特許 6341941 方向性クローニング用ベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6341941

(24)【登録日】2018年5月25日

(45)【発行日】2018年6月13日

(54)【発明の名称】方向性クローニング用ベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/52 20060101AFI20180604BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20180604BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180604BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/52 ZZNA

   C12N15/63 Z

   C12N15/09 Z

【請求項の数】2

【全頁数】66

(21)【出願番号】特願2016-9792(P2016-9792)

(22)【出願日】2016年1月21日

(62)【分割の表示】特願2013-168742(P2013-168742)の分割

【原出願日】2004年9月29日

(65)【公開番号】特開2016-52338(P2016-52338A)

(43)【公開日】2016年4月14日

【審査請求日】2016年1月21日

(31)【優先権主張番号】10/678,961

(32)【優先日】2003年10月3日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】10/702,228

(32)【優先日】2003年11月5日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】593089149

【氏名又は名称】プロメガ コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100086771

【弁理士】

【氏名又は名称】西島 孝喜

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(72)【発明者】

【氏名】スレーター、マイケル、アール．

(72)【発明者】

【氏名】シュトラウス、イーサン、エドワード

(72)【発明者】

【氏名】ウッド、キース、ブイ．

(72)【発明者】

【氏名】ハートネット、ジェームズ、ロバート

【審査官】 鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０６−５０４９１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−０４１６８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０６−５１１１５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Protein Engineering, 1995, Vol.8, No.5, pp.497-499

【文献】 Gene, 1996, Vol.169, pp.131-132

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ベクターを組換え宿主細胞中に導入するステップを含む、毒性遺伝子の発現のための組換え宿主細胞を調製するためのインビトロ方法であって、前記ベクターが、分泌性ドメインを欠失したバルナーゼをコードする核酸断片に作用可能に連結した第１のプロモーターを含み、前記組換え宿主細胞が、原核細胞で構成的に発現される第２のプロモーターからバルスターを発現し、前記バルナーゼが、バルスターの不存在下で発現されると、前記組換え宿主細胞に対して致死的であり、前記宿主細胞が、原核細胞である、方法。

【請求項2】

前記第１のプロモーターが、原核細胞で発現されるプロモーターを含む、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

この出願は、２００３年１１月５日に出願された米国特許出願第１０／７０２，２２８号、及び２００３年１０月３日に出願された米国特許出願第１０／６７８，９６１号の出願日に基づく権利を要求し、これらの開示を本明細書に援用する。

【背景技術】

【0002】

分子生物工学は、薬理学的に重要なタンパク質化合物の生産に変革をもたらした。組換えＤＮＡ技術の出現によって、初めて、組換え宿主細胞での大規模なタンパク質生産が、そのタンパク質をごく少量しか含有していないかもしれない細胞又は組織から労力と費用とをかけてタンパク質を単離する代わりに可能になった。ヒトタンパク質を含めたタンパク質の、宿主における大規模な生産には、対象のタンパク質を宿主細胞、例えば異種宿主細胞で発現させる能力が必要である。この過程は通常、対象のタンパク質をコードする遺伝子の単離又はクローニングと、それに続く、宿主細胞における所望のタンパク質の発現を指示するエレメント（例えばプロモーター）を含有する発現ベクターへのコード領域（オープンリーディングフレーム）の導入とを必要とする。発現ベクターにコード領域を導入若しくはサブクローニングする最も一般的に使用される方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで制限エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡリガーゼを使用するものである。制限エンドヌクレアーゼは、通常、二本鎖ＤＮＡ分子中にある特定のＤＮＡ配列を認識及び切断する酵素である。結果として得られる発現ベクターが細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳混合物中に導入された際に、機能タンパク質を発現できるような方法で、制限酵素を用いて、対象のコーディング領域を含むＤＮＡ断片をクローニングベクターから切り出し、次に、ＤＮＡリガーゼを用いて、切り出されたＤＮＡ断片を、転写調節配列を有する適切に切断されたベクターに結合する。

【0003】

制限酵素によって生成された断片の方向性を制御する際の問題は、一般的に使用されている制限酵素の多くが、回転させた際に同等の末端を生成し、したがって、そのような末端を有するＤＮＡ断片の自己連結は、断片の方向性に関してランダムであるということである。Ｈａｒｔｌｅｙ及びＧｒｅｇｏｒｉ（Ｇｅｎｅ、１３：３４７（１９８１年））は、断片の方向性を連結中に制御する技法を報告したが、その技法は、クローニングされる断片のいずれかの末端に隣接したＡｖａＩ部位の導入を必要とする（Ｈａｒｔｌｅｙ及びＧｒｅｇｏｒｉ、米国特許第４，４０３，０３６号を参照）。ＡｖａＩによる切断は相互に識別可能な末端を生成するので、その断片の自己連結は、「尾部に頭部」の方向性に向けた強い傾向を有する結果となる。これは、「頭部に頭部」、及び「尾部に尾部」の連結が、塩基のミスマッチをもたらすからである。その後、重合された分子をベクターに挿入して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。

【0004】

同様のアプローチにおいて、Ｉｋｅｄａら（Ｇｅｎｅ、７１：１９（１９８８年））は、ＳｆｉＩ切断部位が隣接した、ヒト主要組織適合抗原をコードするＤＮＡ断片の「頭部に頭部」の直列アレイを生成させた。ＳｆｉＩは、回転させた際に同等にならない一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する。ＳｆｉＩ部位は、遺伝子発現カセット及び選択マーカーの共重合体を生成させるのにも使用され、この共重合体は、細胞に形質移入するのに使用することができる（Ｍｏｎａｃｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０：１５７（１９９４年）；Ａｓｓｅｌｂｅｒｇｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４３：２８５（１９９６年））。Ｍｏｎａｃｏらは、この共重合体をＮｏｔＩで処理して、選択マーカー遺伝子の３’末端でこのＤＮＡを切断した。このようにして、形質移入によって導入されたＤＮＡ分子は、１共重合体あたり１選択マーカー遺伝子のみを含有することになる。

【0005】

クラスＩＩＳ制限酵素は、完全に非対称な部位及び相補的付着端を生成することができる。Ｋｉｍ及びＳｚｙｂａｌｓｋｉ（Ｇｅｎｅ、７１：１（１９８８年））は、クローニングするＤＮＡのいずれかの端に、クラスＩＩＳ制限酵素の１つであるＢｓｐＭＩによって認識される部位を導入した。クローニングされたＤＮＡの自己連結は、同じ方向性の繰返し単位を含む多量体を生じた。同様に、Ｔａｋｅｓｈｉｔａら（Ｇｅｎｅ、７１：９（１９８８年））は、ヒトプロテインＣをコードする断片をプラスミドに挿入して、非対称の付着端をその断片に導入することによって、直列の遺伝子増幅を実現した。この事例では、クラスＩＩＳ酵素ＢｓｔＸＩによって認識される部位が使用された。その後、ｎｅｏ遺伝子を含むコスミドベクターに多量体をクローニングし、ラムダファージ粒子内にパッケージングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で増幅した。次に、これらのコスミドベクターをチャイニーズハムスター卵巣ＤＨＦＲ細胞に導入し、ｎｅｏ遺伝子を発現する細胞を選択するためにこれらの細胞をＧ４１８で処理した。Ｔａｋｅｓｈｉｔａらは、コスミドベクター及びヒトプロテインＣ遺伝子を複数コピー含む、直列に連結された、パッケージングされていないＤＮＡを用いた形質移入の後で、低レベルではあるが、細胞がヒトプロテインＣを発現することも見出した。

【0006】

同様のアプローチがＬｅｅらによって記述されているが（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１３：１３９（１９９６年））、彼らは、ベクター中のクラスＩＩＳ制限酵素切断部位に標的ＤＮＡをクローニングし、クラスＩＩＳ制限酵素を用いて単量体挿入配列を切り出し、単量体挿入配列を単離し、この挿入配列を自己連結させ、そして、この多量体をベクターにクローニングすることによって、標的ＤＮＡを直列多量体として増幅させた。Ｌｅｅらによれば、そのような方法は、ペプチドを大量生産するために、短鎖ＤＮＡ断片を重合させるのに有用である。

【0007】

方向性のある連結を強制するための別のアプローチは、非対称付着末端を生成するのに使用される合成リンカー又は合成アダプターを考案することである。例えば、Ｔａｙｌｏｒ及びＨａｇｅｒｍａｎ（Ｇｅｎｅ、５３：１３９（１９８７年））は、連結中における断片の方向性の制御を確立するために、方向性を有する合成アダプターをＤＮＡ断片に結合することによって、Ｈａｒｔｌｅｙ−Ｇｒｅｇｏｒｉアプローチを改変した。重合の後、多量体は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換に適した線状化されたベクターに連結された。Ｓｔａｈｌら（Ｇｅｎｅ、８９：１８７（１９９０年））は、ＤＮＡ断片を「尾部に頭部」の配置で重合させる同様の方法を記述した。この場合、合成オリゴヌクレオチドは、クラスＩＩＳ制限酵素ＢｓｐＭＩの非対称な切断部位に相補的な５’突出末端を有するエピトープ保有ペプチドをコードするように設計されている。重合の後、ベクター中でユニークなＢｓｐＭＩ切断部位に、このペプチドをコードする断片を挿入し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換に使用した。ポリメラーゼ連鎖反応の使用によってクローンのスクリーニングを行い、その後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのペプチド生産用に原核細胞発現ベクターにサブクローニングした。

【0008】

それにも関わらず、転写調節配列を有するベクターに、所望のコード領域を導入できる可能性は、制限酵素認識部位の利用可能性及び適性度によって制限されることが多い。所望のコード領域を取り出すために複数の制限酵素を利用しなければならないことが多く、各酵素に使用される反応条件が相違していて、切り出し反応を別々のステップで行う必要があることがある。さらに、最初の制限酵素反応で使用した特定の酵素を、残りの制限酵素消化を完遂する前に除去する必要がある場合もある。これには、時間のかかる、サブクローニング中間体の精製を必要とする。また、連結の前に制限酵素を不活性化する必要がある場合もある。

【0009】

制限酵素消化に頼らずにｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで標的ＤＮＡ分子を１つのベクターから別のベクターに方向性のある移動を行う方法が記載されている。例えば、Ｃｒｅａｔｏｒ（商標）ＤＮＡクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．社）は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組換えを用いて、ドナーベクターからアクセプターベクターへの標的遺伝子の移動を触媒し、このアクセプターベクターは、所望の宿主発現系の調節エレメントを含有するプラスミドである（米国特許第５，８５１，８０８号を参照）。Ｃｒｅは、バクテリオファージＰ１由来の３８−ｋＤａリコンビナーゼタンパク質であり、ｌｏｘＰ部位と呼ばれる特定の位置におけるＤＮＡ配列間又はその内部での組み換えを媒介する（Ｓａｕｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：１０８６（１９９４年）；Ａｈｒｅｍｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２５９：１５０９（１９８４年））。これらの部位は、組換え反応に方向性を与える８ｂｐのスペーサー領域によって分離された、１３ｂｐの逆方向反復配列２つから成る。ｌｏｘＰ部位中にある８ｂｐのスペーサー領域は、標的遺伝子が一定の方向性及びリーディングフレームで移動されるように強制する特定の方向性を有する。キット中のドナーベクターは、２箇所のｌｏｘＰ部位を含有し、それらは、多重クローニング部位（ＭＣＳ）の５’末端と、クロラムフェニコール耐性遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端とに隣接している。ドナーベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖及び選択のためのアンピシリン遺伝子と、正しい遺伝子組換えを選択するための、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のスクラーゼ遺伝子（ＳａｃＢ）とを含有する。キット中のアクセプターベクターは、単一のｌｏｘＰ部位を細菌プロモーターの後に含有し、この細菌プロモーターは、Ｃｒｅ−ｌｏｘに媒介された組換えの後に、クロラムフェニコールマーカーの発現を駆動する。対象の遺伝子は、導入されれば、そのアクセプターベクターがそのエレメント用に設計されている特定の発現エレメントに連結される。対象の遺伝子のコード配列が、ドナーベクター中で上流にあるｌｏｘＰ部位とインフレームである場合には、それはアクセプターベクター中のすべてのペプチドとインフレームとなる。

【0010】

Ｇａｔｅｗａｙ（商標）クローニングシステムは、ファージラムダベースの部位特異的組換えを用いる。ＬＲ反応は、変異型ａｔｔＬ部位を有するエントリークローンと、対応する変異型ａｔｔＲ部位を有するベクター（デスティネーションベクター、ｐＤＥＳＴ（商標））との間の組換え反応であり、組換えタンパク質（λ組換えタンパク質Ｉｎｔ及びＸｉｓ、並びに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によってコードされるタンパク質ＩＨＦ）の反応混液によって媒介される、発現クローンを作製する反応である。ＢＰ反応は、発現クローン（又はａｔｔＢが隣接しているＰＣＲ産物）と、ドナーベクターとの間の、エントリークローンを作製するための組換え反応である。ＢＰ反応は、２５ｂｐの端末ａｔｔＢ部位（＋４Ｇ）を含有するプライマーを用いて合成されたＰＣＲ産物の迅速な方向性クローニングを可能にする。その結果、ＰＣＲ断片を含有するエントリークローンが生じる。同様に、発現クローン中でａｔｔＢ部位に挟まれているＤＮＡセグメントを移動させて、エントリークローンを作製することができ、このエントリークローンは、対象の配列を、平行反応で１つ又は複数のデスティネーションベクターに移動させて、発現クローンを作製するのに使用することができる。ＬＲ反応によって生成された、結果として生じる２５ｂｐのａｔｔＢ部位（左（Ｎ末端）側のａｔｔＢ１、及び右（Ｃ末端）側のａｔｔＢ２）は、ａｔｔＬ部位（遺伝子に隣接している）に由来し、一方、遠位の配列は、ａｔｔＲ部位に由来する。

【0011】

しかし、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰベースの発現ベクター、又は他の部位特異的リコンビナーゼベースのベクター、例えばＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニングシステムによってコードされたタンパク質は、そのタンパク質のＮ末端及びＣ末端に、部位特異的組換え置換部位によってコードされる多数のアミノ酸残基、例えば８から１３アミノ酸残基を有する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

したがって、対象の核酸配列の方向性のあるクローニングを行う改良法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明は、方向性クローニングに使用する方法及びベクターを提供する。一実施形態では、対象のオープンリーディングフレームを含むベクター（ドナーベクター）は、そのオープンリーディングフレーム（対象のＤＮＡ配列）に隣接した少なくとも２つの制限酵素認識部位（「制限酵素部位」、「制限部位」、又は「認識部位」）と、宿主細胞におけるベクターの複製及び／又は維持のための他のベクター配列（バックボーン配列）と、任意選択で、１つ又は複数の検出可能なマーカー遺伝子、例えば選択マーカー遺伝子とを含み、隣接部位の少なくとも１つは第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素は、ハパックス末端（ｈａｐａｘｏｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ ｅｎｄ）を生成し、例えば、一本鎖末端を産生する、縮重認識配列を有する制限酵素、又は認識配列の外側を切断する制限酵素である。一実施形態では、オープンリーディングフレームに隣接した少なくとも２つの制限酵素部位をドナーベクターが含み、隣接部位の少なくとも１つは第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素はハパックス末端制限酵素、例えば、縮重認識配列を有する制限酵素であり、その部位は、切断された場合に、自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハング又は平滑末端を生成しない。すなわち、その末端は非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングである。別の実施形態では、ドナーベクターはオープンリーディングフレームに隣接した少なくとも２つの制限酵素部位を含み、これら少なくとも２つの隣接部位は、ハパックス認識配列（ｈａｐａｘｏｍｅｒｉｃ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する第１の制限酵素の部位であり、かつ、場合によっては同一制限酵素の部位であり、この部位は、切断された場合に、自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハング又は平滑末端をもたない線状ＤＮＡ断片を産生する。そのようなベクターは、連結されたオープンリーディングフレームを発現するベクター（レシピエントベクター又は発現ベクター）を調製するためのオープンリーディングフレームの供給源として利用することができる。レシピエントベクター中のバックボーン配列は、通常、アクセプターベクターから得られ、これは、転写制御配列、及び、場合によっては、融合タンパク質を生産するための配列を含有する。アクセプターベクターは、ハパックス認識配列を有する第２の制限酵素の制限酵素部位が少なくとも２つ隣接した非必須ＤＮＡ配列と、任意選択で、１つ又は複数の検出可能なマーカー遺伝子、例えば選択マーカー遺伝子とを含む。一実施形態では、アクセプターベクター中の、第２の制限酵素の２つの隣接制限酵素部位は、切断された場合に、自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハング又は平滑末端を生成しないが、第１の制限酵素によって生成された２つのＤＮＡオーバーハングの１つと相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有する線状ＤＮＡ断片を産生する部位である。線状化されたＤＮＡ断片が連結されて、レシピエントベクターが形成されれば、オープンリーディングフレームによって少なくとも一部がコードされているタンパク質を発現する形質転換細胞を産生するように、レシピエントベクターを細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの原核細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、又はこれらの溶解物に導入するか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳混合物に導入することができる。

【0014】

一実施形態では、本発明は、ＤＮＡ断片の方向性サブクローニングの方法を提供する。この方法は、第１の選択的マーカー遺伝子及び対象のＤＮＡ配列を含む第１のベクターを準備するステップを含み、その際、対象のＤＮＡ配列には少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、隣接制限酵素部位のうち少なくとも２つが第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、第１の制限酵素で第１のベクターを消化することによって、第１の選択マーカー遺伝子を欠くが、対象のＤＮＡ配列及び第１対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含む第１の線状ＤＮＡ断片が生成される。この方法に用いる第２のベクターが提供されるが、このベクターは、対抗選択可能な遺伝子が任意選択で含まれ、第１の選択マーカー遺伝子及び非必須ＤＮＡ配列から識別可能な第２の選択マーカー遺伝子を含み、非必須ＤＮＡ配列には少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、これらの隣接制限酵素部位のうち２つ以上が第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、第２の制限酵素で第２のベクターを消化することによって、非必須ＤＮＡ配列を欠くが、第２の選択マーカー遺伝子及び第２対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含む第２の線状ＤＮＡ断片が生成され、第２対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングのそれぞれは、第１対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングの一本鎖ＤＮＡオーバーハングのうちの１つのみと相補的であり、第１の線状ＤＮＡ断片が第２の線状ＤＮＡ断片に一定方向で結合するのを可能にする。第１対及び第２対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを介して一定方向で結合している第１の線状ＤＮＡ分子及び第２の線状ＤＮＡ分子を含む第３のベクターを任意選択で含む混合物を産生する消化及び、任意選択で連結をもたらすのに効果的な条件下において、適当な緩衝液中で、ハパックス末端制限酵素である１つ又は複数の制限酵素、及び任意選択でＤＮＡリガーゼを用いて、第１のベクター及び第２のベクター、第１のベクター及び第２の線状ＤＮＡ断片、又は第２のベクター及び第１の線状ＤＮＡ断片を一体にする。一実施形態では、リガーゼを、１つ又は複数の制限酵素と同時に添加し、別の実施形態では、リガーゼを、１つ又は複数の制限酵素の後に添加する。前述の混合物は、任意選択で宿主細胞内に導入し、形質転換された宿主細胞は、任意選択で、第２の選択マーカー遺伝子を発現するもの、或いは、対抗選択可能な遺伝子を発現しないものを選択する。また、この方法は、第３のベクターの同定を含むこともあり、このベクター中では、対象のＤＮＡ配列が第２の線状ＤＮＡ断片に方向性をもって導入されている。一実施形態では、第１の制限酵素がＳｆｉＩ、ＳａｐＩ、又はこれらのアイソシゾマーである。一実施形態では、第１の制限酵素がＳｆｉＩ又はそのアイソシゾマーであり、第２の制限酵素がＢｇｌＩ又はアイソシゾマーである。一実施形態では、第２の制限酵素がＥａｒＩ又はそのアイソシゾマーである。別の実施形態では、第１の制限酵素及び第２の制限酵素が同一である。任意選択で、対象のＤＮＡ配列は、第１の制限酵素又は第２の制限酵素の部位を１つ又は複数含むオープンリーディングフレームを含む。この実施形態では、これら１つ又は複数の制限酵素で消化する前に、オープンリーディングフレーム中のこれら１つ又は複数の制限酵素の部位の保護、例えば、ＨａｅＩＩＩメチラーゼ、ＳａｐＩメチラーゼ、又はＳｆｉＩメチラーゼなどを用いたメチル化による保護を、消化が阻止されるように、任意選択で行う。別法では、メチル化の前に、第１の制限酵素又は第２の制限酵素の隣接部位を、その隣接制限酵素部位に相補的なオリゴヌクレオチド及びＲｅｃＡと接触させる。一実施形態では、連結及び一定方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列及び第２の線状ＤＮＡ断片の３’末端の５’側にある核酸配列によってコードされているＮ末端融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される。別の実施形態では、連結及び一定方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列及び第２の線状ＤＮＡ断片の５’末端の３’側にある核酸配列によってコードされているＣ末端融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される。さらに別の実施形態では、連結及び一定方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列及び第２の線状ＤＮＡ断片の３’末端及び５’末端のそれぞれ５’側及び３’側にある核酸配列によってコードされている融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される。さらに別の実施形態では、連結及び一定方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列と、一定方向での結合によって生成された置換部位とによってコードされている融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される。

【0015】

したがって、本発明は、クローニング用のベクター系を提供する。一実施形態では、このシステムは、選択マーカー遺伝子及び対象のＤＮＡ配列を含む第１のベクターを含み、対象のＤＮＡ配列には、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、これらの隣接制限酵素部位のうち２つ以上が第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、第１の制限酵素で第１のベクターを消化することによって、第１の選択マーカー遺伝子を含まないが、対象のＤＮＡ配列及び第１対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含む第１の線状ＤＮＡ断片を生成し、第１の制限酵素部位は、第１の線状ＤＮＡ断片を第２のベクターに直接再連結できるように設計されている。このシステムは、第２のベクターを任意選択で含み、第２のベクターは、対抗選択可能な遺伝子が任意選択で含まれ、第１の選択マーカー遺伝子及び非必須ＤＮＡ配列から識別可能な第２の選択マーカー遺伝子を含み、非必須ＤＮＡ配列には少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、第２のベクター中の隣接部位のうち２つ以上が第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、第２の制限酵素で第２のベクターを消化することによって、非必須ＤＮＡ配列を欠くが、第２の選択マーカー遺伝子及び第２対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含む第２の線状ＤＮＡ断片を生成し、第２対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングのそれぞれは、第１対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングの一本鎖ＤＮＡオーバーハングのうちの１つのみと相補的であり、第１の線状ＤＮＡ断片が第２の線状ＤＮＡ断片に一定方向で結合するのを可能にする。さらに、このベクター系の１つ又は複数のベクターを含むキットも提供する。

