特許 6342890 結腸直腸癌の化学的予防

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6342890

(24)【登録日】2018年5月25日

(45)【発行日】2018年6月13日

(54)【発明の名称】結腸直腸癌の化学的予防

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/616 20060101AFI20180604BHJP

   A61K 31/592 20060101ALI20180604BHJP

   A61K 31/593 20060101ALI20180604BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20180604BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20180604BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20180604BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180604BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180604BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/616

   A61K31/592

   A61K31/593

   A61K9/20

   A61K9/48

   A61K9/16

   A61P35/00

   A61P43/00 121

【請求項の数】12

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2015-516735(P2015-516735)

(86)(22)【出願日】2013年6月13日

(65)【公表番号】特表2015-519392(P2015-519392A)

(43)【公表日】2015年7月9日

(86)【国際出願番号】IB2013054846

(87)【国際公開番号】WO2013186734

(87)【国際公開日】20131219

【審査請求日】2016年6月13日

(31)【優先権主張番号】MI2012A001041

(32)【優先日】2012年6月15日

(33)【優先権主張国】IT

(73)【特許権者】

【識別番号】507084903

【氏名又は名称】ソファル ソシエタ ペル アチオニ

(74)【代理人】

【識別番号】110001243

【氏名又は名称】特許業務法人 谷・阿部特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】アレクシス グランデ

(72)【発明者】

【氏名】ファブリツィオ フェッラリーニ

(72)【発明者】

【氏名】サンドラ パレンティ

【審査官】 上條 肇

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／１２５０７３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第９９／０５６６９７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 米国特許出願公開第２００１／００４９３６４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 European Journal of Cancer Prevention, 2008, Vol.17(6), p.502-514

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／６１６

Ａ６１Ｋ ３１／５９ − ３１／５９３

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

結腸直腸癌の予防および／または治療に使用されるための、
（ｉ）５−アミノサリチル酸、またはその薬理学的に許容される塩と、
（ｉｉ）グループＤビタミン、その誘導体、代謝産物、または類似体と
の組合せ医薬であって、
前記グループＤビタミン、またはその誘導体、代謝産物、もしくは類似体は、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３、および１α，２５ジヒドロキシ−ビタミンＤ３を含む群から選択され、
カルシウムを含まないことを特徴とする、組合せ医薬。

【請求項2】

５−アミノサリチル酸およびビタミンＤ３を含むことを特徴とする請求項１に記載の組合せ医薬。

【請求項3】

５−アミノサリチル酸およびビタミンＤ３からなることを特徴とする請求項１に記載の組合せ医薬。

【請求項4】

前記５−アミノサリチル酸、またはその薬理学的に許容される塩は、０．５から５ｇまでに含まれる１日用量で投与され、前記グループＤビタミン、その誘導体、代謝産物、または類似体は、５００から１０，０００ＩＵまでに含まれる１日用量で投与されることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の組合せ医薬。

【請求項5】

前記５−アミノサリチル酸、またはその薬理学的に許容される塩は、約２．４ｇの１日用量で投与され、前記グループＤビタミン、その誘導体、代謝産物、または類似物は、約２０００ＩＵの１日用量で投与されることを特徴とする請求項４に記載の組合せ医薬。

【請求項6】

哺乳類に、特にヒトに投与されることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の組合せ医薬。

【請求項7】

（ｉ）５−アミノサリチル酸、またはその薬理学的に許容される塩と、
（ｉｉ）グループＤビタミン、その誘導体、代謝産物、または類似体と
の組合せと、
少なくとも１種の生理学的に許容される賦形剤と
含む、結腸直腸癌の予防および／または治療用医薬組成物であって、
前記グループＤビタミン、またはその誘導体、代謝産物、もしくは類似体は、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３、および１α，２５ジヒドロキシ−ビタミンＤ３を含む群から選択され、
カルシウムを含まないことを特徴とする、結腸直腸癌の予防および／または治療用医薬組成物。

【請求項8】

経口、筋肉内、皮下、または直腸投与用であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

経口投与によることを特徴とする請求項７または８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、ロゼンジ剤の形状であることを特徴とする請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

