特許 6342802 セリアックスプルー病を治療するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6342802

(24)【登録日】2018年5月25日

(45)【発行日】2018年6月13日

(54)【発明の名称】セリアックスプルー病を治療するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/50 20060101AFI20180604BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180604BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180604BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180604BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180604BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180604BHJP

   A61K 38/48 20060101ALI20180604BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20180604BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20180604BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/50ZNA

   C12N15/00 A

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K38/48

   A61P37/08

   A61P1/00

【請求項の数】12

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2014-525175(P2014-525175)

(86)(22)【出願日】2012年8月10日

(65)【公表番号】特表2014-529399(P2014-529399A)

(43)【公表日】2014年11月13日

(86)【国際出願番号】US2012050364

(87)【国際公開番号】WO2013023151

(87)【国際公開日】20130214

【審査請求日】2015年7月13日

(31)【優先権主張番号】61/521,899

(32)【優先日】2011年8月10日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512272959

【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ワシントン スルー イッツ センター フォー コマーシャライゼーション

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ ＴＨＲＯＵＧＨ ＩＴＳ ＣＥＮＴＥＲ ＦＯＲ ＣＯＭＭＥＲＣＩＡＬＩＺＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(72)【発明者】

【氏名】シーゲル、ジャスティン

(72)【発明者】

【氏名】ベイカー、デビッド

(72)【発明者】

【氏名】ゴードン、シドニー リン アナ

(72)【発明者】

【氏名】パルツ、イングリッド スワンソン

(72)【発明者】

【氏名】スタンレー、エリザベス ジョイ

(72)【発明者】

【氏名】ウルフ、サラ ジェーン

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−０７８４８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０２６９５３８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 J. Biochem.，２００２年 ５月，Vol.131, No.5，p.757-765

【文献】 Database DDBJ/EMBL/GenBank [online]，Accession No. ACV57803，09-SEP-2009 uploaded，<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/257477484>，DEFFINITION: Peptidase S53 propeptide [Alicyclobacillus acidocaldarius sbsp. acidocaldarius DSM 446], 検索日：2016年4月11日

【文献】 Engineered Enzymes，Encyclopedia of life sciences，２００５年 ９月２３日，p.1-8，DOI: 10.1038/npg.els.0003896

【文献】 Database DDBJ/EMBL/GenBank [online]，Accession No. BAC41257，24-JUN-2003 uploaded，<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/BAC41257.1>，DEFFINITION: kumamolisin-As precursor [Alicyclobacillus sendaiensis], 検索日：2016年4月11日

【文献】 Database DDBJ/EMBL/GenBank [online]，Accession No. 1SIO_A，24-SEP-2008 uploaded，<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/47169143>，DEFFINITION: Chain A, Structure of kumamolisin-As complexed with a covalently-bound inhibitor, Acipf, 検索日：2016年4月11日

【文献】 Structure，２００４年 ７月，Vol.12, No.7，p.1313-1323

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ａ６１Ｋ ３８／４８

Ａ６１Ｐ １／００

Ａ６１Ｐ ３７／０８

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号４０の残基１〜３７８に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、
（ａ）ｐＨ４でＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）ペプチドを分解し；
（ｂ）配列番号４０の残基２７８に相当する残基はＳｅｒであり、配列番号４０の残基７８に相当する残基はＧｌｕであり、配列番号４０の残基８２に相当する残基はＡｓｐであり；かつ
（ｃ）配列番号６７と比較してＮ１０２Ｄのアミノ酸の変更を含む
ポリペプチド。

【請求項2】

配列番号６の残基１〜５６７に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、
（ａ）ｐＨ４でＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）ペプチドを分解し；
（ｂ）配列番号６の残基４６７に相当する残基はＳｅｒであり、配列番号６の残基２６７に相当する残基はＧｌｕであり、配列番号６の残基２７１に相当する残基はＡｓｐであり；かつ
（ｃ）配列番号３３と比較してＮ２９１Ｄのアミノ酸の変更を含む
ポリペプチド。

【請求項3】

配列番号４０の残基１〜３７８に少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項4】

配列番号６の残基１〜５６７に少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。

【請求項5】

配列番号４０の残基１〜３７８、または配列番号６の残基１〜５６７を含むポリペプチド。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。

【請求項7】

請求項６に記載の単離核酸を含む核酸発現ベクター。

【請求項8】

請求項７に記載の核酸発現ベクターを含む組換え宿主細胞。

【請求項9】

請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【請求項10】

セリアックスプルーの治療用の医薬組成物であって、セリアックスプルーを治療するために有効な量の、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。

【請求項11】

前記医薬組成物は、セリアックスプルーの治療用の医薬組成物であり、セリアックスプルーに罹患している個体に、セリアックスプルーを治療するために有効な量で投与される、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項12】

経口投与される、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、セリアックスプルー病を治療するための組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0002】

セリアックスプルーは、「グルテン」として知られている小麦、大麦、およびライ麦製品中に見出される食事タンパク質が、遺伝的素因を有する個体の小腸内において免疫応答を喚起する、非常によく見られる疾患である。該疾患から生じる炎症は、小腸の絨毛の破壊をもたらして栄養素の吸収を妨害する可能性がある。症状は、幼児期に現われることもあればそれより後に現われる場合もあり、重症度については下痢、疲労および体重減少から腹部膨満、貧血および神経症状まで広範囲に及びうる。現時点では、食事からのグルテンの完全排除を除いてこの終生にわたる疾患の有効な治療法はない。セリアックスプルーは大部分が十分に診断されないままであるが、該疾患の米国および欧州における有病率は人口の０．５〜１．０％と見積もられている。セリアック病の経口療法として適切な天然に存在する酵素を同定することは、ヒト消化管の過酷かつ酸性度の高い環境においてグルテン由来ペプチドを特異的かつ効率的に分解するための厳格な物理化学的要件ゆえに、困難である。

【図面の簡単な説明】

【0003】

【図1】セリアック病の治療における酵素治療薬の役割を示す概略図。グルテンはα‐グリアジンを含む多数の糖タンパク質で構成されている。α‐グリアジン（配列番号７１）の部分的なタンパク質分解は、炎症および疾患に結びつく可能性のあるＰＱジペプチドモチーフに富むプロテアーゼ耐性ペプチドを生じる。胃において機能し、かつ該免疫原性ペプチドを特異的に分解することができる経口酵素治療薬が加われば、この疾患の治療薬として作用する可能性がある。

【図2】ＫｕｍａＷＴおよびＫｕｍａＭａｘに関するペプチド結合部位のコンピュータ計算モデル。Ａ）ＰＲジペプチドモチーフと複合したＫｕｍａＷＴ。Ｂ）設計されたＰＱジペプチドモチーフと複合したＫｕｍａＭａｘ。活性部位内のコンピュータ計算で設計された残基にはラベルが記され、スティック表示で強調されている。モデル化されたペプチドはクマモリシン‐ＡＳ（Ｋｕｍａｍｏｌｉｓｉｎ−ＡＳ）（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｔ１Ｅ）の結合型を基にしており、最終的な構造はロゼッタ分子モデリングパッケージソフト（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｕｉｔｅ）を使用して生成された。画像はＰｙＭｏｌ ｖ１．５を使用して生成された。

【図3】ペプシンまたはトリプシンとのインキュベーション後のタンパク質の安定性について示す図。安定性は、記載されたｐＨでペプシンまたはトリプシンの存在下または非存在下において３０分間インキュベーションした後にＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル上で観察される完全なタンパク質の相対的残存率を定量化することにより測定された。タンパク質はそれぞれ３連で測定され、エラーバーは標準偏差を表わしている。定量化はＩｍａｇｅＪ（商標）で実施された。

【図4】免疫原性のα９‐グリアジンペプチドはＫｕｍａＭａｘによって分解されることを示す図。Ａ）酵素なし、ＳＣ ＰＥＰ、またはＫｕｍａＭａｘ（商標）とともに５０分間インキュベーションした後の、元のα９‐グリアジンペプチドのＭ＋Ｈイオンの存在量を測定する反応クロマトグラム。Ｂ）ＫｕｍａＭａｘ（商標）の存在下で残存しているα９‐グリアジンペプチドの比率をｐＨ４におけるインキュベーション時間の関数として示す図。データは標準的な指数関数的減衰関数を使用してフィッティングされた。Ｒ^２値は０．９より大きかった。

【発明を実施するための形態】

【0004】

発明の概要
第１の態様では、本発明は、配列番号３５のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、
（ａ）ｐＨ４でＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）ペプチドを分解し；
（ｂ）残基２７８はＳｅｒであり、残基７８はＧｌｕであり、残基８２はＡｓｐであり；かつ
（ｃ）残基７３、１０２、１０３、１０４、１３０、１６５、１６８、１６９、１７２および１７９で構成されている群から選択された１つ以上の残基において配列番号６７と比較してアミノ酸の変更を含んでなる。

【0005】

第２の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、
（ａ）ｐＨ４でＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）ペプチドを分解し；
（ｂ）残基４６７はＳｅｒであり、残基２６７はＧｌｕであり、残基２７１はＡｓｐであり；かつ
（ｃ）残基１１９、２６２、２９１、２９２、２９３、３１９、３５４、３５７、３５８、３６１および３６８で構成されている群から選択された１つ以上の残基において配列番号３３と比較してアミノ酸の変更を含んでなる。

【0006】

第１および第２の態様の様々な実施形態において、ポリペプチドは配列番号１または配列番号３５のアミノ酸配列に少なくとも８５％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含んでなる。別の実施形態では、該ポリペプチドは配列番号２〜６６のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなる。

【0007】

別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであって、配列番号３３と比較して少なくとも１つのアミノ酸の変更を含んでなるポリペプチドを提供する。別の態様では、本発明は、配列番号３５のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであって、配列番号６７と比較して少なくとも１つのアミノ酸の変更を含んでなるポリペプチドを提供する。様々な実施形態において、ポリペプチドは配列番号２〜６６のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなる。

【0008】

さらなる態様では、本発明は、本発明の任意の態様または実施形態のポリペプチドをコードする核酸を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の単離核酸を含んでなる核酸発現ベクターを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本発明の核酸発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を提供する。別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチド、核酸、核酸発現ベクターおよび組換え宿主細胞のうち少なくともいずれかと、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。

【0009】

別の態様では、本発明は、セリアックスプルーを治療するための方法であって、セリアックスプルーに罹患している個体に、本発明の任意の実施形態のポリペプチドもしくは医薬組成物、または配列番号３３もしくは配列番号６７で構成されている群から選択されたアミノ酸を含んでなるポリペプチドを、投与することを含んでなる方法を提供する。