【0016】

対象のアミノ酸配列の発現に適したベクターを作製する方法も提供する。この方法は、第３のベクターを任意選択で含む混合物を産生する、消化及び任意選択で連結をもたらすのに効果的な条件下において、適当な緩衝液中で、１つ又は複数の制限酵素及び任意選択でＤＮＡリガーゼを用いて、少なくとも２つのベクターを一体にするステップを含む。この方法に使用する第１のベクターは、第１の選択マーカー遺伝子及び対象のＤＮＡ配列を含み、対象のＤＮＡ配列には、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、これらの隣接制限酵素部位のうち２つ以上が第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、第１の制限酵素で第１のベクターを消化することによって、第１の選択マーカー遺伝子を欠くが、対象のＤＮＡ配列及び第１対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含む第１の線状ＤＮＡ断片を生成する。第２のベクターは、対抗選択可能な遺伝子が任意選択で含まれ、第１の選択マーカー遺伝子及び非必須ＤＮＡ配列から識別可能な第２の選択マーカー遺伝子を含み、非必須ＤＮＡ配列には２つ以上の制限酵素部位が隣接し、第２のベクター中の隣接部位のうち２つ以上が第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素はハパックス末端制限酵素である。第２の制限酵素で第２のベクターを消化することによって、非必須ＤＮＡ配列を欠くが、第２の選択マーカー遺伝子及び第２対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含む第２の線状ＤＮＡ断片を生成し、第２対の非自己相補的ＤＮＡオーバーハングのそれぞれは、第１対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングの一本鎖ＤＮＡオーバーハングのうちの１つのみと相補的であり、第１の線状ＤＮＡ断片が第２の線状ＤＮＡ断片に一定方向で結合するのを可能にする。一実施形態では、対象のＤＮＡ配列は、１つ又は複数のタンパク質の１つ又は複数のドメインをコードする。

【0017】

一実施形態では、対象のオープンリーディングフレームに隣接する少なくとも１つの制限酵素部位は、内部パリンドロームを認識する制限酵素、例えば、ＳｆｉＩ又はＢｇｌＩなどのＩＩ型酵素であり、これには、限定されるものではないが、塩基認識のあいまい性によって２つを超えるタイプの付着末端（ＤＮＡオーバーハング）を生成する制限酵素、例えば、ＡｈｄＩ、ＡＩｗＮＩ、ＡｐａＢＩ、ＢｇｌＩ、ＢｌｐＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＸＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＤｒａＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｒｄＩ、Ｅａｍ１１０５Ｉ、ＥｃｏＮＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｓｓＩ、ＳａｕＩ、ＳｆｉＩ、ＸｃｍＩ、及びこれらのアイソシゾマーが含まれるが、平滑末端を生成する制限酵素は含まれない。別の実施形態では、対象のオープンリーディングフレームに隣接する少なくとも１つの制限酵素部位は、限定されるものではないが、

【化1】

及び、これらのアイソシゾマーを含めた、認識部位の外に末端を生成する制限酵素など、ＩＩＳ型酵素、例えばＳａｐＩ又はＥａｒＩである。別の実施形態では、前述の制限酵素の１つがクラスＩＩＳ制限酵素であり、これには、限定されるものではないが、

【化2】

又は、

【化3】

と同一の認識部位を有する制限酵素、又は、

【化4】

と同一の認識部位を有する制限酵素である。一実施形態では、前述の制限酵素の１つがＡａｒＩ、ＡｓｃＩ、ＢｂｒＣＩ、ＣｓｐＩ、ＤｒａＩ、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｐＩ、ＳｄａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｆＩ、ＳｐｌＩ、ＳｒｆＩ、ＳｗａＩ、又は、ＡａｒＩ、ＡｓｃＩ、ＢｂｒＣＩ、ＣｓｐＩ、ＤｒａＩ、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｐＩ、ＳｄａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｆＩ、ＳｐｌＩ、ＳｒｆＩ、若しくはＳｗａＩと同一の認識部位を有する制限酵素である。

【0018】

別の実施形態では、本発明は、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接した、対象のオープンリーディングフレームを含むドナーベクターを提供し、これらの隣接部位の１つは第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素は、ある特定の種における、複数、例えば、１００、１０００、１００００、又はそれより大きな数を含めた３以上の数のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームにおいて、低頻度、例えば約２５％未満、例えば約２０％未満、１０％未満、５％未満、又はさらに少ない頻度、例えば約１％の認識部位を有し（「低頻度切断酵素」）、かつ一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、また、これらの隣接部位のもう一方は第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素は、ある特定の種、例えば、第１の制限酵素と同一の種の複数におけるｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームにおいて低頻度の認識部位を有し、かつ、第１の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成する。一実施形態では、第２の制限酵素は平滑末端（「平滑末端切断酵素」）を生成する。１つ又は複数の核酸分子における特定の制限酵素認識部位の頻度は、当技術分野で周知の方法で決定することができる。例えば、そのような頻度を決定するために、ある特定の生物における複数のｃＤＮＡ配列又はオープンリーディングフレームを備えたデータベースを利用することができる。本発明のドナーベクターは、本発明のレシピエントベクターを調製するための、対象のオープンリーディングフレームの供給源として利用することができる。レシピエントベクター中のバックボーン配列は、通常、対象の転写制御配列と、任意選択で、融合タンパク質を生成するための配列とを有するアクセプターベクターから得る。アクセプターベクターは、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接した非必須ＤＮＡ配列と、１つ又は複数の検出可能なマーカー遺伝子とを含む。一実施形態では、アクセプターベクター中の隣接部位の１つは、一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する第３の制限酵素の部位であり、この一本鎖ＤＮＡオーバーハングは、ドナーベクターが第１の制限酵素で消化された際に生成される一本鎖ＤＮＡオーバーハングと相補的である。アクセプターベクター中のもう一方の隣接部位は第４の制限酵素の部位であり、第４の制限酵素は、第１の制限酵素又は第３の制限酵素によって生成される末端とは相補的でないが、第２の制限酵素によって生成される末端と適合性を有する末端、すなわち、それに連結できる末端を生成する。一実施形態では、第２の制限酵素及び第４の制限酵素が平滑末端切断酵素であり、第２の制限酵素及び第４の制限酵素の制限部位は同一の制限酵素によって認識されない。一実施形態では、前述のオープンリーディングフレームが１つ又は複数のタンパク質の１つ又は複数のドメインをコードする。

【0019】

したがって本発明は、ＤＮＡ断片の方向性サブクローニングの方法を提供する。この方法は、第１の選択的マーカー遺伝子及び対象のＤＮＡ配列を含む第１のベクターを準備するステップを含み、対象のＤＮＡ配列には、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ第１の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成し、第１の制限酵素及び第２の制限酵素部位で第１のベクターを消化することによって、第１の選択マーカー遺伝子を欠くが対象のＤＮＡ配列を含む第１の線状ＤＮＡ断片が生成される。また、第２の選択マーカー遺伝子を含む第２のベクターも提供され、第２の選択マーカー遺伝子は、第１の選択マーカー遺伝子及び非必須ＤＮＡ配列から識別可能であり、これには対抗選択可能な遺伝子が任意選択で含まれ、非必須配列には少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、第２のベクター中の隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第３の制限酵素の部位であり、第３の制限酵素は、第１の線状ＤＮＡ断片において第１の制限酵素によって生成される一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、第２のベクター中の隣接制限部位の少なくとも１つは第４の制限酵素の部位であり、第４の制限酵素は、第１の制限酵素又は第３の制限酵素によって生成される末端には相補的でないが第２の制限酵素によって生成された末端には連結できる末端を生成し、第３の制限酵素及び第４の制限酵素で第２のベクターを消化することによって、非必須ＤＮＡ配列を欠くが第２の選択マーカーを含む第２の線状ＤＮＡ断片が生成され、第２の線状ＤＮＡ断片には、第１の線状ＤＮＡ断片が第２の線状ＤＮＡ断片に一方向で結合するのを可能にする末端が隣接する。一定方向で結合している第１の線状ＤＮＡ分子及び第２の線状ＤＮＡ分子を含む第３のベクターを任意選択で含む混合物を産生する消化及び、任意選択で連結をもたらすのに効果的な条件下において、適当な緩衝液中で、１つ又は複数の制限酵素、及び任意選択でＤＮＡリガーゼを用いて、第１のベクター及び第２のベクター、第１のベクター及び第２の線状ＤＮＡ断片、又は第２のベクター及び第１の線状ＤＮＡ断片を一体にする。１つ又は複数の制限酵素で消化を行う前に、オープンリーディングフレーム中の１つ又は複数の制限酵素部位を、消化されないように保護する。一実施形態では、これらの部位がメチル化によって保護され、さらに、任意選択で、メチル化の前に、第１の制限酵素又は第２の制限酵素の隣接部位に、それらの隣接制限酵素部位に相補的なオリゴヌクレオチド及びＲｅｃＡを接触させる。一実施形態では、第２の制限酵素が平滑末端を生成し、かつ、第１の線状ＤＮＡ断片には第１の一本鎖ＤＮＡオーバーハング及び平滑末端が隣接する。一実施形態では、第１の制限酵素及び第３の制限酵素が同一でない。別の実施形態では、第２の制限酵素及び第４の制限酵素が同一でないか、或いは、それぞれが平滑末端を生成する。別の実施形態では、対象のＤＮＡ配列は、第１の制限酵素又は第２の制限酵素の部位を１つ又は複数含むオープンリーディングフレームを含む。

【0020】

さらに、クローニング用のベクター系を提供する。このベクター系は、第１の選択マーカー遺伝子及び対象のＤＮＡ配列を含む第１のベクターを含み、対象のＤＮＡ配列には、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ、第１の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成し、第１のベクターの消化によって、第１の選択マーカー遺伝子を欠くが、対象のＤＮＡ配列を含む第１の線状ＤＮＡ断片が生成され、これらの制限酵素部位は、第１の線状ＤＮＡ断片を第２のベクターに直接再連結できるように設計されている。第２のベクターは、対抗選択可能な遺伝子が任意選択で含まれ、第１の選択マーカー遺伝子及び非必須ＤＮＡ配列から識別可能な第２の選択マーカー遺伝子を含み、非必須ＤＮＡ配列には少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、第２のベクター中の隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第３の制限酵素の部位であり、第３の制限酵素は、第１の制限酵素によって生成される一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、第２のベクター中の隣接制限部位の少なくとも１つは第４の制限酵素の部位であり、第４の制限酵素は、第１の制限酵素又は第３の制限酵素によって生成される末端には相補的でないが第２の制限酵素によって生成された末端には連結できる末端を生成する。第３の制限酵素及び第４の制限酵素で第２のベクターを消化することによって、非必須ＤＮＡ配列を欠くが第２の選択マーカーを含む第２の線状ＤＮＡ断片が生成され、第２の線状ＤＮＡ断片には、第１の線状ＤＮＡ断片が第２の線状ＤＮＡ断片に一方向で結合するのを可能にする末端が隣接する。このベクター系の１つ又は複数のベクターを含むキットも提供する。

【0021】

一実施形態では、第２の制限酵素は平滑末端を生成し、かつ、第１の線状ＤＮＡ断片には第１の一本鎖ＤＮＡオーバーハング及び平滑末端が隣接する。一実施形態では、第１の制限酵素及び第３の制限酵素が同一でない。別の実施形態では、第２の制限酵素及び第４の制限酵素が同一でないか、或いは、それぞれが平滑末端を生成する。例えば、一実施形態では、これらの制限酵素の１つがＡａｒＩ、ＡｓｃＩ、ＢｂｒＣＩ、ＣｓｐＩ、ＤｒａＩ、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｐＩ、ＳｄａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｆＩ、ＳｐｌＩ、ＳｒｆＩ、ＳｗａＩ、又はＡａｒＩ、ＡｓｃＩ、ＢｂｒＣＩ、ＣｓｐＩ、ＤｒａＩ、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｐＩ、ＳｄａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｆＩ、ＳｐｌＩ、ＳｒｆＩ、若しくはＳｗａＩと同一の認識部位を有する制限酵素である。

【0022】

一実施形態では、対象のオープンリーディングフレームに隣接する少なくとも１つの制限酵素部位が、ＳｇｆＩ、ＰｖｕＩ、若しくはＰａｃＩ、ＳｇｆＩと適合性を有する末端を生成する制限酵素、例えば、ＳｇｆＩ、ＰｖｕＩ、ＢｓｔＫＴＩ、若しくはＰａｃＩ、又は、適切な３’ＴＡオーバーハングを有するように選択することができる末端を生成する制限酵素、例えば、

【化5】

若しくは、これらのアイソシゾマーの１つの部位である。一実施形態では、対象のオープンリーディングフレームに隣接する少なくとも１つの制限酵素部位は、ＳｇｆＩ（ＡｓｉＳＩ）、ＰａｃＩ、又はＰｖｕＩ（Ａｆａ２２ＭＩ、Ａｆａｌ６ＲＩ、ＢｓｐＣＩ、ＥａｇＢＩ、ＥｒｈＢ９Ｉ、ＭｖｒＩ、ＮｂｌＩ、Ｐｌｅ１９Ｉ、Ｐｓｕ１６１Ｉ、ＲｓｈＩ、ＸｏｒＩＩ）の１つの部位である。

【0023】

別の実施形態では、対象のオープンリーディングフレームに隣接する少なくとも１つの制限酵素部位は、ＰｍｅＩ（ＭｓｓＩ）、ＤｒａＩ、ＡｈａＩＩＩ（ＤｒａＩ、ＰａｕＡＩＩ、ＳｒｕＩ）、ＮｒｕＩ（Ｂｓｐ６８Ｉ、ＭＩｕＢ２Ｉ、Ｓｂｏ１３Ｉ、ＳｐｏＩ）、ＳｎａＢＩ（ＢｓｔＳＮＩ、Ｅｃｏ１０５Ｉ）、ＳｒｆＩ、又はＳｗａＩ（ＢｓｔＲＺ２４６Ｉ、ＢｓｔＳＷＩ、ＭｓｐＳＷＩ、ＳｍｉＩ）の部位である。別の実施形態では、対象のオープンリーディングフレームに隣接する少なくとも１つの制限酵素部位は、別の平滑末端と連結した後に終止コドンを生成できる平滑末端を生成する制限酵素の部位、例えば、ＰｍｅＩによって生成された末端と連結した後に終止コドンを生成できるもの、例えば、ＥｃａＢＣ３Ｉ（ＴＣ＾ＧＡ）、ＳｃｉＩ（ＣＴＣ＾ＧＡＧ）、ＨｉｎｃＩＩ（ＧＴＹＲＡＣの１バージョンであるＧＴＣ＾ＧＡＣ、）、ＨｐａＩ（ＧＴＴ＾ＡＡＣ）、ＨｉｎｃＩＩ（ＧＴＹＲＡＣの１バージョンであるＧＴＴ＾ＡＡＣ）、ＤｒａＩ（ＴＴＴ＾ＡＡＡ）、ＳｗａＩ（ＡＴＴＴ＾ＡＡＡＴ）、若しくはこれらのアイソシゾマー、又は、５’ＧＡ、５’ＡＧ、若しくは５’ＡＡなど、平滑末端を有するように選択できる末端を生成する制限酵素、例えば、ＢｓａＢＩ、Ｃａｃ８Ｉ、Ｈｐｙ８Ｉ、ＭｌｙＩ、ＰｓｈＡＩ、ＳｓｐＤ５Ｉ、若しくはこれらのアイソシゾマーの部位である。例えば、ＰｍｅＩ及びＤｒａＩによって生成された末端の連結は、終止部位を生成することができ、ＮがそれぞれＡ、Ｔ、Ｇ又はＣである場合に、ＮＴＴ及びＧＡＮ、ＮＣＴ及びＡＧＮ、又はＮＴＴ及びＡＡＮの連結も同様であろう。一実施形態では、ＰｍｅＩによって生成された末端と、別の平滑末端切断酵素によって生成された末端との平滑末端連結から形成された置換部位は、タンパク質融合体のコード配列を産生しうる。例えば、ＰｍｅＩによって生成された末端で終止するオープンリーディングフレームと、

【化6】

又は、これらのアイソシゾマーによって生成された末端の連結は、３’末端でオープンリーディングフレームを伸長させることもできる。

【0024】

一実施形態では、第１の制限酵素がＳｇｆＩであり、任意選択で、第２の制限酵素がＰｍｅＩである。別の実施形態では、第３の制限酵素が３’ＴＡオーバーハングを生成し、例えば、第３の制限酵素がＰｖｕＩ又はＰａｃＩである。

【0025】

一実施形態では、本発明は、対象のＤＮＡ配列の、方向性のあるクローニングを行う方法を提供し、この方法は、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接した対象のＤＮＡ配列、例えば、任意選択で融合タンパク質をコードする対象のＤＮＡ配列を含むレシピエントベクターを利用し、これらの隣接部位の１つは第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素は、ある特定の種における複数のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレーム中で低頻度である認識部位を有し、かつ一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、隣接部位のもう一方は第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素は、ある特定の種における複数のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレーム中で低頻度である認識部位を有し、かつ平滑末端を生成する。アクセプターベクターは、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接した対抗選択可能なマーカーを含みうる。アクセプターベクター中の隣接部位の１つは第３の制限酵素の部位であり、第３の制限酵素は、レシピエントベクターが第１の制限酵素で消化された際に生成される一本鎖ＤＮＡオーバーハングと相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する。アクセプターベクター中のもう一方の隣接部位は第４の制限酵素の部位であり、第４の制限酵素は平滑末端を生成する。この方法は、第１の制限酵素及び第２の制限酵素を有するレシピエントベクター並びに第３の制限酵素及び第４の制限酵素を有するアクセプターベクターを接触させるステップと、この結果得られた線状分子を連結するステップと、連結混合物で宿主細胞を形質転換するステップと、所望の組換え分子、すなわち対象のＤＮＡ配列及びアクセプターベクターのバックボーンを有するベクター、例えば、対抗選択可能な遺伝子を持たず、アクセプターベクターのバックボーンに存在する選択マーカーを任意選択で含むベクターを有する宿主細胞を選択するステップとを含む。一実施形態では、第１の制限酵素及び第３の制限酵素が同一である。一実施形態では、第２の制限酵素及び第４の制限酵素が同一である。このようにして、例えば、アクセプターベクター配列、置換部位、及び対象のＤＮＡ配列の融合体によってコードされた融合タンパク質を発現させるために、対象のＤＮＡ配列をある発現ベクターから別の発現ベクターに移動させることができる。

【0026】

本発明は、対象のアミノ酸配列を発現させるのに適したベクターを作製する方法も提供する。この方法は、第３のベクターを任意選択で含む混合物を産生する、消化及び任意選択で連結をもたらすのに効果的な条件下において、適当な緩衝液中で、１つ又は複数の制限酵素及び任意選択でＤＮＡリガーゼを用いて、少なくとも２つのベクターを一体にするステップを含む。第１のベクターは、第１の選択マーカー遺伝子及び対象のＤＮＡ配列を含み、対象のＤＮＡ配列には、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ、第１の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成し、第１のベクターの消化によって、第１の選択マーカー遺伝子を欠くが、対象のＤＮＡ配列を含む第１の線状ＤＮＡ断片が生成される。第２のベクターは、対抗選択可能な遺伝子が任意選択で含まれ、第１の選択マーカー遺伝子及び非必須ＤＮＡ配列から識別可能な第２の選択マーカー遺伝子を含み、非必須ＤＮＡ配列には少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、第２のベクター中の隣接制限酵素部位の少なくとも１つは第３の制限酵素の部位であり、第３の制限酵素は、第１の制限酵素によって生成される一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、第２のベクター中の隣接制限部位の少なくとも１つは第４の制限酵素の部位であり、第４の制限酵素は、第１の制限酵素又は第３の制限酵素によって生成される末端には相補的でないが第２の制限酵素によって生成された末端には連結できる末端を生成する。第３の制限酵素及び第４の制限酵素で第２のベクターを消化することによって、非必須ＤＮＡ配列を欠くが第２の選択マーカー遺伝子を含む第２の線状ＤＮＡ断片が生成され、第２の線状ＤＮＡ断片には、第１の線状ＤＮＡ断片が第２の線状ＤＮＡ断片に一方向で結合するのを可能にする末端が隣接する。一実施形態では、第２の制限酵素は平滑末端を生成し、かつ、第１の線状ＤＮＡ断片には第１の一本鎖ＤＮＡオーバーハング及び平滑末端が隣接する。別の実施形態では、第１の制限酵素及び第３の制限酵素が同一でない。さらに別の実施形態では、第２の制限酵素及び第４の制限酵素が同一でない。さらに別の実施形態では、第２の制限酵素及び第４の制限酵素が平滑末端を生成する。

【0027】

一実施形態では、連結及び一定方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列及び第２の線状ＤＮＡ断片の３’末端の５’側にある核酸配列によってコードされているＮ末端融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される。別の実施形態では、連結及び一定方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列及び第２の線状ＤＮＡ断片の５’末端の３’側にある核酸配列によってコードされているＣ末端融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される。別の実施形態では、連結及び一定方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列及び第２の線状ＤＮＡ断片の３’末端及び５’末端のそれぞれ５’側及び３’側にある核酸配列によってコードされている融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される。さらに別の実施形態では、連結及び一定方向での結合によって、対象のＤＮＡ配列と、一定方向での結合によって生成された置換部位とによってコードされている融合タンパク質をコードする第３のベクターが産生される。この融合タンパク質は、任意選択で、ＧＳＴ融合タンパク質、ＧＦＰ融合タンパク質、チオレドキシン融合タンパク質、マルトース結合タンパク質融合タンパク質、プロテアーゼ切断部位融合タンパク質、金属結合ドメイン融合タンパク質、又はデハロゲナーゼ融合タンパク質であり、かつ／又は、対応する非融合タンパク質と比較して、より可溶性であるか、より精製しやすいか、又は、より検出しやすいものである。

【0028】

したがって、本発明の方法は、対象のオープンリーディングフレームをクローニングするに、ユニークな末端を生成する１つ又は複数の制限酵素と任意選択でリガーゼとを利用する。ユニークな末端を生成する制限酵素の１つ又は複数の制限酵素部位を有するベクターは、方向性クローニング及び秩序だった遺伝子集合に特に有用である。さらに、本発明のベクター及び方法の使用は、簡便、安価、迅速、かつ、自動化可能であり、高い信頼度とオープンリーディングフレームの移動とをもたらす。さらに、本発明のベクターは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＮ末端及びＣ末端の両方に０又は１アミノ酸残基から数アミノ酸残基、例えば７アミノ酸残基未満が融合した融合タンパク質を発現するように設計することができる。例えば、対象のＤＮＡ配列に隣接したＳｆｉＩ部位を用いて生成された融合体は、Ｎ末端及びＣ末端に４ミノ酸残基を有する融合タンパク質を産生しうるが、一方、対象のＤＮＡ配列に隣接したＳｇｆＩ／ＰｍｅＩ部位又はＳａｐＩ部位を用いて生成された融合体は、Ｃ末端のみに単一のアミノ酸残基を有する融合タンパク質を産生しうる。対象のＤＮＡ配列にＳｆｉＩ又はＰｍｅＩ部位を、例えば増幅反応を用いて付加する場合、切断効率を増大させるために、認識部位に隣接させて、３から５ｂｐを追加に含めることができる。さらに、精製の際、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏにおける、例えば、固定、可溶化、ｉｎ ｓｉｔｕ検出、タンパク質ドメイン調査、及びタンパク質間相互作用に有用な融合パートナー配列を有するＮ末端又はＣ末端融合体を調製することができ、その場合、融合パートナー配列はアクセプターベクター配列及び／又は置換部位がコードする。