制御放出に適切であることを特徴とする請求項７から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記組合せの成分の同時、逐次、または個別投与用である、組合せ製剤としての請求項７から１１のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、
（ｉ）５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ：５−ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）もしくはその誘導体、またはその薬理学的に許容される塩、および
（ｉｉ）グループＤビタミン、その誘導体、代謝産物、または類似体の新しい組合せと、結腸直腸癌の予防および／または治療におけるその使用とに関する。

【0002】

本発明の別の態様は、前記組合せを少なくとも１種の生理学的に許容される賦形剤と一緒に含有する医薬組成物と、結腸直腸癌の予防および／または治療に使用される前記組成物とに関する。

【背景技術】

【0003】

非ステロイド系抗炎症薬、ＮＳＡＩＤＳ（ｎｏｎ ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ）は、結腸直腸癌（ＣＲＣ：ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）に対して認められた化学発癌抑制作用によって特徴付けられる（例えば、非特許文献１参照）。残念ながら、ＮＳＡＩＤの全身および胃腸毒性は、関係する患者の長期治療を要するプロトコルの領域におけるその投与を厳格に制限する（例えば、非特許文献２参照）。種々の研究は、５−ＡＳＡが、ＣＲＣに対する同等の化学発癌抑制作用を得るための将来性ある代替物であり、それと同時にＮＳＡＩＤにより誘発された副作用が回避されることを示す（例えば、非特許文献３参照）。事実、アスピリン、即ち典型的なＮＳＡＩＤとの化学的類似性にも関わらず、５−ＡＳＡは、この療法薬の臨床上の安全性を明確に説明する特性であるシクロオキシゲナーゼの弱い阻害によっておよび無視できる全身吸収によって、特徴付けられる（例えば、非特許文献４参照）。この点に関し、５−ＡＳＡの抗炎症作用がその他のメカニズムによって媒介されることは驚くに当たらず、中でも重要な役割は、ＮＦｋＢおよびＰＰＡＲなどの免疫応答を促進させる転写因子の阻害によっておそらくは果たされる（例えば、非特許文献５参照）。

【0004】

次いで最近の研究は、５−ＡＳＡが、β−カテニンにより媒介される増殖シグナル伝達経路を妨げることを示している。このタンパク質は、結腸直腸癌のほとんど全ての場合に構成上活性化する転写因子である。β−カテニンのリン酸化の状態は、その転写機能に間接的に影響を及ぼすことが公知であり、このタンパク質は、リン酸化した場合に細胞質内で分解するのに対して脱リン酸化した場合には核に転座するとみなされる。非特許文献６は、５−ＡＳＡが、通常ならβ−カテニンの脱リン酸化の原因となるホスファターゼＰＰ２Ａの酵素活性を阻害することができ、したがってその核転座が低減されることを実証している。非特許文献７および８は、５−ＡＳＡによるＣＲＣ癌細胞の治療が、カドヘリンの上科に属しかつ原形質膜上のβ−カテニンを隔離することが可能なμ−プロトカドヘリンとして公知の膜タンパク質の発現を誘発し、β−カテニンが核に転座するのを防止しかつその標的遺伝子の転写を活性化することも実証している。

【0005】

特許文献１は、カドヘリンの上科に属する膜タンパク質、前記μ−プロトカドヘリンの誘発により、５−ＡＳＡでの治療後にβ−カテニンの核転座が阻害されることを、さらに実証している。このカドヘリンは、膜内でβ−カテニンに結合し隔離し、その核転座とその標的遺伝子の転写とを防止する。

【0006】

その数多くの疫学的研究は、ビタミンＤ３（ＶＤ３：ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３）の投与によってＣＲＣの発生が著しく低減することも示唆している。カルシウム恒常性の制御に加え、実際には、ＶＤ３は、中でも結腸の癌腸細胞を引用することも可能な数多くの細胞型で行われる、重要な抗増殖性、分化促進性、およびアポトーシス促進性の活性によっても特徴付けられる（例えば、非特許文献９参照）。この目的で、非特許文献１０は、この場合はＥ−カドヘリンまたは主な上皮カドヘリンの過発現により媒介される原形質膜でのこの転写因子の隔離からなる、５−ＡＳＡに関して既に言及されている類似したメカニズムを通して、ＶＤ３がβ−カテニンのシグナル伝達経路を妨げることを実証している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】欧州特許第２２３９５８０号明細書