【0010】

詳細な説明
引用された参照文献はすべて参照により全体が本願に援用される。本願においては、特に記載のない限り、利用される技術はいくつかの良く知られた参照文献、例えば：サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（Ｄ．ゴッデル（Ｄ． Ｇｏｅｄｄｅｌ）編、「酵素学実験法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９９１年、第１８５巻、米国カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ））、「タンパク質精製のガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（Ｍ．Ｐ．ドイツァー（Ｍ．Ｐ． Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ）編、「酵素学実験法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９９０年、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、「ＰＣＲプロトコール：方法および応用のガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９０年、米国カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、Ｒ．Ｉ．フレシュニー（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、「動物細胞の培養：基本技法の手引き（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」第２版、１９８７年、米国ニューヨーク州ニューヨーク、Ｌｉｓｓ社（Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．）、Ｅ．Ｊ．マレー編、「遺伝子導入および発現のプロトコール（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、ｐ．１０９−１２８、米国ニュージャージー州クリフトン、ヒューマナ出版社（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）、ならびに、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）１９９８年カタログ、米国テキサス州オースティン、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、のうち任意の文献中に見出されうる。

【0011】

本明細書中で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、複数の指示物を含む。本明細書中で使用される「および、ならびに（ａｎｄ）」は、明示的にそうでないことが定められた場合を除き、「または、もしくは（ｏｒ）」と互換的に使用される。

【0012】

本明細書中で使用されるように、アミノ酸残基は以下すなわち：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）、のように短縮される。

【0013】

本発明の任意の態様のすべての実施形態は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、組み合わせて使用されうる。
第１の態様では、本発明は、配列番号３５のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、
（ａ）ｐＨ４でＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）ペプチドを分解し；
（ｂ）残基２７８はＳｅｒであり、残基７８はＧｌｕであり、残基８２はＡｓｐであり；かつ
（ｃ）残基７３、１０２、１０３、１０４、１３０、１６５、１６８、１６９、１７２および１７９で構成されている群から選択された１つ以上の残基において配列番号６７と比較してアミノ酸の変更を含んでなる。

【0014】

以下の実施例において開示されるように、本発明のこの態様のポリペプチドは、例えばセリアックスプルーを治療するために使用することができる。該ポリペプチドは、プロセシング後の（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ）クマモリシン‐Ａｓ（配列番号６７）またはプロセシング前の（ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ）
クマモリシン‐Ａｓ（配列番号３３）のうちいずれかの改変型であって、クマモリシン‐Ａｓはセリン‐カルボキシルペプチダーゼのセドリシンファミリーに属することが知られており、その基質を加水分解するためにプロセシング後の形態において重要な触媒三残基Ｓｅｒ^２７８‐Ｇｌｕ^７８‐Ａｓｐ^８２（プロセシング前の形態ではＳｅｒ^４６７‐Ｇｌｕ^２６７‐Ａｓｐ^２７１）を用いる。その最大活性はｐＨ〜４．０にある。クマモリシン‐Ａｓの天然基質は未知であるが、酸性条件下でコラーゲンを分解することが過去に示されている（４）。加えて、この酵素は、熱に安定であって、理想的な温度は６０℃であるが３７℃でもなおかなりの活性を呈することが示されている。

【0015】

本発明の発明者らは、クマモリシン‐Ａｓが、ほとんどのセリアックスプルー患者において免疫応答の主体を担っていると考えられている「グリアジン」として知られるグルテンのプロリン（Ｐ）およびグルタミン（Ｑ）に富んだ成分を分解することができることを、思いがけず発見した。本発明のポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較して、オリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（グリアジンを代表する基質）に対してｐＨ４において高いプロテアーゼ活性を示す。

【0016】

本発明のこの態様のポリペプチドはｐＨ４においてＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）ペプチドを分解する。そのような分解は以下の実施例において開示される条件下で生じる。
この態様のポリペプチドは、残基７３、１０２、１０３、１０４、１３０、１６５、１６８、１６９、１７２および１７９（番号付けは野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列に基づいている）で構成されている群から選択された１つ以上の残基において配列番号６７（野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓ）と比較して１つ以上のアミノ酸の変更を含んでなる。非限定的実施形態において、野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列（配列番号６７）と比較して１つ以上の変更は、以下すなわち：

【0017】

【表1】

で構成されている群から選択される。

【0018】

様々なさらなる非限定的実施形態では、野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＮ１０２Ｄを含む。別の実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＮ１０２ＤおよびＤ１６９ＮまたはＤ１６９Ｇを含む。別の実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＮ１０２Ｄ、Ｄ１６９Ｇ、およびＤ１７９Ｈを含む。別の実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＳ７３Ｋ、Ｄ１０４Ｔ、Ｎ１０２Ｄ、Ｇ１３０Ｓ、Ｄ１６９Ｇ、およびＤ１７９Ｈを含む。

【0019】

本明細書中で使用されるように、「少なくとも７５％同一」とは、そのポリペプチドが、その完全長アミノ酸配列において、配列番号３５によって定義されたポリペプチドと比較して差異（任意のアミノ酸置換、欠失、付加、または挿入を含む）が２５％以下であることを意味する。

【0020】

様々な好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列に少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。さらなる実施形態では、ポリペプチドは配列番号３５のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。

【0021】

様々なさらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３６〜６６のうちいずれか１つに少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。これらの配列番号で表わされるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）（グリアジンを代表する基質）に対してｐＨ４において高いプロテアーゼ活性を備えたポリペプチドの具体例である。様々な好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３６〜６６のうちいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６〜６６のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。

【0022】

この第１の態様の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１（プロセシング前のクマモリシン‐Ａｓのバリアントに基づいている）のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含んでなり、
（ａ）ｐＨ４でＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）ペプチドを分解し；
（ｂ）残基４６７はＳｅｒであり、残基２６７はＧｌｕであり、残基２７１はＡｓｐであり；かつ
（ｃ）残基１１９、２６２、２９１、２９２、２９３、３１９、３５４、３５７、３５８、３６１、および３６８で構成されている群から選択された１つ以上の残基において配列番号３３と比較してアミノ酸の変更を含んでなる。

【0023】

この実施形態のポリペプチドは、残基１１９、２６２、２９１、２９２、２９３、３１９、３５４、３５７、３５８、３６１、および３６８（番号付けは野生型のプロセシング前のクマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列に基づいている）で構成されている群から選択された１つ以上の残基において配列番号３３（野生型のプロセシング前のクマモリシン‐Ａｓ）と比較して１つ以上のアミノ酸の変更を含んでなる。非限定的実施形態において、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、以下すなわち：

【0024】

【表2】

で構成されている群から選択される。

【0025】

様々なさらなる非限定的実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＮ２９１Ｄを含む。別の実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＮ２９１Ｄおよび３５８Ｎまたは３５８Ｇを含む。別の実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＮ２９１Ｄ、３５８Ｇ、および３６８Ｈを含む。別の実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＶ１１９Ｄ、Ｓ２６２Ｋ、Ｄ２９３Ｔ、Ｎ２９１Ｄ、Ｇ３１９Ｓ、Ｄ３５８Ｇ、およびＤ３６８Ｈを含む。

【0026】

本明細書中で使用されるように、「少なくとも７５％同一」とは、そのポリペプチドが、その完全長アミノ酸配列において、配列番号１によって定義されたポリペプチドと比較して差異（任意のアミノ酸置換、欠失、付加、または挿入を含む）が２５％以下であることを意味する。

【0027】

様々な好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。さらなる実施形態では、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。

【0028】

様々なさらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２〜３２のうちいずれか１つに少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。これらの配列番号で表わされるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）（グリアジンを代表する基質）に対してｐＨ４において高いプロテアーゼ活性を備えたポリペプチドの具体例である。様々な好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２〜３２のうちいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２〜３２のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。

【0029】

第２の態様では、本発明は、配列番号３５のアミノ酸配列を含んでなるかまたは該アミノ酸配列で構成されているポリペプチドであって、配列番号６７と比較して少なくとも１つのアミノ酸の変更を含んでなるポリペプチドを提供する。以下の実施例において開示されるように、本発明のこの態様のポリペプチドは、例えばセリアックスプルーを治療するために使用することができる。該ポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）（グリアジンを代表する基質）に対してｐＨ４において高いプロテアーゼ活性を示す、プロセシング後のクマモリシン‐Ａｓ（配列番号６７）の改変型である。１つの実施形態では、ポリペプチドは配列番号３６のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。配列番号３６のポリペプチドは野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓと比較してＮ１０２Ｄ変異を有する。以下の実施例において示されるように、この変異を含んでいるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において少なくとも１０倍高いプロテアーゼ活性を有する。

【0030】

この第２の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは配列番号３７のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。配列番号３７のポリペプチドは、野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓと比較してＮ１０２Ｄ変異およびＤ１６９ＮまたはＤ１６９Ｇ変異を有する。以下の実施例において示されるように、この変異を含んでいるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において少なくとも２０倍高いプロテアーゼ活性を有する。

【0031】

この第２の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは配列番号３８のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。配列番号３８のポリペプチドは、野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓと比較してＮ１０２Ｄ変異、Ｄ１６９Ｇ、およびＤ１７９Ｈ変異を有する。以下の実施例において示されるように、この変異を含んでいるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において少なくとも５０倍高いプロテアーゼ活性を有する。

【0032】

この第２の態様のさらなる実施形態では、ポリペプチドは配列番号３９〜６６のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。これらの実施形態のポリペプチドはすべて、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において高いプロテアーゼ活性を示すことが実証されている。好ましい実施形態では、ポリペプチドは配列番号６６のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。

【0033】

この第２の態様の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成されるポリペプチドであって、配列番号３３と比較して少なくとも１つのアミノ酸の変更を含んでなるポリペプチドを提供する。以下の実施例において開示されるように、本発明のこの態様のポリペプチドは、例えばセリアックスプルーを治療するために使用することができる。該ポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）（グリアジンを代表する基質）に対してｐＨ４において高いプロテアーゼ活性を示す、プロセシング前のクマモリシン‐Ａｓ（配列番号３３）の改変型である。１つの実施形態では、該ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。配列番号２のポリペプチドはプロセシング前の野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してＮ２９１Ｄ変異を有する。以下の実施例において示されるように、この変異を含んでいるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において少なくとも１０倍高いプロテアーゼ活性を有する。

