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特許6347795癌治療のための新規の組成物および方法

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6347795

(24)【登録日】2018年6月8日

(45)【発行日】2018年6月27日

(54)【発明の名称】癌治療のための新規の組成物および方法

(51)【国際特許分類】

A61K 31/343 20060101AFI20180618BHJP

A61K 45/06 20060101ALI20180618BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20180618BHJP

C07K 16/28 20060101ALN20180618BHJP

【ＦＩ】

A61K31/343

A61K45/06

A61P35/00

!C07K16/28ZNA

【請求項の数】40

【外国語出願】

【全頁数】52

(21)【出願番号】特願2016-4076(P2016-4076)

(22)【出願日】2016年1月13日

(62)【分割の表示】特願2014-177915(P2014-177915)の分割

【原出願日】2008年9月10日

(65)【公開番号】特開2016-65101(P2016-65101A)

(43)【公開日】2016年4月28日

【審査請求日】2016年1月13日

(31)【優先権主張番号】60/971,144

(32)【優先日】2007年9月10日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/013,372

(32)【優先日】2007年12月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510055334

【氏名又は名称】ボストンバイオメディカル，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本健策

(72)【発明者】

【氏名】リーチャンチア

(72)【発明者】

【氏名】キースミクル

(72)【発明者】

【氏名】リーユーチー

【審査官】山村祥子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００７／０８７１２９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２００７／０６１８８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００６／０１４３５９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２００６−５０８９８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７−５１３８９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 J. Nat. Prod.，２０００年，Vol.63，p.492-495

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ３１／３４３

Ａ６１Ｋ４５／０６

Ａ６１Ｐ３５／００

Ｃ０７Ｋ１６／２８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、および薬学的に許容されるその塩または溶媒和物からなる群から選択される第１の作用物質を含む組成物と、
（ｂ）対標的剤、生物剤、ホルモン剤、ＨＤＡＣ阻害剤、レチノイド剤、チェックポイント活性化剤、プロテアソーム阻害剤、アジュバント剤および補助剤からなる群から選択される第２の作用物質を含む組成物または放射線療法を実施する物と
を含む、癌を処置または予防するための組み合わせ物。

【請求項2】

前記第２の作用物質は抗がん剤である、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項3】

前記放射線療法は、放射性物質または放射線増感剤を用いて実施される、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項4】

前記生物剤が、インターロイキン−２（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球ＣＳＦ（フィルグラスチン）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（サルグラモスチム）、シントレデキンベスドトクス（ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ）、バチルスカルメット−ゲラン、レバミゾール、オクトレオチド、アガトリモド（ＣＰＧ７９０９）、シプロイセルＴ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標））、ＧＶＡＸ、Ｍｙｖａｘ、Ｆａｖｌｄ、レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｅｌｏｔａｒｇ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、エンドスタチン、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ザノリムマブ、オファツムマブ、マパツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）、ペルツズマブ、ボロシキシマブ（Ｍ２００）、ＳＧＮ−３０、マツズマブ、アデカツマブ、デノスマブ、ザルツムマブ、イラツムマブ（ＭＤＸ−０６０）、ニモツズマブ、ファーレツズマブ（ＭＯＲＡｂ−００３）、Ｖｉｔａｘｉｎ、イピリムマブ（ＭＤＸ−１０１）、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０）、ＤＰＣ４抗体、ＮＦ−１抗体、ＮＦ−２抗体、Ｒｂ抗体、ｐ５３抗体、ＷＴ１抗体、ＢＲＣＡ１抗体、ＢＲＣＡ２抗体、ガングリオシド（ＧＭ２）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原（ＭＡＲＴ−１、ｇａｐ１００、ＭＡＧＥ１，３チロシン）ならびに乳頭腫ウイルスＥ６およびＥ７断片からなる群から選択される、請求項１または２に記載の組み合わせ物。

