特許 6342174 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6342174

(24)【登録日】2018年5月25日

(45)【発行日】2018年6月13日

(54)【発明の名称】新規なグルコースデヒドロゲナーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/04 20060101AFI20180604BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180604BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180604BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180604BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180604BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180604BHJP

   C12Q 1/32 20060101ALI20180604BHJP

   C12Q 1/54 20060101ALI20180604BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/04 D

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12Q1/32

   C12Q1/54

【請求項の数】9

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2014-21623(P2014-21623)

(22)【出願日】2014年2月6日

(65)【公開番号】特開2015-146773(P2015-146773A)

(43)【公開日】2015年8月20日

【審査請求日】2017年1月31日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003160

【氏名又は名称】東洋紡株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】598041566

【氏名又は名称】学校法人北里研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】山崎 泰裕

(72)【発明者】

【氏名】角田 洋輔

(72)【発明者】

【氏名】相場 洋志

(72)【発明者】

【氏名】岸本 高英

(72)【発明者】

【氏名】大村 智

(72)【発明者】

【氏名】高橋 洋子

(72)【発明者】

【氏名】野中 健一

(72)【発明者】

【氏名】中島 琢自

【審査官】 小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／００１９７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−１７６３６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１４７２０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／００２９７３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ９／００− ９／９９

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＤＷＰＩ（Ｄｅｒｗｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドを含むフラビン結合型グルコース脱水素酵素；
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。

【請求項2】

以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列を有するＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【請求項3】

請求項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。

【請求項4】

請求項３に記載のベクターが導入されている形質転換体。

【請求項5】

請求項２に記載のＤＮＡを有する微生物を培養すること、及び得られる培養液を精製すること、を含む請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を製造する方法。

【請求項6】

微生物が、請求項４に記載の形質転換体である請求項５に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。

【請求項7】

請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。

【請求項8】

請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。

【請求項9】

請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はグルコースデヒドロゲナーゼ（「ＧＤＨ」とも表す。）に関する。また、本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド（「ＦＡＤ」とも表す。）を補酵素とするフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（「ＦＡＤＧＤＨ」とも表す。）、ＦＡＤＧＤＨの製造方法、及びＦＡＤＧＤＨを用いたグルコース測定方法、グルコースセンサ及びグルコースアッセイキット等に関する。

【背景技術】

【0002】

血糖自己測定（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ−Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ）は糖尿病患者が自己の血糖値を管理し、治療に活用するために重要である。近年、ＳＭＢＧのために、電気化学的バイオセンサを用いた簡易型の自己血糖測定器が広く用いられている。バイオセンサは、絶縁性の基板上に電極、酵素反応層を形成した装置である。

【0003】

ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．９９．１０）は、主に血中グルコース濃度測定に用いられる酵素であり、以下の反応を触媒する。
Ｄ−グルコース ＋ 電子受容体（酸化型）
→ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン ＋ 電子受容体（還元型）

【0004】

血中グルコース定量用酵素としては、グルコースデヒドロゲナーゼ、及びグルコースオキシダーゼ（「ＧＯ」とも表す。）（ＥＣ １．１．３．４）等が挙げられる。ＧＯを用いた方法は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘されている。一方でＧＤＨでもピロロキノリンキノン依存型グルコース脱水素酵素（「ＰＱＱＧＤＨ」とも表す。）（ＥＣ １．１．５．２（旧ＥＣ １．１．９９．１７））は、溶存酸素の影響を受けないが、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため正確な血糖値の測定には適していない。

【0005】

ＦＡＤＧＤＨは、溶存酸素の影響を受けず、マルトースにもほとんど作用しない。発明者らは、これまでに子嚢菌からのスクリーニングにより、マルトースやキシロースの影響を受けにくいＦＡＤＧＤＨを発見している。代表的なものとして、特許文献１記載のムコール・ヒエマリス由来のＦＡＤＧＤＨがある。また、特許文献２及び３にも同様の特性を有するＦＡＤＧＤＨが開示されている。

【0006】

ところで、グルコースセンサが使用される環境は室内であり、グルコースセンサを使用する一般ユーザーがセンサストリップを使用する際に厳密な温度管理を行うことはまれである。従って、個人によって保管されるグルコースセンサが曝される温度は、気候の変化により広い（例えば０℃〜４０℃）。

【0007】

一般的に、酵素の反応性は反応条件が低温になるほど低くなる傾向が知られており、ＦＡＤＧＤＨも例外ではない。また、冬場はかなり低い温度（例えば、２〜１０℃）で使用されることが想定される。かかる知見に基づくと、室温が低い状況で使用されるグルコースセンサは実際よりも低い血糖値を示す可能性がある。

【0008】

実際に、「医療と検査機器・試薬」という業界紙において、『ＳＭＢＧ装置とＰＯＣＴ対応血糖測定装置のすみ分け』（２００９年３２（６）Ｐ．７０７−７１３）の中で、ＳＭＢＧ装置の注意点として、環境温度条件が低温度域および高温度域の場合に、測定値がＩＳＯ１５１９７の許容範囲から外れる装置も多く、測定値が極端に低値や高値を示す場合は医療事故の要因になりうることが指摘されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開２０１３−１１６１０２

