特許 6343604 ＢＣＮ基を含むアミノ酸をコードする直交性コドンと、直交性ＰｙｌＲＳ合成酵素とを使用して、ＢＣＮ基を含むアミノ酸をポリペプチドに取り込む方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6343604

(24)【登録日】2018年5月25日

(45)【発行日】2018年6月13日

(54)【発明の名称】ＢＣＮ基を含むアミノ酸をコードする直交性コドンと、直交性ＰｙｌＲＳ合成酵素とを使用して、ＢＣＮ基を含むアミノ酸をポリペプチドに取り込む方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/00 20060101AFI20180604BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20180604BHJP

   C07C 271/22 20060101ALI20180604BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180604BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/00ZNA

   C12P21/00 C

   C07C271/22CSP

   C12N15/09 Z

【請求項の数】13

【全頁数】58

(21)【出願番号】特願2015-512124(P2015-512124)

(86)(22)【出願日】2013年5月15日

(65)【公表番号】特表2015-523965(P2015-523965A)

(43)【公表日】2015年8月20日

(86)【国際出願番号】GB2013051249

(87)【国際公開番号】WO2013171485

(87)【国際公開日】20131121

【審査請求日】2016年2月29日

(31)【優先権主張番号】1208875.3

(32)【優先日】2012年5月18日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】1210303.2

(32)【優先日】2012年6月8日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】503276997

【氏名又は名称】メディカル リサーチ カウンシル

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100102255

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤 誠次

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100188352

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 一弘

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100177714

【弁理士】

【氏名又は名称】藤本 昌平

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100198074

【弁理士】

【氏名又は名称】山村 昭裕

(72)【発明者】

【氏名】チン ジェイソン

(72)【発明者】

【氏名】ラング キャスリン

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／１３６６４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Am. Chem. Soc., 2011年，Vol.133,，p.10708-10711

【文献】 Nat. Chem., 2012年2月，Vol.4, No.4，p.298-304

【文献】 Angew. Chem. Int. Ed., 2010年，Vol.49，p.9422-9425

【文献】 Biomacromolecules, 2011年，Vol.12，p.3692-3697

【文献】 Angew. Chem. Int. Ed., 2012年3月，Vol.51，p.4166-4170

【文献】 J. Am. Chem. Soc., 2012年（Published December 16, 2011)，Vol.134，p.792-795

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ０７Ｃ ２７１／２２

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ ２１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）基を有するアミノ酸を含むポリペプチドであって、
前記ＢＣＮ基が、リシンアミノ酸の残基として存在し、かつテトラジン基に連結されている、
前記ポリペプチド。

【請求項2】

ポリペプチドに、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）基を含むアミノ酸を遺伝学的に取り込むことを含む、ＢＣＮ基を含むポリペプチドの生成方法であって、
ポリペプチドの生成が、
（ｉ）ＢＣＮ基を有するアミノ酸をコードする直交性コドンを含む、前記ポリペプチドをコードする核酸を提供すること；
（ii）前記直交性コドンを認識できる直交性ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対の存在下で前記核酸を翻訳し、ＢＣＮ基を有する前記アミノ酸をポリペプチド鎖に取り込むこと
を含み、
前記ＢＣＮ基を含むアミノ酸が、ＢＣＮリシンである、
前記方法。

【請求項3】

直交性コドンが、アンバーコドン（ＴＡＧ）を含み、ｔＲＮＡが、ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡを含み、ＢＣＮ基を有するアミノ酸が、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）リシンを含み、ｔＲＮＡ合成酵素が、変異Ｙ２７１Ｍ、Ｌ２７４Ｇ、及びＣ３１３Ａ（ＢＣＮＲＳ）を有するＰｙｌＲＳ合成酵素を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

ＢＣＮ基を有するアミノ酸が、野生型ポリペプチド中のリシン残基に対応する位置に取り込まれる、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項5】

ＢＣＮ基を有するアミノ酸が、野生型ポリペプチド中のリシン残基に対応する位置に取り込まれる、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項6】

テトラジン基がさらにフルオロフォアに連結されている、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項7】

フルオロフォアが、フルオレセイン、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）又はホウ素ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）を含む、請求項６に記載のポリペプチド。

【請求項8】

ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）リシン。

【請求項9】

構造：

【化1】

を有する、請求項８に記載のＢＣＮリシン。

【請求項10】

ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）基を有するアミノ酸を含むポリペプチドを提供すること、前記ポリペプチドをテトラジン化合物と接触させてインキュベートすることにより、逆電子要請型ディールス・アルダー付加環化反応によってテトラジンをＢＣＮ基に連結させることを含む、前記テトラジン基を含むポリペプチドの生成方法であって、
前記ＢＣＮ基を有するアミノ酸が、ＢＣＮリシンである、
前記方法。

【請求項11】

テトラジンが、図１の６〜１７から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

テトラジンが、図１の６、７、８、及び９から選択され、反応の擬一次速度定数が、少なくとも８０Ｍ^−１ｓ^−１である、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

テトラジン化合物が、図１の１１及び１７からなる群から選択されるテトラジン化合物である、請求項１０又は１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、（拡張された）遺伝子コードを介したバイオ直交性（bio-orthogonal）基の部位特異的な取り込みに関する。特に本発明は、例えばジエノフィルなどの遺伝学的に取り込まれたアミノ酸基と、例えばテトラジンなどの化学基との加速された逆電子要請型ディールス・アルダー反応によるポリペプチドへの化学基の取り込みに関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子コードの拡張を介したバイオ直交性基の部位特異的な取り込みは、あらゆるプローブでタンパク質を部位特異的に標識付けるための強力な総合戦略を提供する。しかしながら、遺伝学的にコードされ得るバイオ直交性官能基の遅い反応性が、この戦略の有用性を制限してきた。

【0003】

多様なプローブを用いたタンパク質の迅速で部位特異的な標識付けは、化学生物学者にとって未解決の課題であり続けている。酵素介在の標識付けアプローチは迅速かもしれないが、研究中のタンパク質に混乱を生じさせるタンパク質又はペプチド融合を使用しており、標識可能な部位を限定する可能性があり、一方で、構成要素が遺伝学的にコードされ得る「バイオ直交性」反応の多くは、多くの生物学的プロセスを研究するのに有用なタイムスケールで定量的且つ部位特異的なタンパク質の標識付けを達成するには遅すぎる。

【0004】

多様な状況でユーザー定義のプローブを用いてタンパク質を部位特異的に標識する一般的な方法への差し迫った必要性がある。

【0005】

迅速なバイオ直交性反応の重要なクラスとして、ノルボルネンやトランス−シクロオクテンなどの歪みアルケンとテトラジンとの逆電子要請型ディールス・アルダー反応が出現した（Devaraj, N. K.; Weissleder, R.; Hilderbrand, S. A. Bioconjug Chem 2008, 19, 2297、Devaraj, N. K.; Weissleder, R. Acc Chem Res 2011、Blackman, M. L.; Royzen, M.; Fox, J. M. J Am Chem Soc 2008, 130, 13518、Taylor, M. T.; Blackman, M. L.; Dmitrenko, O.; Fox, J. M. Journal of the American Chemical Society 2011, 133, 9646）。これらの反応の一部で報告された速度は極めて速い（Blackman, M. L.; Royzen, M.; Fox, J. M. J Am Chem Soc 2008, 130, 13518、Taylor, M. T.; Blackman, M. L.; Dmitrenko, O.; Fox, J. M. Journal of the American Chemical Society 2011, 133, 9646）。

【0006】

ごく最近、これらの反応を使用してタンパク質を特異的に標識付けるためのアプローチが３つ報告されている。

【0007】

− ２段階法で１３アミノ酸のリポ酸リガーゼタグが結合したタンパク質を標識するために、トランス−シクロオクテン基質を受容するリポ酸リガーゼバリアントが使用されている（Liu, D. S.; Tangpeerachaikul, A.; Selvaraj, R.; Taylor, M. T.; Fox, J. M.; Ting, A. Y. Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 792）。

【0008】

− テトラジンを、遺伝子コードの拡張を介して大腸菌（E. coli）で発現されるタンパク質中の特異的部位に導入して、歪みトランス−シクロオクテン−ジアセチルフルオレセインで誘導体化している（Seitchik, J. L.; Peeler, J. C.; Taylor, M. T.; Blackman, M. L.; Rhoads, T. W.; Cooley, R. B.; Refakis, C.; Fox, J. M.; Mehl, R. A. Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 2898）。

【0009】

− 遺伝子コードの拡張に加えて、インビトロで、大腸菌中で、さらには哺乳動物細胞上でテトラジンフルオロフォアを用いて部位特異的に蛍光発生標識することによって、歪みアルケン（ノルボルネン含有アミノ酸）を取り込むことが実証されている（Lang, K.; Davis, L.; Torres-Kolbus, J.; Chou, C.; Deiters, A.; Chin, J. W. Nature chemistry 2012, 4, 298）。また近年ではノルボルネン含有アミノ酸の取り込みも報告されている（Kaya, E.; Vrabel, M.; Deiml, C.; Prill, S.; Fluxa, V. S.; Carell, T. Angewandte Chemie 2012, 51, 4466、Plass, T.; Milles, S.; Koehler, C.; Szymanski, J.; Mueller, R.; Wiessler, M.; Schultz, C.; Lemke, E. A. Angew Chem Int Edit 2012, 51, 4166）。

【0010】

固定細胞中で、ある種の蛍光標識を検出したところ、トランス−シクロオクテン（cycclooctene）含有アミノ酸（ＴＣＯ）（２）取り込みの効率が低かったことが報告されている（Plass, T.; Milles, S.; Koehler, C.; Szymanski, J.; Mueller, R.; Wiessler, M.; Schultz, C.; Lemke, E. A. Angew Chem Int Edit 2012, 51, 4166）。

【0011】

有機溶媒中でのモデル反応を用いた近年の研究によれば、ＢＣＮ（アジ化物との歪み促進反応（strain promoted reactions）で最初に説明された）（Dommerholt, J.; Schmidt, S.; Temming, R.; Hendriks, L. J. A.; Rutjes, F. P. J. T.; van Hest, J. C. M.; Lefeber, D. J.; Friedl, P.; van Delft, F. L. Angew Chem Int Edit 2010, 49, 9422）とテトラジンとの反応は、極めて迅速に進行する可能性があることが示唆されている（Chen, W. X.; Wang, D. Z.; Dai, C. F.; Hamelberg, D.; Wang, B. H. Chem Commun 2012, 48, 1736）。しかしながら、この反応は、それよりもかなり遅い単純なシクロオクチンと、アジ化物、ニトロン（McKay, C. S.; Blake, J. A.; Cheng, J.; Danielson, D. C.; Pezacki, J. P. Chem Commun 2011, 47, 10040、McKay, C. S.; Chigrinova, M.; Blake, J. A.; Pezacki, J. P. Organic & biomolecular chemistry 2012、Ning, X.; Temming, R. P.; Dommerholt, J.; Guo, J.; Ania, D. B.; Debets, M. F.; Wolfert, M. A.; Boons, G. J.; van Delft, F. L. Angewandte Chemie 2010, 49, 3065、Agard, N. J.; Prescher, J. A.; Bertozzi, C. R. Journal of the American Chemical Society 2004, 126, 15046、Sletten, E. M.; Bertozzi, C. R. Accounts of chemical research 2011, 44, 666）、及びテトラジン（Plass, T.; Milles, S.; Koehler, C.; Szymanski, J.; Mueller, R.; Wiessler, M.; Schultz, C.; Lemke, E. A. Angew Chem Int Edit 2012, 51, 4166、Karver, M. R.; Weissleder, R.; Hilderbrand, S. A. Angewandte Chemie 2012, 51, 920）との反応とは異なり、水性媒体中で、又は高分子の標識付けへの化学選択的な経路として調査されてこなかった。

【0012】

本発明は、従来技術に関連する問題（複数可）を克服することに努めている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Devaraj, N. K.; Weissleder, R.; Hilderbrand, S. A. Bioconjug Chem 2008, 19, 2297

【非特許文献2】Devaraj, N. K.; Weissleder, R. Acc Chem Res 2011

【非特許文献3】Blackman, M. L.; Royzen, M.; Fox, J. M. J Am Chem Soc 2008, 130, 13518

【非特許文献4】Taylor, M. T.; Blackman, M. L.; Dmitrenko, O.; Fox, J. M. Journal of the American Chemical Society 2011, 133, 9646

【非特許文献5】Liu, D. S.; Tangpeerachaikul, A.; Selvaraj, R.; Taylor, M. T.; Fox, J. M.; Ting, A. Y. Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 792

【非特許文献6】Seitchik, J. L.; Peeler, J. C.; Taylor, M. T.; Blackman, M. L.; Rhoads, T. W.; Cooley, R. B.; Refakis, C.; Fox, J. M.; Mehl, R. A. Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 2898

【非特許文献7】Lang, K.; Davis, L.; Torres-Kolbus, J.; Chou, C.; Deiters, A.; Chin, J. W. Nature chemistry 2012, 4, 298

【非特許文献8】Kaya, E.; Vrabel, M.; Deiml, C.; Prill, S.; Fluxa, V. S.; Carell, T. Angewandte Chemie 2012, 51, 4466

【非特許文献9】Plass, T.; Milles, S.; Koehler, C.; Szymanski, J.; Mueller, R.; Wiessler, M.; Schultz, C.; Lemke, E. A. Angew Chem Int Edit 2012, 51, 4166

【非特許文献10】Dommerholt, J.; Schmidt, S.; Temming, R.; Hendriks, L. J. A.; Rutjes, F. P. J. T.; van Hest, J. C. M.; Lefeber, D. J.; Friedl, P.; van Delft, F. L. Angew Chem Int Edit 2010, 49, 9422

【非特許文献11】Chen, W. X.; Wang, D. Z.; Dai, C. F.; Hamelberg, D.; Wang, B. H. Chem Commun 2012, 48, 1736

【非特許文献12】McKay, C. S.; Blake, J. A.; Cheng, J.; Danielson, D. C.; Pezacki, J. P. Chem Commun 2011, 47, 10040

【非特許文献13】McKay, C. S.; Chigrinova, M.; Blake, J. A.; Pezacki, J. P. Organic & biomolecular chemistry 2012

【非特許文献14】Ning, X.; Temming, R. P.; Dommerholt, J.; Guo, J.; Ania, D. B.; Debets, M. F.; Wolfert, M. A.; Boons, G. J.; van Delft, F. L. Angewandte Chemie 2010, 49, 3065

【非特許文献15】Agard, N. J.; Prescher, J. A.; Bertozzi, C. R. Journal of the American Chemical Society 2004, 126, 15046

【非特許文献16】Sletten, E. M.; Bertozzi, C. R. Accounts of chemical research 2011, 44, 666

【非特許文献17】Karver, M. R.; Weissleder, R.; Hilderbrand, S. A. Angewandte Chemie 2012, 51, 920

【発明の概要】

【0014】

当業界にはテトラジン化合物をポリペプチドに結合させる所定の技術が存在する。しかしながら、このような技術は反応速度が遅いという欠点がある。さらにこのような技術は、反応生成物として複数の化学種の生成を可能にする。これは、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析にとって問題を起こす可能性がある色素基間の分子距離が変わりやすいという問題を引き起こす可能性がある。また、生成物の不均質性は治療剤分子の分野において欠点となり得ることから、これは治療剤分子の生成にとっても問題となる可能性がある。

【0015】

本発明者らは、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）基を有する新しいアミノ酸を提供している。これにより反応速度を劇的に増加させることができ、このような増加は有利である。加えて、これにより単一生成物の付加反応が実行されるようになる。これにより均一な生成物が生じ、これは利点となる。またそれにより生成物中の異性体種（立体異性体）も除去されることから、本明細書で実証されるような様々な用途で技術的な利点がもたらされる。加えて、ＢＣＮ付加反応の生成物はエピマー化しないが、それに対して（例えば）ノルボルネン及び／又はＴＣＯ反応からの生成物はエピマーを生じさせる。したがって、エピマーの問題が回避されることも本発明の利点である。

【0016】

したがって、一態様において、本発明は、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）基を有するアミノ酸を含むポリペプチドを提供する。これは、（例えば）テトラジン化合物の付加後に単一の反応生成物を提供するという利点を有する。例えばノルボルネン付加又はＴＣＯ付加などの代替技術は、例えば位置異性体又は立体異性体などの様々な異性体を含む生成物の混合物を生じる。この利点の理由の一つは、生成物が同じになるように分子のＢＣＮ部分が鏡映対称を有することであり、それに対してＴＣＯ／ノルボルネンの場合、分子のその部分がキラルであるため、結合が二重結合の「上面」又は「底面」になり得、生成物中に異なる異性体が生じる。

【0017】

したがって、本発明は、ポリペプチドに例えばテトラジン化合物などの追加の基を結合させることに使用される場合、生成物の均一性に関する利点をもたらす。

【0018】

好適には、前記ＢＣＮ基は、リシンアミノ酸（lysine amino acid）の残基として存在する。

【0019】

他の態様において、本発明は、ＢＣＮ基を含むポリペプチドの生成方法に関し、前記方法は、ポリペプチドにＢＣＮ基を含むアミノ酸を遺伝学的に取り込むことを含む。

【0020】

好適には、ポリペプチドの生成は、
（ｉ）ＢＣＮ基を有するアミノ酸をコードする直交性コドンを含む、ポリペプチドをコードする核酸を提供すること；
（ii）前記直交性コドンを認識できる直交性ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対の存在下で前記核酸を翻訳し、ＢＣＮ基を有する前記アミノ酸をポリペプチド鎖に取り込むこと
を含む。

【0021】

好適には、ＢＣＮ基を含む前記アミノ酸は、ＢＣＮリシンである。

【0022】

好適には、前記直交性コドンは、アンバーコドン（ＴＡＧ）を含み、前記ｔＲＮＡは、ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡを含む。好適には、ＢＣＮ基を有する前記アミノ酸は、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）リシン（bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethanol (BCN) lysine）を含む。好適には、前記ｔＲＮＡ合成酵素は、変異Ｙ２７１Ｍ、Ｌ２７４Ｇ、及びＣ３１３Ａ（ＢＣＮＲＳ）を有するＰｙｌＲＳ合成酵素を含む。

【0023】

好適には、ＢＣＮ基を有する前記アミノ酸は、野生型ポリペプチド中のリシン残基に対応する位置に取り込まれる。これは、ＢＣＮ含有ポリペプチドとそれが誘導される野生型ポリペプチドとの可能な限り近い構造的関係を維持するという利点を有する。

【0024】

他の態様において、本発明は、上述したような単一のＢＣＮ基を含むポリペプチドに関する。したがって好適には、ポリペプチドは、単一のＢＣＮ基を含む。これは、ＢＣＮ基に向けられる可能性がある追加のあらゆる化学修飾のための特異性を維持するという利点を有する。例えば、所望のポリペプチド中に単一のＢＣＮ基しか存在しない場合、起こり得る部分的な修飾の問題（例えば、その後ポリペプチド中のＢＣＮ基の一部のみが修飾される場合）、又は同じポリペプチド中の互いに異なるＢＣＮ基間で変動する反応微環境の問題（これは、ポリペプチド中の異なる位置における異なるＢＣＮ基（複数可）間の不均一な反応性に繋がる可能性がある）が有利に回避される。

【0025】

ＢＣＮ基を取り込むことの重要な利点は、例えば標識などの極めて有用な様々な追加の化合物を容易に且つ特異的にＢＣＮ基に結合させることができることである。

【0026】

他の態様において、本発明は、前記ＢＣＮ基がテトラジン基に連結されている、上述したようなポリペプチドに関する。

【0027】

他の態様において、本発明は、前記テトラジン基がさらにフルオロフォアに連結されている、上述したようなポリペプチドに関する。

【0028】

好適には、前記フルオロフォアは、フルオレセイン、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）又はホウ素ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）を含む。

【0029】

他の態様において、本発明は、ＢＣＮ基を含む新規の非天然アミノ酸に関する。

【0030】

他の態様において、本発明は、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）を含むアミノ酸に関する。

【0031】

他の態様において、本発明は、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）リシンであるアミノ酸に関する。

【0032】

好適には、上述したようなＢＣＮリシンは、以下の構造を有する：

【0033】

【化1】

【0034】

他の態様において、本発明は、テトラジン基を含むポリペプチドの生成方法に関し、前記方法は、上述したようなポリペプチドを提供すること、前記ポリペプチドをテトラジン化合物と接触させてインキュベートすることにより、逆電子要請型ディールス・アルダー付加環化反応によってテトラジンをＢＣＮ基に連結させることを含む。