【請求項5】

前記ホルモン剤が、ジエチルスチベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｂｅｓｔｒｏｌ）、タモキシフェン、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））、トレミフェン（Ｔｏｒｍｉｆｅｎｅ）、フルオキシメステロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、ニルタミド、フルタミド、アミノグルテチミド、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、テトラゾール、ケトコナゾール、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）類似体、酢酸ゴセレリン、ロイプロリド、酢酸メゲストロール、ミフェプリストンおよびプレドニゾン（Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ）からなる群から選択される、請求項１または２に記載の組み合わせ物。

【請求項6】

前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ヒドロキサミド酸サブエロイルアニリド（ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅｈｙｄｒｏｘａｍｉｄｅａｃｉｄ）（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）およびロミデプシン（ＦＫ２２８）からなる群から選択される、請求項１または２に記載の組み合わせ物。

【請求項7】

前記レチノイド剤が、ベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（登録商標））およびカルシトリオール（ＤＮ１０１）からなる群から選択される、請求項１または２に記載の組み合わせ物。

【請求項8】

前記チェックポイント活性化剤がβ−ラパコン（ＡＲＱ５０１）である、請求項１または２に記載の組み合わせ物。

【請求項9】

前記補助剤が、アプレピタント（Ｅｍｅｎｄ（登録商標））、オンダンセトロン（Ｚｏｆｒａｎ（登録商標））、ロラゼパム、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、ジフェンヒドラミン（Ｂｅｎａｄｒｙｌ（登録商標））、ラニチジン（Ｚａｎｔａｃ（登録商標））、シメチジン（Ｔａｇａｍｅｔ（登録商標））、ラニチジン、ファモチジン、エポエチンアルファ（プロクリット）、エポエチンアルファ（Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標））、フィルグラスチム（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））、オプレルベキン（Ｎｅｕｍｅｇａ（登録商標））、ロイコボリンおよびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組み合わせ物。

【請求項10】

前記組成物（ａ）が少なくとも１つの癌幹細胞の自己再生を阻害するためのものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

【請求項11】

前記組成物（ａ）が少なくとも１つの癌幹細胞を死滅させるためのものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

【請求項12】

前記組成物（ａ）が少なくとも別の癌幹細胞の自己再生を阻害するためのものである、
請求項１１に記載の組み合わせ物。

【請求項13】

前記癌が、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、腎細胞癌、黒色腫、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸癌、肉腫、脳腫瘍、胃癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、肝癌（ｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、子宮内膜癌、子宮癌、甲状腺癌、唾液腺癌、髄芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｎｃｅｒ）、胃腸癌、グリア芽細胞腫、肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、腎臓癌、外陰部癌および肝癌（ｈｅｐａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組み合わせ物。

【請求項14】

前記癌が転移性であるか、前記第２の作用物質もしくは前記放射線療法に抵抗性であるか、または再発性である、請求項１３に記載の組み合わせ物。

【請求項15】

前記組成物（ｂ）の投与もしくは前記放射線療法の実施の前に前記組成物（ａ）が投与される、または、前記組成物（ａ）の投与の前に前記組成物（ｂ）が投与される、もしくは前記放射線療法が実施される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

【請求項16】

前記組成物（ａ）の投与の間に、前記組成物（ｂ）が投与される、もしくは前記放射線療法が実施される、または前記組成物（ｂ）の投与もしくは前記放射線療法の実施の間に、前記組成物（ａ）が投与されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

【請求項17】

前記組成物（ａ）、前記組成物（ｂ）、および前記放射線療法に用いる薬剤の少なくとも１つが、経口、鼻、局所、直腸、膣または非経口の投与、または腹腔内、静脈内（ＩＶ）、皮下もしくは筋肉内の注射の経路を介して投与される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

【請求項18】

前記組成物（ａ）が経口経路を介して投与される、請求項１７に記載の組み合わせ物。

【請求項19】

前記組成物（ａ）が、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

【請求項20】

前記組成物（ａ）が、放射線療法と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

【請求項21】

（ａ）２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、および薬学的に許容されるその塩または溶媒和物からなる群から選択される第１の作用物質を含む、癌を処置または予防するための医薬組成物であって、前記第１の作用物質は、
（ｂ）対標的剤、生物剤、ホルモン剤、ＨＤＡＣ阻害剤、レチノイド剤、チェックポイント活性化剤、プロテアソーム阻害剤、アジュバント剤および補助剤からなる群から選択される第２の作用物質、または放射線療法
と組み合わせて投与されることを特徴とする、医薬組成物。

