特許 6341909 ＳＥＯ−Ｆ融合タンパク質を含む人工フォリソーム体、このタンパク質をコードするベクターを含む植物細胞又は酵母細胞、及びＳＥＯ−Ｆ融合タンパク質をコードするベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6341909

(24)【登録日】2018年5月25日

(45)【発行日】2018年6月13日

(54)【発明の名称】ＳＥＯ−Ｆ融合タンパク質を含む人工フォリソーム体、このタンパク質をコードするベクターを含む植物細胞又は酵母細胞、及びＳＥＯ−Ｆ融合タンパク質をコードするベクター

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20180604BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180604BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180604BHJP

   C07K 14/415 20060101ALN20180604BHJP

   C12N 9/00 20060101ALN20180604BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20180604BHJP

   C07K 14/00 20060101ALN20180604BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20180604BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00ZNA

   C12N1/19

   C12N5/10

   !C07K14/415

   !C12N9/00

   !C07K16/00

   !C07K14/00

   !C12N15/00 A

【請求項の数】7

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2015-510750(P2015-510750)

(86)(22)【出願日】2013年5月2日

(65)【公表番号】特表2015-516402(P2015-516402A)

(43)【公表日】2015年6月11日

(86)【国際出願番号】EP2013059190

(87)【国際公開番号】WO2013167471

(87)【国際公開日】20131114

【審査請求日】2016年4月8日

(31)【優先権主張番号】12167377.6

(32)【優先日】2012年5月9日

(33)【優先権主張国】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】597159765

【氏名又は名称】フラウンホーファーゲゼルシャフト ツール フォルデルング デル アンゲヴァンテン フォルシユング エー．フアー．

(74)【代理人】

【識別番号】100166338

【弁理士】

【氏名又は名称】関口 正夫

(74)【代理人】

【識別番号】100152054

【弁理士】

【氏名又は名称】仲野 孝雅

(72)【発明者】

【氏名】ミュラー ボイ

(72)【発明者】

【氏名】プリュフェル ディルク

(72)【発明者】

【氏名】フィッシャー ライナー

【審査官】 野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／００１２２６２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 MULLER, B. et al.，"Recombinant artificial forisomes provide ample quantities of smart biomaterials for use in technical devices."，APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL.，２０１０年１０月，Vol.88, No.3，pp.689-698

【文献】 RUPING, B. et al.，"Molecular and phylogenetic characterization of the sieve element occlusion gene family in Fabaceae plants."，BMC PLANT BIOLOGY，２０１０年１０月 ８日，Vol.10，219(pp.1-14)

【文献】 NOLL, G.A. et al.，"Native and artificial forisomes: functions and applications."，APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL.，２０１１年 ３月，Vol.89, No.6，pp.1675-1682

【文献】 SHEN, A.Q. et al.，"Forisome based biomimetic smart materials."，PROC. SPIE，２００５年，Vol.5765，pp.97-107，ＵＲＬ，http://publica.fraunhofer.de/documents/N-171227.html

【文献】 NOLL, G.A. et al.，"Characteristics of artificial forisomes from plants and yeast."，BIOENGINEERED BUGS，２０１１年，Vol.2, No.2，pp.111-114

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つのＳＥＯ−Ｆ（フォリソームによる篩部閉塞）タンパク質と、少なくとも１つの他のタンパク質又はペプチドとから成る融合タンパク質を含む人工フォリソーム体（ただし、全体又は一部が蛍光性融合タンパク質で構成されるフォリソーム体を例外とする。）であって、
前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、４、５、６、７及び８の配列のうちいずれか１つを有するタンパク質から選択されるタンパク質であり、
前記少なくとも１つの他のタンパク質又はペプチドが、酵素、抗体及び抗原から選択され、
前記人工フォリソーム体が下記変更形態（ａ）又は（ｂ）であり、ただし、４つのシステインのうちの任意の数のシステインが、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質のＣ末端側の部分の６００位のアミノ酸と６７０位のアミノ酸との間に存在し、Ｓ−Ｓ架橋結合を形成できないアミノ酸と交換可能である、人工フォリソーム体。
（ａ）前記他のタンパク質又はペプチドは、最大３０ｋＤａの質量を有し、フォリソーム体が、非融合のＳＥＯ−Ｆタンパク質、並びに、Ｃ末端側でアミノ酸最大４５個分が欠失した、及び／もしくはＮ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失したＳＥＯ−Ｆタンパク質の形態を含まないか、又は
（ｂ）フォリソーム体がタンパク質化学的に利用でき、更に、非融合のＳＥＯ−Ｆタンパク質、又は、Ｃ末端側でアミノ酸最大４５個分が欠失した、及び／もしくはＮ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失したＳＥＯ−Ｆタンパク質の形態を含み、前記非融合のＳＥＯ−Ｆタンパク質、又は、Ｃ末端側でアミノ酸最大４５個分が欠失した、及び／もしくはＮ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失したＳＥＯ−Ｆタンパク質の前記形態がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、４、５、６、７及び８の配列のうちいずれか１つを有するタンパク質のうちから選択され、前記非融合ＳＥＯ−Ｆタンパク質が、他のＳＥＯ−Ｆタンパク質の不在時に、ホモマーフォリソーム体を形成することが可能となる特性を有するタンパク質から選択される。

【請求項2】

前記融合タンパク質は、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質のＮ末端側の端部に融合される酵素を含むか、又は、前記融合タンパク質は、薬学的効能を有するか、又はバイオ技術の観点から利用価値があり、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質のＣ末端側の端部に融合されるタンパク質を含む、請求項１記載の人工フォリソーム体。

【請求項3】

少なくとも２つの融合タンパク質を含み、該融合タンパク質が、それぞれ酵素を含むことで、該酵素のうち第１の酵素を用いた基質の転換による生成物が、前記酵素のうち第２の酵素の基質として使用可能である、請求項１又は２に記載の人工フォリソーム体。

【請求項4】

少なくとも１つのＳＥＯ−Ｆ（フォリソームによる篩部閉塞）タンパク質と、少なくとも１つの他の非蛍光性タンパク質又はペプチドとから成るタンパク質化学に有用な特性を有する融合タンパク質をコードした第１のベクターであって、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、４、５、６、７及び８の配列のうちいずれか１つを有するタンパク質から選択されるタンパク質であり、
前記他の非蛍光性タンパク質又はペプチドが、最大３０ｋＤａの質量を有し、酵素、抗体及び抗原から選択される、第１のベクターと、
ＳＥＯ−Ｆタンパク質、又は、Ｃ末端側でアミノ酸最大４５個分が欠失した、及び／又はＮ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失した、前記タンパク質の形態をコードした第２のベクターであって、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質が、その他のＳＥＯ−Ｆタンパク質がない場合、ホモマーフォリソーム体を形成することができる特性を有し、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質、又は、Ｃ末端側でアミノ酸最大４５個分が欠失した、及び／もしくはＮ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失したＳＥＯ−Ｆタンパク質の前記形態がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、４、５、６、７及び８の配列のうちいずれか１つを有するタンパク質のうちから選択される、第２のベクターとを含み、ただし、４つのシステインのうちの任意の数のシステインが、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質のＣ末端側の部分の６００位のアミノ酸と６７０位のアミノ酸との間に存在し、Ｓ−Ｓ架橋結合を形成できないアミノ酸と交換可能である、
植物細胞又は酵母細胞。

【請求項5】

前記融合タンパク質は、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質のＮ末端側の端部に融合される酵素を含むか、又は、前記融合タンパク質は、薬学的効能を有するか、又はバイオ技術の観点から利用価値があり、前記ＳＥＯ−Ｆタンパク質のＣ末端側の端部に融合されるタンパク質を含む、請求項４に記載の植物細胞又は酵母細胞。

【請求項6】

前記ベクター又は第１のベクターが、第１の酵素のアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードし、前記細胞が、第２の酵素のアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする少なくとも１つの他のベクターを含み、前記第１の酵素を用いた基質の転換による生成物は、前記第２の酵素の基質に適していることを特徴とする、請求項４又は５に記載の植物細胞又は酵母細胞。

【請求項7】

請求項１〜３のいずれか一項記載の人工フォリソーム体であって、前記人工フォリソーム体がタンパク質化学に使用される、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質化学で利用可能な特性を有する人工フォリソーム体と、かかる人工フォリソーム体の細胞内での形成及び分離を可能にするベクターの組み合わせを含む植物細胞及び酵母細胞と、ＳＥＯ−Ｆ融合タンパク質をコードするベクターとに関する。

【背景技術】

【0002】

フォリソームは、マメ科植物 (Fabaceae/Leguminosen/ファバーシエ)の篩部にのみ見られる植物タンパク質体（機械的タンパク質）である。フォリソームは、維管束組織の篩部 に位置する。篩部が損傷を受けると、フォリソームは、カルシウム依存性の構造変調の影響を受け、この構造変調において、フォリソームは、液化状態から凝縮・拡散状態に移行し、この凝縮・拡散状態によって、フォリソームは篩管を閉塞し、これによって、貴重な糖分子の流出が防止される。フォリソームは、サイズの大きいコンパクトな束から成る繊維状の基礎構造の中に位置する。フォリソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＡＴＰに応じて、二価カチオン、ｐＨの変化又は電気刺激によって励起され、交互に発生する収縮及び拡張の複数回反復可能なサイクルを引き起こすことが可能である。