【0029】

ベクターからの意図していない発現を低減するのに有用な組換え宿主細胞も提供する。一実施形態では、この宿主細胞は、１つ又は複数の誘導性遺伝子を欠失しており、例えば宿主細胞は１つ又は複数のラムノース触媒遺伝子を発現しない細胞であり、例えば宿主細胞がｒｈａＢＡＤであり、かつ発現ベクター、例えば宿主細胞に安定に導入された発現ベクターを含む。この発現ベクターは、１つ又は複数の遺伝子の誘導性プロモーターを含み、このプロモーターは、非誘導時の発現レベルが低いものであり、好ましくは、比較的遅い誘導プロフィールを有するが最終の発現レベルが高いもの、例えばｒｈａＢＡＤプロモーターであり、このプロモーターは、異種（非天然）の転写調節遺伝子産物、例えばＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレームなど、オープンリーディングフレームに作用可能に連結されている。一実施形態では、組換え宿主細胞がラムノース異化作用を欠失しており、異種ＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレームに作用可能に連結したラムノース誘導プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子を有する。一実施形態では、宿主細胞が原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。一実施形態では、異種ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなどのファージＲＮＡポリメラーゼである。異種ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター及び対象のオープンリーディングフレームを含む発現ベクターと、ラムノースとを、例えば、同時、或いは逐次的に組換え宿主細胞に接触させることができる。

【0030】

したがって、本発明は、対象のＤＮＡ配列の発現を宿主細胞中で誘導する方法を提供する。この方法は、ラムノース異化作用を欠失しており、かつ異種ＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレームに作用可能に連結したラムノース誘導プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子を有する組換え宿主細胞を、ラムノース、及び、対象のＤＮＡ配列に作用可能に連結した異種ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む発現ベクターと接触させるステップを含む。一実施形態では、対象のＤＮＡ配列には、２つの制限酵素部位が隣接しており、隣接制限酵素部位の１つは第１の制限酵素の部位であり、第１の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、別の隣接制限酵素部位は第２の制限酵素の部位であり、第２の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ第１の制限酵素によって生成されたオーバーハングとは相補的でない末端を生成する。一実施形態では、発現ベクターは、転写ターミネーター配列、例えばｒｒｎＢと、対象のオープンリーディングフレームの５’側にあって、異種転写調節遺伝子産物によって上方制御されるプロモーターと、オープンリーディングフレームに隣接する１つ又は複数の、低頻度切断酵素の制限部位と、任意選択で、ベクターバックボーン中に、選択マーカー遺伝子、ベクターが高コピー数になることを指定する配列、及びベクター多量体化を低減する配列、例えばｃｅｒとを含む。ＲＮＡポリメラーゼなどの異種転写調節遺伝子産物のプロモーターなど、対象のオープンリーディングフレームに作用可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写／翻訳システムにも利用できる。

【0031】

さらに、分泌性ドメイン（シグナル）を欠失したバルナーゼをコードする単離された核酸断片と、この核酸断片を含むベクター、例えばこの核酸断片に連結されたλＰ_Lプロモーターなど、プロモーターを含むベクターと、この核酸断片にコードされた単離されたタンパク質と、このベクターを含む宿主細胞とを提供する。任意選択で、宿主細胞はバルスターを発現する。一実施形態では、宿主細胞は、原核細胞で構成的に発現されるプロモーターからバルスターを発現する。任意選択で、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。一実施形態では、バルスターのオープンリーディングフレームは４ｃプロモーターから発現される。一実施形態では、本発明のベクター系は、分泌性ドメインを欠失したバルナーゼをコードする核酸断片を含む対抗選択可能な遺伝子を含む第２のベクターを含む。例えば、本発明は、分泌性ドメインを欠失したバルナーゼをコードする核酸断片を含むベクターを、原核細胞で構成的に発現されるプロモーターからバルスターを発現する組換え宿主細胞中に導入するステップを含む方法を提供する。

【0032】

本発明のベクター系を宿主細胞内に導入するステップを含む方法であって、第２のベクターが、分泌性ドメインを欠失したバルナーゼをコードする核酸断片を含む対抗選択可能な遺伝子を含む、方法も提供する。

【0033】

３０塩基対未満のＤＮＡ断片の３’側にオープンリーディングフレームを含むベクターも提供する。このＤＮＡ断片は、リボソーム結合部位と、ＳｇｆＩ認識部位と、ｍＲＮＡ中に存在する場合にそのｍＲＮＡが真核生物リボソームのスモールサブユニットに結合するのを促進する配列とを含む。一実施形態では、このＤＮＡ断片は、ＡＡＧＧＡＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧＸ（配列番号１）を含み、配列中、Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣである。

【0034】

さらに、ＳｇｆＩ認識部位と、ｍＲＮＡ中に存在する場合にそのｍＲＮＡが真核生物リボソームのスモールサブユニットに結合するのを促進する、ＡＴＧを含む配列と、この配列中のＡＴＧで開始するオープンリーディングフレームとを含むベクターを提供する。

【0035】

本発明は、平滑末端を生成する第２の制限酵素の認識部位の５’側に３’ＴＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素の認識部位を含むベクターも含み、このベクターは、第１の制限酵素及び第２の制限酵素で消化して、ＳｇｆＩによって生成された末端、及び第３の制限酵素によって生成された末端が隣接したオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片に連結すると、このオープンリーディングフレームを含む組換えベクターを産生し、この場合、第３の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する。一実施形態では、第２の制限酵素及び第３の制限酵素が同一である。別の実施形態では、第１の制限酵素の認識部位がＳｇｆＩの認識部位である。

【0036】

３’ＴＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素の認識部位と、オープンリーディングフレーム中に存在しない、平滑末端を生成する第２の制限酵素の認識部位とを含む第１のオープンリーディングフレームを含むベクターも提供され、このベクターは、第１の制限酵素及び第２の制限酵素で消化して、ＳｇｆＩによって生成され末端及び第３の制限酵素によって生成された末端が隣接した第２のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片に連結すると、第１のオープンリーディングフレーム及び第２のオープンリーディングフレームを含む第３のオープンリーディングフレームを含む組換えベクターを産生し、この場合、第３の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、第３のオープンリーディングフレームは融合ペプチド又はタンパク質をコードする。

【0037】

さらに、ＳｇｆＩ認識部位との１ヌクレオチドのオーバーラップを任意選択で有するリボソーム結合部位と、平滑末端を生成する第１の制限酵素の認識部位とを含むベクターも提供され、このベクターは、ＳｇｆＩ及び第１の制限酵素で消化して、

【化7】

及び第２の制限酵素によって生成された平滑末端が隣接した、ペプチド又はポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片と連結すると、このペプチド又はポリペプチドをコードする組換えベクターを産生し、この場合、第２の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、配列中、Ｘ₁は、このオープンリーディングフレームの開始コドンの３’側にある最初のコドンであり、Ｘ₂はＸ₁に対して相補的であり、Ｙ₁はこのオープンリーディングフレームの残部であり、Ｙ₂はＹに対して相補的である。一実施形態では、Ｘ₁＝ＧＲ₁Ｒ₂であり、配列中、Ｒ₁又はＲ₂＝Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧである。

【0038】

さらに、ＰｍｅＩ認識部位を含み、かつ第１の制限酵素の認識部位が５’末端に隣接した第１のオープンリーディングフレームを含むベクターであって、第１の制限酵素が相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成するベクターも提供され、このベクターは、ＰｍｅＩ及び第１の制限酵素で消化されて、第２のオープンリーディングフレームの５’末端に平滑末端を含み、さらに第２の制限酵素によって生成された末端を含むＤＮＡ断片に連結されれば、第１のオープンリーディングフレーム及び第２のオープンリーディングフレームを含む第３のオープンリーディングフレームを含む組換えベクターを産生し、この場合、第２の制限酵素は、第１の制限酵素によって生成される一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する。一実施形態では、第３のオープンリーディングフレームが、Ｎ₁Ｎ₂Ｎ₃ＧＴＴＴＮ₄Ｎ₅Ｒ（配列番号７２）を含み、配列中、Ｎ₁Ｎ₂Ｎ₃及びＴＮ₄Ｎ₅は、終止コドンをコードしないコドンであり、Ｒは、１つ又は複数のコドンである。別の実施形態では、このＤＮＡ断片の平滑末端が、ＰｍｅＩ以外の制限酵素によって生成される。さらに別の実施形態では、このＤＮＡ断片の平滑末端がＰｍｅＩ消化によって生成される。

【0039】

本発明は、ＰｍｅＩ認識部位を含みかつ第１の制限酵素の部位が５’末端に隣接している第１のオープンリーディングフレームを含むベクターであって、第１の制限酵素が相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成するベクターを含む。このベクターは、ＰｍｅＩ及び第１の制限酵素で消化して、平滑末端、及び第２の制限酵素によって生成された末端を含むＤＮＡ断片に連結すると、Ｎ₁Ｎ₂Ｎ₃ＧＴＴＴＮ₄Ｎ₅を含む組換えベクターを産生し、この場合、第２の制限酵素は、第１の制限酵素によって生成される一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、配列中、Ｎ₁Ｎ₂Ｎ₃ＧＴＴＴは、消化された発現ベクターの３’末端の配列である。一実施形態では、Ｎ₁Ｎ₂Ｎ₃のトリプレットは終止コドンをコードせず、Ｎ₄及びＮ₅＝Ａ、又はＮ₄＝ＡかつＮ₅＝Ｇ、又はＮ₄＝ＧかつＮ₅＝Ａである。別の実施形態では、Ｎ₁Ｎ₂Ｎ₃のトリプレットが終止コドンをコードする。一実施形態では、このＤＮＡ断片の平滑末端がＰｍｅＩ消化によって生成される。別の実施形態では、このＤＮＡ断片の平滑末端が、ＰｍｅＩ以外の制限酵素によって生成される。

【0040】

本発明は、第１の制限酵素の認識部位を含むベクターを第１の制限酵素及び第２の制限酵素で消化して、ＳｇｆＩによって生成された末端、及び第３の制限酵素によって生成された末端が隣接したオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片に、消化されたベクターを連結することによって調製された組換えベクターであって、第１の制限酵素は、平滑末端を生成する第２の制限酵素の認識部位の５’側に３’ＴＡオーバーハングを生成し、第３の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成するベクターを提供する。

【0041】

複数の組換えベクターを含む支持体であって、これらの組換えベクターのうち１つ又は複数が、異なるオープンリーディングフレームを含む、支持体も提供する。これらの組換えベクターの少なくとも１つは、プロモーターと、２つの置換部位が隣接した第１のオープンリーディングフレームとを含む。これらの置換部位は、平滑末端を生成する第１の制限酵素の認識部位の５’側に３’ＴＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素の認識部位の５’側にプロモーターを含むベクターであって、第１の制限酵素及び第２の制限酵素で消化されたベクターと、ＳｇｆＩによって生成された末端、及び第３の制限酵素によって生成された末端が隣接した第１のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列であって、第３の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する、ＤＮＡ配列とを連結することによって形成される。少なくとも１つの組換えベクターを含む組換え細胞のライブラリー、又は、少なくとも１つの組換えベクターを含むベクターのライブラリーも提供される。

【0042】

別の実施形態では、この支持体は複数の組換えベクターを含み、これらの組換えベクターのうち２つ以上が、異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含む。少なくとも１つの組換えベクターが、プロモーターと、第２のオープンリーディングフレーム、及び第２のオープンリーディングフレームとインフレームである１つ又は複数のコドンを含む第１のオープンリーディングフレームとを含み、第２のオープンリーディングフレームには、２つの置換部位が隣接する。これらの置換部位は、ＰｍｅＩ認識部位を含み、かつ、相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素の認識部位が５’末端に隣接している第２のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列であって、ＰｍｅＩ及び第１の制限酵素で消化されたＤＮＡ配列と、前述の１つ又は複数のインフレームのコドンの５’側にある５’末端に平滑末端を含み、さらに、第２の制限酵素によって生成された末端の５’側にあるプロモーターを含むベクターであって、第２の制限酵素は、第１の制限酵素によって生成される一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成するベクターとを連結することによって形成される。少なくとも１つの組換えベクターを含む組換え細胞のライブラリー、又は、少なくとも１つの組換えベクターを含むベクターのライブラリーも提供される。

【0043】

複数の組換えベクターを含む支持体であって、これらの組換えベクターのうち２つ以上が、異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、少なくとも１つの組換えベクターが、プロモーターと、２つの置換部位が隣接したオープンリーディングフレームとを含む、支持体も提供される。これらの置換部位は、ハパックス末端制限酵素である第１の制限酵素の制限酵素部位が少なくとも２つ隣接したオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列であって、このＤＮＡ配列を第１の制限酵素で消化することによって、第１対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングが隣接した第１のＤＮＡ断片が生成される、ＤＮＡ配列と、プロモーター、及び、第２の制限酵素の制限酵素部位が２つ隣接した非必須ＤＮＡ配列を含むベクターであって、第２の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、このベクターを第２の制限酵素で消化することによって第２のＤＮＡ断片が生成され、第２のＤＮＡ断片は、非必須ＤＮＡ配列が欠失していて、かつ第２対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングが隣接しているベクターとを連結することによって形成される。第２対の非自己相補的ＤＮＡオーバーハングのそれぞれは、第１対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングの一本鎖ＤＮＡオーバーハングのうちの１つのみと相補的である。少なくとも１つの組換えベクターを含む組換え細胞のライブラリー、又は、少なくとも１つの組換えベクターを含むベクターのライブラリーも提供される。

【0044】

本発明はさらに、複数の組換えベクター又は組換え細胞を含む支持体を調製する方法を提供する。この方法は、複数の組換えベクター又は組換えベクターを含む組換え細胞を選択するステップを含み、これらの組換えベクターのうち２つ以上が異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、少なくとも１つの組換えベクターが、プロモーターと、２つの置換部位が隣接した第１のオープンリーディングフレームとを含む。これらの置換部位は、平滑末端を生成する第２の制限酵素の認識部位の５’側に３’ＴＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素の認識部位の５’側にプロモーターを含むベクターであって、第１の制限酵素及び第２の制限酵素で消化されたベクターと、ＳｇｆＩによって生成された末端、及び第３の制限酵素によって生成された末端が隣接した第１のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列であって、第３の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する、ＤＮＡ配列とを連結することによって形成される。選択された組換えベクター又は組換え細胞は、次に、支持体の１つ又は複数の容器に導入する。

【0045】

さらに、複数の組換えベクター又は組換え細胞を含む支持体を調製する方法も提供する。この実施形態では、複数の組換えベクター又は組換えベクターを含む組換え細胞が選択され、これらの組換えベクターのうち２つ以上が異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含み、これらの組換えベクターの少なくとも１つが、プロモーターと、第２のオープンリーディングフレーム、及び第２のオープンリーディングフレームとインフレームである１つ又は複数のコドンを含む第１のオープンリーディングフレームとを含み、第２のオープンリーディングフレームには、２つの置換部位が隣接する。これらの置換部位は、ＰｍｅＩ認識部位を含み、かつ、相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素の認識部位が５’末端に隣接している第２のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列であって、ＰｍｅＩ及び第１の制限酵素で消化されたＤＮＡ配列と、前述の１つ又は複数のコドンの５’側にある５’末端に平滑末端を含み、さらに、第２の制限酵素によって生成された末端の５’側にあるプロモーターを含むベクターであって、第２の制限酵素は、第１の制限酵素によって生成される一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成するベクターとを連結することによって形成される。選択された組換えベクター又は組換え細胞は、支持体の１つ又は複数の容器に導入する。

【0046】

一実施形態では、本発明は、複数の組換えベクター又は組換え細胞を含む支持体を調製する方法を提供し、この方法は、複数の組換えベクター又は組換えベクターを含む組換え細胞を選択するステップを含み、これらの組換えベクターのうち２つ以上が異なるポリペプチドのオープンリーディングフレームを含む。少なくとも１つの組換えベクターが、プロモーターと、２つの置換部位が隣接したオープンリーディングフレームとを含み、ハパックス末端制限酵素である第１の制限酵素の制限酵素部位が、少なくとも２つ隣接したオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列であって、このＤＮＡ配列を第１の制限酵素で消化することによって、第１対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングが隣接した第１のＤＮＡ断片が生成される、ＤＮＡ配列と、プロモーター、及び、第２の制限酵素の制限酵素部位が２つ隣接した非必須ＤＮＡ配列を含むベクターであって、第２の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、このベクターを第２の制限酵素で消化することによって第２のＤＮＡ断片が生成され、第２のＤＮＡ断片は、非必須ＤＮＡ配列が欠失していて、かつ第２対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングが隣接しているベクターとを連結することによって置換部位が形成される。第２対の非自己相補的ＤＮＡオーバーハングのそれぞれは、第１対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングの一本鎖ＤＮＡオーバーハングのうちの１つのみと相補的である。選択された組換えベクター又は組換え細胞は、支持体の１つ又は複数の容器内に導入する。

【0047】

複数の変異型組換えベクターを調製する方法も提供する。この方法は、３’ＴＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素の認識部位、及び第２の制限酵素の部位が隣接した複数の変異型オープンリーディングフレームを含むＤＮＡを準備するステップを含み、第２の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成する。このＤＮＡを第１の制限酵素及び第２の制限酵素で消化して、平滑末端を生成する第３の制限酵素の認識部位の５’側にあるＳｇｆＩ認識部位の５’側にあるプロモーターを含むベクターであって、ＳｇｆＩ及び第３の制限酵素で消化されたベクターに連結することによって、複数の変異型組換えベクターが産生される。

【0048】

一実施形態では、複数の変異型オープンリーディングフレームを含むＤＮＡには、ＳｇｆＩ認識部位及び第１の制限酵素の部位が隣接し、第１の制限酵素は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームで低頻度である制限部位を有し、かつ平滑末端を生成し、このＤＮＡをＳｇｆＩ及び第１の制限酵素で消化して、平滑末端を生成する第３の制限酵素の認識部位の５’側に３’ＴＡオーバーハングを生成する第２の制限酵素の認識部位の５’側にプロモーターを含むベクターであって、第２の制限酵素及び第３の制限酵素で消化されたベクターに連結することによって、複数の変異型組換えベクターが産生される。

【0049】

本発明は、複数の変異型組換えベクターを調製する方法も含み、この方法は、ハパックス末端制限酵素であり、かつ第１対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素の制限酵素部位が２つ隣接した複数の変異型オープンリーディングフレームを含むＤＮＡを準備するステップを含む。このＤＮＡを第１の制限酵素で消化して、プロモーター、及び、第２の制限酵素の制限酵素部位が２つ隣接した非必須ＤＮＡ配列を含むベクターに連結することによって、複数の変異型組換えベクターが産生し、第２の制限酵素はハパックス末端制限酵素であり、このベクターを第２の制限酵素で消化することによって、非必須ＤＮＡ配列を欠くが第２対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含むＤＮＡ断片が生成され、第２対の非自己相補的ＤＮＡオーバーハングのそれぞれは、第１対の非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングの一本鎖ＤＮＡオーバーハングのうちの１つのみと相補的である。

【0050】

本発明のベクター及びこれらのベクターを用いた本発明の方法は、オープンリーディングフレームの方向性クローニングに特に有用である。しかし、本発明のベクター及び方法が他の適用にも有用であり、それらは、例えば、バクテリオファージポリメラーゼなどのポリメラーゼに特異的なプロモーターを有するベクターを用いて、例えばプローブ、例えば放射性又は非放射性のプローブを調製するのに、或いは、一本鎖のセンス若しくはアンチセンスプローブ又は治療用のアンチセンスＲＮＡを調製するのに、或いは、アンチセンスの方向性で遺伝子を挿入して、それによって、その遺伝子が発現されないようにするか、例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘ（米国特許第５，６５８，７７２号）、ＦＬＰ／ＦＲＴ、ＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｉｎリコンビナーゼ、及びｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳシステムを用いた組換えを介した構造再編成の後にのみ発現されるようにする（条件的遺伝子不活性化）のに利用することができる。

【0051】

遺伝子解析を行う方法も提供する。この方法は、遺伝子データのデータベースに遺伝子データを格納して、複数の遺伝子記録を生成するステップを含む。遺伝子データを含有するデータベースを検索して、遺伝子記録の第１のサブセットを同定するが、その際、１セットの所定の制限酵素に含まれる制限酵素の認識部位を、各記録が少なくとも１つ有し、第１のサブセット中の少なくとも第２のサブセットの遺伝子記録の制限酵素認識部位に関連した１セットの統計を決定する。

【0052】

一実施形態では、この１セットの統計を決定するステップは、ある所定の制限酵素、又は所定の制限酵素前記１セットに含まれる各制限酵素の認識部位を含む遺伝子記録の数を決定することを含む。別の実施形態では、この１セットの統計を決定するステップは、第２のサブセット中の１遺伝子記録における、所定の１制限酵素、又は前記所定の制限酵素の少なくとも１つの部位の発生数を決定することを含む。さらに別の実施形態では、遺伝子記録が核酸配列を含む。一実施形態では、サブセットの遺伝子記録をふるい分けて、選択された１つ又は複数の特性を有する遺伝子記録を含めるか、或いは排除することをさらに含む。さらに別の実施形態では、サブセットの遺伝子記録をふるい分けて、所定の値より大きなサイズを有する遺伝子記録を排除することをさらに含む。一実施形態では、この所定の値が２１０００字である。この方法は、認識部位中の不確定塩基として存在する特定の塩基、又は制限酵素の認識部位と、認識部位を含有するＤＮＡを前記制限酵素が切断する位置との間に存在する特定の塩基の配列を決定することをさらに含む。一実施形態では、これらの制限酵素の少なくとも１つが、６ｂｐ、７ｂｐ、又は８ｂｐの認識部位を有する。一実施形態では、これらの制限酵素の少なくとも１つがハパックス末端制限酵素である。

【0053】

さらに、遺伝子解析を行う方法を実行するための、コンピュータで実施可能な指令を有するコンピュータ読み込み可能な媒体を提供する。この媒体は、遺伝子データのデータベースに複数の遺伝子記録を格納すること、所定の１制限酵素、又は１セットの所定の制限酵素に含まれる制限酵素の認識部位を各記録が少なくとも１つ有する遺伝子データのデータベースを検索して、第１のサブセットの遺伝子記録を同定すること、及び、第１のサブセット中の少なくとも第２のサブセットの遺伝子記録の制限酵素認識部位に関連した１セットの統計を決定することを含む。遺伝子解析用の計算機化されたシステムも提供する。このシステムは、遺伝子データのデータベースと、プロセッサーと、第１のサブセットの遺伝子記録を同定するための、遺伝子データのデータベースの検索であって、所定の１制限酵素、又は１セットの所定の制限酵素に含まれる制限酵素の認識部位を各記録が少なくとも１つ有する、検索、及び、第１のサブセット中の少なくとも第２のサブセットの遺伝子記録の制限酵素認識部位に関連した１セットの統計の決定を行わせる、プロセッサーによって実行される１セットの１つ又は複数のプログラムとを含む。一実施形態では、この１セットの統計は、ある所定の制限酵素、又は所定の制限酵素の１セットに含まれる各制限酵素の認識部位を含む遺伝子記録の数を含み、例えばこれを決定することを含む。一実施形態では、この１セットの統計は、第２のサブセット中の１遺伝子記録における、所定の１制限酵素、又は前記所定の制限酵素の少なくとも１つの部位の発生数を含み、例えばこれを決定することを含む。一実施形態では、遺伝子記録が核酸配列を含む。一実施形態では、サブセットの遺伝子記録をふるい分けて、選択された１つ又は複数の特性を有する遺伝子記録を含めるか、或いは排除することが、この方法にさらに含まれるか、或いは、プロセッサーによってさらに実行可能である。別の実施形態では、サブセットの遺伝子記録をふるい分けて、所定の値より大きなサイズを有する遺伝子記録を排除することが、この方法にさらに含まれるか、或いは、プロセッサーによってさらに実行可能である。一実施形態では、所定の値が２１０００字である。別の実施形態では、認識部位中の不確定塩基として存在する特定の塩基、又は、制限酵素の認識部位と、認識部位を含有するＤＮＡを前記制限酵素が切断する位置との間に存在する特定の塩基の配列を決定することが、この方法にさらに含まれるか、或いは、プロセッサーによってさらに実行可能である。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】ハパックス部位の例（配列番号１６及び２０）を示す図である。