【特許文献2】特許第４５６１７６４号

【特許文献3】特開２０１２−１９７５６

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の目的は、既存のＦＡＤＧＤＨよりも低温反応性に優れ、低温での血糖測定に影響を与えにくいＦＡＤＧＤＨを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、従来知られているＦＡＤＧＤＨよりも高い低温反応性を有するＦＡＤＧＤＨを見出し、当該ＦＡＤＧＤＨの種々の特性を調べ、本発明を完成させた。

【0012】

すなわち、以下に代表される発明が提供される。
項１．
下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドを含むフラビン結合型グルコース脱水素酵素；
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
項２．
以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列を有するＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
項３．
項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
項４．
項３に記載のベクターが導入されている形質転換体。
項５．
項２に記載のＤＮＡを有する微生物を培養すること、及び得られる培養液を精製すること、を含む項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を製造する方法。
項６．
微生物が、項４に記載の形質転換体である項５に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
項７．
項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
項８．
項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
項９．
項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
項１０．
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含まない、項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
項１１．
タラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株以外の微生物によって、組換え発現で生産された、項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
項１２．
配列番号２に示される塩基配列を有さない、項２に記載のＤＮＡ。
項１３．
タラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株以外の微生物における発現に適するようにコドンユーセージが最適化されている、項２に記載のＤＮＡ。

【発明の効果】

【0013】

本発明により、低温でのより正確な血糖測定が可能になる。また、大腸菌、酵母、力ビ等を宿主細胞とした効率的なフラビン結合型ＧＤＨが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】タラロマイセス・エスピー・ＦＫＩ−２７２５株由来ＧＤＨの温度安定性を示す。

【図2】タラロマイセス・エスピー・ＦＫＩ−２７２５株由来ＧＤＨの各ｐＨにおける相対活性を示す。

【図3】タラロマイセス・エスピー・ＦＫＩ−２７２５株由来ＧＤＨの各ｐＨにおける１６時間処理後の活性残存率を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0016】

１．低温反応性
本発明における低温反応性とは、２５℃での酵素活性、又は３７℃での酵素活性と比較した５℃での酵素活性の相対値として評価される。各温度での酵素反応性は、下記２．記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素（ＦＧＤＨ）活性測定法に準じて、その反応温度を５℃、２５℃、３７℃に変更して測定される。ＦＧＤＨは、２５℃における酵素活性と比較して３５％以上、３７℃での酵素活性と比較して２０％以上であることが好ましい。後述する実施例で測定された代表的なＦＧＤＨは、５℃での反応性が、２５℃での反応性の３９％を示し、３７℃での反応性の２５％を示す。

【0017】

２．フラビン結合型グルコース脱水素酵素（ＦＧＤＨ）活性
ＧＤＨは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する理化学的性質を有する酵素である。本書においては、この理化学的性質をグルコースデヒドロゲナーゼ活性といい、特に断りが無い限り、「酵素活性」又は「活性」とは、当該酵素活性を意味する。前記電子受容体は、ＧＤＨが触媒する反応において、電子の授受を担うことが可能である限り特に制限されないが、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート、及びフェリシアン化合物等を使用することができる。

【0018】

グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法としては、種々の方法が知られているが、本書では、ＤＣＰＩＰを電子受容体として用い、反応前後における７５０ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に活性を測定する方法が用いられる。具体的な試薬組成や測定条件は、特にことわらない限り下記のとおりである。

【0019】

グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法
＜試薬＞
１．５Ｍ Ｄ−グルコースを含む１５０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ７．０（０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
３．１ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
上記Ｄ−グルコースを含むリン酸緩衝液２０ｍＬ、ＤＣＰＩＰ溶液１０ｍＬ、を混合して反応試薬とする。

【0020】

＜測定条件＞
反応試薬３ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、７５０ｎｍの吸光度変化を５分記録する。反応時間をＸ軸、吸光度をＹ軸として測定結果をプロットし、直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度１ＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量である。

【0021】

活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛−（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ−ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）×３．１×希釈倍率｝／｛０．８５×０．１×１．０｝

【0022】

なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、０．８５は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。本書においては、別段の表示をしない限り、酵素活性は上記の測定方法に従って、測定される。

【0023】

本発明のＧＤＨは、フラビンを補欠分子族として要求するフラビン結合型のＧＤＨ（ＦＧＤＨ）である。

【0024】

本発明のＦＧＤＨは、単離されたＦＧＤＨ又は精製されたＦＧＤＨであることが好ましい。また、本発明のＦＧＤＨは、上記保存に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明のＦＧＤＨに関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素は、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明のＦＧＤＨは、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、バッファー）中に存在してもよい。

【0025】

３．ポリペプチド
本発明のＦＧＤＨは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドで構成されることが好ましい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有し、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、且つ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。

【0026】

配列番号１で示されるアミノ酸配列とは、後述する実施例５に示される通り、タラロマイセス・エスピー・ＦＫＩ−２７２５株に由来するＦＧＤＨ（以下、ＴａｓＧＤＨとも表す）のアミノ酸配列であり、後述の４−１〜４−５の特性を全て満たす。

【0027】

上記（ｂ）のポリペプチドは、グルコース脱水素酵素活性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」とも表す。）されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

