ_ｃＫ）^２Ｙ^３Ｑ^４Ｐ^５Ｌ^６Ｄ^７Ｅ^８（Ａ_ｃＫ）^９Ｄ^１０Ｋ^１１Ｔ^１２Ｌ^１３Ｙ^１４Ｄ^１５Ｑ^１６Ｆ^１７Ｍ^１８Ｌ^１９Ｑ^２０Ｑ^２１Ｇ^２２−［ＮＨ_２］を含んでなることができ、ここにおいて、Ａｎｇ２−Ｋ^１１は、Ａｎｇ２連結残基である。

【0076】

本明細書中に記載されるＡｎｇ２ペプチドは、記載したように多くの抗体、特に癌又は増加した血管新生のような増殖性疾患の治療において有用な抗体に共役することができ、そしてｈ３８Ｃ２のような触媒抗体に共役して、ＭＡＣを形成することができる。

【0077】

リンカー
本発明のエフェクター分子（小分子、アプタマー、核酸、タンパク質、又はペプチド（例えばＡｎｇ２結合ペプチド）のような）は、抗体又はその抗原結合部位（例えば抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）にリンカーによって共有的に接続することができる。リンカーは、ペプチド連結残基の側鎖のアミノ基によってペプチドに共有的に接続することができる。これは、リシン残基であることができる。幾つかの態様において、連結残基は、Ｃｙｓ又はＫ（ＳＨ）のようなチオール保有残基であり、そしてリンカーは、連結残基の末端チオール基によってペプチドに共有的に接続される。

【0078】

リンカーは、直鎖又は分枝鎖であることができ（共役付加当たり一つより多いエフェクター分子と共役するために）、そして所望により一つ又はそれより多い炭素環又は複素環基を含んでいてもよい。リンカーの長さは、エフェクター分子及び抗体間の直鎖原子の数の観点から考えることができ、芳香族環等のような環式分子は、環の周りの最短の経路をとることによって数えられる。幾つかの態様において、リンカーは、５−１５個の原子、他の態様では１５−３０個の原子、なお他の態様では３０−５０個の原子、なお他の態様では５０−１００個の原子、そしてなお他の態様では１００−２００個の原子間の直線的広がりを有する。幾つかの態様において、リンカーの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０からなる群から選択される下限、及び７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、及び２００からなる群から選択される上限の範囲である。

【0079】

他のリンカーの留意事項は、溶解度、親油性、親水性、疎水性、安定性（計画された分解と同様に事実上安定）、強剛性、融通性、免疫原性、抗体結合の調節、ミセル又はリポソームへの組込みの能力、等のような得られた化合物の物理的又は薬物動態学的特性を含む。

【0080】

リンカーは、ペプチジルリンカーであることができる。幾つかの態様において、ペプチジルリンカーは、単一アミノ酸残基の繰返し（例えばポリグリシン）、又はエフェクター分子の好ましい提示又は薬物動態を与えるペプチドリンカーを得るための、アミノ酸残基の組合せのような３−２０個間のアミノ酸の長さであることができる。活性化基の存在と最も適合性であるものであるペプチジルリンカーは、リシン及びヒスチジン残基を欠くことができる。配列番号：５９は、例示的なペプチジルリンカーである。

【0081】

別の方法として、リンカーは、非ペプチジルリンカーであることができる。これらの種類のリンカーの典型的な例は、直鎖又は分枝鎖炭化水素、或いは各種の長さのポリエチレングリコールに基づくものであるものである。これらは、芳香族又は非芳香族環、ハロゲン、ケトン、アルデヒド、エステル、スルホニル、リン酸基、等のような他の基を、安定性、強剛性、等電点を達成するために組込むことができる。

【0082】

本発明の幾つかの側面において、リンカーは、式：−Ｘ−Ｙ−Ｚ−を含んでなることができ；ここにおいて、Ｘは、エフェクター分子への接続基であり（例えば、ペプチド連結残基による）、Ｙは、スペーサー領域であり、そしてＺは、抗体（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）上のリシン又はシステイン残基の側鎖への接続分子である。幾つかの側面において、リンカーは、抗体に共役していない場合、式ＸＹＺ^＊のものであることができ、ここで、Ｚ^＊は、抗体に接続した場合、脱離基Ｚ^＊が抗体の共役部位と反応して、共役リンカーＸＹＺを形成するような脱離基である。

【0083】

Ｘは、エフェクター分子への（例えば、ペプチド連結残基によって）特異的方向性共有連結戦略が可能であるように選択することができる。幾つかの側面において、Ｘは、ＣＯＯＨ、イソシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、アシルアジド、スルホン酸、ハロゲン化スルホニル、アルデヒド、ケトン、エポキシド、炭酸塩、アルキル化試薬、イミドエステル、アミン基、及びマレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）基からなる群から選択することができる。例えば、ペプチド連結残基が求核性基を含んでなる場合、Ｘは、求電子基であることができ、そして逆の場合も同じである。例えば、ペプチド連結残基の側鎖がＫ、Ｈ、オルニチン、Ｄａｐ、又はＤａｂのようなアミノ基を含んでなる場合、Ｘは、ＣＯＯＨ、又は他の類似の反応性求電子物質、例えば、イソシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、アシルアジド、スルホン酸又はハロゲン化スルホニル、アルデヒド又はケトン、エポキシド、炭酸塩、アルキル化試薬或いはイミドエステルであることができる。ペプチド連結残基がＤ又はＥである場合、Ｘは、アミン基のような求核基を含んでなることができる。これらの戦略のいずれかは、Ｘ基及びペプチド連結残基間に、アミド結合形成戦略によって共有結合が形成されることを可能にする。例えば、ＸがＣＯＯＨである場合、これは、ペンタフルオロフェニルエステルとして活性化されることができる。この場合、ペプチド連結ペプチド上のアミノ基との反応は、アミド結合の形成に導き、一方ペンタフルオロフェノールは脱離基（これはＸ^＊と呼ばれる）である。

【0084】

【化1】

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【0085】

矢印は、ペプチド連結残基への接続点を示し、そして平行線は、リンカーのＹ基への接続点である。

【0086】

【化2】

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【0087】

ペプチド連結基が、Ｃ、Ｃの相同体、又は他のチオール基含有残基（Ｋ（ＳＨ）のような）である場合、Ｘは、ペプチド連結残基にＸ基を共有的に連結するための、チオール−マレイミド付加反応戦略を可能にするマレイミド基を含んでなることができる。幾つかの側面において、Ｘは：

【0088】

【化3】

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【0089】

のマレイミドであることができ、式中、矢印は、ペプチド連結残基への接続点を示し、そして平行線は、リンカーのＹ基への接続である。命名の容易さのために、マレイミド基を使用して構築された本明細書中に記載されるリンカーは、リンカーの構築後、マレイミド基は一般的にスクシンイミド環に転換されるが、マレイミド含有リンカーと記載され、そしてこれを示すためにＭＡＬと呼ばれる。

【0090】

【化4】

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【0091】

幾つかの側面において、連結残基は、Ｋ（ＳＨ）であり、そしてＸ基は、マレイミドである。
幾つかの側面において、Ｘは、ペンタフルオロフェニルエステルで活性化されたカルボキシル官能基を含んでなり、これは、ペプチド上のリシン側鎖とアミドを形成することができる。

【0092】

【化5】

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【0093】

幾つかの側面において、Ｘは、チオール基を含んでなることができ、ペプチド連結残基及びＸ基間にジスルフィド橋を形成することを可能にする。
幾つかの態様において、Ｙは、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択されるいずれもの原子を含み、そして一つ又はそれより多いアミノ酸、ポリマー或いはブロックコポリマーを含んでなることができる生物学的に適合性の接続鎖である。Ｙは、２−１００個の原子間のリンカーの全長を提供するように選択することがで
きる。Ｙは、リンカーの全長が５ないし３０個の原子間であるように選択することができる。Ｙは、リンカーの全長が１５−２５個の原子間であるように選択することができる。Ｙは、リンカーの全長が約１７ないし約１９個の原子間であるように選択することができる。幾つかの態様において、Ｙは：

【0094】

【化6】

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【0095】

のようなアミノポリエチレングリコール酸であることができ、式中、ｎ＝０ないし１０、幾つかの側面において１−１０、幾つかの側面において１−５、そして幾つかの側面において１である。

【0096】

幾つかの側面において、Ｙは：

【0097】

【化7】

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【0098】

のようなポリエチレングリコール二酸であることができ、式中、ｎ＝０ないし１０、幾つかの側面において１−１０、幾つかの側面において１−５、そして幾つかの側面において１、そして幾つかの側面において、２である。

【0099】

本発明の幾つかの側面において、リンカーのＹ部分は、式：

【0100】

【化8】

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【0101】

を含んでなる。
幾つかの側面において、Ｙは：

【0102】

【化9】

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【0103】

のようなアミノアルカン酸であることができ、式中、ｎ＝０ないし２０、幾つかの側面において１−１０、幾つかの側面において１−５、そして幾つかの側面において１、そして幾つかの側面において、２である。

【0104】

幾つかの側面において、Ｙは：

【0105】

【化10】

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【0106】

のようなアルカン二酸であることができ、式中、ｎ＝０ないし２０、幾つかの側面において１−１０、幾つかの側面において１−５、そして幾つかの側面において１、そして幾つかの側面において、２である。

【0107】

幾つかの側面において、Ｙは：

【0108】

【化11】

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【0109】

のようなポリグリシンであることができ、式中、ｎ＝０ないし１０、幾つかの側面において１−１０、幾つかの側面において１−５、そして幾つかの側面において１、そして幾つかの側面において、２である。

【0110】

幾つかの側面において、Ｙ、Ｘ−Ｙ、Ｙ−Ｚ、及びＸ−Ｙ−Ｚは：

【0111】

【化12】

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【0112】

からなる群から選択することができ、式中、ｍ、ｎ及びｊは、それぞれ独立に０ないし３０である。幾つかの側面において、ｎ＝１−１０、幾つかの側面において、ｎ＝１−５である。幾つかの側面において、ｎの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてｎの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される。Ｎは、１であることができる。Ｎは、２であることができる。Ｎは、３であることができる。Ｎは、４であることができる。Ｎは、５であることができる。Ｎは、６であることができる。幾つかの側面において、ｍ＝１−１０、幾つかの側面において、ｍ＝１−５である。幾つかの側面において、ｍの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてｍの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される。Ｍは、１であることができる。Ｍは、２であることができる。Ｍは、３であることができる。Ｍは、４であることができる。Ｍは、５であることができる。Ｍは、６であることができる。幾つかの側面において、ｊ＝１−１０、幾つかの側面において、ｊ＝１−５である。幾つかの側面において、ｊの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から
選択され、そしてｊの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される。Ｊは、１であることができる。Ｊは、２であることができる。Ｊは、３であることができる。Ｊは、４であることができる。Ｊは、５であることができる。Ｊは、６であることができる。幾つかの側面において、Ｙの全長は、２００個の原子を超えない。幾つかの側面において、Ｙの全長は、１５０個の原子を超えない。幾つかの側面において、Ｙの全長は、１００個の原子を超えない。幾つかの側面において、Ｙの全長は、５０個の原子を超えない。幾つかの側面において、原子の数におけるＹの全鎖長の範囲は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、及び６０からなる群から選択される下限、並びに５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、及び１００からなる群から選択される上限を有することができる。幾つかの側面において、ＸＹＺリンカーは、上記のＹ基と同一であることができる。幾つかの側面において、波線は、Ｘ基に接続する。幾つかの側面において、平行線は、Ｘ基に接続する。幾つかの側面において、波線は、Ｚ基に接続する。幾つかの側面において、平行線は、Ｚ基に接続する。幾つかの側面において、波線は、Ｋ^１８８−ＣＬκの側鎖に接続する。幾つかの側面において、平行線は、Ｋ^１８８−ＣＬκの側鎖に接続する。幾つかの側面において、波線は、エフェクター分子に接続する。幾つかの側面において、平行線は、エフェクター分子に接続する。

【0113】

幾つかの側面において、Ｙ、Ｙ−Ｚ及び／又はＸ−Ｙは：

【0114】

【化13】

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【0115】

のようなマレイミドＰＥＧ酸であることができ、式中、ｎ＝０ないし１２、幾つかの側面において１−１０、幾つかの側面において１−５、そして幾つかの側面において１、そして幾つかの側面において、２である。

【0116】

幾つかの側面において、Ｙ、Ｙ−Ｚ及び／又はＸ−Ｙは：

【0117】

【化14】

[この文献は図面を表示できません]

【0118】

のような、ｎの値の範囲の下限が０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてｎの値の範囲の上限が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択されるようなマレイミドＰＥＧ酸であることができる。Ｎは、１であることができる。Ｎは、２であることができる。Ｎは、３であることができる。Ｎは、４であることができる。Ｎは、５であることができる。Ｎは
、６であることができる。幾つかの側面において、Ｙ、Ｙ−Ｚ及び／又はＸ−Ｙは、式：

【0119】

【化15】

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【0120】

を含んでなり、Ｚ^＊は、抗体上のリシン側鎖に対して特異的方向性共有連結戦略が可能であるように選択することができる。例えば、Ｚは、表面のリシン側鎖のε−アミノと、多くの可能なアミド結合形成戦略の一つを使用して、反応させるためのＣＯＯＨ、又は他の類似の反応性求電子物質であることができる。

【0121】

幾つかの側面において、Ｚ^＊は、活性なエステルを形成するために使用することができる。活性なエステルは、アミンに接続し、そして従って抗体のリシン側鎖のε−アミノに共役することができる。活性なエステルの形成を可能にするＺカルボキシル官能基は、Ｙ基の末端に存在するものである。活性なエステルのアルコール又はフェノール官能基は、結合反応中に脱離基Ｚ^＊として作用し、抗体上のリシン側鎖とのアミドの産生による接続を可能にする。

【0122】

幾つかの態様において、Ｚ^＊基は、式：

【0123】

【化16】

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【0124】

の構造を含んでなり、式中、Ｒ’は、脂肪族又は芳香族基である。
幾つかの態様において、Ｚ^＊基は、式：

【0125】

【化17】

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【0126】

のものであり、式中、Ｒ’＝単独又は組合せのＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチルのいずれかであり、そして１ないし５個間の量で存在することができる。幾つかの態様において、Ｒ^１は、ハロゲンであることができ、そして４又は５個のハロゲン原子が存在することができる。幾つかの態様において、４個のＲ^１原子が存在することができる。幾つかの態様において、５個のＲ^１原子が存在することができる。幾つかの態様において、Ｚ^＊は、テトラフルオロフェニルであることができる。幾つかの態様において、Ｚ^＊は、式：

【0127】

【化18】

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【0128】

を含んでなることができ、式中、平行線は、リンカーのＹ部分への接続点である。
幾つかの側面において、Ｚ^＊基は、式：

【0129】

【化19】

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【0130】

のものであり、式中、Ｒ’＝単独又は組合せのＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチルのいずれかであり、そしてｈ＝１、２、３、４、又は５である。幾つかの態様において、Ｒ^１は、ハロゲンであることができる。幾つかの態様において、Ｒ^１は、Ｆ又はＣｌであり、そしてｈ＝４又は５である。幾つかの態様において、Ｒ^１は、Ｆ又はＣｌであり、そしてｈ＝５である。幾つかの態様において、Ｒ^１は、Ｆであり、そしてｈ＝２、３、４又は５である。幾つかの態様において、Ｒ^１は、Ｆであり、そしてｈ＝３，４又は５である。幾つかの態様において、Ｒ^１は、Ｆであり、そしてｈ＝４又は５である。幾つかの態様において、Ｒ^１は、Ｆであり、そしてｈ＝５である。幾つかの側面において、Ｚ^＊は：

【0131】

【化20】

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【0132】

からなる群から選択することができる。
このような活性なエステルのために、脱離基はＺ^＊であり、そしてＺ基自体は、Ｙ基に接続されたカルボニルである。抗体と反応した場合、Ｚ^＊基は、以下に示すようにアミドを形成する：

【0133】

【化21】

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【0134】

幾つかの態様において、Ｚは：

【0135】

【化22】

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【0136】

である。
幾つかの態様において、Ｚ^＊基は：

【0137】

【化23】

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【0138】

のようなスクアリン酸（ｓｑｕａｒａｔｅ）エステルを含んでなり、式中、Ｒ＝脂肪族基又は置換された芳香族であり、そして：

【0139】

【化24】

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【0140】

からなる群から選択することができる。
幾つかの態様において、Ｚ基は、マレイミド基：

【0141】

【化25】

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【0142】

を含んでなる。
幾つかの側面において、Ｘ^＊ＹＺ^＊リンカーは：

【0143】

【化26】

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【0144】

の構造のマレイミド−ＰＥＧ−ＰＦＰエステルを含んでなり、式中、ｎ＝１ないし１２である。幾つかの側面において、ｎ＝１ないし５である。幾つかの側面において、ｎ＝２である。幾つかの側面において、ｎ＝１である。

【0145】

幾つかの側面において、ＭＡＣは、式：

【0146】

【化27】

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【0147】

のＸＹＺリンカーを含んでなり、式中、ｎ＝１−１２である。幾つかの側面において、ｎ＝１ないし５である。幾つかの側面において、ｎ＝１ないし３である。幾つかの側面において、ｎ＝２である。幾つかの側面において、ｎ＝１である。

【0148】

幾つかの側面において、Ｘ^＊ＹＺ^＊リンカーは：

【0149】

【化28】

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【0150】

からなる群から選択される構造を含んでなり、
そして
式中、ｍ、ｎ及びｊは、それぞれ独立に０ないし３０であり、Ｒ^１はＦであり、そしてｈ＝２、３、４、又は５である。幾つかの側面において、ｎ＝１−１０であり、幾つかの側面において、ｎ＝１−５である。幾つかの側面において、ｎの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてｎの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される。Ｎは、１であることができる。Ｎは、２であることができる。Ｎは、３であることができる。Ｎは、４であることができる。Ｎは、５であることができる。Ｎは、６であることができる。幾つかの側面において、ｍ＝１−１０であり、幾つかの側面において、ｍ＝１−５である。幾つかの側面において、ｍの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてｍの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される。Ｍは、１であることができる。Ｍは、２であることができる。Ｍは、３であることができる。Ｍは、４であることができる。Ｍは、５であることができる。Ｍは、６であることができる。幾つかの側面において、ｊ＝１−１０であり、幾つかの側
面において、ｊ＝１−５である。幾つかの側面において、ｊの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてｊの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される。Ｊは、１であることができる。Ｊは、２であることができる。Ｊは、３であることができる。Ｊは、４であることができる。Ｊは、５であることができる。Ｊは、６であることができる。幾つかの側面において、Ｙの全長は、２００個の原子を超えない。幾つかの側面において、Ｙの全長は、１５０個の原子を超えない。幾つかの側面において、Ｙの全長は、１００個の原子を超えない。幾つかの側面において、Ｙの全長は、５０個の原子を超えない。幾つかの側面において、原子の数におけるＹの全鎖長の範囲は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、及び６０からなる群から選択される下限、並びに５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、及び１００からなる群から選択される上限を有することができる。

【0151】

幾つかの側面において、ＭＡＣは、式：

【0152】

【化29】

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【0153】

のＸＹＺリンカーを含んでなる。
幾つかの側面において、Ｘ^＊ＹＺ^＊リンカーは、式：

【0154】

【化30】

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【0155】

のＰＥＧ−ビス−ペンタフルオロフェニルエステルを含んでなり、式中、ｎ＝１ないし１２である。幾つかの側面において、ｎ＝１ないし１０である。幾つかの側面において、ｎ＝１ないし５である。幾つかの側面において、ｎ＝２である。幾つかの側面において、ｎ＝１である
幾つかの側面において、ＭＡＣは、式：

【0156】

【化31】

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【0157】

のＸＹＺリンカーを含んでなる。
幾つかの側面において、ＭＡＣは、式：

【0158】

【化32】

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【0159】

のＸＹＺリンカーを含んでなる。
幾つかの態様において、ペプチドは、ＸＹＺ^＊に束縛された場合、式：

【0160】

【化33】

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【0161】

を含んでなる。
幾つかの態様において、ＸＹＺ^＊に束縛されたペプチドは、式：

【0162】

【化34】

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【0163】

を含んでなる。
幾つかの側面において、ＭＡＣは、式：

【0164】

【化35】

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【0165】

の化合物を含んでなり、式中、Ａｎｇ２−Ｋは、Ａｎｇ２結合ペプチドのリシン又は修飾されたリシン残基であり、そしてＡｂ−Ｋ−Ａｂ’は、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体上のリシン残基である。

【0166】

幾つかの側面において、ＭＡＣは、式：

【0167】

【化36】

[この文献は図面を表示できません]

【0168】

の化合物を含んでなり、式中、Ａｎｇ２−Ｋは、Ａｎｇ２結合ペプチドのリシン又は修飾されたリシン残基であり、そしてＡｂ−Ｋ−Ａｂは、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体上のリシン残基である。

【0169】

幾つかの側面において、ＭＡＣは、式：

【0170】

【化37】

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【0171】

の化合物を含んでなり、式中、Ａｂ−Ｋ−Ａｂは、抗体２．１２．１．ｆｘのＫ^１８８である。
幾つかの側面において、ＭＡＣは、式：

【0172】

【化38】

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【0173】

を含んでなり、式中、Ａｂ−Ｋ−Ａｂは、抗体２．１２．１．ｆｘのＫ^１８８である。
幾つかの側面において、ＭＡＣは、抗体（これは抗ＩＧＦ１Ｒ抗体であることができる）当たり共役された二つのペプチド（これはＡｎｇ２結合ペプチドであることができる）を含んでなる。幾つかの側面において、一つのペプチドは、抗体の二つのＫ^１８８残基、又はその抗原結合断片のそれぞれに共役される（これは抗体２．１２．１．ｆｘであるこ
とができる）。

【0174】

幾つかの側面において、ＭＡＣは：

【0175】

【化39】

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【0176】

からなる群から選択される式を含んでなり、式中、Ｋ^１８８−ＣＬκは、前記Ｋ^１８８−ＣＬκの側鎖への共有連結であり、エフェクター分子−ＬＲは、エフェクター分子への共有連結であり、そしてｍ、ｎ及びｊは、それぞれ独立に０−３０である。幾つかの側面において、ｎ＝１−１０であり、幾つかの側面において、ｎ＝１−５である。幾つかの側面において、ｎの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてｎの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される。Ｎは、１であることができる。Ｎは、２であることができる。Ｎは、３であることができる。Ｎは、４であることができる。Ｎは、５であることができる。Ｎは、６であることができる。幾つかの側面において、ｍ＝１−１０であり、幾つかの側面において、ｍ＝１−５である。幾つかの側面において、ｍの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてｍの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される。Ｍは、１であることができる。Ｍは、２であることができる。Ｍは、３であることができる。Ｍは、４であることができる。Ｍは、５であることができる。Ｍは、６であることができる。幾つかの側面において、ｊ＝１−１０であり、幾つかの側面において、ｊ＝１−５である。幾つかの側面において、ｊの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０からなる群から選択され、そしてｊの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群から選択される。Ｊは、１であることができる。Ｊは、２であることができる。Ｊは、３であることができる。Ｊは、４であることができる。Ｊは、５であることができる。Ｊは、６であることができる。幾つかの側面において、Ｙの全長は、２００個の原子を超えない。幾つかの側面において、Ｙの全長は、１５０個の原子を超えない。幾つかの側面において、Ｙの全長は、１００個の原子を超えない。幾つかの側面において、Ｙの全長は、５０個の原子を超えない。幾つかの側面において、原子の数におけるＹの全鎖長の範囲は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、及び６０からなる群から選択される下限、並びに５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、及び１００からなる群から選択される上限を有することができる。

【0177】

共役(結合conjugation)の方法
幾つかの側面において、本発明は、抗体又は抗原結合部位を含んでなる多機能性抗体複合体（ＭＡＣ）を調製する方法を提供し、抗体は、ＣＬκ−Ｋ^１８８（Ｋａｂａｔ番号による）の側鎖に接続されるリンカーを経由して少なくとも一つのエフェクター分子に共有的に共役され、前記方法は：式：

【0178】

【化40】

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【0179】

の脱離基ｚ^＊中で終結するリンカーにエフェクター分子を共有的に接続することを含んでなり、式中、Ｒ^１は、単独又は組合せのＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチルのいずれかであり、そして１ないし５間の値で存在することができ、そしてこのように形成されたエフェクター分子−リンカー−脱離基複合体を抗体と、約３．５：
１ないし約４．５：１間のエフェクター分子：抗体のモル比で反応させる。幾つかの側面において、モル比は、約３．７：１ないし４．３：１である。

【0180】

幾つかの側面において、Ｚ^＊基は、式：

【0181】

【化41】

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【0182】

のものであり、式中、Ｒ^１は、単独又は組合せのＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチルのいずれかであり、そしてｈ＝１、２、３、４、又は５である。幾つかの態様において、Ｒ^１は、ハロゲンであることができる。幾つかの態様において、Ｒ１は、Ｆ又はＣｌであり、そしてｈ＝４又は５である。幾つかの態様において、Ｒ^１は、Ｆ又はＣｌであり、そしてｈ＝５である。幾つかの態様において、Ｒ^１は、Ｆであり、そしてｈ＝１、２、３、４又は５である。幾つかの態様において、Ｒ^１は、Ｆであり、そしてｈ＝３、４又は５である。幾つかの態様において、Ｒ^１は、Ｆであり、そしてｈ＝４又は５である。幾つかの態様において、Ｒ^１は、Ｆであり、そしてｈ＝５である。幾つかの側面において、Ｚ^＊は：

【0183】

【化42】

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【0184】

からなる群から選択することができる。
Ｒ^１は、３ないし５個間の量で存在することができる。３個のＲ^１基が存在することができる。Ｒ^１は、４ないし５個間の量で存在することができる。４個のＲ^１基が存在することができる。５個のＲ^１基が存在することができる。Ｒ^１は、フッ素であることができる。Ｒ^１は、塩素であることができる。Ｒ^１は、臭素であることができる。脱離基は、式：

【0185】

【化43】

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【0186】

を含んでなることができる。
幾つかの側面において、本発明は、ＭＡＣを製造する方法を提供し、ここにおいて、ＭＡＣは、更なる標的を結合する少なくとも一つのエフェクター分子と共有的に連結する抗体又はその断片（ペプチド、小分子、アプタマー、核酸分子、又はタンパク質のような）を含んでなり、エフェクター分子が抗体の表面のリシン残基のε−アミノと反応することが可能なＰＦＰ脱離基を伴うリンカーを含んでなることを特徴とする。幾つかの側面において、本発明は、エフェクター分子（ペプチドのような）を、配列番号：１５、配列番号：４５、配列番号：４６又は配列番号：４７の残基６２−１０３を含んでなるカッパー軽
鎖定常領域を含んでなる抗体と共役するための方法を提供し、エフェクター分子を、式：

【0187】

【化44】

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【0188】

の脱離基を含んでなるリンカーと共役することを含んでなり、式中、Ｒ^１は、単独又は組合せのＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチルのいずれかであり、そして１ないし５間の値で存在し、そして脱離基を、定常軽鎖領域と共役したエフェクター分子を伴う抗体を提供するように、配列番号：１５のＫ^８０の側鎖と反応させることができる。