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｏ’Ｍｏｒａｉｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｏｎｃｏｌ ２００９；１（１）：２１−２５

【非特許文献2】Ｇｕａｄａｇｎｉ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００７；２７：３１４７−３１６２

【非特許文献3】Ｒｕｂｉｎ ＤＴ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ，２００８；１４：６５−２７４

【非特許文献4】Ｂｅｒｇｍａｎ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ，２００６；２３：８４１−８５５

【非特許文献5】Ｌｙａｋｈｏｖｉｃｈ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ；３１（２）：２０２−９，２０１０

【非特許文献6】Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２００６；２７（１２）：２３７１−８２

【非特許文献7】Ｐａｒｅｎｔｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ；３１（１）：１０８−１９，２０１０

【非特許文献8】Ｌｏｓｉ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ, ４２（７）：９６０−９７１，２０１１

【非特許文献9】Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｌａｒａ ＡＭ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００７；３９（４）：６７２−７

【非特許文献10】Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；１５４（２）：３６９−８７

【非特許文献11】Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１；２５（４）：４０２−８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、結腸直腸癌を治療するための新しいより有効な療法を見出すことからなる。

【課題を解決するための手段】

【0010】

驚くべきことに、（ｉ）５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）もしくはその誘導体、またはその薬理学的に許容される塩と、（ｉｉ）グループＤビタミン、その誘導体、代謝産物、または類似体との組合せは、β−カテニンの増殖シグナルの伝達経路に対する単一の治療のそれぞれの作用に比べて、両方の有効成分に相乗効果を発揮させ、その構成的活性化が結腸直腸癌の９０％の進行で観察されることを見出した。したがって本発明は、（ｉ）５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）もしくはその誘導体、またはその薬理学的に許容される塩、および（ｉｉ）グループＤビタミン、その誘導体、代謝産物、または類似体の組合せと、この組合せを少なくとも１種の生理学的に許容される賦形剤と共に含む医薬組成物と、結腸直腸癌の予防および／または治療における前記組合せおよび／または医薬組成物の使用とに関する。

【0011】

本発明の組合せには、結腸直腸癌の予防および／または治療で通常使われる投薬量に関して、両方の成分の薬用量を低減させるという利点がある。

【0012】

好ましくは、本発明は、（ｉ）５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）と、（ｉｉ）グループＤビタミン、その誘導体、代謝産物、または類似体との組合せに関する。

【0013】

５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）の誘導体は、好ましくは、スルファサラジン（６−オキソ−３−（（４−（ピリジン−２−イル）スルファモイル］フェニル）ヒドラジニリデン］シクロヘキサ−１，４−ジエン−１−カルボン酸）、オルサラジン（５−［（２Ｚ）−２−（３−カルボキシ−４−オキソ−１−シクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）ヒドラジニル］−２−ヒドロキシ−安息香酸）、およびバサラジド（５−［４−（２−カルボキシエチルカルバミル”）フェニル］ジアゼニル−２−ヒドロキシ−安息香酸）を含む群から選択される。

【0014】

好ましくは、グループＤビタミン、またはその誘導体、代謝産物、もしくは類似物は、ビタミンＤ３（またはコレカルシフェロール、ＩＵＰＡＣ名：（３Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｒ，１７Ｒ）−１７−（（２Ｒ，５Ｒ，Ｅ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−ドデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オール）、ビタミンＤ２（またはエルゴカルシフェロール、ＩＵＰＡＣ名：（３Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｒ，１７Ｒ）−１７−（（２Ｒ，５Ｒ，Ｅ）−５，６−ジメチルヘプタン−３−エン−２−イル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−ドデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オール）、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３（またはカルシフェジオールもしくはカルシジオール、ＩＵＰＡＣ名：（６Ｒ）−６−［（１Ｒ，３ａＲ，４Ｅ，７ａＲ）−４−［（２Ｚ）−２−［（５Ｓ）−５−ヒドロキシ−２−メチリデン−シクロヘキシリデン］エチリデン］−７ａメチル−２，３，３ａ，５，６，７−ヘキサヒドラ−１Ｈ−インデン−１−イル］−２−メチル−ヘプタン−２−オール）、および１α，２５ジヒドロキシ−ビタミンＤ３（またはカルシトリオール、ＩＵＰＡＣ名：（１Ｒ，３Ｓ）−５−［２−［（１Ｒ，３ａＲ，７ａＳ）−１−［（２Ｒ）−６−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン−２−イル］−７ａ−メチル−２，３，３ａ，５，６，７−ヘキサヒドロ−１Ｈ−インデン−４−イリデン］エチリデン］−４−メチリデン−シクロヘキサン−１，３−ジオール）を含む群から選択される。