【0034】

この第２の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。配列番号３のポリペプチドは、プロセシング前の野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してＮ２９１Ｄ変異およびＤ３５８ＮまたはＤ３５８Ｇ変異を有する。以下の実施例において示されるように、この変異を含んでいるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において少なくとも２０倍高いプロテアーゼ活性を有する。

【0035】

この第２の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。配列番号４のポリペプチドは、プロセシング前の野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してＮ２９１Ｄ変異、Ｄ３５８Ｇ、およびＤ３６８Ｈ変異を有する。以下の実施例において示されるように、この変異を含んでいるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において少なくとも５０倍高いプロテアーゼ活性を有する。

【0036】

この第２の態様のさらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５〜３２のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。これらの実施形態のポリペプチドはすべて、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において高いプロテアーゼ活性を示すことが実証されている。好ましい実施形態では、ポリペプチドは配列番号３２のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成され；このポリペプチドは、試験されたポリペプチドの中で、オリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において最も強力なプロテアーゼ活性を有することが以下の実施例において示される。

【0037】

本願の全体にわたって使用されるように、用語「ポリペプチド」は、天然に存在するものであれ合成起源のものであれ、サブユニットであるアミノ酸の配列物を指す該用語の最も広い意味で使用される。本発明のポリペプチドは、Ｌ‐アミノ酸、Ｄ‐アミノ酸（ｉｎ
ｖｉｖｏのＬ‐アミノ酸特異的プロテアーゼに対して抵抗性である）、またはＤ‐アミノ酸およびＬ‐アミノ酸の組み合わせを含んでなることができる。本明細書中に記載されたポリペプチドは化学合成されてもよいし、組換え発現されてもよい。該ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期延長を促進するために、ＰＥＧ化、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）、またはグリコシル化などによって他の化合物に連結されてもよい。そのような連結は、当業者には理解されるように、共有結合であってもよいし、非共有結合であってもよい。ポリペプチドは、任意の他の適切なリンカー、例えば、限定するものではないが精製または検出のために使用可能な任意のリンカー（例えばＦＬＡＧタグまたはＨｉｓタグなど）に連結されてもよい。

【0038】

第３の態様では、本発明は、本発明の任意の態様または実施形態のポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。該単離核酸配列はＲＮＡまたはＤＮＡを含んでなることができる。本明細書中で使用されるように、「単離核酸」とは、ゲノム配列中またはｃＤＮＡ配列中において正常時にその周囲にある核酸配列から取り出されている核酸である。そのような単離核酸配列は、コードされたタンパク質の発現および精製のうち少なくともいずれか一方を容易にするのに有用な追加の配列、例えば、限定するものではないが、ｐｏｌｙＡ配列、修飾コザック配列、ならびに、エピトープタグ、移出シグナル、および分泌シグナル、核局在シグナル、および原形質膜局在シグナルをコードする配列、を含んでなることができる。本明細書中の教示に基づけば、どの核酸配列が本発明のポリペプチドをコードすることになるかは当業者には明白であろう。

【0039】

第４の態様では、本発明は、適切な制御配列に作動可能なように連結された本発明の任意の実施形態の単離核酸を含んでなる核酸発現ベクター（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）を提供する。「組換え発現ベクター（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」には、核酸コード領域または遺伝子を該遺伝子産物の発現を達成することができる任意の制御配列に作動可能なように連結するベクターが含まれる。本発明の核酸配列に作動可能なように連結される「制御配列」は、核酸分子の発現を達成することができる核酸配列である。制御配列は、該制御配列が核酸配列の発現を導くように機能する限り、該核酸配列に隣接している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列がプロモータ配列と核酸配列との間に存在することが可能であり、その場合も該プロモータ配列はコード配列に「作動可能なように連結された」とみなすことができる。他のそのような制御配列には、限定するものではないが、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、およびリボソーム結合部位が挙げられる。そのような発現ベクターは当分野において既知の任意の種類のものであってよく、例えば、限定するものではないが、プラスミドおよびウイルス系の発現ベクターが挙げられる。開示された核酸配列の発現を哺乳類の系において駆動するために使用される制御配列は、構成的（様々なプロモータのうち任意のもの、例えば、限定するものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦプロモータによって駆動される）であってもよいし、誘導型（例えばいくつかの誘導プロモータのうち任意のもの、例えば、限定するものではないが、テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性のプロモータによって駆動される）であってもよい。原核細胞のトランスフェクションに使用される発現ベクターの構築も当分野においてよく知られており、よって標準的技法により達成可能である。（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、「分子クローニング、実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｅ．Ｊ．マレー（Ｍｕｒｒａｙ）編、「遺伝子導入および発現のプロトコール（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、ｐ．１０９−１２８、米国ニュージャージー州クリフトン、ヒューマナ出版社（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）、ならびに、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）１９９８年カタログ、米国テキサス州オースティン、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）を参照されたい）。発現ベクターは、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡへの組込みにより、宿主生物体内において複製可能でなければならない。好ましい実施形態では、発現ベクターはプラスミドを含んでなる。しかしながら、本発明は、ウイルスベクターのような同等の機能を果たす他の発現ベクターを含むことも意図されている。

【0040】

第５の態様では、本発明は、本発明の核酸発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を提供する。該宿主細胞は原核生物であってもよいし真核生物であってもよい。細胞は、一過性にトランスフェクションまたは形質導入されてもよいし、安定的にトランスフェクションまたは形質導入されてもよい。原核細胞および真核細胞への発現ベクターのそのようなトランスフェクションおよび形質導入は、当分野で既知の任意の技法、例えば、限定するものではないが、標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、またはリポソーム介在型、ＤＥＡＥデキストラン介在型、ポリカチオン介在型、もしくはウイルス介在型のトランスフェクションによって行うことができる。（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング、実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｒ．Ｉ．フレシュニー（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、「動物細胞の培養：基本技法の手引き（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」第２版、１９８７年、米国ニューヨーク州ニューヨーク、Ｌｉｓｓ社（Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．）を参照されたい）。本発明のポリペプチドを生産する方法は本発明の補足部分である。
該方法は、（ａ）本発明のこの態様の宿主を該ポリペプチドの発現の助けになる条件下で培養するステップと、（ｂ）任意選択で、発現されたポリペプチドを回収するステップとを含んでなる。発現されたポリペプチドは、無細胞抽出物、細胞ペレットから回収されてもよいし、培地から回収されてもよい。組換え発現されたポリペプチドを精製する方法は当業者にはよく知られている。

【0041】

第６の態様では、本発明は、本発明の任意の態様または実施形態のポリペプチド、核酸、核酸発現ベクター、および組換え宿主細胞のうちの少なくとも１つと、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、例えば、下記に記載された本発明の方法において使用されうる。該医薬組成物は、本発明のポリペプチド、核酸などに加えて、（ａ）リオプロテクタント；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）増量剤；（ｄ）等張化剤；（ｅ）安定化剤；（ｆ）防腐剤および（ｇ）バッファーのうちの少なくともいずれか１つを含んでなることができる。

【0042】

いくつかの実施形態では、医薬組成物中のバッファーは、トリスバッファー、ヒスチジンバッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファーまたは酢酸バッファーである。医薬組成物は、リオプロテクタント、例えばスクロース、ソルビトールまたはトレハロースを含むこともできる。ある実施形態では、医薬組成物は、防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロルヘキシジン（ｃｈｌｏｒｏｈｅｘｉｄｉｎｅ）、フェノール、ｍ‐クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ‐クレゾール、ｐ‐クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、およびこれらの様々な混合物を含む。他の実施形態では、該医薬組成物は、グリシンのような増量剤を含む。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、界面活性剤、例えばポリソルベート‐２０、ポリソルベート‐４０、ポリソルベート‐６０、ポリソルベート‐６５、ポリソルベート‐８０ ポリソルベート‐８５、ポロキサマー‐１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミタート、ソルビタンモノステアラート、ソルビタンモノオレアート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアラート、ソルビタントリオレアート（ｓｏｒｂｉｔａｎ ｔｒｉｏｌｅａｓｔｅ）、またはこれらの組み合わせを含む。医薬組成物はさらに、等張化剤、例えば調合物をヒト血液とほぼ等張または等浸透圧にする化合物も含むことができる。典型的な等張化剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよび塩酸アルギニンが挙げられる。他の実施形態では、医薬組成物はさらに、安定化剤、例えば、対象とするタンパク質と組み合わされたときに、凍結乾燥形態または液体形態における該対象タンパク質の化学的および／または物理学的不安定性を実質的に防止または低減する分子を含む。典型的な安定化剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニンおよび塩酸アルギニンが挙げられる。

【0043】

本発明のポリペプチド、核酸などは医薬組成物中の唯一の活性作用薬であってもよいし、または該組成物が用途に適した１つ以上の他の活性作用薬をさらに含んでなることもできる。

【0044】

本明細書中に記載された医薬組成物は一般に、本明細書中に記載された化合物と薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤との組み合わせを含んでなる。そのような組成物は、薬学的に許容不可能な成分をほとんど含まない、すなわち、本願の出願時点での米国の規制上の要件によって許容されるよりも低い量の薬学的に許容不可能な成分しか含んでいない。この態様のいくつかの実施形態では、化合物が水に溶解または懸濁される場合、組成物はさらに任意選択で追加の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含んでなる。他の実施形態では、本明細書中に記載された医薬組成物は固体の医薬組成物（例えば錠剤、カプセル剤など）である。

【0045】

これらの組成物は製薬分野においてよく知られた方式で調製可能であり、かつ任意の適切な経路によって投与されうる。好ましい実施形態では、医薬組成物および製剤は経口投与のために設計される。従来の製薬用の担体、水性、粉末もしくは油性の基材、増粘剤などが、必要であるかまたは望ましい場合もある。

【0046】

医薬組成物は、任意の適切な形態、例えば、限定するものではないが錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液、シロップ剤、エアロゾル剤（固体として、または液体媒体に含めて）、軟膏剤であって例えば重量比で最大１０％の活性化合物を含有するもの、軟ゼラチンカプセルおよび硬ゼラチンカプセル、無菌注射用溶液、ならびに無菌包装された散剤であってよい。

【0047】

第７の態様では、本発明は、セリアックスプルーを治療する方法であって、セリアックスプルーに罹患している個体に、セリアックスプルーを治療するのに有効な量の、本発明の第１または第２の態様のポリペプチド、配列番号３３のポリペプチド、および配列番号６７のポリペプチドで構成されている群から選択された１つ以上のポリペプチドを投与することを含んでなる方法を提供する。