【図2】３’又は５’オーバーハングを有するハパックス部位の例を示す図である。図２Ａは、ＡｌｗＮＩによって認識される部位の対称性を示す図である。ＡｌｗＮＩは、認識部位内の分断されたパリンドロームを切断する制限酵素である。「Ｎ」と示した塩基を無視すれば、この部位は対称性においてＰｖｕｌｌ部位と同等である。矢印は、両方の鎖における切断部位を示す。二回転対称軸が存在するため、規定しなければならないのは、一方の鎖における認識部位及び切断部位のみであることに留意されたい。しかし、ＡｌｗＮＩによる切断は、不特定の塩基それぞれについて４つの可能性を有する３塩基から成るオーバーハングを有するＤＮＡをもたらすので、末端の配列は鎖によって異なるであろう。図２Ｂは、両方の方向性で示したＦｏｋＩの認識部位及び切断部位（配列番号７３〜７４）を示す図である。この部位は対称性をもたないので、５’から３’への塩基を記す方法が２通りある。切断がどこで起こるかを示すには、両鎖の切断部位を指定しなければならず、これらは矢印によって示した。認識部位の外に切断部位があるので、一本鎖のオーバーハングは４つの塩基の任意のセットになりうる。ＡｌｗＮＩは３’オーバーハングを生成し、一方、ＦｏｋＩは５’オーバーハングを生成することに留意されたい。

【図3】ある特定の生物のゲノムにおいて低頻度の認識部位を有する制限酵素を同定するためのフローチャートを示す図である。

【図4】様々な生物における、ＳａｐＩ、ＳｆｉＩ、又はＳｇｆＩ／ＰｍｅＩの認識部位を含まない配列（０）、０若しくは１つ含む配列（０−１）、又は０、１つ、若しくは２つ含む配列（０−２）のパーセントの比較を示す図である。

【図5A】６生物種における、選択された制限酵素（配列番号２０、５５、７１、及び７５〜７８）の部位存在率を示す図である。

【図5B】６生物種における、選択された制限酵素（配列番号２０、５５、７１、及び７５〜７８）の部位存在率を示す図である。

【図5C】６生物種における、選択された制限酵素（配列番号２０、５５、７１、及び７５〜７８）の部位存在率を示す図である。

【図6】方向性クローニングにおける、中断されたパリンドロームの使用の概要を示す図である。

【図7】ＳｆｉＩ（配列番号７及び８０）を用いた方向性クローニングを示す図である。

【図8】ＰＣＲによる中断パリンドロームのクローニング経路を示す図である。

【図9A】ＰＣＲによる中断パリンドロームのクローニング経路を示す図である。

【図9B】ＰＣＲによる中断パリンドロームのクローニング経路を示す図である。

【図10A】ＰＣＲによる中断パリンドロームのクローニング経路を示す図である。

【図10B】ＰＣＲによる中断パリンドロームのクローニング経路を示す図である。

【図11】ＳｆｉＩ又は他の制限酵素によって生成される３塩基３’オーバーハング（配列番号７、１２、１４、２０、７９、及び８１〜８２）を用いた方向性クローニングに有用な制限エンドヌクレアーゼを示す図である。

【図12】方向性クローニングにおけるＩＩＳ型酵素の使用の概要を示す図である。

【図13】ＳａｐＩ（配列番号４及び１６）を用いた方向性クローニングを示す図である。

【図14】付着末端を生成する酵素と、平滑末端を生成する酵素、例えばＳｇｆＩ及びＰｍｅＩを用いた方向性クローニングの２酵素アプローチを示す図である。

【図15】ＰＣＲ挿入を用いた２酵素クローニング経路を示す図である。

【図16】Ｎ末端融合体の生成、又はＮ末端に融合しない場合における（配列番号８３〜８５）ＳｇｆＩの使用を示す図である。

【図17】単一アミノ酸との融合を含むＣ末端融合体（配列番号８６〜８８）を生成するＰｍｅＩの使用を示す図である。

【図18】２つの対象のタンパク質をコードするベクターを調製するための、ＳｇｆＩ、ＰｍｅＩ、ＰａｃＩ、及びＳｗａＩの組合せの使用を示す図である。

【図19】Ｎ端末のＰａｃＩ−ＳｇｆＩ融合部位（配列番号８９〜９０）、及びＣ末端のＰｍｅＩ−ＳｗａＩ融合部位（配列番号９１）を示す図である。

【図20A】例示的なルシフェラーゼドナーベクター及びアクセプターベクターを示す図である。

【図20B】識別可能なルシフェラーゼ遺伝子に隣接したＳｆｉＩ部位を有するドナーベクター配列及びアクセプターベクター配列の分析的連結を示す図である。

【図21A】本発明のベクター例を示す図である。ＫａｎＲ＝カナマイシン耐性遺伝子；ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子；ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ＝複製開始点配列；ｃｅｒ＝ＸｅｒＣＤ部位特異的リコンビナーゼ標的部位；ｒｒｎＢ ｔｅｒｍ＝双方向性ターミネーター；Ｔ７Ｐ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ＲＢＳ／Ｋｏｚａｋ＝リボソーム結合部位及びコザック配列；並びに、Ｔ７ ｔｅｒｍ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ終止配列である。

【図21B】本発明のベクター例を示す図である。ＫａｎＲ＝カナマイシン耐性遺伝子；ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子；ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ＝複製開始点配列；ｃｅｒ＝ＸｅｒＣＤ部位特異的リコンビナーゼ標的部位；ｒｒｎＢ ｔｅｒｍ＝双方向性ターミネーター；Ｔ７Ｐ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ＲＢＳ／Ｋｏｚａｋ＝リボソーム結合部位及びコザック配列；並びに、Ｔ７ ｔｅｒｍ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ終止配列である。

【図21C】本発明のベクター例を示す図である。ＫａｎＲ＝カナマイシン耐性遺伝子；ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子；ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ＝複製開始点配列；ｃｅｒ＝ＸｅｒＣＤ部位特異的リコンビナーゼ標的部位；ｒｒｎＢ ｔｅｒｍ＝双方向性ターミネーター；Ｔ７Ｐ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ＲＢＳ／Ｋｏｚａｋ＝リボソーム結合部位及びコザック配列；並びに、Ｔ７ ｔｅｒｍ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ終止配列である。

【図21D】本発明のベクター例を示す図である。ＫａｎＲ＝カナマイシン耐性遺伝子；ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子；ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ＝複製開始点配列；ｃｅｒ＝ＸｅｒＣＤ部位特異的リコンビナーゼ標的部位；ｒｒｎＢ ｔｅｒｍ＝双方向性ターミネーター；Ｔ７Ｐ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ＲＢＳ／Ｋｏｚａｋ＝リボソーム結合部位及びコザック配列；並びに、Ｔ７ ｔｅｒｍ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ終止配列である。

【図21E】本発明のベクター例を示す図である。ＫａｎＲ＝カナマイシン耐性遺伝子；ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子；ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ＝複製開始点配列；ｃｅｒ＝ＸｅｒＣＤ部位特異的リコンビナーゼ標的部位；ｒｒｎＢ ｔｅｒｍ＝双方向性ターミネーター；Ｔ７Ｐ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ＲＢＳ／Ｋｏｚａｋ＝リボソーム結合部位及びコザック配列；並びに、Ｔ７ ｔｅｒｍ＝Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ終止配列である。

【図22A】３種の異なった宿主における、３７℃での発現誘導の後でのルシフェラーゼの発現を示す図である。

【図22B】３種の異なった宿主における、２５℃での発現誘導の後、ｔ＝０でのルシフェラーゼの発現を示す図である。

【図22C】３種の異なった宿主における、２５℃での発現誘導の後、ｔ＝５時間及び２１時間でのルシフェラーゼの発現を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0055】

定義
「ユニークな制限酵素部位」という用語は、所与の制限酵素の認識配列が核酸分子中に１つ存在することを示す。

【0056】

「ポリリンカー」又は「多重クローニング部位」という用語は、遺伝子及びｌｏｘ部位などのコード領域など、核酸配列の挿入及び／又は切り出しに使用される、核酸コンストラクトにおける制限酵素部位のクラスターを指す。

【0057】

「原核細胞の終止配列」という用語は、原核細胞宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼによって認識され、その結果、転写の終結をもたらす核酸配列を示す。原核細胞の終止配列は、通常、二回転対称のＧＣリッチ領域と、それに続くＡＴリッチ配列とを含む。一般的に使用されている原核細胞の終止配列は、Ｔ７及びｒｒｎＢの終止配列である。バクテリオファージラムダ由来のＴ_INT、Ｔ_L1、Ｔ_L2、Ｔ_L3、Ｔ_R1、Ｔ_R2、及びＴ_6S終止シグナル、並びに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒｐ遺伝子などの細菌遺伝子由来の終止シグナルを含めた様々な終止配列が当技術分野で知られており、本発明の核酸コンストラクトで利用できる。

【0058】

「真核細胞ポリアデニル化配列」（「ポリＡ部位」又は「ポリＡ配列」とも呼ばれる）という用語は、本明細書で使用される場合、新生ＲＮＡ転写産物の終止及びポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を指す。ポリＡテールを欠く転写産物は不安定であり、迅速に分解されるので、組換え転写産物の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターで用いるポリＡシグナルは、「異種」のものでも、「内在性」のものでもよい。内在性ポリＡシグナルは、ゲノム中における所与の遺伝子のコード領域の３’末端に天然に見出されるものである。異種ポリＡシグナルは、ある遺伝子から単離されて、別の遺伝子の３’に配置されているものである。一般的に使用されている異種ポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡシグナルである。ＳＶ４０ポリＡシグナルは、２３７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ制限断片に含有されており、終止及びポリアデニル化の両方を指示し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ社、（１９８９年））、多数のベクターがＳＶ４０ポリＡシグナルを含有する。一般的に使用されている別の異種ポリＡシグナルはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子に由来するものであり、ＢＧＨポリＡシグナルは市販されている多数のベクターで利用可能である。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ｔｋ）遺伝子由来のポリＡシグナルも、発現ベクターで、ポリＡシグナルとして使用される。

【0059】

本明細書で使用する場合、「選択マーカー」又は「選択マーカー遺伝子」という用語は、それなしには、必須栄養素であろうものを欠失した培地中で増殖する能力を与える酵素活性をコードする遺伝子（例えば酵母細胞のＴＲＰ１遺伝子）の使用を意味し、さらに、選択マーカーは、選択マーカーが発現されている細胞に、抗生物質又は薬物に対する耐性を与えるものでもよい。選択マーカーは、宿主細胞に特定の表現型を与えるために使用することもできる。宿主細胞が選択培地中で増殖するのに選択マーカーを発現しなければならない場合に、このマーカーは正の選択マーカーであるという（例えば、適当な抗生物質の存在下で増殖する能力を与える抗生物質抵抗性遺伝子）。選択マーカーは、特定の遺伝子を含有する宿主細胞に対して否定的な選択を行うのに使用することもでき（例えばｓａｃＢ遺伝子、この遺伝子は発現された場合に、５％のショ糖を含有する培地中で培養された細菌宿主細胞を殺す）、この様に用いられた選択マーカーは負の選択マーカー又は対抗選択可能なマーカーと呼ばれる。

【0060】

本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、１つの細胞から別の細胞にＤＮＡセグメントを導入する核酸分子について使用する。「ビークル」という用語は、「ベクター」と互換性をもって使用される。「ベクター」は「核酸コンストラクト」の１種である。「核酸コンストラクト」という用語には、プラスミドコンストラクト、プラスミドコンストラクト、及びコスミドベクター環状核酸コンストラクトが含まれ、線状核酸コンストラクト（例えば、ラムダ、ファージコンストラクト、ＰＣＲ産物）も同様に含まれる。核酸コンストラクトはプロモーター、そして／又は、エンハンサーなどの発現シグナルを含んでもよい（このような場合にはそれは発現ベクターと呼ばれる）。

【0061】

「発現ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、所望のコード配列と、特定の宿主生物における、作用可能に連結されたコード配列の発現に必要な適当な核酸配列とを含有する組換えＤＮＡ分子を指す。原核細胞での発現に必要な核酸配列には、通常、プロモーター、オペレーター（任意選択）、及びリボソーム結合部位が含まれるが、他の配列が含まれることも多い。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、終止シグナル、及びポリアデニル化シグナルを用いることが知られている。

【0062】

「作用可能な組合せ」、「作用可能な順序」、及び「作用可能に連結した」という用語は、本明細書で使用される場合、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を指示できる核酸分子が生成されるような方法での核酸配列の連結を意味する。この用語は、機能タンパク質が生成される方法でのアミノ酸配列の連結も意味する。

【0063】

「形質転換」及び「形質移入」という用語は、本明細書で使用される場合、原核細胞又は真核細胞の中に外来ＤＮＡを導入することを意味する。原核細胞の形質転換は、コンピテント細胞を作製するための、ＣａＣｌ₂での宿主細胞の処理、及びエレクトロポレーションなどを含めた、当技術分野で知られている様々な方法によって実施することができる。真核細胞の形質移入は、カルシウムリン酸ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション法、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合法、レトロウイルス感染、及びバイオリスティクスを含めた、当技術分野で知られている様々な方法によって実施することができる。

【0064】

本明細書で使用する場合、「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」という用語は、それぞれ、特定のヌクレオチド配列において、或いはその近傍で二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素を指す。

【0065】

本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ分子」という用語は、分子生物学的技法によって一体にされたＤＮＡセグメントから成るＤＮＡ分子を指す。

【0066】

本明細書で使用する場合、「認識部位」は、その配列が二本鎖ＤＮＡに存在する場合は、制限酵素によって認識される特定の塩基配列；或いは、その配列が一本鎖ＲＮＡに存在する場合は、そのＲＮＡがｃＤＮＡに逆転写されて、そのｃＤＮＡを鋳型として用いてＤＮＡポリメラーゼで二本鎖ＤＮＡを生成させた場合に、制限酵素によって認識されるであろう特定の塩基配列；或いは、その配列が一本鎖ＤＮＡに存在する場合は、その一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いてＤＮＡポリメラーゼで二本鎖ＤＮＡを生成させた場合に、制限酵素によって認識されるであろう特定の塩基配列；或いは、その配列が二本鎖ＲＮＡに存在する場合は、ＲＮＡのいずれかの鎖がｃＤＮＡに逆転写されて、そのｃＤＮＡを鋳型として用いてＤＮＡポリメラーゼで二本鎖ＤＮＡを生成させた場合に、制限酵素によって認識されるであろう特定の塩基配列を指す。

【0067】

「オープンリーディングフレーム」は、終止コドンでないコドンを少なくとも３つ連続して含む。

【0068】

ＤＮＡ分子は、「５’末端」及び「３’末端」を有すると言われるが、これは、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、ホスホジエステル結合を介して、その近傍のものの３’酸素に一定方向で結合する様式で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを生成するためである。したがって、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていなければ、「５’末端」と呼び、３’酸素が後続のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結されていなければ、「３’末端」と呼ぶ。本明細書で使用する場合、核酸配列は、さらに大きなオリゴヌクレオチドの内部にある場合にも、５’末端及び３’末端を有するということができる。線状のＤＮＡ分子でも、環状のＤＮＡ分子でも、個別のエレメントは、「下流」又は３’側のエレメントの「上流」又は５’側にあるという。この用語は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’に向かって進行するという事実を反映している。連結している遺伝子の転写を指示するプロモーター及びエンハンサーエレメントは、通常、コード領域の５’側又は上流に見出される。しかし、エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメント及びコード領域の３’側に位置する場合にも、その作用を及ぼすことができる。転写終止シグナル及びポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’側又は下流に位置する。

【0069】

本明細書で使用する場合、「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」という用語は、その遺伝子のコード領域を含む核酸配列、又は、換言すれば、遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡの形態で存在しうる。ＤＮＡの形態で存在する場合、このオリゴヌクレオチドは、一本鎖（すなわちセンス鎖）か、又は二本鎖でありうる。エンハンサー／プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどの適当な調節エレメントは、転写の適切な開始及び／又は一次ＲＮＡ転写物の正しいプロセシングを可能にするのに必要な場合には、遺伝子のコード領域の極めて近傍に配置することができる。別法として、本発明のベクターで使用されるコード領域は、内在性のエンハンサー／プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、又は内在性の調節エレメント及び外来性の調節エレメント両方の組合せを含むこともある。

【0070】

本明細書で使用する場合、「調節エレメント」という用語は、核酸配列の発現における何らかの様相を制御する遺伝子エレメントを指す。例えば、プロモーターは、作用可能に連結したコード領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。他の調節エレメントには、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、及び同様のものが含まれる。

【0071】

真核細胞の転写調節シグナルには、「プロモーター」及び「エンハンサー」エレメントが含まれる。プロモーター及びエンハンサーは、転写に関与する細胞性タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短いアレイから成る（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３６：１２３７（１９８７年））。プロモーター及びエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫、哺乳類細胞、及びウイルスの遺伝子を含めた様々な真核細胞供給源から単離されている（類似の調節エレメント、すなわちプロモーターは原核細胞にも見出されている）。特定のプロモーター及びエンハンサーの選択は、対象のタンパク質を発現させるのに、どの細胞型が使用されるかによる。一部の真核細胞プロモーター及びエンハンサーは、広範な宿主を有し、一方、他のものは限定されたサブセットの細胞型で機能する（概説には、Ｖｏｓｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７（１９８６年）及びＭａｎｉａｔｉｓら、同上（１９８７年）を参照）。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多数の哺乳類種に由来する様々な細胞型で非常に活性が強く、哺乳類細胞でのタンパク質発現に広範に使用されている（Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ．、４：７６１（１９８５年））。広範な哺乳類細胞型で活性の高いプロモーター／エンハンサーエレメントの他の２つ例が、ヒト伸長因子１０遺伝子由来のエレメント（Ｕｅｔｓｕｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２６４：５７９１（１９８９年）、Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ、２１：２１７（１９９０年）、及び、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：５３２２（１９９０年））、並びに、ラウス肉腫ウイルス（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：６７７７（１９８２年））及びヒトサイトメガロウイルス（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１（１９８５年））の長末端反復である。

【0072】

本明細書で使用する場合、「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター及びエンハンサーの機能の両方（すなわち、プロモーターエレメントによって提供される機能と、エンハンサーエレメントによって提供される機能、これらの機能に関する論述は上記参照）を提供できる配列を含有するＤＮＡセグメントを指す。例えば、レトロウイルスの長末端反復は、プロモーター及びエンハンサーの両方の機能を含有する。エンハンサー／プロモーターは、「内在性」でも、「外来性」でも、「異種」でもよい。「内在性」のエンハンサー／プロモーターは、ゲノム中における所与の遺伝子と自然な状態で連結されているものである。「外来性」又は「異種」のエンハンサー／プロモーターは、遺伝操作（すなわち分子生物学的技法）によって、ある遺伝子の近位に、その遺伝子の転写が、連結されているエンハンサー／プロモーターによって指示されるように配置されているものである。

【0073】

発現ベクターに「スプライシングシグナル」が存在すると、組換え転写産物の発現がより高いレベルになることが多い。スプライシングシグナルは、一次ＲＮＡ転写物からのイントロンの除去を媒介し、スプライシングドナー部位及びアクセター部位から成る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１６．７−１６．８（１９８９年））。一般的に使用されているスプライシングドナー及びアクセプター部位は、ＳＶ４０の１６ＳＲＮＡ由来のスプライス部位である。

【0074】

真核細胞における組換えＤＮＡ配列の効率的発現は、結果として生成される転写産物の効率的な終止及びポリアデニル化を指示するシグナルの発現が必要である。転写終止シグナルは、通常、ポリアデニル化シグナルの下流に見出され、長さが数１００ヌクレオチドである。「ポリＡ部位」又は「ポリＡ配列」という用語は、本明細書で使用する場合、新生ＲＮＡ転写産物の終止及びポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を指す。ポリＡテールを欠く転写産物は不安定であり、迅速に分解されるので、組換え転写産物の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターで用いるポリＡシグナルは、「異種」のものでも、「内在性」のものでもよい。内在性ポリＡシグナルは、ゲノム中における所与の遺伝子のコード領域の３’末端に天然に見出されるものである。異種ポリＡシグナルは、ある遺伝子から単離されて、別の遺伝子の３’に配置されているものである。

【0075】

真核細胞の発現ベクターは、「ウイルスレプリコン」又は「ウイルスの複製開始点」も含有しうる。ウイルスレプリコンは、適切な複製因子を発現する宿主細胞内でベクターの染色体外の複製を可能にするウイルスＤＮＡ配列である。ＳＶ４０又はポリオーマウイルスの複製開始点を含有するベクターは、適切なウイルス性Ｔ抗原を発現する細胞で高コピー数（最大１０⁴コピー／細胞）に複製される。ウシ乳頭腫ウイルス又はエプスタインーバーウイルスのレプリコンを含有するベクターは、染色体外において低コピー数（約１００コピー／細胞）で複製される。

【0076】

本明細書で使用する場合、「コードする核酸分子」、「コードするＤＮＡ配列」、及び「コードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を意味する。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。したがって、ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードする。

【0077】

本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、ある遺伝子、例えば、構造遺伝子のコード領域と、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに相当するように、両末端から約１ｋｂの距離にわたって、コード領域の５’末端及び３’末端の両方に隣接した位置に含まれる配列とを含むデオキシリボヌクレオチド配列を意味する。コード領域の５’側に位置し、かつｍＲＮＡ中に存在する配列を５’非翻訳配列と呼ぶ。コード領域の３’側又は下流に位置し、かつｍＲＮＡ中に存在する配列を３’非翻訳配列と呼ぶ；これらの配列。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡ形態及びゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態又はゲノムクローンは、「イントロン」、「介在領域」又は「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって分断されたコード領域を含有する。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写された遺伝子のセグメントであり；イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含有しうる。イントロンは、核転写産物又は一次転写産物から除去又は「スプライスアウト」され；したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物から欠失している。ｍＲＮＡは、翻訳中、新生ポリペプチドのアミノ酸の配列又は順序を特定する機能を有する。

【0078】

イントロンを含有することに加えて、ゲノム形態の遺伝子は、ＲＮＡ転写物存在する配列の５’末端及び３’末端の両方に位置する配列を含みうる。これらの配列は、「隣接」配列又は領域と呼ばれる（これらの隣接配列は、ｍＲＮＡ転写物に存在する非翻訳配列の５’側又は３’側に位置する）。５’隣接領域は、プロモーター及びエンハンサーなど、遺伝子の転写を制御するか、これに影響を与える調節配列を含有しうる。３’隣接領域は、転写、転写後切断、及びポリアデニル化の終止を指示する配列を含有しうる。

【0079】

本明細書で使用する場合、「精製された」又は「精製する」という用語は、試料から夾雑物の除去することを意味する。

【0080】

本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ分子」という用語は、分子生物学的技法によって一体にされたＤＮＡセグメントから成るＤＮＡ分子を指す。