【0028】

当該変異がアミノ酸の置換である場合、置換の種類は、特に制限されないが、ＦＧＤＨの表現型に顕著な影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、その側鎖と性質が類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類される。よって、同一のファミリー内のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。

【0029】

一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して、ＧＤＨをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントを得ることができる。バリアントには、ＧＤＨを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。

【0030】

活性を維持するという観点からは、活性部位又は基質結合部位に影響を与えない部位において上記変異が存在することが好ましい。

【0031】

上記（ｃ）のポリペプチドは、上記１．の低温反応性を保持することを限度で、好ましくは下記４−１〜４−５の特性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＦＧＤＨが有するアミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。

【0032】

一実施形態において、上記（ｃ）のポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全に一致するアミノ酸配列を有していないことが、より改善された特性を備えるという観点から好ましい。また、同様の観点から、上記（ｃ）のポリペプチドは、組換え発現によって得られたポリペプチドであることが好ましい。組換え発現によって得られるポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドとは糖鎖結合等において異なるため、より好ましい特性を有していることが期待される。

【0033】

アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。

【0034】

なお、前記ＦＧＤＨを構成するポリペプチドは、シグナルペプチド部分を欠失していてもよい。Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＤｅｎｍａｒｋのＴｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＢＳ）により提供されているＳｉｇｎａｌＰ ４．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ.ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｓｉｇｎａｌｐ／）を用いて、デフォルトの設定での推定によれば、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１番目から１６番目までがシグナル配列と予想される。したがって、この部分を欠失することは酵素特性に不都合な影響をもたらさないと推察される。

【0035】

４．諸特性
本発明のＦＧＤＨは、下記４−１〜４−５のうち少なくとも１つ以上を備えていることが好ましく、より好ましくはその２つ以上を備え、更に好ましくはその３つの特性を更に備え、より更に好ましくはその４つ以上を備え、一層好ましくはその５つ以上を備え、特に好ましくはその全てを備える。本発明のＦＧＤＨは、上記４−１〜４−５の特性を如何なる組合せで備えていても良いが、上記４−１の特性を備えていることが好ましく、更には上記４−１の特性に加えて更に４−２〜４−５のうち少なくとも１つ以上の特性を備えていることが好ましい。

【0036】

４−１．分子量
本発明のＦＧＤＨを構成するポリペプチド部分の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に約５５ｋＤａである。「約５５ｋＤａ」とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常５５ｋＤａの位置にバンドがあると判断する範囲を含むことを意味する。「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のＦＧＤＨを意味する。微生物によって生産された本発明のＦＧＤＨが糖鎖結合型である場合は、それを熱処理や糖加水分解酵素によって処理することにより、糖鎖を除去した状態（即ち、「ポリペプチド部分」）にすることができる。実質的に糖鎖が結合していない状態とは、熱処理や糖加水分解酵素によって処理された糖鎖結合型ＦＧＤＨに不可避的に残存する糖鎖の存在を許容する。よって、ＦＧＤＨが本来的に糖鎖結合型でない場合は、それ自体が「ポリペプチド部分」に相当する。

【0037】

糖鎖結合型ＦＧＤＨから糖鎖を除去する手段としては、種々の方法が知られている。本書においては、後述する実施例に示すように、糖鎖結合型のＦＧＤＨを１００℃で１０分間加熱処理をして変性させた後、Ｎ−グリコシダーゼＥｎｄｏ Ｈ（ニューイングランドバイオラボ社製）を用いて３７℃で６時間以上処理する方法を使用することができる。

【0038】

本発明のＦＧＤＨに糖鎖が結合している場合、その分子量は、グルコース脱水素酵素活性、基質特異性、及び比活性などにネガティブに影響しない限り特に制限されない。例えば、糖鎖が結合した状態の本発明ＦＧＤＨの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの測定において、６０〜８０ｋＤａであることが好ましい。糖鎖結合型のＦＧＤＨは、酵素をより安定にするという観点及び水溶性を高め、水に溶け易くするという観点から好ましい。

【0039】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量の測定は、一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカーを用いて行うことができる。

【0040】

４−２．基質特異性
本発明のＦＧＤＨの基質特異性は、同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、Ｄ−キシロースに対する反応性が同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％として、５％以下であることが好ましい。また、ＦＧＤＨのＤ−ガラクトースに対する反応性は、同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％として、１％以下であることが好ましい。更に、ＦＧＤＨのマルトースに対する反応性は、同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％として、２％以下であることが好ましい。

【0041】

本書において、本発明のＦＧＤＨの各糖類に対する反応性は、上記２．に示すグルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法において、Ｄ−グルコースを他の糖（例えば、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、又はマルトース）に置き換えて、Ｄ−グルコースの場合の活性と比較することにより求める。但し、比較する場合の各糖類の濃度は５０ｍＭを基準とする。また、基質特異性を測定する際の酵素濃度は、グルコースに対する反応性を測定する時は、反応液の最終酵素濃度を１０μｇ／ｍｌ、キシロースやマルトース及びガラクトースに対する反応性を測定する時は１ｍｇ／ｍｌとする。