【0048】

本発明の発明者らは、クマモリシン‐Ａｓが、ほとんどのセリアックスプルー患者において免疫応答の主体を担っていると考えられている「グリアジン」として知られるグルテンのプロリン（Ｐ）およびグルタミン（Ｑ）に富んだ成分を分解することができることを、思いがけず発見した。本発明のポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較して、オリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）（グリアジンを代表する基質）に対してｐＨ４において高いプロテアーゼ活性を示す。

【0049】

１つの実施形態では、１つ以上のポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列に少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含んでなり、
（ａ）該ポリペプチドはｐＨ４でＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）ペプチドを分解し；
（ｂ）残基２７８はＳｅｒであり、残基７８はＧｌｕであり、残基８２はＡｓｐである。

【0050】

さらなる実施形態において、１つ以上のポリペプチドは、残基７３、１０２、１０３、１０４、１３０、１６５、１６８、１６９、１７２および１７９（番号付けは野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列に基づいている）で構成されている群から選択された１つ以上の残基において配列番号６７（野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓ）と比較して１つ以上のアミノ酸の変更を含んでなる。非限定的実施形態において、野生型のプロセシング後の クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列（配列番号６７）と比較して１つ以上の変更は、以下すなわち：

【0051】

【表3】

で構成されている群から選択される。

【0052】

様々なさらなる非限定的実施形態では、野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＮ１０２Ｄを含む。別の実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＮ１０２ＤおよびＤ１６９ＮまたはＤ１６９Ｇを含む。別の実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＮ１０２Ｄ、Ｄ１６９Ｇ、およびＤ１７９Ｈを含む。別の実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＳ７３Ｋ、Ｄ１０４Ｔ、Ｎ１０２Ｄ、Ｇ１３０Ｓ、Ｄ１６９Ｇ、およびＤ１７９Ｈを含む。

【0053】

様々な好ましい実施形態において、１つ以上のポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。さらなる実施形態では、ポリペプチドは配列番号３５のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。

【0054】

様々なさらなる実施形態において、１つ以上のポリペプチドは、配列番号３６〜６６のうちいずれか１つに少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。これらの配列番号で表わされるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）（グリアジンを代表する基質）に対してｐＨ４において高いプロテアーゼ活性を備えたポリペプチドの具体例である。様々な好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３６〜６６のうちいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３６〜６６のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。

【0055】

好ましい実施形態において、本発明のこの態様の方法で使用されるポリペプチドは、配列番号３３のアミノ酸を含んでなるか、または残基１１９、２６２、２９１、２９２、２９３、３１９、３５４、３５７、３５８、３６１、および３６８（番号付けは野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列に基づいている）で構成されている群から選択された１つ以上の残基において配列番号３３（野生型のプロセシング前のクマモリシン‐Ａｓ）と比較
して１つ以上のアミノ酸の変更を含んでなるポリペプチドを含んでなる。非限定的実施形態において、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、以下すなわち：

【0056】

【表4】

で構成されている群から選択される。

【0057】

様々なさらなる好ましい非限定的実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＮ２９１Ｄを含む。別の実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＮ２９１Ｄおよび３５８Ｎまたは３５８Ｇを含む。別の実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＮ２９１Ｄ、３５８Ｇ、および３６８Ｈを含む。別の実施形態では、野生型クマモリシン‐Ａｓアミノ酸配列と比較して１つ以上の変更は、少なくともＶ１１９Ｄ、Ｓ２６２Ｋ、Ｄ２９３Ｔ、Ｎ２９１Ｄ、Ｇ３１９Ｓ、Ｄ３５８Ｇ、およびＤ３６８Ｈを含む。

【0058】

様々な好ましい実施形態において、本発明のこの態様の方法で使用されるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。さらなる実施形態では、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。

【0059】

様々なさらなる実施形態において、本発明のこの態様の方法で使用されるポリペプチドは、配列番号２〜３２のうちいずれか１つに少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。これらの配列番号で表わされるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）（グリアジンを代表する基質）に対してｐＨ４において高いプロテアーゼ活性を備えたポリペプチドの具体例である。様々な好ましい実施形態において、本発明のこの態様の方法で使用されるポリペプチドは、配列番号２〜３２のうちいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２〜３２のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。

【0060】

第８の態様では、本発明は、セリアックスプルーを治療する方法であって、セリアックスプルーに罹患している個体に、セリアックスプルーを治療するために有効な量の配列番号１〜６７のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを投与することを含んでなる方法を提供する。

【0061】

１つの実施形態では、投与されるポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。配列番号２のポリペプチドは野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してＮ２９１Ｄ変異を有する。以下の実施例において示されるように、この変異を含んでいるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において少なくとも１０倍高いプロテアーゼ活性を有する。

【0062】

この第２の態様の別の実施形態では、投与されるポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。配列番号３のポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してＮ２９１Ｄ変異およびＤ３５８ＮまたはＤ３５８Ｇ変異を有する。以下の実施例において示されるように、この変異を含んでいるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において少なくとも２０倍高いプロテアーゼ活性を有する。

【0063】

この第２の態様の別の実施形態では、投与されるポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。配列番号４のポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してＮ２９１Ｄ変異、Ｄ３５８Ｇ、およびＤ３６８Ｈ変異を有する。以下の実施例において示されるように、この変異を含んでいるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において少なくとも５０倍高いプロテアーゼ活性を有する。

【0064】

この第２の態様のさらなる実施形態では、投与されるポリペプチドは配列番号５〜３２のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。これらの実施形態のポリペプチドはすべて、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において高いプロテアーゼ活性を示すことが実証されている。好ましい実施形態では、投与されるポリペプチドは配列番号３２のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成され；このポリペプチドは、試験されたポリペプチドの中で、オリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において最も強力なプロテアーゼ活性を有することが以下の実施例において示される。

【0065】

別の実施形態では、１つ以上のポリペプチドは配列番号３６のアミノ酸配列を含んでなる。配列番号３６のポリペプチドは野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓと比較してＮ１０２Ｄ変異を有する。以下の実施例において示されるように、この変異を含んでいるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において少なくとも１０倍高いプロテアーゼ活性を有する。別の実施形態では、１つ以上のポリペプチドは配列番号３７のアミノ酸配列を含んでなる。配列番号３７のポリペプチドは、野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓと比較してＮ１０２Ｄ変異およびＤ１６９ＮまたはＤ１６９Ｇ変異を有する。以下の実施例において示されるように、この変異を含んでいるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において少なくとも２０倍高いプロテアーゼ活性を有する。別の実施形態では、１つ以上のポリペプチドは配列番号３８のアミノ酸配列を含んでなる。配列番号３８のポリペプチドは野生型のプロセシング後のクマモリシン‐Ａｓと比較してＮ１０２Ｄ変異、Ｄ１６９Ｇ、および
Ｄ１７９Ｈ変異を有する。以下の実施例において示されるように、この変異を含んでいるポリペプチドは、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において少なくとも５０倍高いプロテアーゼ活性を有する。さらなる実施形態では、１つ以上のポリペプチドは配列番号３９〜６６のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含んでなる。これらの実施形態のポリペプチドはすべて、野生型クマモリシン‐Ａｓと比較してオリゴペプチドＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）に対してｐＨ４において高いプロテアーゼ活性を示すことが実証されている。好ましい実施形態では、ポリペプチドは配列番号６６のアミノ酸配列を含んでなるか、または該アミノ酸配列で構成される。

【0066】

セリアックスプルー（セリアック病またはグルテン不耐症としても知られている）は、「グルテン」として知られている小麦、大麦、およびライ麦製品中に見出される食事タンパク質が、遺伝的素因を有する個体の小腸内において免疫応答を喚起する、非常によく見られる疾患である。該疾患から生じる炎症は、小腸の絨毛の破壊をもたらして栄養素の吸収を妨害する可能性がある。症状は、幼児期に現われることもあればそれより後に現われる場合もあり、重症度については下痢、疲労、体重減量、腹痛、腫脹、ガス過多、消化障害、便秘、腹部膨満、悪心／嘔吐、貧血、紫斑の易形成（ｂｒｕｉｓｉｎｇ ｅａｓｉｌｙ）、抑うつ、不安、小児期の成長遅延、毛髪脱落、皮膚炎、月経停止、口腔内潰瘍、筋痙攣、関節痛、鼻出血、てんかん発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）、手足の刺痛またはしびれ、思春期遅発症、歯牙エナメル質の欠損症、および運動失調または感覚異常のような神経症状まで広範囲に及びうる。現時点では、食事からのグルテンの完全排除を除いてこの終生にわたる疾患の有効な治療法はない。セリアックスプルーは大部分が十分に診断されないままであるが、該疾患の米国および欧州における有病率は人口の０．５〜１．０％と見積もられている。

【0067】

本明細書中で使用されるように、「セリアックスプルーを治療する」とは下記すなわち：（ａ）セリアックスプルーの重症度を低減すること；（ｂ）セリアックスプルーに特徴的な症状の発現を制限または防止すること；（ｃ）セリアックスプルーに特徴的な症状の悪化を抑制すること；（ｄ）かつてセリアックスプルーに罹患していた患者においてセリアックスプルーの再発を制限または防止すること；（ｅ）かつてセリアックスプルーの症状を有していた患者において症状の再発を制限または防止すること；および（ｆ）セリアックスプルーを発症するリスクを有しているが未だセリアックスプルーの臨床的作用を示していない対象者において、セリアックスプルーの発症を制限すること、のうち１つ以上を遂行することを意味する。

【0068】

本発明の方法に従って治療される個体は、セリアックスプルーに罹患している任意の個体、例えばヒト対象者であってよい。該個体は、すでに症状を発症している個体であってもよいし、無症状の個体であってもよい。

【0069】

本明細書中で使用されるように、「有効な量」とはセリアックスプルーの治療を行うのに有効なポリペプチドの量を指す。ポリペプチドは、典型的には上記に開示されたもののような医薬組成物として製剤化され、かつ、従来の薬学的に許容可能な担体、アジュバント、およびビヒクルを含有する投与量単位製剤に含めて任意の適切な経路を介して、例えば、経口的に、非経口的に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）、吸入噴霧により、または局所的に、投与可能である。好ましい実施形態では、医薬組成物および製剤は、例えば錠剤、丸剤、ロゼンジ、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液、またはシロップ剤などによって、経口投与される。