【0081】

「組換えタンパク質」又は「組換えポリペプチド」という用語は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ分子から発現されるタンパク質分子を指す。

【0082】

「天然タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、タンパク質が、ベクター配列によってコードされたアミノ酸残基を含有しないことを示し、すなわち、天然タンパク質は、天然に存在するタンパク質に見出されるアミノ酸のみを含有する。天然タンパク質は、組換えによる方法によって生成しても、或いは天然に存在する供給源から単離してもよい。

【0083】

本明細書で使用する場合、「部分」という用語は、タンパク質に関して言及する場合（「所与のタンパク質の部分」などにおいて）、そのタンパク質の断片を指す。断片は、２アミノ酸残基又はそれより大きなものから、全アミノ酸配列から１アミノ酸を引いた大きさのものにまで及びうる。

【0084】

本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」は、対象のタンパク質と、これに結合した別のペプチド又はタンパク質断片とを含有するキメラタンパク質を指す。融合パートナーは、結合している、対象のタンパク質の溶解性を促進するものでも、例えばその融合体を発現する宿主細胞若しくはその細胞の培養上清、又はこれら両方から、組換え融合タンパク質の同定及び／又は精製を可能にするエピトープタグ又は親和性ドメインを提供するものでも、或いは、別の特性又は活性を有するものでもよく、例えば２つの機能性酵素を融合させて、複数の酵素活性を有する単一タンパク質を生成させることができる。それが望しい場合には、当技術分野で知られている様々な酵素的又は化学的方法によって、対象のタンパク質から融合タンパク質を除去することができる。したがって、本発明のベクターで有用な配列を生成する融合タンパク質の例には、エピトープタグをコードする配列、親和性ドメインをコードする配列、又は他の機能タンパク質をコードする配列、及び同様のものが含まれる。本明細書で使用する場合、「機能タンパク質をコードする配列」という用語の使用は、融合タンパク質を生成するベクターエレメントが、酵素活性、例えばルシフェラーゼ又はデハロゲナーゼ、結合活性、並びに同様のもの、例えばチオレドキシンなど、特定の活性を有するタンパク質又はペプチドをコードすることを示す。例えば、機能タンパク質をコードする配列は、キナーゼ触媒ドメイン（Ｈａｎｋｓ及びＨｕｎｔｅｒ、ＦＡＳＥＢ Ｊ、９：５７６−５９５、１９９５年）をコードするものでもよく、この場合、特定のアミノ酸にリン酸部分を酵素的に付加できる融合タンパク質が生成され、或いは、Ｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメイン（Ｓａｄｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．、６：４３９６、１９８６年；Ｍａｙｅｒ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３：８、１９９３年）をコードするものでもよく、この場合、リン酸化チロシンに特異的に結合する融合タンパク質が生成される。

【0085】

Ｉ．本発明のベクター及び方法において有用な制限酵素部位及び酵素
本発明では、方向性クローニング及び秩序ある遺伝子集合に対する２つの一般的アプローチを使用する。１つのアプローチでは、ハパックス末端制限酵素、例えば、縮重認識又は開裂配列を有する制限酵素認識部位（図１〜２参照）の制限部位を使用する。ハパックス末端酵素は、ユニークな末端を生成することが可能な酵素である（表１）。ＩＩＳ型酵素のＦｏｋＩが含まれ、分断されたパリンドロームのＡｌｗＮＩも含まれる。切断部位は不特定の塩基内に位置しているので、末端はＮで表される。分断又は隣接する認識部位の完全なヌクレオチド配列が書かれていない限り、末端の詳細な性質を述べることはできない。統計学的に述べると、すべての一本鎖のオーバーハングは異なっている。また、これらのオーバーハングが対称要素を有することも考えられない。一般的に、このことは、突出塩基は逆方向の相補配列が後に続く非対称単位の構成はとらず、末端は自己相補的とはならず、そのような末端を有する断片を有するコンカテマーを形成することは不可能となる、ことを意味する。ＥｃｏＲＩなどの非ハパックス末端酵素では、反対の状況が支配的である。認識部位Ｇ↓ＡＡＴＴＣ及び切断によって生成されるオーバーハング末端ＡＡＴＴの両方は、常にパリンドローム様エレメントを示し、あらゆる断片のオーバーハングは、それ自体と相補的であり、同じ酵素によって生成された他のすべての断片の突出末端と相補的である。

【表1】

【0086】

平滑末端を生成する酵素は、決してハパックス末端となることはできない。例えば、ＢｓａＢＩの制限部位はＮを有するが、この酵素は平滑末端を生成する。

【0087】

外見的にハパゾマーであるが、機能的にはハパゾマーでない酵素がある。制限エンドヌクレアーゼは、このカテゴリーであり、それぞれＡｌｗＩ及びＢｐｍＩなどのわずか１種又は２種の不特定の塩基のオーバーハングを生成する（表２）。反対に、複数の縮重を有する部位を認識するそれらのＩＩ型酵素は、機能的にハパゾマーであるが、外見的にハパゾマーではない。例えば、いくつかの位置でＢｓｐ１２８６Ｉによって断片が切断された場合（表２）、一本鎖の伸長のアレイ、例えば、ＧＧＣＣ、ＴＧＣＡ、ＡＧＣＴ、ＧＧＣＡ、ＧＧＣＴ、ＡＧＣＣ、ＡＧＣＡ、ＴＧＣＣ及びＴＧＣＴが生じる。これらの最初の３つは、考慮の対象から除外される明らかな対称要素を有する。後半の６つの突出は、対称要素を持たず、したがって、自己相補的でも、自己連結的でもない。これらはユニークとなる可能性がある。その上で、Ｂｓｐ１２８６Ｉはハパゾマーである。ハパゾターミニシティは、対称性を欠くオーバーハングを有限割合で生じる能力である。制限酵素認識部位の対称性又はその欠如は、全く重要でない。

【表2】

【0088】

Ｂｓｐ１２８６Ｉは、各鎖上に４つの塩基のオーバーハングを有する。２つの塩基はユニークのものとして特定され、２つの塩基は３つの可能性のうちの１つに限定される。明らかに、末端がユニークである統計的な可能性は、２つの完全に不特定のオーバーハング塩基を生成するより少ない。そのような酵素は、ＢｃｇＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｒＤＩ、ＤｒｄＩ及びＥｃｏ５７Ｉを含む。

【0089】

本発明の一実施形態において、ドナーベクターを入手又は調製する。このドナーベクターは、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接し、このうち少なくとも１つが縮重認識配列を有する第１の制限酵素の部位である、対象のＤＮＡ配列を含む。他の実施形態では、対象のＤＮＡ配列には、縮重認識配列を有する制限酵素のための２つの制限酵素部位が隣接し、この部位は同一ではなく、それゆえに、ドナーベクターがその酵素によって切断されると、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有する線状ＤＮＡが産生される。また、ドナーベクターは、場合によっては、対象のＤＮＡ配列ではない、例えば、選択マーカー遺伝子がベクター骨格の一部である、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子も含む。ドナーベクターは、一定方向で、対象のＤＮＡ配列をアクセプターベクターに導入して、得られたレシピエントベクターにおいて対象のＤＮＡ配列を発現させるために有用である。アクセプターベクターは、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する縮重認識配列を有する第２の制限酵素のための少なくとも２つの制限酵素部位が隣接する非必須ＤＮＡ配列を含む。これらの部位は、切断されると、第１の制限酵素によって生成された２つの一本鎖ＤＮＡオーバーハングのうちの１つだけにそれぞれが相補的である一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生じる。一実施形態では、第１の制限酵素と第２の制限酵素は同一である。他の実施形態では、第１の制限酵素と第２の制限酵素は異なり、及びアイソシゾマーではなく、したがって、得られた連結配列（交換部位）は、対象のＤＮＡ配列を導入するために使用される縮重認識配列を有する制限酵素のうちの少なくとも１つによって切断することはできない。例えば、ＢｇｌＩによって生成した一本鎖ＤＮＡオーバーハングとＳｆｉＩによって生成した一本鎖ＤＮＡオーバーハングの融合により、ＳｆｉＩには切断できないが、ＢｇｌＩには切断できる交換部位が生じる。同様に、ＳｇｆＩによって生成した一本鎖ＤＮＡオーバーハングとＰｖｕＩによって生成した一本鎖ＤＮＡオーバーハングの融合により、ＳｇｆＩには切断できないが、ＰｖｕＩには切断できる交換部位が生じる。さらに、ＰｍｅＩによって産生した末端とＤｒａＩによって産生した末端との融合により、ＰｍｅＩには切断できないが、ＤｒａＩには切断できる交換部位が生じる。

【0090】

別のアプローチでは、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接した対象のＤＮＡ配列を含むドナーベクターを得るか、調製する。そして、これら部位のうちの１つは、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレーム内の、低頻度である制限部位を有し、一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素のものであり、もう１つの部位は、少なくとも一生物種のｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレーム内で低頻度である制限部位を有し、かつ第１の制限酵素によって生成されたオーバーハングと相補的でない末端を生成する第２の制限酵素のものである。一実施形態では、第２の制限酵素は、平滑末端を生成する。また、ドナーベクターは、場合によっては、対象のＤＮＡ配列ではない少なくとも１つの選択マーカー遺伝子も含む。ドナーベクターは、一定方向で、対象のＤＮＡ配列をアクセプターベクターに導入して、レシピエントベクターを生じる対象のＤＮＡ配列を発現させるために有用である。アクセプターベクターは、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接する非必須ＤＮＡ配列を含む。一実施形態では、非必須ＤＮＡ配列は、対抗選択可能な遺伝子、例えば、雌雄不稔遺伝子（バルナーゼ遺伝子）、ｃｃｄＢ遺伝子又はＳａｃＢ遺伝子を含む。アクセプターベクターにおける隣接する制限部位のうちの１つは、一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する第３の制限酵素のためのものであり、このオーバーハングは、第１の制限酵素を有するドナーベクターの消化によって生成された一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的である。一実施形態では、第３の制限酵素の制限部位は、第１の制限酵素の制限部位とは異なり、この部位は同一の制限酵素によって切断されない。他の実施形態では、第１の制限酵素及び第３の制限酵素は同一である。アクセプターベクターの他の隣接した制限部位は、第４の制限酵素のもので、第１の制限酵素又は第３の制限酵素によって生成した末端に相補的でない末端を生成する。一実施形態では、第２の制限酵素及び第４の制限酵素は、平滑末端を生成する。一実施形態では、第４の制限酵素の制限部位は、第２の制限酵素の制限部位とは異なり、この部位は同一の制限酵素によって切断されない。このように、交換部位は第２の制限酵素又は第４の制限酵素によって切断が不可能と思われる。他の実施形態では、第２の制限酵素及び第４の制限酵素は同一である。

【0091】

したがって、選択された制限酵素部位を有し、この部位が適切に配置されているドナーベクター及びアクセプターベクターをデザインすることによって、これらのベクターがそれぞれの制限酵素で消化されたら、対象のＤＮＡ配列はアクセプターベクター骨格内で一方向のみで配置させることができる。

【0092】

本発明の実施において有用な制限酵素部位は、平滑末端を生成する酵素によって認識される制限酵素部位だけでなく、クラスＩＩ酵素又はクラスＩＩＳ酵素によって認識されるハパゾメリック配列を含むがこれに限定されず、及び、１種又は複数の種で低頻度切断酵素である酵素を含む。

【0093】

適切なクラスＩＩＳ制限酵素は、５塩基隣接配列を認識する酵素含み、それらの酵素は次に掲げる酵素及びそれらのアイソシゾマー（カッコで示す）を含むがこれらに限定されるものではない。Ａｌｗ２６Ｉ（ＢｓｍＡＩ）、ＡｌｗＩ（ＡｃｌＷＩ、ＢｉｎＩ）、ＡｓｕＨＰＩ（ＨｐｈＩ）、ＢｂｖＩ（Ｂｓｔ７１Ｉ）、ＢｃｅｆＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ（ＢｓｅＧＩ、ＦｏｋＩ）、ＦａｕＩ、ＨｇａＩ、ＭｂｏＩＩ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ及びＴｓｐＲＩ。６塩基隣接配列を認識するクラスＩＩＳ制限酵素は、次に掲げる酵素及びそれらのアイソシゾマーを含むがこれらに限定されるものではない。

【化8】

ＳａｐＩ及びそのアイソシゾマーＶａｐＫ３２Ｉは７塩基隣接配列を認識し、ＳｆｉＩは８塩基隣接配列を認識し、これらの酵素も使用可能である。有用な酵素のさらなる例は、４塩基分離配列を認識する酵素（例えば、Ｂｓｅ４Ｉ（ＢｓｅＬＩ、ＭｓｉＹＩ、ＢｓｌＩ）、ＭｗｏＩ）及び６塩基分離配列を認識する酵素（例えば、ＡｃｃＢ７Ｉ（Ｅｓｐ１３９６Ｉ、ＰｆｌＭＩ、Ｖａｎ９１Ｉ）、ＡｄｅＩ（ＤｒａＩＩＩ）、ＡｈｄＩ（ＡｓｐＥＩ Ｅａｍ１１０５Ｉ、ＥｃｈＨＫＩ、ＮｒｕＧＩ）、ＡｈｗＮＩ、ＡｐａＢＩ（ＢｓｔＡＰＩ）、ＡｓｐＩ（ＰｆｌＦＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ）、ＢｇｌＩ、ＢｓｔＸＩ、ＤｒｄＩ（ＤｓｅＤＩ）及びＥｃｏＮＩ（ＸａｇＩ）、ＸｃｍＩ）を含む。さらなる適切なクラスＩＩＳ制限酵素は、当業者に知られている（例えば、Ｓｚｙｂａｌｓｋｉら、Ｇｅｎｅ１００：１３（１９９１年）参照）。

【0094】

クラスＩＩＳ酵素でない、非パリンドローム末端を生成する他の酵素がある。そのような酵素の例は、次に掲げる酵素を含むが、これらに限定されるものではない。

【化9】

【0095】

本発明で有用な他の酵素は、１種又は複数の生物体の、ＤＮＡ内、例えば、ｃＤＮＡ内に認識部位がほとんどない酵素である（「低頻度切断酵素」）。本発明のこの実施形態のための制限酵素部位を選択するために、生物体由来の複数のｍＲＮＡ、オープンリーディングフレーム及び／又はｃＤＮＡに関する配列の分析を、例えば、コンピュータソフトウェアを使用して実施して、その生物体内におけるそれらの部位の相対的頻度を算出する（図３〜５参照）。例えば、ヒトのｃＤＮＡでは、例えば、３８〜４３％の多数の認識部位を有するが、ヒトのｃＤＮＡでＳｇｆＩ及びＰｍｅＩの組合せ、並びにＳｆｉＩは、例えば、それぞれ２〜３％、１３〜１４％と比較的認識部位が少ない。ＳｇｆＩに相補的な末端を生成することができる酵素は、次に掲げる酵素を含むが、これらに限定されるものではない。

【化10】

【0096】

平滑末端を生成する酵素は、次に掲げる酵素を含むが、これらに限定されるものではない。

【化11】

【0097】

一実施形態において、本発明のベクター内の制限酵素部位は、平滑末端を生成して、好ましくは、特定の生物体における比較的少ない認識部位を有する制限酵素のためのものであって、これらの制限酵素は、例えば、ＰｍｅＩ（ＭｓｓＩ）、ＮｒｕＩ（Ｂｓｐ６８Ｉ、ＭｌｕＢ２１、Ｓｂｏ１３Ｉ、ＳｐｏＩ）、ＳｎａＢＩ（ＢｓｔＳＮＩ、Ｅｃｏ１０５Ｉ）、ＳｒｆＩ及びＳｗａＩ（ＢｓｔＲＺ２４６Ｉ、ＢｓｔＳＷＩ、ＭｓｐＳＷＩ、ＳｍｉＩ）、並びに、

【化12】

又はそのアイソシゾマー、
である。

【0098】

ＩＩ．認識部位の頻度を特定する方法
図３は、本発明の実施形態に従って遺伝分析を実施するための方法３００のフローチャートである。この方法は、１つ又は複数のコンピュータプログラム又はコンピュータ実行形式の指示から成るモジュールによって実行することができる。フローチャートを参照することによって、この方法を説明することは、当業者がそのようなプログラム又はモジュールを開発することを可能にし、これには適切なコンピュータ上（ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ドライブ及びその他のそのようなメディアなどのコンピュータ可読メディアからの指示を実行するコンピュータの１つ又は複数のプロセッサー）でその方法を実行するためのそのような指示が含まれる。図３に示す方法は、本発明の典型的な実施形態を実行する操作環境によって実行できる行為を含む。

【0099】

この方法を実行するシステムは、データベースにソースデータベース（ブロック３０２）から得た遺伝子記録を読み込むことによって立ち上がる。データベースの読む込みは、何らかの操作マニュアルを使用して実行してもよい。一部の実施形態では、遺伝子記録は、例えば、ｃＤＮＡ又はその部分のオープンリーディングフレームを有する遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、公的に利用可能なソースデータベースから得ることができる遺伝子記録を使用して、データベースに読み込まれる。例えば、一部の実施形態では、ヒトの遺伝子データは、インターネットのＵＲＬ（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｌｏｃａｔｏｒ）「ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／ｍＲＮＡ＿Ｐｒｏｔ／ｈｓ＿ｆｎａ．ｇｚ」又はＵＲＬ ｍｇｃ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を通して得ることができる。パン酵母の遺伝子データは、ＵＲＬ「ｇｅｎｏｍｅ−ｆｔｐ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｙｅａｓｔ／ｄａｔａ＿ｄｏｗｎｌｏａｄ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ｇｅｎｏｒｍｉｃ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ｏｒｆ＿ｄｎａ．」を使用して得ることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子データは、ＵＲＬ「ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｋ１２．ｈｔｍ．」から得ることができる。シノラブディス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の遺伝子データは、ＵＲＬ「ｆｔｐ．ｗｏｒｍｂａｓｅ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｗｏｒｍｂａｓｅ／ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ＿ｇｅｎｅｓ＿ｃｕｒｒｅｎｔ．ｇｚ」を使用して得ることができる。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の遺伝子データは、ＵＲＬ「ｔａｉｒｐｕｂ：[e-mail]／ｈｏｍｅ／ｔａｉｒ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｂｌａｓｔ＿ｄａｔａｓｅｔｓ／ｆｉ１ｅ＝ＡＴＨ１．ｃｄｓ．」を使用して得ることができる。本発明の実施形態は、遺伝子データのいかなる特定のソースも限定するものではなく、多くの公的及び私的に利用可能なソースも利用できることに留意する必要がある。一実施形態において、遺伝子記録は、選択した生物体のゲノム内の、少なくとも１０％以上、例えば、２５％、５０％又は５０％超のオープンリーディングフレームを表す。

【0100】

ソースデータベースのデータフォーマットは、遺伝子データベースのために望ましいフォーマットと異なる可能性がある。一部の実施形態において、ソースデータベースは、遺伝子データベースに保存するための共通フォーマットに変換される。

【0101】

所定の制限酵素又は一連の所定の制限酵素の少なくとも１つの認識部位を有する遺伝子データベースにおいて、一部の記録を検索するために照会される（ブロック３０４）。一実施形態において、１種又は複数の所定の制限酵素は、６、７又は８ｂｐの認識部位を有することができ、例えば、１セットが、７ｂｐの認識部位を有する所定の制限酵素及び８ｂｐの認識部位を有する他の所定の制限酵素を含むことができる。しかし、本発明は、セットに含まれる制限酵素のいかなる特定の数、又は所定の制限酵素の１種若しくはセットの認識部位におけるｂｐの特定の数にも限定されない。得られた記録のサブセットを、テンポラリテーブル、単独の結果テーブル又は単独のデータベースに保管してもよい。

【0102】

一部の実施形態において、得られた遺伝子記録のサブセットをふるいにかけて、誤った結果、歪曲した結果、又は有用でない結果（ブロック３０６）につながる可能性のある記録を除外し、或いは選択された特性の記録を含める。例えば、最も大きなオープンリーディングフレームのうちの１つの代表例と思われる、２１，０００ｂｐを超える非常に長い配列が、典型的に、誤った結果、歪曲した結果、又は有用でない結果につながることが認められている。他のふるい分け特性を使用してもよく、これも本発明の範囲内である。そのようなふるい分け特性の例は、特定のＧＣ含量、イントロンの有無、オープンリーディングフレームの予測される翻訳生成物における特異的アミノ酸組成、特異的な遺伝子ファミリーにおける既知の遺伝子に対する類似性、オープンリーディングフレームの予測されるタンパク質生成物の特定の等電点及び／又はオープンリーディングフレーム内の予測される膜貫通タンパク質（を除外又は含めるための）のふるい分けを含む。ふるい分けは、この方法のいずれの時点でも生じる可能性があることに留意する必要がある。例えば、記録を遺伝子データベースに読み込む前にふるいにかけてもよく、又は照会の一部としてふるいにかけてブロック２２０４で記録のサブセットを作製してもよい。

【0103】

次に、一連の１つ又は複数の統計値を、少なくとも１つの制限酵素認識部位（ブロック３０８）を有する記録のサブセットに関する１つ又は複数の照会を出すことによって得ることができる。一部の実施形態では、照会はパターンマッチング照会を含む。このパターンは、当技術分野で公知の方法のいずれかの数で特定することができる。例えば、ワイルドカード文字を使用して、パターンの１つ又は複数の位置を特定するか、正規表現を使用して、パターンを特定してもよい。本発明は、パターンを特定するためのいかなる特定の様式にも限定されない。さらに、このパターンを照会の一部として、データベースエンジンに送信するか、パターンマッチングを、照会によって得た記録に対してビジュアルベーシックなどのプログラムによって実行してもよい。

【0104】

一部の実施形態では、特定の制限酵素認識部位を有する記録の数を、算出及び報告する（ブロック３１０）。一部の実施形態では、統計に含めるために、各記録は、解析する制限酵素のすべての所定のセットに対する認識部位を含む。

【0105】

代替の実施形態では、記録中に存在する制限酵素標的部位の数を算出及び報告する（ブロック３１２）。これら代替の実施形態の一部では、記録は、解析する制限酵素のすべての所定のセットに対する認識部位を含む。

【0106】

さらなる代替の実施形態では、ハパゾメリック制限酵素によって認識又は切断される不明瞭な位置の塩基に関する統計を算出及び報告する（ブロック３１４）。統計は、それらの制限酵素の不明瞭な位置で、塩基の分布を算出するために望ましい。そのような不明瞭性の２つの例は、図１で示しているように、ＳｆｉＩ及びＳａｐＩによって認識又は切断される部位でのＮの存在である。これら代替の実施形態では、認識部位内、或いは認識部位と一部又はすべての所定の制限酵素との間の塩基内のあらゆる不明瞭な塩基の身元を、これら塩基の身元に関する１つ又は複数の統計と共に判定及び報告する。

【0107】

図４〜５は、ここに記載の方法によって算出された、様々な生物体における様々な制限酵素認識部位の頻度を提供する。

【0108】

ＩＩＩ．本発明のベクター
ドナー又はレシピエントベクターを使用して、別のベクター、例えば、発現ベクター又は分離した断片、例えば、ＰＣＲ断片から得たベクター内の対象のＤＮＡ配列、例えば、ライブラリー、例えば、ｃＤＮＡライブラリー内のＤＮＡ配列で、所望の制限酵素認識部位が隣接する対象のＤＮＡ配列を、別のベクター（アクセプターベクター）に導入して、レシピエント（発現）ベクター、例えば、対象のＤＮＡ配列の発現に有用なベクターを作製する。アクセプターベクター内及び対象のＤＮＡ配列に隣接している所望の制限酵素認識部位の存在及び配置は、対象のＤＮＡ配列をアクセプターベクターに一定方向で迅速にサブクローニング又は挿入することを可能にする。