【0042】

４−３．至適活性ｐＨ
本発明のＦＧＤＨは、後述する実施例に示す通り、ｐＨ６．０（リン酸緩衝液）において最も高い活性を示すことが好ましい。また、本発明のＦＧＤＨは、ｐＨ６．５〜７．０の範囲において、ｐＨ６．０（リン酸緩衝液）における活性を１００％とした場合と比較して、８０％以上の相対活性を示すことが好ましい。即ち、本発明のＦＧＤＨの至適活性ｐＨは６．５〜８．０であり、好ましくはｐＨ６．０である。

【0043】

４−４．ｐＨ安定性
本明細書において、特定のｐＨ条件の下、２Ｕ／ｍＬの酵素を２５℃で１６時間処理した後の残存酵素活性が、処理前の同じｐＨ条件下での酵素活性と比較して９０％以上である場合に、当該酵素は、当該ｐＨ条件において安定であると判断する。本発明のＦＧＤＨは、少なくともｐＨ３．５〜６．５の範囲全体で安定であることが好ましい。

【0044】

４−５．温度安定性
本明細書において、特定の温度条件の下、適当な緩衝液中（例えば酢酸カリウムバッファー（ｐＨ５．０））で２Ｕ／ｍＬの酵素を１５分間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して８０％以上である場合に、当該酵素は当該温度条件において安定であると判断する。本発明のＦＧＤＨは、少なくとも４５℃以下（即ち、０℃〜４５℃の温度範囲）において安定であることが好ましい。

【0045】

５．由来
一実施形態において、本発明のＦＧＤＨは、タラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株に由来することが好ましい。タラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株は、石垣島土壌より単離された菌株であり、北里生命科学研究所微生物資源センターで保管されている。該菌株は所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。

【0046】

本発明のＦＧＤＨには、微生物から直接単離されるＦＧＤＨだけでなく、単離されたＦＧＤＨを蛋白質工学的な方法によりアミノ酸配列等を改変したものや、遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。例えば、前述の、タラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株から取得した酵素に改変を加えることによって、特性を付与した改変型の酵素であってもよい。

【0047】

６．フラビン結合型グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記１．のＦＧＤＨをコードするＤＮＡであり、具体的には以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかである。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列を有し、且つ、該塩基配列がグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、且つ、該塩基配列がグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加および／または逆位した塩基配列をＮＡであり、且つ、該塩基配列がグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであり、且つ、該塩基配列がグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【0048】

本書において「タンパク質（ポリペプチドまたはＦＧＤＨなどと言うこともある）をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。

【0049】

本発明のＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質が、グルコース脱水素酵素活性を持つタンパク質として上記１．の低温反応性を満たす限り、配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５%以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である塩基配列を有する。

【0050】

塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴにおいてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、塩基配列の同一性の値（％）を算出する。

【0051】

本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質がグルコース脱水素活性をもつタンパク質として上記１．を満たす限り、配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。ここで「ストリンジェントな条件」とは、一般には、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照して設定することができる。

【0052】

本書では、「ストリンジェントな条件」とは、以下に示す条件を言う。ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる。

【0053】

このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、酵素活性を公知の手法で測定することによって容易に取り除くことができる。

【0054】

好適な一実施形態において、本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡは、単離された状態で存在するＤＮＡである。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、単離されたＤＮＡは、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えば染色体ＤＮＡの場合の「単離された」状態とは、好ましくは、天然状態において共存する他のＤＮＡ成分を実質的に含まない。一方、ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「ＤＮＡ」と記載した場合には単離された状態のＤＮＡを意味する。本発明のＤＮＡには、上記（Ａ）〜（Ｆ）のＤＮＡと相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）も含まれる。

【0055】

本発明のＤＮＡは、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報（特に、配列番号２）を基に、化学的ＤＮＡ合成法により製造、取得することができ、例えば、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって容易に調製することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｄ Ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ （２００１）等参照）。化学的ＤＮＡ合成法としては、フォスフォアミダイト法による固相合成法を例示することができる。この合成法には自動合成機を利用することができる。

【0056】

また、本発明のＧＤＨ生産に用いるＤＮＡの入手方法としては、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法を利用して接続することにより、本発明のＧＤＨの全長をコードするＤＮＡを構築することも可能である。化学合成もしくはＰＣＲ法との組み合わせで全長ＤＮＡを構築することの利点は、該遺伝子を導入する宿主に合わせて使用コドンを遺伝子全長にわたり設計できる点にある。同一のアミノ酸をコードする複数のコドンは均一に使用されるわけではなく、生物種によってその使用頻度が異なる。一般にある生物種において高発現する遺伝子に含まれるコドンは、その生物種において使用頻度の高いコドンを多く含んでおり、逆に発現量の低い遺伝子は使用頻度の低いコドンの存在がボトルネックとなって高発現を妨げている例が少なくない。異種遺伝子の発現に際し、その遺伝子配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに置換することで該異種タンパク質発現量が増大した例はこれまでに多数報告されており、このような使用コドンの改変は異種遺伝子発現量の増大に効果があると期待される。