【0035】

好適には、テトラジンは、図１の６〜１７から選択される。

【0036】

好適には、上記反応の擬一次速度定数は、少なくとも８０Ｍ^−１ｓ^−１である。

【0037】

好適には、テトラジンは、図１の６、７、８、及び９から選択され、上記反応の擬一次速度定数は、少なくとも８０Ｍ^−１ｓ^−１である。

【0038】

この化学反応は、反応が速いという利点を有する。

【0039】

好適には、前記反応が、１０分間又は１０分未満の間進行する。

【0040】

好適には、前記反応が、１分間又は１分未満の間進行する。

【0041】

好適には、前記反応が、３０秒間又は３０秒未満の間進行する。

【0042】

所定の反応環境が反応時間に影響を与える可能性があることに留意されたい。最も好適には、最も短い時間、例えば３０秒間又は３０秒未満がインビトロでの反応に適用される。

【0043】

インビボでの反応、又は例えば組織培地又はその他の真核細胞にとって好適な培地などの真核生物用培養条件での反応は、最大の標識付けが達成されるように３０秒よりも長い間行われる必要がある場合がある。熟練した作業者であれば、本明細書で示された指針に基づき試行錯誤することにより最適な反応時間の決定が可能である。

【0044】

好適には、前記テトラジン化合物は、図１の１１及び１７からなる群から選択されるテトラジン化合物である。

【0045】

他の態様において、本発明は、変異Ｙ２７１Ｍ、Ｌ２７４Ｇ、及びＣ３１３Ａを含む、ＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素に関する。

【0046】

好適には、前記ＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素は、変異Ｙ２７１Ｍ、Ｌ２７４Ｇ、及びＣ３１３Ａを含む、ＭｂＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素に対応する配列を有する。

【0047】

他の態様において、本発明は、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）を含むアミノ酸をポリペプチドに取り込むための、本発明のＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素（複数可）の使用に関する。

【0048】

他の態様において、本発明は、本発明のＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素（複数可）を使用してビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）を含むアミノ酸を取り込むことを含む、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）を含むアミノ酸をポリペプチドに取り込む方法に関する。

【0049】

他の態様において、本発明は、上述したような同種の組換えポリペプチドに関する。好適には、前記ポリペプチドは、上述したような方法によって作製される。

【0050】

また、本明細書に記載されている方法（複数可）に従って生成されたポリペプチドも開示される。このようなポリペプチドは、上述の新しい方法による生成物であることに加えて、ＢＣＮを含むという技術的な特色を有する。

【0051】

変異を導入することは、当業界におけるその通常の意味を有し、言及された残基、モチーフ若しくはドメインの置換、トランケーション、又は欠失を指す場合がある。変異は、例えば変異した配列を有するポリペプチドの合成によってポリペプチドレベルで実行されてもよいし、又は例えば変異した配列をコードする核酸を作製することによってヌクレオチドレベルで実行されてもよく、その後その核酸を翻訳して変異したポリペプチドを生成してもよい。所与の変異部位について置換のためのアミノ酸としてのアミノ酸が特定されていない場合、好適には前記部位のランダム化が使用される。デフォルトの変異として、アラニン（Ａ）が使用される可能性がある。好適には、特定の部位（複数可）で使用される変異は、本明細書に記載された通りである。

【0052】

フラグメントは、長さが、好適には少なくとも１０アミノ酸、好適には少なくとも２５アミノ酸、好適には少なくとも５０アミノ酸、好適には少なくとも１００アミノ酸、好適には少なくとも２００アミノ酸、好適には少なくとも２５０アミノ酸、好適には少なくとも３００アミノ酸、好適には少なくとも３１３アミノ酸であるか、又は好適には所望のポリペプチドの大部分である。

【発明を実施するための形態】

【0053】

本明細書において本発明者らは、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）とテトラジンとの蛍光発生反応を実証する。これらの反応の速度は、多くの「バイオ直交性」反応に関する速度よりも３〜７桁速い。本発明者らは、大腸菌中で、さらには哺乳動物細胞中で発現されるタンパク質にＢＣＮ含有アミノ酸１、及びトランスシクロオクテン含有アミノ酸２（これもテトラジンと極めて迅速に反応する）を効率的に部位特異的に取り込むための、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対及びそれらの使用を説明する。本発明者らは、第一の測定可能なタイムポイントで（数秒又は数分後に）、インビトロで、大腸菌中で、さらには生きた哺乳動物細胞中で、１及び２を含有するタンパク質が部位特異的に蛍光発生標識で標識されることを証明する。さらに本発明者らは、プロテオームに関するテトラジンによる標識付けの特異性、加えて構成要素がコード可能な現行の「バイオ直交性」反応に関する本アプローチの利点を証明する。開発されたアプローチは、動物における部位特異的なタンパク質の標識付けに適用してもよく、さらにこれらは、標識付け及びイメージング研究においても有用性が見出されている。

【0054】

ジエノフィル基を有するアミノ酸を含むポリペプチドは、前記ジエノフィル基がビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）基を含むことを特徴とする。

【0055】

本発明者らは、インビトロで、生きた哺乳動物細胞中で、蛍光を発生するディールス・アルダー反応によりタンパク質を部位特異的に標識付けするために、ビシクロノニン及びトランス−シクロオクテンを遺伝学的にコードすることを説明する。

【0056】

本発明の方法は、インビボで実施してもよいし、又はインビトロで実施してもよい。

【0057】

一実施形態において、好適には、本発明の方法は、ヒト又は動物の体に適用されない。好適には、本発明の方法は、インビトロでの方法である。好適には、本方法は、ヒト又は動物の体の存在を必要としない。好適には、本方法は、ヒト又は動物の体の診断方法又は外科手術方法又は治療方法ではない。

【0058】

ジエノフィル／トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）の態様
広範な態様において、本発明は、テトラジン基と反応できるジエノフィル基を有するアミノ酸を含むポリペプチドに関する。

【0059】

好適には、前記ジエノフィル基は、リシンアミノ酸の残基として存在する。

【0060】

一実施形態において、本発明は、ジエノフィル基を含むポリペプチドの生成方法に関し、前記方法は、ジエノフィル基を含むアミノ酸をポリペプチドに遺伝学的に取り込むことを含む。

【0061】

好適には、ポリペプチドの生成は、
（ｉ）ジエノフィル基を有するアミノ酸をコードする直交性コドンを含む、ポリペプチドをコードする核酸を提供すること；
（ii）前記直交性コドンを認識できる直交性ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対の存在下で前記核酸を翻訳し、ジエノフィル基を有する前記アミノ酸をポリペプチド鎖に取り込むこと
を含む。好適には、ジエノフィル基を含む前記アミノ酸は、ジエノフィルリシン（dienophile lysine）である。

【0062】

好適には、前記直交性コドンが、アンバーコドン（ＴＡＧ）を含み、前記ｔＲＮＡが、ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡを含み、ジエノフィル基を有する前記アミノ酸が、トランス−シクロオクテン−４−オール（ＴＣＯ）含有アミノ酸を含み、前記ｔＲＮＡ合成酵素が、変異Ｙ２７１Ａ、Ｌ２７４Ｍ、及びＣ３１３Ａを有するＰｙｌＲＳ合成酵素（ＴＣＯＲＳ）を含む。

【0063】

好適には、前記ＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素は、変異Ｙ２７１Ａ、Ｌ２７４Ｍ、及びＣ３１３Ａを含む、ＭｂＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素（ＴＣＯＲＳ）に対応する配列を有する。他の態様において、本発明は、トランス−シクロオクテン−４−オール（ＴＣＯ）を含むアミノ酸をポリペプチドに取り込むための、本発明のＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素（複数可）の使用に関する。

【0064】

他の態様において、本発明は、本発明のＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素（複数可）を使用してトランス−シクロオクテン−４−オール（ＴＣＯ）を含むアミノ酸を取り込むことを含む、トランス−シクロオクテン−４−オール（ＴＣＯ）を含むアミノ酸をポリペプチドに取り込む方法に関する。

【0065】

本明細書で論じられる非天然アミノ酸にテトラジン化合物を連結させることに関する本発明の態様は、文脈によって特に他の指定がない限り、ＢＣＮアミノ酸に適用されるのと同等にＴＣＯアミノ酸にも適用される。

【0066】

本発明者らは、室温での水性条件下における、ＢＣＮと様々なテトラジンとの、特別に迅速な蛍光発生反応を報告する。ＢＣＮ−テトラジン反応の速度定数は、ノルボルネンと同じテトラジンとの反応の速度定数よりも５００〜１０００倍大きい。ＴＣＯ−テトラジン反応の速度定数は、ＢＣＮと同じテトラジンとの反応の速度定数よりも１０〜１５倍大きい。歪みアルケンとテトラジンとの反応により、ジアステレオマー及び位置異性体の混合物、加えてジヒドロピリダジンの異性化による異性体が生じる可能性がある（Blackman, M. L.; Royzen, M.; Fox, J. M. J Am Chem Soc 2008, 130, 13518、Taylor, M. T.; Blackman, M. L.; Dmitrenko, O.; Fox, J. M. Journal of the American Chemical Society 2011, 133, 9646）。

【0067】

それに対して、ＢＣＮとテトラジンとの反応により、単一の生成物の形成が起こる。これは、単一分子分光法、及びＦＲＥＴアプローチなどのプローブ結合の方向における均一性が重要となり得るような用途において利点となる可能性がある。

【0068】

本発明者らは、大腸菌中で、さらには哺乳動物細胞中でタンパク質に１及び２を効率的に部位特異的に取り込ませるための、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対及びそれらの使用を説明している。

【0069】

本発明者らは、タンパク質の特異的且つ定量的な標識付け、すなわちコードされたノルボルネンを用いた場合は数十分から数時間かかる過程（Lang, K.; Davis, L.; Torres-Kolbus, J.; Chou, C.; Deiters, A.; Chin, J. W. Nature chemistry 2012, 4, 298）や、アルキンプローブでの銅触媒によるクリックケミストリーによりコードされたアジ化物を用いた場合は数十時間かかる過程（Nguyen, D. P.; Lusic, H.; Neumann, H.; Kapadnis, P. B.; Deiters, A.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2009, 131, 8720）は、コードされたアミノ酸１及び２を使用すれば数秒以内に完了できることを実証している。本発明者らは、シクロオクチンを用いて哺乳動物細胞表面上のＥＧＦＲに取り込まれたアジ化物の標識付けを観察していないが（Lang, K.; Davis, L.; Torres-Kolbus, J.; Chou, C.; Deiters, A.; Chin, J. W. Nature chemistry 2012, 4, 298）、ＥＧＦＲ中のコードされたノルボルネンの標識付けにより、わずか２時間後にテトラジンでの標識付けが可能になり（Lang, K.; Davis, L.; Torres-Kolbus, J.; Chou, C.; Deiters, A.; Chin, J. W. Nature chemistry 2012, 4, 298）、ナノモル濃度のテトラジン−色素コンジュゲートを使用して測定された第一のタイムポイント（２分）でＥＧＦＲを取り込んだ１及び２による強く飽和した標識が観察された。これらの実験から、低分子物質を用いた実験で特徴付けられた迅速なＢＣＮ−テトラジンとＴＣＯ−テトラジンとのライゲーションは、多様な状況でのタンパク質の標識における実質的な向上であると解釈できることが確認される。本発明者らは、インビトロでの、大腸菌中での、さらには生きた哺乳動物細胞中でのこのアプローチの利点を実証してきたが、セノラブディティス・エレガンス（C.elegans）においてＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対を使用して非天然アミノ酸を取り込む能力（Greiss, S.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2011）は、本明細書に記載されている標識付けアプローチを動物での部位特異的タンパク質標識付けに発展できる可能性があることを示唆している。

【0070】

遺伝学的な取り込み及びポリペプチドの生成
本発明に係る方法において、前記遺伝学的な取り込みは、好ましくは直交性又は拡張された遺伝子コードを使用しており、この場合、直交性ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を使用することによってＢＣＮ基を有する特異的アミノ酸残基が遺伝学的に取り込まれるように、１又は２以上の特異的な直交性コドンを割り当ててそのような特異的アミノ酸残基をコードしている。直交性ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対は、原則的に、ＢＣＮ基を含むアミノ酸でｔＲＮＡをチャージでき、さらに直交性コドンに応答してそのＢＣＮ基を含むアミノ酸をポリペプチド鎖に取り込むことができればどのような対であってもよい。

【0071】

直交性コドンは、直交性コドンのアンバー、オーカー、オパール又は四つ組コドン（quadruplet codon）であってもよい。コドンは単に、ＢＣＮ基を含むアミノ酸を運搬するのに使用されると予想される直交性ｔＲＮＡに対応してさえいればよい。直交性コドンは、好ましくはアンバーである。

【0072】

本明細書で示される具体的な実施例はアンバーコドンとそれに対応するｔＲＮＡ／ｔＲＮＡ合成酵素を使用していることに留意されたい。上述したように、これらは変更が可能である。或いは、ＢＣＮ基を含むアミノ酸と共に機能し得る代替のｔＲＮＡ／ｔＲＮＡ合成酵素対を使用又は選択する手間をかけることなく他のコドンを使用するためには、ｔＲＮＡのアンチコドン領域を、最適なコドンにとって望ましいアンチコドン領域で単に交換するだけでもよい。アンチコドン領域は、ｔＲＮＡのチャージ又は取り込み機能にもｔＲＮＡ合成酵素による認識にも関与しないため、このような交換は、全体として、熟練した作業者の技術的範囲内である。

【0073】

したがって、代替の直交性ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を必要に応じて使用してもよい。

【0074】

好ましくは、直交性合成酵素／ｔＲＮＡ対は、メタノサルシナ・バーケリ（Methanosarcina barkeri）ＭＳのピロリシンｔＲＮＡ合成酵素（ＭｂＰｙｌＲＳ）及びそれと同源のアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ）である。

【0075】

メタノサルシナ・バーケリのＰｙｌＴ遺伝子は、ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡのｔＲＮＡをコードする。

【0076】

メタノサルシナ・バーケリのＰｙｌＳ遺伝子は、ＭｂＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素タンパク質をコードする。特定のアミノ酸残基が数値アドレスを使用して記述されている場合、その番号付けは、参照配列としてＭｂＰｙｌＲＳ（メタノサルシナ・バーケリのピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素）のアミノ酸配列（すなわち受託番号Ｑ４６Ｅ７７の公共的に利用可能な野生型メタノサルシナ・バーケリのＰｙｌＳ遺伝子によってコードされたものなど）を使用してなされる：
MDKKPLDVLI SATGLWMSRT GTLHKIKHYE VSRSKIYIEM ACGDHLVVNN SRSCRTARAF RHHKYRKTCK RCRVSDEDIN NFLTRSTEGK TSVKVKVVSA PKVKKAMPKS VSRAPKPLEN PVSAKASTDT SRSVPSPAKS TPNSPVPTSA PAPSLTRSQL DRVEALLSPE DKISLNIAKP FRELESELVT RRKNDFQRLY TNDREDYLGK LERDITKFFV DRDFLEIKSP ILIPAEYVER MGINNDTELS KQIFRVDKNL CLRPMLAPTL YNYLRKLDRI LPDPIKIFEV GPCYRKESDG KEHLEEFTMV NFCQMGSGCT RENLESLIKE FLDYLEIDFE IVGDSCMVYG DTLDIMHGDL ELSSAVVGPV PLDREWGIDK PWIGAGFGLE RLLKVMHGFK NIKRASRSES YYNGISTNL。

【0077】

前記配列は、本明細書において以降、配列番号１と注釈が付けられる。

【0078】

必要があれば、当業者は、使用しようとするＢＣＮのアミノ酸にとって最適になるようにＭｂＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素タンパク質に変異を導入することによってそのタンパク質を適合させてもよい。変異の必要性は、使用されるＢＣＮアミノ酸によって判断される。ＭｂＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素を変異させる必要があり得るような例は、ＢＣＮアミノ酸がＭｂＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素タンパク質によって処理されない場合である。

【0079】

このような変異は、ＭｂＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素に、例えばＭｂＰｙｌＲＳのｔＲＮＡ合成酵素中の以下に示す位置：Ｍ２４１、Ａ２６７、Ｙ２７１、Ｌ２７４、及びＣ３１３の１又は２以上に変異を導入することによって実行されてもよい。

【0080】

一例は、ＢＣＮ基を有する前記アミノ酸が、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）リシンを含む場合である。好適には、前記ｔＲＮＡ合成酵素は、例えば変異Ｙ２７１Ｍ、Ｌ２７４Ｇ、及びＣ３１３Ａ（ＢＣＮＲＳ）を有するＭｂＰｙｌＲＳなどのＰｙｌＲＳ合成酵素を含む。

【0081】

一例は、ジエノフィル基を有する前記アミノ酸が、トランス−シクロオクテン−４−オール（ＴＣＯ）含有アミノ酸を含む場合である。好適には、前記ｔＲＮＡ合成酵素は、例えば変異Ｙ２７１Ａ、Ｌ２７４Ｍ、及びＣ３１３Ａを有するＭｂＰｙｌＲＳ（ＴＣＯＲＳ）などのＰｙｌＲＳ合成酵素を含む。

【0082】

ｔＲＮＡ合成酵素
本発明のｔＲＮＡ合成酵素は様々であり得る。実施例では特定のｔＲＮＡ合成酵素配列が使用されているかもしれないが、本発明は、そのような実施例のみに限定されることは意図されない。

【0083】

原則的には、同じｔＲＮＡチャージ（アミノアシル化）機能を備えていればどのようなｔＲＮＡ合成酵素でも本発明で使用される。

【0084】

例えばｔＲＮＡ合成酵素は、あらゆる好適な種に由来するもの、例えば古細菌から、例えばメタノサルシナ・バーケリＭＳ；メタノサルシナ・バーケリ株フサロ（Methanosarcina barkeri str. Fusaro）；メタノサルシナ・マゼイＧｏ１（Methanosarcina mazei Go1）；メタノサルシナ・アセチボランスＣ２Ａ（Methanosarcina acetivorans C2A）；メタノサルシナ・サーモフィラ（Methanosarcina thermophila）；又はメタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）に由来するものであってもよい。或いはｔＲＮＡ合成酵素は、細菌に由来するもの、例えばデスルフィトバクテリウム・ハフニエンスＤＣＢ−２（Desulfitobacterium hafniense DCB-2）；デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスＹ５１；デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスＰＣＰ１；デスルフォトマクルム・アセトキシダンスＤＳＭ７７１（Desulfotomaculum acetoxidans DSM 771）に由来するものであってもよい。

【0085】

これらの生物からの典型的な配列は、公共的に利用可能な配列である。以下の例を、ピロリシンのｔＲＮＡ合成酵素に関する典型的な配列として示す。

【0086】

＞Ｍ．バーケリＭＳ／１〜４１９／
メタノサルシナ・バーケリＭＳ
バージョンＱ６ＷＲＨ６．１ ＧＩ：７４５０１４１１
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL

【0087】

＞Ｍ．バーケリＦ／１〜４１９／
メタノサルシナ・バーケリ株フサロ
バージョンＹＰ＿３０４３９５．１ ＧＩ：７３６６８３８０
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKASTDTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNIAKPFRELESELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRDFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPDPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLESLIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL

【0088】

＞Ｍ．マゼイ／１〜４５４
メタノサルシナ・マゼイＧｏ１
バージョンＮＰ＿６３３４６９．１ ＧＩ：２１２２７５４７
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL

【0089】

＞Ｍ．アセチボランス／１〜４４３
メタノサルシナ・アセチボランスＣ２Ａ
バージョンＮＰ＿６１５１２８．２ ＧＩ：１６１４８４９４４
MDKKPLDTLISATGLWMSRTGMIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGERLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCRHCRVSDEDINNFLTKTSEEKTTVKVKVVSAPRVRKAMPKSVARAPKPLEATAQVPLSGSKPAPATPVSAPAQAPAPSTGSASATSASAQRMANSAAAPAAPVPTSAPALTKGQLDRLEGLLSPKDEISLDSEKPFRELESELLSRRKKDLKRIYAEERENYLGKLEREITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINSDTELSKQVFRIDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLEAIITEFLNHLGIDFEIIGDSCMVYGNTLDVMHDDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRAARSESYYNGISTNL

【0090】

＞Ｍ．サーモフィラ／１〜４７８
メタノサルシナ・サーモフィラ、バージョンＤＱ０１７２５０．１ ＧＩ：６７７７３３０８
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGKLHKIRHHEVSKRKIYIEMECGERLVVNNSRSCRAARALRHHKYRKICKHCRVSDEDLNKFLTRTNEDKSNAKVTVVSAPKIRKVMPKSVARTPKPLENTAPVQTLPSESQPAPTTPISASTTAPASTSTTAPAPASTTAPAPASTTAPASASTTISTSAMPASTSAQGTTKFNYISGGFPRPIPVQASAPALTKSQIDRLQGLLSPKDEISLDSGTPFRKLESELLSRRRKDLKQIYAEEREHYLGKLEREITKFFVDRGFLEIKSPILIPMEYIERMGIDNDKELSKQIFRVDNNFCLRPMLAPNLYNYLRKLNRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLEAIIKDFLDYLGIDFEIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPVPMDRDWGINKPWIGAGFGLERLLKVMHNFKNIKRASRSESYYNGISTNL

【0091】

＞Ｍ．ブルトニイ／１〜４１６
メタノコッコイデス・ブルトニイＤＳＭ６２４２、バージョンＹＰ＿５６６７１０．１ ＧＩ：９１７７４０１８
MEKQLLDVLVELNGVWLSRSGLLHGIRNFEITTKHIHIETDCGARFTVRNSRSSRSARSLRHNKYRKPCKRCRPADEQIDRFVKKTFKEKRQTVSVFSSPKKHVPKKPKVAVIKSFSISTPSPKEASVSNSIPTPSISVVKDEVKVPEVKYTPSQIERLKTLMSPDDKIPIQDELPEFKVLEKELIQRRRDDLKKMYEEDREDRLGKLERDITEFFVDRGFLEIKSPIMIPFEYIERMGIDKDDHLNKQIFRVDESMCLRPMLAPCLYNYLRKLDKVLPDPIRIFEIGPCYRKESDGSSHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENMEALIDEFLEHLGIEYEIEADNCMVYGDTIDIMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGVNKPWMGAGFGLERLLKVRHNYTNIRRASRSELYYNGINTNL

【0092】

＞Ｄ．ハフニエンス＿ＤＣＢ−２／１〜２７９
デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスＤＣＢ−２
バージョンＹＰ＿００２４６１２８９．１ ＧＩ：２１９６７０８５４
MSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEGLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIVDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN

【0093】

＞Ｄ．ハフニエンス＿Ｙ５１／１〜３１２
デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスＹ５１
バージョンＹＰ＿５２１１９２．１ ＧＩ：８９８９７７０５
MDRIDHTDSKFVQAGETPVLPATFMFLTRRDPPLSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEGLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIVDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN

【0094】

＞Ｄ．ハフニエンスＰＣＰ１／１〜２８８
デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス
バージョンＡＹ６９２３４０．１ ＧＩ：５３７７１７７２
MFLTRRDPPLSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEKLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIFDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN

【0095】

＞Ｄ．アセトキシダンス／１〜２７７
デスルフォトマクルム・アセトキシダンスＤＳＭ７７１
バージョンＹＰ＿００３１８９６１４．１ ＧＩ：２５８５１３３９２
MSFLWTVSQQKRLSELNASEEEKNMSFSSTSDREAAYKRVEMRLINESKQRLNKLRHETRPAICALENRLAAALRGAGFVQVATPVILSKKLLGKMTITDEHALFSQVFWIEENKCLRPMLAPNLYYILKDLLRLWEKPVRIFEIGSCFRKESQGSNHLNEFTMLNLVEWGLPEEQRQKRISELAKLVMDETGIDEYHLEHAESVVYGETVDVMHRDIELGSGALGPHFLDGRWGVVGPWVGIGFGLERLLMVEQGGQNVRSMGKSLTYLDGVRLNI

【0096】

ｔＲＮＡ合成酵素に変異を導入することによって特定のｔＲＮＡチャージ（アミノアシル化）機能がもたらされる場合、例えば上記から選択されるものなどの別の野生型ｔＲＮＡ配列を単に使用するだけでは適切ではない場合がある。このような場合、同じｔＲＮＡチャージ（アミノアシル化）機能を保存することが重要であると予想される。これは、例えば上記から選択されるものなどの代替のｔＲＮＡ合成酵素の主鎖に典型的なｔＲＮＡ合成酵素中の変異（複数可）を移動させることによって達成される。

【0097】

このようにして、対応するｔＲＮＡ合成酵素配列、例えば典型的なＭ．バーケリ配列及び／又はＭ．マゼイ配列以外の他の生物からの対応するｐｙｌＳ配列などに、選択された変異を移動させることが可能であると予想される。

【0098】

例えば典型的なＭ．バーケリ配列及び／又はＭ．マゼイ配列などの公知のｔＲＮＡ合成酵素に対するアライメントによって、標的ｔＲＮＡ合成酵素タンパク質／主鎖を選択してもよい。

【0099】

以下、ｐｙｌＳ（ピロリシンｔＲＮＡ合成酵素）配列を参照することによって本発明の主題を例示するが、その原理は所望の特定のｔＲＮＡ合成酵素にも等しく適用される。

【0100】

例えば図６は、全てのＰｙｌＳ配列のアライメントを示す。これらの全体的な配列同一性％は低い可能性がある。したがって、例えば（単に低い配列同一性スコアを使用するのではなく）公知のｔＲＮＡ合成酵素に配列を並べて、使用されている配列が実際にｔＲＮＡ合成酵素であることを確認することによって、配列を研究することが重要である。

【0101】

したがって、好適には、配列同一性を検討する際に、図６で示されるようにｔＲＮＡ合成酵素全体にわたり検討することが好適である。好適には、同一性％は、図６で定義された通りであってもよい。図７は、ｔＲＮＡ合成酵素間の配列同一性示す図表である。好適には、同一性％は、図７で定義された通りであってもよい。

【0102】

触媒領域に焦点を合わせることが有用な場合がある。図８は、まさにその触媒領域を並べたものである。この目的は、高い同一性％を規定することが可能なｔＲＮＡの触媒領域を提供して、同じｔＲＮＡチャージ（アミノアシル化）機能、例えば新しい又は非天然アミノ酸の認識をもたらすために移植させた変異を受け入れるのに好適な主鎖骨格を捕捉／同定することである。

【0103】

したがって、好適には、配列同一性を検討する際に、図８で示されるように触媒領域全体にわたり検討することが好適である。好適には、同一性％は、図８で定義された通りであってもよい。図９は、触媒領域間の配列同一性を示す図表である。好適には、同一性％は、図９で定義された通りであってもよい。

【0104】

変異を代替のｔＲＮＡ合成酵素主鎖に「移動」又は「移植」することは、ｔＲＮＡ合成酵素主鎖をコードするヌクレオチド配列の部位特異的変異誘発によって達成できる。この技術は当業界で周知である。本質的には、主鎖のｐｙｌＳ配列を選択して（例えば上記で論じられた活性部位アライメントを使用して）、選択された変異を対応する位置／相同な位置に移す（すなわちその中に作製する）。

【0105】

特定のアミノ酸残基が数値アドレスを使用して記述されている場合、明確に他の指定がない限り、その番号付けは、参照配列としてＭｂＰｙｌＲＳ（メタノサルシナ・バーケリのピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素）のアミノ酸配列（すなわち受託番号Ｑ４６Ｅ７７の公共的に利用可能な野生型メタノサルシナ・バーケリのＰｙｌＳ遺伝子によってコードされたものなど）を使用してなされる：
MDKKPLDVLI SATGLWMSRT GTLHKIKHYE VSRSKIYIEM ACGDHLVVNN SRSCRTARAF RHHKYRKTCK RCRVSDEDIN NFLTRSTEGK TSVKVKVVSA PKVKKAMPKS VSRAPKPLEN PVSAKASTDT SRSVPSPAKS TPNSPVPTSA PAPSLTRSQL DRVEALLSPE DKISLNIAKP FRELESELVT RRKNDFQRLY TNDREDYLGK LERDITKFFV DRDFLEIKSP ILIPAEYVER MGINNDTELS KQIFRVDKNL CLRPMLAPTL YNYLRKLDRI LPDPIKIFEV GPCYRKESDG KEHLEEFTMV NFCQMGSGCT RENLESLIKE FLDYLEIDFE IVGDSCMVYG DTLDIMHGDL ELSSAVVGPV PLDREWGIDK PWIGAGFGLE RLLKVMHGFK NIKRASRSES YYNGISTNL

【0106】

これを当業界でよく理解されている通りに使用して、所望の残基の位置が決定されるものとする。これは必ずしも厳密な計数作業とは限らず、すなわち状況又はアライメントに注意を払う必要がある。例えば、所望のタンパク質がわずかに異なる長さを有する場合、（例えば）Ｌ２６６に対応するその配列中の正しい残基の位置決定は、単に所望の配列の２６６番目の残基を使用するのではなく、その配列を並べてそれと等価な又はそれに対応する残基を選ぶことを必要とする場合がある。これは十分に、熟練した読者の技術的範囲内である。

【0107】

本明細書で使用される変異の表記法は、当業界において標準的なものである。例えばＬ２６６Ｍは、野生型の配列の２６６位におけるＬに相当するアミノ酸がＭで置き換えられていることを意味する。

【0108】

以下、典型的なＭ．バーケリ及びＭ．マゼイ配列を参照しながら代替のｔＲＮＡ主鎖間の変異の移植を例示するが、他の主鎖への移植又は他の主鎖からの移植にも同じ原理が等しく適用される。

【0109】

例えばＭｂ ＡｃＫＲＳは、ＡｃＫを取り込むための改変された合成酵素である。
親のタンパク質／主鎖：Ｍ．バーケリＰｙｌＳ
変異：Ｌ２６６Ｖ、Ｌ２７０Ｉ、Ｙ２７１Ｆ、Ｌ２７４Ａ、Ｃ３１７Ｆ
ＭｂＰＣＫＲＳ：ＰＣＫを取り込むように加工された合成酵素
親のタンパク質／主鎖：Ｍ．バーケリＰｙｌＳ
変異：Ｍ２４１Ｆ、Ａ２６７Ｓ、Ｙ２７１Ｃ、Ｌ２７４Ｍ

【0110】

同じ基質特異性を有する合成酵素は、これらの変異をＭ．マゼイＰｙｌＳに移植することにより得ることができる。２つの合成酵素の配列相同性は、図１０で見ることができる。したがって、Ｍｂ主鎖からＭｍのｔＲＮＡ主鎖に変異を移植することによって、以下の合成酵素：
Ｍ．マゼイＰｙｌＳに変異Ｌ３０１Ｖ、Ｌ３０５Ｉ、Ｙ３０６Ｆ、Ｌ３０９Ａ、Ｃ３４８Ｆを導入するＭｍのＡｃＫＲＳ、及び
Ｍ．マゼイＰｙｌＳに変異Ｍ２７６Ｆ、Ａ３０２Ｓ、Ｙ３０６Ｃ、Ｌ３０９Ｍを導入するＭｍのＰＣＫＲＳ
の生成が可能である。

【0111】

これらの典型的な変異が移植された合成酵素の全長配列を以下に示す。

【0112】

＞Ｍｂ＿ＰｙｌＳ／１〜４１９
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
＞Ｍｂ＿ＡｃＫＲＳ／１〜４１９
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSGEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMVAPTIFNYARKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFFQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
＞Ｍｂ＿ＰＣＫＲＳ／１〜４１９
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERFGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLSPTLCNYMRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
＞Ｍｍ＿ＰｙｌＳ／１〜４５４
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
＞Ｍｍ＿ＡｃＫＲＳ／１〜４５４
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMVAPNIFNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
＞Ｍｍ＿ＰＣＫＲＳ／１〜４５４
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERFGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLSPNLCNYMRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL

【0113】

同じ原理が他の変異及び／又は他の主鎖にも等しく適用される。

【0114】

望ましい機能／基質特異性が保存されていることを確認するために、この方式で生成された移植されたポリペプチドをテストすることが有利であると予想される。

【0115】

上述した方法のための所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを複製可能な組換えベクターに取り込むことができる。ベクターを使用すれば、適合する宿主細胞中で核酸を複製できる。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入して、ベクターを適合する宿主細胞に導入して、ベクターの複製を引き起こす条件下で宿主細胞を増殖させることによって本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。宿主細胞からベクターを回収してもよい。好適な宿主細胞としては、例えば大腸菌などの細菌が挙げられる。

【0116】

好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によりコード配列を発現させることができる制御配列に機能するように結合しており、すなわちベクターは発現ベクターである。用語「機能するように結合する」とは、記載されている構成要素が、それらの意図した方式でそれらを機能させる関係にあることを意味する。コード配列に「機能するように結合した」調節配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような方式でライゲーションされる。

【0117】

本発明のベクターを、記載されているような好適な宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトして、本発明のタンパク質を発現させてもよい。この過程は、タンパク質をコードするコード配列のベクターによる発現をもたらす条件下で上述したような発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養して、任意選択で発現されたタンパク質を回収することを含んでいてもよい。

【0118】

ベクターは、例えば、複製起点、任意選択で前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、及び任意選択でプロモーターのレギュレーターを備えたプラスミド又はウイルスベクターであってもよい。ベクターは、１つ又は２以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子を含有していてもよい。ベクターは、例えば、宿主細胞をトランスフェクト又は形質転換するのに使用できる。

【0119】

本発明のタンパク質をコードする配列に機能するように結合した制御配列としては、プロモーター／エンハンサー、及び他の発現調節シグナルが挙げられる。これらの制御配列は、発現ベクターがそこで使用されるように設計されている宿主細胞に適合するように選択されてもよい。プロモーターという用語は当業界で周知であり、サイズ及び複雑度が最小のプロモーターから上流の要素及びエンハンサーなどのプロモーターまで様々な核酸領域を包含する。

【0120】

本発明の他の態様は、例えばインビトロにおいて、最適なタンパク質に、好適には真核細胞中に遺伝学的に且つ部位特異的にＢＣＮ含有アミノ酸（複数可）を取り込む方法などの方法である。前記方法による遺伝学的取り込みの利点の１つは、ＢＣＮアミノ酸を含むタンパク質を形成してからそれらを細胞に送達する必要性をなくすことであって、これはなぜなら、この実施形態では、ＢＣＮアミノ酸を含むタンパク質を標的細胞中で直接合成できるためである。本方法は、以下のステップ：
ｉ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列中の望ましい部位において、アンバーコドンなどの直交性コドンを導入するか、又は特定のコドンを、例えばアンバーコドンなどの直交性コドンで置き換えるステップ、
ii）細胞中に、例えばピロリシル（pyrollysyl）−ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対などの直交性ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対の発現系を導入するステップ、
iii）本発明に係るＢＣＮ含有アミノ酸を含む培地中で細胞を増殖させるステップ
を含む。

【0121】

ステップ（ｉ）は、タンパク質の遺伝子配列中の望ましい部位において、特定のコドンを例えばアンバーコドンなどの直交性コドンで置き換えることを必然的に伴う。これは、単に例えばプラスミドなどのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトを導入することだけで達成でき、その場合、ＢＣＮ含有アミノ酸が導入される／置き換えられることが望ましい部位は、例えばアンバーコドンなどの直交性コドンが含まれるように変更される。これは十分に当業者の能力の範囲内であり、このようなものの例を以下に示す。

【0122】

ステップ（ii）は、望ましい位置（例えばアンバーコドン）にＢＣＮ含有アミノ酸を特異的に取り込むための直交性発現系を必要とする。したがって、例えば直交性ピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素などの特異的な直交性ｔＲＮＡ合成酵素と、それに対応する、ＢＣＮ含有アミノ酸で前記ｔＲＮＡを一緒にチャージできる特異的な直交性ｔＲＮＡ対とが必要である。これらの例を本明細書で示す。

【0123】

タンパク質の発現及び精製
本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を使用して、本発明のタンパク質を発現させることができる。本発明のタンパク質の発現をもたらす好適な条件下で宿主細胞を培養してもよい。本発明のタンパク質の発現は、本発明のタンパク質が継続的に生成されるように構成的であってもよいし、又は発現を開始させるための刺激を必要とする誘導型であってもよい。誘導型発現の場合、例えば、例えばデキサメタゾン又はＩＰＴＧなどの誘導物質を培地に添加することによって、必要に応じてタンパク質生成を開始させることができる。

【0124】

本発明のタンパク質は、例えば酵素、化学的及び／又は浸透圧溶解、並びに物理的な破壊などの当業界で公知の様々な技術によって宿主細胞から抽出が可能である。

【0125】

本発明のタンパク質は、例えば分取用クロマトグラフィー、親和性精製又は他のあらゆる好適な技術などの当業界で公知の標準的な技術によって精製が可能である。

【0126】

定義
用語「含む」（comprises、comprise、comprising）は、当業界におけるその通常の意味を有し、すなわち記載された特色又は特色の群が包含されるが、この用語は、それ以外の記載された特色又は特色の群のいずれかが存在することを排除しないと理解されるものとする。

【図面の簡単な説明】

【0127】

【図1】この研究で使用される非天然アミノ酸１〜５及びテトラジン誘導体（６〜１７）の構造式を示す図である。ＴＡＭＲＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、及びＣＦＤＡは、フルオロフォアの一般名称であり、それらの構造式は、補足の図Ｓ４に示される）。

【図2】ＢＣＮ−テトラジン反応の速度論と分光分析による特徴付けを示すグラフである。ａ）反応のストップトフロー速度論；差し込み図は、テトラジン７の５−ノルボルネン−２−オール（Ｎｏｒ）へのコンジュゲーションを示しており、異なるタイムスケールであることに留意すること；条件：ｃ_７＝０．０５ｍＭ、ｃ_ＢＣＮ＝ｃ_Ｎｏｒ＝ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（５５／４５）中の５ｍＭ、２５℃。ｂ）７とＢＣＮとの反応に関する二次速度定数ｋを示すグラフである。ｃ）１１とＢＣＮとの蛍光発生反応を示すグラフである。

【図3】大腸菌中でＢＣＮＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ又はＴＣＯＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対を使用した非天然アミノ酸の遺伝学的にコードされた効率的な取り込みを示す図である。ａ）１５０位にアンバーコドンを有するｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ_６のアミノ酸依存性過剰発現を示す。抗Ｈｉｓ_６抗体を使用して溶解産物中の発現されたタンパク質を検出した。ｂ）クーマシー染色されたゲルは、精製したタンパク質を示す。ｃ−ｅ）アミノ酸取り込みの質量分析を示すグラフである：ｓｆＧＦＰ−１−Ｈｉｓ_６、実測値：２８０１７．５４Ｄａ、計算値：２８０１７．６２Ｄａ；ｓｆＧＦＰ−２−Ｈｉｓ_６、実測値：２７９９３．３６Ｄａ、計算値：２７９９２．８２Ｄａ；本文で記載されているようにして３の存在下で生成されたｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ_６、実測値：２８０１９．３４Ｄａ、計算値：２８０１９．６３Ｄａ。全ての質量スペクトルにおける比較的小さい不明瞭なピークは、Ｎ末端メチオニンのタンパク質分解的切断に相当する１３１Ｄａの損失を示す。

【図4】テトラジン−フルオロフォアを用いた迅速且つ特異的な組換えタンパク質の標識付けを示すグラフである。ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル内蛍光により実証された、テトラジン−色素コンジュゲート１１（１０等量）を用いた１、２、及び４を有するｓｆＧＦＰの特異的な標識付けを示す。３の存在下で生成されたｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ_６については、化学量論を下回る極めてわずかな標識付けしか見られない。ｂ）１を用いたｓｆＧＦＰ−１の定量的な標識付けを、ＥＳＩ−ＭＳにより実証したグラフである（バイオコンジュゲーション（bioconjugation）前（青色のスペクトル、実測値：２８０１８．１±２Ｄａ、計算値：２８０１７．６Ｄａ）及びバイオコンジュゲーション後（赤色のスペクトル、実測値：２８８２４．２±２Ｄａ、計算値：２８８２３．２Ｄａ））。ｃ）１１を用いたｓｆＧＦＰ−２の定量的な標識付けを、ＥＳＩ−ＭＳにより実証したグラフである（バイオコンジュゲーション前（青色のスペクトル、実測値：２７９９３．２±２Ｄａ、計算値：２７９９２．８Ｄａ）及びバイオコンジュゲーション後（赤色のスペクトル、実測値：２８７９９．４±２Ｄａ、計算値：２８７９９．１Ｄａ））。ｄ）ＭＳでは１１を用いた（３の存在下で発現された）ｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ_６の標識付けは検出できなかったことを示すグラフである。ｅ）部位特異的に取り込まれたアミノ酸１及び２を含有するタンパク質の極めて迅速な標識付けを示すグラフである。ｓｆＧＦＰ−１（左）及びｓｆＧＦＰ−２（中央）は１１で定量的に標識されるが、その場合、ゲルをローディングするのには数秒しかかからないが、同じ条件下でｓｆＧＦＰ−４を完全に標識するには１時間かかる（右）。