【0189】

抗体は、配列番号：１５の残基７４−１０５と実質的に相同性の軽鎖定常領域を含んでなることができる。抗体は、配列番号：１５、配列番号：４５、配列番号：４６又は配列番号：４７の残基６２−１０３と実質的に相同性の軽鎖定常領域を含んでなることができる。幾つかの側面において、抗体は、配列番号：１５の残基７４−９０と実質的に相同性の軽鎖領域を含んでなることができる。幾つかの側面において、エフェクター分子は、配列番号：１５のＫ^８０において共役される。幾つかの側面において、エフェクター分子は、Ｋ^８２において共役される。幾つかの形態において、Ａｎｇ２結合ペプチドは、ＣＬκ−Ｋ^１８８（Ｋａｂａｔ番号による）において抗ＩＧＦ１Ｒ抗体に共役される。

【0190】

幾つかの側面において、この方法は、抗体又はその抗原結合部位をエフェクター分子と組合せることを含んでなり、ここにおいて、エフェクター分子は、ＰＦＰ脱離基を含んでなるリンカーに共有的に接続される。

【0191】

幾つかの側面において、本発明は、エフェクター分子をタンパク質に共役する方法を提供し、ここにおいて、エフェクター分子は、式：

【0192】

【化45】

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【0193】

の脱離基Ｚ^＊中で終結するリンカーに接続され、式中、Ｒ’は、単独又は組合せのＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチルのいずれかであり、そして１ないし５間の値で存在し、そしてタンパク質は、エフェクター分子がＫ^８０残基のε−アミノ基に共役されるように、Ｋ^８０を含む配列番号：１５、配列番号：４５、配列番号：４６又は配列番号：４７の残基６２−１０３を含んでなり、エフェクター分子及び接続されたリンカーを、タンパク質と、約３．７：１ないし約４．３：１のエフェクター分子：タンパク質のモル比で反応させることを含んでなる。

【0194】

幾つかの側面において、エフェクター分子、リンカー及び脱離基は、本明細書中に記載したとおりであることができる。幾つかの側面において、タンパク質は、抗体の軽鎖定常領域を含んでなることができる。幾つかの側面において、タンパク質は、配列番号：１５を含んでなることができ、そして共役の部位は、Ｋ^８０である。

【0195】

幾つかの側面において、エフェクター分子：抗体（例えば、ＡＢＰ：抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）のモル比は、約２．５ないし約４．６：１の間である。本発明の幾つかの側面において、モル比は、約３．７：１であり、そして約４．３：１である。本発明の幾つかの側面において、エフェクター分子：抗体のモル比は、約４：１である。幾つかの側面において、
モル比は、約２：１ないし約７：１の間である。幾つかの側面において、モル比は、約３：１ないし約６：１の間である。幾つかの側面において、モル比は、約３：１ないし約７：１の間である。幾つかの側面において、モル比は、約３：１ないし約５：１の間である。

【0196】

抗体当たり１．５より少ない共役を有することが好ましい本発明の側面において（単一のエフェクター分子が必要である場合のような）、モル比は、約１：１ないし約６：１の間であることができ、ここにおいて、緩衝液は、ＨＥＰＥＳを少なくとも０．０２Ｍの濃度で含んでなる。ＨＥＰＥＳの濃度は、約０．１Ｍないし約１Ｍの間であることができる。ＨＥＰＥＳの濃度は、約０．１Ｍないし約０．５Ｍの間であることができる。抗体当たり１．５より少ない共役を有することが好ましい本発明の側面において（単一のエフェクター分子が必要である場合のような）、モル比は、約１：１ないし約３：１の間であることができる。

【0197】

幾つかの側面において、好ましいモル比は、約１、約１．２、約１．４、約１．５、約１．６、約１．８、約２，、約２．２、約２．４、約２．５、約２．６、約２．８、約３、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５、約５．２、約５．４、約５．５、約５．６、約５．８、約６、約６．２、約６．４、約６．５、約６．６、約６．８、約７、約７．３、約７．５、約７．７、約８、約８．５、約９、約９．５、及び約１０対１からなる群から選択される下限、並びに約１．５、約１．６、約１．８、約２、約２．２、約２．４、約２．５、約２．６、約２．８、約３、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５、約５．２、約５．４、約５．５、約５．６、約５．８、約６、約６．２、約６．４、約６．５、約６．６、約６．８、約７、約７．３、約７．５、約７．７、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、及び約１５対１からなる群から選択される上限の範囲である。

【0198】

幾つかの側面において、本発明は、更にエフェクター分子及びタンパク質を少なくとも約３０分間一緒に共役させることを含んでなる。幾つかの側面において、持続時間は、少なくとも約６０分間である。幾つかの側面において、持続時間は、少なくとも約２時間である。幾つかの側面において、本発明は、更にエフェクター分子及び抗体を約４℃ないし約４０℃の間で共役させることを含んでなる。幾つかの側面において、本発明は、更にエフェクター分子及び抗体を約１０℃ないし約３０℃の間で共役させることを含んでなる。幾つかの側面において、本発明は、更にエフェクター分子及び抗体を約１５℃ないし約３０℃の間で共役させることを含んでなる。幾つかの側面において、反応は、約１８℃ないし約２５℃で行われる。幾つかの側面において、反応は、約２２℃で行われる。幾つかの側面において、反応は、概略室温で行われる。

【0199】

幾つかの側面において、結合反応（conjugation reaction）は、ｐＨ約６．５ないしｐＨ約８間で行われる。幾つかの側面において、結合反応は、ｐＨ約６．７５ないしｐＨ約８．０間で行われる。幾つかの側面において、結合反応は、ｐＨ約７．７で行われる。幾つかの側面において、結合反応は、ｐＨ約７で行われる。幾つかの側面において、結合反応は、ｐＨ約７．２で行われる。幾つかの側面において、結合反応は、ｐＨ約７．５で行われる。幾つかの側面において、結合反応は、その下限が５．５、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９及び８からなる群から選択され、そしてその上限が６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．５、及び
９からなる群から選択されるｐＨ値の範囲の間で行われる。

【0200】

幾つかの側面において、ｐＨは、６．５以下であることができる；これは、抗体当たり約１．５より少ない共役（結合）が必要である適用において、特に有用であることができる。幾つかの側面において、ｐＨは、約５．５ないし約６．５の間である。

【0201】

幾つかの側面において、塩濃度は、約０．２Ｍ以下であることができる。塩は、ハロゲン化物塩（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）であることができ、そしてＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｃａのような金属を含んでなることができる。塩は、ＮａＣｌであることができる。塩は、ＫＣｌであることができる。約０．１Ｍより上の塩濃度を、速度及び／又は抗体当たりの共役の数を制約するために使用することができる。塩濃度は、約０ないし約０．１Ｍの間であることができる。塩濃度は、約０ないし約０．５Ｍの間であることができる。塩濃度は、約０ないし約０．３Ｍの間であることができる。

【0202】

幾つかの側面において、本発明の方法は、抗体又はその抗原結合部位を、製剤緩衝液中でｐＨ約５．５で処方することを含んでなる。製剤緩衝液は、酢酸ナトリウム及びトレハロース緩衝液であることができる。この緩衝液は、いずれもの第一アミンを含有せず、そしてそれ自体がｐＨ調節のために十分に役立つ利点を有する。抗体は、約１５ないし約２５ｍｇ・ｍｌ^−１の量で存在することができる。幾つかの側面において、抗体は、約２０ｍｇ・ｍｌ^−１の量で存在することができる。

【0203】

製剤緩衝液のｐＨは、ｐＨ約７．２ないしｐＨ約８．０に調節することができる；幾つかの態様において、製剤緩衝液は、ｐＨ７．７に調節することができる。製剤緩衝液のｐＨは、リン酸緩衝液で調節することができる。リン酸緩衝液は、約４０ｍＭないし約８０ｍＭの間の濃度であることができる。リン酸緩衝液は、約１０ｍＭないし約２００ｍＭの間の濃度であることができる。

【0204】

幾つかの側面において、エフェクター分子／リンカー及び脱離基Ｚ^＊との結合反応中の抗体の濃度は、範囲の下限が、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約３０、及び約４０ｍｇ・ｍｌ^−１から選択され、そして範囲の上限が、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約５００ｍｇ・ｍｌ^−１からなる群から選択される範囲であることができる。

【0205】

エフェクター分子（ペプチド又はＡＢＰのような）は、少なくとも約２ｍｇ・ｍｌ^−１の濃度で元に戻すことができる。エフェクター分子は、少なくとも約５ないし約２０ｍｇ・ｍｌ^−１の濃度で、そして幾つかの態様において、１０ｍｇ・ｍｌ^−１であることができる濃度で、使用に先だって希釈されたプロピレングリコール中で元に戻すことができる。

【0206】

結合反応は、抗体又はその抗原結合部位及びエフェクター分子を、４モルのエフェクター分子対１モルの抗体のモル比で混合し、そして１８℃ないし２５℃で約２時間ないし約２４時間インキュベーションすることによって行うことができる。幾つかの態様において、抗体及びエフェクター分子間の結合反応は、室温で２時間である。幾つかの態様において、結合反応は、少なくとも約２時間である。幾つかの態様において、結合反応は、少なくとも約３０分間である。

【0207】

反応物は、クエンチし、そしてｐＨ約５．０ないしｐＨ約６．０に調節することができる。幾つかの態様において、クエンチされた反応物は、ｐＨ５．５に調節することができる。これは、コハク酸塩及びグリシン緩衝液を、例えばｐＨ約４．０で使用して達成する
ことができる。この緩衝液は、ＴＲＩＳ又は他のアミノ酸緩衝液のような他の更に普通の緩衝液を超える利点がある。コハク酸塩は、共役分子に対してストレス性であることができるダイアフィルトレーション中の凝集及び沈殿の抑制を援助し、そしてグリシンは更なる第一アミンを含有する（特にＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２の場合）。

【0208】

反応物を濃縮することができ、そして未反応のエフェクター分子（例えばペプチド又はＡＢＰ）、関連する種（リンカーが水溶媒との反応によって加水分解されたペプチドのような）及び反応混合物の他の未反応成分（ＰＦＰのような）を、５０ｋＤａの膜又はサイズ排除クロマトグラフィーを使用するダイアフィルトレーションによって、コハク酸塩、グリシン、塩化ナトリウム、及びｐＨ５．５の３０ｍｇ・ｍｌ^−１のトレハロース緩衝液中に除去することができる。

【0209】

幾つかの側面において、この方法は、エフェクター分子をＣＬκ−Ｋ^１８８（Ｋａｂａｔ番号による）に共役することを含んでなることができる。幾つかの側面において、本発明は、ペプチドを、抗体又はその抗原結合部位の軽鎖λドメインと共役し、ＣＬγ領域の一部をＣＬκ領域の対応する部分と置換することを含んでなり、ペプチドに本明細書中で定義したとおりの脱離基Ｚ^＊を含んでなるリンカーを接続し、そして前記ペプチド−リンカー−脱離基複合体を抗体と反応させることを含んでなり、抗体中で置換されたＣＬκ領域が、少なくとも配列番号：１５、４５、４６、又は４７の残基６２−１０６を含んでなることを特徴とする。幾つかの側面において、ＣＬκ領域は、少なくとも配列番号：１５、４５、４６、又は４７の残基６２−１０６を含んでなる。幾つかの側面において、ＣＬκ領域は、少なくとも配列番号：１５、４５、４６、又は４７の残基１−１０３を含んでなる。幾つかの側面において、ＣＬκ領域は、少なくとも配列番号：１５、４５、４６、又は４７の残基１−１０６を含んでなる。

【0210】

幾つかの側面において、本発明は、ペプチドをマウスの抗体又はその抗原結合部位に共役し、マウスのＣＬ領域の一部をヒトＣＬκ領域の対応する部分と置換することを含んでなり、ペプチドを本明細書中で定義したとおりの脱離基Ｚ^＊を含んでなるリンカーと接続し、そして前記ペプチド−リンカー−脱離基複合体を抗体と反応させることを含んでなり、抗体中で置換されたヒトＣＬκ領域が少なくとも配列番号：１５、４５、４６、又は４７の残基６２−１０３を含んでなることを特徴とする。幾つかの側面において、ヒトＣＬκ領域は、少なくとも配列番号：１５、４５、４６、又は４７の残基６２−１０６を含んでなる。幾つかの側面において、ヒトＣＬκ領域は、少なくとも配列番号：１５、４５、４６、又は４７の残基６２−１０３を含んでなる。幾つかの側面において、ヒトＣＬκ領域は、少なくとも配列番号：１５、４５、４６、又は４７の残基１−１０６を含んでなる。本発明のこれらの側面は、マウスのＣＬκ領域がＫ^１８８を含まずになるため、好都合であることができる（マウスのＣＬκ中の対応する配列は、ＲＨＮである；配列番号：４９の残基７９−８１を参照されたい）。

【0211】

本発明の医薬組成物
本発明は、ＭＡＣ及び医薬的に受容可能な担体を含んでなる医薬組成物を提供する。本明細書中で使用する場合、“医薬的に受容可能な担体”は、いずれもの、そして全ての生理学的に適合性の溶媒、分散媒体、被覆、抗微生物及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、等を含む。医薬的に受容可能な担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等の一つ又はそれより多く、並びにこれらの組合せを含み、そして等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、又は塩化ナトリウムを組合せて含むことができる。湿潤或いは少量の湿潤剤又は乳化剤、抗体又は抗体部分の保存期間若しくは有効性を向上する保存剤或いは緩衝液のような補助物質のような医薬的に受容可能な物質。

【0212】

本発明の組成物は、各種の形態であることができる。これらは、例えば、液体溶液（例えば、注射用及び注入用溶液）、分散物又は懸濁液、錠剤、丸薬、散薬、リポソーム及び座薬のような液体、半固体及び固体剤形を含む。好ましい形態は、投与の意図する様式及び治療的適用に依存する。典型的な好ましい組成物は、一般的に抗体によるヒトの受動免疫のために使用されるものと同様な組成物のような注射用又は注入用溶液の形態である。投与の好ましい様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい態様において、抗体は、静脈内注入又は注射によって投与される。もう一つの好ましい態様において、抗体は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。

【0213】

医薬組成物は、更に抗腫瘍剤又は造影試薬のようなもう一つの成分を含んでなることができる。本発明のもう一つの側面は、本発明のＭＡＣ及びこれらの抗体を含んでなる医薬組成物を含んでなるキットを提供する。キットは、ＭＡＣ又は医薬組成物に加えて、診断又は治療剤を含むことができる。キットは、更に診断又は治療法における使用のための説明書を含むこともできる。幾つかの態様において、キットは、抗体又はその医薬組成物及び診断剤を含む。他の態様において、キットは、抗体又はその医薬組成物及び一つ又はそれより多い更なる抗悪性腫瘍剤、抗腫瘍剤又は化学療法剤のような治療剤を含む。

【0214】

これらの薬剤及び本発明の化合物は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、等のような医薬的に受容可能な賦形剤と組合せることができる。特定の投与管理、即ち、投与量、時間及び頻度は、特定の個体及びその個体の病歴に依存するものである。

【0215】

受容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される投与量及び濃度において受容者にとって非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、及び他の有機酸のような緩衝液；塩化ナトリウムのような塩；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールのような）；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンのようなアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールのような糖；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮ^ＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^ＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含んでなることができる。

【0216】

本発明のリポソーム含有化合物は、米国特許第４，４８５，０４５号及び４，５４４，５４５号中に記載されているような当技術において既知の方法によって調製される。向上された循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号中に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＤ−ＰＥ）を含んでなる脂質組成物による逆相蒸発法によって産生することができる。リポソームは、規定された細孔サイズのフィルターを通して押し出されて、所望の直径を持つリポソームを得る。

【0217】

活性成分は、更に例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド状薬物供給系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロ球、マイクロ乳剤、ナノ粒子及びナノカプセル）或いはマクロ乳剤中で封入することもできる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）中に開示されている。

【0218】

持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の適した例は、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半浸透性基質を含み、この基質は、成形された物品の形態、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルであることができる。持続放出基質の例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及び７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ^ＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸リュープロリドからなる注射用マイクロ球）のような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、酢酸イソ酪酸スクロース、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。

【0219】

Ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は、滅菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。本発明の治療化合物は、一般的に滅菌アクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルを有する容器内に入れられる。

【0220】

適した乳剤は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ^ＴＭ、Ｌｉｐｏｓｙｎ^ＴＭ、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ^ＴＭ、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ^ＴＭ及びＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ^ＴＭのような商業的に入手可能な脂肪乳剤を使用して調製することができる。活性成分は、予備混合された乳剤組成物中に溶解するか、又は別の方法として、これを油（例えば、大豆油、紅花油、綿実油、ゴマ油、コーン油又はアーモンド油）並びにリン脂質（例えば、卵リン脂質、大豆リン脂質又は大豆レシチン）及び水との混合によって形成された乳剤中に溶解することができるかのいずれかであることができる。乳剤の等張性を調節するために、他の成分、例えばグリセロール又はグルコースを加えることができることは認識されるものである。適した乳剤は、典型的には２０％までの、例えば５ないし２０％の間の油を含有するものである。脂肪乳剤は、０．１ないし１．０μｍ、特に０．１ないし０．５μｍ間の脂肪液滴を含んでなることができ、そして５．５ないし８．０間の範囲のｐＨを有する。

【0221】

乳剤組成物は、本発明の化合物を、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ^ＴＭ又はその成分（大豆油、卵リン脂質、グリセロール及び水）と混合することによって調製されたものであることができる。

【0222】

吸入又は吹送のための組成物は、医薬的に受容可能な水性又は有機溶媒、或いはこれらの混合物中の溶液及び懸濁液、並びに粉末を含む。液体又は固体の組成物は、先に提示したような適した医薬的に受容可能な賦形剤を含有することができる。幾つかの態様において、組成物は、局所又は全身性効果のために、経口或いは鼻腔の呼吸経路によって投与される。好ましい滅菌の医薬的に受容可能な溶媒中の組成物は、ガスの使用によって噴霧することができる。噴霧された溶液は、噴霧デバイスから直接呼吸することができるか、又は噴霧デバイスは、顔面マスク、テント又は間欠的陽圧呼吸器に接続することができる。溶液、懸濁液又は粉末組成物は、好ましくは経口又は鼻腔的に、製剤を適用な様式で供給するデバイスから投与することができる。

【0223】

本発明の化合物及び組成物は、関連する指示のための確立された治療と共に使用することができる。例は、血管新生疾患、特に癌の治療のための５−フルオロウラシル、イリノテカン、オキサリプラチン（ｏｘｉｌａｐｌａｔｉｎ）、セツキシマブ、スニチマブ及びリツキシマブを含む。他の例は、ラニビズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、及びパリビズマブを含む。

【0224】

本発明の治療法
治療法も更に本発明によって提供される。治療法は、本発明の化合物又は組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる。

【0225】

本発明は、本発明の化合物又は本発明の組成物の、血管新生を阻害又は減少する、或いは血管新生性疾患に伴う疾病又は徴候を治療若しくは予防する方法における使用を提供する。本発明は、血管新生を阻害又は減少する、或いは血管新生性疾患に伴う疾病又は徴候を治療若しくは予防する、治療的に有効な量の本発明の化合物又は組成物を患者に投与することを含んでなる方法を提供する。更に提供されるものは、本発明の化合物又は組成物を供給或いは投与する方法、及び本発明の化合物又は組成物を使用する治療の方法である。更に提供されるものは、治療的に有効な量の本発明による化合物又は医薬組成物を患者に投与することを含んでなる癌を治療する方法である。本明細書中で使用する場合、血管新生が媒介する症状は、異常な血管新生活性によって起こされる症状、又は血管新生活性を調節する化合物が、治療的用途を有するものである。本発明の化合物又は組成物で治療及び／又は診断することができる疾病及び症状は、癌、関節炎、高血圧、腎臓疾患、乾癬、眼疾患に伴う眼の血管新生、感染又は外科的介入、黄斑変性症、糖尿病性網膜症、等を含む。

【0226】

更に具体的には、“癌”の例は、本発明に関連して本明細書中で使用する場合、肺（ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ）、頭頸部、卵巣、大腸、直腸、前立腺、肛門領域、胃、乳房、腎臓及び尿管、腎盂、甲状腺、膀胱、脳の癌、腎細胞癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍の癌、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンスリンパ腫、脊髄軸腫瘍、中咽頭、下咽頭、食道、膵臓、肝臓、胆嚢及び胆管、小腸、尿路の癌；又はリンパ腫、或いは一つ又はそれより多い前述の癌の組合せを含む。なお更に具体的には、“癌”の例は、本発明に関連して本明細書中で使用する場合、肺癌（ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、大腸癌、直腸癌、前立腺癌、肛門領域の癌、或いは一つ又はそれより多い前述の癌の組合せから選択される癌を含む。

【0227】

他の態様において、本発明の医薬組成物は、制約されるものではないが、加齢関連黄斑変性症、血管形成術及び乾癬後の再狭窄のような非癌性過剰増殖性疾患に関する。もう一つの態様において、本発明は、ＩＧＦ１Ｒ及び／又はＡｎｇ２の活性化を必要とする哺乳動物の治療のための医薬組成物に関し、ここにおいて、医薬組成物は、治療的に有効な量の本発明の活性化抗体及び医薬的に受容可能な担体を含んでなる。本発明の医薬組成物は、骨粗鬆症、虚弱或いは哺乳動物が少なすぎる活性な成長ホルモンを分泌するか、又は成長ホルモンに反応することが不可能な疾患を治療するために使用することができる。

【0228】

本明細書中で使用する場合、薬物、化合物、又は医薬組成物の“有効な投与量”或いは“有効な量”は、いずれもの一つ又はそれより多い有益な或いは所望の結果を得るために十分な量である。予防的使用において、有益な又は所望の結果は、危険度を排除又は減少すること、重篤度を減少すること、又は疾病の生化学的、組織学的及び／又は行動的徴候、疾病の発症中に存在するその合併症及び中間の病理学的表現型を含む疾病の発症を遅延することを含む。治療的使用において、有益な又は所望の結果は、腫瘍のサイズ、広がり、腫瘍の脈管構造、或いは癌又は増加した血管新生に伴う他の疾病の一つ又はそれより多い徴候を減少すること、疾病を治療するために必要な他の薬物の投与量を減少すること、他の薬物の効果を向上すること、及び／又は患者の疾病の進行を遅延することのような臨床的結果を含む。有効な投与量は、一回又はそれより多い投与で投与することができる。本発明の目的のために、薬物、化合物、又は医薬組成物の有効な投与量は、予防的又は治療的治療を直接若しくは間接的のいずれかで達成するために十分な量である。臨床的文脈から理解されるように、薬物、化合物、又は医薬組成物の有効な投与量は、もう一つの薬物、化合物、又は医薬組成物との関連で、達成することができるか、或いは達成すること
ができない。従って、“有効な投与量”は、一つ又はそれより多い治療剤が投与される文脈において考慮することができ、そして一つの薬剤は、一つ又はそれより多い他の薬剤との関連において所望の結果を達成することができた又は達成された場合、有効な量で与えられたと考えることができる。

【0229】

“個体”又は“患者”は、哺乳動物、更に好ましくは、ヒトである。哺乳動物は、更に、制約されるものではないが、家畜、競技動物、愛玩動物、霊長類、及びウマを含む。
好都合には、本発明の組成物の治療的投与は、血管新生の減少及び／又は癌の場合、腫瘍体積の安定化又は減少をもたらす。好ましくは、腫瘍体積は、本発明のＭＡＣの投与前より少なくとも約１０％又は約１５％低い。更に好ましくは、腫瘍体積は、ＭＡＣの投与前より少なくとも約２０％低い。なお更に好ましくは、腫瘍体積は、ＭＡＣの投与前より少なくとも約３０％低い。好都合には、腫瘍体積は、ＭＡＣの投与前より少なくとも約４０％低い。更に好都合には、腫瘍体積は、ＭＡＣの投与前より少なくとも約５０％低い。非常に好ましくは、腫瘍体積は、ＭＡＣの投与前より少なくとも約６０％低い。最も好ましくは、腫瘍体積は、ＭＡＣの投与前より少なくとも約７０％低い。

【0230】

本発明の方法による本発明の化合物の投与は、例えば、受容者の生理学的状態、投与の目的が治療的又は予防的のいずれであるか、そして熟練した医師にとって既知の他の因子によって、連続的又は間欠的であることができる。本発明の化合物の投与は、前もって選択された期間にわたって本質的に連続的であることができるか、又は一連の間隔を置いた投与であることができる。

【0231】

抗体
“免疫グロブリン”は、四量体の分子である。天然に存在する免疫グロブリンにおいて、それぞれのテトラマーは、ポリペプチド鎖の二つの同一のペアからなり、それぞれのペアは、一つの“軽”（約２５ｋＤａ）及び一つの“重”鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に責任のある１００ないし１１０個、又はそれより多いアミノ酸の可変領域を含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能に責任のある定常領域を定義する。ヒトの軽鎖は、κ及びλ軽鎖として分類される。重鎖は、α、δ、ε、γ、及びμと分類され、そして抗体のアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭとしてそれぞれ定義される。軽及び重鎖内で、可変及び定常領域は、約１２個又はそれより多いアミノ酸の“Ｊ”領域によって接続され、重鎖は更に約１０個のアミノ酸の“Ｄ”領域を含む。それぞれの軽／重鎖ペアの可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが、二つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。

【0232】

免疫グロブリン鎖は、更に相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる三つの超可変領域によって接続された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。それぞれのペアの二つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列させられ、特異的エピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、両方の軽及び重鎖は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含んでなる。アミノ酸のそれぞれのドメインへの帰属は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７ ａｎｄ １９９１））の定義による。

【0233】

ＣＤＲを構成する特定の抗体中のアミノ酸残基の確認は、当技術において公知の方法を使用して決定することができる。例えば、抗体のＣＤＲは、最初にＫａｂａｔ等（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅ
ａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）によって定義された超可変領域として確認することができる。ＣＤＲの位置は、更に最初にＣｈｏｔｈｉａ等（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３）によって記載された構造的ループ構造として確認することができる。ＣＤＲ確認のための他の方法は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ間の妥協であり、そしてＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェア（現在Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用して誘導される“ＡｂＭ決定”、又はＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２−７４５中に明記された、観察された抗原接触に基づくＣＤＲの“接触決定”を含む。ＣＤＲの“立体配置決定”として本明細書中で言及されるもう一つの方法において、ＣＤＲの位置は、抗原結合に対してエンタルピー的寄与をする残基として確認することができる（Ｍａｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１１５６−１１６６）。更に他のＣＤＲ境界決定は、上記方法の一つに厳密に従うことはできないが、しかしこれらを、特定の残基又は残基の群或いは全体のＣＤＲさえも、抗原の結合に有意に影響しないという予測又は実験的結果に照らして、短く或いは長くすることができるが、それにもかかわらず、ＫａｂａｔのＣＤＲの少なくとも一部と重複するものである。本明細書中で使用する場合、ＣＤＲは、方法の組合せを含む等技術において既知のいずれもの方法によって決定されるＣＤＲを指す。本明細書中で使用される方法は、これらの方法のいずれかによって決定されたＣＤＲを使用することができる。一つより多いＣＤＲを含有するいずれもの与えられた態様において、ＣＤＲ（又は抗体の他の残基）は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、延長された、ＡｂＭ、接触、及び／又は立体構造的決定のいずれかによって決定することができる。