【0057】

上記の理由から、本発明のＧＤＨをコードするＤＮＡは、それが導入される宿主細胞により適したコドン（即ち、該宿主において使用頻度の高いコドン）に改変すること（最適化）が望ましい。各宿主のコドン使用頻度は、該宿主生物のゲノム配列上に存在する全遺伝子における各コドンの使用される割合で定義され、たとえば１０００コドンあたりの使用回数で表される。またコドン使用頻度は、その全ゲノム配列の解明されていない生物にあっては代表的な複数遺伝子の配列から近似的に算出することも可能である。組換えようとする宿主生物におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（財）かずさＤＮＡ研究所のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ）に公開されている遺伝暗号使用頻度データベースを用いることができ、または各生物におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよく、あるいは使用する宿主生物のコドン使用頻度データを自ら決定してもよい。入手したデータと導入しようとする遺伝子配列を参照し、遺伝子配列に用いられているコドンの中で宿主生物において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに置換すればよい。このような使用頻度の高いコドンとしては、例えば宿主が大腸菌Ｋ１２株である場合にあっては、ＧｌｙにはＧＧＴまたはＧＧＣ、ＧｌｕにはＧＡＡ、ＡｓｐにはＧＡＴ、ＶａｌにはＧＴＧ、ＡｌａにはＧＣＧ、ＡｒｇにはＣＧＴまたはＣＧＣ、ＳｅｒにはＡＧＣ、ＬｙｓにはＡＡＡ、ＩｌｅにはＡＴＴまたはＡＴＣ、ＴｈｒにはＡＣＣ、ＬｅｕにはＣＴＧ、ＧｌｎにはＣＡＧ、ＰｒｏにはＣＣＧなどが挙げられる。

【0058】

標準的な遺伝子工学的手法としては、具体的には、本発明のＦＧＤＨが発現される適当な起源微生物より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明のＤＮＡ配列（例えば、配列番号２の塩基配列）に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ．， ７８， ６６１３（１９８１）等参照〕。

【0059】

ｃＤＮＡライブラリーを調整するための起源微生物は、本発明のＦＧＤＨを発現する微生物であれば特に制限されないが、好ましくは、タラロマイセス属に分類される微生物である。

【0060】

微生物からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等は、いずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。例えば、ｃＤＮＡによって産生されるポリペプチドに対して、該ポリペプチド特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を適宜選択して実施することができる。

【0061】

ＤＮＡの取得に際しては、ＰＣＲ法またはその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法、特に５’−ＲＡＣＥ法〔Ｍ．Ａ． Ｆｒｏｈｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ．， ８， ８９９８ （１９８８）〕等の採用が好適である。

【0062】

ＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、配列番号２の塩基配列に基づいて適宜設計し合成することができる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等によることができる。

【0063】

本発明のＤＮＡを使用することにより、本発明のＦＧＤＨを容易に大量に、安定して製造することができる。

【0064】

７．ベクター
本発明のベクターは、上記２．で説明する本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。

【0065】

大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）など）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。糸状菌を宿主とするときは、ｐＵＮ１、ｐＵＳＣ等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。

【0066】

発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １．８４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。

【0067】

８．形質転換体
本発明は、宿主細胞に本発明のＤＮＡが導入された形質転換体に関する。本発明のＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記７．で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現してＦＧＤＨを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、植物培養細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。

【0068】

宿主が原核細胞の場合は、エシェリヒア属、バチルス属、ブレビバチルス属、コリネバクテリウム属などが例として挙げられ、それぞれ、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、バチルス・サブチリス、ブレビバチルス・チョウシネンシス、コリネバクテリウム・グルタミカムなどが例として挙げられる。また、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例として挙げられる。

【0069】

宿主が酵母の場合は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、キャンデイダ属、ピキア属、クリプトコッカス属などが例として挙げられ、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリス、ピキア・パストリス、クリプトコッカス・エスピーなどが例として挙げられる。ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが挙げられる。宿主が糸状菌細胞である場合は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、タラロマイセス属などが例として挙げられ、それぞれ、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・レセイ、タラロマイセス・エスピー等を例示することができる。

【0070】

本発明においては、ＦＧＤＨが単離されたタラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株を宿主とすることも好ましい。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。

【0071】

本発明の形質転換体は、好ましくは、上記７．に示される発現ベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション及びトランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、Ｈａｎａｈａｎの方法、酢酸リチウム法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法、等を利用して実施することができる。

【0072】

本発明の形質転換体は、本発明のＦＧＤＨを産生する能力を有するため、それを用いて効率的に本発明のＦＧＤＨを製造することが可能となる。

【0073】

９．フラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法
本発明のＦＧＤＨは、典型的には、本発明のＦＧＤＨの生産能を有する微生物を培養することで製造される。培養に供される微生物は、本発明のＦＧＤＨを産生する能力を有する限り特に制限されず、例えば、上記５．に示すタラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株及び上記８．に示す形質転換体を好適に利用することができる。

【0074】

上記のタラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株は、北里生命科学研究所微生物資源センターに保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。

【0075】

培養方法及び培養条件は、本発明のＦＧＤＨが生産される限り特に限定されない。即ち、ＦＧＤＨが生産されることを条件として、使用する微生物の生育に適合した方法及び条件を適宜設定できる。以下に、培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。