【図5】哺乳動物細胞中のタンパク質への１及び２の部位特異的な取り込みと、１１を用いた細胞表面及び細胞内哺乳動物タンパク質の迅速且つ特異的な標識付けとを示すグラフである。ａ）ウェスタンブロットから、全長ｍＣｈｅｒｒｙ（ＴＡＧ）ｅＧＦＰ−ＨＡの発現は、１又は２及びｔＲＮＡ_ＣＵＡの存在に依存することが実証される。ＢＣＮＲＳ、ＴＣＯＲＳは、ＦＬＡＧタグを有する。ｂ）生きた哺乳動物細胞中の細胞表面タンパク質の特異的且つ超迅速な標識付けを示す写真である。トランスフェクトされた細胞の膜において、１２８位に１、２又は５を有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが緑色蛍光として観察できる（左のパネル）。１１（４００ｎＭ）を用いた細胞の処置により、１又は２を含有するＥＧＦＲが選択的に標識される（中央のパネル）。右のパネルは、緑色蛍光画像と赤色蛍光画像とを統合したものを示し、ＤＩＣは微分干渉コントラストである。１１を添加してから２分後に細胞を画像化した。ｃ）生きた哺乳動物細胞中の核タンパク質の特異的且つ迅速な標識付けを示す写真である。トランスフェクトされた細胞の核中で、Ｊｕｎ−１−ｍＣｈｅｒｒｙが赤色蛍光として観察できる（左のパネル）。細胞透過性のテトラジン色素１７（２００ｎＭ）を用いた細胞の処置により、ｊｕｎ−１−ｍＣｈｅｒｒｙが選択的に標識される（中央のパネル）。右のパネルは、赤色蛍光と緑色蛍光とを統合したものを示す。ｊｕｎ−５−ｍＣｈｅｒｒｙを有する細胞の標識付けは観察されなかった。

【図6】ＰｙｌＳ配列のアライメントを示す図である。

【図7】ＰｙｌＳ配列の配列同一性を示す図である。

【図8】ＰｙｌＳ配列の触媒ドメインのアライメントを示す図である（３５０から４８０；図６のアライメントに基づく番号付け）。

【図9】ＰｙｌＳ配列の触媒ドメインの配列同一性を示す図である。

【図10】Ｍ．バーケリＰｙｌＳ又はＭ．マゼイＰｙｌＳをベースとして変異が移植された合成酵素のアライメントを示す図である。赤色の星印は、変異した位置を示している。

【図11】スキーム１を示す図である。本発明者らは、インビトロでの、大腸菌中での、さらには哺乳動物細胞中での非天然アミノ酸１及び２の、合成、遺伝学的なコード化、及び蛍光発生による標識付けを実証する。

【図12】（補足の図Ｓ１）対応するテトラジン（６、７、９、及び８）とＭｅＯＨ中の２等量のＢＣＮ（約４／１のエキソ／エンド混合物）との反応からのピリダジン生成物（６−ＢＣＮ、７−ＢＣＮ、９−ＢＣＮ、８−ＢＣＮ）の形成を示すＬＣ／ＭＳの軌跡（２５４ｎｍ）を示すグラフである。全ての質量はダルトンで示される。反応物を室温で１０〜３０分インキュベートした後、ＨＰＬＣの軌跡をとった。ピリダジン生成物への変換に関する総体的な収量は９８％を超えていた。

【図13】（補足の図Ｓ２）ストップトフローデバイスを使用したＵＶ分光分析による様々なテトラジンとＢＣＮとの反応の速度定数ｋの決定を示すグラフである。（ａ）ＢＣＮ添加時の化合物６の３２０ｎｍにおけるＵＶ吸光度の応答（１００等量＝５ｍＭ）；データを単一指数方程式にフィッティングさせることによって、ｋ’値を決定した（左のパネル）；各測定を３〜５回実行し、観察された速度ｋ’の平均をＢＣＮの濃度に対してプロットして、プロットの傾きから速度定数ｋを得た。４種全てのテトラジンに関して完全な測定のセットを二連で行い（中央及び右のパネル）、補足の表１に値の平均を報告する。（ｂ−ｄ）（ａ）と同様のテトラジン７、９及び８に関するグラフである。条件：ｃ_{テトラジン}＝９／１のＨ_２Ｏ／ＭｅＯＨ中の０．０５ｍＭ、ｃ_ＢＣＮ＝ＭｅＯＨ中の０．５〜５ｍＭ、その結果、最終的な５５／４５ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ混合物を得た。全ての実験を２５℃で記録した。

【図14】（補足の図Ｓ３）ストップトフローデバイスを使用したＵＶ分光分析によるテトラジン６及び７とＴＣＯとの反応の速度定数ｋの決定を示すグラフである。（ａ）ＴＣＯ添加時の化合物６の３２０ｎｍにおけるＵＶ吸光度の応答（１００等量＝５ｍＭ）；データを２つの単一指数方程式の合計にフィッティングさせることによって、迅速な単一指数方程式に関するｋ’値を決定した（左のパネル）；各測定を３〜５回実行し、観察された速度ｋ’をＴＣＯの濃度に対してプロットして、プロットの傾きから速度定数ｋを得た。両方のテトラジンに関して完全な測定のセットを少なくとも二連で行い（中央及び右のパネル）、補足の表１に値の平均を報告する。（ｂ）（ａ）と同様のテトラジン７に関するグラフである。条件：ｃ_{テトラジン}＝９／１のＨ_２Ｏ／ＭｅＯＨ中の０．０５ｍＭ、ｃ_ＴＣＯ＝ＭｅＯＨ中の０．５〜５ｍＭ、その結果、最終的な５５／４５ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ混合物を得た。全ての実験を２５℃で記録した。

【図15】（補足の図Ｓ４）この研究で使用される様々なテトラジン−フルオロフォアの構造式を示す図である。これらのテトラジン−フルオロフォアの合成及び特徴付けに関する詳細は参考文献２に見出すことができる。

【図16】（補足の図Ｓ５）９−ヒドロキシメチルビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）と反応するときのテトラジン−フルオロフォアの蛍光の「ターンオン」を示すグラフである。水中の対応するテトラジン−フルオロフォアの２マイクロＭ溶液（ＤＭＳＯ中の２ｍＭ）を３００等量のＢＣＮと反応させた。ＢＣＮ添加前に、及びＢＣＮ添加の３０分後に放出スペクトルを記録した。励起波長：ＴＡＭＲＡ−色素及びＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−Ｘ：５５０ｎｍ；ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ：４９０ｎｍ。

【図17】（補足の図Ｓ６）１５０位にアンバーコドンを有するｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ_６のアミノ酸依存性発現を示すグラフである。抗Ｈｉｓ_６抗体を使用して溶解産物中の発現されたタンパク質を検出した。アミノ酸１の精製したエキソ又はエンドジアステレオマーを使用して、エキソ型がＢＣＮＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡによってｓｆＧＦＰに優先的に取り込まれることを実証した。

【図18】（補足の図Ｓ７）様々なテトラジンを用いたｓｆＧＦＰ−１の標識付け反応のＬＣ−ＭＳによる特徴付けを示すグラフである。黒色のピークは、標識付け前のｓｆＧＦＰ−１の実測された質量を示し、有色のピークは、ｓｆＧＦＰ−１と６、７、９、及び８との反応後に実測された質量を示す。全ての質量はダルトンで示される。全てのテトラジンでの標識付けは、特異的且つ定量的である。反応条件：ｓｆＧＦＰ−１の約１０□Ｍ溶液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中）に、１０等量の対応するテトラジン（メタノール中の１ｍＭストック溶液）を添加し、反応混合物を室温で１０〜３０分インキュベートした。

【図19】（補足の図Ｓ８）ＬＣ−ＭＳが、テトラジンフルオロフォアコンジュゲート１２、１６、１３、及び１４を用いたｓｆＧＦＰ−１の特異的且つ定量的な標識付けを示すことを示すグラフである。赤色のピークは、標識付け前のｓｆＧＦＰ−１の実測された質量を示し、有色のピークは、ｓｆＧＦＰ−１と１２（ａ）、１６（ｂ）、１３（ｃ）、及び１４（ｄ）との反応後に実測された質量を示す。質量の予測値と実測値は、ダルトンで示される。全てのテトラジン−フルオロフォアでの標識付けは、特異的且つ定量的である。反応条件：ｓｆＧＦＰ−１の約１０□Ｍ溶液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中）に、１０等量の対応するテトラジン色素（ＤＭＳＯ中の２ｍＭストック溶液）を添加し、反応混合物を室温で１０〜３０分インキュベートした。

【図20】（補足の図Ｓ９）ｓｆＧＦＰ及び大腸菌プロテオームにおける１及び２の標識付けの特異性を示す図である。クーマシー染色されたゲルは、指定された濃度の非天然アミノ酸１、２、３（エキソ及びエンドジアステレオマーの両方）、及び５の存在下でｓｆＧＦＰを産生する大腸菌からのタンパク質を示す。ゲルの蛍光において、ゲルは、テトラジン−色素コンジュゲート１１による特異的な標識付けを示す。アミノ酸１、２、及び３−エキソは同様のレベルで取り込まれるが（クーマシー染色されたゲル及びウェスタンブロットから判断した場合）、本発明者らは、３−エキソ及び３−エンドの存在下で生成されたｓｆＧＦＰの標識付けは極めてかすかで、化学量論を下回ることを観察している。これらの観察は、インビボでは３中のトランス−アルケンの一部しかそのシス異性体に変換されないことと一致する。

【図21】（補足の図Ｓ１０）ｓｆＧＦＰ及び大腸菌プロテオームにおける１の標識付けの特異性を示すグラフである。レーン１〜５：クーマシー染色されたゲルであり、指定された濃度の非天然アミノ酸１及び５の存在下でｓｆＧＦＰを産生する大腸菌からのタンパク質を示す。レーン６〜１０：抗Ｈｉｓ６抗体を使用して溶解産物中の発現されたタンパク質が検出された。レーン１１〜１５：指定されたフルオロフォア１１で標識されたタンパク質の蛍光画像を示す。

【図22】（補足の図Ｓ１１）テトラジン−フルオロフォアコンジュゲート１１による２分間のＥＧＦＲ−ＧＦＰの特異的且つ超迅速な標識付けを示す写真である。トランスフェクトされた細胞の膜において、１２８位に１を有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが緑色蛍光として観察できる（左のパネル）。１１（４００ｎＭ）で細胞を処置することにより、１を含有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが選択的に標識される（中央のパネル）。右のパネルは、緑色蛍光画像と赤色蛍光画像とを統合したものを示し、ＤＩＣは微分干渉コントラストである。１１を添加してから２分後に細胞を画像化した。同じサンプル中のＥＧＦＲ−ＧＦＰを発現していない細胞については標識付けは観察されず、ＥＧＦＲ−５−ＧＦＰを有する細胞は１１で標識されなかった。

【図23】（補足の図Ｓ１２）テトラジン−フルオロフォアコンジュゲート１１による５分間のＥＧＦＲ−ＧＦＰの特異的且つ超迅速な標識付けを示す写真である。トランスフェクトされた細胞の膜において、１２８位に１を有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが緑色蛍光として観察できる（左のパネル）。１１（４００ｎＭ）で細胞を処置することにより、１を含有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが選択的に標識される（中央のパネル）。右のパネルは、緑色蛍光画像と赤色蛍光画像とを統合したものを示し、ＤＩＣは微分干渉コントラストである。１１を添加してから５分後に細胞を画像化した。同じサンプル中のＥＧＦＲ−ＧＦＰを発現していない細胞については標識付けは観察されず、ＥＧＦＲ−５−ＧＦＰを有する細胞は１１で標識されなかった。

【図24】（補足の図Ｓ１３）テトラジン−フルオロフォアコンジュゲート１１による１０分間のＥＧＦＲ−ＧＦＰの特異的且つ超迅速な標識付けを示す写真である。トランスフェクトされた細胞の膜において、１２８位に１を有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが緑色蛍光として観察できる（左のパネル）。１１（４００ｎＭ）で細胞を処置することにより、１を含有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが選択的に標識される（中央のパネル）。右のパネルは、緑色蛍光画像と赤色蛍光画像とを統合したものを示し、ＤＩＣは微分干渉コントラストである。１１を添加してから１０分後に細胞を画像化した。同じサンプル中のＥＧＦＲ−ＧＦＰを発現していない細胞については標識付けは観察されず、ＥＧＦＲ−５−ＧＦＰを有する細胞は１１で標識されなかった。

【図25】（補足の図Ｓ１４）アミノ酸１を含有するＥＧＦＲ−ＧＦＰの超迅速な標識付けに対して、テトラジン−フルオロフォアコンジュゲート１１でＥＧＦＲ−４−ＧＦＰを有する細胞を特異的に標識するには２時間かかったことを示す写真である（Devaraj, N. K.; Weissleder, R. Acc Chem Res 2011）。トランスフェクトされた細胞の膜において、１２８位に４を有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが緑色蛍光として観察できる（左のパネル）。１１（２００ｎＭ）で細胞を処置することにより、４を含有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが標識される（中央のパネル）。右のパネルは、緑色蛍光画像と赤色蛍光画像とを統合したものを示し、ＤＩＣは微分干渉コントラストである。１１を添加してから２時間後に細胞を画像化した。

【図26】（補足の図Ｓ１５）テトラジン−フルオロフォアコンジュゲート１１を２分で用いたＥＧＦＲ−ＧＦＰの特異的且つ超迅速な標識付けを示す写真である。トランスフェクトされた細胞の膜において、１２８位に２を有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが緑色蛍光として観察できる（左のパネル）。１１（４００ｎＭ）で細胞を処置することにより、２を含有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが選択的に標識される（中央のパネル）。右のパネルは、緑色蛍光画像と赤色蛍光画像とを統合したものを示し、ＤＩＣは微分干渉コントラストである。１１を添加してから２分後に細胞を画像化した。同じサンプル中のＥＧＦＲ−ＧＦＰを発現していない細胞については標識付けは観察されず、ＥＧＦＲ−５−ＧＦＰを有する細胞は１１で標識されなかった。

【図27】（補足の図Ｓ１６）テトラジン−フルオロフォアコンジュゲート１１による５分間のＥＧＦＲ−ＧＦＰの特異的且つ超迅速な標識付けを示す写真である。トランスフェクトされた細胞の膜において、１２８位に２を有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが緑色蛍光として観察できる（左のパネル）。１１（４００ｎＭ）で細胞を処置することにより、２を含有するＥＧＦＲ−ＧＦＰが選択的に標識される（中央のパネル）。右のパネルは、緑色蛍光画像と赤色蛍光画像とを統合したものを示し、ＤＩＣは微分干渉コントラストである。１１を添加してから５分後に細胞を画像化した。同じサンプル中のＥＧＦＲ−ＧＦＰを発現していない細胞については標識付けは観察されず、ＥＧＦＲ−５−ＧＦＰを有する細胞は１１で標識されなかった。

【図28】（補足の図Ｓ１７）哺乳動物細胞における３の部位特異的な取り込みと、テトラジン−フルオロフォアコンジュゲート１１による３０分間及び６０分間でのＥＧＦＲ−ＧＦＰの標識付けとを示す図である。ａ）ウェスタンブロットから、全長ｍＣｈｅｒｒｙ（ＴＡＧ）ｅＧＦＰ−ＨＡの発現は、３又は５及びｔＲＮＡ_ＣＵＡの存在に依存することが実証される。ＢＣＮＲＳ及びＰｙｌＲＳは、ＦＬＡＧタグを有する。ｂ−ｃ）トランスフェクトされた細胞の膜において、１２８位に３が存在するＥＧＦＲ−ＧＦＰは緑色蛍光として観察できる（左のパネル）。１１（４００ｎＭ）で細胞を処置することにより、３を含有するＥＧＦＲ−ＧＦＰ（中央のパネル）がかすかであるが測定可能な標識がなされることを示す写真である。この観察は、哺乳動物細胞において３の一部でのそのシス型に結合したトランス−アルケンの異性化と一致する。右のパネルは、緑色蛍光画像と赤色蛍光画像とを統合したものを示し、ＤＩＣは微分干渉コントラストである。１１を添加してから３０分又は６０分後に細胞を画像化した。同じサンプル中のＥＧＦＲ−ＧＦＰを発現していない細胞については標識付けは観察されなかった。

【図29】（補足の図Ｓ１８）生きた哺乳動物細胞中の核タンパク質の特異的且つ超迅速な標識付けを示す写真である。トランスフェクトされた細胞の核中で、Ｊｕｎ−１−ｍＣｈｅｒｒｙは赤色蛍光として観察できる（左のパネル）。細胞透過性のテトラジン色素１７（２００ｎＭ）を用いた細胞の処置により、ｊｕｎ−１−ｍＣｈｅｒｒｙが選択的に標識される（中央のパネル）。右のパネルは、赤色蛍光と緑色蛍光とを統合したものを示す。ＤＩＣは微分干渉コントラストである。１１を添加してから１５分後に細胞を画像化した。同じサンプル中のｊｕｎ−ｍＣｈｅｒｒｙを発現していない細胞については標識付けは観察されず、ｊｕｎ−５−ｍＣｈｅｒｒｙを有する細胞は１１で標識されなかった。

【0128】

以下、本発明を例を挙げて説明する。これらの実施例は例示的なものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとは意図されない。
［実施例］

【0129】

ここで本発明者らはテトラジンとＢＣＮとの迅速で蛍光を発生する反応を開発し、大腸菌中での、さらには哺乳動物細胞中でのＢＣＮとアミノ酸１及び２を含有するトランスシクロオクテン両方の遺伝学的コード化を実証する。本発明者らは、大腸菌中での、さらには生きた哺乳動物細胞中でのテトラジンプローブを用いたタンパク質の特異的且つ迅速な標識付けを示し、これまでに報告されているバイオ直交性の標識付け戦略（図１１−スキーム１）に関するアプローチの利点を明確に実証する。

【実施例1】

【0130】

化学及び付加反応
様々なジエノフィル（ＢＣＮ、ＴＣＯ（トランス−シクロオクテン−４−オール）、及びｓＴＣＯ（ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−イルメタノール））とテトラジンとの反応の速度定数を決定した（Blackman, M. L.; Royzen, M.; Fox, J. M. J Am Chem Soc 2008, 130, 13518、Taylor, M. T.; Blackman, M. L.; Dmitrenko, O.; Fox, J. M. Journal of the American Chemical Society 2011, 133, 9646、Liu, D. S.; Tangpeerachaikul, A.; Selvaraj, R.; Taylor, M. T.; Fox, J. M.; Ting, A. Y. Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 792、Plass, T.; Milles, S.; Koehler, C.; Szymanski, J.; Mueller, R.; Wiessler, M.; Schultz, C.; Lemke, E. A. Angew Chem Int Edit 2012, 51, 4166、Chen, W. X.; Wang, D. Z.; Dai, C. F.; Hamelberg, D.; Wang, B. H. Chem Commun 2012, 48, 1736）。しかしながら、多くの場合において、研究者は様々なテトラジン、溶媒系又は測定方法を使用してきたことから、各ジエノフィルと所望のテトラジンとの反応性の定量的な比較を難しくしている。本発明者らの初期の実験から、各ジエノフィルとテトラジン６との反応速度（図１）は、擬一次条件下における手作業での混合によって研究するには速すぎることが確認された。それゆえに本発明者らは、これらの反応の擬一次速度定数を直接決定するストップトフロー技術を検討した。メタノール／水（５５／４５）混合物中の１０倍〜１００倍過量のＢＣＮと反応するときの３２０ｎｍにおける吸光度の指数関数的減衰に従って、本発明者らは、ＢＣＮと６及び７との反応の速度定数を決定したところ、それぞれ４３７Ｍ^−１ｓ^−１（＋／−１３）及び１２４５Ｍ^−１ｓ^−１（＋／−４５）であった。ＬＣ−ＭＳ及びＮＭＲから、予想される生成物の形成が確認される（補足の情報及び補足の図１）。同じ条件下で、本発明者らは、ＴＣＯと６及び７との速度定数を決定したところ、それぞれ５２３５Ｍ^−１ｓ^−１（＋／−２５８）及び１７２４８Ｍ^−１ｓ^−１（＋／−３１３２）であった。これらのデータから、ＢＣＮと６との反応は、５−ノルボルネン−２−オールと６との反応よりもおよそ１０００倍速いが（Lang, K.; Davis, L.; Torres-Kolbus, J.; Chou, C.; Deiters, A.; Chin, J. W. Nature chemistry 2012, 4, 298）、一方でＴＣＯの速度は、ＢＣＮの速度よりもおよそ１０〜１５倍速いことが実証される。ｓＴＣＯの速度はストップトフロー技術で正確に測定するには速すぎることから、本発明者らは、ｓＴＣＯの速度は、ＴＣＯの速度よりも少なくとも５０倍速いと推測している。ＢＣＮとテトラジン８及び９との反応でも類似の速度加速が観察された（図１、図２ａ、及び２ｂ、補足の表１、並びに補足の図Ｓ２及びＳ３）。