【0234】

本明細書中で使用する場合、ある残基は、そのＫａｂａｔ番号と一致している；従って、Ｋ^１８８−ＣＬκは、カッパー軽鎖の初めから数える、Ｋａｂａｔ番号によるカッパー軽鎖の残基１８８を指す。残基の番号が、適用される具体的な番号の慣例によって変化することができることは認識されることである。

【0235】

“抗体”は、特異的結合のためにインタクトな抗体と競合するインタクトな免疫グロブリン又はその抗原結合部位を指す。抗原結合部位は、組換えＤＮＡ技術、或いはインタクトな抗体の酵素的又は化学的開裂によって産生することができる。抗原結合部位は、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特異性抗体及びポリペプチドに特異的抗原結合を与えるために十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドを含む。Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨＩドメインからなる一価の断片である；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド橋によって連結された二つのＦａｂ断片を含んでなる二価の断片である；Ｆｄ断片は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる；Ｆｖ断片は、抗体の一本腕のＶＬ及びＶＨドメインからなる；そしてｄＡｂ断片は、ＶＨドメイン又はＶＬドメイン（例えば、ヒト、ラクダ科、又はサメ）からなる。

【0236】

一般的に、抗体に対する言及は、更にその抗原結合部位に、そして特に、ＣＬκのＫ^１８８を含んでなるその抗原結合部位を指すと解釈されるべきである。
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ及びＶＨ領域がペアとなって、合成リンカーにより一価の分子を形成し、これが一本のタンパク質鎖となることを可能にする抗体である。二重特異性抗体は、ＶＨ及びＶＬドメインが一本のポリペプチド鎖上に発現するが、しかし同一鎖上の二つのドメイン間のペア形成を可能にするためには短すぎるリンカーを使用し、これによって、ドメインがもう一つの鎖の相補的ドメインとペアを作り、そして二つの抗原結合部位を作成させる二価の二重特異性抗体である。一つ又はそれより多いＣＤＲを、共有的又は非共有的のいずれかで分子に組込んで、これをイムノアドヘシンにすることができる。イムノアドヘシンは、ＣＤＲ（等）を大きいポリペプチド鎖の一部として組込むこ
とができ、ＣＤＲ（等）をもう一つのポリペプチド鎖に共有的に連結することができ、又はＣＤＲ（等）を非共有的に組込むことができる。ＣＤＲは、イムノアドヘシンが、関心のある特定の抗原に特異的に結合することを可能にする。

【0237】

抗体は、一つ又はそれより多い結合部位を有することができる。一つより多い結合部位が存在する場合、結合部位は、互いに同一であることができ、又は異なっていることができる。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、二つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体又はＦａｂ断片は、一つの結合部位を有し、一方“二重特異的”又は“二機能性”抗体は、二つの異なった結合部位を有する。

【0238】

“単離された抗体”は、（１）その天然の状態でそれを伴う他の天然に結合された抗体を含む天然に結合された成分と結合していない、（２）同一種からの他のタンパク質を含まない、（３）抗体を天然には発現しない細胞によって発現される、又は異なった種からの細胞によって発現される、或いは（４）天然に存在しない抗体である。

【0239】

用語“ヒト抗体”は、ヒト免疫グロブリン配列から誘導される一つ又はそれより多い可変及び定常領域を有する全ての抗体を含む。本発明の幾つかの態様において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の全ての可変及び定常ドメインは、ヒト免疫グロブリン配列から誘導される（全ヒト抗体）。ヒト化抗体は、重及び軽鎖のフレームワーク並びに定常ドメイン中のある種のアミノ酸が、ヒトにおける免疫反応を回避又は抑制するように変異された非ヒト種から誘導される抗体である。別の方法として、ヒト化抗体は、ヒト抗体からの定常領域を非ヒト種の可変ドメインに融合することによって産生することができる。

【0240】

用語“キメラ抗体”は、一つの抗体からの一つ又はそれより多い領域及び一つ又はそれより多い他の抗体からの一つ又はそれより多い領域を含有する抗体を指す。
用語“エピトープ”は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体への特異的結合が可能ないずれものタンパク質決定基を含む。エピトープの決定基は、通常アミノ酸又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面の集団からなり、そして通常特異的な三次元構造的特徴、並びに特異的荷電的特徴を有する。抗体は、解離係数が＜１ｕＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、そして更に好ましくは：＜１０ｎＭである場合、抗原を特異的に結合すると言われる。

【0241】

用語、多機能性抗体複合体、又はＭＡＣは、標的に結合する少なくとも一つのエフェクター分子に共有的に共役する本明細書中で定義されるとおりの抗体、又はその抗原結合部位を指す。エフェクター分子は、ペプチド、小分子、タンパク質、核酸分子、毒素、アプタマー、又は抗原結合性抗体或いはその断片であることができる。ペプチド等の共役に対する言及は、本明細書を通して、タンパク質及び（抗原結合性）抗体又はその断片への共役に対して一般的に適用されることを指す。エフェクター分子及び抗体（又はその断片）間の接続は、共有的連結であることができる。エフェクター分子がタンパク質又はペプチドである幾つかの態様において、エフェクター分子は、抗体鎖の一つのＮ又はＣ末端に融合することができる。融合によって、エフェクター分子及び抗体が、そのそれぞれのペプチド骨格間のペプチド結合によって融合されることは理解されることである。幾つかの側面において、エフェクター分子は、リンカーによって抗体に共有的に共役され、そして二つをペプチド骨格で接続するペプチド結合を経由して融合されない。

【0242】

幾つかの態様において、本発明のＭＡＣは、ヒト化抗ＩＧＦ１Ｒ抗体を含んでなる。本発明のＭＡＣは、齧歯類が全ヒト抗体を産生するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を齧歯類に導入することによって全ヒト抗ＩＧＦ１Ｒ抗体を含んでなることができる。更に提供されるものは、全ヒト抗ＩＧＦ１Ｒ抗体である。全ヒト抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は、マウス又はマウス誘導モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）に固有の免疫原性及びアレルギー性反応を最小化し、そして従って投与された抗体の効力及び安全性が増加することが予測される。
全ヒト抗体の使用は、繰返した抗体の投与を必要とすることができる炎症及び癌のような慢性及び再発性のヒト疾病の治療において、実質的な利点を提供することが予測することができる。もう一つの態様において、本発明は、補体を結合しない抗ＩＧＦ１Ｒ抗体を含んでなるＭＡＣを提供する。

【0243】

本発明において使用するための抗ＩＧＦ１Ｒ抗体を産生する方法は、ＷＯ０２０５３５９６及びＷＯ２００５０１６９６７中に記載され、この両方は、本明細書中に参考文献として援用される。

【0244】

幾つかの態様において、変異前の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体と比較して、変異された抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のＶＨ又はＶＬ領域のいずれかにおいて１０個より多くないアミノ酸変化が存在する。幾つかの態様において、変異された抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のＶＨ又はＶＬ領域のいずれかにおいて５個より多くないアミノ酸変化が存在する。３個より多くないアミノ酸変化が存在することができる。他の態様において、定常ドメインにおいて１５個より多くないアミノ酸変化が存在する。定常ドメインにおいて１０個より多くないアミノ酸変化が存在することができる。定常ドメインにおいて５個より多くないアミノ酸変化が存在することができる。

【0245】

更に、二つ（又はそれより多い）単鎖抗体が互いに連結された、融合抗体を作成することができる。これは、一本のポリペプチド鎖上に二価又は多価の抗体を作成することを所望する場合、或いは二重特異性抗体を作成することを所望する場合に有用である。

【0246】

一つの種類の誘導された抗体が、二つ又はそれより多い抗体（同一種類の又は異なった種類の；例えば二重特異性抗体を作成するため）を架橋することによって産生される。適した架橋剤は、適当なスペーサーによって分離された二つの別個の反応性基を有するヘテロ二機能性であるもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、又はホモ二機能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）を含む。

【0247】

もう一つ種類の誘導された抗体は、標識された抗体である。本発明の抗体又は抗体の一部を誘導体化することができる有用な検出剤は、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、塩化５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル、フィコエリトリン、ランタニドリン等を含む蛍光性化合物を含む。抗体は、更にホースラディッシュペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリリン酸塩、グルコースオキシダーゼ等のような検出のために有用である酵素で標識することもできる。抗体が検出可能な酵素で標識された場合、これは、識別することができる反応生成物を酵素が産生するために使用する、更なる試薬を加えることによって検出される。例えば、試薬ホースラディッシュペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素及びジアミノベンジジンの添加は、検出可能である着色された反応生成物に導く。抗体は、更にビオチンで標識し、そしてアビジン又はストレプトアビジン結合の間接的測定によって検出することができる。抗体は、更にガドリニウムのような磁性試薬で標識することもできる。抗体は、更に二次レポーター（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）によって認識される所定のポリペプチドエピトープで標識することもできる。幾つかの態様において、標識は、各種の長さのスペーサーアームによって接続されて、潜在的な立体障害を減少する。

【0248】

抗体は、更にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル又はエチル基、或いは炭水化物基のような化学基で誘導することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特徴を改良するために、例えば、血清半減期を増加する又は組織結合性を増加するために有用であることができる。

【0249】

触媒抗体（Catalytic Antibodies）
本発明の幾つかの側面において、ＭＡＣは、触媒抗体、又はその抗原結合部位を含んでなる。幾つかの側面において、抗体は、アルドラーゼ抗体であることができる。

【0250】

抗体技術の他の要素中で、抗体、有用な断片並びにその変種及び修飾、結合部位及びＣＤＲ、抗体標品、発現、ヒト化、アミノ酸修飾、グリコシル化、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、抗体の血清半減期の増加、発現ベクター、哺乳動物宿主系、及び折畳みを記載しているＵＳ２００６２０５６７０の内容、特に段落［０１５３］−［０２３３］は、本明細書中に参考文献として援用される。

【0251】

“結合部位”（更に抗原結合部位としても知られる）は、本明細書中で使用される場合、適当な抗原（又は構造的に類似のタンパク質）の決定基と結合する（又は結合することができる）免疫グロブリンの領域又はＩｇドメインを指す。この用語は、一般的にＣＤＲ及び抗原結合に関係する隣接するフレームワーク残基を含む。

【0252】

“アルドラーゼ抗体”は、本明細書中で使用する場合、重荷（例えば共役による）から解放された場合、脂肪族ケトン供与体及びアルデヒド受容体間のアルドール付加反応を触媒する結合部位部分を含有する抗体を指す。アルドラーゼ抗体は、担体タンパク質にカップリングし、そして更に抗体の結合部位において反応性ε−アミノ基を伴うリシンを有することによって特徴づけられる、式：

【0253】

【化46】

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【0254】

の１，３−ジケトンハプテンを含む免疫原による免疫反応性動物の免疫化によって産生することは可能である。アルドラーゼ抗体は、更に１，３−ジケトンハプテンによる、１，３−ジケトンハプテン及び触媒抗体のリシンのε−アミノ基間の複合体の形成による阻害にかけられるその触媒活性によって特徴づけられる。

【0255】

考察したように、ある態様において、本発明のＭＡＣ、組成物及び試料を製造するために使用されるある種の抗体は、抗体結合部位における反応性側鎖を含んでなることができる。反応性側鎖は、天然に存在することができるか、又は変異によって抗体中に入れることができる。抗体結合部位の反応性残基は、残基が抗体を製造するために最初に確認したリンパ系細胞中に存在する核酸によってコードされる場合のように、抗体に伴われることができる。別の方法として、アミノ酸残基は、特定の残基をコードするようにＤＮＡを意図的に変異することによって生じることができる。反応性残基は、例えば、本明細書中で考察されるような独特なコドン、ｔＲＮＡ、及びアミノアシル−ｔＲＮＡを使用する生合成的組込みによって生じる非天然の残基であることができる。もう一つの方法において、アミノ酸残基又はその反応性官能基（例えば、求核性アミノ基又はスルフヒドリル基）は、抗体結合部位中のアミノ酸残基に接続されることができる。従って、“抗体の結合部位中のアミノ酸残基を経由して”生じる抗体との共有連結は、本明細書中で使用する場合、連結が、抗体結合部位のアミノ酸残基に直接的であるか、又は抗体結合部位のアミノ酸残基の側鎖に連結する化学分子を経由することができることを意味する。幾つかの態様において、アミノ酸はシステインであり、そして側鎖の反応性基は、スルフヒドリル基である。他の態様において、アミノ酸残基は、リシンであり、そして側鎖の反応性基は、ε−アミノ基である。幾つかの態様において、アミノ酸は、Ｋａｂａｔ番号による重鎖上のＫ^９３である。幾つかの態様において、アミノ酸は、配列番号：５２及び５４の番号付けによるＨＣｈ３８Ｃ２上のＫ^９９である。

【0256】

触媒抗体は、一つ又はそれより多い反応性アミノ酸側鎖を含んでなる適した結合部位を伴う抗体の一つの供給源である。このような抗体は、アルドラーゼ抗体、ベータラクタマーゼ抗体、エステラーゼ抗体、及びアミダーゼ抗体を含む。

【0257】

一つの態様は、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ３３Ｆ１２及びｍＡｂ３８Ｃ２（そのＶＬ及びＶＨは、配列番号：５６及び５７を含んでなる）のようなアルドラーゼ抗体、並びにこのような抗体の適当にキメラ及びヒト化された変種（例えば、ｈ３８Ｃ２ＩｇＧ１：配列番号：５１及び５２、並びにｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ２：配列番号：５３及び５４）を含んでなる。マウスｍＡｂ３８Ｃ２（及びｈ３８Ｃ２）は、反応性リシンをＨＣＤＲ３の近くに、しかしその外側に有し、そして反応性免疫化によって産生され、そして機構的に天然のアルドラーゼ酵素を模倣する触媒抗体の新しい分類のプロトタイプである。使用することができる他のアルドラーゼ触媒抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０１５を有するハイブリドーマ８５Ａ２；ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０１４を有するハイブリドーマ８５Ｃ７；ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０１７を有するハイブリドーマ９２Ｆ９；ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２３を有するハイブリドーマ９３Ｆ３；ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２４を有するハイブリドーマ８４Ｇ３；ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０１８を有するハイブリドーマ８４Ｇ１１；ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０１９を有するハイブリドーマ８４Ｈ９；ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８２５を有するハイブリドーマ８５Ｈ６；ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０１６を有するハイブリドーマ９０Ｇ８によって製造される抗体を含む。反応性リシンを経由して、これらの抗体は、天然のアルドラーゼのエナミン機構を使用してアルドール及びレトロ−アルドール反応を触媒する。

【0258】

本発明の化合物は、更にチオエステラーゼ及びエステラーゼ触媒抗体の結合部位において見だされるもののように、標的剤を、反応性システインに連結させることによって形成することができる。反応性アミノ酸を含有する抗体は、反応性アミノ酸をコードするように抗体結合部位残基を変異すること、又は抗体結合部位中のアミノ酸側鎖を、反応性基を含有するリンカーで化学的に誘導することを含む当技術において公知の手段によって調製することができる。

【0259】

抗体は、ヒト化抗体であることができる。本発明の化合物が抗体の結合部位に共有的に連結し、そしてこのような抗体がヒト化される場合、このような抗体が、Ｗ基に対する高い連結親和性の維持を伴ってヒト化されることが重要である。各種の形態のヒト化マウスアルドラーゼ抗体は意図されている。一つの態様は、ヒト定常ドメインＣ_κ及びＣ_γ１１を伴うヒト化アルドラーゼ触媒抗体ｈ３８ｃ２ＩｇＧ１又はｈ３８ｃ２Ｆａｂを使用する。Ｃヒト生殖系列Ｖ_κ遺伝子ＤＰＫ−９及びヒトＪ_κ遺伝子ＪＫ４を、ｍ３８ｃ２のカッパ軽鎖可変ドメインのヒト化のためのフレームワークとして使用し、そしてヒト生殖系列遺伝子ＤＰ−４７及びヒトＪ_Ｈ遺伝子ＪＨ４を、ｍ３８ｃ２の重鎖可変ドメインのヒト化のためのフレームワークとして使用した。図１８Ｃは、ｍ３８ｃ２、ｈ３８ｃ２、及びヒト生殖系列中の可変軽及び重鎖間の配列アラインメントを例示する。ｈ３８ｃ２は、そのアロタイプのいずれかを含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の定常ドメインを使用することができる。もう一つの抗体は、ｈ３８ｃ２（配列番号：５５及び５６）の可変ドメイン（Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ）及びＫ^１８８−ＣＬκを含んでなるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体からの定常ドメインを含んでなるキメラ抗体を使用する。抗体は、全長の抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ_ｖ、ｄｓＦ_ｖ、ｓｃＦ_ｖ、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、二重特異性抗体、又はｈ３８ｃ２からのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含んでなるミニボディであることができる。抗体は、ｈ３８ｃ２からのＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメイン、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４からなる群から選択される定常ドメインを含んでなる抗体であることができる。抗体は、ｈ３８Ｃ２ＩｇＧ１（配列番号：５１及び５２）であることができる。抗体は、ｈ３８Ｃ２ＩｇＧ２（配列番号：５３及び５４）
であることができる。抗体は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体からの定常領域を含んでなるマウスアルドラーゼ抗体のヒト化変種であることができる。もう一つの態様において、抗体は、マウスアルドラーゼ抗体（例えば配列番号：５７及び５８）からのＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域、並びにヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体からの定常領域を含んでなるキメラ抗体である。更なる態様において、抗体は、天然の又は未変性のヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体からのポリペプチド配列を含んでなるマウスアルドラーゼ抗体の完全なヒト変種である。

【0260】

各種の形態のヒト化アルドラーゼ抗体断片も更に意図されている。一つの態様は、ｈ３８ｃ２Ｆ（ａｂ’）_２を使用する。ｈ３８ｃ２Ｆ（ａｂ’）_２は、ｈ３８ｃ２ＩｇＧ１のタンパク質分解消化によって産生することができる。もう一つの態様は、ｈ３８ｃ２からのＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインを含んでなるｈ３８ｃ２ｓｃＦｖを使用し、これは、介入リンカー（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号：５９）によって所望により接続されていてもよい。ヒト化の代替として、ヒト抗体を産生することができる。例えば、免疫化（又は触媒抗体の場合反応性免疫化）によって内因性免疫グロブリンの産生の非存在中で、ヒト抗体の全レパートリーを産生することが可能である遺伝子導入動物（例えばマウス）を産生することが今や可能である。

【0261】

本明細書中で使用する場合、“薬物動態”は、時間をかけた血清中の投与された化合物の濃度を指す。薬物力学は、時間をかけた標的及び非標的組織中の投与された化合物の濃度、並びに標的組織（例えば、効力）及び非標的組織（例えば、毒性）に対する効果を指す。例えば、薬物動態又は薬物力学における改良は、不安定な連結を使用することにより、又はいずれものリンカーの化学的性質を改変する（例えば、溶解度、電荷、等を変化する）ことによるような、特定の標的剤或いは生物学的薬剤に対して設計することができる。用語“Ｋ_ｏｆｆ”は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の切断（ｏｆｆ）速度定数を指す。用語“Ｋ_ｄ”は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指す。

【0262】

幾つかの態様において、ＭＡＣの抗ＩＧＦ１Ｒ抗体部分は、そのインスリン受容体に対する選択性より少なくとも５０倍大きいＩＧＦ１Ｒに対する選択性を有する。幾つかの態様において、ＭＡＣの抗ＩＧＦ１Ｒ抗体部分の選択性は、そのインスリン受容体に対する選択性より１００倍より多く大きい。幾つかの態様において、ＭＡＣの抗ＩＧＦ１Ｒ抗体部分は、ＩＧＦ１Ｒ以外のいずれもの他のタンパク質に対していずれもの認識可能な特異的結合を示さない。

【0263】

本発明の幾つかの側面において、ＭＡＣは、高い親和性でＩＧＦ１Ｒに結合する。幾つかの態様において、ＭＡＣは、１×１０^−８Ｍ又はそれより小さいＫ_ｄでＩＧＦ１Ｒに結合する。幾つかの態様において、ＭＡＣは、１×１０^−９Ｍ又はそれより小さいＫ_ｄでＩＧＦ１Ｒに結合する。幾つかの態様において、ＭＡＣは、５×１０^−１Ｍ又はそれより小さいＫ_ｄでＩＧＦ１Ｒに結合する。幾つかの態様において、ＭＡＣは、１×１０^−１Ｍ又はそれより小さいＫ_ｄでＩＧＦ１Ｒに結合する。

【0264】

本発明の幾つかの側面において、ＭＡＣは、ＩＧＦ１Ｒからの低い解離速度を有する。一つの態様において、ＭＡＣは、１×１０^４ｓ^−１又はそれより低いＫ_ｏｆｆを有する。幾つかの態様において、Ｋ_ｏｆｆは、１×１０^−５ｓ^−１又はそれより低い。

【0265】

幾つかの側面において、本発明は、化合物の医薬的に受容可能な塩、立体異性体、互変異性体、溶媒和物、及びプロドラッグ、本発明の試料、組成物並びに医薬組成物を提供する。

【0266】

触媒抗体リンカー
標的剤を触媒抗体の結合部位に接続するために適したある種のリンカー（触媒抗体リンカー：ＣＡリンカー）が、その内容が本明細書中に参考文献として援用されるＵＳ２００９０９８１３０中に開示されている。用語“標的剤”は、用語“エフェクター分子”と区別するために本明細書中で使用されが、しかしＣＡリンカー又はＭＡＣ−リンカーの末端において接続される分子の種類が、互換的であることができることは明白である。特に、（ＣＡ−）リンカー、特異的（ＣＡ−）リンカー構造、（ＣＡ−）リンカーの合成及びＰ、Ｑ及びＷの異なった要素の組合せを記載する一般式に関するＵＳ２００９０９８１３０の、並びに（その中にそれぞれＸ、Ｙ及びＺとして分類されている）具体的に、そして一般的にその中に記載されているような側面は、本明細書中に含まれる。

【0267】

ＣＡリンカーは、ＣＡ−直鎖又は分枝鎖であることができ、そして一つ又はそれより多い炭素環又は複素環基を所望により含んでいてもよい。ＣＡリンカーの長さは、環の周りの最短の経路を取ることによって数えられる芳香族環等のような環式分子を伴う直鎖分子の数に関して考えることができる。幾つかの態様において、ＣＡリンカーは、５−１５個間の原子、他の態様において１５−３０個の原子、なお他の態様において３０−５０個の原子、なお他の態様において５０−１００個の原子、そしてなお他の態様において１００−２００個の原子の直鎖の長さを有する。他のＣＡリンカーの考慮事項は、溶解性、親油性、親水性、疎水性、安定性（計画された分解のようにおおよそ安定）、強直性、柔軟性、免疫原性、及び抗体結合の調節、ミセル又はリポソーム中に組込まれる能力、等のような、得られた化合物の物理的又は薬物動態学的特性上の影響を含む。

【0268】

幾つかの側面において、ＣＡリンカーは、ＴＡ連結残渣の側鎖に共有的に連結することができる。リンカーは、式：Ｐ−Ｑ−Ｗを含んでなることができ；ここにおいて、Ｐは、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択されるいずれもの原子を含む生物学的に適合性な接続鎖であり、そしてポリマー又はブロックコポリマーを含んでなることができ、そしてリンカーが直鎖である場合、連結残基（適宜に、側鎖、アミノ末端又はカルボキシル末端経由）に共有的に連結され、Ｑは、少なくとも一つの環構造を含んでなる所望により存在する認識基であり；そしてＷは、抗体の結合部位中のアミノ酸側鎖への共有連結を含んでなる接続分子である。

【0269】

存在する場合、Ｑは、所望により置換された構造：

【0270】

【化47】

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【0271】

を有することができ、式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅは、独立に炭素又は窒素であり；ｆは、炭素、窒素、酸素、又は硫黄であり；Ｑは、十分な原子価の何れもに二つの環の位置で独立にＰ及びＷに接続し；そして四つより多くないａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、又はｆは、同時に窒素であり、そして好ましくは環構造中のａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅは、それぞれ炭素である。幾つかの側面において、Ｑは、フェニルであることができる。いずれもの理論に束縛されることを望むものではないが、Ｗ基が反応性アミノ酸側鎖と反応することができるように、Ｑ基は、反応基が適した抗体結合部位中に位置決めすることを援助することができると信じられる。

【0272】

ＣＡリンカーは、抗体、タンパク質、又はこれらの断片のようなマクロ分子と共有的に又は非共有的に結合を形成することが可能な反応基を、これが含有するように設計することができる。反応性基は、特定の結合部位中の反応性残基と共に使用するために選択され
る。例えば、アルドラーゼ抗体によって改変される化学分子は、ケトン、ジケトン、ベータラクタム、活性なエステル ハロケトン、ラクトン、酸無水物、マレイミド、アルファ−ハロアセトアミド、シクロヘキシルジケトン、エポキシド、アルデヒド、アミジン、グアニジン、イミン、エナミン、リン酸塩、ホスホン酸塩、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、遮蔽又は保護されたジケトン（例えばケタール）、ラクタム、ハロケトン、アルデヒド、等であることができる。

【0273】

幾つかの態様において、Ｗは、抗体の結合部位中の残基の側鎖と共役する前に、アゼチジノン、ジケトン、アシルベータ−ラクタム、活性なエステル、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン基、アルデヒド、マレイミド、活性化されたアルケン、活性化されたアルキン、又は一般的に、求核性又は求電子性置換に感受性な脱離基を含んでなる分子を形成するために配置された一つ又はそれより多いＣ＝Ｏ基を含む。他の基は、ラクトン、酸無水物、アルファ−ハロアセトアミド、イミン、ヒドラジド、又はエポキシドを含むことができる。抗体の結合部位中の反応性求核基（例えば、リシン又はシステイン側鎖）に共有的に結合することができる例示的なリンカーの求電子反応基は、アシルベータ−ラクタム、単純なジケトン、スクシンイミド活性なエステル、マレイミド、リンカーを伴うハロアセトアミド、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン、アルデヒド、アミジン、グアニジン、イミン、エナミン、リン酸塩、ホスホン酸塩、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、遮蔽又は保護されたジケトン（例えばケタール）、ラクタム、スルホン酸塩、等、イミン、ケタール、アセタールのような遮蔽されたＣ＝Ｏ基、並びにいずれもの他の既知の求電子基を含む。ある態様において、反応性基は、アシルベータ−ラクタム、単純なジケトン、スクシンイミド活性なエステル、マレイミド、リンカーを伴うハロアセトアミド、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン、又はアルデヒドを形成するように配置された一つ又はそれより多いＣ＝Ｏ基を含む。Ｗは、置換されたアルキル、置換されたシクロアルキル、置換されたアリール、置換されたアリールアルキル、置換されたヘテロシクリル、又は置換されたヘテロシクリルアルキルであることができ、ここにおいて、少なくとも一つの置換基は、１，３−ジケトン分子、アシルベータ−ラクタム、活性なエステル、アルファ−ハロケトン、アルデヒド、マレイミド、ラクトン、酸無水物、アルファ−ハロアセトアミド、アミン、ヒドラジド、又はエポキシドである。幾つかの側面において、Ｗ基は、本発明のペプチドに増加した半減期を提供することができるマクロ分子骨格に共有的に連結される。幾つかの側面において、Ｗ基は、存在する場合、抗体の結合部位に共有的に連結される。