【0076】

培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、特に制限されない。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。

【0077】

タラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株を培養して本発明のＦＧＤＨを得る場合は、その微生物の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、固体培養で行った方が有利な場合もある。

【0078】

培地のｐＨは、培養する微生物の生育に適していればよく、例えば約３〜８、好ましくは約５〜７程度に調整し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２５〜３５℃程度で、１〜１５日間、好ましくは１〜７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。

【0079】

上記のような条件で培養した後、培養液又は菌体よりＦＧＤＨを回収することが好ましい。ＦＧＤＨを菌体外に分泌する微生物を用いる場合は、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。タラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株が産生するフラビン結合型グルコース脱水素酵素は基本的に分泌型のタンパク質である。

【0080】

他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、機械的手法、又はリゾチーム等の酵素を利用した手法等によって破砕した後、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＦＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取し、分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。

【0081】

精製は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿処理、加熱処理や等電点処理、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。

【0082】

カラムクロマトグラフィーを用いる場合は、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等を用いることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。

【0083】

なお、培養液からのグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質の採取（抽出、精製など）にあたっては、グルコース脱水素酵素活性、マルトース作用性、熱安定性などのうちいずれか１つ以上を指標に行ってもよい。

【0084】

各精製工程では原則としてＧＤＨ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験などによって、適切な条件を予め設定可能な場合にはこの限りでない。

【0085】

組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。

【0086】

１０．グルコースの測定方法等
グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＦＧＤＨを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のＦＧＤＨを用いてグルコースの濃度又は量が測定可能である限り、その態様は特に制限されないが、例えば、本発明のＦＧＤＨを試料中のグルコースに作用させ、グルコースの脱水素反応に伴う電子受容体（例えば、ＤＣＰＩＰ）の構造変化を吸光度で測定することにより実施することができる。より具体的には、上記２．に示す方法に従って、実施することができる。本発明に従った、グルコース濃度の測定は、試料に本発明のＦＧＤＨを添加すること、又は添加して混合することにより実施することができる。グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。グルコース濃度又は量の測定が可能である限り、試料に添加する酵素の量はと特に制限されない。

【0087】

１１．グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うＦＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、本発明のＦＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。また、ＦＧＤＨを含む試薬中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを適宜添加してもよい。

【0088】

１２．グルコースセンサ
本発明に従うＦＧＤＨを用いるグルコースセンサは、電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰといった補酵素、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることができる。使用する電子メディエーターとしては、ＧＤＨの補酵素であるＦＡＤから電子を受け取り、発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられ、たとえばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，５−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、ニトロソアニリン、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等が例示されるが、これらに限定されない。また、電極上のＧＤＨ組成物中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、さらにはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリグルタミン酸などの親水性ポリマーを含んでもよい。

【0089】

センサーを用いたグルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＦＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

【0090】

以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。以下の実施例の記載はいかなる面においても本発明を限定しない。

【実施例】

【0091】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0092】

＜実施例１＞
タラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株からのＧＤＨの取得
５０ｍＬのＹＰＤ培地（０．５重量％酵母エキス、１重量％ペプトン、２重量％グルコース）を５００ｍＬ坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、前培養用の培地を調製した。予めＤＰプレート培地で復元したタラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株を前培養培地に一白金耳植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで３日間振とう培養し、種培養液を得た。

【0093】

次に、６．０Ｌの生産培地（酵母エキス３．０重量％、グルコース重量３．０％、ｐＨ６．０）を１０Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地を調製した。５０ｍＬの種培養液を本培養培地に植菌し、培養温度２５℃、攪拌速度３５０ｒｐｍ、通気量２．０Ｌ／分、管内圧０．２ＭＰａの条件で３日間培養した。その後、培養液を３Ｌまで濃縮し、粗酵素液を得た。

【0094】

粗酵素液に４０％飽和になるように硫酸アンモニウムを徐々に添加し、予め４０％飽和の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した５００ｍＬのＰＳセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）のリニアグラジエントで溶出させた。溶出されたＧＤＨ画分を分画分子量１０，０００の中空糸膜（スペクトラムラボラトリーズ製）で濃縮後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ２５（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、脱塩を実施した。その後、脱塩した画分を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、夾雑タンパクのみを吸着させた。そして、得られた画分を４０％飽和の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した５０ｍＬのＲｅｓｏｒｃｅ Ｐｈｅ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）のリニアグラジエントで溶出させた。さらに、溶出した画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、精製酵素を得た。以下、得られた精製ＧＤＨを「Ｔａｓ−ＧＤＨ」とも表する。

【0095】

＜実施例２＞
温度依存性
実施例１で得られたＴａｓ−ＧＤＨについて上記２．に示したＦＡＤＧＤＨの活性測定法に従い、５℃、２５℃、３７℃での活性を測定した。酵素濃度については最終濃度が１７μｇ／ｍｌとなるように調整した。

【0096】

＜比較例１＞
特許文献２の配列番号４のアミノ酸配列を麹菌で組み替え産生し、精製した酵素について上記２．に示したＦＡＤＧＤＨの活性測定法に従い、５℃、２５℃、３７℃での活性測定を行った。酵素濃度については最終濃度３．８μｇ／ｍｌとなるように調整した。