【0003】

フォリソームは、数百万のサブユニットから構成される。ここで言うサブユニットとは、その機能に応じて「フォリソームによる篩部閉塞」（“Ｓｉｅｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｂｙ Ｆｏｒｉｓｏｍｅｓ”＝ＳＥＯ−Ｆ）と呼ばれる同族タンパク質である。細菌発現ベクターを用いて、上記の同族タンパク質をコードしたいくつかの遺伝子を発現させる手順は、非特許文献１に記載されている。メディカーゴ・トルンクラータ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃｕｌａｔａ）には少なくとも４つのサブユニット（ＳＥＯ−Ｆ１〜ＳＥＯ−Ｆ４）が存在することは、確実視された（非特許文献２、非特許文献３）。これら４つのサブユニットは全て、現在では配列されており、これらのサブユニットの配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１〜４）を、図１〜４に示した。トンカマメ（Ｄｉｐｔｅｒｙｘ ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）、ミヤコグサ、エンドウ及びソラマメの各種植物のＳＥＯ−Ｆ１タンパク質の配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５〜８）を、図９〜１２に示した。植物においては、異なるＳＥＯ−Ｆタンパク質が凝集して、フォリソームタンパク質体を成す。外部組織（タバコ植物体、酵素）にそれぞれ遺伝子を発現させることで、タルウマゴヤシにおいて、上記のサブユニットのうち２つのみ、すなわちＳＥＯ−Ｆ１及びＳＥＯ−Ｆ４が、それぞれその他のサブユニットの不在時であっても合成されて、ホモマーから成る人工フォリソームをなすことが示された。非特許文献４、非特許文献５参照。これに反して、サブユニットＳＥＯ−Ｆ２は、ホモマーから成る人工フォリソームに自己組織化されることはないが、サブユニットＳＥＯ−Ｆ１ともサブユニットＳＥＯ−Ｆ４と共に凝集し得る。

【0004】

分析の目的で、既に、ＳＥＯ−Ｆ融合タンパク質が生成された。たとえばグンドゥラ・ノルは、非特許文献１によれば、大腸菌における抗体生成の目的で、フォリソーム遺伝子酵素結合を行った。しかし、ここでは、フォリソーム体の生成は認められなかった。Ｈ・Ｃ・ペリシエ（Ｈ・Ｃ・Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒ）他は、非特許文献３において、フォリソームサブユニットと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とから成る融合タンパク質について説明し、この緑色蛍光タンパク質を用いて、融合タンパク質が移植されるトランスジェニック植物において、上記サブユニットとフォリソーム体との関連性を確認することが可能となった。Ｂ・ミュラー他は、非特許文献６において、タルウマゴヤシから得られた遺伝子ＭｔＳＥＯ１〜ＭｔＳＥＯ４の一方と、ビーナス遺伝子とから成る融合タンパク質と、黄色蛍光タンパク質とをコードした４つのベクターについて説明している。融合タンパク質は、ベンサミアナタバコの上皮細胞に発現することが可能である。それぞれＭｔＳＥＯ遺伝子も同時に発現し、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１とＭｔＳＥＯ−Ｆ４の場合には、フォリソーム体に類似しているが、異なる表現型を有するタンパク質複合体が生成される。ＭｔＳＥＯ−Ｆ２とＭｔＳＥＯ−Ｆ３の場合には、同一の実験手法で、細胞質局在性のタンパク質のみが検出される。更に、このような人工フォリソーム体が大量に生成可能であることを証明するために、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１ｖｅｎｕｓとＭｔＳＥＯ−Ｆ４／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１ｖｅｎｕｓの同時発現が酵素中で行われた。加えて、大量の人工フォリソーム体は、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１又はＭｔＳＥＯ−Ｆ４の単独発現によって生成可能である。

【0005】

タンパク質生化学はここ数十年多大な進歩を遂げたが、組換産物として生成されたタンパク質の精製は、極めて困難であった。このような状況は、たとえば、膜結合タンパク質又は毒性タンパク質に当てはまる。まさに、酵素の場合には、酵素の量及び／又は活性が所望の範囲にないという状況がしばしば見られるため、必要な量が原因となって、アッセイその他の費用が並外れて高額になる。組換えタンパク質の発現についても、それ自体としては、問題となり得る。それゆえ、これらのタンパク質の多くは、発現生物内で正しく折り畳まれないか、又は不活性の形態の封止体として細胞内で析出される。生成のもう１つの要件は、多くの場合担体（アガロース、ナイロン）への固定化によって実現される酵素の再利用可能性である。多くの場合、かかる固定化は、酵素活性の大幅な低下を引き起こすため、アッセイその他の費用が並外れて高額になる。特に、ポリクローナル抗体の精製は、通常クロマトグラフ法を用いて行われ、依然として改善が必要な状況である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｇ．Ｎｏｌｌ, Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｃｈａｒａｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ ｄｅｒ Ｆｏｒｉｓｏｍｅ，Ｇｉｅｓｓｅｎ, ２００５．

【非特許文献2】Ｇ．Ｎｏｌｌｅｔ ａｌ.,Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ６５（２００７）, ２８５−２９４

【非特許文献3】Ｈ. Ｃ．Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ），４９（２００８）、１６９９−１７１０

【非特許文献4】Ｇ．Ｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ.,Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂｕｇｓ，２：２（２０１１）, １−４

【非特許文献5】Ｇ．Ｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＆ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ６：１, １５１−１５３

【非特許文献6】Ｂ．Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８９（２０１１）：１６７５−１６８２.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

以上から、本発明は、ここで是正策を創出し、タンパク質として、一方では容認される費用で製造することが可能であり、他方、上記の目的で、上のタンパク質の使用を容易にするか、又は、従来公知で同様の目的で使用されてきたタンパク質その他の材料の使用の際の結果との比較で、上のタンパク質の使用の際の結果を改善する構造又は形状を有するタンパク質を提供するという課題を設定した。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記の課題の解決において、本発明は、改変されたフォリソームを提供することを提案する。このフォリソームは、タンパク質化学の多くの点で、特に、このフォリソームに融合タンパク質の形態で含有される生化学活性を有する構造の形態で、改善及び簡略化をもたらすことを可能にする。融合を介して酵素の機能がフォリソームに導入される場合には、フォリソームが担体として使用可能となり、この担体に酵素が固着されることで、外部マトリックスとの結合が不必要になる。しかし、フォリソームは、たとえば、その精製が容易となる組換えタンパク質の生成との関連で、結合される外来タンパク質の保護機能も有する。外来タンパク質は、フォリソームの形態で容易に分離され、次いで、必要に応じて、適合したプロテアーゼ切断部位及び対応するタンパク質分解酵素を用いて、フォリソームから分離することが可能となる。融合を介して抗原性の構造をフォリソームに導入した場合には、フォリソームそのものが抗体の精製に利用可能となる。更に、本発明の物体は、その接合特性又は構造変調特性の意図的な改変によって、マイクロ工学で役割を果たすことが可能である。

【0009】

従来の研究として、上に引用された、ＳＥＯ−Ｆ遺伝子及びＳＥＯ−Ｆタンパク質の分析との関連での文献において、ＳＥＯ−Ｆ１又はＳＥＯ−Ｆ４タンパク質から成る融合タンパク質に蛍光タグを施したものは、対応する天然タンパク質と共に、フォリソーム体をなす。しかし、本発明の発明者は、任意のタンパク質を含む任意のＳＥＯ−Ｆユニットを含む融合タンパク質から、又はこの融合タンパク質を用いて、フォリソームを生成することは不可能であることを確認する必要があった。にもかかわらず、発明者は、外来タンパク質を用いて、本発明の使用目的に適した人工フォリソーム体を生成するのに成功した。かかるフォリソーム体は、酵素内で発現可能であり、このため、大量のフォリソーム体が提供可能となる。特に、ＳＥＯ−Ｆタンパク質又はそのセグメント、更には、Ｃ末端及びＮ末端が、多数のタンパク質、場合によってはペプチドと結合可能であり、ここで、以下の条件の１つが満たされる限りにおいて、フォリソーム体をなすことが証明された。

【0010】

それゆえ、本発明の課題は、少なくとも１つのＳＥＯ−Ｆタンパク質又は少なくとも５０のアミノ酸を含むＳＥＯ−Ｆタンパク質の少なくとも１つのセグメントと、少なくとも１つの他のタンパク質又はペプチドとから成る融合タンパク質を含む人工フォリソーム体の提供によって解決され、ここで、
（ａ）他のタンパク質又はペプチドが、最大３０ｋＤａ、好ましくは２５ｋＤａの質量を有する、及び／又は
（ｂ）フォリソーム体が、更に、非融合の、多くの場合天然のＳＥＯ−Ｆタンパク質、又は、Ｃ末端側でアミノ酸最大約５０個分、特に最大約４５個分、好ましくは最大４３個分が欠失した、及び／又は、Ｎ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失した、上記のタンパク質の形態を含み、非融合ＳＥＯ−Ｆタンパク質が、他のＳＥＯ−Ｆタンパク質の不在時に、ホモマーフォリソーム体を形成する特性を有するか、又は
（ｃ）他のタンパク質又はペプチドが、第２のＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントであり、その条件として、２つのＳＥＯ−Ｆタンパク質のうちの１つが、非融合の形態では、ホモマーフォリソーム体を形成することが可能であり、融合タンパク質が、Ｎ末端タンパク質セグメントとＣ末端タンパク質セグメントとから成り、２つのタンパク質セグメントの融合が、２つのＳＥＯ−Ｆタンパク質において同一又は略同一な領域に位置し、タンパク質の機能に関連する領域について見ると、同一又は略同一な部位に位置することで、融合タンパク質が、完全なＳＥＯ−Ｆタンパク質となるが、融合タンパク質は、必要に応じて、Ｃ末端側でアミノ酸最大約５０個分、最大約４５個分、好ましくは最大４３個分及び／又は、Ｎ末端側でアミノ酸最大１３個分が欠失することが可能である。

【0011】

もちろん、上記の条件（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のうち二以上を満たすフォリソーム体も、本発明に含まれる。

【0012】

上述の通り、融合タンパク質ＭｔＳＥＯ−Ｆ１ｖｅｎｕｓ及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４ｖｅｎｕｓと、それぞれの天然タンパク質ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１ｖｅｎｕｓ及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４／ＭｔＳＥＯ−Ｆ４ｖｅｎｕｓとの組み合わせから成るフォリソーム体は、先行技術から公知である。かかるフォリソーム体は、本特許の保護の範囲から除外されるべきである。このフォリソーム体は、フォリソーム検出の目的で生成されているが、本発明はこれを目的としておらず、タンパク質化学で発生する特定の問題の解決を目的としている。それゆえ、必要に応じて励起光下で、融合タンパク質が蛍光体である限りにおいて、ＳＥＯ−Ｆタンパク質又はペプチドが、ＧＦＰタンパク質（図１３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９参照）又はビーナスタンパク質（図１４及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０参照）、若しくは、そのセグメント又はその（人工の）修飾体に融合する、融合タンパク質から成るか又はこれを用いて生成されるフォリソーム体は、本特許の保護の範囲には含まれない。融合タンパク質を組み込んだ際に、蛍光性を有するか、又は、化学発光タンパク質のように、その他の方法で視認可能なペプチドを含む構造を有するフォリソーム体も、少なくともこのフォリソーム体が、以下に規定の意味で生化学活性又は生化学活性化能を有する限りにおいて、本発明に含まれることにはならない。最も広義では、必要があれば、この条件は、そのＳＥＯ−Ｆ分子に由来しないタンパク質部分が、所望の融合の存在の確認以外の目的を達成することができないか、又は通常その必要もない融合タンパク質から成るか又はこれを含む全てのフォリソーム体に該当する。もちろん、上記の例外は、上記のフォリソーム体を含有するか、又はかかるフォリソーム体を用いて、本発明の生成物又は対応する融合タンパク質が生成される全ての本発明の生成物にも適用される。