【0274】

幾つかの側面において、共役の前に（例えば、抗体の結合部位との）、Ｗは、構造：

【0275】

【化48】

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【0276】

を有し、式中、ｑ＝０−５である。ｑは、１又は２であることができる。ｑは、１であることができる。他の側面において、ｑは、２であることができる。
幾つかの側面において、抗体の結合部位との共役後、Ｗは、構造：

【0277】

【化49】

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【0278】

を有し、式中、ｑ＝０−５であり、そして抗体−Ｎ−は、抗体の結合部位中の側鎖への共有結合である。ｑは、１又は２であることができる。ｑは、１であることができる。他の側面において、ｑは、２であることができる。

【0279】

Ｐは、三つの成分；Ｐｐ−Ｐｓ−Ｐｙを含んでなる基であることができ、ここにおいて、Ｐｐは、標的剤と結合可能なように特異的に適合された基であり、Ｐｓは、Ｐ基のスペーサー領域であり、そしてＰｙは、Ｗ基に結合するように適合された基である。幾つかの側面において、Ｐｙは、アミド結合、エナミン結合、又はグアニジニウム結合から選択される。Ｐｙは、Ｑ基に隣接した（２個の原子以内）水素原子を提供するように選択することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、Ｈ原子が、Ｈ結合相互作用による疎水性ポケットの、特にｈ３８Ｃ２のような触媒抗体の結合間隙の疎水性ポケットに関するＱ基の認識を援助することができると信じられる。従って、例えば、アミド結合は、ＮＨ基のＨを水素結合のために提供し、ＮＨ基がＱ基に直接結合するように方向付けすることができる。別の方法として、アミドのＣ＝Ｏ基は、Ｑ基に原子約２個分隣接するが、しかしなおＨ−結合のために利用可能なＮＨ基のＨにより、Ｑ基に結合することができる。幾つかの態様において、Ｐｙは、非存在である。幾つかの態様において、Ｐｙ基は、式：

【0280】

【化50】

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【0281】

を有する。
幾つかの側面において、Ｐｓは、Ｐｓがいずれもの過度に反応性の基を提供しないように選択される。Ｐｓは、２−１５個間の原子の全長のＰ基を提供するように選択することができる。Ｐｓは、Ｐ基の全長が２ないし１０個間の原子であるように選択することができる。Ｘｓは、Ｐ基の全長が、４−８個の原子であるように選択することができる。Ｐｓは、Ｐ基の全長が５個の原子であるように選択することができる。Ｐｓは、Ｐ基の全長が６個の原子であるように選択することができる。幾つかの側面において、Ｐは、以下の式：

【0282】

【化51】

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【0283】

の一つを含んでなることができ、式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０であり、そしてｍは、存在又は非存在である；ｎは、１、２、３、４、５、又は６であることができる；ｎは、１、２、３、又は４であることができる；ｎは、１であることができる；ｎは、２であることができる；ｎは、３であることができる；ｎは、４であることができる。

【0284】

幾つかの側面において、Ｐｓは、以下の式：

【0285】

【化52】

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【0286】

の一つを含んでなる。
Ｐｐは、理想的には、ペプチド、タンパク質、小分子、核酸又はアプタマーのような標的分子（ＴＡ連結残基）の連結残基への特異的方向性共有連結戦略が可能なように選択される。例えば、ＴＡ連結残基が、求核基を含んでなる場合、Ｐｐは、求電子基であることができ、そして逆もまた同じである。例えば、ＴＡ連結残基の側鎖が、Ｋ、Ｈ、Ｙ、オルニチン（ｏｒｔｈｉｎｉｎｅ）、Ｄａｐ、又はＤａｂのようなアミノ基を含んでなる場合、Ｘｐは、ＣＯＯＨ、又は他の類似の反応性求電子物質であることができる。ＴＡ連結残基がＤ又はＥである場合、Ｐｐは、アミン基のような求核基を含んでなることができる。これらの戦略のいずれかは、Ｐｐ基及びＴＡ連結残基間に形成される共有結合を、アミド結合形成戦略によって可能にする。ＴＡ連結基がアミノ基である場合、Ｐｐは、式：

【0287】

【化53】

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【0288】

を含んでなることができる。
Ｐは、所望により存在する生物学的に適合性のポリマー又はブロックコポリマーであることができる。Ｐは、構造：

【0289】

【化54】

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【0290】

のものであることができ、式中、Ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、３２、４３、４４、又は４５であり；ｗ、ｒ、及びｓは、それぞれ独立に０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であり；そしてＲ^ｂは、それぞれの出現において
、独立に水素、置換された又は非置換のＣ_１−１０アルキル、置換された又は非置換のＣ_３−７シクロアルキル−Ｃ_０−６アルキル、或いは置換された又は非置換のアリール−Ｃ_０−６アルキルである。

【0291】

ＴＡ連結残基がＣ、Ｃの相同体、又は他のチオール基含有残基である場合、Ｐｐは、マレイミド基（又は類似）を含んでなることができ、Ｐｐ基のＴＡ連結残基に共有的に連結するチオール−マレイミド付加反応戦略を可能にする。幾つかの側面において、Ｐｐは、更にチオール基を含んでなることができ、ＴＡ連結残基及びＰｐ基間にジスルフィド橋を形成することを可能にする。幾つかの側面において、Ｐｐは、マレイミド：

【0292】

【化55】

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【0293】

であることができ、式中、矢印は、標的分子への接続点を示し、そして平行線は、リンカーのＱ基への接続である。標的分子への接続点が、システイン残基、又は他のチオール保有側鎖を含んでなる場合、共役の機構は、以下：

【0294】

【化56】

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【0295】

のとおりであることができる。
幾つかの側面において、Ｐｐ基は、置換されたマレイミド：

【0296】

【化57】

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【0297】

を含んでなる。
幾つかの側面において、Ｐは：

【0298】

【化58】

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【0299】

であり、式中、ｖ及びｗは、Ｘの骨格長が６−１２個の原子であるように選択される；
幾つかの側面において、ＴＡリンカーは、式：

【0300】

【化59】

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【0301】

のものであり、式中、ｎ＝１、又は２、又は３、又は４、５、６、７、８、９、或いは１０である；ｎは、１、２、３、４、５、又は６であることができる；ｎは、１であることができる；ｎは、２であることができる；ｎは、３であることができる；ｎは、４であることができる。Ｍは、非存在であることができる。Ｍは、存在であることができる。

【0302】

幾つかの側面において、ＴＡリンカーは、式：

【0303】

【化60】

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【0304】

のものであることができ、式中、ｎ＝１、又は２、又は３、又は４、５、６、７、８、９、或いは１０である；ｎは、１、２、３、４、５、又は６であることができる；ｎは、１であることができる；ｎは、２であることができる；ｎは、３であることができる；ｎは、４であることができる。Ｍは、非存在であることができる。Ｍは、存在であることができる。

【0305】

幾つかの側面において、ＣＡリンカーのＰ部分は、本発明のＭＡＣのためのリンカーのＹ、Ｘ−Ｙ、Ｙ−Ｚ及びＸ−Ｙ−Ｚ部分として使用することができる。
ペプチド及びタンパク質
アシルリシン、又はＫａｃ（更にＡｃＫ）は：

【0306】

【化61】

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【0307】

を指し、Ｋ（ＳＨ）は：

【0308】

【化62】

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【0309】

ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）：

【0310】

【化63】

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【0311】

ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）：

【0312】

【化64】

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【0313】

ホモシステイン：

【0314】

【化65】

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【0315】

ホモセリン：

【0316】

【化66】

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【0317】

オルニチン：

【0318】

【化67】

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【0319】

を指す。
一般的に、本明細書中に記載される細胞及び組織培養物、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学及びタンパク質、並びに核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して、そしてその技術において使用される命名法は、当技術において公知の、そして普通に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、一般的に、当技術において公知の、そして他に示さない限り、本明細書を通して引用され、そして考察された各種の一般的な、そして更に具体的な参考文献中に記載されるような、慣用的な方法によって行われる。本明細書中で使用する場合、２０個の慣用的なアミノ酸及びその略語は、慣用的な使用に従う。“ポリペプチド”、“ペプチド”及び“タンパク質”は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。本明細書中で使用される場合、これらの用語は、一つ又はそれより多いアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学類似体である
アミノ酸ポリマーに適用される。これらの用語は、更に天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用される。アミノ酸は、結合及びペプチドの他の所望の特徴が維持されている限り、Ｌ又はＤ型であることができる。ポリペプチドは、モノマー性又はポリマー性であることができる。

【0320】

“Ｄ”接頭辞、例えば、Ｄ−Ａｌａ又はＮ−Ｍｅ−Ｄ−Ｉｌｅ、或いは小文字様式、例えば、ａ、ｉ、ｌ、（Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＬｅｕのＤ変種）によって他に示されない限り、本明細書及び付属する特許請求の範囲中で記載されるペプチド中のアミノ酸及びアミノアシル残基のアルファ炭素の立体構造は、天然の又は“Ｌ”配置である。

【0321】

全てのペプチド配列は、α−Ｎ−末端アミノ酸残基が左にあり、そしてα−Ｃ−末端アミノ酸が右にある一般的に受容される習慣によって書かれている。本明細書中で使用する場合、用語“Ｎ末端”は、ペプチド中のアミノ酸の遊離α−アミノ基を指し、そして用語“Ｃ末端”は、ペプチド中のアミノ酸の遊離α−カルボン酸末端を指す。一つの基でＮ終結したペプチドは、Ｎ末端アミノ酸残基のアルファ−アミノ窒素上に一つの基を保有するペプチドを指す。一つの基でＮ終結されたアミノ酸は、α−アミノ窒素上に一つの基を保有するアミノ酸を指す。

【0322】

本明細書中で使用する場合、“ハロ”、“ハロゲン”又は“ハロゲン化物”は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを指す。
本明細書中で使用する場合、“生物学的活性”は、化合物、組成物、又は他の混合物のｉｎ ｖｉｖｏの活性、或いは化合物、組成物又は他に混合物のｉｎ ｖｉｖｏの投与の結果である生理学的反応を指す。従って生物学的反応は、このような化合物、組成物、及び混合物の治療効果、診断効果及び医薬的活性を包含する。用語“生物学的に活性”又は“機能的”は、ＡＡ標的剤の特徴であるか又はそれに類似した少なくとも一つの活性を示すポリペプチドを指す。

【0323】

用語“生物学的に適合性のもの”は、本明細書中で使用する場合、細胞内及び細胞外の生物学的分子と、生物学的に不活性又は非反応性であり、そして非毒性である何物かを意味する。

【0324】

語句“置換されたアルキル”は、炭素（等）又は水素（等）に対する一つ又はそれより多い結合が、制約されるものではないが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩのようなハロゲン化物中のハロゲン原子；ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、及びエステル基のような基中の酸素原子；チオール基、アルキル及びアリールスルフィド基、スルホン基、スルホニル基、及びスルホキシド基のような基中の硫黄原子；アミン、アミド、アルキルアミン、ジアルキルアミン、アリールアミン、アルキルアリールアミン、ジアリールアミン、Ｎ−オキシド、イミド、及びエナミンのような基中の窒素原子；トリアルキルシリル基、ジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基、及びトリアリールシリル基のような基中のケイ素原子；並びに各種の他の基中の他の異種原子のような、非水素及び非炭素原子への結合によって置換されているアルキル基を指す。置換されたアルキル基は、更に炭素（等）又は水素（等）原子への一つ又はそれより多い結合が、カルボニル、カルボキシル、及びエステル基中の酸素；イミン、オキシム、ヒドラゾン、及びニトリルのような基中の窒素のような、異種原子への結合によって置換された基を含む。置換されたアルキル基は、特に、炭素又は水素への一つ又はそれより多い結合がフッ素原子への一つ又はそれより多い結合によって置換されたアルキル基を含む。置換されたアルキル基の一つの例は、トリフルオロメチル基及びトリフルオロメチル基を含有する他のアルキル基である。他のアルキル基は、炭素又は水素原子への一つ又はそれより多い結合が、置換されたアルキル基が、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ基、又はヘテロシクリルオキシ基を含有するように酸素原子への結合によって置換されているものを含む。な
お他のアルキル基は、アミン、アルキルアミン、ジアルキルアミン、アリールアミン、（アルキル）（アリール）アミン、ジアリールアミン、ヘテロシクリルアミン、（アルキル）（ヘテロシクリル）アミン、（アリール）（ヘテロシクリル）アミン、又はジヘテロシクリルアミン基を有するアルキル基を含む。

【0325】

語句“非置換のアルキル”は、先に定義したとおりの二価の非置換のアルキル基を指す。従って、メチレン、エチレン、及びプロピレンは、非置換のアルキレンのそれぞれの例である。語句“置換されたアルキル”は、先に定義したとおりの二価の置換されたアルキル基を指す。置換された又は非置換の低級アルキレン基は、１から約６個までの炭素を有する。

【0326】

語句“非置換のシクロアルキル”は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルのような環式アルキル基、並びに先に定義したとおりの直鎖又は分枝鎖アルキル基で置換されたこのような環を指す。この語句は、更に制約されるものではないが、アダマンチル、ノルボルニル、及びビシクロ［２．２．２］オクチル等のような多環式アルキル基、並びに先に定義したとおりの直鎖又は分枝鎖アルキル基で置換されたこのような環を含む。従って、この語句は、特にメチルシクロヘキシル基を含むものである。この語句は、異種原子を含有する環式アルキル基を含まない。非置換のシクロアルキル基は、親化合物中の一つ又はそれより多い炭素原子（等）、酸素原子（等）、窒素原子（等）、及び／又は硫黄原子（等）に結合することができる。幾つかの態様において、非置換のシクロアルキル基は、３から２０個の炭素原子を有する。他の態様において、このような非置換のシクロアルキル基は、３から８個までの炭素原子を有し、一方、他において、このような基は、３から７個の炭素原子を有する。

【0327】

語句“置換されたシクロアルキル”は、非置換のシクロアルキルに対して、置換されたアルキル基が、非置換のアルキル基に対して有するものと同じ意味を有する。従って、この語句は、制約されるものではないが、オキソシクロヘキシル、クロロシクロヘキシル、ヒドロキシシクロペンチル、及びクロロメチルシクロヘキシル基を含む。

【0328】

図面の詳細な説明

【図面の簡単な説明】

【0329】

【図1A】図１Ａは、可変領域に対するコンセンサス配列を伴う抗体２．１２．１及び２．１２．１．ｆｘの重鎖からのアミノ酸配列の整列を示す。

【図1B】図１Ｂは、可変領域に対するコンセンサス配列を伴う抗体２．１２．１及び２．１２．１．ｆｘの軽鎖からのアミノ酸配列の整列を示す。ＣＤＲは、下線を引かれ、そして定常領域は、イタリックで示す。抗体２．１２．１及び２．１２．１．ｆｘの配列は、ＷＯ２００５０１６９６７及びＷＯ２００５０１６９６７中に開示されているとおりである。

【図2A】図２は、質量分析によるＭＡＣのインタクトな分子量分析は、多数のペプチドが抗ＩＧＦ１Ｒ抗体２．１２．１．ｆｘに接続していることを示す。図２Ａは、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体２．１２．１．ｆｘの質量分析データである。

【図2B】図２Ｂ−２Ｄは、ＭＡＣ−２の質量分析データであり、三つの別個のロットの複製実験を示す。

【図2C】図２Ｂ−２Ｄは、ＭＡＣ−２の質量分析データであり、三つの別個のロットの複製実験を示す。

【図2D】図２Ｂ−２Ｄは、ＭＡＣ−２の質量分析データであり、三つの別個のロットの複製実験を示す。

【図3A】図３は、２．１２．１．ｆｘ（ＩＧＦ１Ｒ）及びＭＡＣ−２の三つのロット（ＭＡＣ）の質量分析データであり、ここで、ジスルフィド結合は還元されている。図３Ａは、２．１２．１．ｆｘ（ＩＧＦ１Ｒ）、軽鎖の質量分析データである。

【図3B】図３Ｂは、２．１２．１．ｆｘ（ＩＧＦ１Ｒ）、重鎖の質量分析データである。

【図3C】図３Ｃは、ＭＡＣ−２、ロット１の軽鎖の質量分析データである。

【図3D】図３Ｄは、ＭＡＣ−２、ロット１の重鎖の質量分析データである。

【図3E】図３Ｅは、ＭＡＣ−２、ロット２の軽鎖の質量分析データである。

【図3F】図３Ｆは、ＭＡＣ−２、ロット２の重鎖の質量分析データである。

【図3G】図３Ｇは、ＭＡＣ−２、ロット３の軽鎖の質量分析データである。

【図3H】図３Ｈは、ＭＡＣ−２、ロット３の重鎖の質量分析データである。

【図4】図４Ａは、黒丸で記述されたキモトリプシン開裂部位を伴う抗体２．１２．１．ｆｘの軽鎖のアミノ酸配列である。Ｌｙｓ残基（潜在的な共役の部位）を含有するキモトリプシン断片は、Ｎ末端からの番号によって標識されている。軽鎖のＹ１５断片は、下線を引かれている。図４Ｂは、黒丸で記述されたキモトリプシン開裂部位を伴う抗体２．１２．１．ｆｘの重鎖のアミノ酸配列である。Ｌｙｓ残基（潜在的な共役の部位）を含有するキモトリプシン断片は、Ｎ末端からの番号によって標識されている。

【図5A】図５Ａは、共役されたリシン含有ペプチド：軽鎖Ｙ１５の質量分析データであり、非共役の（複合体形成していない）抗ＩＧＦ１Ｒ抗体２．１２．１．ｆｘ（ＩＧＦ１ｒ）及びＭＡＣ−２（ＭＡＣ）に対する質量分析データ、並びにＹ１５断片の代表を示す。

【図5B】図５Ｂは、非共役の軽鎖Ｙ１５断片の質量分析データであり、非共役の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体２．１２．１．ｆｘ（ＩＧＦ１ｒ）及びＭＡＣ−２（ＭＡＣ）に対する質量分析データ、並びにＹ１５断片の代表を示す。

【図6A】図６Ａは、２．１２．１．ｆｘのトリプシン断片に対する選択されたイオンのＬＣＭＳクロマトグラムのデータである。

【図6B】図６Ｂは、Ｌｙｓ^１８８がＭＡＣ−２のＡＢＰで修飾された場合のトリプシン断片に対する選択されたイオンのＬＣＭＳクロマトグラムのデータである。

【図7A】図７Ａは、２．１２．１．ｆｘのトリプシン断片に対する選択されたイオンのＬＣＭＳクロマトグラムのデータである。

【図7B】図７Ｂは、Ｌｙｓ^１９０がＭＡＣ−２のＡＢＰで修飾された場合のトリプシン断片に対する選択されたイオンのＬＣＭＳクロマトグラムのデータである。

【図8】図８は、インタクトなＭＡＣ−２の質量スペクトルである。

【図9A】図９Ａは、ＭＡＣ−２に対する還元された重鎖の質量スペクトルである。

【図9B】図９Ｂは、ＭＡＣ−２に対する還元された軽鎖の質量スペクトルである。

【図10】Ａｎｇ１−４の結合ＥＬＩＳＡである。Ａｎｇファミリー（Ａｎｇ１−４）のメンバーへのＭＡＣの結合の代表的グラフである。

【図11】Ａｎｇ２の競合ＥＬＩＳＡである。ＭＡＣに対するＡｎｇ２のＴｉｅ２受容体への結合に対する競合の代表的グラフである。

【図12】ＩＧＦ１Ｒの競合ＥＬＩＳＡである。ＭＡＣに対するＩＧＦ１のＩＧＦ１Ｒへの結合に対する競合の代表的グラフである。

【図13】３Ｔ３−ｈＩＧＦ１Ｒ細胞に対するＭＡＣによるＩＧＦ１誘導のＩＧＦ１Ｒ自己リン酸化の阻害である。

【図14A】図１４Ａは、ベヒクル、Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２、ＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．１．ｆｘ）又はＭＡＣ−２（ＩＰ、１×／週）による治療後の、Ｃｏｌｏ２０５大腸腺癌異種移植腫瘍の体積である。データは、ｎ＝１０／群の０−２８日間の平均及びＳＥとして示す（２８日を超える全ての群に対してｎ＝１０）。^＊：Ｐ＜０．０５、ＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．１．ｆｘ）１０ｍｇ／ｋｇ対ＭＡＣ−２、１０ｍｇ／ｋｇ；^＊＊：Ｐ＜０．０１、Ａｎｇ２−ｈ３８Ｃ２対ＭＡＣ−２；二元Ａｎｏｖａ、ボンフェローニ事後検定。

【図14B】図１４Ｂは、切除され、そして冷凍された腫瘍から調製された溶菌液中の相対的ＩＧＦ１Ｒ発現レベルである。

【図15A】図１５Ａは、ベヒクル又はＭＡＣ−２（ＩＰ、１×／週、０．３−１０ｍｇ／ｋｇ）による毎週のＩＰ治療後の、Ｃｏｌｏ２０５大腸腺癌異種移植腫瘍の体積である。データは、ｎ＝１０／群の平均及びＳＥとして示す。^＊＊＊：Ｐ＜０．００１、ＰＢＳ対ＭＡＣ−２（全ての投与量）；二元Ａｎｏｖａ、ボンフェローニ事後検定。

【図15B】図１５Ｂは、２８日目の最終腫瘍重量である。

【図15C】図１５Ｃは、ベヒクル又はＭＡＣ−２（ＩＰ、毎週１回）による治療後の、Ｃｏｌｏ２０５大腸腺癌異種移植腫瘍の微小血管密度である。

【図15D】図１５Ｄは、切除され、そして冷凍された腫瘍から調製された溶菌液中の相対的Ａｎｇ２発現レベルである。

【図15E】図１５Ｅは、切除され、そして冷凍された腫瘍から調製された溶菌液中の相対的ＩＧＦ１Ｒ発現レベルである。

【図16A】図１６Ａは、ベヒクル、Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．１．ｆｘ）（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＭＡＣ−２（１、３又は１０ｍｇ／ｋｇ）による毎週１回のＩＰ治療後の、Ｃｏｌｏ２０５大腸腺癌異種移植腫瘍の体積である。

【図16B】図１６Ｂは、ベヒクル、ＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１３．２）（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＭＡＣ−２（１０ｍｇ／ｋｇ）による毎週１回のＩＰ治療後の、Ｃｏｌｏ２０５大腸腺癌異種移植腫瘍の体積である。

【図16C】図１６Ｃは、ベヒクル、Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．１．ｆｘ及び２．１３．２）（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＭＡＣ−２（１、３又は１０ｍｇ／ｋｇ）或いは２．１２．１．ｆｘ又は２．１３．２（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかと組合せたＡｎｇ２−ｈ３８ｃ２（１０ｍｇ／ｋｇ）による毎週１回のＩＰ治療後の、Ｃｏｌｏ２０５大腸腺癌異種移植腫瘍の体積である。全てのデータは、ｎ＝１０／群の平均及びＳＥとして示す。

【図17】図１７は、ベヒクル又はＭＡＣ−２（ＩＰ、週１回）による毎週の治療後のＭＤＡ−ＭＢ−４３５黒色腫の腫瘍体積である。^＊＊：Ｐ＜０．０５、ＰＢＳ対ＭＡＣ−２、２０ｍｇ／ｋｇ；^＊＊＊：Ｐ＜０．０１、ＰＢＳ対Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２、１０ｍｇ／ｋｇ又はＭＡＣ−２、３ｍｇ／ｋｇ：二元Ａｎｏｖａ、ボンフェローニ事後検定。データは、ｎ＝１０／群の平均及びＳＥとして示す。

【図18A】図１８Ａは、ｍ３８ｃ２、ｈ３８ｃ２、及びヒト生殖系列の可変ドメインのアミノ酸配列の整列である。フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ等によって定義されている。星印は、ｍ３８ｃ２及びｈ３８ｃ２間又はｈ３８ｃ２及びヒト生殖系列間の差を示す。

【図18B】図１８Ｂは、マウス定常軽鎖カッパ領域（ｍＣＬκ）、ヒト定常軽鎖カッパ領域（ｈＣＬκ）、及びヒト定常軽鎖ラムダ領域（ＨＣＬλ）のアミノ酸配列の整列である。ｍＣＬκ及びｈＣＬκ間；並びにｈＣＬκ及びｍＣＬλ間の差は、星印として示し、そして保存された置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）は、十字で示している。

【発明を実施するための形態】

【0330】

本発明をよりよく理解することができるために、以下の実施例が記載される。これらの実施例は、例示のみの目的のためであり、そしていずれもの様式で本発明の範囲を制約すると解釈されるべきではない。

【0331】

実施例

【実施例1】

【0332】

実施例１ 本発明で使用されるペプチドの合成

【0333】

【化68】

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【実施例2】

【0334】

実施例２：実施例１のように調製したペプチドの樹脂からの開裂。

【0335】

【化69】

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【実施例3】

【0336】

実施例３ ＡＢＰ−チオール−リンカー化合物の合成

【0337】

【化70】

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【0338】

異なった繋留点を伴うＡｎｇ２結合ペプチド（ＡＢＰ）の類似体を合成した（実施例１及び２を参照）。最初に、遊離のチオールＡＢＰ中間体を、合成及び精製し、そして次いでマレイミド−ＰＥＧ_２−ＰＦＰリンカーを加え、続いて最終的な精製工程により、純粋なＰＦＰで活性化されたＡＢＰを得た。ペプチド鎖の構築及び開裂を、スキーム１及び２に概略示すように行って、純粋なＡＢＰを産生した。

【0339】

ＡＢＰ（２８４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）中に撹拌しながら溶解した。別に、Ｓ−トリチル−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ、６２ｍｇ、概略０．１２５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４８ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（０．０２５ｍｌ、０．２５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．５ｍｌ）中で溶解するまで５分間撹拌した。ＡＢＰ溶液及び活性化されたＭＰＡ溶液を、２時間一緒に混合した。反応の進行をＬＣＭＳによってモニターした。２時間後、溶液を、氷冷のエーテル（４０ｍｌ）中にゆっくりと加えて、ＡＢＳ−Ｓ−トリチル−ＭＰＡ生成物を沈殿させた。白色の沈殿物を濾過によって収集し、次いで乾燥した。次いで固体の残渣を、トリフルオロ酢酸のジクロロメタン中の溶液（１：１０、１０ｍｌ）中に溶解し、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）を加え（０．０５０ｍｌ）、そして１時間撹拌した。溶液を減圧下で明るい黄色の油状物まで蒸発し、次いで粗製のチオールペプチドを氷冷のエーテルの添加によって沈殿させた。生成物を遠心によって収集し、そして真空中で乾燥した。残渣をアセトニトリルの５０％水溶液中に溶解し、次いで凍結乾燥して、粗製のチオールペプ
チド（ＨＰＬＣ分析により概略８０％の純度）を得た。粗製のチオールペプチドを準分離用ＨＰＬＣによって精製して、１４５ｍｇの配列番号：２７を得た。
配列番号：２７-Ｋ（ＳＨ）¹¹−ＭＡＬ−２ＰＥＧ−ＰＦＰの合成