【0070】

投薬レジメンは最適な所望の応答（例えば治療的または予防的応答）を提供するために調節可能である。適切な投薬量域は、例えば体重１ｋｇあたり０．１ｕｇ〜１００ｍｇと
なりうるが；別例として、適切な投薬量域は体重１ｋｇあたり０．５ｕｇ〜５０ｍｇ；１ｕｇ〜２５ｍｇ、または５ｕｇ〜１０ｍｇであってもよい。ポリペプチドは単回ボーラス投与で送達されることも可能であるし、主治医の決定により２回以上（例えば２、３、４、５回またはそれ以上）投与されてもよい。

【0071】

実施例
セリアック病は、人口のおよそ１％が罹患する自己免疫疾患である^１，２。この疾患は、小麦粉中の主要タンパク質であるグルテン、ならびに大麦およびライ麦中の関連タンパク質に対する炎症反応を特徴とする^２。グルテンは、糖タンパク質であるグリアジンおよびグルテニンの不均質な混合物で構成されている^３。摂取されると、α‐グリアジンは胃および腸のプロテアーゼによって部分的に分解されてオリゴペプチドとなるが、該オリゴペプチドはその並外れて高いプロリンおよびグルタミンの含量が原因でそれ以上のタンパク質分解に抵抗性を有する^３（図１）。不完全なタンパク質分解から生じる、セリアック病の人々の腸内で炎症および損傷を刺激する免疫原性のオリゴペプチドは、ＰＱモチーフに富んでいる^４，５（図１）。現在、この疾患の唯一の治療は食事からグルテンを完全に排除することであるが、これは、現代の食物製品中にこのタンパク質が遍在するため為し遂げることは困難である^６。

【0072】

免疫原性ペプチドが炎症を引き起こす能力を有する前に該ペプチドを加水分解するために経口投与型プロテアーゼが使用される、経口酵素療法（ＯＥＴ、ｏｒａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈｅｒａｐｙ）について、現在、グルテン不耐症の治療法としての探求がなされている。この目的のため、いくつかの異なるプロテアーゼは、該プロテアーゼがプロリンまたはグルタミン残基のいずれかの後ろを切断する特異性ゆえに検討されてきた^{４，７−９}。しかしながらこれらの酵素は、グルテンを分解するためのＯＥＴにおいて該酵素を使用する妨げとなる特徴を示すことが多い。これらのペプチダーゼのほとんどは中性のｐＨで最適な触媒活性を示すが；ヒトの胃のｐＨは２〜４の範囲にある。したがってこれらの酵素はｐＨが中性の小腸に達したときに最も活性が高いが、これではセリアック病の有効な予防には間に合わない。というのも小腸はグルテンに由来する病理が発症する部位であるからである^２，１０。加えて、これらの酵素のうちいくつかはヒトの胃の低いｐＨにおける不安定性を示すか、消化プロテアーゼによるタンパク質分解を受けやすいか、または該酵素の精製時に大規模なリフォールディング手順を必要とし^７，１１、これらはいずれも臨床的に使用するための努力の妨げとなる特徴である。

【0073】

グルテン不耐症の治療におけるＯＥＴの適用のための理想的なプロテアーゼは、次の特性すなわち：低ｐＨにおいて最適活性であること、精製が容易であること、ヒトの胃の条件下で安定であること、およびグルテン由来の免疫原性オリゴペプチドに見出されるアミノ酸モチーフに対して特異性が高いこと、を兼ね備えることになろう。ここで本発明者らは、これらの特性を示すエンドペプチダーゼの工学的設計について報告する。本発明者らは、好酸性細菌アリシクロバチルス・センダイエンシス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｎｄａｉｅｎｓｉｓ）から酸性条件において活性の高いプロテアーゼ、クマモリシン‐Ａｓ（ＫｕｍａＷＴ）を同定し、該プロテアーゼを所望のオリゴペプチド特異性に向けて工学的に設計するためにコンピュータ計算によるモデリング手法を使用した。コンピュータ計算により設計された、ＫｕｍａＭａｘ（商標）と呼ばれる酵素は、野生型のＫｕｍａＷＴと比較して、１００倍を超える高いタンパク質分解活性を示し、また標的のＰＱモチーフに対する基質特異性においては８００倍の変化を示した。加えて、ＫｕｍａＭａｘ（商標）は、通常の胃内プロテアーゼに対する抵抗性を示し、かつリフォールディングの必要を伴わずに大腸菌にて高収率で生産される。したがって、このプロテアーゼおよび本明細書中で報告されるその他のプロテアーゼは、セリアック病の有望な治療薬候補に相当する。

【0074】

結果
α‐グリアジンエンドペプチダーゼの選択およびコンピュータ計算による設計
胃内の条件下でグルテンペプチドを分解することができる新規なプロテアーゼを工学的に設計するために、本発明者らは最初に、我々の工学的設計努力の出発点として適切なプロテアーゼを同定することに焦点を置いた。理想的には、この鋳型プロテアーゼは低いｐＨにおいて安定性および活性を兼ね備えたうえでジペプチドアミノ酸モチーフに対する特異性も実証されるものとなろう。本発明者らは、酵素クマモリシン‐Ａｓ（ＫｕｍａＷＴ）を鋳型として同定したが、これはこのプロテアーゼが元来ｐＨ範囲２〜４にわたって最適活性を有するからであり^１２、このｐＨ範囲は食事が摂取される前後のヒト胃内のおよそのｐＨ範囲（それぞれｐＨ２および４）と一致している^１３。ＫｕｍａＷＴはさらに、生理学的に妥当な温度３７℃において高い安定性および活性を示す^１４。加えて、この酵素の精製は容易であって大腸菌における標準的な組換えタンパク質生産方法を使用してかなりの収量を生じ^１４、このことは突然変異体ライブラリのスクリーニングにとっても、またＯＥＴで使用するための大規模バッチにおける最終的な生成にとっても重要な特性である。最後に、ＫｕｍａＷＴは元来、単一アミノ酸特異性とは対照的に特定のジペプチドモチーフを認識する^１４。これは消化時に摂取される必要のある経口プロテアーゼ治療薬にとって重要な特性である、というのも、ジペプチド特異性は胃の中の他の食物由来ペプチドによる競合的阻害の低減をもたらすはずであるからである。

【0075】

セリアック病のための有効なＯＥＴは、免疫原性のグルテン由来オリゴペプチド中にプロリン‐グルタミン（ＰＱ）ジペプチドが高頻度で出現することから（図１）、恐らくはこのジペプチドに対する特異性を示すことになろう。ＫｕｍａＷＴはそのペプチド基質のＰ２位のプロリンに対して強い特異性を有するが、該プロリンは免疫原性のα‐グリアジンペプチドの分解に関して対象となるアミノ酸残基のうちの１つと一致している。Ｐ１の部位では、ＫｕｍａＷＴは正に荷電したアミノ酸であるアルギニンまたはリジンを選好することが立証されている^１４。このような選好性にもかかわらず、ＫｕｍａＷＴは、アルギニンまたはリジンの認識と比較して著しく低いレベルとはいえ、Ｐ１位のグルタミンを認識することも可能である^１４。Ｐ１位のグルタミンを認識するというこの軽微な固有の傾向は、ＫｕｍａＷＴがこの部位のグルタミンを選好するための工学的再設計に適している可能性を示唆している。Ｐ１’の部位ではＫｕｍａＷＴは広範な特異性を示すが、これは、図１に示されるようにＰＱモチーフの後ろの部位の残基が免疫原性ペプチドによって様々であるので望ましいことである。

【0076】

ＫｕｍａＷＴのこれらの特徴を前提として、本発明者らの第１の目的は、ＫｕｍａＷＴのＳ１結合ポケットが本来のＰＲまたはＰＫ基質よりもＰＱジペプチドモチーフを選好するように、該ポケットをコンピュータ計算により再設計することであった。ロゼッタ分子モデリングパッケージソフトを使用して、本発明者らは、ＫｕｍａＷＴのＳ１結合ポケット内のＰＲジペプチドを、この酵素の解析済み結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｔ１Ｅ）を用いてモデル化した。その結果、２つの負に荷電したアミノ酸Ｄ３５８およびＤ３６８がＰ１位の正に荷電したアミノ酸の結合を促進する可能性が高いことが明らかとなった（図２Ａ）。Ｐ２のプロリンに対する元来の特異性は、このアミノ酸残基と酵素のＳ２ポケット内のＷ３１８の芳香環との疎水的相互作用に主に由来するようである。Ｐ１位はプロリンに関して特異的であることが本発明者らの酵素バリアントにおいては望ましいので、本発明者らはＳ１ポケットの設計の際にこの天然のトリプトファンを維持した。

【0077】

Ｓ１ポケットがＰ１位にグルタミンを選好するＫｕｍａＷＴ基質特異性を再設計するために、本発明者らは、ロゼッタ分子モデリングパッケージソフトに対してＦｏｌｄｉｔインタフェースを使用してＫｕｍａＷＴ結合ポケット内の理論上の突然変異を生成した。α‐グリアジン全体にわたって見出される共通の免疫原性モチーフに相当するテトラペプチド、ＰＱＬＰ（配列番号６８）がＰ２〜Ｐ２’活性部位の位置へとモデル化された。この
構造は既に活性部位に結合したポリペプチドを包含しており、よってこのポリペプチドの残基がロゼッタを使用してＰＱＬＰ（配列番号６８）テトラペプチドモチーフへと変異せしめられた。該テトラペプチドの０．８ｎｍ（８Å）半径以内の合計７５個の残基が、Ｓ１ポケット内でのグルタミンの結合を促進する突然変異を見出すために、天然に存在する２０種のアミノ酸のうちいずれかへと無作為化された。これらの突然変異は、新たな酵素‐ＰＱＬＰ基質複合体の全体エネルギーが天然基質と比較して低減されるか、または５ロゼッタエネルギー単位を越えて増加しなかった場合に、許容された。より小さな中性アミノ酸であるグルタミンを受け入れるために、本発明者らは我々のコンピュータ計算による取り組みを、１）設計過程においてＳ１ポケットの負電荷を除去すること、２）大きなアミノ酸であるアルギニンのグルタミンへの置換から生じた空間を埋めること、および３）グルタミンのアミド官能基に水素結合を供給すること、に注力した。このコンピュータ計算によるモデル化から、１〜７個の同時突然変異を含有する１０７個の新規設計物が得られた。これらの設計タンパク質はその後構築されて、ＰＱＬＰ（配列番号６８）ペプチドに対するその触媒活性が評価された。