【0131】

【表1】

【0132】

補足の表１：ストップトフローデバイスを使用して擬一次条件下で測定された２５℃における様々なテトラジン（６、７、９、及び８）とＢＣＮ及びＴＣＯとの反応の速度定数ｋと、２１℃における同じテトラジンと５−ノルボルネン−２−オールとの反応の速度定数との比較（Devaraj, N. K.; Weissleder, R. Acc Chem Res 2011）。少なくとも２つの独立した測定から値を決定した。溶媒系：５５／４５メタノール／水。ＢＣＮのテトラジンへの付加環化反応は、５−ノルボルネン−２−オールの同反応よりも５００〜１０００倍速く、ＴＣＯとテトラジンとの反応は、ＢＣＮとテトラジンとの反応よりも１０〜１５倍速い。

【0133】

１１、１３、１４、及び１６など数種のテトラジンフルオロフォアコンジュゲート（図１、補足の図Ｓ４）において遊離のフルオロフォアを実質的に消光させると、フルオロフォア発光の際に５１０〜５３０ｎｍの吸収最大で近位のテトラジン発色団へのエネルギー移動が起こることが観察される（Lang, K.; Davis, L.; Torres-Kolbus, J.; Chou, C.; Deiters, A.; Chin, J. W. Nature chemistry 2012, 4, 298、Devaraj, N. K.; Hilderbrand, S.; Upadhyay, R.; Mazitschek, R.; Weissleder, R. Angew Chem Int Ed Engl 2010, 49, 2869）。本発明者らは、ＢＣＮとテトラジンフルオロフォアコンジュゲート１１、１３、１４、及び１６との反応により５〜１０倍の蛍光の増加が起こることを発見し、これは、ピリダジン生成物の形成が効率的にフルオロフォアの消光を軽減することを示唆している（図２ｃ及び補足の図Ｓ５）。ＢＣＮとこれらのテトラジンとの蛍光発生反応は、歪みアルケンとこれらのテトラジンとの反応と同様に（Lang, K.; Davis, L.; Torres-Kolbus, J.; Chou, C.; Deiters, A.; Chin, J. W. Nature chemistry 2012, 4, 298、Devaraj, N. K.; Hilderbrand, S.; Upadhyay, R.; Mazitschek, R.; Weissleder, R. Angew Chem Int Ed Engl 2010, 49, 2869）、標識シグナルを最大化にしつつ遊離のテトラジンフルオロフォアから生じる蛍光を最小化するために、イメージング実験に関して有利である。

【実施例2】

【0134】

アミノ酸の設計
次に本発明者らは、インビトロ及び細胞中の両方で多様なプローブを用いてタンパク質を部位特異的に標識付けるために、ＢＣＮ、ＴＣＯ、及びｓＴＣＯを有するアミノ酸を設計し、合成し、遺伝学的にコードすることを試みた。Ｍ．バーケリ（Ｍｂ）及びＭ．マゼイ（Ｍｍ）などのメタノサルシナ種からのピロリシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対及びそれらの進化した誘導体が、アンバーコドンに対応する増え続ける一連の構造的に多様な非天然アミノ酸を部位特異的に取り込ませるのに使用されてきた（Fekner, T.; Li, X.; Lee, M. M.; Chan, M. K. Angew Chem Int Ed Engl 2009, 48, 1633、Nguyen, D. P.; Garcia Alai, M. M.; Kapadnis, P. B.; Neumann, H.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2009, 131, 14194、Nguyen, D. P.; Lusic, H.; Neumann, H.; Kapadnis, P. B.; Deiters, A.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2009, 131, 8720、Nguyen, D. P.; Elliott, T.; Holt, M.; Muir, T. W.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2011, 133, 11418、Neumann, H.; Peak-Chew, S. Y.; Chin, J. W. Nat Chem Biol 2008, 4, 232、Polycarpo, C. R.; Herring, S.; Berube, A.; Wood, J. L.; Soll, D.; Ambrogelly, A. FEBS Lett 2006, 580, 6695、Li, X.; Fekner, T.; Ottesen, J. J.; Chan, M. K. Angew Chem Int Ed Engl 2009, 48, 9184、Wang, Y. S.; Fang, X.; Wallace, A. L.; Wu, B.; Liu, W. R. Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 2950）。ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対は様々な宿主で直交性であり、大腸菌、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、酵母、ヒト細胞、及びＣ．エレガンスなどの増え続ける一連の細胞及び生物での遺伝子コード拡張のために大腸菌中で進化した合成酵素を使用できるようにすることから、ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対は、タンパク質に非天然アミノ酸を取り込むためのおそらく最も万能なシステムとして出現したものである（Lang, K.; Davis, L.; Torres-Kolbus, J.; Chou, C.; Deiters, A.; Chin, J. W. Nature chemistry 2012, 4, 298、Mukai, T.; Kobayashi, T.; Hino, N.; Yanagisawa, T.; Sakamoto, K.; Yokoyama, S. Biochem Biophys Res Commun 2008, 371, 818、Hancock, S. M.; Uprety, R.; Deiters, A.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2010, 132, 14819、Greiss, S.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2011、Lin, S. X.; Zhang, Z. R.; Xu, H.; Li, L.; Chen, S.; Li, J.; Hao, Z. Y.; Chen, P. R. Journal of the American Chemical Society 2011, 133, 20581、Gautier, A.; Nguyen, D. P.; Lusic, H.; An, W.; Deiters, A.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2010, 132, 4086）。本発明者らは、ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対又は進化した誘導体を使用してタンパク質に取り込むことを目的として、非天然アミノ酸１、２、及び３（図１）を設計した。補足の情報で記載されているようにしてアミノ酸を合成した。

【実施例3】

【0135】

ポリペプチドへの遺伝学的な取り込み及びｔＲＮＡ合成酵素
本発明者らは、タンパク質に多様な非天然アミノ酸を部位特異的に取り込むための本発明者らの実験室で事前に作製されたＭｂＰｙｌＲＳのミュータントのパネルと共に、Ｃ末端にヘキサヒスチジン−（Ｈｉｓ_６）タグを有するスーパーフォルダー（superfolder）緑色蛍光タンパク質（ｓｆＧＦＰ）中の１５０位に導入されたアンバーコドンに応答して１、２及び３を取り込ませるそれらの能力に関してＭｂＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対をスクリーニングした。Ｃ末端のＨｉｓ_６タグに対するウェスタンブロットで判断したところ、ＭｂＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対は、テストされたいずれの非天然アミノ酸の取り込みも指示しなかった。しかしながら、酵素活性部位に３つのアミノ酸置換Ｙ２７１Ｍ、Ｌ２７４Ｇ、Ｃ３１３Ａを含有するＭｂＰｙｌＲＳのミュータント（Virdee, S.; Kapadnis, P. B.; Elliott, T.; Lang, K.; Madrzak, J.; Nguyen, D. P.; Riechmann, L.; Chin, J. W. Journal of the American Chemical Society 2011, 133, 10708）（これを本発明者らはＢＣＮ−ｔＲＮＡ合成酵素、ＢＣＮＲＳと名付けた）とＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡ及びｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ_６をコードし１５０位にアンバーコドンを有するプラスミド（psfGFP150TAGPylT-His₆）とを含有する細胞は、抗Ｈｉｓ_６ウェスタンブロット及びクーマシー染色で判断したところ（図３ａ）、全長ｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ_６のアミノ酸依存性合成を引き起こした。１及びそのエンド異性体を使用した追加のタンパク質発現実験から、エキソ型は、ＢＣＮＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡによって優先的にタンパク質に取り込まれることを実証した（補足の図Ｓ６）。本発明者らは、変異Ｙ２７１Ａ、Ｌ２７４Ｍ、及びＣ３１３Ａを有する追加の合成酵素ミュータントを見出し（Virdee, S.; Kapadnis, P. B.; Elliott, T.; Lang, K.; Madrzak, J.; Nguyen, D. P.; Riechmann, L.; Chin, J. W. Journal of the American Chemical Society 2011, 133, 10708）、本発明者らはこれらをＴＣＯ−ｔＲＮＡ合成酵素、ＴＣＯＲＳと名付けた。ＴＣＯＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対は、２の存在下で、psfGFP150TAGPylT-His₆からのｓｆＧＦＰのアミノ酸依存性合成を引き起こした。最後に本発明者らは、ＢＣＮＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対、加えてＴＣＯＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対はいずれも、３の存在下で、psfGFP150TAGPylT-His₆からのｓｆＧＦＰのアミノ酸依存性合成を引き起こすことを見出した。Ｈｉｓ−タグ及びゲル濾過により精製した後、それぞれのアミノ酸でｓｆＧＦＰが優れた収量で単離された（培養液１Ｌ当たり６〜１２ｍｇ、図３ｂ）。これは、５などの他のよく取り込まれた非天然アミノ酸で得られた収量に匹敵する。各非天然アミノ酸の存在下でpsfGFP150TAGPylT-His₆から生成されたｓｆＧＦＰのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）は、それらの部位特異的な取り込みと一致する（図３ｃ〜３ｅ）。

【実施例4】

【0136】

部位特異的な取り込み
テトラジン−色素−プローブが部位特異的に取り込まれた１を有する組換えタンパク質と効率的且つ特異的に反応することを実証するため、本発明者らは、１０等量のテトラジンフルオロフォアコンジュゲート１１で、精製したｓｆＧＦＰ−１−Ｈｉｓ_６を室温で１時間標識した。ＳＤＳ−ｐａｇｅ及びＥＳＩ−ＭＳ分析から、１を含有するｓｆＧＦＰの定量的な標識を確認した（図４ａ及び４ｂ）。対照実験から、ｓｆＧＦＰ−４は、ｓｆＧＦＰ−１を標識するのに使用されるのと同じ条件下で標識され、ｓｆＧＦＰ−５での非特異的な標識は検出されないことを実証した。ＥＳＩ−ＭＳから、ｓｆＧＦＰ−１は、様々なテトラジン６、７、８、及び９（補足の図Ｓ７）で、さらにテトラジンフルオロフォアコンジュゲート１２、１３、１４、及び１６（補足の図Ｓ８）で効率的且つ特異的に誘導体化できることが実証される。また本発明者らは、精製したｓｆＧＦＰ−２−Ｈｉｓ_６は、テトラジンフルオロフォア１１で定量的に標識できる（図４ａ及び４ｃ）ことも実証した。興味深いことに、本発明者らは、３の存在下で増殖させたＴＣＯＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ及びpsfGFP150TAGPylT-His₆を発現する細胞から精製したｓｆＧＦＰ−Ｈｉｓ_６は極めてわずかしか標識されないこと（図４ａ及び４ｄ）、及び精製前のこのタンパク質の標識は化学量論を下回ること（補足の図Ｓ９）を観察している。３の存在下で発現されたｓｆＧＦＰは、３の取り込みに対応する質量を有しているので、これらの観察は、インビボで３のトランス−アルケンの一部がその非反応性のシス異性体に変換されたことと一致する。この異性化は、チオールの存在下で起こることが公知である（Taylor, M. T.; Blackman, M. L.; Dmitrenko, O.; Fox, J. M. Journal of the American Chemical Society 2011, 133, 9646）。

【実施例5】

【0137】

反応の特異性及び選択性
ＢＣＮと様々なテトラジンベースの色素との反応が、細胞環境内で高度に効率的且つ特異的であるだけでなく、高度に選択的でもあることをさらに実証するために、本発明者らは、ｓｆＧＦＰ−１−Ｈｉｓ_６を発現する大腸菌での反応を行った（補足の図Ｓ１０）。様々なレベルで（細胞に添加される１の濃度を調整することによって制御された）ｓｆＧＦＰ−１を発現する細胞をタンパク質発現誘導の４時間後に回収し、ＰＢＳで洗浄し、テトラジン色素１１と共に室温で３０分インキュベートした。未反応のテトラジン−色素を消光させるために過量のＢＣＮを添加した後、細胞を溶解させ、反応混合物を分析した。ゲル内蛍光から、１を有する組換えｓｆＧＦＰは、テトラジンコンジュゲートＴＡＭＲＡ色素１１を用いて特異的に標識されたことが実証された。溶解産物中の多くのタンパク質がｓｆＧＦＰ−１に匹敵する量で存在したが、本発明者らは、極めてわずかなバックグラウンドの標識付けしか生じないことを観察しており、これは、大腸菌プロテオームに関してこの反応は特異的であることを示唆している。

【実施例6】

【0138】

標識速度
低分子物質で観察されたＢＣＮ−及びＴＣＯ−テトラジン付加環化の反応速度が、特別に迅速なタンパク質の標識付けに繋がるかどうかを調査するために、本発明者らは、１、２又は４を有する精製されたｓｆＧＦＰの標識付けを、１０等量のテトラジン−フルオロフォアコンジュゲート１１と比較した。時間の関数としての標識反応のゲル内蛍光イメージング（図４ｅ）から、ｓｆＧＦＰ−４の反応はおよそ１時間で完了することが示される。それに対してｓｆＧＦＰ−１及びｓｆＧＦＰ−２の標識付けは、第一のタイムポイントを測定するためにかかった数秒のうちに完了し、これは、ＢＣＮ−及びＴＣＯ−テトラジン反応の速度加速は、よりいっそう迅速なタンパク質の標識に繋がることを実証している。

【実施例7】

【0139】

哺乳動物細胞への適用
哺乳動物細胞中でのアミノ酸１及び２の取り込みを実証するために、本発明者らは、哺乳動物用に最適化したＭｂＰｙｌＲＳへの１又は２の取り込みを可能にする変異を移植することによって、ＢＣＮＲＳ及びＴＣＯＲＳの哺乳動物用に最適化したバージョンを作製した。ウェスタンブロットによって、本発明者らは、ＢＣＮＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対又はＴＣＯＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡを使用して、１及び２の両方を、哺乳動物細胞中のタンパク質に高効率で遺伝学的にコードできることを実証した（図５ａ）。

【0140】

迅速なＢＣＮ−テトラジンのライゲーションが、哺乳動物細胞上のタンパク質を部位特異的に標識付けることに関して利点をもたらすかどうかを調査するために、本発明者らは、１（０．５ｍＭ）の存在下で培養したＢＣＮＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対を含有するＨＥＫ−２９３細胞中で、１２８位にアンバーコドンを有する上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合体（ＥＧＦＲ（１２８ＴＡＧ）ＧＦＰ）を発現させた。１の存在下で全長ＥＧＦＲ−１−ＧＦＰが生成され、その結果、細胞膜に明るい緑色蛍光が生じた。テトラジン−フルオロフォアコンジュゲートを用いてＥＧＦＲの１２８位（受容体の細胞外ドメイン上にある）で１を標識するために、本発明者らは１１（４００ｎＭ）と共に細胞をインキュベートし、培地を交換し、ＴＡＭＲＡ標識から生じた赤色蛍光、加えて全長ＥＧＦＲ−ＧＦＰの発現から生じた緑色蛍光を画像化した。ＴＡＭＲＡ蛍光は、細胞表面のＥＧＦＲ−ＧＦＰ蛍光と共にうまく局在化した。本発明者らが測定できた第一のタイムポイントの２分以内にＥＧＦＲ−１−ＧＦＰを有する細胞の明確な標識付けが観察され、追加のタイムポイントから、標識付けは２分以内に飽和したことが実証され（図５ｂ及び補足の図Ｓ１１〜Ｓ１４）、テトラジンフルオロフォア１２でも類似の結果が得られた。ＥＧＦＲ−ＧＦＰ融合体に２を取り込むことにより、テトラジンフルオロフォア１１を用いた、同様に迅速且つ効率的な標識が起こった（図５ｂ及び補足の図Ｓ１５〜Ｓ１６）。それに対して、本発明者らが同一な条件下でＥＧＦＲ−４−ＧＦＰを有する細胞の何らかの特異的な標識付けを観察するまで２時間かかった（補足の図Ｓ１４）（Lang, K.; Davis, L.; Torres-Kolbus, J.; Chou, C.; Deiters, A.; Chin, J. W. Nature chemistry 2012, 4, 298）。対照実験において、本発明者らによれば、ＥＧＦＲ−５−ＧＦＰを有する細胞の標識付けも観察されず、さらにＥＧＦＲ−ＧＦＰを発現していない細胞の非特異的な標識付けも検出されなかった。本発明者らは、ＢＣＮＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対及び３の存在下で（ＥＧＦＲ（１２８ＴＡＧ）ＧＦＰ）からのＨＥＫ２９３細胞で発現されるＥＧＦＲ−ＧＦＰの弱いが測定可能な標識付けを観察している（補足の図Ｓ１７）。これらの観察は、哺乳動物細胞中の３の一部の異性化と一致し、さらに本発明者らの大腸菌における観察とも一致する。

【0141】

哺乳動物細胞中での細胞内タンパク質の迅速な標識付けを実証するために、本発明者らは、ＪｕｎＢ（ｊｕｎ）とｍＣｈｅｒｒｙとの間のリンカーにアンバーコドンを有する遺伝子から、転写因子、ｊｕｎをＣ末端ｍＣｈｅｒｒｙ融合体と共に発現させた。アミノ酸１及びＢＣＮＫＲＳ／ｔＲＮＡ_ＣＵＡ対の存在下で、ＨＥＫ細胞中でｊｕｎ−１−ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を産生したところ、予想通りに、細胞の核に局所化した（図５ｃ及び補足の図Ｓ１８）。細胞透過性のジアセチルフルオレセインテトラジンコンジュゲート（２００ｎＭ）での標識付けにより、分析された第一のタイムポイントで（１５分の標識付け、それに続いて９０分の洗浄）ｍＣｈｅｒｒｙシグナルと共にうまく局在化する緑色蛍光が生じた。同じサンプル中のトランスフェクトされていない細胞中又はｊｕｎ−５−ｍＣｈｅｒｒｙを発現する対照細胞中では特異的な標識付けは観察されず、それにより細胞内の標識付けの特異性がさらに確認された。