【0340】

【化71】

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【実施例4】

【0341】

実施例４ Ａｎｇ−２結合ペプチド−チオール中間体（ＡＢＰ−ｔｉ）の産生
ペプチド鎖の構築を、０．１ミリモル規模で行った。使用した樹脂は、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ＰＬ樹脂（１５０ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ／ｇ置換）であった。標準的なＦｍｏｃ化学プロトコルを使用して、ペプチドを構築した。Ｆｍｏｃの除去は、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３×５分間であり、そして全ての樹脂の洗浄工程はＤＭＦを使用した。アミノ酸を組込むために、それぞれの残基に対して、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＮＭＭ活性化を使用する一回のカップリング工程を２時間使用した。連結残基（Ｋ（ＳＨ））を、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎ^ε−メルカプトプロピオン酸−Ｓ−Ｔｒｔ）−ＯＨとして組込んだ。鎖の構築後、Ｎ末端のＦｍｏｃ基を除去し、そしてペプチド樹脂をアセチル化によってキャップした。最終の樹脂をＤＣＭで洗浄し、そして一晩真空中で乾燥した。得られた最終の樹脂の重量は次のとおり：配列番号：２９−Ｋ（ＳＨ）^９：６２７ｍｇ、配列番号：３０−Ｋ（ＳＨ）^１６：５７３ｍｇ、配列番号：３１−Ｋ（ＳＨ）^１８：６４２ｍｇ、そして配列番号：３２−Ｋ（ＳＨ）^１９：６４１ｍｇであった。

【0342】

保護基の加酸分解的（ａｃｉｄｏｌｙｔｉｃ）除去及び樹脂からのペプチドの開裂は、ＴＦＡ／水／ジチオトレイトール／トリイソプロピルシラン（９０：４：４：２の比、５ｍｌ）のカクテルを２時間使用して達成した。溶液を樹脂から濾過し、そして樹脂を更なる５ｍｌの未希釈のＴＦＡで洗浄した。混合した濾液をシロップ状まで蒸発し、次いで氷冷のエーテルの添加により、白色の粉末が沈殿物した。粉末を遠心によって収集し、次いでアセトニトリルの５０％水溶液（２０ｍｌ）中に溶解し、冷凍し、そして一晩凍結乾燥した。

【0343】

結果：
配列番号：２９−Ｋ（ＳＨ）^９

【0344】

【化72】

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【0345】

得られた粗製の配列番号：２９−Ｋ（ＳＨ）^９の量は、２５２ｍｇであった。ＨＰＬＣによる粗製の配列番号：２９−Ｋ（ＳＨ）^９の分析は、きれいな主要ピークを示した；５−９５％Ｂ／３０分、Ｃ１８、Ｒｔ＝１８．３分。粗製の配列番号：２９−Ｋ（ＳＨ）^９の更なるＬＣＭＳ分析は、主要ピークが所望の生成物であることを示した；［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９３０、＋２＝１４６５、＋３＝９７７を観察した。

【0346】

配列番号：３０−Ｋ（ＳＨ）^１６

【0347】

【化73】

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【0348】

得られた粗製の配列番号：３０−Ｋ（ＳＨ）^１６の量は、２２９ｍｇであった。ＨＰＬＣによる粗製の配列番号：３０−Ｋ（ＳＨ）^１６の分析は、きれいな主要ピークを示した；５−９５％Ｂ／３０分、Ｃ１８、Ｒｔ＝２２．０分。粗製の配列番号：３０−Ｋ（ＳＨ）^１６の更なるＬＣＭＳ分析は、主要ピークが所望の生成物であることを示した；［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９１５、＋２＝１４５８、＋３＝９７２を観察した。

【0349】

配列番号：３１−Ｋ（ＳＨ）^１８

【0350】

【化74】

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【0351】

得られた粗製の配列番号：３１−Ｋ（ＳＨ）^１８の量は、２５２ｍｇであった。ＨＰＬＣによる粗製の配列番号：３１−Ｋ（ＳＨ）^１８の分析は、きれいな主要ピークを示した；５−９５％Ｂ／３０分、Ｃ１８、Ｒｔ＝２１．１分。粗製の配列番号：３１−Ｋ（ＳＨ）^１８の更なるＬＣＭＳ分析は、主要ピークが所望の生成物であることを示した；［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９１２、＋２＝１４５６、＋３＝９７１を観察した。

【0352】

配列番号：３２−Ｋ（ＳＨ）^１９

【0353】

【化75】

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【0354】

得られた粗製の配列番号：３２−Ｋ（ＳＨ）^１９の量は、２６１ｍｇであった。ＨＰＬＣによる粗製の配列番号：３２−Ｋ（ＳＨ）^１９の分析は、きれいな主要ピークを示した；５−９５％Ｂ／３０分、Ｃ１８、Ｒｔ＝２０．０分。粗製の配列番号：３２−Ｋ（ＳＨ）^１９の更なるＬＣＭＳ分析は、主要ピークが所望の生成物であることを示した；［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９３０、＋２＝１４６５、＋３＝９７７を観察した。

【0355】

精製：
分離用ＨＰＬＣカラムを、ＴＦＡの希釈水溶液及びアセトニトリルで事前平衡した。粗製のＡＢＰ−チオール中間体（即ち、連結残基としてＫ（ＳＨ）を伴うＡＢＰ）をＤＭＦ（３ｍｌ）中に溶解し、次いでカラム上に吸着させ、そして希釈ＴＦＡ中のアセトニトリルの勾配を適用することによって溶出した。画分を、質量（Ｍ＝１４６５）によって自動的に収集した。カラムからの溶出を、ＵＶによってモニターし、得られた画分を分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。最も純粋な画分（分析用ＨＰＬＣにより＞９５％）を混合し、そして凍結乾燥して、次の量：８７ｍｇの純粋な配列番号：２９−Ｋ（ＳＨ）^９、５０ｍｇの純粋な配列番号：３０−Ｋ（ＳＨ）^１６、５９ｍｇの純粋な配列番号：３１−Ｋ（ＳＨ）^１８、及び３９ｍｇの純粋な配列番号：３２−Ｋ（ＳＨ）^１９を得た。

【0356】

リンカーの合成
ＡＢＰを、本発明の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体に共役するために、五つの異なった活性化戦略を考慮した、（実施例５−９）（例示的構造は、配列番号：２７−Ｋ（ＳＨ）^１１を使用して示す）：

【実施例5】

【0357】

実施例５ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）（配列番号：２７−Ｋ^１１−ＮＨＳ）

【0358】

【化76】

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【0359】

配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＮＨＳの合成
配列番号：２７−Ｋ（５．１）を、ＮＨＳで活性化されたカルボキシル基が最終の活性化されたペプチド精製物（５．３）上に残り、そしてその後の共役のために使用可能なままであるように、ビス−ＮＨＳ、ＰＥＧ_ｘ−リンカー（５．２）と反応させた。これは、ＡＢＰ上の４個の他の遊離カルボキシル基の存在によって必要とされた。これらは、活性化された基の位置が、容易に制御することができず、そしてこれが多数のカルボキシル側鎖が活性化されるものである可能性があるものであるために、簡単なｉｎ ｓｉｔｕの活性化戦略を妨げる。

【0360】

ビス−ＰＥＧ_５−ＮＨＳエステル及びＡＢＰ（配列番号：２７）間の反応を試験した。ＤＭＳＯ中の１０倍過剰のリンカーの溶液を使用して、ＡＢＰ及びＮ−メチルモルホリン（塩基として）のＤＭＳＯ中の溶液を、十分に撹拌された溶液中でゆっくりと滴定した。試料を採取し、そしてＨＰＬＣ及びＬＣＭＳによって各種の時点で試験した。約２時間後、かなりの生成物の形成があり（５．１から５．３を形成するための概略８０％転換）、そしてこれは、ビス−ＮＨＳリンカー試薬から容易に分離された。然しながら、ＤＭＳＯ中でさえ、生成物５．３は時間をかけて遊離酸の形態にゆっくりと転換された（ここでＮＨＳ−エステル基は、不活性な遊離カルボキシルに転換される）。更に、粗製の反応混合物を分画して、所望の生成物５．３を単離する場合、これは、更に精製及びその後の凍結
乾燥行程中に加水分解にさらされた。この方法は、ある程度の生成物を合成することにおいて好結果であったが、得られたＮＨＳ−エステルの水に対する不安定性が、その後の結合反応におけるその適用を制約するものであると考えられた。ＭＡＬ−ＰＥＧ２−ＮＨＳの更なる試験を、実施例３０（Ｚ^＊基Ｚ１３を含んでなる）に示す。

【実施例6】

【0361】

実施例６ マレイミド（Ｍａｌ）（配列番号：２７−Ｋ^１１−Ｍａｌ）

【0362】

【化77】

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【0363】

マレイミド活性化は、一般的に遊離チオール共役パートナーと協調して使用される。抗体２．１２．１．ｆｘ中に遊離チオール残基は存在しないが、遊離チオールをタンパク質に導入するために使用することができる、幾つかの化学的方法があり、そして従ってマレイミドに基づく共役のための連結部位が提供される。

【0364】

Ｍａｌ含有ペプチドは、一般的に簡単なマレイミド／酸含有リンカーを使用して比較的単純に合成される。幾つかの配列番号：２７−ＭＡＬ化合物が以下に示すように合成される。一般的に、マレイミドで活性化されたペプチドは、内因性チオール（遊離システイン側鎖から誘導される）又は他の化学的手段、例えばトラウト（Ｔｒａｕｔ’ｓ）試薬によって導入されるチオールのいずれかを欠くタンパク質又は抗体にはよく共役しなかった。

【0365】

【化78】

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【0366】

配列番号：２７−Ｋ^１１−Ｍａｌ

【0367】

【化79】

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【0368】

配列番号：２７−Ｋ^１１−４ＰＥＧ−Ｍａｌ−２

【実施例7】

【0369】

実施例７ アゼチジノン（ＡＺＤ）（配列番号：２７−Ｋ^１１−ＡＺＤ）

【0370】

【化80】

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【0371】

ＡＺＤで活性化されたＡＢＰは、リシン側鎖のアミノ酸と非常にゆっくりと反応した。リン酸緩衝液中のｐＨ７ないし９で、共役を試みて、その電荷を減少することによって抗体表面のリシンの求核性の傾向を増加した（表面タンパク質上のリシンのｐＫａは、約９．１ないし１１．２である）。抗体の安定性に伴う問題点及びＡＺＤの加水分解は、９より上のｐＨの使用を妨げた。１５モルのＡＺＤで活性化されたＡＢＰを、抗体の１モル当たり）３日間の反応時間をかけて加え、低いレベルの共役を得た（抗体当たり平均２個のＡＺＤで活性化されたＡＢＰ）。塩基性のｐＨにおいて、ＡＺＤの加水分解が急速に起こり（２４時間後５０％）、減少したレベルの共役に寄与した。

【実施例8】

【0372】

実施例８ スクアリン酸のエステル（スクアリン酸塩）。（配列番号：２７−スクアリン酸）

【0373】

【化81】

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【0374】

スクアリン酸から製造されたアルキルエステルは、中性のｐＨでチオールと選択的に反応し、一方高いｐＨ（概略８．５以上）において、これらは、更にアミンと、しかし更にゆっくりと反応することができること知られている。スクアリン酸塩の反応性は、アルキル基のアリール基による置換によって有意に向上することができる。本発明は、ＡＢＰの幾つかのスクアリン酸塩誘導体を提供し、ここで、‘Ｒ’の性質（Ｒは、エチル、フェニル、２−メトキシカルボニルフェニル、３−フルオロフェニル及び３，５−ジフルオロフェニルからなる群から選択される）、及びリンカーの位置が変化する場合、他の誘導体が変化する。スクアリン酸エチルは、遊離チオールによく共役するが、しかしタンパク質及び抗体上の遊離アミンに対して、ｐＨが９より上の場合でない限り不良である。スクアリン酸アリールは、本発明の抗体上の遊離リシンに中性のｐＨで共役する場合、良好な効率を示す。

【実施例9】

【0375】

実施例９ ペンタフルオロフェニルエステル（ＰＦＰ）（配列番号：２７−ＰＦＰ）

【0376】

【化82】

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【0377】

本発明は、更に比較的安定な活性化されたペプチドを形成するためのペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステルの使用を提供する。この方法は、ＰＦＰ基が安定な活性化されたペプチド生成物から溶液中で容易に導入することができ、これ自体は観察される僅かなＰＦＰエステルの加水分解を伴って標準的なＨＰＬＣ法を使用して精製することができることにおいて他の方法を超える幾つかの利点を有する。抗体に共役することが可能な反応性基を伴うリンカーに共有的に接続したＡＢＰを合成することにおける挑戦は、ＡＢＳ配列中の四つの酸性側鎖（三つのアスパラギン酸及び一つのグルタミン酸）の存在である。これらは、一つの酸側鎖上の部位特異的活性化を確実にする既知の簡単な方法がないため、ペプチド及び活性化剤を使用する簡単な活性化戦略を妨げる。

【0378】

この問題を解決するために、本発明は、これによって、ＰＦＰのような活性化されたエステル基が、化学選択性反応（チオール／マレイミド化学を使用して）又はペプチド側鎖とアミドを形成するが、しかし他の末端を活性なエステルとして残す二重活性なエステルを使用するかのいずれかによって、ペプチド上の側鎖リシンに直接カップリングすることができる合成経路を提供する。

【0379】

幾つかの態様において、戦略は、ＰＦＰエステルとして活性化されたそれぞれの酸を伴うビス−酸ＰＥＧであることができる。ある塩基の存在を伴う有機溶液において、ビス−ＰＦＰリンカーの末端は、リシンのＮ−ε−アミノ側鎖と必要な繋留点で反応して、安定なアミド連結を形成し、一方他端は、他のＰＦＰ基を維持した。この戦略に伴う一つの潜在的な問題は、ペプチドが、リンカーのそれぞれの末端に存在するＰＦＰ分子のそれぞれに付加するものであるペプチドダイマーを形成する可能性である。幾つかの側面において、本発明は、化学量論並びにそれぞれのペプチド及びビス−ＰＥＧ−ＰＦＰリンカーの付加を変更することによってこの更なる問題を克服する。本発明によって提供される一つの解答は、ペプチドを超える過剰のリンカーが常に存在するように、過剰のビス−Ｐｆｐリンカーを溶液中に有し、そして溶液中のペプチドをゆっくりと加えることである。約３．７：１ないし約４．３：１間の比を、又は幾つかの態様において、約４：１のペプチドを超えるリンカーの比を有することによって、ダイマーの存在を伴わずに必要なＰＦＰで活性化されたペプチドを合成することができる。配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰのための合成スキームを、以下のスキーム８に示す：

【0380】

【化83】

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【0381】

ビス−ｄＰＥＧ_５−ＯＰｆｐリンカー（８．２）の合成
ビス−ｄＰＥＧ_５−酸（１ｍｍｏｌ、３３８ｍｇ）を、無水のジクロロメタン（５ｍｌ）中に溶解し、次いでペンタフルオロフェノール（２ｍｍｏｌ、３６８ｍｇ）を、ジシクロヘキシカルボジイミド（１ｍｍｏｌ、２０８ｍｇ）と共に加えた。溶液を一晩室温で撹拌した。この時間後、微細な白色のジシクロヘキシル尿素副産物を濾過して除去し、そして濾液を乾燥状態まで蒸発して、淡黄色の軽油状物を得た。ＴＬＣ及びＨＰＬＣによる分析は、正しいＭＳ＝６７０を持つ純粋な生成物を示した。生成物を更なる精製無しに次の工程で使用した。生成物は−２０℃で数ヶ月間安定である。

【0382】

配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰ（８．３）の合成
配列番号：２７（８．１）（７３０ｍｇ）を、無水のジメチルホルムアミド（８ｍｌ）中に溶解し、そしてＮ−メチルモルホリン（０．０５ｍｌ）を加えた。未希釈のビス−ｄＰＥＧ_５−ＯＰｆｐ試薬（８．２）（０．５ｍｌ）のアリコートをガラスバイアル（２０ｍｌ）中に入れた。激しく撹拌しながら、配列番号：２７／ＮＭＭ溶液を、４×２ｍｌのアリコートでビス−ｄＰＥＧ_５−ＯＰｆｐ試薬に２時間かけて加え、次いで最終混合物を更に１時間撹拌した。配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰ生成物への転換の進行を分析用ＨＰＬＣによってモニターした。反応の終りに、溶液を濾過し、そして２．５４ｃｍ（１”）のＣ８カラムの準分離用ＨＰＬＣによって直接精製した。最も純粋な画分（分析用ＨＰＬＣによって＞９５％）を混合し、そして凍結乾燥して、４００ｍｇ（４８％収率）の最終ＡＢＰ−１−５ＰＥＧ−ＰＦＰペプチドリンカー−２生成物を得た。類似の機構を、配列番号：２７−Ｋ（ＳＨ）^１１−マレイミド−２ＰＥＧ−ＰＦＰを産生するために使用することができる（スキーム４参照）。

【0383】

マレイミド−２ＰＥＧ−ＰＦＰの合成

【0384】

【化84】

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【0385】

マレイミド−ｄＰＥＧ_２−酸（３２８ｍｇ、１ｍｍｏｌ、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）、ペンタフルオロフェノール（０．１０３ｍｌ、１ｍｍｏｌ、ＰＦＰ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（２０６ｍｇ、１ｍｍｏｌ、ＤＣＣ）を、乾燥ＤＣＭ（１０ｍｌ）中に溶解し、そして１時間室温で撹拌した。形成した微細な白色の沈殿物（ＤＣＵ副産物）を濾過によって除去し、そして濾液を乾燥状態まで真空中で蒸発した。生成物を微細な白色の粉末として高い収率（４９０ｍｇ、定量的）で得た。純度は、分析用ＨＰＬＣによって＞９５％であった；ＭＳは、［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４９５を示した。

【0386】

ＰＦＰで活性化されたＡＢＰ類似体の合成
精製されたＡＢＰ−チオール中間体（即ち、連結残渣としてＫ（ＳＨ）を伴うＡＢＰ）のそれぞれの試料（３０−４０ｍｇ）を、無水のＤＭＦ（２ｍｌ）中に溶解した。Ｍａｌ−ＰＥＧ_２−ＰＦＰ（２０ｍｇ）を、Ｎ−メチルモルホリン（５ｍＬ）と共に加えた。反応物を撹拌し、そして生成物の形成の時間経過を追跡するために室温でモニターした。出発ペプチドのＰＦＰで活性化されたＡＢＰ生成物への完全な転換は、最初の２時間で観察された。溶液を濾過し、そして生成物のピークを、準分離用ＨＰＬＣによって直接単離した。それぞれの場合、凍結乾燥後、生成物を概略４０％の収率で単離した。

【0387】

【化85】

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【0388】

配列番号：２７−Ｋ（ＳＨ）^１１−ＭＡＬ−２ＰＥＧ−ＰＦＰ：２１ｍｇ、

【0389】

【化86】

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【0390】

配列番号：３０−Ｋ（ＳＨ）^１６−ＭＡＬ−２ＰＥＧ−ＰＦＰ：６ｍｇ、

【0391】

【化87】

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【0392】

配列番号：３１−Ｋ（ＳＨ）^１８−ＭＡＬ−２ＰＥＧ−ＰＦＰ：９ｍｇ、

【0393】

【化88】

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【0394】

配列番号：３２−Ｋ（ＳＨ）^１９−ＭＡＬ−２ＰＥＧ−ＰＦＰ：１２ｍｇ。

【実施例10】

【0395】

実施例１０ 抗体の結合
ＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２薬物の生成物を、２．１２．１．ｆｘをＡｎｇ２結合ペプチドと共役することによって製造した。ＭＡＣ−１は、配列番号：２７−Ｋ（ＳＨ）^１１−ＭＡＬ−２ＰＥＧ−ＰＦＰを伴う２．１２．１．ｆｘを含んでなり、そしてＭＡＣ−２は、配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰを伴う２．１２．１．ｆｘを含んでなる。それぞれのＭＡＣの試料中の２．１２．１．ｆｘ分子当たりのペプチド共役の数を計算した（表１参照）。

【0396】

【表1】

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【0397】

ＭＡＣ−１の産生

【0398】

【化89】

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【0399】

配列番号：２７−Ｋ（ＳＨ）^１１−ＭＡＬ−２ＰＥＧ−ＰＦＰ。

【0400】

【化90】

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【0401】

ＭＡＣ−２の産生

【0402】

【化91】

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【実施例11】

【0403】

実施例１１ ＰＦＰベースの共役のための条件の最適化
方向性共役のための最適反応条件を確立するために一連の実験を行った。それぞれの反応の共役の終了時に、反応をコハク酸塩及びグリシン緩衝液でクエンチし、ｐＨを概略５．５に低下し、そしていずれもの遊離ペプチド又はペプチド／リンカーをクエンチした。ＭＡＣ−２の分析を、ＭＡＣのインタクトな分子量（ＭＷ）を、エレクトロスプレー飛行時間型質量分析法検出を、続いてサイズ排除クロマトグラフィーカラムによる塩及び賦形剤からのタンパク質の分離を使用して測定することによって行った。

【0404】

温度
２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．７で１８ｍｇ・ｍｌ^−１に、リン酸緩衝液で０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。ペプチド／リンカー（配列番号：２７−Ｋ^１１ ５ＰＥＧ−ＰＦＰ）を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に４．３：１のモル比で加
え、そして２時間、１８、２２、又は２５℃で反応させた。結果を表２に示す。

【0405】

【表2】

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【0406】

反応ｐＨ
２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ６．５、６．７５、７．０、７．２５、７．５、７．７５、又は８．０で、１８ｍｇ・ｍｌ^−１に、リン酸緩衝液で０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。配列番号：２７−Ｋ^１１ ５ＰＥＧ−ＰＦＰ（Ｌ２）を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に４．３：１のモル比で加え、そして２時間室温で反応させた。結果を表３に示す。

【0407】

【表3】

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【0408】

２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．０、７．５及び８．０で、２ｍｇ・ｍｌ^−１に、ＨＥＰＥＳ緩衝液で０．０２Ｍの最終濃度に調節した。配列番号：２７−Ｋ^１１ ５ＰＥＧ−ＰＦＰを、ＤＭＳＯ中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に５：１のモル比で加え、そして一晩室温で反応させた。結果を表４に示す。共役のレベルは、ｐＨ８．０より上で減少した。

【0409】

【表4】

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【0410】

結合反応の時間
２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．７で１８ｍｇ・ｍｌ^−１に、リン酸緩衝液で０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。配列番号：２７／５ＰＥＧ−ＰＦＰを、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に４．３：１のモル比で加え、そして３０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、又は２４００分間、室温で反応させた（表５）。

【0411】

【表5】

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【0412】

ペプチドとタンパク質のモル比
２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．５で１８ｍｇ・ｍｌ^−１に、ＨＥＰＥＳ緩衝液で０．２ＭのＨＥＰＥＳの最終濃度に調節した。配列番号：２７−Ｋ^１１ ５ＰＥＧ−ＰＦＰを、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に１、２、３，４、及び５：１のモル比で加え（表６）、そして少なくとも２時間、室温で反応させたが、しかし高濃度のＨＥＰＥＳ緩衝液は、共役の減少したレベルをもたらした。

【0413】

【表6】

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【0414】

２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．７で１８ｍｇ・ｍｌ^−１に、リン酸緩衝液で０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。配列番号：２７−Ｋ^１１ ５ＰＥＧ−ＰＦＰを、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に５、７、１０、１２、及び１５：１のモル比で加え（表７）、そして２時間、室温で反応させて、ＭＡＣを高いレベルの共役で産生した。

【0415】

【表7】

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【0416】

２．１２．１．ｆｘ抗体及び配列番号：２７−Ｋ^１１ ５ＰＥＧ−ＰＦＦのモル比を更に最適化するために、２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．７で１８ｍｇ・ｍｌ^−１に、リン酸緩衝液で０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。ペプチド／リンカーを、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に２．５、２．８、３．１、３．４、３．７、４．０、４．３、又は４．６：１のモル比で加え（表８）、そして２時間、室温で反応させた。

【0417】

【表8】

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【0418】

２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．０で、２ｍｇ・ｍｌ^−１に、ＨＥＰＥＳ緩衝液で０．０２Ｍの最終濃度に調節した。配列番号：２７−Ｋ^１１ ５ＰＥＧ−ＰＦＰを、ＤＭＳＯ中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に、５、６、７、８、１０：１のモル比で加え、そして一晩室温で反応させた。結果を表９に示す。

【0419】

【表9】

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【0420】

各種のタンパク質濃度における２．１２．１．ｆｘの共役特性（conjugation profile
）
２．１２．１．ｆｘの、各種の濃度における配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰとの共役特性を分析した。２．１２．１．ｆｘを＞５０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５の２００ｍのトレハロースで所望の濃度に希釈し、そして６０ｍＭのｐＨ７．７のリン酸ナトリウムと混合した 配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰを５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、そして抗体と４．３：１のモル比で混合し、そして一晩室温で反応させた。全ての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー−質量分析法（ＳＥＣ−ＭＳ）によってインタクトな共役タンパク質として分析して、タンパク質の共役した形態の数及び量を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；多数の共役部位は、ペプチドの質量差によって分離される個別のシグナルとして観察される。多数の共役種の相対的な量は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表１０は、抗体の各種の濃度における２．１２．１．ｆｘのペプチドとの共役特性を示す。１０ｍｇ／ｍＬないし５０ｍｇ
／ｍＬの抗体濃度において、共役は、１．８個又はそれより大きい付加の平均で０−５個間の付加の分布で起こる。０．５ないし５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度において、共役は、１．５個又はそれより小さい付加の平均で、０−３個間の付加の分布で起こる。

【0421】

【表10】

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【0422】

反応緩衝液の選択
２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．７で１８ｍｇ・ｍｌ^−１に、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、又はリン酸ナトリウム緩衝液で、０．０５Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰを、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に、１、２、３、４、又は５：１のモル比で加え、そして２時間、室温で反応させた。低い反応ｐＨは、減少したレベルの共役をもたらした（表１１）。

【0423】

【表11】

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【0424】

２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．５、７．７及び８．０で、１８ｍｇ・ｍｌ^−１に、ホウ酸ナトリウム及びリン酸ナトリウム緩衝液で、０．０４Ｍの最終濃度に調節した。配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰを、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に、４．３：１のモル比で加え、そして２時間、室温で反応させた（表１２）。