【0078】

これらの設計プロテアーゼ各々の、ＰＱＬＰ（配列番号６８）モチーフに対する活性を試験するために、部位特異的突然変異導入法を使用して所望の突然変異が天然のヌクレオチド配列に組み入れられ、変異型酵素バリアントが大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で生産された。これらの酵素バリアントは次に、蛍光消光性のα‐グリアジンヘキサペプチドアナログＱＸＬ５２０‐ＰＱＰＱＬＰ‐Ｋ（５‐ＦＡＭ）‐ＮＨ２（ＦＱ）（配列番号６９）を基質として使用して、清澄化された全細胞溶解物中の酵素活性についてｐＨ４でスクリーニングされた。このアッセイで試験された１０７個の酵素バリアントのうち、１３％は酵素機能を喪失しており、３２％はＫｕｍａＷＴと比較して活性の有意差を示さず、５５％はこの基質に対して観察される活性が増大した。その後、細胞溶解物中に著しい活性増大を示した最も有望な２８個の酵素バリアントが、ＫｕｍａＷＴの酵素活性との精密な比較を行うために精製された。精製およびタンパク質濃度の補正後、これらの酵素の活性はＫｕｍａＷＴよりも２倍から１２０倍の範囲にわたって高活性であった（テーブル１）。最も高活性のバリアントはＫｕｍａＭａｘ（商標）と命名され、さらなる特徴解析のために選出された。

【0079】

【表5】

テーブル１ 精製および配列決定が行われたすべての突然変異体のＰＱモチーフに対する加水分解活性を野生型クマモリシン‐Ａｓと比較した変化倍率。これらは、精製、配列決定、および純粋タンパク質のアッセイにおいて野生型クマモリシンと比較する試験が行われたすべての突然変異体についての変化倍率の結果である（補足テーブル１に記載のようにして計算された）。アッセイは、０．０１２５ｍｇ／ｍＬの酵素終濃度および５μΜの基質濃度を用いてｐＨ４で行われた。

【0080】

ＫｕｍａＭａｘ（商標）は、野生型アミノ酸配列と比較して７個の突然変異すなわち：Ｖ１１９Ｄ、Ｓ２６２Ｋ、Ｎ２９１Ｄ、Ｄ２９３Ｔ、Ｇ３１９Ｓ、Ｄ３５８Ｇ、Ｄ３６８Ｈを含んでいる（図２Ｂ）。これらのうち変異Ｇ３１９Ｓ、Ｄ３５８Ｇ、およびＤ３６８Ｈは、Ｐ１位の所望のグルタミン残基との新たな水素結合を相乗的に導入するようである。モデル化されるように、Ｇ３１９Ｓ変異は、Ｐ１ポケット内のグルタミンと相互作用する新たな水素結合に寄与する可能性の高い、グルタミンのアミドのカルボニル酸素から０．２５ｎｍ（２．５Å）に位置するヒドロキシル基を導入するようである。Ｄ３６８Ｈ変異は該セリンヒドロキシル基を安定させることが予測され、活性部位内への該セリンヒドロキシル基の配置はひいてはＤ３５８Ｇ変異によって立体的に許容される。モデル化されたようなグルタミンとの新規な所望の相互作用を提供することに加えて、これら３つの突然変異はさらに、天然のＫｕｍａＷＴ基質の正に荷電したアルギニン残基を安定させると
予想される２つの酸性残基の除去も行う（図２）。部位特異的突然変異導入の際に偶然に組込まれたＶ１１９Ｄはプロペプチドドメイン内に位置し、したがって成熟型酵素の触媒活性には影響を及ぼさない。その他の３つの変異はＰ２‐Ｐ２’ポケット内の残基と直接接触せず、したがって、ヘキサペプチドの他の構成成分、発蛍光団、または消光物質との相互作用を導入する可能性が高い。Ｇ３１９Ｓ／Ｄ３５８Ｇ／Ｄ３６８Ｈの三重変異体だけではＫｕｍａＷＴと比較して７倍しか触媒活性の上昇を示さず；ＫｕｍａＭａｘ（商標）について測定されるよりも概算で１７倍低いので、観察された全体的な触媒反応増大にとって上記の突然変異が重要であることは明らかである。

【0081】

速度論的特徴および基質特異性
免疫原性グルテン基質アナログＦＱに対するＫｕｍａＭａｘ（商標）およびＫｕｍａＷＴの触媒反応効率は、６〜１００μΜの基質について速度対基質曲線をフィッティングすることにより計算されたように、それぞれ５６８Ｍ^−１ｓ^−１および４．９Ｍ^−１ｓ^−１であることが分かった（テーブル２）。これらの値は、ＫｕｍａＭａｘ（商標）が上述の初期活性スクリーニングにおいてＦＱ基質に対する酵素活性の１２０倍の増大を示したという観察と一致している。残念ながらこれらの基質濃度では速度の有意な飽和は観察されず、したがって個々の反応速度定数ｋ_ｃａｔおよびＫ_Ｍは測定できなかった。これは驚くべきことではない、というのも、ＫｕｍａＷＴの反応速度定数の過去の分析からは４０μΜのＫｍが報告されている。したがって、有意な飽和は１００μΜ未満の基質濃度では予想されないであろう。

【0082】

【表6】

テーブル２．ＫｕｍａＭａｘ（商標）およびＫｕｍａＷＴについてのペプチド基質の反応速度定数。基質１００μΜまで飽和は観察されなかったので、蛍光（Ｆｌ）消光性（Ｑｕ）のＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）ペプチドに関するＫｕｍａＷＴおよびＫｕｍａＭａ（商標）についての触媒反応効率（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ Ｍ^−１ｓ^−１）はいずれも直線に対してフィッティングされた。蛍光シグナルは、生成物の蛍光の基質クエンチングの説明となる標準曲線を用いて、「材料および方法」に記載されているようにして定量化された。ｐＮＡが連結されたペプチドについての触媒反応効率も同様の方式で決定され、「材料および方法」に記載されている。全てのフィッティングについて少なくとも６回独立に測定された速度が用いられ、Ｒ^２は０．９より大きかった。ｎ．ｄ．は未検出。

【0083】

蛍光消光性のＰＱＰＱＬＰ（配列番号３４）ヘキサペプチド基質に対してＫｕｍａＭａｘ（商標）がＫｕｍａＷＴと比較して活性が高いということは、ＫｕｍａＭａｘがＰＱジペプチドモチーフに対してより高い選好性を有することを示唆している一方で、基質特異性について直接的には情報をもたらしていない。ＫｕｍａＭａｘ（商標）の特異性がＫｕｍａＷＴの天然のＰＲジペプチドよりもＰＱジペプチドを選好するように確かに変化したことを確認するために、スクシニル‐アラニン‐Ｐ２‐Ｐ１‐Ｐ１’の形の４つのペプチドが、Ｐ２およびＰ１特異性を評価するべく両酵素に対する基質として提供された。これらのペプチドはＰ１’位にリポーターであるｐ‐ニトロアニリン（ｐＮＡ）を含有しており、ペプチド切断を分光計で読取ることが可能となっている。４つのペプチドはそれぞれＰ２位およびＰ１位に次のアミノ酸すなわち：プロリン‐グルタミン（ＰＱ）、プロリン‐アルギニン（ＰＲ）、グルタミン‐プロリン（ＱＰ）、およびプロリン‐グルタミン酸
（ＰＥ）を有するものであった。触媒反応効率が各基質について計算され、テーブル２に報告されている。ＦＱ基質に対する触媒活性の測定と同じように、ＫｕｍａＷＴまたはＫｕｍａＭａｘ（商標）によるこれらのペプチドに対する活性の飽和は観察されなかった。これは、ｐＮＡ基がΡ１’ポケットにおける結合を部分的に妨害することを示唆している、というのも、代替ＫｕｍａＷＴ基質について過去に報告された飽和レベルを十分に越える１ｍＭまでの基質濃度について試験が行われたからである。

【0084】

この特異性アッセイでは、ＫｕｍａＭａｘ（商標）は、ＫｕｍａＭａｘが選好するように設計された対象のジペプチドであるＰＱ基質に対し、その最高レベルの活性を実証した。ＫｕｍａＭａｘ（商標）はＰＲモチーフまたは他のモチーフに対する特異性の低下を示すように明確に設計されはしなかったが、ＰＱに対するその特異性の増大が、標的とされていないモチーフに対するその活性を低下させた可能性がある。実際、ＫｕｍａＭａｘ（商標）は、このアッセイではＱＰまたはＰＲ基質に対する有意な触媒活性を示さなかった（テーブル２）。過去の報告^１４と一致して、ＫｕｍａＷＴはＰＲモチーフに対してその最高レベルの活性を示した。ＫｕｍａＷＴは、３つの他のペプチド基質に対しては有意に低い活性レベルを示した。ＰＱジペプチドモチーフに対するＫｕｍａＷＴの触媒活性は以前に報告されている^１４一方で、本アッセイではＰＱジペプチド基質に対して際立った活性は観察されなかったが、これは、酵素活性部位へのこのペプチドの結合に対するｐＮＡの妨害作用に起因する可能性がある。いずれの酵素も、ｐＨ４で中性の電荷を有することが予測される立体的に同等の（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）基質ＰＥに対する活性を示したが；ＫｕｍａＭａｘ（商標）はＰＥペプチド基質に対してはＰＱ基質に対する活性と比較しておよそ５倍の活性低下を示し、このことはＰＱジペプチドモチーフに対するＫｕｍａＭａｘ（商標）の非常に強い選択性を示している。

【0085】

先に議論されたように、セリアック病のＯＥＴとして現在探究されているいくつかの酵素が存在する。これらの酵素のうち２つは、プロリルエンドペプチダーゼであるＳＣ ＰＥＰおよびグルタミン特異的エンドプロテアーゼであるＥＰ‐Ｂ２が工学的に設計されたものである^１５。これらのプロテアーゼの触媒反応効率をＫｕｍａＭａｘ（商標）の触媒反応効率と比較するために、天然型のＳＣ ＰＥＰおよびＥＰ‐Ｂ２酵素が大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で発現され、精製され、その触媒活性が評価された。ＳＣ‐ＰＥＰは、ｐＨ４においてＦＱグルテン基質アナログに対して１．６Ｍ^−１ｓ^−１の触媒反応効率を示したが、これは、この基質に対してのＫｕｍａＭａｘ（商標）よりおよそ３５０倍低いレベルの活性に相当する。ｐＨ４では、ＳＣ ＰＥＰはＱＰを含む４つのｐＮＡ連結ペプチド基質のうちいずれに対しても際立った活性を示さなかった。同様のｐＮＡ連結ペプチドを使用する過去の研究はこれらの基質に対するＳＣ ＰＥＰの活性を実証したが、そのアッセイはｐＨ４．５以上で実施されている^１５。他のグループと同様に、本発明者らはＳＣ ＰＥＰがｐＨ７ではＱＰ基質に対して触媒反応効率２３９０Ｍ^−１ｓ^−１の際立った活性レベルを示すことを見出し、よってこの組換えＳＣ ＰＥＰが十分に機能することを確認した（データは示さない）。これは、ＳＣ ＰＥＰが胃のｐＨ範囲では無視できるレベルの低い触媒活性しか持たないこと、よってα‐グリアジンペプチドが小腸に達した時点では有効であると予想されるにすぎないことを報告している過去の文献と一致している^{１５，１６}。