【0109】

アクセプターベクターは、ペプチド又はポリペプチド（融合パートナー）をコードする所望の制限酵素認識部位の５’及び／又は３’側の配列であって、対象のＤＮＡ配列に作用可能に結合させ、細胞、細胞可溶化物又はｉｎ ｖｉｔｒｏの転写／翻訳システム内で発現させると、融合タンパク質を産生する配列を含むことができる。そのようなペプチド又はポリペプチドを、融合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に配置させてもよい。代わりに、融合タンパク質はＮ末端又はＣ末端の両方にペプチド又はポリペプチドを含むことができ、各ペプチド又はポリペプチドは異なってもよい。代わりに、対象のＤＮＡは、それ自体融合タンパク質をコードすることができ、アクセプターベクターと結合すると、組換えポリペプチドをコードするレシピエントベクターで、組換えポリペプチドがＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端及びＣ末端の両方に１つ又は複数の残基をさらに含み、例えば、所望の制限酵素認識部位の５’及び／又は３’側の配列によってコードされる残基など、この残基がアクセプターベクター内の配列によってコードされる、レシピエントベクターを生じる。さらに、１つ又は複数のアミノ酸残基は、対象のＤＮＡ配列の末端とアクセプターベクターとの連結によって生成した交換部位によってコードされることができる。

【0110】

一実施形態において、ペプチド又はポリペプチドの融合パートナーは、エピトープ標識、親和性ドメイン、例えば、プロテアーゼ認識部位、或いは酵素、例えば、チオレドキシン又はデハロゲナーゼである。エピトープ標識は、エピトープ特異的抗体によって認識される短いペプチド配列である。エピトープ標識を含む融合タンパク質は、クロマトグラフィー樹脂と結合した抗体を使用して、単純かつ容易に精製することができる。エピトープ標識の存在は、組換えタンパク質自身に特異的な抗体を作製する必要なしに、ウエスタンブロット法などのその後の分析で、組換えタンパク質を検出することをさらに可能にする。一般に使用されるエピトープ標識の例には、Ｖ５、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、ＲＹＩＲＳ、カルモジュリン結合ドメイン、ペプチドＰｈｅ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、キチン結合ドメインなどが含まれる。

【0111】

親和性ドメインは、固体支持体上に固定された結合パートナーなどの結合パートナーと相互作用の可能なペプチド配列が一般的である。複数の連続的な単一アミノ酸、例えば、ヒスチジンなどの金属イオン親和性配列をコードするＤＮＡ配列は、発現タンパク質と融合すると、ニッケルセファロースなどの、樹脂カラムに結合する高い親和性によって、組換えタンパク質の一段階精製に使用することができる。エンドペプチダーゼ認識配列を、ポリアミノ酸標識と対象のタンパク質の間で操作して、エンテロキナーゼ及びその他のプロテアーゼで消化することによりリーダーペプチドのその後の除去を可能にすることができる。キチン結合ドメイン（キチンに結合する）、ＧＳＴ（グルタチオンと結合する）、ビオチン（アビジン及びストレプトアビジンと結合する）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、一部のブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）、ポリヒスチジントラクト（ＨＩＳ_n）などのペプチド又はタンパク質をコードする配列も、対象のタンパク質の精製を促進するために使用することができる。親和性ドメインは、インテイン（タンパク質自己スプライシングエレメント、Ｃｈｏｎｇら、Ｇｅｎｅ１９２：２７１（１９９７年））の使用を含む、当技術分野において周知の方法によって対象のタンパク質から分離することができる。一実施形態において、複数の融合パートナーの配列を、対象のペプチド又はポリペプチドの配列に結合させることができ、例えば、親和性ドメインを対象のポリペプチドに結合するプロテアーゼ切断認識部位に結合させる。

【0112】

オープンリーディングフレームの５’末端で、定義された融合を起こすことを目的とした発現ベクターを作製するために（例えば、アクセプターベクターは、融合のためのペプチド又はタンパク質をコードした交換部位の５’側の配列を含まない）、所望の制限酵素認識部位を、ベクター内の所望の翻訳開始点に置く。注意を払い、不適切に翻訳を開始する恐れのある交換部位の上流へのＡＴＧ又は開始コドンの導入を防止する。例えば、適合するオーバーハングを、ＤＮＡ断片内のオープンリーディングフレームの開始コドンの５’側に有するアクセプターベクターのＳｇｆＩ消化によって生成されたオーバーハングの融合により、そのオープンリーディングフレームのための新規開始部分を含む組換えベクターを産生することができる。組換えベクターに存在するアクセプターベクター由来の配列は、ＳｇｆＩ消化によって生成されたオーバーハングの５’側の配列を含み、場合によって、適切に配置されたＲＢＳを含む。場合によって、オープンリーディングフレームの５’末端の配列は、Ｋｏｚａｋ配列又はその部分を含み、ｍＲＮＡ内に存在すると、真核細胞リボソームの小サブユニットを結合することが可能である。

【0113】

融合タンパク質のＮ末端に位置するペプチド又はタンパク質をコードしたベクターを対象のＤＮＡ配列に融合（すなわち、翻訳融合）することによって融合タンパク質を生成することを目的とした発現ベクターを作製するために、制限酵素認識部位を、１）オープンリーディングフレームが、アクセプターベクターの制限酵素認識部位の中に維持され、２）アクセプターベクターの制限酵素認識部位のリーディングフレームが、ドナーベクター内に含まれる制限酵素認識部位で発見されるリーディングフレームのフレーム内にあるというように、正しいリーディングフレームに配置する。さらに、アクセプターベクターの適切な制限酵素認識部位は、インフレームの終止コドンの導入を避けるようにデザインする。ドナーベクター内に含まれる対象のＤＮＡ配列は、したがって、所望のＮ末端融合タンパク質の作製を促進するために、アクセプターベクターの特定のリーディングフレームにクローンを作る。例えば、対象のＤＮＡ配列の５’末端とアクセプターベクターの３’末端のＳｇｆＩ部位の融合により、読み過し配列が作製される。

【0114】

同様に、融合タンパク質のＣ末端に位置するペプチド又はタンパク質をコードしたベクターを対象のＤＮＡ配列と融合することによって融合タンパク質を生成することを目的とした発現ベクターを作製するために、制限酵素認識部位を、１）オープンリーディングフレームが、アクセプターベクターの制限酵素認識部位の中に維持され、２）アクセプターベクターの制限酵素認識部位のリーディングフレームが、ドナーベクター内に含まれる制限酵素認識部位で発見されるリーディングフレームのフレーム内にある（すなわち、３’末端の対象のＤＮＡ配列に隣接する部位）というように、正しいリーディングフレームに配置する。したがって、ドナーベクター内に含まれる対象のＤＮＡ配列は、Ｃ末端融合タンパク質の作製を促進するために、特定のリーディングフレームでクローンを作ることができる。例えば、ＰｍｅＩ部位とＥｃｏＲＶ部位又はＢａｌＩ部位との融合は、Ｃ末端で加えられた少なくとも２つのアミノ酸を有するＣ末端融合を生成することができるが、２つのＰｍｅＩ部位又はＰｍｅＩ部位とＤｒａＩ部位の融合は、Ｃ末端で加えられた１つのアミノ酸を有するＣ末端融合を生成することができる。

【0115】

一実施形態において、発現ベクターは、複数の融合パートナー、例えば、精製のための親和性標識及び対象のタンパク質に融合するプロテアーゼ切断部位を有するタンパク質をコードする。

【0116】

本明細書のクローニング系を使用することで、タンパク質配列をＮ末端及び／又はＣ末端の融合パートナーの極めて近位で発現させることを可能にする。特別の利点は、リーディングフレームを選択することが可能であるということである。このことは、対象のＤＮＡ配列を正確に配置するだけでなく、融合遺伝子の末端を明確にすることを可能にする。

【0117】

また、本発明の実施において使用されるベクターは、１種又は複数の選択マーカー遺伝子に加えて、ベクターの複製、維持又は完全性における、ある機能を一般に有する１種又は複数の核酸配列を、例えば、複製開始点に含む。複製開始点は、ユニークなＤＮＡ断片であり、多量体開始点−結合タンパク質によって認識される短い複数の反復配列を含み、開始部位でＤＮＡ複製酵素を組み立てることにおいて、主要な役割を果たす。ここで使用される発現ベクターに使用するための適切な複製開始点は、大腸菌ｏｒｉＣ、ｃｏｌＥ１プラスミド開始点、２μ及びＡＲＳ（両方とも酵母システムに有用）、ｓｆｌ、ＳＶ４０ ＥＢＶ ｏｒｉＰ（哺乳類のシステムに有用）、ｐ１５、又はｐＳＣ１０１で発見される複製開始点などを含む。

【0118】

選択マーカー配列は、選択マーカー配列を含むベクターによって首尾よく形質転換され、このマーカーを発現しているか、細胞が成長したかどうかを選択する手段を提供するのでベクターの有用なエレメントである。そのようなマーカーには、一般に薬剤耐性及び栄養要求性の２つのタイプがある。薬剤耐性マーカーは、さもなければ細胞を殺すと思われる外から加えられた薬剤を、細胞が解毒することを可能にする。栄養要求性マーカーは、必須成分を欠く培地で増殖中に、必須要素（通常、アミノ酸）を合成する。

【0119】

多種多様な選択マーカー遺伝子が利用可能である（例えば、以下を参照。Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：４８７（１９９０年）；Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、１８５：５３７（１９９０年）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｇｅｎｅ、１０３：５３（１９９１年）；Ｒｏｍａｎｏｓら、「ＤＮＡクローニング２、発現システム（ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、２．ｓｕｐ．ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１２３−１６７ページ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９５年）；Ｍａｒｋｉｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５４：３５９（１９９６年）；Ｐｆｅｉｆｅｒら、Ｇｅｎｅ、１８８：１８３（１９９７年）；Ｔｕｃｋｅｒ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ、Ｇｅｎｅ．１９９：２５（１９９７）；Ｈａｓｈｉｄａ−Ｏｋａｄｏら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４２５：１１７（１９９８年））。通常の選択マーカー遺伝子配列は、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）などの抗生物質に対する耐性の配列を含む。選択可能な栄養要求性遺伝子配列は、例えば、ｈｉｓＤを含み、ヒスチジノールの存在下でヒスチジンを含まない培地における成長を可能にする。

【0120】

適切な選択マーカー遺伝子は、ブレオマイシン耐性遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ＡＵＲＩ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子などを含む。

【0121】

代わりのアプローチは、対応する野生型酵素より活性の低い突然変異酵素をコードする選択可能な遺伝子標識を使用することである。例として、Ｍｕｎｉｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、７：８３（１９９４年）は、活性低下を示す変異体チミジンキナーゼ酵素のデザインについて記載している（また、以下も参照。Ｌｉｕ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６３：６３８（１９８８年）；Ｍｅｎｄｅｌら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ３９：２１２０（１９９５年））。また、低活性変異体は、アデノシンデアミナーゼ及びジヒドロ葉酸レダクターゼについても記載されている（例えば、以下を参照。Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７：３６６４（１９８８年）；Ｊｉａｎｇら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ、Ｇｅｎｅｔ．、６：２２７１（１９９７年）；Ｅｒｃｉｋａｎ−Ａｂａｌｉら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４９：４３０（１９９６年））。

【0122】

マーカー遺伝子の別の種類は、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、酵素（例えば、胎盤アルカリ燐酸分解酵素、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ又はルシフェラーゼ）、或いは抗体（例えばＣＤ４、ＣＤ８、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質など）によって検出できる細胞表面タンパク質などの容易に検出可能なタンパク質を産生する遺伝子である。そのような選択マーカー遺伝子の発現生成物は、非形質移入細胞から形質移入細胞を、そのような標準的手段、例えば、ＦＡＣＳ選別又は磁気ビーズ分離技術によって選別するために使用することができる。

【0123】

メタロチオネイン遺伝子は、カドミウム、亜鉛及び銅などの有害金属に対して高い親和性を有するタンパク質をコードする（Ｂｅａｃｈ ａｎｄ Ｐａｌｍｉｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：２１１０（１９８１年）；Ｈｕａｎｇら、ＥＸＳ、５２：４３９（１９８７年）；Ｃｚａｊａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１４７：４３４（１９９１年））。したがって、メタロチオネイン遺伝子は、本明細書に記載の方法のために適切な滴定可能な標識を提供する。

【0124】

一実施形態において、アクセプターベクターは、所望の制限酵素部位が隣接する対抗選択可能な遺伝子を含む。この点に関して好ましい遺伝子は、構成的活性が低いか、持たない誘導性の致死遺伝子（好ましくは、さらに一部の免疫因子を有する）、例えば、ｂａｒ（バルスター）などの遺伝子、制限酵素をコードする致死遺伝子（対応するメチラーゼをコードする遺伝子）、或いはヌクレアーゼコリシンをコードする致死遺伝子、例えば、Ｅ９デオキシリボヌクレアーゼ並びにコリシンリボヌクレアーゼ及びｔリボヌクレアーゼ、又はギラーゼＡ、並びにＭａｚＦ（ＣｈｐＡＫ）、Ｄｏｃ（Ｐｈｄ）、ＰａｒＥ、ＰａｓＢ、ＳｔｂＯｒｆ２、ＨｉｇＢ、ｚ、ＲｅｌＥ、Ｔｘｅ、ＹｅｏＢ、ＳａｃＢ、ＫｉｌＲ、ＫｏｒＡ、ＫｏｒＢ、Ｋｉｄ（Ｋｉｓ）、ＰｅｍＫ（ＰｅｍＩ）、Ｈｏｋ（Ｓｏｋ）、Ｄｃｃ（Ｐｎｏ）、ＣｃｄＢ（ＣｃｄＡ）、Ｆ’プラスミドなどの致死遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。

【0125】

その他の選択アプローチは、調節転写調節物質、例えば、テトラサイクリン誘導又は抑制系（例えば、ＷＯ９６／０１３１３参照）の使用を含む。

【0126】

また、本発明の実施において使用されるアクセプターベクターは、タンパク質発現において一部の機能を有する１つ又は複数の核酸配列、すなわち、転写制御配列、例えば、プロモーター配列又はエンハンサー配列などの誘導又は抑制可能な制御配列も含む。

【0127】

プロモーター−エンハンサー配列は、ＲＮＡポリメラーゼが結合して、転写を開始するＤＮＡ配列である。このプロモーターは、どの鎖が転写されるかについて特定することにより転写物の極性を判定する。細菌のプロモーターは、転写の開始に関連した−３５及び−１０ヌクレオチドのコンセンサス配列からなり、特異的シグマ因子及びＲＮＡポリメラーゼによって結合される。真核生物のプロモーターは、より複雑である。ベクターに利用される大部分のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。基本転写因子（ＧＴＦ）は、最初に開始点近くの特定の配列に結合し、次に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を受け入れる。これらの最小限のプロモーターエレメントに加えて、小さな配列要素が、特定のプロモーターの活性を調節するモジュラーＤＮＡ結合／トランス活性化タンパク質（例えば、ＡＰ−１、ＳＰ−１）によって特異的に認識される。ウイルスのプロモーターは、細菌又は真核生物プロモーターと同様の機能を提供し、さらに、ｔｒａｎｓ（バクテリオファージＴ７）において特異的ＲＮＡポリメラーゼを提供するか、細胞性因子及びＲＮＡポリメラーゼ（ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＣＭＶ）を補充する。ウイルスのプロモーターは、これらが一般に特に強力なプロモーターであることが好ましい。

【0128】

さらに、プロモーターは、構成的又は制御可能（すなわち、誘導性又は抑制解除可能）のいずれか一方にすることができる。誘導性要素は、プロモーターと共に働くＤＮＡ配列であり、リプレッサー（例えば、大腸菌のｌａｃＯ／ＬＡＣ Ｉｑリプレッサー系）又はインデューサー（例えば、酵母菌のＧａｌＩ／ＧＡＬ４インデューサー系、大腸菌のｒｈａＢＡＤ／ラムノース）のいずれか一方と結合する。いずれの場合でも、プロモーターが抑制解除又は誘発されるまで（この時点で、「オンの状態」になる）、プロモーターは実質的に「オフの状態」なっている。

【0129】

構成的なプロモーターの例には、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター、ｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴプロモーターなどが含まれる。誘導性の原核生物のプロモーターの例には、バクテリオファージの主要な右及び左のプロモーター（Ｐ_L及びＰ_R）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃａ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、ａｒａＣ及びｇａｌプロモーター、α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６２：１７６（１９８５年））、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｈａＢＡＤプロモーター、及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のσ−２８−特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎら、Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、３２：１１（１９８４年））、かん菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のバクテリオファージのプロモーター、（Ｇｒｙｃｚａｎ、「かん菌の分子学的生物学（Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ、１９８２年）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のプロモーター（Ｗａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２０３：４６８（１９８６年））、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）プロモーター（米国特許第４，８５５，２３１号及び同第４，８０８，５３７号）などが含まれる。典型的な原核生物のプロモーターは、Ｇｌｉｃｋ（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１：２７７（１９８７年））、Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．６８：５０５（１９８６年））及びＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、１８：４１５（１９８４年））によって概説されている。一実施形態では、プロモーターはＴ７プロモーター又はＳＰ６プロモーターである。

【0130】

例えば、好ましい真核生物のプロモーターは、マウスのメタロチオネインＩ配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．、１：２７３（１９８２年））、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｃｅｌｌ、３１：３５５（１９８２年））、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、２９０：３０４（１９８１年））、酵母菌ＧａｌＩ遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、７９：６９７１（１９８２年）、Ｓｉｌｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８１：５９５１（１９８４年））、バキュロウイルスプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、エクジソン反応性プロモーター、テトラサイクリン反応性プロモーターなどを含む。

【0131】

適切な原核生物のベクターは、大腸菌において複製が可能なプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ＰＡＣＹＣ１８４、ｉｔＶＸ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）など）などのプラスミドを含む。そのようなプラスミドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋによって明らかにされている（参照「分子クローニング：実験マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年）。かん菌プラスミドは、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などを含み、Ｇｒｙｃｚａｎによって明らかにされている（「かん菌の分子学的生物学（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ）」前出、ｐｐ．３０７−３２９中）。適切なストレプトマイセス属プラスミドは、ｐｌＪ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：４１７７（１９８７年））及びｐｈｉ．Ｃ３１などのストレプトマイシーズバクテリオファージ（Ｃｈａｔｅｒら、「放線菌目生物学に関する第６回国際会議（Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ、ｐｐ．４５−５４、１９８６年中）を含む。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）プラスミドは、Ｊｏｈｎら（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、８：６９３（１９８６年））及びＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、３３：７２９（１９７８年））によって概説されている。大腸菌の連鎖配列の発現に関するアクセプターベクターのベクター骨格は、ａｍｐ^R遺伝子、Ｔ７転写制御要素、及びＧＳＴ、チオレドキシン又はデハロゲナーゼと対象のタンパク質との融合などの融合タンパク質を産生する配列を含む。

【0132】

適切な真核生物プラスミドは、例えば、ＢＰＶ、ＥＢＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２−ミクロンサイクル、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＭＴ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（Ｓｐｌ）、ｐＶｇＲＸＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、など、又はこれらの誘導体を含む。そのようなプラスミドは、当技術分野において周知である（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．、１９：２６５（１９８２年）、Ｂｒｏａｃｈ「酵母菌サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の分子生物学：生活環及び遺伝（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．ｐｐ．４４５−４７０、１９８１年中）、Ｂｒｏａｃｈ、Ｃｅｌｌ、２８：２０３（１９８２年）、Ｄｉｌｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．、１０：３９（１９８０年）、Ｍａｎｉａｔｉｓ、「細胞生物学：包括的論文、第３巻、遺伝子発現配列（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｖｏｌ．３、Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ｐｐ．５６３−６０８、１９８０年中）。一実施形態では、哺乳類の細胞における連鎖配列の発現又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの真核生物の転写／翻訳反応に関するアクセプターベクターのベクター骨格は、ｐＣＭＶＴｎＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）及びＧＳＴ又はデハロゲナーゼと対象のタンパク質の融合などの融合タンパク質を産生する配列である。

【0133】

プロモーター／プラスミドの組合せを、適切な宿主細胞と共に使用し、適切な宿主細胞として、例えば、大腸菌、ストレプトマイセス属、シュードモナス属及びかん菌などの原核細胞又は酵母菌、例えば、ピシア（Ｐｉｃｃｈｉａ）、サッカロミセス属若しくは分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの真核生物細胞、昆虫細胞、トリ細胞、植物細胞、或いは哺乳類細胞、例えば、ヒト、サル、ブタ、ヒツジ、げっ歯類、ウシ、ウマ、ヤギ、イヌ又はネコの細胞、並びにその溶解産物、例えば、ＴＮＴ、小麦麦芽溶解産物又はＳ３０溶解産物が挙げられる。

【0134】

一実施形態において、宿主細胞は組換え細胞、例えば組換え原核細胞である。一実施形態では、組換え宿主細胞は、誘導経路、例えば、ラムノース異化経路などの糖経路に１種又は複数の遺伝子に欠損があり、異種のＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレームと作用可能に結合させた１種又は複数の遺伝子のための誘導プロモーターを含む組換えＤＮＡを含む。組換え宿主細胞若しくはそこの溶解産物、又は異種ＲＮＡポリメラーゼを補充されたｉｎ ｖｉｔｒｏの転写／翻訳混合物を、対象のＤＮＡ配列と作用可能に結合させた異種ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを含む本発明のベクターと接触させる。一実施形態では、組換え宿主細胞はラムノース異化反応が不完全な組換え大腸菌であって、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼオープンリーディングフレームと作用可能に結合させたｒｈａＢＡＤプロモーターを含む。ラムノースの非存在下で、そのような細胞は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを欠くか、低濃度であり、したがって、特に毒性遺伝子のクローン化に有用である。

【0135】

他の実施形態では、組換え宿主細胞は、細胞に致死性である遺伝子産物に対する免疫因子を発現する。免疫因子は、好ましくは構成的プロモーターから発現される。致死性の遺伝子産物をコードする発現ベクターは、繁殖した組換え細胞及び形質転換細胞に導入することができる。一実施形態では、遺伝子産物はバルナーゼであって、分泌断片（１つのペプチド）の配列を除去し、場合によって、分泌配列の最終コドンの代わりにＡＴＧを加えることによって修飾している。