【0097】

＜比較例２＞
特許文献１の配列番号１のアミノ酸配列を酵母で組み替え産生し、精製した酵素を比較例２として調製し、上記２．に示したＦＡＤＧＤＨの活性測定法に従い、５℃、２５℃、３７℃での活性測定を行った。酵素濃度については最終濃度４．７μｇ／ｍｌで統一した。

【0098】

実施例２、比較例１、及び比較例２の測定結果、及び５℃での酵素活性の２５℃及び３７℃での酵素活性に対する相対値を表１に示す。

【0099】

【表1】

【0100】

表１に示される通り、実施例１で得られたＴａｓ−ＧＤＨが５℃において高い活性を有していることが確認された。

【0101】

＜実施例３＞
温度安定性
実施例１で得られたＴａｓ−ＧＤＨの温度安定性を調べた。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に２Ｕ／ｍｌとなるようにＴａｓ−ＧＤＨを添加し、各温度（４℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃）で１５分間維持した後、上記２．に示したＦＡＤＧＤＨ活性測定方法を用いてＧＤＨ活性を測定し、処理前のＧＤＨ活性と比較して残存率を求めた。結果を図１に示す。

【0102】

その結果、Ｔａｓ−ＧＤＨは、４℃〜４５℃の範囲の温度での処理した場合、９０％以上の残存率を有していた。以上から、Ｔａｓ−ＧＤＨは、４５℃までの加温処理で実質的な失活が起こらないことが確認された。

【0103】

＜実施例４＞
ｐＨ依存性
実施例１で得られたＴａｓ−ＧＤＨの至適ｐＨを調べた。１００ｍＭ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０−５．５、図２中■印でプロット）１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５−６．４、図２中□印でプロット）、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．３−７．８、図２中▲でプロット）、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０−８．０、図２中△印でプロット）を用いた。それぞれのｐＨにおける３７℃での活性を測定し、最も高い活性値を基準（１００％）として、各ｐHにおける相対活性を求めた。結果を図２に示す。

【0104】

その結果、Ｔａｓ−ＧＤＨの至適活性ｐＨは、リン酸カリウム緩衝液を使用した場合のｐＨ６．３であった。また、ｐＨ６．３〜７．０の範囲で、ｐＨ６．３における活性を１００％とした場合と比較して９０％以上の相対活性を示した。以上のことから、Ｔａｓ−ＧＤＨの至適活性ｐＨはｐＨ６．３〜７．０であることが確認された。

【0105】

＜実施例５＞
ｐＨ安定性
実施例１で得られたＴａｓ−ＧＤＨ酵素液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ安定性を調べた。１００ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ２．５−３．５、図中■でプロット）、１００ｍＭ 酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ３．５−ｐＨ５．５：図３中□印でプロット）、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５−ｐＨ６．５：図３中▲印でプロット）、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−ｐＨ８．０：図３中△印でプロット）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５−ｐＨ９．０：図３中●印でプロット）を用い、２５℃、１６時間、各緩衝液中で酵素を維持した後のグルコースを基質とした場合の活性を測定した。処理後の活性値と処理前の同じ緩衝液中での活性値を比較し、残存活性率を求めた。結果を図２に示す。

【0106】

その結果、改変型ＦＡＤＧＤＨは、ｐＨ３．５〜ｐＨ６．５の範囲で９０％以上の活性残存率であった。以上のことから、改変型ＦＡＤＧＤＨの安定ｐＨ域はｐＨ３．５〜ｐＨ６．５であることが確認された。

【0107】

＜実施例６＞
基質特異性
実施例１で得られたＴａｓ−ＧＤＨについて上記２．に示したＦＡＤＧＤＨの活性測定法に従い、Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースを基質とした場合の活性を測定した。Ｄ−グルコースを基質とした場合の活性を１００％とし、それと比較した他の糖に対する活性を求めた。各糖の濃度は２００ｍＭとした。結果を表２に示す。なお、酵素濃度は、グルコースに対する活性を測定した場合は最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように調製し、他の糖に対する活性を測定した場合は、最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。結果を表２に示す。

【0108】

【表2】

【0109】

＜実施例７＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量の推定
実施例１で得られたＴａｓ−ＧＤＨについて１００℃、１０分間、加熱処理して変性させた後、５Ｕのエンドグリコシダーゼ（Ｅｎｄｏ Ｈ：ニューイングランドバイオラボ社製）で３７℃、１時間処理し、タンパク質に付加している糖鎖を分解した。次に、糖鎖を分解した酵素について、Ｎｕ−ＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果、主に５５ｋＤａにバンドが見られたため、それのバンドをゲルから切り出し、トリプシンで消化させた後ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析による消化断片の分子量測定、およびＭＡＳＣＯＴ解析によるタンパク質の同定を行った。結果、５５ｋＤａのバンドから得られるペプチドが既知のＦＡＤ依存型ＧＭＣオキシドレダクターゼ様タンパク質と高いヒット率を示したため、このバンドがＧＤＨであると推定した。