【請求項22】

前記第２の作用物質は抗がん剤である、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

前記放射線療法は、放射性物質または放射線増感剤を用いて実施される、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項24】

【請求項25】

【請求項26】

前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ヒドロキサミド酸サブエロイルアニリド（ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅｈｙｄｒｏｘａｍｉｄｅａｃｉｄ）（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）およびロミデプシン（ＦＫ２２８）からなる群から選択される、請求項２１または２２に記載の医薬組成物。

【請求項27】

前記レチノイド剤が、ベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（登録商標））およびカルシトリオール（ＤＮ１０１）からなる群から選択される、請求項２１または２２に記載の医薬組成物。

【請求項28】

前記チェックポイント活性化剤がβ−ラパコン（ＡＲＱ５０１）である、請求項２１または２２に記載の医薬組成物。

【請求項29】

【請求項30】

前記組成物（ａ）が少なくとも１つの癌幹細胞の自己再生を阻害するためのものである、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項31】

前記組成物（ａ）が少なくとも１つの癌幹細胞を死滅させるためのものである、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項32】

前記組成物（ａ）が少なくとも別の癌幹細胞の自己再生を阻害するためのものである、
請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項33】

【請求項34】

前記癌が転移性であるか、前記第２の作用物質もしくは前記放射線療法に抵抗性であるか、または再発性である、請求項３３に記載の医薬組成物。

【請求項35】

前記第２の作用物質の投与もしくは前記放射線療法の実施の前に前記第１の作用物質が投与される、または、前記第１の作用物質の投与の前に前記第２の作用物質が投与される、もしくは前記放射線療法が実施される、請求項２１〜３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項36】

前記第１の作用物質の投与の間に、前記第２の作用物質が投与される、もしくは前記放射線療法が実施される、または前記第２の作用物質の投与もしくは前記放射線療法の実施の間に、前記第１の作用物質が投与されることを特徴とする、請求項２１〜３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項37】

前記第１の作用物質、前記第２の作用物質、および前記放射線療法に用いる薬剤の少なくとも１つが、経口、鼻、局所、直腸、膣または非経口の投与、または腹腔内、静脈内（ＩＶ）、皮下もしくは筋肉内の注射の経路を介して投与される、請求項２１〜３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項38】

前記第１の作用物質が経口経路を介して投与される、請求項３７に記載の医薬組成物。

【請求項39】

前記第１の作用物質が、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む、請求項２１〜３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項40】

前記第１の作用物質が、放射線療法と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項２１〜３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願への相互参照）
本願は、それぞれ２００７年９月１０日および２００７年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／９７１，１４４号、６１／０１３，３７２号の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。

【0002】

発明の分野
本発明は、癌および他の障害の組合せの治療での、Ｓｔａｔ３経路阻害剤および癌幹細胞阻害剤の組成物および使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

癌幹細胞（ＣＳＣ）
近年では、腫瘍形成のニューモデルが広く受け入れられ、そこでは、腫瘤全体の小さな画分だけが腫瘍内の腫瘍形成活性を担うと仮定されているが、古いモデルまたはクローン遺伝モデルは、すべての変異腫瘍細胞がそのような腫瘍形成活性に等しく寄与すると仮定している。ニューモデルに従うと、腫瘍形成性細胞のこの小さな画分は、幹細胞様特性を有する形質転換細胞であり、「癌幹細胞」（ＣＳＣ）と呼ばれる。ＢｏｎｎｅｔおよびＤｉｃｋは、１９９０年代に、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）におけるＣＳＣの存在をインビボで最初に証明した。彼らのデータは、免疫不全マウスに移植すると、ヒトＡＭＬ細胞の小さな亜集団だけがＡＭＬを転移させる能力を有し、他のＡＭＬ細胞は白血病を誘発することができないことを示した。後に、これらのＣＳＣは、原始造血幹細胞と同じ細胞マーカー、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８⁻を有することが判明した［１］。それ以来、研究者は、脳、乳房、皮膚、前立腺その他の腫瘍を含む各種の腫瘍で、ＣＳＣを確定的に認めた。