【0425】

【表12】

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【0426】

２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．７で１８ｍｇ・ｍｌ^−１に、リン酸ナトリウム緩衝液で、０．０４Ｍ、０．０６Ｍ、又は０．０８Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。ペプチド／リンカー（配列番号：２７−Ｋ^１１ ５ＰＥＧ−ＰＦＰ）を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に４．３：１のモル比で加え、そして２時間、室温で反応させた。結果を表１３に示す。

【0427】

【表13】

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【0428】

共役に対する緩衝液成分の影響
プロピレングリコール： ２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．７で、１８ｍｇ・ｍｌ^−１に、リン酸ナトリウム緩衝液で、０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。ペプチド／リンカー（配列番号：２７−Ｋ^１１ ５ＰＥＧ−ＰＦＰ）を、プロピレングリコール溶液（結合反応物中の５％プロピレングリコール）中で２０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に４．３：１のモル比で加え、そして更なる０ないし１５％のプロピレングリコールと混合し（５、１０、１５、及び２０％の最終プロピレングリコールのパーセント）、そして２時間、室温で反応させた。結果を表１４に示す。

【0429】

【表14】

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【0430】

塩化ナトリウム： ２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．０で、２ｍｇ・ｍｌ^−１に、ＨＥＰＥＳ緩衝液で０．０２Ｍの最終濃度に、０．１４Ｍの塩化ナトリウムの存在及び非存在中で調節した。配列番号：２７−Ｋ^１１ ５ＰＥＧ−ＰＦＰを、ＤＭＳＯ中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に５：１のモル比で加え、そして一晩室温で反応させた。結果を表１５に示す。共役のレベルは、塩化ナトリウムの存在中で減少する。

【0431】

【表15】

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【0432】

ＨＥＰＥＳ： ２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．０で、２ｍｇ・ｍｌ^−１に、ＨＥＰＥＳ緩衝液で０．２Ｍ及び０．０２Ｍの最終濃度に調節した。配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰを、５０％のプロピレングリコール中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に５：１のモル比で加え、そして２時間、室温で反応させた。結果を表１６に示す。共役のレベルは、０．２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で減少する。

【0433】

【表16】

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【0434】

ＤＭＳＯ： ２．１２．１．ｆｘ抗体を、ｐＨ７．７で、１５ｍｇ・ｍｌ^−１に、リン酸ナトリウム緩衝液で０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節し、そしてＤＭＳＯを３０％の最終濃度で加えた。配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰを、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に４：１のモル比で加え、そして２時間室温で反応させた。結果を表１７に示す。

【0435】

【表17】

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【0436】

結合（共役）反応のパラメーターの考察
エフェクター分子（この実施例の場合、ペプチド）と抗体のモル比が、約３．５：１より低く減少した場合、共役のレベルは、表８に示すように減少する。別の場合として、表９は、モル比を増加することが、増加したレベルの共役をもたらすことを示す。抗体当たりのペプチドの数を増加することは、一般的にその抗原（この場合ＩＧＦ１Ｒ受容体）に対する抗体（この場合２．１２．１ ｆｘ）の結合効率を減少し、従って、ペプチドと抗体のモル比は、抗体−抗原、及びペプチド−同族の結合の両方を最大にするように最適化された。

【0437】

共役緩衝液を変更することは、共役パターンを変更することができることも更に見出された。アミンを含有する賦形剤は、これらがＰＦＰ基と反応することができるため、一般的にあまり好ましくない。炭酸塩及びホウ酸塩のような緩衝液は、共役のために使用することができるが、しかしこれらのｐＫａ（ホウ酸はｐＫａが約９並びに炭酸塩は二つのｐＫａが約６及び約１１）が、ＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２のために最適として確認された７．７の共役ｐＨから離れていた（表１１）ために回避された。共役のレベルは、反応の化学的条件のみに依存的ではなく、更に時間にも基づいている。２時間後、殆どのＰＦＰで活性化されたペプチドは、抗体と反応してしまったか、又はＰＦＰＺ^＊は、加水分解されている（表５）。

【0438】

ＰＦＰで活性化されたペプチド／リンカーは、リシンの側鎖のアミノ基と急速に反応した。共役は、リン酸緩衝液中のｐＨ６．５ないし８で行われて、抗体表面のリシンの求核性の傾向を、表３及び４に示すようにその電荷（表面タンパク質上のリシンのｐＫａは約９．１ないし１１．２である）を減少することによって増加した。

【0439】

ＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２の共役のための最適な条件は、次のように記載される：２．１２．１．ｆｘ抗体を、リン酸緩衝液で０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度にｐＨ７．７に調節した。ペプチド／リンカー（配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰ）を、プロピレングリコール中で１０ｍｇ・ｍｌ^−１に再構成した（反応物中の最終プロピレングリコール濃度は１０％）。ペプチド／リンカーを、２．１２．１．ｆｘ抗体に４．３：１のモル比で加え、そして２時間周囲の室温で反応させた。反応をコハク酸塩及びグリシン緩衝液でクエンチし、ｐＨを概略６．０に低下させ、そしていずれもの遊離のペプチドをクエンチした。幾つかの側面において、反応混合物を濃縮することができ、そしてペプチド関連種（リンカーが水溶媒との反応によって加水分解されたペプチドのような）及び反応混合物中の他の要素（ＰＦＰのような）は、例えば５０ｋＤａ膜を使用するダイアフィルトレーション、又はサイズ排除クロマトグラフィーによって、コハク酸塩、グリシン、塩化ナトリウム、及び３０ｍｇ・ｍｌ^−１でｐＨ５．５のトレハロース緩衝液に除去することができる。

【0440】

先に列挙した共役条件を、それぞれの工程パラメーターの範囲を決定するために変化させた。パラメーターの範囲は、共役中に起こることができる及び／又は種の集団中に１０％より大きい変化が観察される迄拡大した可変性に基づいて設定した。表１８は、ＭＡＣ
−２に対して同様な共役特性をもたらすパラメーターを要約する。

【0441】

【表18】

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【実施例12】

【0442】

実施例１２ 抗体上のリンカー部位
一般的に、スクアリン酸塩及びＮＨＳエステルが、ある状況において使用するためのある程度の可能性を示したが、ハロゲンフェニルエステルを含んでなるＺ^＊脱離基のみが方向性の共役の一貫したレベルを示した。

【0443】

５個の提案されたリンカーの２個のみ（ＰＦＰエステル及びスクアリン酸塩）が、ＭＡＣの調製において好結果であった。求電子性リンカーが、一般的にペプチド（Ａｎｇ２ペプチド（ＡＢＰ）のような）の抗体（ＩＧＦ１Ｒ抗体のような）への共役を可能にするものであることを仮定したが、アゼチジノンリンカーは、受容可能な速度におけるペプチドの抗体への共役を可能にしなかった（反応は有意に過剰のアゼチジノンリンカーを要し、そして極端に遅かった）。表１９にＭＡＣの調製のために使用したそれぞれのリンカーの幾つかの考慮事項を示す。

【0444】

【表19】

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【実施例13】

【0445】

実施例１３ 抗体上の共役したペプチドの位置
ＭＡＣ−２薬物生成物分子は、２．１２．１．ｆｘ抗体（α−ＩＧＦ１Ｒ−１）に、スキーム１１に記載したような５ＰＥＧ−ＰＦＰリンカーを使用して接続した１−４個の配列番号：２７分子の分布からなる。これは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムによる塩及び賦形剤からのタンパク質分離後に、エレクトロスプレー飛行時間型質量分析検出を使用してＭＡＣ−２のインタクトな分子量（ＭＷ）を測定することによって決定された。２．１２．１．ｆｘ抗体及びＭＡＣ−２の３個のロットのインタクトな分子量（ＭＷ）を示す質量分析データを、図３に示す。図２Ａは、共役前の２．１２．１．ｆｘを示す。これは、単一のＭＷを示す均一な分子である。ＭＡＣ−２のロットは、２．１２．１．ｆｘに共役したペプチドの分布を示す；１−４個間の共役付加（ＣＡ）が観察される。それぞれの形態の相対的量は、ロット間で一貫し、そしてそれぞれのロット中の最も普通の形態は、それぞれの個々の２．１２．１．ｆｘ抗体に接続された２個のペプチド（配列番号：２７）を有する。

【0446】

２．１２．１．ｆｘ抗体中のジスルフィド結合を還元することによって、軽及び重鎖を別個に観察することができる。ジスルフィドの還元は、インタクトな２．１２．１．ｆｘ抗体を２０ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理することによって行われる。得られた重及び軽鎖の混合物を、先に記載したようにインタクトな分子量のために分析する。図３に示したデータは、２．１２．１．ｆｘ上のＡＢＰの位置に対する証拠を提供する。ＭＡＣ−２のロット中の軽鎖の大部分（＞６５％）は、共役している。殆どの共役した軽鎖は、１個のＣＡを含有する。２個のＣＡも低いレベルで更に観察される。殆ど全ての観察された重鎖（＞９０％）は、非修飾であり、これは、非常に僅かな共役したペプチドが重鎖上に位置することを示唆している。

【0447】

ペプチドマッピングを、共役の正確な位置を決定するために使用した。この方法は、次のとおりであった：ＭＡＣ−２のアリコートを８Ｍのグアニジン塩酸塩で変性し、ジスルフィド結合をＴＣＥＰで還元し、そして得られたシステインスルフヒドリルをヨードアセトアミドでアルキル化する。次いでこの処理されたタンパク質の試料を、プロテアーゼキモトリプシン（１：１２５のプロテアーゼ：ＭＡＣの重量比）で消化した。次いで得られたキモトリプシンペプチドを、Ｃ８液体クロマトグラフィーカラムによる分離後、質量分
析によって個別に検出した。この技術により、ＭＡＣ−２は、キモトリプシンによって、重及び軽鎖上で図４中の配列中に注記された（黒丸で）位置において断片に消化された。次いでそれぞれのペプチドのＭＷの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）検出を使用して、どのリシン残基が共役ペプチドによって修飾されたかを決定した。断片が共役ペプチドの接続によって修飾された場合、そのＭＷはそれに応じて変化する。

【0448】

重鎖の断片Ｙ１、Ｙ６、Ｙ９、Ｙ１０、Ｙ２０、Ｙ２５、Ｙ２６、Ｙ２９、Ｙ３２、Ｙ３３、Ｙ３４、Ｙ３７、Ｙ４０及びＹ４３は、Ｌｙｓ残基を含有する。これらの中で、ペプチドの共役は、Ｙ６、Ｙ１０、Ｙ２５、Ｙ３３、及びＹ３７において検出された。軽鎖の断片Ｙ３、Ｙ１０、Ｙ１１、Ｙ１２、Ｙ１３、Ｙ１４、Ｙ１５、及びＹ１６は、Ｌｙｓ残基を含有する。これらの中で、共役は、Ｙ３、Ｙ１３、及びＹ１５において検出された。

【0449】

Ｙ１５と呼ばれる軽鎖断片（軽鎖上のＮ末端から１５番目のキモトリプシン断片）は、図５に示したデータに基づき共役していることが見いだされた。ＭＡＣの修飾されたＹ１５断片のＭＷは、明確に検出された。非共役の２．１２．１．ｆｘ試料において、修飾されたＹ１５断片の証拠は存在しなかった。非修飾のＹ１５断片は、ＭＡＣ及び２．１２．１．ｆｘの両方で観察された。この断片の大きさは、この断片の全てが非修飾の形態で存在するために、２．１２．１．ｆｘ試料において高い。この断片がＭＡＣ−２中で共役されるため、非修飾Ｙ１５の観察されるレベルは減少し、これは、図５中でより小さい面積を持つピークとして観察される。

【0450】

ＭＡＣ−２の軽鎖断片Ｙ１５上で観察される配列番号：２７−５ＰＥＧの共役の量は、非修飾のＹ１５の減少したピーク面積を測定することによって推定される。非共役の２．１２．１．ｆｘが、１００％を示すようにシグナル強度を正規化した後、ＭＡＣ−２の３個の独立したロットは、それぞれ１７％、２７％及び２２％の非共役のＹ１５断片を示した。

【0451】

ＭＡＣ試料中のＹ１５の観察された大きさを、２．１２．１．ｆｘ試料中のＹ１５の大きさに正規化した。７５−８５％間のＹ１５断片を、ＭＡＣ−２中で修飾されたと決定した。ＭＡＣ−２が殆ど１−２個の共役付加を含有することを考慮して、これは、ＭＡＣ−２中の共役の殆どが、軽鎖断片Ｙ１５の２個のＫ残基（Ｋ^１８８又はＫ^１９０）の一つに位置することを示唆する。２．１２．１．ｆｘの配列に関係する断片Ｙ１５の位置を、図４に示す。

【0452】

トリプシン酵素消化を、Ｋ^１８８及びＫ^１９０間を識別するために使用した（トリプシンはＫ及びＲのＣ末端に対して特異性を有する）。トリプシンは、共役したＫ残基を消化しないため、酵素的消化は、どのＫ残基が共役されるかによって異なったペプチドの長さを産生する。トリプシンで消化されたＭＡＣ−２からのＬＣＭＳデータの試験は、ペプチドが、Ｋ^１８８に特異的に接続する証拠を提供する。修飾されたＫ^１９０の証拠は、観察されなかった。

【0453】

ＭＡＣ−２を、ＴＣＥＰで還元し、そして先に記載したようにグアニジン塩酸塩で変性した。タンパク質濃度を、２ｍｇ／ｍｌに、そしてｐＨを７．８にトリス消化緩衝液で調節した。精製したトリプシンを、１：１２５のプロテアーゼ：ＭＡＣの重量比で加え、そして３０℃で４時間インキュベートした。試料を、ＬＣＭＳによって分析するまで、−２０℃で保存した。断片の試料を、Ｃ１８逆相カラムで、水／アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡの移動相を使用して分離した。断片の検出を、２１４ｎｍのＵＶ及びＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析の両方によってモニターした。全てのデータの解析を、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアを使用して行った。

【0454】

ＭＡＣ−２のトリプシン消化による断片の形成は、ペプチド共役の部位に依存する。リシンは、共役のために標的とされる残基である。図２−５に示したデータは、ペプチド結合の支配的な部位が、Ｋ^１８８又はＫ^１９０のいずれかであることを示す。以下のスキームは、Ｋ^１８８又はＫ^１９０における共役によって起こるトリプシン消化反応を示す。

【0455】

【化92】

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【0456】

問題となっている二つの潜在的な消化断片の化学構造は以下のとおりである：

【0457】

【化93】

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【0458】

図６は、Ｋ^１８８が、ペプチドに共役した場合のトリプシンペプチドに対する選択されたイオンのＬＣＭＳクロマトグラムデータを示す。図７は、Ｋ^１９０が、共役したペプチドで修飾された場合のトリプシン断片に対する選択されたイオンのＬＣＭＳクロマトグラムデータを示す。これらのデータは、単独のＫ^１８８のみが共役されることを示唆する；この状況は、ＭＡＣ−２中で検出されるが、しかし２．１２．１．ｆｘ対照実験において非存在である有意なシグナルをもたらす。Ｋ^１９０における修飾からの結果は、負の対照と比較して独特であるいずれものデータを提供しない。

【0459】

予測できるものとは対照的に、ペプチド／リンカーは、２．１２．１．ｆｘの軽鎖のＫ^１８８（配列番号：１５のＫ^８０）を優先的に装飾するように見受けられる。これは、２．１２．１．ｆｘ抗体のＦｃ部分が、影響されていないという驚くべき利点を有する。試験は、得られたＭＡＣ−２のＰＫが、非共役の２．１２．１．ｆｘのＰＫと概略等しいことを示す。抗体上の多数の部位に対する乱雑な非特異的共役は、より低いＰＫを持つ生成物をもたらすことができる。ＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２によって例示される本発明の方向性共役は、より低いＰＫを含む乱雑な非特異的共役によって起こされることができる可能
な有害な影響の幾つかを最小にする利益を提供する。

【0460】

この方法の再現性を確立するために、実験を繰り返した。ＭＡＣ−２を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、そしてインタクトな共役タンパク質として、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって分析して、タンパク質の共役形態の数及び量を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；多数の共役部位が、共役されたペプチド／リンカーの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数の共役種の相対的な定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われた。図８は、代表的なＭＡＣ−２のスペクトルを示す；定量化のために使用された計算を、表２０に示す。インタクトなＭＡＣ−２に対する平均共役付加は、次：ＳＵＭＰＲＯＤＵＣＴ（共役付加の数（ＣＡ）、ＣＡ当たりパーセント）の式を使用して、２．１１と計算される。この例は、０−４個間のペプチド付加の分布として起こるペプチドの共役を示し、最大の形態は、２個のペプチド付加であり、そしてペプチド付加の平均数は２．１１である。多数の個体による再現分析は、共役の特性が一貫し、そして再現可能であることを示す。

【0461】

【表20】

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【0462】

ペプチド結合（共役）の程度を、２．１２．１．ｆｘの軽及び重鎖で別個に試験した。ＭＡＣ−２を変性し、そしてジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩及びジチオトレイトールを使用して還元した。得られた遊離の軽及び重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれの共役特性を決定した。図９は、それぞれの鎖の代表的なスペクトルを示す；定量化のために使用した計算を、表２１に示す。還元された重鎖ＭＡＣ−２に対する平均共役付加（平均ＣＡ）は、次：ＳＵＭＰＲＯＤＵＣＴ（共役付加の数（ＣＡ）、ＣＡ当たりパーセント）の式を使用して、０．１４と計算され、そして還元された軽鎖ＭＡＣ−２に対する平均ＣＡは、０．８６と計算された。これらのデータは、共役の位置が軽鎖においてより高いことを証明する；軽鎖上の最も豊富な形態は、一つのペプチド付加を含有し、そして軽鎖は、平均０．８６個のペプチド付加を含有する。重鎖上の共役は、有意に低いレベルで観察される。多数の個体によるこの実験の再現分析は、共役の特性が一貫し、そして再現可能であることを示す。

【0463】

【表21】

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【0464】

ＭＡＣ−２を、ジチオトレイトールで還元し、そしてシステイン残基を、ヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化によってアルキル化した。キモトリプシンをタンパク質分解消化のために使用した。溶液中の消化された断片を、液体クロマトグラフィー 質量分析（ＬＣＭＳ）を使用して分析した。個々の断片をＣ１８のＨＰＬＣカラムで分離し、そしてその正確な質量を四重飛行時間（Ｑ−ＴｏＦ）質量分析器で測定した。得られた断片の質量を使用して、非修飾の断片又は共役ペプチドで修飾された断片を確認した。この実験は、リシン残基を含有するキモトリプシン断片に焦点を当てることによって、これらがペプチド共役のための可能な部位であると解釈された。表２２は、全てのこのような断片の列挙を示す。空白の項目は、この技術を使用して検出されない断片である。ペプチド修飾物質を伴って観察された検出された断片は、共役の潜在的部位であると考えられる。

【0465】

表１６の表の項目を以下に説明する：
・ 断片番号：Ｎ末端からのキモトリプシン断片番号；連結された断片（即ち、Ｙ１−２）は、欠損した開裂部位を示す。

【0466】

・ 始点／終点：Ｎ末端からの断片位置の番号。
・ ペプチド質量（Ｄａ）：ダルトンで記載された断片の理論的質量。
・ 保持時間（対照／分析物）：ＬＣＭＳ断片マッピング実験におけるクロマトグラフーの保持／溶出の時間。

【0467】

・ ＭＳシグナル強度（対照／分析物）：ＭＳによって観察された観察シグナルの大きさ。
・ 質量誤差−ｐｐｍ（対照／分析物）：断片の理論値対観察質量の比較；＞１０、そして特にゼロ（０）に近い値は、良好な質量の精度を示す。

【0468】

・ 修飾物質：断片に対する潜在的共有付加；Ｌｙｓ残基のペプチド−抗体結合断片、ＣＡＭ−システイン残基のカルボキシメチル化。
・ 星印は、それぞれの断片の修飾された（例えば、共役された）変種を示す。

【0469】

・ Ｐｅｐは、共役されたペプチドを示す。
Ｙ１５断片へのペプチドの方向性共役は、共役レベルを定量化することによって示される。次の分析は、２．１２．１．ｆｘ基準生成物のペプチドマッピング実験中に共役を有することが観察されたそれぞれのペプチド断片に対して行われた。共役された基準生成物（ＭＡＣ−２）と比較した、非共役対照（２．１２．１．ｆｘ抗体骨格−共役無し）中の非修飾ペプチドに対して観察されたシグナル強度の比を、表２３に示す。それぞれの試料の同じペプチドの直接の比較が可能であるため、非修飾シグナルが使用される。例えば、非共役ペプチドは、一（１）の比をもたらす、対照対生成物試料の同じ観察されたシグナル強度を有することが予測されるものである。共役は、生成物試料中の非修飾ペプチドの
観察される量の減少をもたらすものであり、これは、一（１）より大きい比によって示されるものである。表２３のデータは、対照及び生成物間の試料並びに実験の変動を補正するために更に正規化される。表２３は、軽鎖ペプチドＹ１５が、それぞれの他の共役されたペプチドより有意に高いレベルで共役されることを示す。これは、共役が、方向性の様式で起こり、そしてＫ残基間に無作為に分布されないことを示唆する。

【0470】

【表22-1】

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【0471】

【表22-2】

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【0472】

【表22-3】

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【0473】

【表23】

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［実施例１３］

【0474】

実施例１３ Ａｎｇ１−４結合ＥＬＩＳＡ
ハイバインディングハーフウェル（Ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｈａｌｆ−ｗｅｌｌ）プレートを、５０ｕｌのＰＢＳ中の組換えヒトＡｎｇ１、ヒトＡｎｇ２、マウスＡｎｇ３又はヒトＡｎｇ４（全ての試薬はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから、２５０μｇ／ｍｌ）で被覆し、そして４℃で一晩インキュベートした。プレートを３回洗浄緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、そして１５０μｌ／ウェルのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋで室温で１時間遮断した。プレートを３回洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄後、調製した投与溶液（範囲：０．００５−５０，０００ｎｇ／ｍｌ）をプレートに加え、そして１時間インキュベートして、プレート上の被覆されたＡｎｇファミリーのメンバーへの化合物の結合を可能にした。それぞれのアンギオポイエチンに対する正の対照は、それぞれのファミリーメンバー（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによって供給された）に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体のいずれかを含んでいた。プレートを３回洗浄し、そして５０μｌのＨＲＰと共役した抗ヒトＩｇＧ（０．８μｇ／ｍＬ）（又は正の対照に対してそれぞれの種）を加え、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、そして５０μｌ（２５μｌのＴＭＢ＋２５μｌのＨ_２Ｏ_２）の基質溶液を加え、そして１−５分間インキュベートした。発色を２５μｌの２ＭのＨ_２ＳＯ_４で停止した。４５０ｎｍのＯＤを、４５０ｎｍの補正波長で測定した。

【実施例14】

【0475】

実施例１４ Ａｎｇ２の逆競合アッセイ
Ａｎｇ２の逆競合ＥＬＩＳＡのために、ヒトＴｉｅ２−Ｆｃ、アンギオポイエチン−２タンパク質、ビオチニル化抗ヒトＡｎｇ２抗体、及びストレプトアビジンＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）並びにＰｉｅｒｃｅからのＴＭＢ基質を使用した。ハイバインディングハーフウェルプレートを、５０μｌのＰＢＳ中のＴｉｅ２−Ｆｃ（５０ｎｇ／ウェル）で被覆し、そして４℃で一晩インキュベートした。プレートを３回洗浄緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、そして１５０μｌ／ウェルのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋで室温で１時間遮断した。プレートを３回洗浄した。洗浄後、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中の５０ｎｇ／ｍｌ（０．８３ｎＭ）のＡｎｇ２の存在中の５０μｌのＡｎｇ２結合ペプチド化合物（５０ｎＭ、一連の５×希釈）を加え、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中の５０μｌの１μｇ／ｍｌのビオチニル化抗Ａｎｇ２検出抗体を加え、そして２時間室温でインキュベートした。
プレートを３回洗浄し、そして５０μｌのストレプトアビジンＨＲＰ（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中の１：２００希釈）を室温で２０分間で加えた。プレートを３回洗浄し、そして５０μｌ（２５μｌのＴＭＢ＋２５μｌのＨ_２Ｏ_２）の基質溶液を加え、そして２０−３０分間インキュベートした。発色を２５μｌの２ＭのＨ_２ＳＯ_４で停止した。４５０ｎｍのＯＤを、５４０ｎｍの補正波長で測定した。ＩＣ５０値（Ａｎｇ２−Ｔｉｅ２結合の５０％阻害）を、Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェア中の非線形Ｓ字状用量−反応曲線フィッティング機能を使用して計算した。

【0476】

Ａｎｇ２−ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１を、ある実施例における対照として使用した。Ａｎｇ２−ｈ３８Ｃ２の産生及び構造は、ＷＯ２００８０５６３４６中の化合物４３として完全に記載され、その内容、化合物４３の産生に関する側面に対する特別な言及は、本明細書中に組込まれる。簡単には、構造は、以下：

【0477】

【化94】

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【0478】

のとおりであり、式中、そしてリンカーは、抗体の結合部位のＫ^９９（Ｋａｂａｔ番号によりＫ^９３）のε−アミノ基に共有的に接続し、そして抗体は、ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１（配列番号：５１及び５２）（ＷＯ２００８／０５６３４６の配列番号：１８９及び配列番号：１９０）である。

【実施例15】

【0479】

実施例１５ ＩＧＦ１Ｒ競合アッセイ
ＩＧＦ１Ｒ競合ＥＬＩＳＡのために、組換えヒトＩＧＦ１Ｒ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ビオチニル化ＩＧＦ１（ＧｒｏＰｅｐ Ｌｔｄ．）ストレプトアビジン−ポリ−ＨＲＰ２０（ＳＤＴ）、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ、及びＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用した。ハイバインディングハーフウェルプレートを、５０ｕｌのＰＢＳ中のＩＧＦ１Ｒ（６２．５ｎｇ／ウェル）で被覆し、そして４℃で一晩インキュベートした。プレートを３回洗浄緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、そして１５０μｌ／ウェルのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋで室温で１時間遮断した。プレートを３回洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄後、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中の１００ｎｇ／ｍＬ（１３．３ｎＭ）のビオチニル化ＩＧＦ１の存在中の５０μｌのＩＧＦ１Ｒ結合化合物（１μＭ、一連の５×希釈）を加え、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、そして５０μｌのストレプトアビジン−ポリ−ＨＲＰ２０（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中の１：５０００希釈）を室温で２０分間で加えた。プレートを３回洗浄し、そして５０μｌ（２５μｌのＴＭＢ＋２５μｌのＨ_２Ｏ_２）の基質溶液を加え、そして５−１０分間インキュベートした。発色を２５μｌの２ＭのＨ_２ＳＯ_４で停止した。４５０ｎｍのＯＤを、４５０ｎｍの補正波長で測定した。ＩＣ_５０値（ＩＧＦ１とＩＧＦ１Ｒの結合の５０％阻害）を、Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェア中の非線形Ｓ字状用量−反応曲線フィッティング機能を使用して計算した。