【0086】

ＥＰ‐Ｂ２については、ｐＨ４ではＦＱ基質に対して極めて低いレベルの活性しか検出されず、また４つのｐＮＡペプチド基質のうちいずれに対する活性も観察されなかった（データは示さない）。これは、同等の基質を使用したＥＰ‐Ｂ２活性の過去の報告^１１とは一致していない。ＥＰ‐Ｂ２は、大腸菌内で封入体を形成し、活性酵素を得るためにはリフォールディングを必要とするので、精製困難な酵素である。本発明者らはＥＰ‐Ｂ２のリフォールディングのために過去に報告された方法^{１１，１７，１８}を使用して可溶性タンパク質を得ることができず、よって本発明者らはオンカラムリフォールディングの手
法を使用し、その結果可溶性タンパク質を生産した。この可溶性ＥＰ‐Ｂ２はｐＨ４で予測どおりの自己プロセシング活性を示したが^１１（データは示さない）、この酵素の活性の欠如は、該酵素が本発明者らの方法を使用しても適切にリフォールディングしなかった可能性を示唆している。これは、異なるタンパク質発現ベクターの使用に起因する別のＮ末端およびＣ末端タグが原因であることも考えられ、詳細な調査が必要である。

【0087】

プロテアーゼ安定性
低いｐＨにおける触媒活性の実証に加えて、ヒトの消化管での使用が意図されるいかなるタンパク質治療薬も、消化プロテアーゼによる分解への抵抗性を示さなければならない。胃および小腸において最も豊富な２つのプロテアーゼは、それぞれペプシンおよびトリプシンである。ペプシンは胃の低いｐＨ範囲で最適なタンパク質分解活性を示す一方、トリプシンは小腸のより中性側のｐＨにおいて主として活性を有する。これらのプロテアーゼによる分解に対するＫｕｍａＭａｘ（商標）の抵抗性を評価するために、０．０１または０．１ｍｇ／ｍＬのＫｕｍａＭａｘ（商標）が、ペプシンおよびトリプシンのいずれにとっても生理学上適切な濃度である０．１ｍｇ／ｍＬの各プロテアーゼとともに、該プロテアーゼそれぞれの至適ｐＨ範囲でインキュベートされた。ＳＣ ＰＥＰおよびＥＰ‐Ｂ２が対照として含められたが、これは、ＥＰ‐Ｂ２はペプシンには抵抗性であるがトリプシンには弱いことが立証されており、かつＳＣ ＰＥＰは両プロテアーゼに対する感受性を示すからである^{１１，１５}。各タンパク質はそれぞれのプロテアーゼの存在下または非存在下で３０分間インキュベートされ、その後タンパク質は熱で不活性化され、残存しているタンパク質分解を受けていないものの比率がＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルを使用して測定された（図３）。

【0088】

このアッセイでは、ＫｕｍａＭａｘ（商標）はペプシンおよびトリプシンの両方に対して高い安定性を示し、いずれかのプロテアーゼとともに半時間インキュベーションした後でもおよそ９０％の完全なタンパク質が残存していた（図３）。過去の報告と矛盾せず、ＳＣ ＰＥＰはペプシンおよびトリプシンの両方に対して感受性を示し、これらのプロテアーゼとのインキュベーション後に残存している酵素は２０％未満であった。予想通り、トリプシンはＥＰ‐Ｂ２を効率的にタンパク質分解し、インキュベーション後の残存は１０％未満であったが、ペプシンの存在下ではＥＰ‐Ｂ２の有意な分解は観察されなかった。観察されたタンパク質分解がプロテアーゼ活性によるものであって酵素的自己プロセシングによるものではないことを確認するために、各酵素はｐＨ４または７のいずれかでインキュベートされて見かけのタンパク質分解が他のプロテアーゼの非存在下で１時間にわたって分析された（データは示さない）。ＫｕｍａＭａｘ（商標）およびＥＰ‐Ｂ２はｐＨ４で１０分未満の間にプロペプチドから活性型の酵素への自己プロセシングを示したが、ＳＣ ＰＥＰは示さなかった。３つのタンパク質はいずれもこの１時間にわたって＞９０％安定したままであった。これらのタンパク質はいずれも、ｐＨ７で１時間のインキュベーション中には有意なレベルの自己プロセシングまたはタンパク質分解を示さなかった。

【0089】

免疫原性α９‐グリアジンペプチドの分解
免疫原性ペプチドアナログに対してＫｕｍａＭａｘ（商標）によって示された高レベルの触媒活性は（テーブル２）、グルテン不耐症のＯＥＴにおける治療薬としてのＫｕｍａＭａｘ（商標）の使用が期待できることを実証している。しかしながら、これらのアッセイは、この酵素がグルテン由来の関連する免疫原性ペプチドを分解する能力を直接評価するものではない。したがって本発明者らは、α９‐グリアジンすなわちＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹ（配列番号７０）の中に存在する免疫優勢ペプチドに対するＫｕｍａＭａｘ（商標）の直接的なタンパク質分解活性について調べた。

【0090】

ＫｕｍａＭａｘは、５００μΜのα９‐グリアジンペプチドとともにおよそ１：１００
の酵素・ペプチドモル比にて３７℃、ｐＨ４でインキュベートされたが、このモル比はヒトの胃の中におけるこのペプチドの生理学的に適切な濃度に相当する。ＳＣ ＰＥＰが比較のためにこの実験に含められたが、それはこの酵素がＦＱ基質に対してＫｕｍａＭａｘ（商標）よりもかなり低い活性を示すからである。インキュベーション物からの試料は、タンパク質分解反応を停止させるために１０分ごとに８０％アセトニトリル中で停止処理された。完全体の免疫原性ペプチドの残存率は、高速液体クロマトグラフィー質量分析法を使用して測定されたが、該方法ではα９‐グリアジンペプチドのＭ＋Ｈ親イオンがモニタリングされた。ＫｕｍａＭａｘ（商標）は、免疫原性ペプチドの９５％超がＫｕｍａＭａｘ（商標）との５０分間のインキュベーション後にタンパク質分解されてしまうように、このアッセイにおいて免疫原性ペプチドに対する高レベルの活性を示し、一方ＳＣ ＰＥＰの存在下またはプロテアーゼの非存在下では該ペプチドの有意な分解は観察されなかった（図４Ａ）。ＫｕｍａＭａｘ（商標）の存在下での該ペプチドの半減期は、インキュベーション時間に対して残存しているペプチドの比率をプロットすることにより決定され、８．５±０．７分であると算出された（図４Ｂ）。

【0091】

考察
酵素療法はセリアック病の治療のための魅力的な方法であるが、それはこの治療形態が静脈内注射を必要としないことになるからである。しかしながら、セリアック病の有効な治療薬であるために必要なすべての特性を示す、ＯＥＴで使用するための適切なプロテアーゼを同定することが課題である。具体的には、ＯＥＴで使用される理想的なプロテアーゼは、３７℃で２〜４のｐＨ範囲で活性を維持し、かつ一般的な消化プロテアーゼによる分解に抵抗性を有することになろう。加えて、該タンパク質治療薬は、理想的には免疫原性のグルテン由来ペプチドに見出される共通モチーフについて厳格な特異性を示すことになろう。最後に、該タンパク質は組換え法を使用して容易に生産されるべきである。単一の天然の酵素がこれらの特性をすべて包含することはなさそうであるが、本発明者らは、これらの重要な特性のうちいくつかを有しているタンパク質が、コンピュータ分析、突然変異誘発、およびスクリーニングを通じて、その欠けている性質を示すように工学的に設計されうることを実証する。

【0092】

工学的に設計されたプロテアーゼであるＫｕｍａＭａｘ（商標）は、所望のＰＱジペプチドモチーフに対し、高レベルの活性、および特異性を示した（テーブル２）。ＰＱモチーフに対する特異性は、本来のＰＲモチーフとは対照的に、モデル化されたようにこのジペプチドモチーフ内のグルタミンと直接接触する、ＫｕｍａＭａｘのＳ１ポケット内における新しい水素結合の追加に由来する可能性が高い（図２Ｂ）。この特異性の変換はグルテン全体にわたって共通して見出されるモチーフに対する活性を導くだけでなく、標的とされていない基質に対する活性を大幅に低下させる（テーブル２）。経口プロテアーゼが標的ではない基質を認識する能力を持たないことは重要な特徴である、というのもこの特徴は食物の消化中に胃の中で産生される多数の他のペプチドによる競合的阻害を低減するからである。ＫｕｍａＭａｘ（商標）またはＫｕｍａＷＴは、より高い特異性を工学的に設計するためのプラットフォームとしての役割を果たす可能性が高い、というのも、ＫｕｍａＷＴはＰ２位およびＰ１位を越えてある程度の選択性を示しているからである^１４。この方法を使用して、固有の免疫原性エピトープに対して特異的な一連のカスタマイズされたプロテアーゼを生成することも考えられる。