【0004】

腫瘍形成のＣＳＣモデルは、腫瘍移植を確立するために、数万または数十万の腫瘍細胞を実験動物に注入する必要がある理由を説明するであろう。ヒトＡＭＬでは、これらの細胞の頻度は、１０，０００分の１未満である［２］。所与の腫瘍細胞集団内で稀であるとしても、そのような細胞がほとんどすべての腫瘍型に存在するという証拠が増えている。しかし、癌細胞系は、組織培養で成長するように特に適応させた癌細胞の亜集団から選択されるので、癌細胞系の生物学的特性および機能的特性は、劇的な変化を経る可能性がある。したがって、すべての癌細胞系が、ＣＳＣを含むというわけではない。

【0005】

癌幹細胞は、多くの類似した形質を正常幹細胞と共有する。例えば、ＣＳＣは、限られた分裂数とは対照的に、自己再生能力、すなわち、さらなる腫瘍形成性癌幹細胞を、一般的に他の分裂腫瘍細胞よりも遅い速度で生成する能力を有する。ＣＳＣは、複数の細胞型に分化する能力を有するが、そのことは、多くの腫瘍が宿主器官に固有の複数の細胞型を含むだけでなく、不均一性が腫瘍転移で通常保持されもするという、組織学的証拠を説明するであろう。ＣＳＣは、基本的に腫瘍形成、癌転移および癌再発を担うことが証明されている。ＣＳＣは、腫瘍開始細胞、癌幹様細胞、幹様癌細胞、高度腫瘍形成性細胞、腫瘍幹細胞、固形腫瘍幹細胞または超悪性細胞とも呼ばれる。

【0006】

癌幹細胞の存在は、将来の癌治療および療法に、基本的な関連性を有する。現在の癌治療の効力は、試験の初期の段階では、腫瘍縮みのサイズ、すなわち死滅する腫瘤の量でしばしば測定される。ＣＳＣは腫瘍の非常に小さな割合を形成し、それらのより分化した後代よりも著しく異なる生物特性を有するので、腫瘤の測定は、幹細胞に特異的に作用する薬剤を必ずしも選択できるわけではない。実際、癌幹細胞は、放射線療法（ＸＲＴ）に耐性であるようで、化学療法薬および対標的薬剤にも治療抵抗性である［３〜５］。正常な体細胞性幹細胞は本来化学療法剤に耐性である−それらは、薬剤を送り出す様々なポンプ（ＭＤＲなど）を有し、効率的なＤＮＡ修復機構を備える。さらに、それらは遅い速度の細胞ターンオーバーも有するが、化学療法剤は複製速度の速い細胞を標的にする。正常幹細胞の突然変異した対応物である癌幹細胞は、それらが薬剤療法および放射線治療を生き延びることを可能にする、類似した機構を有することもできる。言い換えると、従来の化学療法および放射線療法は、腫瘍を再生することができない腫瘍の大部分を形成する、分化した細胞または分化中の細胞を死滅させる。他方、分化した細胞および分化中の細胞をもたらす癌幹細胞の集団は、手付かずの状態であることができ、疾患の再発を引き起こすことができよう。従来の抗癌療法のさらなる危険は、例えば化学療法の治療が、化学療法に耐性の癌幹細胞だけを残し、続いて起こる再発性の腫瘍も化学療法におそらく耐性であろうという可能性である。

【0007】

生存癌幹細胞は腫瘍を再生息させ、再発を引き起こすことができるので、抗癌療法はＣＳＣに対する戦略を含むことが不可避である（図１を参照）。これは、雑草の再成長を阻止するためにタンポポの根部を除去することの必要性に例えられた［６］。癌幹細胞を選択的に標的にすることによって、攻撃的で切除不能な腫瘍、および治療抵抗性もしくは再発性の癌を有する患者を治療すること、ならびに、腫瘍転移および再発を予防することが可能になる。したがって、癌幹細胞を標的にする特異的療法の開発は、癌患者の生存および生活の質の改善に、特に転移癌を有する患者のために希望を与える。この未開拓の可能性の錠を開ける鍵は、癌幹細胞の自己再生および生存にとって選択的に重要である経路の特定および検証である。癌および胚性幹細胞もしくは成体幹細胞での腫瘍形成の基礎をなす複数の経路が過去に解明されているが、癌幹細胞の自己再生および生存についてはいかなる経路も特定、検証されていない。