【0015】

より好ましくは、本発明の組合せはビタミンＤ３を含む。

【0016】

本発明の一態様によれば、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）とビタミンＤ３との前記組合せは、カルシウムを含まない。

【0017】

本発明のその他の態様によれば、前記組合せは、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）とビタミンＤ３とからなる。

【0018】

一態様によれば、本発明は、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）およびビタミンＤ３の組合せと、この組合せを少なくとも１種の生理学的に許容される賦形剤と共に含む医薬組成物と、結腸直腸癌の予防および／または治療における前記組合せおよび／または医薬組成物の使用とに関する。

【0019】

別の態様によれば、本発明は、例えば、健康な／正常な個人；腸の慢性炎症性疾患（クローン病および潰瘍性直腸結腸炎など）に罹患している患者；結腸−直腸の腺腫および／または腺癌の内視鏡的除去術下にある患者；遺伝的癌症候群（リンチ症候群および家族性腺腫性ポリポーシスなど）に罹患している患者など、新生物を発症する異なるリスクを有する者において、結腸直腸癌を予防するための本発明の組合せおよび／または医薬組成物の使用に関する。

【0020】

本発明の組合せおよび／または医薬組成物を投与するための適切な経路には、経口、筋肉内、皮下、または直腸投与が含まれ、好ましくは経口投与である。

【0021】

本発明の医薬組成物は、組合せの成分の同時、逐次、または個別投与のための、組合せ製剤として、２成分が同じ投薬単位または個別の投薬単位中に存在する医薬組成物として配合することができる。

【0022】

好ましくは、２成分の個別の投与は、１から２４時間までを含む時間間隔で行われる。

【0023】

本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、ロゼンジ剤の形で配合することができる。

【0024】

好ましい態様によれば、本発明の医薬組成物は、経口投与のため圧縮形態にある同じ投薬単位中に、組合せの２成分を少なくとも１種の生理学的に許容される賦形剤と共に含む。

【0025】

結腸直腸癌の予防および／または治療のための本発明の組合せの使用は、０．５から５ｇの範囲に含まれる量、好ましくは約２．４ｇの量の５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）もしくはその誘導体またはその薬理学的に許容される塩と、５００から１０，０００ＩＵの範囲に含まれる量、好ましくは約２０００ＩＵの量のグループＤビタミン、その誘導体、代謝産物、または類似体とを毎日投与することを含む。

【0026】

患者に投与される本発明の組成物の量は、当業者に周知の様々な因子、例えば患者の体重、投与経路、および病気の重症度によって異なり得る。

【0027】

他の態様によれば、本発明は、腸の異なる区域、例えば、全身吸収を目的とするグループＤビタミン、その誘導体、代謝産物、または類似体に関しては小腸に、局所作用を有する５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）もしくはその誘導体、またはその薬理学的に許容される塩に関しては結腸に、２成分を制御放出するのに適しており、したがって、２種の活性成分の対応する濃度は本発明の目的に最適である、医薬組成物に言及する。

【0028】

好ましい態様によれば、本発明の組合せおよび／または医薬組成物は、哺乳類、特にヒトに投与される。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】５−ＡＳＡ、ＶＤ３、および５−ＡＳＡ＋ＶＤ３での治療に供された細胞系ＨＴ２９の成長曲線を示す図である。ｘ軸には治療時間が示されており、ｙ軸には、初期の細胞数と比較した細胞増殖数が示されている。データは、３つの独立した実験から得られた平均±ｓ．ｅ．ｍとして示されている。