【0142】

補足の実施例
タンパク質の発現及び精製
ｓｆＧＦＰと取り込まれた非天然アミノ酸１とを共に発現させるために、本発明者らは、大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を、pBKBCNRS（これは、ＭｂＢＣＮＲＳをコードする）及びpsfGFP150TAGPylT-His₆（これは、ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡと、Ｃ末端にヘキサヒスチジンタグを有し１５０位にアンバーコドンを有するｓｆＧＦＰ遺伝子とをコードする）で形質転換した。１ｍｌのＳ．Ｏ．Ｂ培地（０．２％グルコースが補充された）中で３７℃で１時間、細胞を回収し、その後、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びテトラサイクリン（２５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ（１００ｍｌ）中でインキュベートした（１６時間、３７℃、２３０ｒ．ｐ．ｍ）。この一晩培養したもの２０ｍｌを使用して、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びテトラサイクリン（１２μｇ／ｍＬ）が補充された１ＬのＬＢを植え付け、３７℃でインキュベートした。ＯＤ_６００＝０．４〜０．５で、最終濃度が２ｍＭになるまで１の水溶液を添加した。３０分後、最終濃度が０．２％になるまでアラビノースを添加することによりタンパク質発現を誘導した。誘導から３時間後、細胞を遠心分離によって回収し、必要になるまで−８０℃で凍結した。細胞を氷上で融解させ、３０ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１００μｇ／ｍＬのＤＮアーゼＡ、Roche社製のプロテアーゼ阻害剤）に懸濁した。タンパク質を４℃で超音波破砕することによって抽出した。抽出物を遠心分離（２０分、２１．０００ｇ、４℃）によって透明化し、抽出物に６００μＬのＮｉ^２＋−ＮＴＡビーズ（Qiagen社製）を添加し、この混合物を撹拌しながら４℃で１時間インキュベートした。ビーズを遠心分離（１０分、１０００ｇ）によって収集した。ビーズを３０ｍＬの洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）中に３回再懸濁し、１０００ｇで沈降させた。その後、ビーズを１０ｍＬの洗浄緩衝液に再懸濁し、カラムに移した。タンパク質を２００ｍＭイミダゾールが補充された３ｍｌの洗浄緩衝液で溶出させ、HiLoad 16/60 Superdex 75 Prep Gradeカラム（GE Life Sciences社製）を、１ｍＬ／分の流速（緩衝液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で用いたサイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製した。タンパク質を含有する画分をプールし、Amicon Ultra-15 3kDa MWCO遠心フィルターデバイス（Millipore社製）で濃縮した。４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製されたタンパク質を分析し、質量分析によってそれらの質量を確認した（補足の情報を参照）。細胞がpBKTCORS（これは、ＭｂＴＣＯＲＳをコードする）及びpsfGFP150TAGPylT-His₆（これは、ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡと、Ｃ末端にヘキサヒスチジンタグを有し１５０位にアンバーコドンを有するｓｆＧＦＰ遺伝子とをコードする）で形質転換されることを予測して、同じ方式で、２及び３が取り込まれたｓｆＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ−２、ｓｆＧＦＰ−３を調製した。細胞がpBKPylRS（これは、ＭｂＰｙｌＲＳをコードする）及びpsfGFP150TAGPylT-His₆（これは、ＭｂｔＲＮＡ_ＣＵＡと、Ｃ末端にヘキサヒスチジンタグを有し１５０位にアンバーコドンを有するｓｆＧＦＰ遺伝子をコードする）で形質転換されることを予測して、同じ方式で、４及び５が取り込まれたｓｆＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ−４、ｓｆＧＦＰ−５を調製した。精製されたタンパク質の収量は最大６〜１２ｍｇ／Ｌであった。

【0143】

タンパク質の質量分析
6130 Quadrupole分光計を備えたAgilent社製1200LC-MSシステムを使用して、ＥＳＩ−ＭＳを実行した。溶媒系は、緩衝液ＡとしてＨ_２Ｏ中の０．２％ギ酸及び緩衝液Ｂとしてアセトニトリル（ＭｅＣＮ）中の０．２％ギ酸からなっていた。Phenomenex社製Jupiter C4カラム（１５０×２ｍｍ、５μｍ）を使用してタンパク質へのＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを実行し、サンプルをポジティブモードで分析し、続いてタンパク質のＵＶ吸光度を２１４及び２８０ｎｍで分析した。総タンパク質質量をMS Chemstationソフトウェア（Agilent Technologies社製）内のデコンボリューションにより計算した。

【0144】

加えて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ、Micromass社製）を用いたＬＣＴ飛行時間型質量分析計で総タンパク質質量を決定した。タンパク質を２０ｍＭの炭酸水素アンモニウムで再緩衝化し、１％ギ酸を含有するアセトニトリルと１：１で混合した。或いはサンプルをC4 Ziptip（Millipore社製）を用いて調製し、１％ギ酸を含有する５０％水性アセトニトリルに直接注入した。サンプルを１０μＬ／分で注入し、ウマ心臓ミオグロビンを使用したポジティブイオンモードで較正を行った。３０回分のスキャンを平均して、MassLynxバージョン４．１（Micromass社製）を用いて最大エントロピーのデコンボリューションにより分子量を得た。Protparam（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）を使用して野生型タンパク質の理論上の質量を計算し、非天然アミノ酸含有タンパク質の理論上の質量を手動で調整した。

【0145】

テトラジン−ＢＣＮ又はテトラジン−ＴＣＯ付加環化によるタンパク質の標識付け
インビトロでの様々なテトラジンを用いた精製されたタンパク質の標識付け
４０μＬの精製組換えタンパク質（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中に約１０μＭ）にテトラジン化合物６、７、８、又は９のＭｅＯＨ中の１ｍＭ溶液４μＬを添加した（約１０又は２０等量）。室温で３０分インキュベートした後、溶液をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳで分析した（補足の図Ｓ９）。

【0146】

インビトロでのテトラジン及びテトラジン−色素コンジュゲートを用いた精製されたタンパク質の標識付け：
１又は２が部位特異的に取り込まれた精製組換えｓｆＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ−１又はｓｆＧＦＰ−２（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中の約１０μＭ）を、それぞれ１０等量のテトラジン−色素コンジュゲート１１、１２、１３、１４、１５又は１６（ＤＭＳＯ中の２ｍＭ）と共にインキュベートした。溶液を室温でインキュベートし、３０分〜３時間後にアリコートを取り、ＳＤＳ ＰＡＧＥで分析し、C4-ZIPTIPで脱塩した後、ＥＳＩ−ＭＳで分析した。ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルをクーマシーで染色するか、又はTyphoonイメージャーでスキャンして、ゲル内蛍光を可視化した（図４及び補足の図Ｓ８）。

【0147】

インビトロでの時間の関数としてのテトラジン−色素コンジュゲートを用いた精製されたタンパク質の標識付け：
２ｎｍｏｌの精製されたｓｆＧＦＰ−１、ｓｆＧＦＰ−２又はｓｆＧＦＰ−４（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中の１０μＭ）を、２０ｎｍｏｌのテトラジン−色素コンジュゲート１１（ＤＭＳＯ中の２ｍＭ溶液１０μｌ）と共にインキュベートした。この溶液から様々なタイムポイント（０、３０秒、１分、２分、５分、１０分、３０分、１時間、２時間、３時間）で８μＬのアリコートを採取し、７００倍過量のＢＣＮ又はＴＣＯで消光させ、液体窒素に沈めた。サンプルを５％のβ−メルカプトエタノールが補充されたNuPAGE LDSサンプル緩衝液と混合し、１０分で９０℃まで加熱し、４〜１２％のＳＤＳ ｐａｇｅで分析した。Typhoon Trioホスホイメージャー（GE Life Sciences社製）を用いて蛍光バンドをスキャンすることによって標識されたタンパク質の量を定量した。ラバーバンド（rubber band）でのバックグラウンド減算によるImageQuant（商標）TLソフトウェア（GE Life Sciences社製）を使用してバンドを定量した。ゲル内蛍光から、ｓｆＧＦＰ−４の場合、１０等量のテトラジン−フルオロフォア１１を使用したところ標識付けは１時間以内に完了するが（図４ｅ）、それに対してｓｆＧＦＰ−１及びｓｆＧＦＰ−２の標識付けは、第一のタイムポイントを測定するためにかかった数秒のうちに完了したことが示される。

【0148】

テトラジン−色素コンジュゲートを用いた大腸菌プロテオーム全体の標識付け：
psfGFP150TAGPylT-His₆及びpBKBCNRS、又はpsfGFP150TAGPylT-His₆及びpBKPylRSのいずれかを含有する大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を、アンピシリン（pBKBCNRSの場合、１００μｇ／ｍＬ）又はカナマイシン（pBKPylRSの場合、５０μｇ／ｍＬ）、及びテトラサイクリン（２５μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢに植え付けた。細胞を、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩振盪しながらインキュベートした。一晩培養したもの２ｍＬを使用して、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びテトラサイクリン（１２μｇ／ｍＬ）、又はカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）及びテトラサイクリン（１２μｇ／ｍＬ）が補充された１００ｍＬのＬＢに植え付け、３７℃でインキュベートした。ＯＤ_６００＝０．５で、３ｍｌの培養物のアリコートを取り出し、様々な濃度（１ｍＭ、２ｍＭ、及び５ｍＭ）の１及び１ｍＭの５を補充した。３７℃で振盪しながら３０分インキュベートした後、タンパク質の発現を３０μＬの２０％アラビノースの添加により誘導した。３．５時間発現させた後、１ｍＬの細胞懸濁液を遠心分離（１６０００ｇ、５分）することによって細胞を収集した。細胞をＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、再度沈降させ、上清を捨てた。この過程をさらに２回繰り返した。最後に、洗浄した細胞ペレットを１００μＬのＰＢＳに懸濁し、３μＬのテトラジン−色素コンジュゲート１１（ＤＭＳＯ中の２ｍＭ）と共に室温で３０分インキュベートした。未反応のテトラジン−色素を消光させるために２００倍過量のＢＣＮを添加した後、細胞を５％のβ−メルカプトエタノールが補充されたNuPAGE LDSサンプル緩衝液１００μＬに再懸濁し、９０℃で１０分加熱し、１６０００ｇで１０分遠心分離した。未精製の細胞溶解産物を４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、タンパク質レベルを査定した。ゲルをクーマシー染色するか、又はTyphoonイメージャーでスキャンして、蛍光バンドを可視化した（補足の図Ｓ９及びＳ１０）。ヘキサヒスチジンタグ（Cell Signaling Technology社製、Ｈｉｓタグを有する２７Ｅ８マウスｍＡｂ、番号２３６６）に対する抗体を用いてウェスタンブロットを行った。

【0149】

ストップトフローによる低分子物質の付加環化の反応速度定数の決定
ストップトフローデバイスを用いた（Applied Photophysics社製、補足の図Ｓ２及びＳ３及び補足の表１）経時的な３２０、３００又は２８０ｎｍのテトラジンのＵＶ吸光度における指数関数的減衰に従って、１０倍〜１００倍過量のメタノール／水混合物中のＢＣＮ又はＴＣＯを用いて擬一次条件下における様々なテトラジンの速度定数ｋを測定した。各テトラジン（９／１の水／メタノール中の０．１ｍＭ）並びにＢＣＮ及びＴＣＯ（メタノール中の１〜１０ｍＭ）に応じてストック溶液を調製した。測定前に、ストップトフローデバイスのシリンジ中でテトラジンとＢＣＮ及びＴＣＯ溶液の両方を温度調節した。ストップトフロー器具で等量の調製されたストック溶液を混合することにより、０．０５ｍＭのテトラジンの最終濃度と、１０〜１００等量のＢＣＮ又はＴＣＯに相当する０．５〜５ｍＭのＢＣＮ又はＴＣＯの最終濃度を得た。以下の機器パラメーター：波長、６及び７には３２０ｎｍ；８には３００ｎｍ、９には２８０ｎｍ；１秒当たり５００〜５０００のデータポイント）を使用してスペクトルを記録した。全ての測定は２５℃で行われた。ＢＣＮ−テトラジン反応については単一指数方程式にデータをフィッティングし、ＴＣＯ−テトラジン反応については２つの単一指数方程式の合計にデータをフィッティングした。各測定を３〜５回実行し、観察された速度ｋ’の平均（ＴＣＯ−テトラジン反応の場合、第一の指数方程式）をＢＣＮ又はＴＣＯの濃度に対してプロットして、プロットの傾きから速度定数ｋを得た。４種全てのテトラジンに関して完全な測定のセットを二連で行い、補足の表１に値の平均を報告する。全てのデータの加工をKaleidagraphソフトウェア（Synergy Software社製、Reading、UK）を使用して行った。

【0150】

哺乳動物細胞用途のためのクローニング
プラスミドpMmPylS-mCherry-TAG-EGFP-HA（Gautier, A. et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc 132, 4086-8 (2010)、Lang, K. et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature chemistry 4, 298-304 (2012)）及びpMmPylRS-EGFR-（128TAG）-GFP-HA（Lang, K. et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature chemistry 4, 298-304 (2012)）を両方とも酵素AflII及びEcoRV（NEB社製）で消化し、野生型ＭｍＰｙｌＲＳを除去した。ミュータント合成酵素ＭｂＢＣＮＲＳ及びＭｂＴＣＯＲＳの合成遺伝子を、GeneArtによって同じフランキング部位を用いて作製した。また合成ＭｂＢＣＮＲＳ及びＭｂＴＣＯＲＳもAflII及びEcoRVで消化し、野生型合成酵素（ＭｍＰｙｌＳ）の代わりにクローニングした。迅速ライゲーションキット（Roche社製）を使用して、ベクターpMbBCNRS-mCherry-TAG-EGFP-HA、pMbBCNRS-EGFR（128TAG）-GFP-HA、及びpMbTCORS-EGFR（128TAG）-GFP-HAを作製した。ＭｍＰｙｌＲＳをＭｂＢＣＮＲＳに変換することによってpCMV-cJun-TAG-mCherry-MmPylRSプラスミド（Fiona Townsley作製）からpCMV-cJun-TAG-mCherry-MbBCNRSプラスミドを作製した。pMbBCNRS-mCherry-TAG-EGFP-HAプラスミドに関してもこれを実行した。

【0151】

ＨＥＫ２９３細胞におけるアミノ酸１、２、及び３の取り込み
ポリリシンでコーティングしたμ−ディッシュ（Ibidi社製）上でＨＥＫ２９３細胞を平板培養した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でほぼコンフルエンスに増殖させた後、リポフェクトアミン２０００（Life Technologies社製）を使用して、２μｇのpMbBCNRS-EGFR（128TAG）-GFP-HA及び２μｇのp4CMVE-U6-PylT（これは、野生型ピロリシルｔＲＮＡの４つのコピーを含有する）（Gautier, A. et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc 132, 4086-8 (2010)、Lang, K. et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature chemistry 4, 298-304 (2012)）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト後、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ中、３７℃及び５％ＣＯ_２で細胞をそのまま一晩増殖させた。ウェスタンブロット用に、細胞を２４ウェルプレートで平板培養し、ほぼ集密状態に増殖させた。リポフェクトアミン２０００を使用して、pMbBCNRS-mCherry-TAG-EGFP-HA、又はpMmPylRS-mCherry-TAG-EGFP-HA、又はpTCORS-mCherry-TAG-EGFP-HAコンストラクト、及びp4CMVE-U6-PylTプラスミドを細胞にトランスフェクトした。０．５ｍＭの１、１ｍＭの２又は１ｍＭの５の存在下又は非存在下で１６時間増殖させた後、ＲＩＰＡ緩衝液（Sigma社製）を使用して細胞を氷上で溶解させた。溶解産物を沈降させ、上清を４×ＬＤＳサンプル緩衝液（Life technologies社製）に添加した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ニトロセルロースメンブレンに移し、一次ラット抗ＨＡ（Roche社製）及びマウス抗ＦＬＡＧ（Ab frontier社製）を使用してブロットし、ここで二次抗体はそれぞれ抗ラット（Santa Cruz Biotech社製）及び抗マウス（Cell Signaling社製）であった。

【0152】

哺乳動物細胞表面タンパク質の標識付け
ポリリシンでコーティングしたμ−ディッシュ上で細胞を平板培養し、ほぼコンフルエンスに増殖させた後、細胞にそれぞれ２μｇのpMbBCNRS-EGFR（128TAG）-GFP-HA又はpMbTCORS-EGFR（128TAG）-GFP-HA、及びp4CMVE-U6-PylTをトランスフェクトした。０．５ｍＭの１（０．５％ＤＭＳＯ）、１ｍＭの２又は１ｍＭの３の存在下で、３７℃及び５％ＣＯ_２で、０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で８〜１６時間増殖させた後、細胞を０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で洗浄し、次いで０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で一晩インキュベートした。次の日、細胞をもう一度洗浄し、その後４００ｎＭのテトラジン（terazine）−色素コンジュゲート（conjuagate）１１を２〜６０分で添加した。培地を２回交換し、次いで細胞を画像化した。Zeiss社製780レーザースキャニング顕微鏡で、Planアポクロマート６３倍油浸対物レンズ；スキャンの拡大率：１×又は２×；スキャン解像度：５１２×５１２；スキャン速度：９；平均化：１６×によりイメージングを実行した。ＥＧＦＰを４８８ｎｍで励起させ、４９３〜５５４ｎｍで画像化し、ＴＡＭＲＡを励起させ、それぞれ５６１ｎｍ及び５６６〜６８５ｎｍで検出した。

【0153】

対照実験を同様にして行ったが、トランスフェクトは、pMbBCNRS-EGFR（128TAG）-GFP-HAの代わりにpMmPylRS-EGFR（128TAG）-GFP-HAで行われた。１ｍＭの５の存在下で、さらに０．５％ＤＭＳＯの非存在又は存在下で（アミノ酸１の場合と同様に）細胞を一晩増殖させた。

【0154】

哺乳動物の核タンパク質の標識付け
ポリリシンでコーティングしたμ−ディッシュ上で細胞を平板培養し、ほぼコンフルエンスに増殖させた後、細胞にそれぞれ２μｇのpCMV-cJun-TAG-mCherry及びp4CMVE-U6-PylTをトランスフェクトした。０．５ｍＭの１（０．５％ＤＭＳＯ）の存在下で、３７℃及び５％ＣＯ_２で、０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中でおよそ１６時間増殖させた後、細胞を０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで洗浄し、次いで０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で一晩インキュベートした。次の日、２時間かけて２回の培地交換とそれに続く３０分インキュベートを行うことにより細胞を繰り返し洗浄した。２００ｎＭテトラジン−色素コンジュゲート１１を１５分で添加し、次いで細胞を再度、９０分かけて繰り返し洗浄した。細胞表面の標識付けに関してイメージングを実行した。

【0155】

化学合成：
一般的な方法：
Bruker Ultrashield（商標）400 Plus分光計（^１Ｈ：４００ＭＨｚ、^１３Ｃ：１０１ＭＨｚ、^３１Ｐ：１６２ＭＨｚ）でＮＭＲスペクトルを記録した。化学シフト（δ）はｐｐｍで報告され、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルについてはＣＤＣｌ_３（７．２６ｐｐｍ）、ｄ_６−ＤＭＳＯ（２．５０ｐｐｍ）、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルについてはＣＤＣｌ_３（７７．０ｐｐｍ）、ｄ_６−ＤＭＳＯ（３９．５ｐｐｍ）の残留した非重水素化溶媒ピークが記載される。^１３Ｃ−及び^３１Ｐ−ＮＭＲ共鳴は、プロトンデカップリングされている。結合定数（Ｊ）は最近接の０．１Ｈｚに対して測定され、観察された通りに示される。分裂パターンは以下のように示される：ｓ、一重項；ｄ、二重項；ｔ、三重項；ｑ、四重項；ｑｕｉｎ、五重項；ｓｅｘｔ、六重項；ｍ、多重項。シリカ60F-254プレートで分析薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を実行した。紫外線（２５４ｎｍ）及び／又は過マンガン酸カリウム染色でスポットを可視化した。シリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ又は７０〜２３０メッシュ）でフラッシュカラムクロマトグラフィーを実行した。6130 Quadrupole分光計を備えたAgilent社製1200LC-MSシステムを使用して、ＥＳＩ−ＭＳを実行した。溶媒系は、緩衝液ＡとしてＨ_２Ｏ中の０．２％ギ酸及び緩衝液Ｂとしてアセトニトリル（ＭｅＣＮ）中の０．２％ギ酸からなっていた。Phenomenex社製Jupiter C18カラム（１５０×２ｍｍ、５μｍ）を使用して低分子物質のＬＣ−ＭＳを実行した。可変波長を使用し、ポジティブ及びネガティブイオンモードでＭＳ獲得を実行した。Varian社製PrepStar/ProStar HPLCシステムを使用して分取用ＨＰＬＣ精製を実行し、Phenomenex社製C18カラム（２５０×３０ｍｍ、５μｍ）から自動的に画分を収集した。１９１ｎｍでのＵＶ吸光度によって化合物を同定した。全ての溶媒及び化学試薬を商業的な供給元から購入し、さらなる精製を行わないで使用した。ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ、約４／１のエキソ／エンド混合物）をオランダのSynAffix社から購入した。特に他の指定がない限りアルゴンの不活性雰囲気下で、オーブンで乾燥させたガラス製品中で非水性反応を実行した。実験で使用した全ての水を蒸留した。ブラインは、塩化ナトリウムの飽和水溶液を指す。

【0156】

【化2】

【0157】

文献の手法に従って（Dommerholt, J. et al. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angewandte Chemie-International Edition 49, 9422-9425 (2010)）、エキソ−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（エキソ−ＢＣＮ、Ｓ１８）を合成した。