【実施例16】

【0480】

実施例１６ ＩＧＦ１誘導ＩＧＦ１Ｒ自己リン酸化阻害アッセイ
ＩＧＦ１Ｒ自己リン酸化阻害アッセイのために、ヒトＩＧＦ１Ｒを発現するように操作されたマウス３Ｔ３細胞を使用し、そしてリン酸化を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのホスホ−ＩＧＦＩ受容体β（Ｔｙｒ１１３１）サンドイッチＥＬＩＳＡキット＃７３０２によって決定した。ヒトＩＧＦ１Ｒを発現しているインタクトな細胞を、９６ウェルの組織培養処理丸底プレート中に播種し（５．０×１０^４細胞／ウェル）、そして５０μｌの増殖培地（３７℃、５％ＣＯ_２、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン、及び５００μｇ／ｍＬのジェネチシンを伴うＤＭＥＭからなる培養培地）中で一晩付着させた。１６時間後、増殖培地を吸引によって除去し、そしてウェル当たり５０μｌの１００ｎｇ／ｍＬ（１３．３ｎＭ）の組換えヒトＩＧＦ１の存在中のＩＧＦ１Ｒ結合化合物（１ｍＭ、一連の８×希釈）を含有する新しい増殖培地を加え、そして１０分間室温でインキュベートした。プレートを液体を吸引により除去し、そしてウェル当たり１００μｌの氷冷のＰＢＳを加えることによって洗浄した。冷ＰＢＳを直ちに吸引して除去し、そして６０μＬの溶菌緩衝液（溶菌緩衝液で開始、全ての以下の試薬は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって製造された、チロシン１１３１におけるＩＧＦ１Ｒのリン酸化を定量するために設計された商業的キットの一部として供給された）を、それぞれのウェルに加え、そして振盪しながら室温で１０分間インキュベートした。次いでプレートを４℃で５分間遠心した。次いで上清（ウェル当たり５０μｌ）を除去し、そしてホスホ−ＩＧＦ１受容体ベータ（Ｔｙｒ１１３１）ウサギ抗体で事前被覆され、そしてウェル当たり５０μｌの試料希釈物を含有する９６ウェルプレートに加えた。プレートを一晩１６時間穏やかに振盪しながら４℃でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、そして１００μＬのヒトＩＧＦ１受容体検出抗体（マウス由来）を、それぞれのウェルに１時間で３７℃で加えた。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、そして１００μＬのＨＲＰと連結したマウスＩｇＧ二次抗体を、それぞれのウェルに３０分間で３７℃で加えた。プレートを４回洗浄し、そして１００μＬのＴＭＢ基質をそれぞれのウェルに加え、そして３０分間インキュベートした。発色を、５０μｌの２ＭのＨ_２ＳＯ_４で停止した。４５０ｎｍのＯＤを、５４０ｎｍの補正波長で測定した。ＩＧＦ１処理を伴う及び伴わない内部対照は、リン酸化現象の特異性を確認し、そして膜通過シグナル伝達の阻害％を決定した。ＥＣ_５０値（最大半量シグナルが達成される濃度）を、Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェア中の非線形Ｓ字状用量−反応曲線フィッティング機能を使用して計算した。

【実施例17】

【0481】

実施例１７ ＩＧＦ１Ｒ下方制御アッセイ
ＩＧＦ１Ｒの下方制御のために、ヒト大腸腺癌Ｃｏｌｏ２０５細胞を使用し、そしてＩＧＦ１Ｒの細胞表面の発現を、フローサイトメトリーによって決定した。増殖培地（ＲＰＭＩ、１０％胎児ウシ血清、グルタミン）中の５×１０^４細胞／ウェルを蒔かれた組織培養９６ウェルプレートを、化合物の滴定で３時間３７℃で処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣｅｌｌＳｔｒｉｐｐｅｒで取出し、そして新しい９６ウェルプレートに移した。細胞を、２．５％の胎児ウシ血清を伴うＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、フィコエリトリンと共役したマウスモノクローナル抗−ヒトＩＧＦ１Ｒ（Ｒ＆Ｄ ＦＡＢ３９１Ｐ、１０μｌ／５×１０^−５細胞）と共に暗所で１時間インキュベートした。次いで細胞を、３回、２．５％の胎児ウシ血清を伴うＰＢＳで洗浄した。細胞表面上のＩＧＦ１Ｒの存在を、ＦＡＣＳアレイを使用するフローサイトメトリーによって決定し、そしてデータをＦｌｏＪｏソフトウェアで解析した。受容体の数を、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ ＰＥビーズ（ＢＤ
３４０４９５）を使用して発生した標準曲線に、データを適合させることによって計算した。データを、負の対照のｈＩｇＧ２に対する試験化合物による下方制御のパーセントとして報告した。

【0482】

結果及び考察
ヒトＡｎｇ２に特異的に結合するＭＡＣ−２の能力を、図１０に示す。ＭＡＣ−２及びＡｎｇ２−ｈ３８ｃ２は、ヒトＡｎｇ２に結合することが可能であったが、しかしヒトＡｎｇ１、ヒトＡｎｇ４又はマウスＡｎｇ３には可能ではなく、Ａｎｇ２に対して高い特異性を示し、そして他のアンギオポイエチンファミリーのメンバーに対しては示さなかった。

【0483】

ＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２は、Ａｎｇ２競合アッセイ（図１１及び表２４）に示すように、Ａｎｇ２を結合することが可能であり、そしてＴｉｅ２への結合を防止した。驚くべきことに、Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２との比較において、ＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２の両方は、Ａｎｇ２を競合的に結合する能力の増加を示した。共役したＭＡＣが結合し、そしてＡｎｇ２のＴｉｅ２への結合が阻害されたことを確認した後、ＩＧＦ１が、ＩＧＦ１Ｒに結合することに対して競合する能力を、ＩＧＦ１Ｒ競合アッセイ（図１２）によって決定した。ＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２は、ＩＧＦ１Ｒ結合に対してＩＧＦ１と競合するために、親の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．１．ｆｘ）のように効率的であった。ＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２は、低いナノモルの範囲のＩＣ_５０値を示した。対照的に、ある他の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体による試験において、ペプチドの共役は、ＩＧＦ１Ｒと相互作用する抗体の能力と干渉することが観察された（データは示していない）。

【0484】

競合アッセイにおいて観察されたＩＧＦ阻害を、ＩＧＦ誘導のシグナル伝達現象を阻害することに翻訳することを確認するために、細胞ベースの機能アッセイを使用して、ＩＧＦ刺激後のＩＧＦ１Ｒの自己リン酸化の阻害を決定した（図１３及び表２４）。ＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２は、親の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．２、ｆｘ）と、同様な活性を有していた；従って、制約されたＡｎｇ２ペプチドの共役は、ＭＡＣの自然の結合及び阻害を変化しないように見受けられる。

【0485】

ＩＧＦ１Ｒの自己リン酸化を阻害することに加えて、抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体は、更にＩＧＦ１Ｒの内部移行及び分解を起こし、受容体の下方制御をもたらす。この行動は、処理の２時間内に観察され、そして２４時間維持される。ＭＡＣを、ヒト大腸腺癌細胞系Ｃｏｌｏ２０５上のＩＧＦ１Ｒレベルを下方制御する能力に対して試験した。細胞を、３時間培養液中でＭＡＣ化合物の滴定により処理した。細胞を収集し、そしてＩＧＦ１Ｒの表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。負の対照のｈＩｇＧ２と比較したＩＧＦ１Ｒの下方制御のパーセントを決定した（表２４）。ＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２は、親のＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．１．ｆｘ）と同様なＩＧＦ１Ｒ下方制御活性を有する。

【0486】

【表24】

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【0487】

抗体当たり２個のペプチドを共役することがＩＧＦ１Ｒの自己リン酸化及び下方制御を行うことに関して理想的であり、そして抗体当たり２個より多い又は少ないペプチドの共役が、これらの機能をＭＡＣが行う能力を減少することを示した。

【0488】

ＩＧＦ１Ｒ活性を調節するための２．１２．１．ｆｘの能力に対する、抗体当たりのペプチドの数の影響を評価するために、ＭＡＣ−１の２種類の試料を調製し、ここで、反応条件は、共役を減少する（低ＭＡＣ−１）か、又は共役を増加する（高ＭＡＣ−１）かのいずれかを提供するように設定された（表２５）。試料を、ＩＧＦ１Ｒを下方制御及びリン酸化する能力に対して分析した（表２５）。ＩＧＦ１Ｒ経路を効率よく調節するための高ＭＡＣ−１の、低ＭＡＣ−１と比較した能力に、有意な差が存在する。抗体当たり約２個より多いペプチドの共役は、抗体当たり約２個又はそれより少ないペプチドの共役と比較して、ＩＧＦ１Ｒの自己リン酸化を阻害する及びＩＧＦ１Ｒの下方制御を誘導するの両方に対するＭＡＣの機能の活性を制約する。従って、一つの二重機能性成分中の二つの異なった生物学的経路を効率よく調節するために、（ペプチド及び標的の薬物動態によるが）抗体当たり約２個のペプチドの共役が理想的であるかもしれない。

【0489】

【表25】

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【実施例18】

【0490】

実施例１８ Ｉｎ ｖｉｖｏの薬物動態
プロトコル
マウス及びサルの血清中の血清ＭＡＣレベルを測定するために、検証された直接結合の酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）法を使用した。簡単には、試料中のＭＡＣを、ＩＧＦＲ１又はＡｎｇ２と結合させ、これを、マイクロタイタープレートに受動的に吸着させ、そしてホースラディッシュペルオキシダーゼと共役した抗−ヒトＩｇＧを、発色性基質と共に使用して、血清試料中のＭＡＣ−２の濃度に比例するシグナルを発生させる。マウス血清中のＭＡＣ−２の定量化の上限及び下限は、２６．０及び１０００ｎｇ／ｍｌであり、そしてカニクイザルの血清中では、５２．０及び２０００ｎｇ／ｍｌである。

【0491】

Ａｎｇ２及びＩＧＦ１Ｒの逆ＥＬＩＳＡ
ハイバインディングハーフウェルプレートを、５０μｌのＰＢＳ中のＩＧＦ１Ｒ（６２．５ｎｇ／ウェル）又はＡｎｇ２（６．２５ｎｇ／ｍｌ）で被覆し、そして４℃で一晩インキュベートした。プレートを３回洗浄緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、そして１５０μｌ／ウェルのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋで室温で１時間遮断した。プレートを３回洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄後、調製した投与溶液の標準液（範囲：３．９１−５００ｎｇ／ｍｌ）及び血清試料をプレートに加え、そして１時間インキュベートして、ＭＡＣ複合体の、プレート上の被覆されたＡｎｇ２又はＩＧＦ１Ｒへの結合を可能にした。プレートを３回洗浄し、そして５０μｌのＨＲＰと共役したヤギ抗−ヒトＩｇＧ（０．８μｇ／ｍＬ）を加え、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、そして５０μｌ（２５μｌのＴＭＢ＋２５μｌのＨ_２Ｏ_２）の基質溶液を加え、そして１−５分間インキュベートした。発色を２５μｌの２ＭのＨ_２ＳＯ_４で停止した。４５０ｎｍのＯＤを、４５０ｎｍの補正波長で測定した。ＭＡＣ複合体の血清濃度を、標準曲線を使用して計算した。ＥＬＩＳＡによって決定されたＭＡＣ複合体の濃度を、時間の関数としてプロットした。更なるデータ解析を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎバージ
ョン４．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して行って、ＭＡＣ複合体のβ半減期（Ｔ１／２）及び曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。

【0492】

マウス
ＰＫの研究を、投与の開始時の体重が概略２０−２２グラムのオスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ＣＦＷ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）を使用して行った。ＭＡＣ化合物を静脈内投与した。血液試料を、時点当たり４匹のマウスから、次の時点：０．０８、０．５、１、３、５、７及び２４時間に採取した。試料収集の前に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを全ての血液試験管に加えた。血液を氷上で３０分間凝固させ、そして次いで１２０００ｒｐｍで５−１０分間４℃で遠心して、血清を収集し、そしてＥＬＩＳＡによる分析まで−８０℃で直ちに保存した。投与溶液を、Ａｎｇ２又はＩＧＦ１Ｒの逆ＥＬＩＳＡによる血清試料の分析のための標準曲線を確立するために使用した。それぞれの血清試料のアリコートを、Ａｎｇ２又はＩＧＦ１Ｒの逆ＥＬＩＳＡのいずれかによって分析した。

【0493】

サル
ＭＡＣ−２の薬物動態学的特性を決定した。２匹のオスのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ
ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、研究において使用した；ＭＡＣ−２を、静脈内（ボーラス）注射によって１０ｍｇ／ｋｇの投与量レベルで投与した。全てのサルを、投与の一日目に、投与後５分、１５分、１時間、４時間及び８時間に、そしてその後一日二回、治療に対する何らかの反応に対して観察した。１、２、３、４、５，７及び１４日目に体重を測定し、そして記録した。血液試料を、毒物動態学的分析のために所定の時点で得て、そして血清を分離し、そして−８０℃で保存した。

【0494】

ＭＡＣ−２による治療に関係することができる注目すべき不都合な臨床的徴候は、研究中になかった。体重の特性は、満足であった。概略１．０ｍＬの血液試料を、それぞれのサルの大腿の静脈から時点（０．０８−５０４時間）に単純な凝固試験管に収集した。血液試料を、収集後室温で１時間静置させたままにし、そして次いで３０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心した。得られた血清試料を、分析に先だって概略−８０℃で保存した。

【0495】

結果
探索的非ＧＬＰ薬物動態（ＰＫ）研究を、オスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス及びオスのカニクイザルで行った（表２６及び２７）。ＭＡＣのＡｎｇ２及びＩＧＦ１Ｒ結合活性の両方を解析した。マウスにおいて、ＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２は、３８３−３９７時間のベータ相半減期を持つ、親の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体と同様な滞留時間を示した。ＭＡＣ−１及びＭＡＣ−２Ａｎｇ２結合能力は、一回投与のＩＶ研究のマウスにおける１０５−１２０時間のベータ相半減期を持つ、Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２と同様な滞留時間を示した。カニクイザルにおいて、ＭＡＣ−２は、１００．４時間のベータ相半減期を持つ、親の抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体よりわずかに短い滞留時間を示した。ＭＡＣ−２Ａｎｇ２結合能力は、９７．８時間のベータ相半減期と、Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２と同様な滞留時間を示した。

【0496】

【表26】

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【0497】

【表27】

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【実施例19】

【0498】

実施例１９ Ｉｎ ｖｉｖｏの薬理学
プロトコル
ＭＡＣ−２の抗腫瘍活性を、Ｃｏｌｏ２０５（ヒト大腸腺癌）又はＭＤＡ−ＭＢ−４３５（黒色腫）異種移植モデルで評価した。Ｃｏｌｏ２０５又はＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を、１０％のＦＢＳ ＲＰＭＩ培地で培養し、そして０．１ｍｌのハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ）中の３×１０^６細胞を、生後５−７週のメスのｎｕ／ｎｕマウスの上部側腹部に皮下注射し、そして治療の開始に先立ち２００−４００ｍｍ^３の体積を確立させた。腫瘍が確立された後、マウスを、同一の腫瘍体積を持つ治療群（ｎ＝９−１０／群）にランダム化し、そしてＭＡＣ−２治療剤を腹腔内（ＩＰ）注射によって毎週１回投与した。組合せ研究において、更なる抗癌剤を、ＭＡＣ−２と同時に開始して毎週ＩＰ注射によって投与した。腫瘍体積をノギスを使用して週１回又は２回測定し、そして体重を、治療期間中毎週測定した。幾つかの研究において、ベヒクル治療の対照群の腫瘍体積が２０００ｍｍ^３に達した時点で、全てのマウスをＣＯ_２窒息によって安楽死させ、そして腫瘍を切除し、秤量し、そして更なる組織学的及び／又は免疫化学的評価のために加工した。仮性生存研究において、それぞれの治療群の平均腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えた時点で、マウスをＣＯ_２窒息によって安楽死させ、そして腫瘍を切除し、そして秤量した。

【0499】

結果
Ｃｏｌｏ２０５（ヒト大腸腺癌）異種移植モデルで行った実験を、図１２Ａ及び１３Ａに例示する。Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２又は抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．１．ｆｘ）の毎週の投与は、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍の成長を阻害した。毎週投与されるＡｎｇ２−ｈ３８ｃ２及び抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体の組合せは、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍の成長を阻害することにおいて、更なる利点を示した。単独のＭＡＣ−２の毎週の投与は、組合せと同様な利益を示した（図１４Ａ）。別個の研究において、ＭＡＣ−２は、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍の成長、及び最終腫瘍重量を用量依存的に阻害した（図１５Ａ、Ｂ）。

【0500】

２８日目に、化合物で治療されたマウスを犠牲にし、そして腫瘍を切除し、そして瞬間冷凍した。ＭＡＣ−２の抗血管新生効果を評価するために、腫瘍の微小血管密度を、ベヒクル（ＰＢＳ）又はＭＡＣ−２（０．３ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまでの用量反応範囲）で治療したＣｏｌｏ２０５大腸腺腫異種移植腫瘍の冷凍された切片に対して免疫組織化学的に評価した。腫瘍を、マウス特異的モノクローナル抗体でＣＤ３１に対して染色し、そして免疫反応性を、それぞれの腫瘍からの三つの切片の五つの部分から定量した（図１３Ｃ）。腫瘍の微小血管密度は、ＭＡＣ−２（１０ｍｇ／ｋｇ、毎週一回）によって、ベヒクル治療群との比較において、約４２％有意に減少され、ＭＡＣ−２治療の抗血管新生活性を確認した。

【0501】

ＭＡＣ−２が、ｉｎ ｖｉｖｏでＡｎｇ２及びＩＧＦ１Ｒの両方を標的とするか否かを調査するために、Ａｎｇ２及びＩＧＦ１Ｒ発現レベルに対するＭＡＣ−２の効果を、ベヒクル、Ａｎｇ２−ｈ３２ｃ２、ＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．１．ｆｘ）又はＭＡＣ−２（０．３ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまでの用量反応範囲）で治療された二つの独立のＣｏｌｏ２０５異種移植腫瘍で評価した。溶菌液を冷凍された切除腫瘍から調製し、そしてＡｎｇ２及びＩＧＦ１Ｒの免疫反応性を、ＥＬＩＳＡによって定量した。Ａｎｇ２及びＩＧＦ１Ｒの免疫反応性は、ＭＡＣ−２の治療によって用量依存的様式（１、３及び１０ｍｇ／ｋｇ）で、ベヒクル治療群との比較において有意に減少した（図１４Ｂ、１５Ｄ、及び１５Ｅ）。ＩＧＦ１Ｒレベルに対するＭＡＣ−２の効果は、ＩＧＦ１Ｒ拮抗性抗体（２．１２．１．ｆｘ）に対して観察されたものと同様である（図１４Ｂ）。更に、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒのレベルは、ＭＡＣ−２で治療されたマウスからの腫瘍中で減少された（データは示されていない）。これらに腫瘍の固定された切片の免疫蛍光も、更にＩＧＦ１Ｒ及びｐＩＧＦ１Ｒの減少を確認した（データは示されていない）。これらのデータは、ＭＡＣ−２治療が、Ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルのＡｎｇ２及びＩＧＦ１Ｒ経路に両方に影響することを示す。

【0502】

三つの別個の研究において、ＭＡＣ−２治療は、ベヒクル（ＰＢＳ）、Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２及びＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．１．ｆｘ及び２．１３．２）と比較して、継続した腫瘍阻害に導いた（図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ）。抗−ＩＧＦ１Ｒ抗体２．１３．１は、ＷＯ０２／０５３５９６中の、それぞれのシグナル配列を差引いた配列番号：４５及び配列番号：４７として記載されている。ＭＡＣ−２による腫瘍の阻害は、Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２及び２．１２．１．ｆｘの組合せと同様であり、そしてＡｎｇ２−ｈ３８ｃ２及び２．１３．２より更に活性である（図１６Ｃ）。ＭＡＣ−２治療は、体重増加に影響せず（データは示されていない）、そしてマウスは、研究を通して良好な健康状態であるように見受けられた。マウスのそれぞれの群の腫瘍を、疑似生存研究として２０００ｍｍ^３まで進行させた。Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２及び抗ＩＧＦ１Ｒ抗体治療群の両方は、４８日目に中止した；然しながら、ＭＡＣ−２治療（３−１０ｍｐｋ）の腫瘍は、研究を停止した９４日目においてなお２０００ｍｍ^３より小さかった。

【0503】

ＭＡＣ−２の抗腫瘍効力も、更にＭＤＡ−ＭＢ−４３５黒色腫異種移植モデルにおいて評価した。ＭＡＣ−２の毎週の投与（３及び２０ｍｇ／ｋｇＩＰ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５モデルにおける腫瘍の成長の有意な４０％の減少（６７日目）をもたらした（図１７）。従って、ＭＡＣ−２は、二つの異なったヒト異種移植腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍効力を示した。

【実施例20】

【0504】

実施例２０ 各種の抗体のペプチド共役特性
幾つかの異なった抗体のペプチドとの共役特性を、配列番号：２７及び５ＰＥＧをそれぞれ例示的ペプチド及びリンカーとして使用して解析した。全ての試験された抗体は、十分に確認され、そして特徴付けされた抗原相互作用を持つヒト又は完全にヒト化されたＩ
ｇＧ抗体であった。ｈＡｂλテストは、ＣＬλを含んでなり、一方、２．１２．１．ｆｘ、ｍＡｂκテスト１、ｈ２８Ｃ２−ＩｇＧ１（配列番号：５１及び５２）及びｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ２（配列番号：５３及び５４）は、それぞれＣＬκを含んでなる。それぞれの抗体を、２０ｍＭのｐＨ７．０のＨＥＰＥＳに緩衝液交換し、そして５−２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。配列番号：２７／Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰを、５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、そして関連する抗体と４．３：１のモル比で混合し、そして少なくとも２時間室温で反応させた。全ての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態のタンパク質の数及び定量化を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；多数のペプチド共役部位は、結合したペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数のペプチド共役種の相対的定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表２２は、各種の抗体のペプチド共役特性を示す。

【0505】

ＣＬκを含有する抗体に対して、ペプチド共役は、０−４個間のペプチド付加の分布で起こり、最大の形態は２ないし３個のペプチド付加である。対照的に、ＣＬλを含んでなる抗体、ｈＡｂλテストに対して、ペプチドの共役は、０−４個間のペプチド付加の分布で起こり、最大の形態は、１又は２個のペプチド付加である。

【0506】

ペプチド共役の程度を、軽及び重鎖で別個に行った。それぞれの試料を変性し、そしてジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩及びジチオトレイトールを使用して還元した。得られた遊離の軽及び重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれの共役特性を決定した。各種の抗体の軽及び重鎖上のペプチド共役特性を、表２８に示す。２．１２．１．ｆｘ及びｈＡｂκテスト１において、データは、共役の位置が軽鎖において高いことを示す；軽鎖上の最も豊富な形態は、一つ（１個）のペプチド付加を含有する。重鎖上の共役は、有意に低いレベルで観察される。ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１及びｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ２において、共役の匹敵するレベルが軽及び重鎖上で観察され、軽鎖上に僅かな共役の優先性がある。ＣＬλを含有する抗体（ｈＡｂλテスト）において、共役の大部分は重鎖において起こり、低いレベルの共役が軽鎖において観察された。

【0507】

【表28】

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【0508】

それぞれの抗体２．１２．１．ｆｘ、ｈＡｂλテスト及びｈＡｂκテスト１を、共役過程の後に評価して、その受容体結合を保持する抗体骨格の能力に対する共役付加の効果を決定した（天然のｍＡｂと比較して）（表２９）。結果は、試験抗体へのペプチドの方向性共役が、抗体結合を変更しなかったように見受けられることを示す。

【0509】

【表29】

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【実施例21】

【0510】

実施例２１ ＩｇＧ２−κの代表的抗体のペプチド共役特性
ＩｇＧ２−κ抗体（ｈＡｂκテスト２）の、３９−マーペプチドによる共役特性を解析した。抗体を８ｍｇ／ｍＬに濃縮し、そして緩衝されたものを、ｐＨ８．０の４０ｍＭのＨＥＰＥＳに交換した。ペプチドを１００％のＤＭＳＯで再懸濁し、そして抗体と５．０：１のモル比で混合し、そして一晩室温で反応させた。全ての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態のタンパク質の数及び定量化を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；多数のペプチド共役部位は、ペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数のペプチド共役種の相対的定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表３０は、３９−マーペプチドによるｈＡｂκテスト２のペプチド共役特性を示す。ペプチドの共役は、０−４個間のペプチド付加の分布で起こり、２．０３個のペプチド付加の平均であり、そしてＣＬκ−Ｋ^１８８上の方向性共役と一致する。

【0511】

【表30】

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【0512】

別個の実験において、３９−マーペプチドを、先に記載したように、ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ２にＭＡＬ−２ＰＥＧ−ＰＦＰと共に、異なったモル濃度で共役させた。更に、３９−マーペプチドに対する同族受容体の結合を分析した。示した結果（表３１）は、Ｋ^１８８−ＣＬκにおける方向性共役と一致する。更に、抗体当たりのペプチドの平均数の増加は、標的に対する全体的結合を、実質的に増加しなかった。これは、抗体当たりの共役の増加が標的結合を増加することができないというある種のシナリオを示し、本発明の利点の一つを示す；抗体当たりの共役したペプチドの数の制御は、単位ペプチド当たりの最大の標的結合を達成することを援助することができる。

【0513】

【表31】

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【実施例22】

【0514】

実施例２２：ビオチンの２．１２．１．ｆｘ Ｆａｂへの共役
ビオチン−２．１２．１．ｆｘ
２．１２．１．ｆｘのＦａｂ領域（配列番号：５０及び４）の、ＰＦＰ−ビオチンとの共役特性を解析した。抗体Ｆａｂを２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、そして緩衝されたものを、ｐＨ５．５の２０ｍＭの酢酸ナトリウム＋２００ｍＭのトレハロースに交換し、そしてｐＨ７．７の６０ｍＭのリン酸ナトリウムを添加した。ＰＦＰ−ビオチンを１００％のＤＭＳＯで再懸濁し、そして抗体と一連のモル比で混合し、そして一晩室温で反応させた。全ての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態の数及び定量化を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；多数の共役部位は、共役したペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数のペプチド共役種の相対的定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表３２は、２．１２．１．ｆｘのＰＦＰ−ビオチンのモル比による共役特性を示す。共役は、モル比の増加に従って、０−２個間の付加の分布で起こる。抗体当たりの低い分子の数は、使用されたモル比に基づき、先の結果と一致する。これは、一つ又はそれより多い反応のパラメーターを変更することによって共役の量を制御するこの方法の柔軟性の有用な証明である。