【0110】

＜実施例８＞
ＧＤＨ遺伝子の取得
（１）Ｔｏｔａｌ―ＲＮＡの調製
タラロマイセス・エスピー・ＦＫＩ−２７２５株をＧＤＨ生産培地（酵母エキス３．０重量％、グルコース３．０重量％、ｐＨ６．０）６０ｍＬに接種し、２日間、２５℃で振とう培養した。この培養液を濾紙濾過し、菌糸体を回収した。得られた菌糸体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて粉砕した。次いで、ホットフェノール法により、粉砕した菌糸体からＴｏｔａｌ―ＲＮＡを得た。

【0111】

（２）部分アミノ酸配列の決定
実施例１で得られた精製Ｔａｓ−ＧＤＨについてＮｕ−ＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて染色し、当該酵素の分子量に相当するバンド部分を切り出した。切り出したゲル断片を外部機関に委託し、その中に含まれるタンパク質の内部アミノ酸配列情報を取得した。その結果、得られたアミノ酸配列は、ＭＶＧＦＴＶＨＰＤＴＬＤＲ（配列番号３）およびＡＹＹＷＰＹＥＡＲ（配列番号４）であった。

【0112】

（３）遺伝子配列の決定
上記の部分アミノ酸配列情報に基づき、ミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製した。上記（１）にて調製したタラロマイセス・エスピー・ＦＫＩ−２７２５株のＴｏｔａｌ−ＲＮＡをテンプレートとし、Ｓｍａｒｔｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて、そのプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、１００ｂｐ程度の長さに相当するシングルバンドが確認された。このバンドに含まれる増幅ＤＮＡ断片を精製し、Ｔａｒｇｅｔ ｃｌｏｎｅ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用いて、ｐＴＡ２（東洋紡社製）に前記増幅ＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、組換えプラスミドｐＴＡ−Ｔｈ２７２５ＧＤＨｐａｒｔｉａｌを構築した。

【0113】

次いで、得られたｐＴＡ−Ｔｈ２７２５ＧＤＨｐａｒｔｉａｌを用い、公知のヒートショック法により大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡社製）を形質転換した。得られた形質転換体からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドを抽出・精製し、プラスミド中に含まれる前記増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した（１１１ｂｐ）。

【0114】

得られた前記増幅ＤＮＡ断片の配列情報を元に、Ｓｍａｒｔｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて３’側及び５’側のＧＤＨ遺伝子未知領域を決定した。いずれも各キットのプロトコールに従い、３’ＲＡＣＥ、及び５’ＲＡＣＥを行った。前記の方法に従って得られた複数のプラスミド中に含まれるＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、配列番号２に示す全鎖長１７８２ｂｐのタラロマイセス・エスピー・ＦＫＩ２７２５株由来ＧＤＨ遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列により予測した当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１に示す。

【0115】

＜実施例９＞
ＧＤＨ遺伝子の組換え発現
実施例２で明らかにしたタラロマイセス・エスピーＦＫＩ−２７２５株由来ＦＧＤＨ遺伝子（配列番号２）をかずさＤＮＡ研究所提供のコドンユーセージデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｋａｚｕｓａ.ｏｒ.ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）内の、サッカロマイセス・セレビシエ コドンユーセージテーブル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｋａｚｕｓａ.ｏｒ.ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ.ｃｇｉ?ｓｐｅｃｉｅｓ＝４９３２）を元にコドンユーセージの至適化を行い、至適化遺伝子配列を取得した（配列番号５）。配列番号５では、ＳｉｇｎａｌＰにより輸送シグナルであることが予測された１６アミノ酸残基分のＤＮＡを除去すると共に、後の制限酵素処理のため制限酵素サイトを付加している。配列番号５に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを、外部機関に合成依頼し、ｐＵＣベクターに接続されたサッカロマイセス・セレビシエコドンユーセージ至適化遺伝子を取得した（ｐＵＣ−Ｔｈ２７２５ＧＤＨ−Ｓｃ）。ｐＵＣ−Ｔｈ２７２５ＧＤＨ−Ｓｃを制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで処理し、遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を取得し、同じく制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで処理したベクターｐＹＥＳ３（インビトロジェン社）と混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ラーゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このように、ライゲーションしたＤＮＡをコンピテントハイＤＨ５α（東洋紡製）に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換した。得られた形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミド（ｐＹＥＳ３ＴａｓＧＤＨ）を抽出した。これを用いて、サッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン社）を定法で形質転換を実施した。

【0116】

次に得られた形質転換体を、１重量％酵母エキス、５重量％ポリペプトン、及び５重量％ガラクトースを含む培地で２０℃にて７２時間培養し、培養液を１２０００ｒｐｍにて５分間遠心することで菌体を取得した。菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０を１ｍＬ添加し、ボルテックスで十分に懸濁した。懸濁液に少量のガラスビーズを加えた後、ビーズショッカー（安井器械（株）製）で３，０００ｒｐｍ、２分間×２回の条件で破砕し、４℃、２，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離して、培養上清を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液の活性を上記２．に示す方法に従って測定したところ、0.740 U/mlのGDH活性が確認された。

【産業上の利用可能性】

【0117】

本発明により製造したグルコースデヒドロゲナーゼは、血糖値測定用試薬、血糖センサー並びにグルコース定量キットの原料としての供給が可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]