【0158】

ＭｅＣＮ（１０ｍＬ）中のエキソ−ＢＣＮ−ＯＨ Ｓ１８（５３８ｍｇ、３．５８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．０ｍＬ、１４．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（１．３８ｇ、５．３７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。この溶液を室温に温め、３時間撹拌し、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーの短いパッドを通過させて粗油を精製し（ヘキサン中の６０％ＥｔＯＡｃで溶出）、エキソ−ＢＣＮ−スクシンイミジルカーボネートを得て、これをそれ以上精製しないで使用した。ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ．ＨＣｌ（２．６１ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１．４９ｍＬ、８．５８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＦ（４ｍＬ）中のエキソ−ＢＣＮ−ＯＳｕ（１．２５ｇ、４．２９ｍｍｏｌ）をカニューレを介して添加した。この溶液を室温で１４時間撹拌し、Ｅｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、Ｈ_２Ｏ（３×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによって粗油を精製し（ＤＣＭ（０．１％ＡｃＯＨ）中の０〜５％ＭｅＯＨ）、エキソ−Ｆｍｏｃ−ＢＣＮＫ−ＯＨ Ｓ１９を白色の固体として得た（２段階で１．６５ｇ、８５％）。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）１２．６７〜１２．３１（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、７．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ ７．５）、７．７３（２Ｈ，ｄ，Ｊ ７．４）、７．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ ７．８）、７．４２（２Ｈ，ｔ，Ｊ ７．４）、７．３４（２Ｈ，ｔ，Ｊ ７．４）、７．１０（１Ｈ，ｔ，Ｊ ５．７）、４．３１〜４．１９（３Ｈ，ｍ）、３．９５〜３．８７（１Ｈ，ｍ）、３．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ ６．４）、３．４５〜３．２５（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、３．０１〜２．９１（２Ｈ，ｍ）、２．５２〜２．５０（１Ｈ，ｍ）、２．３３〜２．１５（４Ｈ，ｍ）、２．１１〜２．０２（２Ｈ，ｍ）、１．７５〜１．５４（２Ｈ，ｍ）、１．４６〜１．２３（６Ｈ，ｍ）、０．７０〜０．５８（２Ｈ，ｍ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）１７４．４、１５６．９、１５６．６、１４４．３０、１４４．２７、１４１．２、１２８．１、１２７．５、１２５．７、１２０．６、９９．４、６８．１、６６．１、５４．３、４７．１、３３．３、３０．９、２９．５、２３．９、２３．４、２２．７、２１．３；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ５４３（１００％［Ｍ−Ｈ］⁻）。

【0159】

ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のエキソ−Ｆｍｏｃ−ＢＣＮＫ−ＯＨ Ｓ１９（１７４ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ポリマーに結合したピペラジン（１．２８ｇ、１．２８ｍｍｏｌ、２００〜４００メッシュ、標識付けの程度：ローディング１ｇ当たり１．０〜２．０ｍｍｏｌ、２％がジビニルベンゼンで架橋された）を添加した。得られた混合物を室温で４時間撹拌し、濾過し、この試薬をＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ（３：１、３×５０ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で蒸発させ、Ｈ_２Ｏ（１００ｍＬ）中に溶解させ、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で洗浄した。水相を減圧下で蒸発させ、凍結乾燥させて、エキソ−Ｈ−ＢＣＮＫ−ＯＨ１を白色の固体として得た（１０１ｍｇ、９８％）。それに続く哺乳動物細胞を使用した全ての標識付け実験について、エキソ−Ｈ−ＢＣＮＫ−ＯＨ１を逆相ＨＰＬＣ（０：１のＨ_２Ｏ：ＭｅＣＮから９：１のＨ_２Ｏ：ＭｅＣＮの勾配）によってさらに精製した。ＨＰＬＣ（０：１ Ｈ_２Ｏ：ＭｅＣＮ〜９：１ Ｈ_２Ｏ：ＭｅＣＮ勾配）。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ／Ｄ_２Ｏ（１：１））４．１４〜３．７６（ｍ，３Ｈ）、３．５６〜３．２９（ｍ，２Ｈ）、３．１８〜２．８１（ｍ，３Ｈ）、２．３１〜１．９８（ｍ，５Ｈ）、１．７１〜１．５２（ｍ，４Ｈ）、１．５１〜１．２９（ｍ，４Ｈ）、１．２９〜１．０８（ｍ，３Ｈ）、０．９５〜０．６６（ｍ，２Ｈ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ／Ｄ_２Ｏ（１：１））１６９．４、１６５．９、１０１．３、７６．０、５５．８、３１．８、３０．１、２９．９、２５．２、２３．２、２２．１、２１．０、１８．７；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ３２３（１００％［Ｍ＋Ｈ］^＋）。文献の手法に従って（Dommerholt, J. et al. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angewandte Chemie-International Edition 49, 9422-9425 (2010)）、エンド−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（エンド−ＢＣＮ）を合成し、１と類似の様式で対応するアミノ酸について詳述した。

【0160】

【化3】

【0161】

磁気式の撹拌棒を備えたガラス製バイアル（Biotage（登録商標）Ltd.）に化合物６（３９．２ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）を入れ、空気を通さないアルミニウム／ゴム製の隔壁で密封した。バイアルの内容物を真空中で乾燥させ、アルゴンガスでパージした（３回）。バイアルにＭｅＯＨ（１ｍｌ）を添加し、続いてエキソ−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（エキソ−ＢＣＮ、Ｓ１８）（１ｍｌのＭｅＯＨ中に２０．２ｍｇ、０．１３４４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この混合物を室温で撹拌した。２分以内に、この反応混合物は脱色し、内容物をさらに１分撹拌した。次いでこの混合物を減圧下で蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨ）で精製し、ピリダジンＳ２０をかすかに黄色の半固体として得た（４９ｍｇ、９６％）。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）９．１６（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、８．７７〜８．７１（１Ｈ，ｍ）、８．６７（１Ｈ，見かけｄ，Ｊ ２．１）、８．０１（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、７．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ ７．８）、７．８９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ ７．８，７．６，１．７）、７．７５（１Ｈ，見かけｄ，Ｊ ８．４）、７．４０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ ７．４，４．９，１．１）、５．９３（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、４．０２（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．０）、３．４９〜３．３１（２Ｈ，ｍ）、３．１２〜２．８８（４Ｈ，ｍ）、２．６８〜２．４９（２Ｈ，ｍ）、１．８８〜１．６０（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、１．６０〜１．５０（１Ｈ，ｍ）、１．４８（９Ｈ，ｓ）、０．９２〜０．７２（４Ｈ，ｍ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１６９．０、１５９．２、１５９．０、１５６．９、１５６．８、１５５．７、１５２．１、１４８．９、１４３．０、１４０．９、１３７．０、１３４．４、１２８．０、１２５．１、１２４．９、１２３．５、８０．７、６６．４、４５．７、３０．７、２９．９、２９．６、２９．５、２８．５（３ｘＣＨ_３（^ｔＢｕ））、２８．０、２７．８、２１．７；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ５３１（１００％［Ｍ＋Ｈ］^＋）。

【0162】

【化4】

【0163】

Ｈ_２Ｏ（１０ｍＬ）中のＮａＯＨ（１．５０ｇ、３７．５０ｍｍｏｌ）及びジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（３．００ｇ、１３．７５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｈ_２Ｏ（１０ｍＬ）中の市販の４−（アミノメチル）ベンゾニトリル塩酸塩Ｓ２１（２．１１ｇ、１２．５０ｍｍｏｌ）を室温で添加した。この混合物を１６時間撹拌し、その後、白色の沈殿が形成された。この混合物を濾過し、Ｈ_２Ｏ（５０ｍＬ）で洗浄し、得られた固体を真空中で乾燥させて、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメートＳ２２を白色の固体として得た（２．７８ｇ、９６％）。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）７．６２（２Ｈ，ｄ，Ｊ ８．２）、７．３９（２Ｈ，ｄ，Ｊ ８．２）、５．００（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、４．３７（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．８）、１．４６（９Ｈ，ｓ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１５５．９、１４４．７、１３２．４、１２７．８、１１８．９、１１１．１、８０．１、４４．２、２８．４；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ２３３（１００％［Ｍ＋Ｈ］^＋）。

【0164】

文献の手法の改変法によりテトラジン１０を合成した（Yang, J., Karver, M.R., Li, W., Sahu, S. & Devaraj, N.K. Metal-catalyzed one-pot synthesis of tetrazines directly from aliphatic nitriles and hydrazine. Angewandte Chemie 51, 5222-5 (2012)）。１，４−ジオキサン（０．５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルカルバメートＳ２２（９８ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、酢酸ホルムアミジン（４３９ｍｇ、４．２２ｍｍｏｌ）、及びＺｎ（ＯＴｆ）_２（７７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、ヒドラジン一水和物（１．０２４ｍＬ、２１．１０ｍｍｏｌ）を室温で添加した。この反応液を６０℃に加熱し、１６時間撹拌した。この反応液を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈した。この反応液を１ＭのＨＣｌ（１０ｍＬ）で洗浄し、水相をＥｔＯＡｃ（２×５ｍＬ）で抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた未精製の残留物をＤＣＭと酢酸との混合物（１：１、５ｍＬ）中に溶解させ、ＮａＮＯ_２（５８４ｍｇ、８．４４ｍｍｏｌ）を１５分かけてゆっくり添加したところ、その間に反応液が明るい赤色になった。活発な空気パージで亜硝酸ガス（nitrous fumes）を追い出し、次いでこの反応液をＤＣＭ（２５ｍＬ）で希釈した。この反応混合物を、炭酸水素ナトリウム（飽和水溶液、２５ｍＬ）で洗浄し、水相をＤＣＭ（２×１０ｍＬ）で抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、テトラジン１０をピンク色の固体として得た（８５ｍｇ、７０％）。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１０．２１（１Ｈ，ｓ）、８．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ ８．２）、７．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ ８．２）、４．９７（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、４．４５（２Ｈ，ｄ，Ｊ ６．０）、１．４９（９Ｈ，ｓ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１４９．４、１４２．６、１４１．１、１３２．１、１２０．８、１１９．２、１１８．８、５１．８、３９．０；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ １８８（１００％［（Ｍ−Ｂｏｃ）＋２Ｈ］^＋）。

【0165】

ＤＣＭ（４ｍＬ）中のテトラジン１０（７５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ジオキサン（２ｍＬ、８．０ｍｍｏｌ）中の４ＭのＨＣｌを添加した。１時間後、この反応を完了させ、溶媒を減圧下で除去して、第一アミンの塩酸塩Ｓ２３をピンク色の固体として得た（６１ｍｇ、１００％）。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）１０．６４（１Ｈ，ｓ）、８．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ ８．４）、７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ ８．４）、４．１８（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．５）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）１６５．２、１５８．２、１３８．９、１３１．９、１２９．８、１２７．９、４１．８；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ １８８（１００％［Ｍ＋Ｈ］^＋）。

【0166】

Ｅ−５−ヒドロキシシクロオクテン及びＥ−エキソ−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−イルメタノールを、これまでに述べられた光化学的な手法（Taylor, M.T., Blackman, M.L., Dmitrenko, O. & Fox, J.M. Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Journal of the American Chemical Society 133, 9646-9 (2011)、Royzen, M., Yap, G.P. & Fox, J.M. A photochemical synthesis of functionalized trans-cyclooctenes driven by metal complexation. Journal of the American Chemical Society 130, 3760-1 (2008)）、又は以下で記載されている非光化学的なプロトコールのいずれかによって作製した。

【0167】

【化5】

【0168】

ＤＣＭ（３００ｍＬ）中の市販の９−オキサビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エンＳ２４（１０ｇ、８０．５３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ジイソブチルアルミニウムヒドリド（シクロヘキサン中の１．０Ｍ溶液、８９ｍＬ、８９ｍｍｏｌ）を０℃で一滴ずつ添加した。この溶液を０℃で３０分撹拌し、室温に温め、１６時間撹拌した。この時間の後、この反応液を０℃に冷却し、プロパン−２−オール（５０ｍＬ）、続いてＨＣｌ（１Ｍ水溶液、１００ｍＬ）をゆっくり添加した。水相をＤＣＭ（３×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の１０〜２０％ＥｔＯＡｃ）で粗生成物を精製し、シクロオクテン−４−オールＳ２５を無色の油として得た（８．４２ｇ、８３％）。スペクトルデータは文献と合致していた（Zhang, K., Lackey, M.A., Cui, J. & Tew, G.N. Gels based on cyclic polymers. Journal of the American Chemical Society 133, 4140-8 (2011)）。

【0169】

【化6】

【0170】

ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のシクロオクテン−４−オールＳ２５（５．６ｇ、４４．０ｍｍｏｌ）、イミダゾール（７．５ｇ、０．１１ｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１結晶）の撹拌溶液に、ｔｅｒｔ−ブチル（クロロ）ジメチルシラン（１３．３ｇ、８８．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。この溶液を室温に温め、９０分撹拌し、その間に白色の沈殿が形成された。この反応液を０℃に冷却し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、炭酸水素ナトリウム（飽和水溶液、１００ｍＬ）を添加した。相を分離させ、水相をＤＣＭ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の１０〜２０％ＤＣＭ）で粗生成物を精製して、シリルエーテルＳ２６を無色の油として得た（１０．５５ｇ、定量）。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）５．７１〜５．６３（１Ｈ，ｍ）、５．６０〜５．５２（１Ｈ，ｍ）、３．８０（１Ｈ，見かけｔｄ，Ｊ ８．６，４．２）、２．３４（１Ｈ，ｄｔｄ，Ｊ １３．８，８．２，３．８）、２．２５〜２．１５（１Ｈ，ｍ）、２．１３〜２．０５（１Ｈ，ｍ）、２．０２〜１．９３（１Ｈ，ｍ）、１．８７〜１．５２（５Ｈ，ｍ）、１．４７〜１．３５（１Ｈ，ｍ）、０．８８（９Ｈ，ｓ）、０．０４（３Ｈ，ｓ）、０．０３（３Ｈ，ｓ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１３０．４、１２９．４、７３．１、３８．０、３６．５、２６．１、２５．８、２５．１、２２．７、１８．４、−３．４；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ２４１（１１％［Ｍ＋Ｈ］^＋）。

【0171】

【化7】

【0172】

ＤＣＭ（８０ｍＬ）中のシリルエーテルＳ２６（１０．６ｇ、４３．９ｍｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（７．０ｇ、６５．８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ペルオキシ酢酸（酢酸中の３９％、１０．３ｍｌ、５２．７ｍｍｏｌ）を０℃で一滴ずつ添加した。この混合物を室温に温め、１４時間撹拌した。この反応液を０℃に冷却し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、チオ硫酸ナトリウム（飽和水溶液、１００ｍＬ）を添加した。この混合物を室温で１０分撹拌し、次いでＮａＯＨ（２Ｍ水溶液）でｐＨ１２まで塩基性化した。相を分離させ、有機相をＨ_２Ｏ（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の８０％〜９０％ＤＣＭ）で粗生成物を精製して、エポキシドＳ２７／Ｓ２８をジアステレオマーの分離できない混合物として（^１Ｈ−ＮＭＲにより２．３：１）及び無色の油として（１０．２ｇ、９１％）得た。主要なジアステレオマー：δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）３．９０（１Ｈ，見かけ六重線，Ｊ ４．２）、２．９０（２Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ １６．７，８．３，４．４）、２．２１〜２．０９（１Ｈ，ｍ）、１．８５〜１．６０（６Ｈ，ｍ）、１．５０〜１．３８（２Ｈ，ｍ）、１．３４〜１．２３（１Ｈ，ｍ）、０．８８（９Ｈ，ｓ）、０．０４（３Ｈ，ｓ）、０．０３（３Ｈ，ｓ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１７１．９、５５．５、５５．４、３６．３、３４．３、２７．７、２６．０、２５．８、２２．６、１８．３、−３．４；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ２５７（８％［Ｍ＋Ｈ］^＋）。

【0173】

【化8】

【0174】

ＴＨＦ（８０ｍＬ）中のエポキシドＳ２７／Ｓ２８（７．９ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）及びジフェニルホスフィン（６．４３ｍＬ、３７．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中の２．５Ｍ、１４．８ｍＬ、３７．０ｍｍｏｌ）を−７８℃で１５分かけて一滴ずつ添加した。得られた混合物を−７８℃で１時間撹拌し、室温に温め、１４時間撹拌した。この反応混合物をＴＨＦ（８０ｍＬ）で希釈し、０℃に冷却した。酢酸（５．５４ｍＬ、９２．４ｍｍｏｌ）、続いて過酸化水素（３０％水溶液、７．６８ｍＬ、６７．７ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温に温め、４時間撹拌した。チオ硫酸ナトリウム（飽和水溶液、１００ｍＬ）を添加し、この混合物を１０分撹拌した。水相をＥｔＯＡｃ（３×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（３×２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、ホスフィンオキシドＳ２９／Ｓ３０／Ｓ３１／Ｓ３２を４種のジアステレオマーの混合物として得て、これをさらに精製しないで使用した。δ_Ｐ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）４５．２、４４．８、４４．４、４３．８；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ４５９（１００％［Ｍ＋Ｈ］^＋）。

【0175】

【化9】

【0176】

ＤＭＦ（１００ｍＬ）中の未精製のヒドロキシルホスフィンオキシドＳ２９／Ｓ３０／Ｓ３１／Ｓ３２の撹拌溶液に、水素化ナトリウム（鉱油中の６０％分散液、２．４６ｇ、６１．５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。得られた混合物を室温に温め、スズ箔で包み、２時間撹拌した。この反応液を０℃に冷却し、Ｅｔ_２Ｏ（２００ｍＬ）で希釈し、Ｈ_２Ｏ（２００ｍＬ）を添加した。相を分離させ、合わせた有機物をブライン（２×２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。未精製の混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の１〜１５％ＤＣＭ）で精製して、トランス−シクロオクテンＳ３３／Ｓ３４を、Ｅ型にのみ選択性を有するジアステレオマーの分離可能な混合物として、及び無色の油として得た（３段階で２．７８ｇ、１．２：１のジアステレオ異性体、３８％）。Ｓ３３：δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）５．６４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ １６．０，１０．８，３．６）、５．４５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ １５．９，１１．１，３．２）、４．０１（１Ｈ，見かけｄｄ，Ｊ １０．２，５．４）、２．４１（１Ｈ，ｑｄ，Ｊ １１．５，４．４）、２．２６〜２．１９（１Ｈ，ｍ）、２．０９〜１．９４（３Ｈ，ｍ）、１．９２〜１．７３（２Ｈ，ｍ）、１．７１〜１．６３（１Ｈ，ｍ）、１．５４（１Ｈ，ｔｄｄ，Ｊ １４．０，４．７，１．１）、１．３０〜１．０８（１Ｈ，ｍ）、０．９４（９Ｈ，ｓ）、０．０３（３Ｈ，ｓ）、０．０１（３Ｈ，ｓ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１３５．９、１３１．５、６７．６、４４．０、３５．２、３４．８、２９．７、２７．７、２６．２、１８．４、−４．７、−４．８；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ２４１（８％［Ｍ＋Ｈ］^＋）。Ｓ３４：δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）５．５５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ １５．９，１１．０，３．６）、５．３６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ １６．１，１０．８，３．４）、３．４２〜３．３７（１Ｈ，ｍ）、２．３６〜２．２８（２Ｈ，ｍ）、２．２２（１Ｈ，見かけｑｄ，Ｊ １１．２，６．３）、２．０２〜１．８７（４Ｈ，ｍ）、１．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ １４．９，６．２）、１．６７〜１．４５（２Ｈ，ｍ）、０．８７（９Ｈ，ｓ）、０．０３（６Ｈ，ｓ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１３５．５、１３２．５、７８．６、４４．９、４２．０、３４．６、３３．０、３１．３、２６．１、１８．３、−４．４、−４．５；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ２４１（１２％［Ｍ＋Ｈ］^＋）。全ての追加の実験については、トランス−シクロオクテンＳ３４が使用されており、その場合、エクアトリアル位はＣ４−酸素置換基で占有される。

【0177】

【化10】

【0178】

ＭｅＣＮ（５ｍＬ）中のシリルエーテルＳ３４（５７３ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＨＦ中の１Ｍ溶液、２３．８ｍＬ、２３．８ｍｍｏｌ）及びフッ化セシウム（１．０８ｇ、７．１４ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた混合物をスズ箔で包み、室温で３６時間撹拌した。この期間後、この反応液を０℃に冷却し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、Ｈ_２Ｏ（１００ｍＬ）を添加した。相を分離させ、有機相をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）で粗生成物を精製して、第二アルコールＳ３５を無色の油として得た（２８９ｍｇ、９６％）δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）５．６０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ １６．０，１０．７，４．２）、５．４１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ １６．０，１１．１，３．７）、３．５２〜３．４５（２Ｈ，ｍ）、２．４０〜２．２５（３Ｈ，ｍ）、２．０３〜１．９０（４Ｈ，ｍ）、１．７５〜１．５３（３Ｈ，ｍ）、１．２５〜１．１８（１Ｈ，ｍ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１３５．１、１３２．８、７７．７、４４．６、４１．１、３４．３、３２．６、３２．１；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ １２７（１４％［Ｍ＋Ｈ］^＋）。