【0136】

ＩＶ．制限酵素部位を保護するためのＤＮＡ結合タンパク質の使用
対象のＤＮＡ配列をドナーベクターへ、又はドナーベクターからアクセプターベクターへ導入する工程において、対象のＤＮＡ配列に隣接する制限酵素部位、すなわち、クローニングに有用な制限酵素部位は、対象のＤＮＡ配列又はベクター配列のいずれか一方に存在することもできる。特定の制限酵素を含む部位を対応する酵素による切断から保護するために、ＤＮＡ結合タンパク質及びメチル化を使用してもよい。例えば、ＲｅｃＡ（ＲｅｃＡ切断及び産生）によって制限部位を保護する工程は、部分的な制限消化に比べて、より再現性があり、より良好な収量をもたらし、より取り扱いやすい。制限酵素認識部位を保護するその他の手段は、リプレッサータンパク質、真核生物転写制御因子、大腸菌宿主組込み因子又は三重らせん体構造を形成することが可能なオリゴヌクレオチドを使用することを含むが、ＲｅｃＡを使用した保護の特異性は、完全に合成一本鎖ＤＮＡによるものである。ＡＴＰ［γ−Ｓ］などの加水分解抵抗性ＡＴＰ類似体の存在下で、ＲｅｃＡタンパク質は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に非特異的に結合し（およそ、３つのヌクレオチドごとに１つのＲｅｃＡモノマー）、シナプス前フィラメントと呼ばれる構造を形成する。次に、このＲｅｃＡ被覆オリゴヌクレオチドを相同の２本鎖ＤＮＡでアニールして、安定した三重鎖ＤＮＡ−たんぱく質複合体を形成する。シナプス前フィラメントは、ｉ）反応に加えられるｓｓＤＮＡの配列及び長さは、シナプス前フィラメントの部位と範囲を判定する、及びｉｉ）シナプス前フィラメントは、ＤＮＡメチラーゼ及び制限酵素による修飾からハイブリッド形成部位のＤＮＡを保護するという点で、有用な分子的研究手段となる。これらの特徴は、ＲｅｃＡタンパク質−媒介ＤＮＡ複合体が、ゲノムマッピング及びＤＮＡ断片のサブクローニングなどの、所定部位でのＤＮＡ切断を必要とする分子生物学的処理に新しいレベルの特異性を加えることを可能にする。ＰＣＲ法と比較して、ＤＮＡ結合タンパク質の使用は、より迅速であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏの増幅の複数のサイクルにより生じる突然変異を導入しない。

【0137】

一般的なプロトコールは、メチル化から制限部位を保護すること、制限酵素切断（ＲｅｃＡ切断）に特異的にすること、及び消化から制限部位を保護すること（ＲｅｃＡ保護）を含む。ＲｅｃＡ切断プロトコールは、Ｋｏｏｂら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１ １０８４（１９８８年））、Ｋｏｏｂら（Ｇｅｎｅ、７４、１６５（１９８８年））及びＫｏｏｂら（Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０、５８３１（１９９２年））のＲｅｃＡアキレスの切断手順に基づく。さらに、ＲｅｃＡ切断は、所望の制限部位が断片内で数回繰り返されるとき、サブクローニングのための制限断片を作製することに有用である。しかし、所望の断片内で制限部位の繰り返しがわずか１又は２ヵ所の場合、ＲｅｃＡ保護が好ましい。電気泳動法の後、ＲｅｃＡ生成物の蛍光分析に基づいて、これら２つのプロトコールは、１つの部位を保護した場合、常に７０％〜８０％の保護をもたらした。また、この技術は、アガロース栓に包埋されたＤＮＡに対して使用してもよい。

【表3】

【0138】

Ａ．ＲｅｃＡ切断又は保護反応
ＲｅｃＡ濃度
ＲｅｃＡ保護の特異性及び有効性を最大にするために、オリゴヌクレオチド：ＲｅｃＡ比を操作する必要があることがある。１０μＬ反応に６．２５μｇのＲｅｃＡの濃度は、よく作用する。

【0139】

オリゴヌクレオチド濃度
ＲｅｃＡに対するオリゴヌクレオチドの結合のモルストイキオメトリー（ＲｅｃＡタンパク質のモルに対するヌクレオチドのモルに関する）は３：１である。換言すれば、あらゆる一本鎖ＤＮＡの３つのヌクレオチドごとに、１つのＲｅｃＡタンパク質が結合する。この比は、オリゴヌクレオチドの容積とは関係がなく、ＲｅｃＡ ６．２５μｇあたりオリゴヌクレオチド１６０ｎｇに相当する。４０ｎｇ単位の増加による４０〜２８０ｎｇの一連の滴定は、ＲｅｃＡに対して使用するオリゴヌクレオチドの最適濃度を判定するために有用である。次に、非特異的保護が問題である場合、ＡＴＰ［γ−Ｓ］添加後の反応にオリゴ（ｄＴ）１６０ｎｇを添加してもよい。

【0140】

オリゴヌクレオチドのデザイン
溶液中でのＲｅｃＡ切断及びＲｅｃＡ保護のために、３０〜３６塩基長のオリゴヌクレオチドが推奨される。保護部位は、このプロトコールの開発を通して使用した３０塩基のオリゴヌクレオチドの中央部に位置していた（また、以下も参照。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ Ｍａｇａｚｉｎｅ ＃５０より「ゲノムマッピング及びサブクローニングに関するＲｅｃＡ切断及び保護（ＲｅｃＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ Ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）」）。

【0141】

緩衝液
メチル化後、塩濃度を調整して、酵素の活性を改善する必要があろう。酢酸塩は、塩化物よりＲｅｃＡトリプレックスに対して不安定化しないと思われ、したがって、塩化カリウム又は塩化ナトリウムよりむしろ酢酸カリウムを使用するとよい。

【0142】

ＲｅｃＡ切断の生成物のサブクローニング
ＲｅｃＡ切断反応の生成物がメチル化されるので、宿主の制限／修飾系との不和合性によって、形質転換頻度が低い可能性がある。形質転換の有効性が低い場合、宿主の遺伝子型を既知のメチル化誘発制限系と比較して、このことが原因であるか判定する。

【0143】

ＩＶ．例示的なベクター系
一実施形態において、ドナーベクター内及び／又は対象のＤＮＡ配列に隣接している、少なくとも１つの制限酵素部位は、縮重認識配列を有する制限酵素、例えば、ＳｆｉＩが分断されたパリンドローム配列（図６）を認識する縮重認識配列を有する制限酵素のためのものである。分断されたパリンドローム配列を認識し、方向性クローニングに使用する一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する制限酵素を使用するために、その制限酵素のための少なくとも２つのユニークな部位及び／又は第１の制限酵素によって生成されるオーバーハングと相補的である、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する異なる制限酵素のためのユニークな部位を使用する。他の方法を使用して、例えば、メチル化の使用によって、所望のベクター並びに／又は選択可能及び対抗選択可能な遺伝子の頻度を高めることができる。

【0144】

図７は、分断されたパリンドロームを認識する制限酵素のための制限酵素部位を有するドナーベクター及びアクセプターベクターの使用の概略図を示す（酵素Ｉ；ユニーク配列はＡ及びＢ、これらの相補配列はそれぞれＡ’及びＢ’、パリンドローム配列はボックスによって示す）。本ドナーベクターは、薬剤耐性遺伝子１、及び分断されたパリンドロームを認識する制限酵素のための１つ又は複数の制限酵素部位が隣接した、対象のＤＮＡ配列（淡灰色のボックス）を有する。本アクセプターベクターは、異なる薬剤耐性遺伝子（薬剤耐性遺伝子２）を有し、縮重認識配列を有する制限酵素による消化後、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングＡ’及びＢ’を有し、これらはそれぞれ、酵素Ｉによるドナーベクターの消化後に存在する非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングと相補的である。したがって、酵素Ｉによるドナーベクターの消化後、並びに線状化アクセプターベクター及びリガーゼの存在下で、対象の線状化ＤＮＡ配列をアクセプターベクターに一定方向で連結させて、レシピエントベクターを産生させる。図７Ａでは、酵素Ｉの制限酵素認識部位の半分の部位は、レシピエントベクターにおける対象のＤＮＡ配列の各末端に存在する。連結が制限部位を再生すると、その後、競合的逆反応が起こる（図７Ｂ）。図７Ｃでは、アクセプターベクターよりむしろレシピエントベクターを有する細胞が容易に特定できるように、アクセプターベクターの対抗選択可能な遺伝子（致死遺伝子）を使用する。

【0145】

図８は、縮重認識配列を有する制限酵素の制限酵素部位を含むように対象のＤＮＡ配列を修飾する１つの方法を示す。増幅反応において、５’末端に制限酵素のためのユニークな縮重配列及び３’末端に対象のＤＮＡ配列鎖のうちの１つに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを使用する。また、それらのユニーク配列は、薬剤耐性遺伝子を含むベクターでも存在する。増幅断片及びベクターを、制限酵素、及び本発明のドナーベクターを産生するように加えられたリガーゼによって消化する。この部位が、例えば、Ｄｃｍ部位で、ＤＮＡのメチル化状態に対して感受性の高い制限酵素によって、又はＳｆｉＩに対してはメチラーゼを使用して認識されるならば、メチル化は逆反応を最小化することができる。次に、ドナーベクターを、縮重認識配列を有して、対象のＤＮＡ配列を遊離させる制限酵素によって消化し、例えば、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する縮重認識配列を有する異なる酵素によって生成した相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有するアクセプターベクターと混合する。

【0146】

図９Ａ−図９Ｂは、本発明のドナーベクターを作製するための別のアプローチを示す。対象のＤＮＡ配列を、縮重認識配列を有する制限酵素の制限酵素部位を含むように修飾する。増幅反応において、５’末端に制限酵素のためのユニークな縮重配列及び３’末端に対象のＤＮＡ配列鎖のうちの１つに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを使用する。対象のＤＮＡ配列は、その制限酵素のための内部部位を含むことができる。消化からそれらの内部部位を保護するために、これらをメチル化するが、増幅断片末端の隣接部位は、依然としてメチル化されていないので、消化に対して感受性が高い。このことを達成するために、非メチル化のまま残された部位に相補的なオリゴヌクレオチドとＲｅｃＡなどのＤＮＡ結合タンパク質を増幅断片に加える。次に、内部部位を適切なメチラーゼでメチル化する。カラムを使用して、増幅断片からオリゴヌクレオチド−ＤＮＡ結合タンパク質複合体を取り除いてもよい。対象のＤＮＡ配列の末端に加えられた部位は、消化されると、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する。相補的オーバーハングは、ベクター内で、縮重認識部位を有する選択した制限酵素による消化によって生成することができ、この酵素は増幅断片を消化するために使用した酵素と異なっていてもよい。次に、増幅断片及びベクターを１つ又は複数の制限酵素で消化し、得られた線状断片を、薬剤耐性遺伝子、及び一本鎖ＤＮＡオーバーハングを連結することにより生成された部位が隣接した対象のＤＮＡ配列を含むベクターを形成するように連結し、生成された部位は縮重認識配列を有する１つ又は複数の酵素、例えば、増幅断片を消化するために使用される酵素によって認識される。

【0147】

図１０Ａ−図１０Ｂは、本発明のレシピエントベクターを作製するためのアプローチを示す。この実施形態において、ドナーベクターは薬剤耐性遺伝子、及び縮重認識配列を有して１つ又は複数の制限酵素部位を内部に含む酵素のための制限酵素部位が隣接した対象のＤＮＡ配列を含む。消化からそれらの内部部位を保護するために、これらをメチル化する。隣接する部位は、依然としてメチル化されずに残り、したがって、消化に対して感受性が高いことを確実にするために、非メチル化のまま残された部位に相補的なオリゴヌクレオチドとＤＮＡ結合タンパク質をドナーベクターに加える。次に、オリゴヌクレオチド／ＤＮＡ結合タンパク質に結合されていない制限酵素の部位を、適切なメチラーゼでメチル化する。カラムを使用して、このドナーベクターからオリゴヌクレオチド−ＤＮＡ結合タンパク質複合体を取り除いてもよい。次に、ドナーベクターを、縮重認識配列を有する制限酵素のための少なくとも２つの認識部位を有するアクセプターベクターに加えて、この制限酵素は、非メチル化部位を切断する制限酵素を有するドナーベクターの消化によって生成したオーバーハングと相補的な、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する。アクセプターベクターは、ドナーベクターの薬剤耐性遺伝子とは異なる薬剤耐性遺伝子を含むことが好ましい。一実施形態において、アクセプターベクターを消化するために使用する制限酵素は、ドナーベクターを消化するために使用する制限酵素とは異なってもよい。ドナーベクター及びアクセプターベクターの消化により得られた線状ＤＮＡ断片のその後の連結は、レシピエントベクターを産生する。

【0148】

一実施形態において、ドナーベクター及びアクセプターベクターを線状にするために使用する制限酵素は同一であって、例えば、このドナーベクターは、対象のＤＮＡ配列に隣接しているユニークなＳｆｉＩ部位を有し、ＳｆｉＩで消化されると、部位は、ＳｆｉＩを有するアクセプターベクターの消化後生成した一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的である、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する。他の実施形態では、ドナーベクターは、対象のＤＮＡ配列に隣接しているユニークなＢｇｌＩ部位を有し、ＢｇｌＩで消化されると、この部位は、ＢｇｌＩを有するアクセプターベクターの消化後生成した一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的である、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する。他の実施形態では、ドナーベクター及びアクセプターベクターを線状にするために使用される縮重認識配列を有する制限酵素は異なり、例えば、このドナーベクターは、対象のＤＮＡ配列に隣接しているユニークなＳｆｉＩ部位を有し、ＳｆｉＩで消化されると、部位は、ＢｇｌＩを有するアクセプターベクターの消化後生成した一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的である、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する。ドナーベクター及びアクセプターベクターを作製することにおいて、ＳｆｉＩと共に有用な制限酵素を図１１に示す。ＳｆｉＩ及び／又はＢｇｌＩ用のメチラーゼは周知の方法により得ることができる（参照、米国特許第５，１７９，０１５号、同第５，２００，３３３号及び同第５，３２０，９５７号）。例えば、組換えＢｇｌＩ及びその対応するメチラーゼの作製法は、米国特許第５，３６６，８８２号で開示されている。組換えＳｆｉＩ及び対応するメチラーゼの作製法は、米国特許第５，６３７，４７６号で提供されている。ＳｆｉＩ認識部位を含むベクターに対して有用な他のメチラーゼは、ＨａｅＩＩＩ及びＤｃｍメチラーゼのメチラーゼを含む。

【0149】

他の実施形態において、ドナーベクター内及び／又は対象のＤＮＡ配列に隣接している、少なくとも１つの制限酵素部位は、ＩＩＳ型酵素、例えば、ＳａｐＩのための部位である。図１２は、ＩＩＳ型制限酵素のための認識部位を有するベクターを使用するドナーベクター及びアクセプターベクターからの本発明のレシピエントベクターの作製法を示す。方向性クローニングでＩＩＳ型制限酵素のための部位を使用するために、その制限酵素のための少なくとも２つのユニークな部位及び／又は第１の制限酵素によって生成されるオーバーハングと相補的である、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する異なる制限酵素のためのユニークな部位を選択する。選択可能な遺伝子及び対抗選択可能な遺伝子の使用に加えて、メチル化を使用して、所望のベクターの頻度を高めてもよい。

【0150】

一実施形態において、ドナーベクター及びアクセプターベクターを線状にするために使用する制限酵素は同一であって、例えば、このドナーベクターは、対象のＤＮＡ配列に隣接しているユニークなＳａｐＩ部位を有し、ＳａｐＩで消化されると、部位は、ＳａｐＩを有するアクセプターベクターの消化後生成した一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的である、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する。他の実施形態では、ドナーベクターは、対象のＤＮＡ配列に隣接しているユニークなＥａｒＩ部位を有し、ＥａｒＩで消化されると、この部位は、ＥａｒＩを有するアクセプターベクターの消化後生成した一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的である、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する。他の実施形態では、ドナーベクター及びアクセプターベクターを線状にするために使用される制限酵素は異なり、例えば、このドナーベクターは、対象のＤＮＡ配列に隣接しているユニークなＳａｐＩ部位を有し、ＳａｐＩで消化されると、部位は、ＥａｒＩを有するアクセプターベクターの消化後生成した一本鎖ＤＮＡオーバーハングに相補的である、非自己相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する。ＳａｐＩ及び対応するメチラーゼの作製法は、米国特許第５，６６３，０６７号で開示されている。

【0151】

交換部位で１２の塩基（３つの潜在的コドン）を産生する、方向性クローニングのためのＳｆｉＩベクターの使用とは対照的に、ＳａｐＩベクターの使用により、交換部位で３つの塩基（１つの潜在的コドン）を産生する。したがって、ＳａｐＩベクターは、レシピエントベクターで有用であり、これはレシピエントベクターで対象のＤＮＡ配列によってコードされているタンパク質が、わずか２つの追加の残基を、１つはＮ末端及び１つはＣ末端、例えば、Ｎ末端のメチオニンのためのコドン及び複数のタンパク質のＣ末端で又はＣ末端近くで頻繁に発見されるＣ末端の残基を含むことができることによる。したがって、ＳａｐＩベクターから発現されるタンパク質は、それらの対応する未変性タンパク質に組成が非常に近い。さらに、交換部位を形成するオーバーラップ配列を、特定の生物体において特定の頻度で使用されるコドンに対応するように選択してもよい。

【0152】

図１４〜図１５で示す他の実施形態では、方向性クローニングのために２つの酵素のアプローチを使用する。ドナーベクターでは、対象のＤＮＡ配列は、少なくとも２つの制限酵素部位が隣接する。この部位の１つは、少なくとも一生物種でｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームの低頻度切断酵素であって、一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する第１の制限酵素のものであり、他の部位も、少なくとも一生物種でｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームの低頻度切断酵素であって、第１の制限酵素によって生成した末端に相補的でない末端を生成する第２の制限酵素のものである。一実施形態では、第２の制限酵素は、平滑末端を生成する。例えば、ドナーベクターは、薬剤耐性遺伝子１を有し、ヒトｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームの低頻度切断酵素であり、一本鎖ＤＮＡオーバーハング、例えばＳｇｆＩを生成する酵素（酵素Ｉ）のための制限酵素に隣接し、その同一種で低頻度切断酵素であり、平滑末端、例えばＰｍｅＩを生成する、制限酵素（酵素ＩＩ）のための部位が隣接する対象のＤＮＡ配列を有する。場合によって、発現ベクターであるドナーベクターを、異なる薬剤耐性遺伝子を有し、少なくとも２つの制限酵素部位で、場合によって、対抗選択可能な遺伝子を有するアクセプターベクターと混合する。本アクセプターベクターの部位のうちの１つは、酵素Ｉ、例えば、ＰｖｕＩ又はＰａｃＩによって生成された一本鎖ＤＮＡオーバーハングと相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する制限酵素（酵素ＩＩＩ）のものであって、１つの制限酵素部位は、酵素ＩＩによって生成された末端と連結することができる末端を生成する酵素（酵素ＩＶ）のためのものであり、例えば、酵素ＩＶは平滑末端を生成し、例えば、酵素ＩＶはＰｍｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｌＩ又はＤｒａＩである。本酵素による消化後、線状にされたドナーベクター及びアクセプターベクターの連結は、異なる薬剤耐性遺伝子、並びに２対の相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングの連結又は相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングと平滑末端の連結を通して、アクセプターベクター配列に連結した対象のＤＮＡ配列を含む、レシピエントベクターを産生する。

【0153】

一実施形態において、対象のＤＮＡ配列は、少なくとも１つの種においてｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームの低頻度切断酵素であって、一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する制限酵素（酵素Ｉ）のための制限酵素部位、及びｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームの低頻度切断酵素であって、第１の制限酵素によって生成された末端又は平滑末端に相補的でない末端を生成する制限酵素（酵素ＩＩ）のための制限酵素部位を含むように修飾する（図１５）。対象のＤＮＡ配列を、一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する低頻度切断酵素のための部位に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、及び低頻度切断酵素であって、第１の制限酵素によって生成した末端、例えば、平滑末端に相補的でない末端を生成する酵素によって認識される部位に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドと混合し、この混合物を増幅反応にかけて、ＤＮＡ断片を得る。一実施形態では、第２の制限酵素は、平滑末端切断酵素である。対象のＤＮＡ配列の末端に加えた部位は、消化されると、各末端に一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成するか、１つの末端及び反対の末端の平滑末端に一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成する。酵素Ｉによって生成されたオーバーハングに相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハング、又は酵素Ｉ及び平滑末端に対して生成されたオーバーハングに相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングを、制限酵素ＩＩＩ及びＩＶを有するアクセプターベクター内で生成させて、それぞれ線状化アクセプターベクターを産生させる。薬剤耐性遺伝子を含む線状化アクセプターベクターを、消化されたＤＮＡ断片に連結させて、レシピエントベクターを得る。本レシピエントベクターは、アクセプターベクターの薬剤耐性遺伝子、並びに各末端の相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングの連結、又は１つの末端の相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングと反対の末端の平滑末端の連結によって生成した部位が隣接した対象のＤＮＡ配列を含む。ＳｇｆＩ／ＰｍｅＩアプローチは、タンパク質のＮ末端、例えば、ＲＢＳ又はＫｏｚａｋ配列の３’側に配置されたＮ末端にさらなる残基を持たないタンパク質をコードするレシピエントベクター、或いは１つ又は複数のアミノ酸残基のＮ末端融合又はＣ末端融合を有する融合タンパク質をコードするレシピエントベクターを得ることができる（図１６〜図１７及び表Ｉは、平滑末端を生成する酵素、及びＰｍｅＩによって生成した平滑末端と、これらの酵素のそれぞれによって生成した平滑末端の連結によって生じた交換部位を示す）。

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【0154】

また、ＳｇｆＩ／ＰｍｅＩアプローチは、２つの対象のＤＮＡ断片を同一のベクターに導入するためにも使用される（図１８〜図１９）。例えば、ドナーベクターを、薬剤耐性遺伝子１、並びに少なくとも一生物種でｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームの低頻度切断酵素であって、一本鎖ＤＮＡを生成する制限酵素（酵素Ｉ）、例えば、ＳｇｆＩのための制限部位と、ｃＤＮＡ又はオープンリーディングフレームの低頻度切断酵素であって、平滑末端を生成する制限酵素（酵素ＩＩ）、例えば、ＰｍｅＩのための部位が隣接する対象のＤＮＡ配列を含むように入手又は作製する。アクセプターベクターは、薬剤耐性遺伝子２、及び酵素Ｉと線状になるドナーベクター内のオーバーハングと相補的である一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成し、酵素Ｉ、例えば、ＰｖｕＩと異なる制限酵素（酵素ＩＩＩ）のための制限部位と、平滑末端を生成し、酵素ＩＩ、例えば、ＨｐａＩと異なる酵素（酵素ＩＶ）のための制限部位を含むように入手又は作製する。また、アクセプターベクターは、制限部位をさらに２つ含み、それぞれがアクセプターベクター内の対象のＤＮＡ配列の５’又は３’側であり、このうちの１つが酵素Ｉによって生成されたオーバーハングと相補的であって、酵素Ｉ、例えば、ＰａｃＩと異なる制限酵素（酵素Ｖ）のための制限部位であり、もう１つは、平滑末端を生成し、この酵素が酵素ＩＩ又は酵素ＩＶ、例えば、ＳｗａＩと異なる制限酵素のための制限部位である。本ドナーベクターは、酵素Ｉ及び酵素ＩＩと線状になっており、酵素ＩＩＩ及び酵素ＩＶと線状になったアクセプターベクターと連結して、薬剤耐性遺伝子２、対象のＤＮＡ配列、並びに両方が対象のＤＮＡ配列の５’又は３’側である制限酵素Ｖ及び酵素ＶＩのための部位を有するレシピエントベクターを産生する。薬剤耐性遺伝子、並びに酵素Ｉのための制限部位及び酵素ＩＩのためのもう１つの制限部位が隣接する異なる対象のＤＮＡを有する第２のドナーベクターを、酵素Ｉ及び酵素ＩＩで消化し、酵素Ｖ及び酵素ＶＩと線状になるレシピエントベクターと混合し、対象のＤＮＡ断片の両方を有する第２のレシピエントベクターを得る。そのようなレシピエントベクターは、例えば、ハイブリッド試験又は共存試験の２つで、タンパク質−タンパク質相互作用を調べるために有用であり、特に、１種のタンパク質が、出現していないか、そのタンパク質に対する結合タンパク質の発現がない場合に、低濃度のみで発現する系で有用である。