【0008】

癌幹細胞の特定および単離について、多くの研究がなされてきた。用いられる方法は、薬剤を排出するＣＳＣの能力を主に活用するか、癌幹細胞に関連する表面マーカーの発現に基づく。

【0009】

例えば、ＣＳＣは多くの化学療法剤に耐性であるので、ＣＳＣが、ＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰ−１）などの薬剤流出ポンプ［７〜１１］、および他のＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）スーパーファミリー構成員［１２、１３］をほとんど遍在的に過剰発現することは、驚くべきことでない。したがって、当初、造血幹細胞および白血病幹細胞を富化するために用いられたサイドポピュレーション（ＳＰ）技術も、ＣＳＣの特定および単離のために採用された［１４］。最初にＧｏｏｄｅｌｌらによって記載されたこの技術は、ＣＳＣを濃縮した細胞集団を定義および単離するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２などの蛍光色素の識別的ＡＢＣ輸送体依存性流出を利用する［１０、１５］。具体的には、ＳＰはベラパミルで薬剤流出をブロックすることによって明らかにされ、その時点では、もはや色素をＳＰから排出することができない。

【0010】

研究者は、癌幹細胞と大部分の腫瘍とを区別する特異的マーカーの発見にも集中した。最も一般的に発現されるＣＳＣ表面マーカーには、ＣＤ４４、ＣＤ１３３およびＣＤ１６６が含まれる［１６〜２４］。これらの表面マーカー（複数可）の差次的発現に主に基づく腫瘍細胞の選別は、今日まで記載されている大部分の高度に腫瘍形成性のＣＳＣを説明してきた。したがって、これらの表面マーカーは、癌細胞系、および大半の腫瘍組織からの癌幹細胞の特定および単離のためによく検証される。

【0011】

Ｓｔａｔ３経路。

【0012】

多くの異なる遺伝子欠損が哺乳動物またはヒトの癌細胞にあり、多くのものが、癌の治癒に向けた探求で研究されてきた。例えば、ｐ５３腫瘍サプレッサーは、半分を超えるヒト癌で欠陥があるか、全く欠けていることがわかっている。ＳＴＡＴ（シグナルトランスデューサおよび転写アクチベータ（ＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｅｒｓａｎｄＡｃｔｉｖａｔｏｒｏｆＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ））タンパク質ファミリーは、増殖、生存および他の生物学的過程を促進するために、サイトカイン／成長因子に応じて活性化される潜在性の転写因子である。それらの中で、Ｓｔａｔ３は、成長因子受容体チロシンキナーゼ、ＪａｎｕｓキナーゼまたはＳｒｃファミリーキナーゼなどによって媒介される、重要なチロシン残基のリン酸化によって活性化される。これらのキナーゼには、それらに限定されないが、ＥＧＦＲ、ＪＡＫ、Ａｂｌ、ＫＤＲ、ｃ−Ｍｅｔ、Ｓｒｃ、およびＨｅｒ２が含まれる［２５］。チロシンリン酸化後、Ｓｔａｔ３はホモ二量体を形成し、核に移行し、標的遺伝子のプロモーター領域内の特異的ＤＮＡ応答エレメントに結合し、遺伝子発現を誘導する［２６］（図２を参照）。