【0515】

【化95】

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【0516】

ビオチン−ＰＦＰ

【0517】

【表32】

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【実施例23】

【0518】

実施例２３ ビオチンのｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１への共役
ビオチン−ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１
抗体ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１を、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝液で、０．０２Ｍの最終濃度に、２０ｍｇ／ｍＬに調節した。ビオチン−ＰＦＰを、水中で１０ｍｇ／ｍＬに再構成し、そしてｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１に５：１のモル比で加え、そして室温で２時間反応させた。未反応のＰＦＰ−ビオチンを、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去し、そしてｐＨ６．５のヒスチジン、グリシン、及びスクロース緩衝液に緩衝液交換した。試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態のタンパク質の数及び定量化を決定した。表３３は、ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１のビオチン−ＰＦＰとの共役特性を示す。ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１の共役は、１．１個の共役の平均で、０−３個間のＣＡの分布で起こる。共役の増加は、反応条件の最適化後に可能となるものである。ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１上のＶＨ−Ｋ^９９（Ｋａｂａｔ番号によればＫ^９３）の反応性は、触媒抗体試験化合物ＣＡＴＣ−１と反応させた場合、＞９５％であることが確認され、そして逆相クロマトグラフィーによって分析された。

【0519】

【化96】

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【0520】

ＣＡＴＣ−１
ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１

【0521】

【表33】

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【実施例24】

【0522】

実施例２４ ２．１２．１．ｆｘ及びＫ^１８８、Ｋ^１９０変異体の共役特性
ペプチドマッピングに基づけば、Ｙ１５断片中には２個のＬｙｓが存在する。活性な共役部位を識別するために、Ｋ^１８８及びＫ^１９０を、Ｒにそれぞれ又は組合せて変異させた。変異体を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に記載されたプロトコルに従って産生した。変異を、オリゴヌクレオチドプライーマーによって誘発し、そしてＤＮＡ配列決定によって確認した。変異されたｍＡｂｓを、ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、そしてタンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂｓをＭＳを使用して特徴づけした。配列番号：３３、３４及び３５は、２．１２．１．ｆｘのＩＧＦ１ｒ変異体軽鎖配列を示す。

【0523】

抗体を、ｐＨ７．５又は６．５の０．０２ＭのＨＥＰＥＳに、２ｍｇ／ｍＬで緩衝液交換した。ｐＨが６．５の場合、次いでｐＨ７．７の６０ｍＭのリン酸ナトリウムを添加した。配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰを、５０％のプロピレングリコールで希釈し、そしてタンパク質と４．３：１のモル比で混合し、そして一晩室温で反応させた。全ての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態のタンパク質の数及び定量化を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；多数の共役部位は、結合したペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数のペプチド共役種の相対的定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表３４は、非修飾の２．１２．１．ｆｘ、２．１２．１．ｆｘ−Ｋ^１８８Ｒ（ＬＣ：配列番号：３３）、２．１２．１．ｆｘ−Ｋ^１９０Ｒ（ＬＣ：配列番号：３４）、及び２．１２．１．ｆｘ−Ｋ^１８８Ｒ−Ｋ^１９０Ｒ（ＬＣ：配列番号：３５）の共役特性を示す。Ｋ^１８８Ｒ変異体は、減少した共役を示した。Ｋ^１９０Ｒは、未共役の２．１２．１．ｆｘと類似の共役を有していた。ＭＡＣ−２の共役は、組合せのＨＥＰＥＳ／リン酸塩緩衝液を使用するの他のアッセイで観察されたものより低かった。

【0524】

【表34】

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【実施例25】

【0525】

実施例２５ Ｋ^１８８に対する方向性共役の機構を解明するための２．１２．１．ｆｘ変異体
Ｋ^１８８に接近した残基を試験した。Ｈ^１８９側鎖は、Ｋ^１８８のε−アミノ基に非常に近い。Ｈｉｓは、プロトン移動反応にしばしば関係するために、Ｈ^１８９は、Ｋ^１８８共役のために必要である可能性が非常にある。Ｋ^１８８部位特異的共役におけるＨ^１８９の役割を研究するために、本出願人等は、ヒスチジンをアラニンで置換することによってイミダゾール環を除去した。

【0526】

Ｄ^１５１Ａ及びＤ^１５１Ａ／Ｈ^１８９Ａ変異体を、部位特異的共役におけるＤ^１５１の役割並びにＤ^１５１及びＨ^１８９の組合せ効果を研究するために製造した。
変異体を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に記載されたプロトコルに従って産生した。変異を、オリゴヌクレオチドプライーマーによって誘発し、そしてＤＮＡ配列決定によって確認した。変異されたｍＡｂｓを、ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、そしてタンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂｓを、ＭＳを使用して特徴づけした。次の２．１２．１．ｆｘ軽鎖変異体：Ｄ^１５１Ａ（配列番号：３６）、Ｋ^１８８Ａ（配列番号：３７）、Ｈ^１８９Ａ（配列番号：３８）、Ｋ^１９０Ａ（配列番号：３９）及びＤ^１５１Ａ／Ｈ^１８９Ａ（配列番号：４０）を産生した。

【0527】

それぞれの抗体を、ｐＨ５．５の２０ｍＭの酢酸ナトリウム、２００ｍのトレハロースに２００ｍｇ／ｍｌで緩衝液交換した。次いでタンパク質にｐＨ７．７の６０ｍＭのリン酸ナトリウムを添加した。配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰを、５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、そして抗体と４．３：１のモル比で混合し、そして一晩室温で反応させた。全ての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態のタンパク質の数及び定量化を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；多数の共役部位は、共役したペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数のペプチド共役種の相対的定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。

【0528】

表３５は、２．１２．１．ｆｘ、２．１２．１．ｆｘ−Ｄ^１５１Ａ、２．１２．１．ｆｘ−Ｋ^１８８Ａ、２．１２．１．ｆｘ−Ｈ^１８９Ａ、２．１２．１．ｆｘ−Ｋ^１９０Ａ、及び２．１２．１．ｆｘ−Ｄ^１５１Ａ／Ｈ^１８９Ａ変異体の共役特性を示す。方向性共役を維持したＫ^１９０Ａを除く、全ての変異体は、非修飾の２．１２．１．ｆｘ抗体と比較して、減少した平均共役レベルを示した。

【0529】

共役の程度を、軽及び重鎖上で別個に試験した。それぞれの試料を変性し、そしてジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩及びジチオトレイトールを使用して還元した。得られた遊離の軽及び重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれの共役特性を決定した。２．１２．１．ｆｘ及び変異体上の軽並びに重鎖上の共役特性を表３５に示す。表に記載した全ての変異体は、Ｋ^１９０Ａを除き、非修飾の２．１２．１．ｆｘと比較して軽鎖上の減少した共役レベルを示した。変異体の重鎖の共役レベルは、非修飾の２．１２．１．ｆｘと同様なレベルであった。

【0530】

【表35】

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【実施例26】

【0531】

実施例２６ ラムダ／カッパ置換
ｈＡｂλテスト１中のＬＣλを、ＬＣκで置換して、これがＬＣ誘導体化のレベル、方向性及び／又は制御を増加するか否かを決定した。ＬＣλ／ＬＣκドメイン置換ハイブリッド構築物を、オーバーラップＰＣＲを使用して産生した。ＬＶλ及びＬＣκを、ｈＡｂλテスト及びカッパｍＡｂ軽鎖を、別個にテンプレートとして使用してＰＣＲで増幅した。これらの二つのＰＣＲ産物をテンプレートとして混合した；ｈＡｂλテスト１順方向プライマー及びＬＣκ逆方向プライマーを、オーバーラップＰＣＲ反応中で使用して、全長のｈＡｂλテストＬＶ／ＬＣκＤＮＡを増幅した。ハイブリッド抗体構築物を、ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、そしてタンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製した抗体を、ＭＳを使用して特徴づけした。ｈＡｂλテストＬＣκハイブリッドは、その同族受容体に天然のｍＡｂ（ｈＡｂλテスト）と同様に結合した（表３６）。配列番号：４１、４２及び４３は、ｈＡｂλテスト、ｈＡｂλテスト−λκ（λＪを伴う）、及びｈＡｂλテスト−λκＪ（κＪを伴う）からの軽鎖定常領域である。

【0532】

【表36】

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【実施例27】

【0533】

実施例２７ ｈＡｂλテスト１変異体：モチーフ修飾
短いモチーフ“ＫＨ”が、ＣＬλの対応する領域でＭＡＣ形成のために十分であるか否かを確立するために、ｈＡｂλテスト中の残基ＣＬλ^{１８８／１８９}の簡単な配列スイッチを伴う変異体を、Ｋ^１８７の傍のヒスチジンに入れるために製造し、従って“Ｋ^１８７Ｓ^１８８Ｈ^１８９”は、“Ｋ^１８７Ｈ^１８８Ｓ^１８９”となった。変異体を、Ｑｕｉｃｋ
Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に記載されたプロトコルに従って産生した。変異を、オリゴヌクレオチドプライーマーによって誘発し、そしてＤＮＡ配列決定によって確認した。変異抗体構築物を、ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、そしてタンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製した抗体をＭＳを使用して特徴づけした。ｈＡｂλテスト−Ｓ^１８８Ｈ／Ｈ^１８９Ｓ（ＬＣ：配列番号：４４）変異体は、その受容体、並びに親ｈＡｂλテスト抗体にも結合した（表３７）。

【0534】

【表37】

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【実施例28】

【0535】

実施例２８ ｈＡｂλテスト１変異体の共役特性
それぞれの抗体（ｈＡｂλテスト、ｈＡｂλテスト−λκ、ｈＡｂλテスト−λκＪ及びｈＡｂλテスト−Ｓ^１８８Ｈ／Ｈ^１８９Ｓ）を、ｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍのトレハロースに、２０ｍｇ／ｍｌで緩衝液交換した。次いでタンパク質にｐＨ７．７の６０ｍＭのリン酸ナトリウムを添加した。配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰを、５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、そして抗体と４．３：１のモル比で混合し、そして一晩室温で反応させた。全ての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態のタンパク質の数及び定量化を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；多数のペプチド共役部位は、ペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数のペプチド共役種の相対的定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表３８は、共役の全体のレベルが、二つのＬＣがスイッチされたハイブリッド中で増加されたことを示す（λκ及びλκＪ−前者はラムダＪ断片を含み、後者はカッパＪ断片を含む）。共役レベルは、ｈＡｂλテスト対照の平均ＣＡを超えて増加し、１．６６から、それぞれ２．１９（λκ）及び２．５３（λκＪ）まで行った。変異体は、天然の配列と比較して僅かな影響を有し、単独の“ＫＨ”モチーフがＭＡＣに形成のために十分ではないことを示唆した。

【0536】

ペプチド共役の程度を、軽及び重鎖上で別個の試験した（表３８）。それぞれの試料を変性し、そしてジスルフィド結合をグアニジン塩酸塩及びジチオトレイトールを使用して還元した。得られた遊離の軽及び重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれの共役特性を決定した。還元分析において、天然のｈＡｂλテストのＬＣは、５％のみの１個のＣＡを有するが、然しこれは、ｈＡｂλテスト−λκにおいて５８％の１個のＣＡ及びｈＡｂλテストλκＪにおいて６３％の１個のＣＡに劇的に跳ね上がる。ＬＣスイッチは、ＨＣ共役のレベルに対して僅かな影響を有し、これは、かなり一定なままであった（ＨＣ共役が中程度に増加するλκＪを除く）。再び、変異体は、天然の配列と比較して僅かな影響を有し、単独の“ＫＨ”モチーフがＭＡＣ形成のために十分ではないことを示唆した。

【0537】

【表38】

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【0538】

これらの共役形態の受容体結合特質を、更に評価して、共役した抗体のその受容体になお結合する能力に対する、配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰによる共役の効果を決定した（表３９）。

【0539】

【表39】

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【実施例29】

【0540】

実施例２９ 異なった脱離基を使用するＭＡＣの産生
活性なエステル脱離基の活性の程度及び／又は構造が、方向性共役効果を規定することにおいて重要であるか否かを調査するために、配列番号：２７−Ｋ^１１（ＳＨ）ＭＡＣ−２ＰＥＧ−ＰＦＰの一連の代替活性化エステル類似体を合成した。共役生成物の分布を、インタクトな複合体のＭＳによって試験し、そしてインパクトな複合体の還元及び軽及び重鎖の分離後、軽及び重鎖の両方へのペプチド付加の程度も更にＭＳによって決定した。

【0541】

代替活性化エステルの構造及び命名を、以下に示す。
代替活性化ペプチドを、実施例１−３に先に示したものと同じ戦略及び方法を使用して合成した。簡単には、それぞれの活性化された基を、Ｚ^＊がＰＦＰを置換する新しい脱離基であるマレイミド−２ＰＥＧ−Ｚ^＊リンカーに組込んだ。上記の化合物を合成するために、精製されたＡＢＰ−チオールペプチド（即ち、連結残基としてＫ（ＳＨ）を伴うＡＢＰ）の試料（３０−４０ｍｇ）を、無水のＤＭＦ（２ｍｌ）中に溶解した。ＭＡＬ−ＰＥＧ２−Ｚ^＊（２０ｍｇ）を、Ｎ−メチルモルホリン（５ｍＬ）と共に加えた。反応物を撹拌し、そして生成物の形成の時間経過を追跡するために室温でＨＰＬＣによってモニターした。出発ペプチドの活性化エステルが連結したＡＢＰ生成物への完全な転換は、２−６時間内に観察された。溶液を濾過し、そして生成物のピークを、準分離用ＨＰＬＣによっ
て直接単離した。生成物を、凍結乾燥後、概略３０−５０％の範囲の収率で単離した。

【0542】

結合反応を標準的な条件下で行った。簡単には、２．１２．１．ｆｘ溶液を、ｐＨ７．７のリン酸ナトリウムで０．０６Ｍの最終濃度に希釈することによって、２．１２．１．ｆｘ抗体溶液を調製した。別個に、ペプチドをプロピレングリコール中で２０ｍｇ／ｍｌに溶解し、次いでこの溶液を水で１０ｍｇ／ｍｌに希釈することによって、ペプチド溶液を調製した。結合反応のために、ペプチド及び抗体溶液を４：１のモル比で、処方された時間混合した。時間経過研究のために、結合反応の試料を、ｐＨ４．０の４０ｍＭのコハク酸、２００ｍＭのグリシン（１：１、容量／容量）の溶液と混合することによって、共役溶液の試料を各種の時点でクエンチした。結合反応の時間経過を、ＨＰＬＣによって追跡した。配列番号：２７を、例示的なペプチドとして使用した。

【0543】

【化97】

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【0544】

配列番号：２７−Ｋ^１１−ＭＡＬ−２ＰＥＧ−Ｚ^＊

【0545】

【表40】

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【0546】

表４０は、結合反応の開始後２４時間目のインタクトな複合体の最終生成物分布を示す。結果は、幾つかのエステルは全く反応せず（Ｚ４、Ｚ１２）、他は緩慢に反応し（例えばＺ５）、一方幾つかはＰＦＰ（Ｚ１）のそれに近づく特性を与えた（例えばＺ３）ことを示す。

【0547】

共役の動態
それぞれの最終複合体に対する時間をかけた付加の速度を、表４１、４２、４３及び４４に示す。０ＣＡは、誘導体化されていない２．１２．１．ｆｘ抗体であり、一方、１、２又は３ＣＡは、それぞれの試験された時点における２．１２．１．ｆｘ抗体への１、２又は３個のペプチドの付加である。

【0548】

【表41】

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【0549】

【表42】

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【0550】

【表43】

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【0551】

【表44】

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【0552】

軽及び重鎖の分布
それぞれの代替活性化エステルに対するペプチド共役の程度を、軽及び重鎖に対して別個に試験した。それぞれの試料を変性し、そしてジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩及びジチオトレイトールを使用して還元した。得られた遊離の軽及び重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれの共役特性を決定した。２．１２．１．ｆｘの軽及び重鎖並びに変異体上のペプチド共役特性を、表４５に示す。表に記載した殆ど全ての活性化ペプチドは、ＰＦＰ（Ｚ１）を使用する化合物と比較して、同様な共役のレベルを示した２，３，６−トリフルオロフェニル（Ｚ３）を除き、軽鎖上の減少した共役レベルを示した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）から誘導された活性化されたエステル、即ち、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド及び２−ヒドロキシ−イソインドリン−１，３−ジオン（Ｚ８及びＺ９）は、重鎖の誘導体化に対してより大きい傾向を示した。

【0553】

【表45-1】

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【0554】

【表45-2】

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【0555】

【表45-3】

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【実施例30】

【0556】

実施例３０
代替活性化エステルの更なる例を、表４５に示す。ＰＦＰエステルの幾つかの類似体の共役の時間経過を試験した。ＰＦＰ中のフッ素基の数及び位置を減少することによって、より低い反応性の活性なエステルの形態を合成することができ、そして調査した。２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステル及び２，４，６−トリフルオロフェニルエステルを、配列番号：２７−Ｋ^１１（ＳＨ）ＭＡＣ−２ＰＥＧ−ＰＦＰへの共役後、両方試験した。１−ヒドロキシ−ピロリジン−２，５−ジオン（ＮＨＳ）を、配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰに共役した。

【0557】

【化98】

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【0558】

２時間の共役後、これらのより少なく活性化された形態は、ＰＦＰより低い２．１２．１．ｆｘへの全体的共役を与えた。ＮＨＳ基は、更により低い全体的な共役を示した。ＮＨＳ及びＰＦＰを含有するペプチドは、２．１２．１．ｆｘに共役した。還元された形態を、２時間目における分布を観察するために分析した。ＰＦＰは、１−ヒドロキシ−ピロリジン−２，５−ジオン（ＮＨＳ）（全体的にＬＣに３１％、しかし全体的に重鎖に３４％）と比較して、軽鎖の誘導体化に、はるかに大きい傾向（全体的にＬＣに７７％、重鎖に６％のみ）を示した。

【0559】

【表46】

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【0560】

化合物Ｚ１−Ｚ１５は、各種の異なった構造の種類の活性なエステルである。これは、芳香族環の周りの異なった数及びパターンのフッ素原子の置換を有する一連のフッ素化された芳香族の活性なエステル（化合物Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ１１、Ｚ１４及びＺ１５）を考慮し、そしてこれらの構造が、タンパク質の誘導体化のためにその反応性及び傾向が如何に影響するかを考慮することを啓発する。これらの誘導体の抗体共役の動態は、ペンタフルオロフェニル（Ｚ１）の反応が完結に達する、２時間の時点で好都合に比較することができる。環の周りのフッ素置換のレベルの増加に伴い、全体の共役の増加したレベル、
及び未反応抗体の同時の減少が存在する。反応の速度は、フッ素化されたフェニル脱離基のｐＫａに直接関係し、最も酸性のフェノールがより高い反応速度を与える。共役の速度は、Ｚ１＞Ｚ１４＞Ｚ３＞Ｚ１５＞Ｚ２＞Ｚ１１である。フッ素置換パターンの微妙な影響は、化合物Ｚ２、Ｚ３及びＺ１５を比較することによって観察することができる。

【0561】

活性なエステルの構造は、更に結合反応の方向性に有意に影響した。一般的に、フッ素化された芳香族エステルは、軽鎖誘導体化（先に記述したように主としてＣＬκ−Ｋ^１８８）に対する顕著な傾向を示した。対照的に、Ｎ−スクシンイミド誘導体に基づく幾つかのエステル（Ｚ８、Ｚ９及びＺ１３）は、より少ない優先性を示し、しばしばより大きいレベルの重鎖誘導体化が観察された。

【実施例31】

【0562】

実施例３１
ＭＡＣ−１（ペプチド及びＰＦＰ活性化基間のＰＥＤ−２−マレイミド−メルカプトプロピオニルリンカー）及びＭＡＣ−２（ペプチド及びＰＦＰ活性化基間の直鎖ＰＥＧ−５リンカー）間の共役の速度を評価した。表４７は、２．１２．１ｘに対するこれらの活性化されたペプチドを比較している。結果は、活性化されたペプチドは、これらの僅かに異なったリンカーの構造にもかかわらず、誘導体化の速度及び程度に関して非常に類似して行動することを示す。

【0563】

【表47】

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【実施例32】

【0564】

実施例３２ リンカーの長さの影響
異なった長さのリンカーを有する最終共役分布特性に対する影響を試験した。ペプチドをＰＦＰ基に接続する、異なったＰＥＧの長さのリンカーを持つ化合物を合成した。０、１、２、３及び４個のペプチドの２．１２．１．ｆｘへの付加に対する結果を、表４８に要約する。全体的に、ＰＥＧリンカーの長さを変化することは、一般的に共役の分布に僅
かな影響を有したことが得られた。

【0565】

【表48】

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【0566】

【化99】

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【実施例33】

【0567】

実施例３３： 代替ペプチド配列の共役
他のペプチド配列における本発明の適用の可能性を確認するために、配列番号：６０及び配列番号：６１（テスト−ペプチド−１、及び−２）を共役した。配列番号：６０及び６１を、５−ＰＥＧ−ＰＦＰとの、そして次いで２．１２．１．ｆｘ抗体との共役に、配列番号：２７−Ｋ^１１−５ＰＥＧ−ＰＦＰとの反応のために先に最適化した条件下でかけた。共役特性及びＬＣ／ＨＣ共役の分析の結果を、表４９に示す。配列番号：６０及び配列番号：６１の両方は、軽鎖に対する方向性共役を示した。ＬＣ／ＨＣ分布の更なる分析において、ＭＡＣ−２のそれに対する概略７０％のＬＣの誘導体化、及びＨＣに対する１０％より少ない誘導体化を伴う同様な特性が観察された。

【0568】

【表49】

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【0569】

【化100】

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【実施例34】

【0570】

実施例３４：
ペプチドマッピング実験を、抗体の軽鎖上のＫ^１８８において方向性共役に導く重要なパラメーターを確認する目的のために、ある範囲のタンパク質／共役の組合せに対して行った。表５０は、行われたペプチドマッピング実験の結果を記載する。それぞれの研究パラメーターに対して、先に記載したペプチドマッピング法を使用した。“^＊＊＊”は、Ｋ^１８８−ＣＬκに対する高いレベルの方向性共役を示す。“^＊＊”及びより低い程度に対する“^＊”は、方向性共役はなお観察されるが、しかし遅い反応条件、少ない全体的共役、又は一つの軽鎖のみにおける平均のような差を示すことができ、そして従って、抗体当たり０．０ないし１．５個間のペプチドを伴うＭＡＣを産生する（例えば）ような特異的状況に更に適していることができることを示す。“−”は、これらの反応条件が、Ｋ^１８８−ＣＬκにおける方向性共役に対して好ましくないように見受けられるものを示す。

【0571】

Ｋ^１８８−ＣＬκが方向性共役の位置であるＭＡＣ−２において観察されたために、別のパラメーターにおけるペプチドマッピング研究は、この位置に焦点を合わせた。それぞれの研究のパラメーターに対する詳細なペプチドマッピングデータは含まれていないが、しかし他のＫ残基における有意な共役レベルは観察されず、そして他のＭＡＣの観察は、Ｋ^１８８−ＣＬκにおける方向性共役と一致した。

【0572】

２．１２．１．ｆｘのＫ^１８８Ｒ及びＫ^１８８Ａ変異は、この部位における方向性共役の喪失をもたらし；この特異的残基の本質的な役割を示唆すた。Ｋ^１９０Ｒ、及びＫ^１９０Ａの変異は、Ｋ^１８８に対する方向性共役を妨害せず、そしてなおこれを向上することができる。試験された他の研究パラメーターの、軽鎖定常領域のサブタイプの少なくとも一部は、方向性共役に対する有意な影響を有することが観察された；軽鎖サブタイプカッパの少なくとも一部は、必要であることが決定された。ラムダ軽鎖サブタイプへの共役（例示的なλ含有抗体、ｈＡｂλテスト１を使用）は、方向性共役を示さなかった。ｈＡｂλテスト１のＬＣλがＬＣκに変異された場合、Ｋ^１８８における方向性共役は回復され
た。

【0573】

【表50】

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【0574】

本発明は、先に記載した代表的な態様を参照して、上に述べたように幅広く開示され、そして例示されている。当業者は、本発明に対する各種の改変を、その思想及び範囲から逸脱することなく行うことができることを認識するものである。全ての刊行物、特許出願、及び公表された特許は、本明細書中に参考文献として、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許出願公開又は公表された特許が、具体的に、そして個別に、その全てが参考文献として組込まれることが示されるように、同じ程度に援用される。参考文献によって組込まれた文章中に含有される定義は、これらが、本開示中の定義に矛盾する範囲に対して排除される。

【0575】

明確化のために別個の態様中の文脈に記載された本発明のある種の特徴を、更に一つの態様の組合せにおいて提供することができることは認識されることである。対照的に、簡潔のために、一つの態様の文脈において記載された本発明の各種の特徴は、別個に又はいずれもの適した部分的組合せにおいて提供することができる。

【0576】

本発明の一つの態様に関して考察されたいずれもの制約を、本発明のいずれもの他の態様に適用することができることは明確に意図されている。更に、本発明のいずれもの組成物は、本発明のいずれもの方法において使用することができ、そして本発明のいずれもの方法は、本発明のいずれもの組成物を製造又は使用するために使用することができる。特に、単独で或いは一つ又はそれより多い更なる請求項、及び／又は記載の側面との組合せで特許請求項に記載される本発明のいずれもの側面は、請求項及び／又は記載及び／又は配列の列挙及び／又は図面中の他の場所に明記された本発明の他の側面と組合せ可能であると理解されることである。

【0577】

本明細書中に見出される具体的な例が発明の範囲内に入らない限り、前記具体的例は、明確に否認することができる。
特許請求の範囲における用語“又は”の使用は、代替物のみを指すために明確に示さない限り、“及び／又は”、或いは、開示が代替物のみ及び“及び／又は”を指す定義を支持するが、代替物が互いに排他的であることを意味するために使用される。
本明細書の仕様中で使用する場合、“一つ”又は“一つの”は、他に明確に示さない限り、一つ又はそれより多くを意味することができる。本明細書の特許請求項（等）で使用する場合、用語“含んでなる”と組合せて使用する場合、用語“一つ”又は“一つの”は、一つ又は一つより多くを意味することができる。本明細書中で使用する場合、“もう一つ”は、少なくとも二つ目又はそれより多くを意味することができる。本明細書中で他に定義しない限り、本発明に関して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって普通に理解される意味を有するものである。更に、文脈によって他に要求されない限り、単数の用語は、複数を含むものであり、そして複数の用語は、単数を含むものである。用語“含んでなる／含んでなり”及び用語“有し／含み”は、本発明に関して本明細書中で使用する場合、記述した特徴、整数、工程又は成分の存在を規定するために使用されるが、しかしその一つ又はそれより多い他の特徴、整数、工程、成分又は基の存在或いは付加を妨げない。

【0578】

【化101】

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【0579】

【化102】

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【図1A】

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【図1B】

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【図2A】

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【図2B】

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【図2C】

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【図2D】

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【図3A】

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【図3B】

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【図3C】

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【図3D】

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【図3E】

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【図3F】

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【図3G】

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【図3H】

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【図4】

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【図5A】

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【図5B】

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【図6A】

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【図6B】

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【図7A】

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【図7B】

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【図8】

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【図9A】

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【図9B】

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【図10】

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【図11】

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【図12】

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【図13】

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【図14A】

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【図14B】

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【図15A】

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【図15B】

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【図15C】

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【図15D】

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【図15E】

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【図16A】

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【図16B】

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【図16C】

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【図17】

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【図18A】

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【図18B】

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【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]