【0013】

本発明は、融合タンパク質から成るフォリソームとして、フォリソームに人工的な生化学活性又は活性化能又は変化を加えた機械的特性を付与するフォリソームを対象とする。それゆえ、他のタンパク質又はペプチドは、人工的な生化学活性又は活性化能を有するタンパク質又はペプチドか、或いは、第２のＳＥＯ−Ｆタンパク質のセグメントから選択される。

【0014】

本発明によれば、「生化学活性又は活性化能を有するタンパク質又はペプチド」という記載は、特に、その生体触媒作用のゆえに、酵素のように、物質転換に使用される全てのタンパク質、免疫反応を引き起こすことが可能であるか、特に抗体及び抗原と同様の薬学的効能を有する全てのタンパク質、外来タンパク質又は外部ペプチドとの結合部位を有する全てのタンパク質又はペプチド、更に、その他のバイオ技術の観点から利用価値のあるタンパク質又はペプチドを含む。本発明によれば、「バイオ技術の観点から利用価値のある」とされるのは、たとえば、その合成が医療用の用途又は診断方法の目的で、重要性を帯びることがある全てのタンパク質又はペプチドである。多くのタンパク質又はペプチドが、基質に結合された生物材料又は生化学的に生成された材料との親和反応が原因で、基質に固定化されることで、再利用可能性を達成する。これらのタンパク質又はペプチドも、本発明によれば、「バイオ技術の観点から利用価値のある」ものに該当する。これに反して、視認可能であり、特に蛍光タンパク質のように、生体触媒作用又は上記の特性のうち、生体触媒作用以外のものが、問題のタンパク質又はペプチドに欠けている場合に、（もっぱら）融合タンパク質の形成の確認に使用されるタンパク質又はペプチドは、上の記載には含まれない。

【0015】

発明者は、通常は、融合タンパク質が他のＳＥＯ−Ｆタンパク質の不在時に、ホモマーフォリソーム体を形成する特性を有する限りにおいて、融合タンパク質が非融合の、たとえば天然のＳＥＯ−Ｆタンパク質と同時発現する場合には常に、フォリソーム体が酵素内で形成されることを確認できた。これに関しては条件（ｂ）参照。これは、ホモマーを形成するＳＥＯ−Ｆが存在することで、組立に関連する構造の数と相違が比較的大きくなることに起因するとすることが可能である。

【0016】

しかし、驚くべきことに、発明者は、上に規定した融合タンパク質が、上記のＳＥＯ−Ｆタンパク質の存在がなくとも、外来タンパク質部分が一定の大きさを超えなければ、フォリソーム体に自己組織化することを確認できた。発明者は、上記の目的で、非ＳＥＯ−Ｆ部分が、最大３０ｋＤａの質量を有することになることを確認した。上記の限界を約２５ｋＤａに設定する（条件（ａ））と一層有利である。上記の方法で得られるフォリソーム体は、若干薄手で繊維質であるが、それでも精製される。

【0017】

人工フォリソームの定義の条件（ｃ）について、ＳＥＯ−Ｆタンパク質に必要な特性を全て有するＳＥＯ−Ｆ融合生成物が、人工的に生成可能であることが確認されたことはすでに述べた。この前提条件は、融合タンパク質の少なくとも一部が、ホモマーフォリソーム体を形成することが可能であるＳＥＯ−Ｆタンパク質に由来することにある。かかるタンパク質においては、構造はいっそう顕著に特徴的なものとなり、この構造が自己組織化、更にはフォリソーム形成に役立つと想定される。ある程度の欠失が、Ｎ末端領域よりもＣ末端領域で際立って発生している可能性があるという上記の可能性は、発明者としては必ずしも固執するつもりはないが、発明者の今のところの見解としては、自己組織化に関連する構造がＮ末端領域には存在しないことに起因する。

【0018】

発明者が発見した可能性である、（ｃ）による条件のもとで、必要に応じてホモマーとして、すなわち、他の、たとえば非融合タンパク質の存在がなくとも、フォリソームに自己組織化する人工的なＳＥＯ−Ｆタンパク質に想到する可能性によって、その自己組織化能が目的に応じて制御される、たとえばこの能力を高めることが可能なフォリソームの生成が開始される。このようにして、かかるフォリソームの機械的特性が、所望の用途に適応可能となる。たとえば、構造変調のために条件（Ｃａ^２＋含量及び／又はｐＨ値及び／又は電気刺激）を変動させることが可能になり、もってフォリソームが、天然のフォリソームでは構造変調を引き起こすことのない条件でも使用可能となる。

【0019】

本発明によれば、融合タンパク質は、Ｃ末端側、すなわち、クローニングベクター及び「アップストリーム」領域でのＤＮＡ読み取りとの関係で、又は、Ｎ末端をなす、すなわち、クローニングベクター及び「ダウンストリーム」領域でのＤＮＡ読み取りとの関係で、他のタンパク質を含む。

【0020】

特別な利点が、本発明によって、以下の分野で得られる。
ａ）酵素の固定化は、工業分野で使用される酵素において利用される。というのは、酵素の固定化は、酵素の再利用可能性という利点と、酵素生成物の不純物の低減をもたらすからである。しかし、酵素の安定性及び酵素活性は、可溶性の酵素の形態と比較した場合、通常は使用される担体によって低減される。従来、酵素の固定化は、多くの場合、酵素の担体への吸着、組み込み、架橋結合又は共有結合によって行われる。固定化法の不都合は、たとえば、吸着及び組み込みの場合には不十分な酵素の固定であり、架橋結合の場合には毒性を有する化学物質の使用であり、共有結合の場合にはアミノ酸の本質をなす官能基の阻害である。担体としては、アクリル樹脂、ハイドロゲル及び珪藻土のような合成ポリマー、ＰＮＩＰＡＭのようなスマートポリマー、又は、アガロース、セルロース、スターチ及びキトサンのようなバイオポリマーが従来使用されてきた。それゆえ、たとえば、アガロース１ｇ当たり１０００〜１７５０単位の活性を有するアガロース粒子に固定化されたグルコース−６−リン酸脱水素酵素が商用に供給されている。酵素の精製、その後の酵素の担体への結合は、２つの別々の作業ステップであり、酵素活性は、固定化の後に、著しく低下させられる。
ｂ）組換えタンパク質の発現は、タンパク質の特性に応じて、問題となることがある。たとえば、毒性タンパク質は、発現生物の生活力に影響を及ぼし、組換えタンパク質の生成量を低下させる。その他のタンパク質は、正しく折り畳まれないか、又は非活性の形態の封止体として、細胞内で析出される。これ以外の問題が、組換えタンパク質の精製の際に発生することがある。それゆえ、たとえば、膜タンパク質の分離が、膜成分との相互作用によって困難となるか、又は、タンパク質が、精製プロセス中に分解される。更に、精製プロセスは、通常極めて費用がかさみ、多くの場合、大量の環境に有害な化学物質の使用なしではすませられない。実際には、精製は、工業的な製法においては、複数のステップに区分される。ここで、作業ステップには、沈殿、ろ過又はクロマトグラフィー法が含まれる。上記の方法において最重要の基準は、精製効率、費用効率、かかる方法の生体内持続性である。たとえば、沈殿は、非常に安価であるが、低い純度しか得られず、大量の化学物質の使用を前提とするが、ろ過又はクロマトグラフィー法は著しく費用がかさむ。この理由から、生成物の一体性を高め、費用を削減し、化学物質の使用を低減する新規の精製方法の開発は、高まる業界の関心の的である。
ｃ）ポリクローナル抗体の獲得は、それぞれの抗原（タンパク質又はペプチド）の動物への注射によって行われる。数週間経つと、ポリクローナル血清が動物の血管から採取可能となる。モノクローナル抗体の獲得のために、形質細胞が脾臓又はリンパ節から分離され、がん細胞と融合され、無菌培養で培養される。複数回分離を行った後、ハイブリドーマ培養に成功し、このハイブリドーマ培養は、単一の細胞に由来し、所望のモノクローナル抗体を分泌する。特に、ポリクローナル抗体においては、モノクローナル抗体の場合よりもまれに、所望の抗体以外にも、有害な抗体（たとえばケラチン抗体）及び／又は検出を妨害する物質（たとえば、使用された抗原に類似するタンパク質又は凝集し検出方法を妨害するタンパク質）が血清中に含まれる。このような物質は、所望の抗体から分離する必要がある。これは、従来クロマトグラフィー法によって実施されてきた。この目的で、抗原は、コラムマトリックスに結合される。その後、マトリックスは、「不純物を含む」抗体溶液でインキュベートされ、こうして、特異的な抗体が抗原更にはマトリックスに結合することが可能となる。マトリックスが洗浄された後に、抗体がコラムから溶離される（たとえば、酸性を示すｐＨ値の溶液によって）。この手間のかかる方法の単純化と、効率の向上は、大いに必要とされる。
ｄ）しかし、本発明の利点は、外来タンパク質の生成及び特性にとどまらない。フォリソームそのものの分野でも、かかる利点は、有利に利用可能である。上述した通り、フォリソームは、カルシウムに起因するか、又はｐＨ依存性の構造変調のために、制御モジュールとしてマイクロ流体システム内で使用可能である機械的タンパク質である。それゆえ、Ａ. Ｑ. Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ., Ｓｍａｒｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）』２（２００６），２２５−２３５及びＫ. Ｕｈｌｉｇ ｅｔ ａｌ., Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ １７（２００８），１３２２−１３２８は、マイクロ流路中の蛍光粒子の流れが、一体化されたフォリソームによって制御されることを証明した。しかし、意図的且つ持続的なフォリソームの固定は、従来はもっぱら手動で、マイクロ操作技術を用いて、且つ極めて大量の時間及び労力の消費のもとで可能であった。それゆえ、シェン他及びウルリッヒ他（上掲論文）によって、天然のガラスの接着力が利用された。ここで、フォリソームは、表面に押しつけられた場合には、この表面に固定される。しかし、かかる接着力は、液体の流れ中でのフォリソームの固定を保証するものではない。更に、フォリソームが表面に接着した場合には、フォリソームの反応強度が低下する（Ｇ．Ｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂｕｇｓ，２：２（２０１１），１１１−１１４）。