【図2】５−ＡＳＡ、ＶＤ３、および５−ＡＳＡ＋ＶＤ３で治療したＨＴ２９細胞での、β鎖のシグナル伝達経路に属する遺伝子のＲＮＡメッセンジャーのＱＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。分析された遺伝子をｘ軸に示し、一方、ＲＮＡメッセンジャーのレベルの定量的変動をｙ軸に示す。データは、３つの独立した実験から得られた平均±ｓ．ｅ．ｍとして表示されている。

【図3】５−ＡＳＡおよびＡＳＡでの治療に供された細胞系ＣａＣｏ２の成長曲線を示す図である。ｘ軸には、分析された化合物およびその濃度が示され、ｙ軸には、初期の細胞数と比較した細胞増殖数が示されている。データは、３つの独立した実験から得られた平均±ｓ．ｅ．ｍとして表示されている。

【図4】５−ＡＳＡおよびＡＳＡで治療したＣａＣｏ２におけるβ鎖のシグナル伝達経路に属する遺伝子のＲＮＡメッセンジャーのＱＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。分析された遺伝子はｘ軸に示され、それに対してＲＮＡメッセンジャーのレベルの定量的変動をｙ軸に示す。データは、３つの独立した実験から得られた平均±ｓ．ｅ．ｍとして表示されている。

【発明を実施するための形態】

【0030】

材料および方法
ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から得られた結腸直腸腺癌の細胞系ＣａＣｏ２およびＨＴ２９を、熱および１ｍＭのＬ−グルタミン（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ）で不活性化した１０％ウシ胎児血清（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、Ｄｅｖｏｎ、ＵＫ）で成長させた。５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ、ＳＯＦＡＲ Ｓ．ｐ．Ａ．、Ｍｉｌａｎ、イタリア）およびアセチルサリチル酸（ＡＳＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓｅ、ＭＯ、ＵＳＡ）を、それぞれ２０および１０ｍＭの濃度で培地に溶解した。ビタミンＤ３（ＶＤ３）（１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、カルシトリオール、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１０^-7Ｍの濃度で培地に希釈した。細胞系ＨＴ２９を用いて実施した実験では、３００，０００細胞を各サンプルごとに播き、５−ＡＳＡ、ビタミンＤ３、または５−ＡＳＡとＶＤ３との組合せを各ウェルに添加した。一方、細胞系ＣａＣｏ２を用いて実施した実験でも、再び３００，０００細胞を各サンプルごとに播いたが、５−ＡＳＡまたはＡＳＡを各ウェルに添加した。次いで処理された細胞を、２４時間ごとに細胞計数に供して、異なる刺激の抗増殖作用をモニターした。治療の９６時間後、全ての細胞を収集し、再吸収させ、「Ｑｉａｇｅｎ全ＲＮＡ精製キット」を用いて製造元の取扱説明書（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に従いＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの完全性および濃度を、Ｂｉｏ−Ａｎａｌｙｚｅｒ技法（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して試験した。次いで合計で１００ｎｇのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造元より提供された取扱説明書に基づき逆転写した。次いでＱＲＴ−ＰＣＲを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）配列検出システムを用いて実施し、様々なサンプルで測定されたｍＲＮＡの相対レベルを定量した。μ−プロトカドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ｐ２１^waf-1、ＫＬＦ４、およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ：ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のｍＲＮＡを増幅するためのトリガーおよびプローブがＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより考案された。ｃＤＮＡの各サンプルを、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、５０μｌの反応体積として３つずつ処理した。熱サイクルを、５０℃で２分間の初期変性から開始し、９０℃で１０分間を経た後、９５℃で１５秒および６０℃で１分を４０サイクル行った。ＱＲＴ−ＰＣＲシグナルを、対応する定量方法ΔΔＣｔを使用して評価した（Ｌｉｖａｋ ＫＪ、Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ。相対的遺伝子発現データを、リアルタイム定量ＰＣＲおよび２（−ΔΔＣ（Ｔ））方法を使用して分析した（例えば、非特許文献１１参照）。この手順は、内因性対照（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化され、また較正サンプルと比較した、標的遺伝子の遺伝子発現の相対的な差を計算する。得られた値を、メッセンジャーレベルの変動の相対量（ＲＱ：ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ）として表した。