【0013】

正常な細胞では、Ｓｔａｔ３活性化は一時的で、厳しく制御されており、３０分〜数時間持続する。しかし、Ｓｔａｔ３は、すべての主要な癌腫ならびに一部の血液系腫瘍を含む、広範なヒト癌で異常に活動的であることがわかっている。Ｓｔａｔ３は、癌の進行において複数の役割を演ずる。強力な転写調節因子として、それは多くの重要な細胞機能に関与する遺伝子、例えばＢｃｌ−ｘｌ、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１、Ｖｅｇｆ、ＭＭＰ−２、およびサバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）を標的にする［２７〜３２］。それは、腫瘍免疫監視機構および免疫細胞動員の重要な負の調節因子でもある［３３〜３５］。

【0014】

アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、Ｓｔａｔ３のドミナントネガティブ型、および／またはチロシンキナーゼの遮断によってＳｔａｔ３シグナル伝達を切断することは、インビトロおよび／またはインビボである癌細胞系または腫瘍を阻害する［２６、２８、３６、３７］。しかし、これまで、Ｓｔａｔ３と癌幹細胞機能の間に、実験的にいかなる明白な関連付けもされていない。また、研究者は、癌幹細胞を含むことが見いだされている癌に関して潜在的治療用途を探究するための、有効なＳｔａｔ３経路阻害剤を見いだしていない。前に記載のように、癌幹細胞（ＣＳＣ）は、基本的に腫瘍形成、癌転移および癌再発の役割を担うことが最近証明されており、それらが腫瘤のどんなに小さい部分を構成しようとも、これらの細胞を有することが公知である腫瘍を標的にするいかなる治癒治療の設計においても考慮するべきである。