【0021】

その構造変調特性が、所定の刺激の影響のもとで変化する（たとえば、異なるｐＨ値又は異なるＣａ^２＋濃度における、液化状態から拡散状態、又はその逆への移行によって）フォリソームの提供も期待される。

【0022】

本発明の発明者は、上記の領域のうち４つ全てにおける利点が得られる材料を提供することに成功した。ここで、多くの場合、融合タンパク質の発現は、他のタンパク質サブユニットの存在とは無関係にホモマーを形成可能であるフォリソームタンパク質の同時発現が、同一の細胞内で発生した場合に、可能となる。これに反して、融合タンパク質の発現は、小型の外来タンパク質の使用時に、利用価値のある生成物をもたらすが、他方、その他の場合には、フォリソーム体が全く形成されず、可溶性の形態のタンパク質が存在するか、又は「封止体」が細胞内に堆積する。

【0023】

融合タンパク質とホモマーフォリソーム体をなすＳＥＯ−Ｆサブユニットとの同時発現が行われる、及び／又は融合タンパク質が、小型の外来タンパク質サブユニットを伴って発現した場合には、植物又は酵素において、安定したフォリソーム体が発現され、このフォリソーム体は、外来タンパク質又はペプチドの存在にもかかわらず、略天然フォリソームの形状を有する。それゆえ、本発明は、個別にモジュール化可能で、機能性の人工フォリソームを生成する可能性をもたらす。この点が驚くべきであるのみならず、特に、ここで、フォリソーム体の自己組織化が、外来タンパク質の機能効果を妨害しないという確認も、驚くべきである。酵素と融合したＳＥＯ−Ｆサブユニットを例に、フォリソーム体が、商用の固定化担体と比較して、外来タンパク質の活性を、低い強度で低下させることが証明可能となったが、この点は、全ての融合タンパク質について想定可能ではあったが、一連のそれ以外のタンパク質においては、定量的な比較の可能性がないことから、確認されてはいなかった。

【0024】

ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４の使用は特に好ましい。しかし、他の供給源由来のＳＥＯ−Ｆサブユニットも同様に使用される。

【0025】

それぞれの天然のＳＥＯ−Ｆサブユニットの鎖全体が、融合タンパク質内に存在することが確認可能であった。これに代えて、ＳＥＯ−Ｆサブユニットの鎖の、必要に応じて比較的小さい一部分でも、たとえば、約６０〜２５０の長さの領域でも十分であることが、発明者が蛍光タンパク質との融合を用いて確認可能となった。この点は、ＳＥＯ−Ｆ１又はＳＥＯ−Ｆ４のように、ホモマーをなすタンパク質の存在が、外来タンパク質が一定量を上回った場合にフォリソームが形成されるか否か決定する。

【0026】

融合タンパク質のＳＥＯ−Ｆ成分は、全てのＳＥＯ−Ｆサブユニットに由来するとすることが可能である。好ましくはＳＥＯ−Ｆ１、ＳＥＯ−Ｆ２及びＳＥＯ−Ｆ４に由来し、特に、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、ＭｔＳＥＯ−Ｆ２及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４に由来する。

【0027】

同時発現した非融合ＳＥＯ−Ｆタンパク質が存在する限りにおいては、フォリソームの形成を確保するために、略完全又は少なくともその大部分が完全なものとなる必要がある。しかし、発明者は、それぞれのサブユニットの鎖全体が存在する必要があることについては確認していない。Ｎ末端の少なくとも最大１３のアミノ酸及び／又はＣ末端の少なくとも最大４３のアミノ酸、必要に応じて最大４５のアミノ酸、可能であれば、最大５０のアミノ酸の欠失が、本発明のフォリソーム体が影響を受けない範囲で、許容可能である。

【0028】

本発明のフォリソーム体は、任意の数のサブユニットから構成可能である。通常は、融合タンパク質１種との組み合わせでの非融合ＳＥＯ−Ｆサブユニット１種か、又は、融合タンパク質の外来タンパク質部が上記の大きさを上回らなければ、融合タンパク質１種のみでも十分である。フォリソーム体は、通常、約１０^６〜１０^７の個別のタンパク質鎖から成り、必要に応じて、非融合ＳＥＯ−Ｆサブユニットの数と融合タンパク質の数の比が、外来タンパク質の種類と大きさに応じて、約４：１〜１：１の範囲となる。

【0029】

本発明の個々のフォリソーム体は、通常、１種類の融合タンパク質のみを含む。しかし、このフォリソーム体は、複数の異なる融合タンパク質を含むことがある。この点についての特異的且つ特に好適な例は、以下の第１）項において説明される。

【0030】

各フォリソームサブユニットが天然の供給源に由来することは、本発明には何の役割も持たない。本発明のフォリソーム体は、トンカマメ（Ｄｉｐｔｅｒｙｘ ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ、ソラマメ、ナタマメ及びミヤコグサに由来するＳＥＯ−Ｆ遺伝子を用いて生成される。ここから、本発明によれば、マメ科の全ての植物の対応する遺伝子が使用可能であることが推論される。更に、遺伝子組換え又は合成ＳＥＯ−Ｆ遺伝子又はフォリソームサブユニットも、少なくとも、上記の植物の属する科で保存されている領域が維持されているか又は存在している限りにおいては、使用可能である。

【0031】

異なるフォリソームサブユニットのアミノ酸配列における４つのシステインの順番が、かかるフォリソームサブユニットの構造及び安定性に、多大な影響を及ぼすと、長きにわたって仮定されてきた。上記のシステインは、３つのフォリソームサブユニット全てにおいて、アミノ酸配列のＣ末端部（６００位以降）、特に、ＣＰＮＰＸＣＧＲＶＭＥＶＸＳＸＸＹＫＣＣ（Ｘは、変更可能なアミノ酸を示す）という高度保存モチーフに位置する。このモチーフは、全てのＳＥＯ−Ｆ遺伝子において（すなわち、他の植物の科におけるＳＥＯ−Ｆ遺伝子においても）、高度に保存される。対応するシークエンスロゴは、図５に示した。しかし、発明者は、この部位の存在がフォリソーム形成に本質的ではないことを証明することが可能であった。というのは、同時発現した非融合ＳＥＯ−Ｆ又は２つのＳＥＯ−Ｆ成分から成る融合タンパク質として、ＳＥＯ−Ｆタンパク質を使用することが可能であり、Ｃ末端が最大４３のアミノ酸、必要に応じて最大４５のアミノ酸、又は、最大５０のアミノ酸分だけ短縮され、ここで本発明のタンパク質鎖の自己組織化特性は失われない。ＳＥＯ−Ｆ１又はＳＥＯ−Ｆ４が、全長にわたって、又は、上記の保存モチーフの一部又は全体が存在する配列長で使用される場合には、上記のシステインが、明らかに無視できない役割を帯びる。特に、上記のシステインが、「部位特異的突然変異」を用いて、一部又は全体が、ジスルフィド架橋形成を実現しないアミノ酸に置換され、このアミノ酸は、たとえばグリシン又はアラニンのように、上記のシステインのうち最後の２つ（シークエンスロゴではシステインＣ２１及びＣ２２）が変異した場合、タンパク質フィブリルが他の場合にはフォリソーム体に自己組織化しないような形で、フォリソーム体の構造状態を変化させることが証明された。それゆえ、理論の制約を受けようとするのでない限り、２つのフォリソームサブユニットの上記のシステインの間のジスルフィド架橋がタンパク質フィブリルの秩序立った自己組織化に起因することは想定できない。これに反して、上記のシステインのうち最初の２つ（シークエンスロゴではシステインＣ３及びＣ８）のうち、少なくとも１つが変異した場合、そのシステインの発現の後、典型的なフォリソーム体が形成されるが、このフォリソーム体は、カルシウムイオン及びＮａＨＳＯ_３の添加後に完全に溶解する。カルシウムがタンパク質フィブリルの反発作用を引き起こし、ＮａＨＳＯ_３の添加が、その後も残存するジスルフィド架橋を溶解する。それゆえ、システインＣ３及びＣ８が、個々のサブユニットの結合による繊維形成に関与していると想定され、それゆえ、タンパク質が、その変異後に、その可溶性の形状に転移することが可能になる。

【0032】

繊維体は有利な特性を有することが可能で、本発明に含まれている。それゆえ、「人工フォリソーム」という表現は、本発明で使用される場合には、本発明の少なくとも１つの実施形態において、上記のファイバーネットワークも含める。

【0033】

特に有利なものは、上記の可溶性のフォリソーム体である。というのは、このフォリソーム体によって、以下の例に示した通り、タンパク質の精製が容易になるためである。

【0034】

フォリソーム体の生成は、上述のとおり、好ましくは植物細胞又は酵母細胞で行われ、酵母細胞の使用が特に有利である。というのは、酵母細胞の使用が大量の人工フォリソーム体の生成を可能にするからである。それゆえ、本発明は、これに応じて形質転換された細胞を対象とする。そして最後に、本発明は、これを用いて本発明のフォリソーム体が生成可能となる、新規のベクター構造体を含む。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】メディカーゴ・トルンクラータのサブユニット（ＳＥＯ−Ｆ１）の配列を示す。