【0031】

［実施例１］
結腸−直腸の腺癌細胞系ＨＴ２９の、５−ＡＳＡおよびＶＤ３での治療によって促進された抗増殖作用の分析
対応するＶＤＲ受容体から誘導された、ＶＤ３に対するその応答性により選択された結腸直腸腺癌細胞系ＨＴ２９を、個々に使用され、また関連付けて使用される５−ＡＳＡ ２０ｍＭおよびＶＤ３ １０^-7Ｍでの「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」処理に供し、癌性結腸細胞に対して分析された化合物により決定された抗増殖作用を定量した。この実験から得られた細胞計数値に基づく成長曲線のプロットは、５−ＡＳＡとＶＤ３とを組み合わせた治療が、単一の治療で観察されたものよりも明らかに優れているさらなる抗増殖作用を引き起こすことを示している。この知見は、刺激を与えた９６時間で何よりも明らかであり、対照では１４の増殖が検出され、５−ＡＳＡでの治療においては８倍、ＶＤ３の治療では１０倍、組み合わせた治療では５倍しか検出されなかった（図１）。これらのデータは、結腸直腸癌細胞における５−ＡＳＡおよびＶＤ３での治療によって個々に実現された抗増殖作用を裏づけ、それらの薬理学的関連付けから得られる追加の作用の存在をさらに実証する。

【0032】

［実施例２］
５−ＡＳＡおよびＶＤ３での治療に供される結腸−直腸の結腸直腸腺癌細胞ＨＴ２９での、増殖、分化、およびアポトーシスを制御する遺伝子のＱＲＴ−ＰＣＲ分析
５−ＡＳＡ／ＶＤ３の関連付けによる、細胞系ＨＴ２９に対して決定された作用を分子レベルでチェックするために、「リアルタイム」定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して、そのタンパク質生成物がμ−プロトカドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ｐ２１^waf1、およびＫＬＦ４などの癌性結腸細胞の増殖、分化、およびアポトーシスの制御に関与する一連の遺伝子の発現を分析した。この分析は、先に開示された濃度で使用された研究済みの薬物での９６時間の治療に供した細胞培養物で実施した。

【0033】

列挙された遺伝子の選択は、以下に説明される一連の知見に由来する。μ−プロトカドヘリンおよびＥ−カドヘリンは、細胞間接着を媒介するカドヘリン科に属するタンパク質であり、したがって間接的に、抗転移活性を有する。それらは、原形質膜上で転写因子β−カテニンを隔離し、それが標的遺伝子の転写を活性化するのを防止することによって、細胞増殖を制御することも実証されている。これら記載の理由のため、これらカドヘリンの発現は、上皮腫瘍において頻繁に下方制御される。タンパク質ｐ２１^waf1の体系化遺伝子は、β−カテニンの主なネガティブ標的の１つであり、その発現の大量誘発の後に、アポトーシスによる細胞死後の増殖抑制を決定することができる細胞周期の重要なレギュレーターである。最後に、ＫＬＦ４は、β−カテニンにより媒介される増殖活性と対照をなすその能力に部分的に由来し、または部分的にしか特徴付けられていない分子メカニズムを通して、結腸癌細胞の増殖および分化の制御において決定的な役割を果たす転写因子の体系化癌抑制遺伝子である。これまで述べてきた遺伝子の重要性は、それらが全て結腸直腸癌の発症および進行に関与するという事実によっても十分に強調される。

【0034】

得られたデータは、５−ＡＳＡによる単一の治療が、μ−プロトカドヘリンに関しては２．５倍、Ｅ−カドヘリンに関しては２．２倍、ｐ２１に関しては２．９倍、ＫＬＦ−４に関しては２．２倍のメッセンジャー発現の増加を決定することを実証している。ＶＤ３での治療後、これらの値はそれぞれ１、１．７、１．５、および１．６であり、それに対して組合せ治療後には、それらはそれぞれ３．２、３．１、４．２、および３．１であり、問題となっている薬物の関連付けにより、試験された遺伝子のメッセンジャー発現の誘発に対して相加作用が決定されることを示している（図２）。