【0179】

【化11】

【0180】

ＤＭＦ（７．５ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ．ＨＣｌ（３０３ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１９ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、スクシンイミジル（Succimidyl）カーボネートＳ３６（２００ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。この溶液を室温に温め、スズ箔で包み、１２時間撹拌した。この期間後、この溶液を減圧下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０〜１０％ＭｅＯＨ）で精製して、Ｆｍｏｃ−ＴＣＯＫ−ＯＨ Ｓ３７／Ｓ３８を、依然としてＤＭＦ（３５０ｍｇ、８１％）を含有する黄色の油として得た。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）７．７５〜７．６９（２Ｈ，ｍ）、７．６３〜７．５２（２Ｈ，ｍ）、７．４１〜７．３３（２Ｈ，ｍ）、７．３２〜７．２５（２Ｈ，ｍ）、５．８２〜５．３４（３Ｈ，ｍ）、５．２７（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、４．９０〜４．５０（１Ｈ，ｍ）、４．４７〜４．０１（５Ｈ，ｍ）、３．３２〜３．３０（１Ｈ，ｍ）、２．３９〜１．０８（１７Ｈ，ｍ）；δ_Ｃ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１７４．３、１５６．３、１５５．９、１４３．８、１４３．６、１４１．１、１３５．０、１３４．８、１３２．８、１３２．６、１２７．５、１２６．９、１２５．０、１１９．８、８０．３、６６．８、５３．４、４７．０、４１．０、４０．４、３８．５、３４．１、３２．５、３２．３、３２．１、３０．８、２９．３、２２．３；ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ_３０Ｈ_３６Ｎ_２Ｏ_６Ｎａの［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値：５４３．２４７１、実測値：５４３．２４６６。

【0181】

ＤＣＭ（４ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＴＣＯＫ−ＯＨ Ｓ３７／Ｓ３８（０．２６９ｇ、０．５１７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ピペリジン（１ｍＬ）を添加した。この混合物をスズ箔で包み、室温で３０分撹拌した。この反応混合物を減圧下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の３０〜５０％ＭｅＯＨ）で粗生成物を精製して、Ｈ−ＴＣＯＫ−ＯＨ１を象牙色の固体として得た。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ｄ_４−ＭｅＯＤ）５．６３〜５．５６（１Ｈ，ｍ）、５．５０〜５．４３（１Ｈ，ｍ）、４．３１〜４．２５（１Ｈ，ｍ）、３．６０〜３．５３（１Ｈ，ｍ）、３．１１〜３．０３（２Ｈ，ｍ）、２．３７〜２．２６（３Ｈ，ｍ）、２．０２〜１．３６（１３Ｈ，ｍ）；δ_Ｃ（１００ＭＨｚ，ｄ_４−ＭｅＯＤ）１７４．３、１５９．０、１３６．３、１３３．９、８１．８、５６．０、４２．４、４１．４、３９．８、３５．４、３３．７、３２．３、３２．１、３０．９、２３．６；ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：Ｃ_１５Ｈ_２５Ｎ_２Ｏ_４の［Ｍ−Ｈ］⁻計算値：２９７．１８１４、実測値：２９７．１８１１。

【0182】

【化12】

【0183】

文献の手法に従ってエキソ−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−イルメタノールＳ１８を合成した（Taylor, M.T., Blackman, M.L., Dmitrenko, O. & Fox, J.M. Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Journal of the American Chemical Society 133, 9646-9 (2011)）。

【0184】

【化13】

【0185】

ＤＣＭ（３５ｍｌ）中のエキソ−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−イルメタノールＳ１８（２．７５ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）、イミダゾール（２．１５ｇ、３１．６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２．２１ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ｔｅｒｔ−ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（７．４５ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。この溶液を室温に温め、２４時間撹拌し、その間に白色の沈殿が形成された。この反応液を０℃に冷却し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、炭酸水素ナトリウム（飽和水溶液、１００ｍＬ）を添加した。相を分離させ、水相をＤＣＭ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％ＤＣＭ）で粗生成物を精製して、シリルエーテルＳ３９を無色の油として得た（６．８５ｇ、９７％）。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）７．７９〜７．６４（４Ｈ，ｍ）、７．５０〜７．３２（６Ｈ，ｍ）、５．６３（２Ｈ，ｄｍ，Ｊ １１．５）、３．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ ６．２）、２．４０〜２．２１（２Ｈ，ｍ）、２．１８〜１．９６（４Ｈ，ｍ）、１．４５〜１．３３（２Ｈ，ｍ）、１．０７（９Ｈ，ｓ）、０．７２〜０．５６（３Ｈ，ｍ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１３５．７、１３４．３、１３０．２、１２９．５、１２７．６、６７．９、２９．１、２８．６、２７．２、２６．９、２２．０、１９．３；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ４０８（１０％，［Ｍ＋ＮＨ_４］^＋）。

【0186】

【化14】

【0187】

ＤＣＭ（６５ｍＬ）中のシリルエーテルＳ３９（６．４９ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）及び無水炭酸ナトリウム（２．６４ｇ、２４．９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ペルオキシ酢酸（３．３８ｍｌ、酢酸中の３９％、１９．９ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。この混合物を室温に温め、２４時間撹拌した。次いでこの反応液を０℃に冷却し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、チオ硫酸ナトリウム（飽和水溶液、１５０ｍＬ）を添加した。この混合物を室温で３０分撹拌し、次いでＮａＯＨ（２Ｍ水溶液）でｐＨ１２まで塩基性化した。相を分離させ、有機相をＨ_２Ｏ（２００ｍＬ）、ブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（１００％ＤＣＭ）で粗生成物を精製して、エポキシドＳ４０及びＳ４１を、ジアステレオマーの分離できない混合物として（^１Ｈ ＮＭＲ分光分析によれば１：１）及び無色の油として（５．９７ｇ、８８％）得た。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）７．７２〜７．６３（８Ｈ，ｍ）、７．４７〜７．３４（１２Ｈ，ｍ）、３．５７（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．６）、３．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．９）、３．０３〜３．１０（２Ｈ，ｍ）、３．０２〜２．９１（２Ｈ，ｍ）、２．３６〜２．２４（２Ｈ，ｍ）、２．２１〜２．０８（２Ｈ，ｍ）、２．０６〜１．８５（６Ｈ，ｍ）、１．３５〜１．１２（４Ｈ，ｍ）、１．０６（９Ｈ，ｓ）、１．０５（９Ｈ，ｓ）、０．９２〜０．８０（２Ｈ，ｍ）、０．７８〜０．４７（６Ｈ，ｍ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１３５．６５、１３５．６３、１３４．２、１３４．１、１２９．６（２×ＣＨ）、１２７．６（２×ＣＨ）、６７．４、６７．０、５６．９１、５６．８５、２９．７、２７．７、２６．９（２×３ＣＨ_３）、２６．６、２６．５、２３．３１、２３．２５、２１．７、２０．４、１９．２（２×２Ｃ）；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ４０７（９％，［Ｍ＋Ｈ］^＋）。

【0188】

【化15】

【0189】

ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のエポキシドＳ４０／Ｓ４１（５．４７ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）及びジフェニルホスフィン（２．５７ｍＬ、１４．８０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中の２．５Ｍ、５．９２ｍＬ、１４．８ｍｍｏｌ）を−７８℃で１５分かけて一滴ずつ添加した。得られた混合物を−７８℃で１時間撹拌し、室温に温め、追加で１４時間撹拌した。この反応混合物をＴＨＦ（８０ｍＬ）で希釈し、０℃に冷却した。酢酸（１．５４ｍＬ、２６．９ｍｍｏｌ）を添加し、続いて過酸化水素（３０％水溶液、３．０５ｍＬ、２６．９ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温に温め、４時間撹拌した。チオ硫酸ナトリウム（飽和水溶液、１００ｍＬ）を添加し、この混合物を１０分撹拌した。水相をＥｔＯＡｃ（３×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（３×２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。未精製の混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の４０〜１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、ホスフィンオキシドＳ４２／Ｓ４３／Ｓ４４／Ｓ４５を、２種のジアステレオ異性体（diasteroisomers）の５１：１８混合物として得て（２段階で５．６１ｇ、６９％）、これらはそれぞれ、位置異性体（Ｓ４２／Ｓ４５及びＳ４３／Ｓ４４）の１：１混合物である。主要なジアステレオマー：δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）７．８２〜７．６８（４Ｈ，ｍ）、７．６８〜７．５８（４Ｈ，ｍ）、７．５２〜７．３２（１２Ｈ，ｍ）、４．５８〜４．４５（１Ｈ，ｍ）、４．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ ５．３）、３．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ ６．０）、２．４７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ １２．０，１１．７，４．３）、２．２１〜２．０７（１Ｈ，ｍ）、２．０５〜１．８５（２Ｈ，ｍ）、１．７８〜１．５５（３Ｈ，ｍ）、１．２２〜１．０５（１Ｈ，ｍ）、１．０３（９Ｈ，ｓ）、０．９１〜０．７５（１Ｈ，ｍ）、０．６２〜０．３５（３Ｈ，ｍ）；δ_Ｐ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）３９．７；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ６０９［１００％，（Ｍ＋Ｈ）^＋］。割合が低い方のジアステレオマー：δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）７．８７〜７．７７（２Ｈ，ｍ）、７．７４〜７．６０（６Ｈ，ｍ）、７．５２〜７．３０（１２Ｈ，ｍ）、４．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ ４．０）、３．８９〜３．７８（１Ｈ，ｍ）、３．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ １０．７，５．８）、３．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ １０．７，６．２）、３．２６〜３．１０（１Ｈ，ｍ）、２．２２〜２．１２（１Ｈ，ｍ）、２．００〜１．７８（３Ｈ，ｍ）、１．７０〜１．６２（１Ｈ，ｍ）、１．４２〜１．２８（１Ｈ，ｍ）、１．０４（９Ｈ，ｓ）、１．０４〜０．９２（２Ｈ，ｍ）、０．７９〜０．６５（１Ｈ，ｍ）、０．５５〜０．４１（１Ｈ，ｍ）、０．２７〜０．１２（１Ｈ，ｍ）；δ_Ｐ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）３９．６；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ６０９［１００％，（Ｍ＋Ｈ）^＋］。

【0190】

【化16】

【0191】

無水ＤＭＦ（６０ｍＬ）中のヒドロキシルホスフィンオキシドＳ４２／Ｓ４３／Ｓ４４／Ｓ４５（４．６８ｇ、７．６９ｍｏｌ）の撹拌溶液に、水素化ナトリウム（鉱油中の６０％分散液、０．４６ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。得られた混合物を室温に温め、スズ箔で包み、２時間撹拌した。この反応混合物を０℃に冷却し、Ｅｔ_２Ｏ（２００ｍＬ）及びＨ_２Ｏ（２００ｍＬ）で希釈し、相を分離させ、水相をヘキサン（１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（飽和水溶液、５×２５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。未精製の混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の１〜２０％ＤＣＭ）で精製して、トランス−シクロオクテンＳ４６を、Ｅ型にのみ選択性を有する単一のジアステレオマーとして得た（２．０８ｇ、６９％）；δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）７．７２〜７．６２（４Ｈ，ｍ）、７．４６〜７．３４（６Ｈ，ｍ）、５．８３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ １６．１，９．２，６．２）、５．１１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ １６．１，１０．６，３．３）、３．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ ５．７）、２．２８〜２．４０（１Ｈ，ｍ）、２．１２〜２．２７（３Ｈ，ｍ）、１．８０〜１．９５（２Ｈ，ｍ）、１．０４（９Ｈ，ｓ）、０．７４〜０．９０（１Ｈ，ｍ）、０．４６〜０．６０（１Ｈ，ｄｍ，Ｊ １４．０）、０．３１〜０．４２（２Ｈ，ｍ）、０．１８〜０．２９（１Ｈ，ｍ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１３８．６、１３５．８、１３４．４、１３１．３、１２９．６、１２７．７、６８．１、３９．０、３４．１、３２．９、２８．２、２７．９、２７．０、２１．６、２０．５、１９．４。

【0192】

【化17】

【0193】

ＴＨＦ（５ｍＬ）中のシリルエーテルＳ４６（０．７８ｇ、２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＨＦ中の１Ｍ溶液、１０．０ｍｌ、１０．０ｍｍｏｌ）を室温で添加し、スズ箔で包み、４５分撹拌した。この期間後、この反応混合物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。相を分離させ、有機相をブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）で粗生成物を精製して、第一アルコールＳ４７を無色の油として得た（０．２９ｇ、９６％）；δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ｄ_４−ＭｅＯＤ）５．８７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ １６．５，９．３，６．２）、５．１３（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ １６．５，１０．４，３．９，０．８）、３．３９〜３．４７（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ ６．２，１．５）、２．３４〜２．４４（１Ｈ，ｍ）、２．１２〜２．３３（３Ｈ，ｍ）、１．８２〜１．９８（２Ｈ，ｍ）、０．９０（１Ｈ，ｄｔｄ，Ｊ １２．５，１２．５，７．１）、０．５５〜０．７０（１Ｈ，ｍ）、０．４１〜０．５５（１Ｈ，ｍ）、０．２７〜０．４１（２Ｈ，ｍ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ｄ_４−ＭｅＯＤ）１３９．３、１３２．２、６７．５、３９．９、３４．８、３３．８、２９．２、２８．７、２３．０、２１．９；ＭＳ−ＣＩ（ＮＨ_３）：Ｃ_１０Ｈ_１５のｍ／ｚ［Ｍ−ＯＨ］計算値：１３５．１１７４；実測値：１３５．１１７３。

【0194】

【化18】

【0195】

ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ．ＨＣｌ（４７８ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．２７ｍＬ、１．５８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ｐＮＯ_２−フェニルカーボネートＳ４８（２５０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。この溶液を室温に温め、スズ箔で包み、１６時間撹拌した。この期間後、この溶液を減圧下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０〜５％ＭｅＯＨ）で精製して、Ｆｍｏｃ−エキソ−ｓＴＣＯＫ Ｓ４９を白色の発泡体として得た（３７３ｍｇ、８７％）。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）１３．０９〜１２．０６（１Ｈ，ｂｒ ｓ）、７．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ ７．５）、７．７３（２Ｈ，ｄ，Ｊ ７．５）、７．６６〜７．５６（１Ｈ，ｍ）、７．４３（２Ｈ，ｔ，Ｊ ７．４）、７．３４（２Ｈ，Ｊ ７．４）、７．０８（１Ｈ，ｔ，Ｊ ５．４）、５．８４〜５．７２（１Ｈ，ｍ）、５．１３〜５．０１（１Ｈ，ｍ）、４．３１〜４．１９（３Ｈ，ｍ）、３．９３〜３．７９（３Ｈ，ｍ）、３．００〜２．９０（２Ｈ，ｍ）、２．３１〜２．０７（４Ｈ，ｍ）、１．９１〜１．７８（２Ｈ，ｍ）、１．７５〜１．４９（２Ｈ，ｍ）、１．４５〜１．２２（４Ｈ，ｍ）、０．９１〜０．７５（１Ｈ，ｍ）、０．６２〜０．４５（２Ｈ，ｍ）、０．４３〜０．３２（２Ｈ，ｍ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）１７３．９、１５６．４、１５６．１、１４３．８、１４０．７、１３７．９、１３１．０、１２７．６、１２７．０、１２５．２、１２０．１、７９．１、６７．９、６５．６、５３．８、４６．６、３８．１、３３．４、３１．９、３０．４、２９．０、２７．２、２４．３、２２．８、２１．２、２０．２；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ５４５（１００％［Ｍ−Ｈ］⁻）。

【0196】

ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ（３：１、８ｍＬ）中のエキソ−ｓＴＣＯＫ Ｓ４９の撹拌溶液に、水酸化リチウム一水和物（９４ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液をスズ箔で包み、室温で４時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）及びＨ_２Ｏ（１００ｍＬ）を添加した。水相をＡｃＯＨの添加により慎重にｐＨ４まで酸性化し、ＥｔＯＡｃ（４×１００ｍＬ）で抽出した。水相を減圧下で蒸発させ、凍結乾燥させて、エキソ−ｓＴＣＯＫ３を白色の固体として得た。それに続く哺乳動物細胞を使用した全ての標識実験について、エキソ−Ｈ−ｂｃｎＫ−ＯＨ１を逆相ＨＰＬＣ（０：１のＨ_２Ｏ：ＭｅＣＮから９：１のＨ_２Ｏ：ＭｅＣＮの勾配）によってさらに精製した。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）７．２１〜７．０９（１Ｈ，ｂｒ ｍ）、５．８５〜５．７２（１Ｈ，ｍ）、５．１４〜５．０２（１Ｈ，ｍ）、３．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ ２．６）、３．１４〜３．０５（１Ｈ，ｍ）、２．９８〜２．８６（２Ｈ，ｍ）、２．３１〜２．０８（４Ｈ，ｍ）、１．９２〜１．７８（２Ｈ，ｍ）、１．７３〜１．６５（１Ｈ，ｍ）、１．５５〜１．４４（１Ｈ，ｍ）、１．４１〜１．２５（４Ｈ，ｍ）、０．９０〜０．６２（１Ｈ，ｍ）、０．６５〜０．４５（２Ｈ，ｍ）、０．４３〜０．３２（２Ｈ，ｍ）；δ_Ｃ（１０１ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）１７５．５、１５６．３、１３７．９、１３１．１、６７．８、５４．５、３８．１、３３．４、３２．１、３２．０、２９．２、２７．２、２４．７、２４．３、２２．５、２１．２、２０．２；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：ｍ／ｚ ３２５（１００％［Ｍ＋Ｈ］^＋）。

【0197】

補足の実施例の参考文献：
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6. Royzen, M., Yap, G.P. & Fox, J.M. A photochemical synthesis of functionalized trans-cyclooctenes driven by metal complexation. Journal of the American Chemical Society 130, 3760-1 (2008).
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【0198】

本文の参考文献：
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(22) Nguyen, D. P.; Elliott, T.; Holt, M.; Muir, T. W.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2011, 133, 11418.
(23) Neumann, H.; Peak-Chew, S. Y.; Chin, J. W. Nat Chem Biol 2008, 4, 232.
(24) Polycarpo, C. R.; Herring, S.; Berube, A.; Wood, J. L.; Soll, D.; Ambrogelly, A. FEBS Lett 2006, 580, 6695.
(25) Li, X.; Fekner, T.; Ottesen, J. J.; Chan, M. K. Angew Chem Int Ed Engl 2009, 48, 9184.
(26) Wang, Y. S.; Fang, X.; Wallace, A. L.; Wu, B.; Liu, W. R. Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 2950.
(27) Mukai, T.; Kobayashi, T.; Hino, N.; Yanagisawa, T.; Sakamoto, K.; Yokoyama, S. Biochem Biophys Res Commun 2008, 371, 818.
(28) Hancock, S. M.; Uprety, R.; Deiters, A.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2010, 132, 14819.
(29) Greiss, S.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2011.
(30) Lin, S. X.; Zhang, Z. R.; Xu, H.; Li, L.; Chen, S.; Li, J.; Hao, Z. Y.; Chen, P. R. Journal of the American Chemical Society 2011, 133, 20581.
(31) Gautier, A.; Nguyen, D. P.; Lusic, H.; An, W.; Deiters, A.; Chin, J. W. J Am Chem Soc 2010, 132, 4086.
(32) Virdee, S.; Kapadnis, P. B.; Elliott, T.; Lang, K.; Madrzak, J.; Nguyen, D. P.; Riechmann, L.; Chin, J. W. Journal of the American Chemical Society 2011, 133, 10708.

【0199】

上記の明細書で述べた全ての出版物は、参照により本明細書に組み入れられる。記載された本発明の態様及び実施形態の本発明の範囲から逸脱しない様々な改変及びバリエーションが当業者には明らかであると予想される。具体的な好ましい実施形態に関して本発明を説明したが、特許請求された発明は、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されよう。実際に、説明された本発明を実行するための当業者にとっては明らかな様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]