【図2】メディカーゴ・トルンクラータのサブユニット（ＳＥＯ−Ｆ２）の配列を示す。

【図3】メディカーゴ・トルンクラータのサブユニット（ＳＥＯ−Ｆ３）の配列を示す。

【図4】メディカーゴ・トルンクラータのサブユニット（ＳＥＯ−Ｆ４）の配列を示す。

【図5】シークエンスロゴを示す。

【図6】ＳＥＯ−Ｆ１及びＳＥＯ−Ｆ２に由来する本発明のフォリソーム体に結合されるグルコース−６−リン酸脱水素酵素の酵素活性試験を示す。

【図7】フォリソーム体ＳＥＯ−Ｆ１及びＳＥＯ−Ｆ４を用いたＭＳＰ１_１９の精製を示す。

【図8】人工フォリソームの固定化のための、ＩｇＧ抗体とＢドメインとの相互作用の利用を示す。

【図9】トンカマメのＳＥＯ−Ｆ１タンパク質の配列を示す。

【図10】ミヤコグサのＳＥＯ−Ｆ１タンパク質の配列を示す。

【図11】エンドウのＳＥＯ−Ｆ１タンパク質の配列を示す。

【図12】ソラマメのＳＥＯ−Ｆ１タンパク質の配列を示す。

【図13】ＧＦＰタンパク質の配列を示す。

【図14】ビーナスタンパク質の配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0036】

以下において、本発明は、複数の例を用いて詳細に説明され、この例は、一方では本発明の適用可能性の範囲を示し、他方では、これを用いれば当業者が本発明を実施することが可能になる、個々の措置を具体的に示している。それゆえ、上記の例が限定的なものと理解されてはならないことは明白であるはずである。

【0037】

１） 酵素結合された融合タンパク質を含むフォリソーム体
酵素とＳＥＯ−Ｆタンパク質との結合によって、人工フォリソームに、酵素の担体として使用されるという形で機能が加えられる。酵素は、このようにして固定化することが可能になる。ここで、酵素結合されたフォリソームは、酵素と融合された、必要に応じて短縮された第１のＳＥＯ−Ｆサブユニットと、必要に応じて、必要があれば又は要請に応じて、上記のとおり欠失することが可能であるＳＥＯ−Ｆ１とＳＥＯ−Ｆ４とのうちから選択される第２のＳＥＯ−Ｆユニットとから成る。融合タンパク質は、Ｃ末端又はＮ末端側で、融合酵素を担持することが可能である。酵素結合されたフォリソームは、酵素（たとえばサッカロマイセス・セレビシエ）、細菌（たとえば大腸菌）又は植物（たとえばタバコ）のような、目的に適した発現生物における同時発現によって生成される。酵素における（同時）発現が特に好ましい。発生した酵素結合されたフォリソームは、高い安定性で際立っている。このフォリソームは、発現生物から単離され（たとえば酵母細胞の分解によって）、たとえば、遠心分離法／密度勾配遠心分離法によって、細胞成分から分離される。グルコース−６−リン酸脱水素酵素をフォリソームサブユニットのＮ末端に融合される酵素とすると、市販品として入手可能な固定化された酵素と比較して明らかに高い酵素活性が測定可能となる（フォリソーム１ｇ当たり２７００単位に対して、アガロース１ｇ当たり１０００〜１７５０単位。図４参照）。ここで、酵素が、直接固定化された形態で、生成生物から単離可能となり、これによって、担体結合ステップの分だけ、酵素生成が減少する。これは、作業の簡素化に相当するのみならず、明白且つ驚くべき形で外的要因による活性の上昇をもたらす。ヘキソキナーゼとホスホグルコイソメラーゼとを用いて同様の方法で生成された融合タンパク質は、同様の結果をもたらした。

【0038】

同時発現が１種類にとどまらず、２種類以上の融合タンパク質を用いて行われ、融合パートナーが、第１の酵素の反応生成物が、第２の酵素の基質として使用され、第２の酵素の反応生成物が、必要に応じて第３の酵素の基質として使用されるか、又は反応複合体が生成され、この反応複合体上で、一定の反応連鎖が発生する。

【0039】

融合タンパク質において、酵素はＳＥＯ−Ｆタンパク質のＣ末端にも結合した状態で存在することが可能である。

【0040】

２） 組換えタンパク質の精製
上述の通り、本発明の人工フォリソーム体は、組換えタンパク質の精製系として利用される。ここで、組換えタンパク質は、ＳＥＯ−Ｆサブユニットに結合され、融合タンパク質は、必要に応じて、第２のＳＥＯ−Ｆサブユニットと同時発現し、第２のＳＥＯ−Ｆサブユニットは、上述の通り、たとえば酵母細胞又は植物細胞において、他のサブユニットの不在時にホモマーを成すことが可能である。組換えタンパク質は、融合タンパク質のＣ末端又はＮ末端側に存在し、必要があれば、プロテアーゼ制限部位を備えることで、精製に続いて、外来タンパク質のフォリソーム体からの分離を確保することが可能である。得られた人工フォリソーム体の単離と精製は、細胞分解更には、たとえば遠心分離法／密度勾配遠心分離法を用いて行われる。この代わりに、タンパク質ポリマーが、特に、上記のＣ末端側に保存されたシステインの一又は複数の変異の後に、高いＣａ^２＋濃度（＜２ｍＭ）又は高いＣａ^２＋濃度（＜２ｍＭ）と還元条件（＞１８．５μＭのＮａＨＳＯ_３）との組み合わせを用いて、ポリマーの固体状態から可溶状態に転移することが可能となる。こうして、フォリソーム技術が、沈殿、ろ過及びクロマトグラフィー法という従来の方法と完全に決別し、この代わりに遠心分離法及びタンパク質の構造状態に依拠した完全に新規の精製系を提供する。この技術に基づいて、多数のタンパク質のタンパク質精製が容易になり、且つ安価となることが可能となった。更に、上記の精製系は、精製されるタンパク質の毒性作用又は膜相互作用が、フォリソーム結合によって軽減されるか又は阻止されるという利点を有する。それゆえ、たとえばマラリア抗原ＭＳＰ１_１９については、その精製がその強力な膜相互作用によって、他の方法では極めて困難であったが、このマラリア抗原も本発明を用いて、首尾よく精製された。この点は、図７に示す抗原の免疫学的検出を用いて証明された。

【0041】

３） 抗体の精製
本発明は、人工フォリソームを用いてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の精製を実施し、もって従来のクロマトグラフィー法による分離ステップを回避することを可能にする。この目的で、抗原は、上記の方法を用いて、フォリソーム遺伝子（上に定義された通り、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、ＭｔＳＥＯ−Ｆ２又はＭｔＳＥＯ−Ｆ４又はそのセグメント）のアップストリーム又はダウンストリーム領域でクローニングされる。次いで、抗原・ＭｔＳＥＯ−Ｆ間の融合が、必要に応じてＣ末端側及び／又はＮ末端側で最大１３個のアミノ酸が欠失したＭｔＳＥＯ−Ｆ１及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４と共に、酵素において発現する。ここで、酵素内で、抗原を含む人工フォリソームが形成される。

【0042】

酵素は培養され、遠心分離され、分解される。ここで、抗原を担持する人工フォリソームは、遊離した状態で溶液中に存在し、以下において、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の精製に利用可能となる。

【0043】

抗原を含む人工フォリソームは、抗体血清によってインキュベートされる。ここで、特異的な抗体が人工フォリソームに結合される。フォリソームは遠心分離され、洗浄され、次いで、抗体がｐＨシフトを用いて溶離される。その後、抗体溶液は中和され、さまざまな用途（ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ免疫沈降、抗体療法その他）に利用可能となる。

【0044】

４） フォリソーム特性の改変
本発明を用いて、フォリソームは、新規の、技術的に有益な特性を獲得するように改変される。たとえば、フォリソームの表面への接着力は、フォリソームがタンパク質又は（タンパク質又はペプチドの）タグと融合されたＳＥＯ−Ｆサブユニットを含有するとすることで改善される。こうして、フォリソームは、マイクロ流路内に配置され、固定化される。この例となるのは、黄色ブドウ球菌タンパク質Ａ由来Ｂドメイン、グルタチオン−Ｓ−転移酵素ビオチン又はビオチンとの融合であって、これらによって、生成生物内で生成され、次いで単離された人工フォリソームの表面機能の獲得が、かかる人工フォリソームが、共有結合を介して、ＩｇＧ、グルタチオン又はストレプトアビジンでコーティングされた表面に結合することが可能となるような形で実現される。更に、他のサブユニットの不在時にはホモマーを形成可能であるＳＥＯ−Ｆサブユニットと、融合タンパク質との同時発現が行われるか、又は発現産物中の外来タンパク質部が過度に大きくない場合に、安定したフォリソームが得られる。こうして、機械的タンパク質体として利用されるフォリソームの表面上又はマイクロ流路中の配置に関連する問題が排除される。外来タンパク質との融合に代えて他のＳＥＯ−Ｆタンパク質との融合が行われれば、その構造変調特性が、Ｃａ^２＋濃度及びｐＨ値の影響下で変動する機械的タンパク質体が得られる。

【0045】

以下の具体的な実施例は、本発明の理解を更に深めるためのものである。

【実施例】

【0046】

例１−人工フォリソームでの酵素の固定化
Ｉ． フォリソーム遺伝子ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、ＭｔＳＥＯ−Ｆ２又はＭｔＳＥＯ−Ｆ４は、翻訳終止コドンの有無にかかわらず、以下のオリゴヌクレオチドを有するタルウマゴヤシｃＤＮＡに基づいて増幅された（制限部位には下線を引いた）。
MtSEO-F1 fw NcoI: 5’-AGA ACC ATG GGA TCA TTG TCC AAT GGA ACT AAA C-3’
MtSEO-F1 rev XhoI with stop codon: 5’-AGA CTC GAG TCA TAT CTT GCC ATT CTG TGG AGC-3’
MtSEO-F1 rev XhoI without stop codon: 5’-AGA CTC GAG CAT ATC TTG CCA TTC TGT GGA GC-3’
MtSEO-F2 fw NcoI: 5’-AGA ACC ATG GGA TCC ACT GCA TTG TCC TAT AAT G-3’
MtSEO-F2 rev XhoI with stop codon: 5’-AGA CTC GAG TCA AAT GCA GCA ACT ATC TGG-3’
MtSEO-F2 rev XhoI without stop codon: 5’-AGA CTC GAG ATG CAG CAA CTA TCT GGA-3’
MtSEO-F4 fw NcoI: 5’- AGA ACC ATG GGA TCC CTT TCC AAC TTA GGA AG-3’
MtSEO-F4 rev XhoI with stop codon: 5’-AGA CTC GAG TCA AAC ACC AAG ATT GTT TGG-3’
MtSEO-F4 rev XhoI without stop codon: 5’- AGA CTC GAG ACA CCA AGA TTG TTT GGT TC-3’