【0035】

これらの結果は明らかに、５−ＡＳＡ／ＶＤ３を関連付けたものを、結腸直腸癌に対して化学予防的に使用するのに適切なものにする。

【0036】

［実施例３］
結腸直腸腺癌細胞系における５−ＡＳＡおよびＡＳＡでの治療によって促進される抗増殖および分子作用の比較分析
５−ＡＳＡの化学予防的性質に関連した有効性および安全性のプロファイルをさらに特徴付けるために、先に説明した系列と同じタイプの一連の実験を実施し、５−ＡＳＡおよびアスピリン（ＡＳＡ）、即ちＮＳＡＩＤ系列の主な薬物での治療後に、癌性結腸細胞に関して決定された生物学的作用の比較分析を実施した。これらの実験は、同じ由来のその他の細胞系との比較から生じる５−ＡＳＡに対する選択的応答性のために結腸直腸腺癌細胞系で実施し、培養物を９６時間の治療時間に曝した。

【0037】

得られた結果は、ＡＳＡが５−ＡＳＡよりも明白な抗増殖作用を有するが、これは分析された薬物２０ｍＭの濃度でもたらされる明らかな毒性作用に関連付けられたものであり、この濃度では、１に等しい細胞充実性「倍率変化」値によって示された完全な増殖遮断にも関わらず、５−ＡＳＡで治療された全ての細胞は生存し、それに対してＡＳＡでの治療に供された細胞は、０．２に等しい細胞充実性「倍率変化」により示されるように８０％の死亡率を有することを実証している（図３）。これらの結果から生じる追加の知見は、ＡＳＡ １０ｍＭおよび５−ＡＳＡ ２０ｍＭの濃度が、治療に供される癌細胞上で完全に重ね合わせることができる抗増殖作用を促進するので、２種の比較された薬物の均等物であると実際にみなすことができるという事実からなる（図３）。

【0038】

これらの細胞培養物からおよび対照として使用されるその他の培養物から採取されたサンプルでは、先のパラグラフで列挙された遺伝子のメッセンジャーＲＮＡのレベル（図２参照）を、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定した。得られた結果は、５−ＡＳＡ ２０ｍＭで治療した後に、μ−プトロカドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ｐ２１^waf1、およびＫＬＦ４遺伝子のメッセンジャー発現がそれぞれ３．８、２．４、８．０、および５．５倍誘発されたことを示しており（図４）、細胞系ＨＴ２９で既に観察されたデータを裏づけている。一方、１０ｍＭに等しい等価用量のＡＳＡでの治療は、その発現が５．８倍の増加を示し、したがって５−ＡＳＡでの対応する治療で観察されたものに匹敵するとみられる遺伝子ｐ２１^waf1の唯一の例外はあるものの、分析した遺伝子を誘発しなかった。このデータは、遺伝子ｐ２１^waf1の分子制御を特徴付ける重複性および不均質性を考えれば意外ではなく、その発現は、μ−プロトカドヘリン、Ｅ−カドヘリン、およびＫＬＦ４の体系化遺伝子の評価を通して本発明者らの実験条件で求められるβ鎖の増殖シグナル伝達経路によって制御されるだけではなく、数多くのシグナル伝達経路によっても制御される。この結果から生じる最も真実味のある結論は、結果的に、ＡＳＡが、５−ＡＳＡによる同じ作用を媒介するもの以外の分子メカニズムを通してｐ２１^waf1の発現を誘発させるという考察からなり、したがって、比較した薬物の関係において後者の作用の特異性が実証される。

【0039】

全体として、これまで提示されてきたデータはしたがって：１）５−ＡＳＡが、ＶＤ３と協調して働いて、β−カテニンのシグナル経路およびこれに矛盾することなく癌性結腸細胞の増殖活性を阻害し、それがこの薬理学的関連付けを結腸直腸癌に対する化学予防的使用に適切なものにし；２）５−ＡＳＡは、それほど毒性がなく、したがって化学予防的な保護を得るために必要とされるような長期使用の目的ではＡＳＡよりも安全であり；３）等価用量のＡＳＡおよび５−ＡＳＡは全く異なる分子メカニズムを通して作用し、それがＡＳＡと比較した５−ＡＳＡの作用の特異性を立証することを示す。

【0040】

参考文献

【0041】

【0042】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】