【0093】

方法
タンパク質の発現および精製
ｐＥＴ２９ｂプラスミド内に組込まれた、対象の各タンパク質をコードする遺伝子は、形質転換により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内に導入された。個別のコロニーが採取され、５０μｇ／μＬカナマイシンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（商標）（ＴＢ＋Ｋａｎ）に接種され、３７℃で終夜インキュベートされた。５００ｕＬの終夜培養物が５
００ｍＬの自動誘導培地（５ｇトリプトン、２．５ｇ酵母エキス、４６５ｍＬ ｄｄＨ_２Ｏ）に添加され、３７℃でおよそ４時間振とうされ、次に自動誘導成分が添加された（５００ｕＬ ＭｇＳＯ_４、５００ｕＬの１０００×微量金属、２５ｍＬの２０×ＮＰＳ、１０ｍＬの２０×５０５２、５００ｕＬの５０ｍｇ／ｍＬ Ｋａｎ）。その後、培養物は１８℃で３０時間に振とうされてから遠沈された。ペレットは１０ｍＬの１×ＰＢＳに再懸濁され、次に５ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ｂＭＥ、２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．２ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ、ｄｄＨ_２Ｏ）とともに超音波処理することで溶解され、遠沈された。タンパク質はその後１ｍＬのＴＡＬＯＮ（登録商標）コバルトアフィニティカラムで精製された。ＫｕｍａＭａｘ、ＫｕｍａＷＴ、およびＳＣ Ｐｅｐは２０ｍＬの洗浄バッファー（１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ｂＭＥ、ｄｄＨ_２Ｏ）で３回洗浄され、次に１５ｍＬの溶出バッファー（２００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ｂＭＥ）中に溶出された。ＥＰ‐Ｂ２はカラム上でリフォールディングされねばならず、よって溶解後にペレットは１０ｍＬのＥＰ‐Ｂ２バッファーに再懸濁されたが、該バッファーは、ＥＰ‐Ｂ２封入体の変性を可能にするためにｄｄＨ_２Ｏの代わりに塩酸グアニジン中で希釈されるという点でのみ洗浄バッファーと異なっている。この再懸濁物はペレット化され、上清（変性ＥＰ‐Ｂ２を含む）は０．８μｍフィルタを用いてカラム上へ向けてろ過された。ＥＰ‐Ｂ２は２０ｍＬのＥＰ‐Ｂ２バッファーで１回洗浄され、その後カラム上でタンパク質をリフォールディングするために２０ｍＬの洗浄バッファーで２回洗浄された。タンパク質は１５ｍｌの溶出バッファーを用いて溶出された。全てのタンパク質は１５ｍＬから〜５００ｕＬまで濃縮され、次いで１Ｌの透析バッファー（２０％グリセロール、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ｂＭＥ）の中で１回透析された。タンパク質濃度は、ＫｕｍａＷＴおよびすべてのＫｕｍａＷＴバリアントについては５３，９８５Ｍ^−１ｃｍ^−１、ＳＣ Ｐｅｐについては１５２，２９０Ｍ^−１ｃｍ^−１、およびＥＰ‐Ｂ２については５８，２４５Ｍ^−１ｃｍ^−１の吸光係数を用いて分光測光法で計算された。

【0094】

スクリーニング方法
ＫｕｍａＷＴに突然変異を生成するためにキュンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）の突然変異誘発法が使用された。プレートから採取された個別のコロニーは、深型の９６ウェルプレートで増殖せしめられた。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）バッファー（１％の１００×Ｔｒｉｔｏｎ、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．５ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ、１×ＰＢＳ）を用いて細胞を溶解した後、上清は１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーでｐＨ４に調節された。ＦＱ基質に対する活性について粗くスクリーニングするために、１０ｕＬの上清が９６ウェル黒色プレート内の５μΜの基質９０ｕＬに添加され、蛍光が１時間にわたって３０秒間隔で測定された。

【0095】

精製酵素のアッセイ
活性スクリーニングにおいてＦＱ基質に対し最も高い活性を示したクマモリシン‐Ａｓのバリアントは、配列が決定され、次いで小スケールで精製された。５００ｕＬのＴＢ＋Ｋａｎ終夜培養物は５０ｍＬのＴＢ＋Ｋａｎに添加され、光学密度０．５〜０．８に達するまで３７℃で増殖せしめられた。ＩＰＴＧが０．５ｍＭになるように添加され、培養物は２２℃で１６〜２４時間発現せしめられた。細胞は遠沈され、５００ｕＬの洗浄バッファー（１×ＰＢＳ、５ｍＭイミダゾール、ｄｄＨ_２Ｏ）中に再懸濁され、２ｍＬのエッペンドルフ（登録商標）チューブに移され、１ｍＬの溶解バッファー（１×ＰＢＳ、５ｍＭイミダゾール、２×Ｂｕｇ Ｂｕｓｔｅｒ（商標）、２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、０．２ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ、ｄｄＨ_２Ｏ）中で溶解された。遠心分離後、上清は新しいチューブへ傾瀉された。２００ｕＬのＴＡＬＯＮコバルト樹脂を備えたカラムがエッペンドルフチューブ内に置かれ、上清が該カラムの上に注がれて２０分間振り動かされた後、遠沈されて通過画分が廃棄された。タンパク質は５００ｕＬの洗浄バッファーで３回洗浄され
、洗浄の間の通過画分は廃棄された。酵素は２００ｕＬの溶出バッファー（１×ＰＢＳ、２００ｍＭイミダゾール、ｄｄＨ_２Ｏ）中で溶出され、濃度は５３，９８５Ｍ^−１ｃｍ^−１の吸光係数を使用して分光測光法により算出された。

【0096】

アッセイについて、クマモリシン‐Ａｓ突然変異体はｐＨ４の１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー中で１５分間インキュベートされた。酵素は、最終的なタンパク質濃度が０．０１２５ｍｇ／ｍＬとなるように５μΜの基質に添加された。蛍光は１時間にわたって３０秒間隔で測定された。

【0097】

速度論的特徴解析
グルテン分解に関する酵素バリアントの傾向は、蛍光消光されたα‐グリアジンヘキサペプチドアナログＱＸＬ５２０‐ＰＱＰＱＬＰ‐Ｋ（５‐ＦＡＭ）‐ＮＨ２（ＦＱ）（配列番号６９）を基質とした加水分解によって測定された。各酵素は１００ｍＭのｐＨ４酢酸ナトリウムバッファー中で室温にて１５分間インキュベートされた。１５分後、５０ｕＬの蛍光基質がペプチド終濃度１００、５０、２５、１２．５、６．２５、および０μΜの範囲で添加され、すべての基質濃度変動値にわたって０．０５μΜのＫｕｍａＭａｘ（商標）、０．５μΜのＫｕｍａＷＴ、０．５μΜのＳＣ Ｐｅｐ、および０．５μΜのＥＰ‐Ｂ２の濃度が維持された。プレートの読み取りは直ちに分光光度計で１時間、励起波長に４５５ｎｍを使用し、４８５ｎｍの発光波長を読み取って行われた。

【0098】

該酵素について、加水分解されるとｐ‐ニトロアニリン（ｐＮＡ）を放出する様々な色素形成基質すなわち：［Ｓｕｃ‐ＡＰＱ‐ｐＮＡ］、［Ｓｕｃ‐ＡＱＰ‐ｐＮＡ］、［Ｓｕｃ‐ＡＰＥ‐ｐＮＡ］、および［Ｓｕｃ‐ＡＰＲ‐ｐＮＡ］を使用して、様々なジペプチドモチーフに対する特異性についても試験された。この場合も、各酵素は１００ｍＭのｐＨ４酢酸ナトリウムバッファー中で室温にて１５分間インキュベートされた。１５分後、２０ｕＬの基質が、基質終濃度１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５、および０μΜの範囲となるように、かつ試験されているすべての酵素が最終的に０．５μΜの濃度になるように、酵素インキュベーション物に添加された。プレートの読み取りは直ちに分光光度計で１時間、反応物による３８５ｎｍの吸収をモニタリングして行われた。

【0099】

蛍光ペプチド用の標準曲線には、基質および生成物を併せてｐＨ４のバッファー中で様々な濃度で混合することが必要であった。基質濃度は１００、５０、２５、１２．５、６．２５、および０μΜであり、生成物濃度は２０、５、１．２５、０．３１２５、０．０７８１２５、０μΜであった。

【0100】

吸収性ペプチドの標準曲線には、ｐＨ４バッファーで希釈された１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５、０．７８１２５、０．３９０６２５、０．１９５３１２５、０．０９７６５６２５、および０μΜの生成物濃度を要した。

【0101】

プロテアーゼ安定性
酵素の安定性は、消化プロテアーゼであるペプシンおよびトリプシンの存在下で測定された。ＫｕｍａＷＴ、ＫｕｍａＭａｘ（商標）、ＳＣ Ｐｅｐ、およびＥＰ‐Ｂ２は、各消化プロテアーゼの天然のｐＨ環境と一致するバッファー中でインキュベートされた。ペプシン消化アッセイ用に酵素をプレインキュベートするためにはｐＨ３．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム、およびトリプシン消化アッセイ用にはｐＨ７．５の透析バッファー（「タンパク質の発現および精製」を参照）が使用された。実験用の酵素はそれぞれ０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で各バッファー中にて３７℃で１５分間インキュベートされた。

【0102】

適切なバッファー中でのプレインキュベーション後、０．１ｍｇ／ｍＬの消化プロテア
ーゼが添加された。反応は３連で実施され、３７℃で３０分間インキュベートされた。ＳＤＳの添加および５分間の煮沸により確実に消化プロテアーゼを不活性化した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルから、ＩｍａｇｅＪを使用して、酵素分解の定量化が可能となった。

【0103】

タンパク質の自己タンパク質分解速度はペプシンまたはトリプシンの非存在下でｐＨ４および７．５において測定された。０．２ｍｇ／ｍＬの濃度の各酵素は、ｐＨ４の１００ｍＭ酢酸ナトリウムおよびｐＨ７．５の透析バッファー中でインキュベートされた。２０、４０、および６０分において時間点がとられた。ＳＤＳが添加され、酵素の変性およびさらなる自己タンパク質分解の阻害を確実にするためにアリコートが５分間煮沸された。ここでもＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルとＩｍａｇｅＪとの併用により酵素の自己タンパク質分解の定量化が可能となった。

【0104】

ＬＣＭＳグリアジン分解アッセイ
完全長α９‐グリアジンに対する酵素活性は高速液体クロマトグラフィー‐質量分析法を使用して測定された。各酵素について、ｐＨ４の１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー７μＬが５μΜの酵素２８μＬに添加され、別個の３μＬのグリアジンのチューブと並んで３７℃で１５分間インキュベートされた。次に２７μＬの各酵素混合物、および対照として２７μＬの透析バッファーがグリアジンの各チューブに添加された。これらはもう一度３７℃でインキュベートされ、１０、２０、３０、４０および５０分において５μＬの試料が取り出された。各時点の試料は、１％のギ酸およびおよそ３３μΜのロイペプチンを含んだ９５μＬの８０％アセトニトリル中で停止処理された。該試料は、様々なプロテアーゼによるグリアジン分解を経時的に比較するためにＨＰＬＣで分析された。

【0105】

参考文献

【0106】

【表7】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]