【0047】

増幅産物は、制限酵素ＮｃｏＩ/ＸｈｏＩで制限され、ｐＥＮＴＲ４^ＴＭベクター（インビトロジェン社、独国）の対応する切断部位にクローニングされた。こうして、ｐＥＮＴＲ４^ＴＭ−ＭｔＳＥＯ−Ｆベクターが、翻訳終止コドンの有無にかかわらず生成された。

【0048】

ＩＩ． サッカロマイセス・セレビシエ由来の酵素ヘキソキナーゼ２（ＨＸＫ２）、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）の遺伝子は、以下のオリゴヌクレオチドを有するｃＤＮＡに基づいて増幅された（制限部位には下線を引いた）。
G6PDH fw XhoI: 5’-AGA CTC GAG AAT GAG TGA AGG CCC CGT C-3’
G6PDH rev XhoI: 5’- AGACTCGAGCTAATTATCCTTCGTATCTTC
HXK2 fw XhoI: 5’-AGACTCGAGAATGGTTCATTTAGGTCCAAA
HXK2 bw XhoI: 5’-AGACTCGAGTTAAGCACCGATGATACCA
PGI XhoI fw: 5’-AGACTCGAGAATGTCCAATAACTCATTCAC
PGI XhoI rev: 5’- AGACTCGAGATCACATCCATTCCTTGAATTG
Invertase XhoI fw: 5’-AGACTCGAGAGCATCAATGACAAACGAAAC
Invertase XhoI rev: 5’- AGACTCGAGCTATTTTACTTCCCTTACTTGG

【0049】

増幅産物は、制限酵素ＮｃｏＩ/ＸｈｏＩで制限され、翻訳終止コドンなしのｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆベクターの対応する切断部位にクローニングした（ａ）Ｉ．参照）。こうして、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−Ｇ６ＰＤＨ、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−Ｇ６ＰＤＨ、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−Ｇ６ＰＤＨ、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＨＸＫ２、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＨＸＫ２、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−ＨＸＫ２、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＰＧＩ、ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＰＧＩ及びｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−ＰＧＩの各ベクターが得られた。

【0050】

ＩＩＩ． 翻訳終止コドンを有するｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及び翻訳終止コドンを有するｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４の各ベクターは、酵母ベクター４２５ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）に組み換えられた。結果として得られた発現構築物４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及び４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４が、酵母株ＩｎｖＳｃ１（インビトロジェン社、独国）に形質転換された。選択のために、酵母株のロイシン栄養要求性の相補が利用された。結果として得られた酵母が、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１又はＭｔＳＥＯ−Ｆ４から人工フォリソームを生成し、この人工フォリソームが、酵素結合の基礎として使用される。

【0051】

ＩＶ． 上記のＭｔＳＥＯ−Ｆ・酵素間の融合（１．ＩＩ参照）を伴うｐＥＮＴＲ４ベクターは、酵母ベクター４２５ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）によって組み換えられた。結果として得られたベクター（４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−Ｇ６ＰＤＨ、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−Ｇ６ＰＤＨ、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−Ｇ６ＰＤＨ、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＨＸＫ２、４２４ＧＰＤ-ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＨＸＫ２、４２４ＧＰＤ -ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−ＨＸＫ２、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＰＧＩ、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＰＧＩ、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−ＰＧＩ）は、酵母に形質転換され、この酵母は、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１又はＭｔＳＥＯ−Ｆ４から成る人工フォリソームの生成のために、プラスミドを得ている（ａ）ＩＩＩ参照）。それゆえ、結果として得られた二重変異体（たとえば、４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−Ｇ６ＰＤＨ）は、ロイシン栄養要求性又はトリプトファン栄養要求性との関連で相補される。

【0052】

Ｖ． 酵素結合フォリソームを生成する（ａ）Ｉ〜ＩＶ参照）発現酵母は、ＯＤ６００ｎｍが５〜７の範囲までは、５０ｍＬの規模で培養され、遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）を用いて回収される。酵母ペレットは、５０ｍＬのＶ培地（１０ ｍＭのＴＲＩＳ、 １０ ｍＭのＥＤＴＡ、 １００ ｍＭのＫＣｌ、 ｐＨ ７．４）で洗浄され、再度遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）を行った後、−２０℃で凍結される。凍結された酵母ペレットは、１ｍＬのＶ培地で再懸濁され、約５００ｍｇ（４２５〜６００μｍ）のガラスビーズで移し替える。細胞の分解は、１．５ｍＬの容器中で、ミキサーミルＭＭ４００（レッチ、独国）内で３０Ｈｚの周波数で行われる。次いで、人工フォリソームが、不溶性の細胞成分と共に遠心分離され、０．５ｍＬのＶ培地で再懸濁される。次いでこの溶液が、スクロース又はナイコデンツによる密度勾配にかけられ、ここで、スクロース又はナイコデンツの濃度は、４０％〜７０％の勾配で増加する。この勾配が、ベックマン超遠心分離機を用いて、１６３，０００×ｇ、４℃の条件で、３時間遠心分離された。

【0053】

その後、勾配中のフォリソーム含有相は、ピペットを用いて収集され、Ｖ培地を用いて１：２に希釈され、２つの等量のアリコートに分けられる。アリコートは１０分間１００×ｇで遠心分離され、上清が除去された。第１のアリコートのフォリソームは、次いで５０μＬのＶ培地に加えられ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いた酵素結合した人工フォリソームの質量・濃度測定に使用された。第２のアリコートは、５０μＬの酵素緩衝液に加えられた（Ｇ６ＰＤＨに結合したフォリソーム用：２５０ｍＭグリシルグリシン緩衝液、ｐＨ７．４；ＨＸＫ２に結合したフォリソーム用：１３．３ｍＭのＭｇＣｌ_２を加えた０．０５Ｍｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８；ＰＧＩに結合したフォリソーム用：２５０ｍＭグリシルグリシン緩衝液、ｐＨ７．４）。このアリコートは、特異的酵素アッセイを用いた、フォリソームに結合した酵素の活性の測定に使用された。

【0054】

ＶＩ． 酵素結合した人工フォリソーム（ａ）ＩＶ参照）は、その質量及び濃度に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検証された。ここで、酵素結合した人工フォリソームが構成される元となるフォリソームタンパク質（たとえば、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及びＭｔＳＥＯ−Ｆ２酵素融合タンパク質）が分離された。個々のタンパク質の存在は、生物情報から予測された質量（たとえば、ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−Ｇ６ＰＤＨ＝１２４．７キロダルトン）と、ゲル中の実際の質量（ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−Ｇ６ＰＤＨ＝約１３０ｋＤａ）と比較することで確認される。タンパク質の濃度測定は、規定されたタンパク質の量の標準系列を追加で加えたものを用いるか、又はタンパク質マーカ、プレシジョンＰｌｕｓプロテイン未着色スタンダード（バイオラッド社）を用いて行われる。５０ｍＬの発現培養物から、選択されたフォリソームタンパク質及び酵素融合に応じて、タンパク質の総量（個々のＭｔＳＥＯ−Ｆタンパク質＋ＭｔＳＥＯ−Ｆ酵素融合）５６〜１２４μｇ分の酵素結合した人工フォリソームが得られる。ここで、タンパク質の総含有量に占めるＭｔＳＥＯ−Ｆ酵素融合の割合は、融合パートナーに応じて、１０％〜５０％となる。タンパク質総量（５０ｍＬの発現培養物当たり１２４μｇ）においても、酵素融合タンパク質（５０ｍＬの発現培養物当たり３７μｇ）においても、最大量は、ＰＧＩに結合した酵素フォリソーム（ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＰＧＩ）の生成時に得られた。

【0055】

フォリソームによって固定化された酵素の活性は、特異的分光光度測定用酵素アッセイを用いて測定された。グルコース−６−リン酸脱水素酵素については、シグマ・アルトリッチ社（独国）の推奨プロトコルが使用された。アッセイは、Ｇ６ＰＤＨに触媒された、グルコース−６−リン酸の６−ホスホグルコノラクトンへの変換に依拠している。この反応の際に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）が、以下の通り、ＮＡＤＰＨに還元される。

【化1】

【0056】

３４０ｎｍの波長域におけるＮＡＤＰＨの消失は、分光光度測定によって測定可能であり、この消失を用いて、酵素活性が計算可能となる。アッセイのために、第２のアリコート（ａ）Ｖ参照）から精製された酵素フォリソームが使用される。酵素結合されたフォリソームの算出された濃度を用いて、人工フォリソーム１グラム当たりで測定された酵素活性が計算可能である。構造物（ａ）ＩＩＩ参照）に応じて、フォリソームによって固定化されたグルコース−６−リン酸脱水素酵素については、人工フォリソーム１グラム当たり２０００〜２７００単位の活性が得られた。これに比較して、シグマ・アルトリッチ社（独国）によって市販品として入手可能となった固定化されたグルコース−６−リン酸脱水素酵素では、アガロース１グラム当たり１０００〜１７５０単位の活性しか得られなかった。それゆえ、本発明のグルコース−６−リン酸脱水素酵素は、明らかにより高い特異的酵素活性（担体の量に対する酵素活性）を有する。図６は、ＳＥＯ−Ｆ１及びＳＥＯ−Ｆ２に由来する本発明のフォリソーム体に結合されるグルコース−６−リン酸脱水素酵素の酵素活性試験を示す。

【0057】

フォリソームによって固定化されたヘキソキナーゼ２及びホスホグルコイソメラーゼの活性も、同様のアッセイ原理に基づいて測定された。ここでは、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＰＨの吸光増加を用いて酵素活性を測定するために、相前後して推移する２つの酵素反応のみが利用された。ヘキソキナーゼ２については、ワーシントン社（レークウッド、ニュージャージー州、米国）の推奨プロトコルが使用され、このプロトコルの基礎は、以下に示す反応である。