【0155】

Ｖ．ライブラリー
本発明のベクターは、特定の生物体のゲノムの少なくとも１０％、及び５０％まで又は５０％を超えるオープンリーディングフレームを表すライブラリーなどの、オープンリーディングフレームのライブラリー、並びに突然変異オープンリーディングフレームのライブラリーを作成するために使用してもよい。例えば、個々のオープンリーディングフレームに対する増幅プライマーをデザインする。フォワードプライマーに関して、一実施形態では、ＳｇｆＩ部位は、オープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＴＧ）から（上流の）５’側の１塩基を配列し、このプライマーは、増幅中にプライマーをアニールするために適切なＴ_m（例えば、＞４５℃）を、オープンリーディングフレームの補体を有する鋳型に提供するための長さであって、このためにリーディングフレームからの十分な配列を有する。リバースプライマーは、オープンリーディングフレームの終止コドンより前の最終コドンのアンチセンスに、直接に追加したＰｍｅＩ部位を含む。リバースプライマーは、増幅中にプライマーをアニールするための適切なＴ_mを鋳型に提供するための長さであって、このためにオープンリーディングフレームのＣ末端の部分から十分なアンチセンス配列を有し、対応するフォワードプライマーとＴ_mが一致することが好ましい（例えば、＞４５℃）。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩ部位に対して５’側に追加された３〜５塩基をさらに有し、これら酵素による増幅オープンリーディングフレームの迅速な消化を確実にすることが好ましい。次に、オープンリーディングフレームを、オープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡテンプレート、ＲＮＡプレパラート、ゲノムＤＮＡ又はプラスミドクローンから増幅する。オープンリーディングフレームは、特に、増幅領域が８００ｂｐを超えている場合、高フィデリティーポリメラーゼ、例えば、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによって増幅することが好ましい。

【0156】

増幅オープンリーディングフレームは、ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩによるＡ−テーリング又は消化と、適切に線状化されたベクターへの連結の２つの方法でクローン化してもよい。一実施形態では、増幅ＤＮＡを、各３’末端でさらなるアデニン残基とつないだ後に、標準のＴをつないだＰＣＲクローニングベクター（例えば、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によってクローン化する。代わりに、トポイソメラーゼＩ部位を、フォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにＴＯＰＯ（登録商標）−クローニングベクター（例えば、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、又はＡをつないだ場合はｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してクローン化したＰＣＲ断片の５’末端に加える。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用して、増幅オープンリーディングフレームを生成するならば、Ａ−テーリングは不必要である。例えば、５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む１Ｘ Ｔａｑ反応緩衝液内の０．２ｍＭのｄＡＴＰで、ＰＣＲ断片を７０℃で１５分間処理し、わずかな部分を（例えば、１〜２μＬ）、例えば、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒによる連結反応又はＳｇｆＩ及びＰｍｅＩによる消化のために、並びにＳｇｆＩ及びＰｍｅＩ、例えばＡＣＣＥＰＴ−６（図２１Ｃ参照）によって消化したベクターへの連結のために取り除く。場合によって、増幅断片は、例えば、プライマーを取り除くためにＳｇｆＩ及びＰｍｅＩでの消化の前に精製する。制限消化の後で、この断片を、場合によっては精製して、消化断片から遊離したわずかなオリゴヌクレオチドを取り除く。

【0157】

次に、連結混合物を、適切な大腸菌宿主、例えば、ＪＭ１０９に形質転換して、選択培地、例えば、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ−寒天で平面培養する。３７℃で一晩培養後、得られたコロニーを採集し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを補充したＬＢ培地で一晩増殖し、プラスミドＤＮＡを精製し、例えば、ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩでプラスミドを消化して、消化したプラスミドをゲル電気泳動にかけることによって、適切なサイズの挿入物であるかスクリーニングする。

【0158】

オープンリーディングフレームをクローン化する工程は、生物体の１種又は群の複数のオープンリーディングフレームを同時に実施することができる。例えば、フォワードプライマー及びリバースプライマーを、９６ウェル又は３８４ウェルプレートなどのアレイフォーマットで、特定のオープンリーディングフレームに対するフォワードプライマー及びリバースプライマーが同じウェル内にあるように、供給することができる。鋳型ｃＤＮＡ及び増幅試薬を、プレート全体に同時に供給し、増幅反応をすべての９６ウェル又は３８４ウェルで同時に実施することが可能である。同様に、増殖ＤＮＡを精製する工程、場合によっては、制限酵素による増幅ＤＮＡの消化又は増幅ＤＮＡのＡ−テーリング、ベクターへの連結、及び大腸菌の形質転換を、９６ウェル又は３８４ウェルプレートで果たすことができる。形質転換混合物を選択培地で個々に平板培養することが可能で、３７℃で一晩培養後、得られたコロニーを採集し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを補充したＬＢ培地で一晩増殖する。プラスミドＤＮＡを精製し、例えば、ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩでプラスミドを消化して、ゲル電気泳動にかけることによって、適切なサイズの挿入物であるかスクリーニングする。次に、正しいサイズの挿入物を含むプラスミドを保有するコロニーを、９６ウェル又は３８４ウェルプレートに戻し、したがって、オープンリーディングフレームの配列した収集物又はライブラリーを作製することができる。一実施形態では、アレイは、５％以上、例えば、１０％〜３０％、又は７０％以上の生物体の１種又は群の複数のオープンリーディングフレームを表す。代わりに、アレイは、特定のオープンリーディングフレームのサブセット、例えば、特定の生物体由来のパラロガス遺伝子の多重遺伝子族、複数の生物体由来の一群のオルソロガス遺伝子、類似した経路（例えば、シグナル伝達経路）に含まれる一連の遺伝子、或いは、例えば、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼ、例えば、キナーゼ、例えば、受容体若しくは非受容体チロシンキナーゼ又はＭＡＰキナーゼを含む受容体若しくは非受容体セリン／スレオニンキナーゼ、ホスファターゼ、例えば、チロシンホスファターゼ、プロテアーゼ、グアニル酸シクラーゼ、Ｇタンパク質結合受容体、Ｇタンパク質制御因子、チトクロームＰ４５０酵素、ホスホリパーゼ、医療用タンパク質、例えば、治療用タンパク質、工業用タンパク質、例えば、生体触媒作用タンパク質などを含むがこれに限定されるものではない、機能的に関連した遺伝子産物をコードした１群の遺伝子を含むことができる。

【0159】

他の実施形態では、オープンリーディングフレームの非配列ライブラリーを、特定の特性、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの酵母菌の２つのハイブリッドに対するスクリーンにおける対象のタンパク質への結合、或いはベクター骨格に存在するオープンリーディングフレームの遺伝子産物の発現（共発現系）を変更することの、選択源又はスクリーニング源として使用する。一実施形態では、各ウェルで増殖したコロニー由来のＤＮＡを精製することが可能で、各ウェルから少量を１つの共通のプールに混合させて、対象のタンパク質を発現させる酵母菌に形質転換させることができる。代わりに、オープンリーディングフレームのライブラリーを、対象のタンパク質をコードするベクターに挿入、及び対象のタンパク質と相互に作用又は対象のタンパク質の発現を増加する遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームを有することが特定されたクローンをコードするベクターに挿入する。一実施形態では、相互作用する遺伝子産物をコードする２つの遺伝子は、多シストロン性ＲＮＡ、例えば、ＩＲＥＳを有する多シストロン性ＲＮＡに存在する。

【0160】

また、プールライブラリーを、方向性進展のために使用してもよい。したがって、特定のオープンリーディングフレームを、例えば、突然変異誘発ＰＣＲによって突然変異誘発する。突然変異誘発されたプール内の各突然変異誘発オープンリーディングフレームは、オープンリーディングフレームの５’末端及び３’末端にそれぞれＳｇｆＩ及びＰｍｅＩ部位を有する。突然変異誘発されたプールは、場合によって、ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩによって消化し、場合によって、制限消化によって遊離したわずかなオリゴヌクレオチドから精製し、適切なベクター、例えば、ＡＣＣＥＰＴ−６に連結する。次に、連結混合物を、適切な大腸菌宿主、例えば、ＪＭ１０９に形質転換し、選択培地の、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ−寒天で平面培養する。３７℃で一晩培養後、得られたコロニーを採集し、選択ＬＢ培地を使用して９６ウェル又は３８４ウェルプレートで一晩増殖し、選択活性、例えば、対応する非突然変異誘発オープンリーディングフレームにコードされる遺伝子産物の活性と異なる活性をスクリーニングする。一部の実施形態では、複数のクローンが各ウェルに存在し、同胞選択法を使用して所望の特性を有するクローンを特定する。例えば、１つのウェルに所望の特性が認められた場合、選択培地で平面培養することができ、３７℃で一晩培養後、得られたコロニーを採集し、９６ウェル又は３８４ウェルプレートで一晩再増殖し、特性を再度スクリーニングする。

【0161】

本発明は、次の限定を意図しない実施例によりさらに説明されよう。

【実施例】

【0162】

（例１）
アンピシリン感受性ドナーベクターを、緑色発光ルシフェラーゼ遺伝子を有し、この遺伝子が消化後に相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成しないＳｆｉＩ部位が隣接するように作製する（図２０Ａ）。また、アンピシリン耐性アクセプターベクターを、赤色発行ルシフェラーゼ遺伝子を有し、この遺伝子が消化後に相補的一本鎖ＤＮＡオーバーハングを生成しないが、それぞれが緑色発光ルシフェラーゼ遺伝子に隣接した一本鎖ＤＮＡオーバーハングのうちの１つに相補的であるＳｆｉＩ部位が隣接するように作製する。これらの２つのベクターを、ＳｆｉＩを含むＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液により５０℃で１時間消化した。反応物を室温まで冷却し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加した。連結反応を、２２℃で３０〜６０分間実施した。一部の連結反応物をゲル電気泳動にかけ、別の一部分はＪＭ１０９を形質転換するために使用した。形質転換細胞を、ニトロセルロース上に置き、一晩インキュベートした。

【0163】

フィルターを、１ｍＭのルシフェリンカリウム塩を含む１００ｍＭのクエン酸１ｍＬ（ｐＨ５．５）に４０℃で浮かせた。次に、像をＣＣＤデジタルカメラ（ミノルタＤｉｍａｇｅ７、４秒、ｆ４．５）で得た。この結果は、ＳｆｉＩがリガーゼ緩衝液において切断し、切断された末端がＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で再連結することを示している（図２０Ｂ）。所望のクローン数を改善するために、対抗選択可能マーカーを含むアクセプターベクターを使用してもよい。

【0164】

（例２）
ベクター
ｐＤＯＮＯＲ−４ＣＡＴベクターは、ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩ部位間の天然プロモーターのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子源として利用した。ｐＤＯＮＯＲ−４は、細菌選択のためのカナマイシン耐性遺伝子、方向性フレキシブルクローニングのための制限酵素部位ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩを含む。

【0165】

ｐＤＯＮＯＲ−６ＬａｃＺベクターは、ＬａｃＺレポーター遺伝子源として利用した。ｐＤＯＮＯＲ−６は、細菌選択のためのカナマイシン耐性遺伝子、方向性フレキシブルクローニングのための制限酵素部位ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩを含む。

【0166】

ｐＡＣＣＥＰＴ−Ｆベクター（図２１Ａ）は、レポーター遺伝子の骨格配列源として利用した。ｐＡＣＣＥＰＴ−Ｆは、細菌選択のためのアンピシリン耐性遺伝子、方向性フレキシブルクローニングのための制限酵素部位ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩを含む。

【0167】

結果
ｐＤＯＮＯＲ−６ＬａｃＺ由来のＬａｃＺレポーター遺伝子を、２段階の工程でｐＡＣＣＥＰＴ−Ｆに導入した。最初に、ｐＤＯＮＯＲ−６ＬａｃＺを、ＢＳＡを含むＰｒｏｍｅｇａ緩衝液Ｃの制限酵素ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩによって３７℃で１時間消化し、ベクターからＬａｃＺ遺伝子を遊離させた。消化後、反応管を６５℃へ２０分間加熱することでこの制限酵素を、不活化した。第２の線状ｐＡＣＣＥＰＴ−Ｆ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ、ＤＴＴ及び追加の緩衝液Ｃを反応管に加え、管を２２℃で１時間インキュベートすることで連結を開始した。連結の後で、反応物の一定分量を大腸菌細胞（ＪＭ１０９）に形質転換し、形質転換混合物をアンピシリン、Ｘ−ｇａｌ及びラムノースを含むＬ培地（ＬＢ）プレート上に蒔いて培養した。コロニーを、それによって青色を発するＸ−ｇａｌの利用能について視覚的スクリーニングをした。結果は、約９０％のコロニーが、ＬａｃＺ遺伝子のｐＤＯＮＯＲ−６ＬａｃＺからｐＡＣＣＥＰＴ−Ｆベクターへの導入パーセント（パーセンテージは、総青色コロニー数／総コロニー数×１００によって算出した）を示す青色を発することを実証した。

【0168】

また、ｐＤＯＮＯＲ−６ＬａｃＺ由来のＬａｃＺレポーター遺伝子を、２段階の工程でｐＤＥＳＴ−Ｆに導入した。最初に、ベクターｐＤＯＮＯＲ−６ＬａｃＺ及びｐＡＣＣＥＰＴ−Ｆを、１つの管内で、ＢＳＡを含むＰｒｏｍｅｇａ緩衝液Ｃの制限酵素ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩによって３７℃で１時間消化し、ベクターからＬａｃＺ遺伝子を遊離した。消化後、この制限酵素を、反応管を６５℃へ２０分間加熱することで不活化した。第２に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ、ＤＴＴ及び追加の緩衝液Ｃを反応管に加え、管を２２℃で１時間インキュベートすることで連結を開始した。連結の後で、反応物の一定分量を大腸菌細胞（ＪＭ１０９）に形質転換し、形質転換混合物をアンピシリン、Ｘ−ｇａｌ及びラムノースを含むＬＢプレート上に蒔いて培養した。結果は、約８１％のコロニーが青色を発することを実証した。

【0169】

ｐＤＯＮＯＲ−４ＣＡＴ由来のＣＡＴレポーター遺伝子を、２段階の工程でｐＡＣＣＥＰＴ−Ｆに導入した。最初に、ｐＤＯＮＯＲ−４ＣＡＴを、ＢＳＡを含むＰｒｏｍｅｇａ緩衝液ＣのＳｇｆＩ及びＰｍｅＩによって３７℃で１時間消化し、ベクターからＣＡＴ遺伝子を遊離した。消化後、この制限酵素を６５℃へ２０分間不活化した。第２に、線状ｐＡＣＣＥＰＴ−Ｆ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ、ＤＴＴ及び追加の緩衝液Ｃを反応管に加え、連結を２５℃で１時間実施した。連結の後で、反応物の一定分量を大腸菌ＪＭ１０９細菌細胞に形質転換し、形質転換混合物を、アンピシリンを含むＬＢプレート上に蒔いて培養した。得られたコロニーのうち、１００コロニーをクロラムフェニコール含むＬＢプレート上に蒔いて再培養した。クロラムフェニコール上で増殖したコロニーは、ＣＡＴ遺伝子を含んだ。ｐＤＯＮＯＲ−４ＣＡＴからｐＡＣＣＥＰＴ−ＦベクターへのＣＡＴ遺伝子の導入効率を約９４％であると判定した（パーセンテージは、総ＣＡＴ耐性コロニー数／総試験コロニー数×１００によって算出した）。

【0170】

ｐＤＯＮＯＲ−４ＣＡＴ由来のＣＡＴレポーター遺伝子を、１段階の工程でｐＡＣＣＥＰＴ−Ｆに導入した。ｐＤＯＮＯＲ−４ＣＡＴ、線状ｐＡＣＣＥＰＴ−Ｆ、制限酵素ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩ、ＢＳＡを含むＰｒｏｍｅｇａ緩衝液Ｃ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ、並びにＤＴＴを反応管に加えた。制限消化を、３７℃で１時間反応管をインキュベートすることで開始した。消化後、反応温度を１時間で２５℃に下げて連結反応が生じることを可能にした。連結の後で、反応物の一定分量を大腸菌ＪＭ１０９細菌細胞に形質転換し、形質転換混合物を、アンピシリンを含むＬＢプレート上に蒔いて培養した。得られたコロニーのうち、１００コロニーをクロラムフェニコール含むＬＢプレート上に蒔いて再培養した。クロラムフェニコール上で増殖したコロニーは、ＣＡＴ遺伝子を含んだ。ｐＥＮＴＲＹ−４のＣＡＴからアクセプターベクターへのＣＡＴ遺伝子の導入効率を約３７％であると判定した。

【0171】

（例３）
方向性クローニングを含むクローニングに有用な誘導系は、誘導プロモーターによって調節される遺伝子産物をコードする組換え宿主細胞を含み、この遺伝子産物は、細胞に導入されたベクターにおける対象のＤＮＡの転写を特異的に増加する。一実施形態では、第１のベクターは、プロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターに作用可能に連結した対象の遺伝子のためのオープンリーディングフレームを含み、本ベクターは、プロモーターの５’側の転写ターミネーター配列、例えば、ｒｒｎＢターミネーター（異常発現を減少する）、薬剤耐性遺伝子、例えば、ｋａｎ^R、宿主細胞における高いコピー数でのベクターの維持を可能にする配列、場合によって、ベクターの多量体化を減少する配列、例えば、ｃｅｒ配列を有し、さらにオープンリーディングフレームに隣接した制限酵素を有する。一実施形態では、オープンリーディングフレームに隣接した制限酵素部位は、相補ＤＮＡ末端を生成しない２つの異なる低頻度切断酵素のためのものである（酵素Ｉ及び酵素ＩＩ）（図２１）。また、図２１のベクターは、ＰｍｅＩ部位のＴ７転写ターミネーター３’を含む。オープンリーディングフレームのための対象の骨格を有する第２のベクターは、好ましくは、異なる薬剤耐性遺伝子、例えば、ａｍｐ^Rを含み、さらに、場合によって、同一の転写ターミネーター配列、プロモーター、宿主細胞における高いコピー数でのベクターの維持を可能にする配列を含み、さらに、場合によって、対象のオープンリーディングフレームを含むベクターのような、ベクターの多量体化を減少させる配列を含み、第２のベクターにおける転写ターミネーター配列及びプロモーターは、それぞれ、酵素Ｉ及び酵素ＩＩにより生成された末端と互換性を持つ末端を生成する２つの制限酵素（酵素ＩＩＩ及び酵素ＩＶ）のための制限酵素部位に対して５’側にある。例えば、酵素ＩはＳｇｆＩ、酵素ＩＩはＰｍｅＩ、酵素ＩＩＩはＰｖｕＩ及び酵素ＩＶはＤｒａＩである。他の実施形態では、酵素Ｉ及びＩＩＩにより認識される制限部位は同一であって、例えば、ＳｇｆＩのための部位であり、酵素ＩＩ及びＩＶにより認識される制限部位は同一であって、例えば、ＰｍｅＩのための部位である。得られたベクターは、誘導して遺伝子産物を発現することができる宿主細胞に導入し、遺伝子産物は、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなどの遺伝子産物で、オープンリーディングフレームの５’側であるプロモーターの転写を増加する。

【0172】

例えば、クローン、及び対象の遺伝子の発現に有用な宿主細胞を含むラムノース−誘導系を作製した。例えば、ＪＭ１０９における１種又は複数のｒｈａＢＡＤ触媒遺伝子を、挿入突然変異を通して、除去、交換又は中断する。一実施形態において、ＪＭ１０９のｒｈａＢ遺伝子を除去し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼオープンリーディングフレームに連結したｒｈａＢＡＤプロモーターを含むベクター（例えば、以下を参照のこと。Ｅｇａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３４：８７（１９９３年）及びＷｉｌｍｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ．、７３：９５（２００１年））をこれらの細胞に安定して導入し、組換え宿主細胞ＪＭ１０９ＲＸを産生した。Ｔ７プロモーターに連結したルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターを、ＪＭ１０９ＲＸ、ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びＢＬ２１−ＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞に導入した。形質転換細胞を、２５℃又は３７℃のいずれかで増殖し、次に、ラムノース（ＪＭ１０９ＲＸ）、ＩＰＴＧ（ＢＬ２１（ＤＥ３））又はアラビノース（ＢＬ２１−ＡＩ）と接触し、ルシフェラーゼ活性を様々な時点で測定した。

【0173】

データは、相当するアラビノース誘導系におけるより、形質転換ＪＭ１０９ＲＸ細胞ではるかに低いレベルの非誘導性ルシフェラーゼの発現が見られたことを示した。ラムノース−誘導系が毒性遺伝子をクローン化することに限定されるものではないが、このように、ラムノース誘導系は、ドナーベクター又は増幅断片で存在する毒性遺伝子をクローン化することに特に有用であると考えられる。

【0174】

さらに、形質転換ＪＭ１０９ＲＸ細胞でのルシフェラーゼ活性の誘導は、形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞又はＢＬ２１−ＡＩ細胞でのルシフェラーゼ活性と比べて遅いが、ＲＬＵが１００倍大きいとき、例えば、ｔ＝４時間の時間で、高い最終誘発レベル、例えば、高いタンパク質レベルをもたらした（図２２Ａ及びＣ）。さらに、２５℃でのラムノース誘導系の使用は、３７℃での使用より高い、例えば、ピークで少なくとも１０〜７０倍以上ルシフェラーゼ活性を産生した（図２２Ａ及びＣ）。そのような系の観察された発現のプロフィールは、発現タンパク質の溶解性を増加することを、例えば、組合せ時間を増加することによって、可能にすると考えられる。さらに、ラムノース誘導系はグルコースを抑制できる。したがって、ラムノース及びグルコースを組み合わせることにより、ｒｈａＢＡＤプロモーターに連結した対象の遺伝子の発現プロフィールを細かく調整することができる。

【0175】

（例４）
毒性遺伝子の発現系を作製した。安定して形質転換された宿主細胞（ＪＭ１０９）を、ｌａｍＢに統合された構成的プロモーター、例えば、４ｃプロモーターから発現した、バルナーゼ、バルスターの免疫因子をコードした発現ベクターを含むように作製した。分泌配列を欠いた切断バルナーゼ遺伝子（参照、例えば、登録番号Ｘ１２８７１又はＭ１４４４２（バシラス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のバルナーゼ遺伝子）或いはＡＥ００７６００（アロストリヂウム・アセトブチリカム（Ａｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のバルナーゼ遺伝子））に連結したλＰ_Lプロモーターを含むベクターを、これらの安定して形質転換された細胞に導入した。

【0176】

すべての出版物、特許及び特許出願は、参照することにより本願明細書に援用する。前述の明細書において、本発明は、その特定の好ましい実施形態に関連して記載しており、多くの詳細は説明の目的のために示しているが、本発明はさらなる実施形態を受け入れることが可能で、ここに記載した詳細のいくつかを、本発明の基本原理から逸脱せずに大幅に変更することができることは当業者には明らかとなろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図21E】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]