【化2】

【0058】

２番目の反応に必要とされたグルコース−６−リン酸脱水素酵素は、本アッセイのアプローチに、市販品として入手可能な、可溶性の酵素として所定の活性を有するものの形で添加された。構造物（ａ）ＩＩＩ参照）に応じて、フォリソームによって固定化されたヘキソキナーゼ２については、人工フォリソーム１グラム当たり６０００〜８０００単位の活性が得られた。これに対して、シグマ・アルトリッチ社の提供するアガロースによって固定化されたヘキソキナーゼについては、わずか５０〜７５単位の活性しか得られなかった。

【0059】

ホスホグルコイソメラーゼについては、シグマ・アルトリッチ社（独国）の推奨プロトコルが使用され、このプロトコルの基礎は、以下に示す反応である。

【化3】

【0060】

構造物（ａ）ＩＩＩ参照）に応じて、フォリソームによって固定化されたホスホグルコイソメラーゼについては、人工フォリソーム１グラム当たり６０００〜８０００単位の活性が得られた。これに対して、シグマ・アルトリッチ社の提供するアガロースによって固定化されたヘキソキナーゼについては、わずか３００〜６００単位の活性しか得られなかった。

【0061】

例２−タンパク質の精製
２．１ａ 未変異のフォリソーム遺伝子を用いるか、又は未変異のフォリソーム遺伝子の不在時の組換えタンパク質の精製
Ｉ． マラリア表面抗原ＭＳＰの断片（ＭＳＰ１_１９）のコードされた配列は、以下のオリゴヌクレオチドを有するベクターに基づいて増幅された（制限部位には下線を引いた）。
MSP1₁₉ NcoI fw: 5’- AGACCATGGACCTGCGTATTTCTCAG-3’
MSP1₁₉ NcoI FaXa rev: 5’- AGACCATGGTACGACCTTCGATCCTGCATATAGAAATGCC-3’
MSP1₁₉ XhoI FaXa fw: 5’- AGACTCGAGAATCGAAGGTCGTGACCTGCGTATTTCTCAG-3’
MSP1₁₉ XbaI rev: 5’- AGATCTAGATCACCTGCATATAGAAATG-3’

【0062】

プライマーＭＳＰ１_１９ＮｃｏＩ ＦａＸａ ｒｅｖ及びＭＳＰ１_１９ ＸｈｏＩ ＦａＸａ ｆｗは、遺伝子特異的な配列に加えて、プロテアーゼ因子Ｘａの認識部位（斜体にて表記）を含んでいる。第１の増幅産物は、制限酵素ＮｃｏＩで処理され、終止コドンを有するベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、終止コドンを有するベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２及び終止コドンを有するベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４それぞれのＮｃｏＩ切断部位においてクローニングされる（ａ）Ｉ参照）ことで、ベクターｐＥＮＴＲ４− ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、 ｐＥＮＴＲ４− ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２及びｐＥＮＴＲ４− ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４を得る。第２の増幅産物−Ｍｔは、制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａＩで処理され、終止コドンなしのベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、終止コドンなしのベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２及び終止コドンなしのベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４それぞれのＸｈｏＩ／ＸｂａＩ切断部位においてクローニングされる（ａ）Ｉ参照）ことで、ベクターｐＥＮＴＲ４ＳＥＯ−Ｆ１− ＭＳＰ１_１９、 ｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２− ＭＳＰ１_１９及びｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４− ＭＳＰ１_１９を得る。発現ベクター４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２、４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＭＳＰ１_１９、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＭＳＰ１_１９及び４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−ＭＳＰ１_１９の生成のために、生成されたベクターは、酵母ベクター４２４ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）によって組み換えられた。

【0063】

ＩＩ． ベクター４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４及び４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−ＭＳＰ１_１９が、酵母株ＩｎｖＳｃ１（インビトロジェン社、独国）に形質転換された。選択のために、酵母株のトリプトファン栄養要求性の相補が利用された。ＭＳＰ１_１９及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４から成る融合タンパク質が、他のＭｔＳＥＯ−Ｆタンパク質のこれ以上の発現を伴わずに、フォリソームを形成する。

【0064】

ベクター４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２、 ４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＭＳＰ１_１９及び４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ２−ＭＳＰ１_１９は、酵母に形質転換され、この酵母は、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１から成る人工フォリソームの生成のために、プラスミド（４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）を得ている（ａ）ＩＩＩ参照）。それゆえ、結果として得られた酵母（たとえば、４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）は、ロイシン栄養要求性又はトリプトファン栄養要求性との関連で相補され、ＭＳＰ１_１９タンパク質と融合する人工フォリソームを生成する。

【0065】

ＭＳＰ１_１９と融合する人工フォリソームは、１．Ｖに記載した通り精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法を用いて検証され、定量化された。全ての構造物は精製に利用可能であった。細胞培養物１Ｌ当たりの０．４９ｍｇのＭＳＰ１_１９の最適な精製については、発明者は、４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４構造物でも達成した。培養と精製の適応による最適化は、将来、より大量のタンパク質量の精製をもたらすことになる。更に、プロテアーゼ因子Ｘａを用いたインキュベーションによって、ＭＳＰ１_１９タンパク質が、人工タンパク質から分離可能になる。加えて、発明者は、いくつかの還元性を有し、カルシウムを含有するという緩衝条件が、人工フォリソームの溶解をもたらす可能性がある（特に、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１タンパク質の６１５位及び６２０位におけるシステインの変異の場合）ことを認めた。この不溶相から可溶相への転移は、タンパク質精製に利用可能である。図７は、フォリソーム体ＳＥＯ−Ｆ１及びＳＥＯ−Ｆ４を用いたＭＳＰ１_１９の精製を示す。ＭＳＰ１_１９の免疫学的検出が図示されている。

【0066】

２．１ｂ システインにより変異されたフォリソーム遺伝子を用いた組換えタンパク質の精製
ＭｔＳＥＯ−Ｆ１遺伝子において、シークエンスロゴでシステインＮｏ．３及び８（図５）は、アジレントテクノロジー社（カリフォルニア州、米国）のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩ部位特異的突然変異誘発キットを用いて、製造者の注意事項に従い、セリンに変異させた。出発物質として使用されたのは、ベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１として、終止コドンを有するものと終止コドンなしのもの（例１）である。システインＮｏ．３及び８は、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１タンパク質のアミノ酸の６１５位及び６２０位に相当する。それゆえ、結果として得られた変異ＭｔＳＥＯ−Ｆ１遺伝子は、以下においてＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）と言う。

【0067】

マラリア表面抗原の断片（ＭＳＰ１_１９）のコードされた配列は、例２．１ａにおいて記載された通り、ｐＥＮＴＲ４^ＴＭベクター（インビトロジェン社、独国）のベクターにおいては、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）のアップストリーム領域及びダウンストリーム領域でクローニングされる。

【0068】

酵母ベクター４２５ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）によるベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）の組換え及び酵母ベクター４２４ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）によるベクターｐＥＮＴＲ４−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）及びｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ/Ｃ６２０Ｓ）−ＭＳＰ１_１９の組換えを用いて、発現ベクター４２５ＧＰＤ− ＭｔＳＥＯ−Ｆ１ （Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）、４２４ＧＰＤ−ＭＳＰ１_１９−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）、 ４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）−ＭＳＰ１_１９が生成される。

【0069】

酵母ベクターは、以下の組み合わせ、すなわち

【化4】

で、酵母株ＩｎｖＳｃ１（インビトロジェン社、独国）に形質変換される。選択のために、酵母株のロイシン栄養要求性及びトリプトファン栄養要求性の相補が利用された。結果として得られた酵母は、ＭＳＰ１_１９タンパク質を含有するＭｔＳＥＯ−Ｆ１（Ｃ６１５Ｓ／Ｃ６２０Ｓ）由来の人工フォリソームを生成する。

【0070】

結果として得られた人工フォリソームは、還元性の緩衝液中で、カルシウムイオン（４ｍＭのＣａＣｌ、２００μＭのＮａＨＳＯ_３、１０ｍＭのＴＲＩＳ、１００ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ ７．２）によって約１００％可溶性の形状に転移され、変異なしのバージョンでは、わずかな部分しか可溶性の形状に転移しない。

【0071】

それゆえ、精製プロセスが短縮可能となる。培養後、ＭＳＰ１_１９タンパク質を含有する酵母細胞は分解され、人工フォリソーム及び酵母破片は、遠心分離によって可溶性部分から分離し、次いで、タンパク質・フォリソーム融合が可溶相に転移することが可能となる。

【0072】

２．２ 人工フォリソーム遺伝子を用いた抗体の精製
Ｉ． ゴム小粒子結合蛋白質３（ＳＲＲＰ３）のコードされた配列は、以下のオリゴヌクレオチドを有するベクターに基づいて増幅された（制限部位には下線を引いた）。
SRPP3 XhoI fw: 5‘-AGA CTCGAGA ATGACCGACGCTGCTTC-3‘
SRPP 3 XhoI rev: 5‘-AGA CTCGAG TCATGTTTCCTCCACAATC-3‘

【0073】

増幅産物は、制限酵素ＸｈｏＩで処理され、翻訳終止コドンなしのｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１ベクターのＸｈｏＩ切断部位にクローニングされる（ａ）Ｉ．参照）ことで、ベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＳＲＰＰ３を得る。発現ベクター４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＳＲＰＰ３の生成のために、生成されたベクターは、酵母ベクター４２４ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）によって組み換えられた。

【0074】

ＩＩ． ベクター４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＳＲＰＰ３は、酵母に形質転換され、この酵母は、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１から成る人工フォリソームの生成のために、すでにプラスミド（４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）を含んでいる（１．ＩＩＩ参照）。結果として得られた酵母（たとえば、４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−ＳＲＰＰ３）は、ロイシン栄養要求性及びトリプトファン栄養要求性との関連で相補され、ＳＲＰＰ３タンパク質と融合する人工フォリソームを生成する。酵母は、ＯＤ６００ｎｍまでは、５０ｍＬの規模で培養され、遠心分離され、１ｍＬのＶ培地（１０ｍＭのＴＲＩＳ、 １０ｍＭのＥＤＴＡ、 １００ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）で、ボールミルを用いて分解される。ここで、抗原を担持する人工フォリソームは、遊離した状態で溶液中に存在し、以下において、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の精製に利用可能となる。

【0075】

ＩＩＩ． 抗原を含む人工フォリソームは、５００μＬのポリクローナル抗体血清を用いて、ウサギにおいて生成されたＳＲＰＰ３との比較で、３０分間インキュベートされる。ここで、特異的抗体は、人工フォリソームに結合する。フォリソームは遠心分離（４０００×ｇ、４分間）され、１ｍＬのＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、２ ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４）で三度洗浄された。次いで、抗体は、４５０μＬの０．１Ｍグリシン・ＨＣｌ溶液（ｐＨ２．７）で５分間溶離される。その後、抗体は、４５０μＬの０．１Ｍｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．５）で中和される。以下のブロットにおいては、精製される抗体（血清不純物のない状態）の高い特異性が確認される。フォリソームを用いて精製された抗体は、さまざまな用途（ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ免疫沈降、抗体療法その他）に利用可能となる。このような精製の原理は、図７に示している。図８は、人工フォリソームの固定化のための、ＩｇＧ抗体とＢドメインとの相互作用の利用を示している。Ｂドメインと結合されたＳＥＯ−Ｆ１サブユニットから成る人工フォリソームは、蛍光ＩｇＧ抗体を形成する。

【0076】

例３−人工フォリソームの技術的表面への固定（表面結合）
Ｉ． グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）のコードされた配列は、以下のオリゴヌクレオチドを有するｐＧｅｘ−３Ｘベクター（ＧＥヘルスケア社、米国）に基づいて増幅された（制限部位には下線を引いた）。
GST fw NcoI XhoI fw: 5’-AGACCA TGG GAC TCG AGA ATG TCC CCT ATA CTA GGT TA-3’
GST SalI rev: 5’-AGA GTC GAC TTA ACG ACC TTC GAT CAG ATC-3’

【0077】

この断片は、制限酵素ＮｃｏＩ／ＳａｌＩで処理され、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで切断されたベクターｐＥＮＴＲ４^ＴＭでクローニングされ、この結果、ベクターｐＥＮＴＲ４−ＧＳＴが生成される。以下において、終止コドンを有するＭｔＳＥＯ−Ｆ１遺伝子の増幅産物（１．Ｉ参照）が、結果として生成されるベクターのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位でクローニングされることで、ベクターｐＥＮＴＲ４−ＧＳＴ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１を得る。発現ベクター４２４ＧＰＤ−ＧＳＴ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１の生成のために、ベクターｐＥＮＴＲ４−ＧＳＴ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１は、酵母ベクター４２４ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）によって組み換えられた。発現ベクターは、酵母に形質転換され、この酵母は、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１から成る人工フォリソームの生成のために、すでにプラスミド（４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）を含んでいる（ａ）ＩＩＩ参照）。結果として得られた酵母（４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／４２４ＧＰＤ−ＧＳＴ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）は、ロイシン栄養要求性及びトリプトファン栄養要求性との関連で相補され、ＧＳＴタグを有する人工フォリソームを生成する。この酵母は、ａ）Ｖに記載の通り精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、それぞれのタンパク質（ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及びＧＳＴ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）の存在が検証可能となった。更に、結果として得られた人工のＧＳＴ結合されたフォリソームが、グルタチオン結合されたマトリックス（グルタチオンセファロース４Ｂ、アマシャムバイオサイエンス社、米国）に接着することも証明された。

【0078】

ＩＩ． 黄色ブドウ球菌タンパク質Ａ由来Ｂドメインのコードされた配列は、以下のオリゴヌクレオチドを有する４２４ＧＰＤ−ｃｃｄＢ−ＴＡＰベクター（ＧＥヘルスケア社、米国）に基づいて増幅された（制限部位には下線を引いた）。
B-Domain NcoI fw: 5’- AGACCATGGCGGATAACAAATTCAACA-3’
B-Domain NcoI rev: 5’-AGACCATGGCTTTTGGTGCTTGAGCATC-3’
B-Domain XhoI fw: 5’- AGACTCGAGAGCGGATAACAAATTCAAC-3’
B-Domain XhoI rev: 5’- AGACTCGAGTCATTTTGGTGCTTGAGCATC-3’

【0079】

第１の増幅産物は、制限酵素ＮｃｏＩで処理され、終止コドンを有するベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及び終止コドンを有するベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４のＮｃｏＩ切断部位でクローニングされる（ａ）Ｉ．参照）ことで、ベクターｐＥＮＴＲ４−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及びｐＥＮＴＲ４−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４を得る。第２の増幅産物は、制限酵素ＸｈｏＩで処理され、終止コドンなしのベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及び終止コドンなしのベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４のＸｈｏＩ切断部位でクローニングされる（ａ）Ｉ．参照）ことで、ベクターｐＥＮＴＲ４− ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ及びｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−Ｂ−ｄｏｍａｉｎを得る。発現ベクター４２４ＧＰＤ−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１、４２４ＧＰＤ−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ、４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−Ｂ−ｄｏｍａｉｎの生成のために、生成されたベクターは、酵母ベクター４２４ＧＰＤ−ｃｃｄＢ（アドジーン、米国）によって組み換えられた。

【0080】

ベクター４２４ＧＰＤ−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４及び４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４−Ｂ−ｄｏｍａｉｎは、酵母株ＩｎｖＳｃ１（インビトロジェン社、独国）に形質変換された。選択のために、酵母株のトリプトファン栄養要求性の相補が利用された。Ｂドメイン及びＭｔＳＥＯ−Ｆ４から成る融合タンパク質が、他のＭｔＳＥＯ−Ｆタンパク質のこれ以上の発現を伴わずに、フォリソーム構造を形成する。

【0081】

ベクター４２４ＧＰＤ−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１及び４２４ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１−Ｂ−ｄｏｍａｉｎは、酵母に形質転換され、この酵母は、ＭｔＳＥＯ−Ｆ１から成る人工フォリソームの生成のために、すでにプラスミド（４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）を含んでいる（１．ＩＩＩ参照）。結果として得られた酵母（たとえば、４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１／４２４ＧＰＤ−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１）は、ロイシン栄養要求性及びトリプトファン栄養要求性との関連で相補され、Ｂドメインと融合する人工フォリソームを生成する。以上生成されたＢドメインを含む人工フォリソームは全て、ＩｇＧに結合されたセファロース（ＧＥヘルスケア社、米国）に固定化される。

【0082】

２．３ 異なるＳＥＯ−Ｆタンパク質から成る人工ＳＥＯ−Ｆフォリソームの生成及び精製
２．３．１ ＭｔＳＥＯ−Ｆ４のアミノ酸１〜９６とＭｔＳＥＯ−Ｆ１のアミノ酸７３〜６４８との融合
Ｎ末端側のＭｔＳＥＯ−Ｆ４断片及びＣ末端側のＭｔＳＥＯ−Ｆ１断片は、以下のオリゴヌクレオチド、すなわち
MtSEO-F4 MSLSN NcoI fw 5’-AGACCATGGGATCCCTTTCCAACTTAGGAAGTG -3’
MtSEO-F4 LISCQ NcoI rev 5‘-AGACCATGGCCTGACAAGAAATCAGCTT-3‘
MtSEO-F1 MITTR NcoI fw 5‘-AGACCATGGGAATGATAACCACCCCTC-3’
MtSEO-F1 QNGKI XhoI rev 5'-AGACTCGAGGTCATATCTTGCCATTCTGTGGAG-3'
によって増幅され、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩによって制限されたｐＥＮＴＲ４ベクターＩＩクローニングされた。その後、生成されたベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４（１−２８８ｂｐ）／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（２１９−１９４４ｂｐ）は、植物発現ベクターｐＢａｔＴＬ及び酵母発現ベクター４２５ＧＰＤ−ｃｃｄＢによって組み換えられた。生成されたｐＢａｔＴＬ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４（１−２８８ｂｐ）／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（２１９−１９４４ｂｐ）は、アグロバクテリウムに形質転換され、このアグロバクテリウムで、ベンサミアナタバコ植物体が浸透を受けた（ミュラー他、２０１０）。生成されたベクター４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４（１−２８８ｂｐ）／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（２１９−１９４４ｂｐ）は、酵母株ＩｎｖＳｃ１に形質転換された。２つの系ではいずれも、人工フォリソームの形成が顕微鏡で観察可能であった。精製は、上の例１．Ｖに記載した通り実施された。

【0083】

２．３．２ ＭｔＳＥＯ−Ｆ１のアミノ酸１〜５８３とＭｔＳＥＯ−Ｆ２のアミノ酸６２０−６７０との融合
Ｎ末端側のＭｔＳＥＯ−Ｆ１断片及びＣ末端側のＭｔＳＥＯ−Ｆ２断片は、以下のオリゴヌクレオチド、すなわち
MtSEO-F1 MSLNS NcoI fw 5'-AGACCATGGGATCATTGTCCAATGGAACTA-3'
MtSEO-F1 FKEYY XhoI rev 5‘-AGACTCGAGTGATAGTATTCTTTGAATGCAAT-3‘
MtSEO-F2 DTKLS XhoI fw 5‘-AGACTCGAGTGATACTAAGCTTTCAGAGAT-3‘
MtSEO-F2 DSCCI XhoI bw 5'-AAACTCGAGTCAAATGCAGCAACTATCTGGATCATC-3'
によって増幅され、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩによって制限されたｐＥＮＴＲ４ベクターＩＩクローニングされた。その後、生成されたベクターｐＥＮＴＲ４−ＭｔＳＥＯ−Ｆ４（１−２８８ｂｐ）／ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（２１９−１９４４ｂｐ）は、植物発現ベクターｐＢａｔＴＬ及び酵母発現ベクター４２５ＧＰＤ−ｃｃｄＢによって組み換えられた。生成されたｐＢａｔＴＬ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（１−１７４９ｂｐ）／ＭｔＳＥＯ−Ｆ２（１８６０−２０１０ｂｐ）は、アグロバクテリウムに形質転換され、このアグロバクテリウムで、ベンサミアナタバコ植物体が浸透を受けた（ミュラー他、２０１０）。生成されたベクター４２５ＧＰＤ−ＭｔＳＥＯ−Ｆ１（１−１７４９ｂｐ）／ＭｔＳＥＯ−Ｆ２（１８６０−２０１０ｂｐ）は、酵母株ＩｎｖＳｃ１に形質転換された。２つの系ではいずれも、人工フォリソームの形成が顕微鏡で観察可能であった。精製は、上の例１．Ｖに記載した通り実施された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]