【0015】

癌以外の疾患では、インターロイキン６（ＩＬ６）などの様々なサイトカインによるＳｔａｔ３の過度の活性化が、いくつかの自己免疫疾患および炎症性疾患で証明されている［３８］。近年では、Ｓｔａｔ３経路は、ＴＨ１７Ｔ細胞応答の生成におけるその必要不可欠な役割を通して、病的免疫応答を促進することも明らかにされている［３９］。さらに、ＩＬ６−Ｓｔａｔ３経路媒介性の炎症が、アテローム硬化、末梢血管疾患、冠状動脈疾患、高血圧症、骨粗鬆症、２型糖尿病および認知症の共通の原因であることがわかっている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明は、Ｓｔａｔ３が、広範囲の癌にわたって癌幹細胞（ＣＳＣ）の生存能および自己再生能の両方において重要な役割を果たすという本明細書で提供される実験的証拠に一部基づく。本発明は、ある化合物がＳｔａｔ３経路阻害剤として作用し、それらがインビトロおよびインビボの両方で効果的にＣＳＣを阻害することを確認するデータも提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する障害を有する対象を治療する方法であって、
（ａ）前記異常なＳｔａｔ３経路活性の少なくとも一部を阻害するために、前記対象に第１の作用物質を第１の量で投与するステップと、
（ｂ）前記対象にシグナル伝達阻害剤を含む第２の作用物質を第２の量で投与するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記第１の作用物質が、Ｓｔａｔ３タンパク質のリン酸化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の二量体化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の核移行を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質のＤＮＡ結合活性を実質的に阻害すること、およびＳｔａｔ３タンパク質の転写活性を実質的に阻害することからなる群から選択される作用を通してＳｔａｔ３経路活性を阻害する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１の作用物質が、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、および薬学的に許容されるその塩または溶媒和物からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記障害が、自己免疫疾患、炎症性疾患、炎症性腸疾患、関節炎、喘息および全身性エリテマトーデス、自己免疫脱髄障害、アルツハイマー病、脳卒中、虚血再灌流傷害および多発性硬化症からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記障害が癌である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記癌が、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、腎細胞癌、黒色腫、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸癌、肉腫、脳腫瘍、胃癌、多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫からなる群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記第２の作用物質が対標的剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記第２の作用物質が成長因子受容体標的剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記成長因子受容体標的剤が、キナーゼに関連する成長因子受容体を標的にする抗体を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記成長因子受容体が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）または血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記成長因子受容体標的剤が、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、Ｔａｒｃｅｖａ、ＰＤ１５３０３５、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、Ａｖａｓｔｉｎ、パニツムマブ、トラスツズマブおよび抗ｃ−Ｍｅｔ抗体からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記第２の作用物質がキナーゼ標的剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記キナーゼ標的剤がキナーゼ阻害剤を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記キナーゼ標的剤がチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記ＴＫＩが、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、Ｓｕｔｅｎｔ（スニチニブ）、ラパチニブ、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、バンデタニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、セジバニブ、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、ゲフィチニブ（Ｉｒｒｅｓｓａ）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、レスタウルチニブ、ＡＲＱ１９７からなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記キナーゼ標的剤が、セフィチニブ（ｃｅｆｉｔｉｎｉｂ）（Ｉｒｅｓｓａ）、ＺＤ６４７４（ＡＺＤ６４７４）、ＥＭＤ−７２０００（マツズマブ）、パニツマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ）、ＩＣＲ−６２、ＣＩ−１０３３（ＰＤ１８３８０５）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、ＡＥＥ７８８（ピロロ−ピリミジン）、ＥＫＢ−５６９、ＥＸＥＬ７６４７／ＥＸＥＬ０９９９、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ソラフィニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、バンデチニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ）、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）、ＰＴＫ７８７（バタラニブ）、パゾパニブ、ＡＺＤ２１７１、エベロリムス、セリシクリブ、ＡＭＧ７０６、アキシチニブ、ＰＤ０３２５９０１、ＰＫＣ−４１２、ＣＥＰ７０１、ＸＬ８８０、ボスチニブ、ＢＩＢＦ１１２０、ＢＩＢＦ１１２０、ニロチニブ、ＡＺＤ６２４４、ＨＫＩ−２７２、ＭＳ−２７５、ＢＩ２５３６、ＧＸ１５−０７０、ＡＺＤ０５３０、エンザスタウリン、ＭＬＮ−５１８およびＡＲＱ１９７からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記第２の作用物質が新脈管形成阻害剤を含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記新脈管形成阻害剤が、ＣＭ１０１、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、血小板因子−４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、新脈管形成抑制ステロイド＋ヘパリン、軟骨由来新脈管形成阻止因子、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、バチマスタット、マリマスタット、アンギオスタチン、エンドスタチン、２−メトキシエストラジオール、テコガラン、トロンボスポンジン、αＶβ３阻害剤、リノミドおよびＡＤＨ−１からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する癌の対象を治療する方法であって、
（ａ）前記異常なＳｔａｔ３経路活性の少なくとも一部を阻害するために、前記対象に第１の作用物質を第１の量で投与するステップと、
（ｂ）前記対象に第２の抗癌剤を第２の量で投与するステップと
を含む方法。
（項目２０）
前記第１の作用物質が、Ｓｔａｔ３タンパク質のリン酸化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の二量体化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の核移行を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質のＤＮＡ結合活性を実質的に阻害すること、およびＳｔａｔ３タンパク質の転写活性を実質的に阻害することからなる群から選択される作用を通してＳｔａｔ３経路活性を阻害する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記第１の作用物質が、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、および薬学的に許容されるその塩または溶媒和物からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記癌が、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、腎細胞癌、黒色腫、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸癌、肉腫、脳腫瘍、胃癌、多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記第２の作用物質が、少なくとも１つの癌に対する標準の第１選択の治療薬である、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記第２の作用物質が細胞傷害性薬を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
前記第２の作用物質が、ＤＮＡ損傷剤、抗有糸分裂剤および代謝拮抗剤からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２６）
前記ＤＮＡ損傷剤が、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤およびＤＮＡインターカレータからなる群から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記アルキル化剤が、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロルエタミン、メルファラン、ウラシルマスタード、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、カルボプラチン、シスプラチン、サトラプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、ＥＴ−７４３、ＸＬ１１９（ベカテカリン）、ダカルバジン、クロルメチン、ベンダムスチン、トロホスファミド、ウラムスチン、フォテムスチン、ニムスチン、プレドニムスチン、ラニムスチン、セムスチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、マンノスルファン、トレオスルファン、テモゾロミド、カルボコン、トリアジコン、トリエチレンメラミンおよびプロカルバジンからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記トポイソメラーゼ阻害剤が、ドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アントラセンジオン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカトマイシン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、カンプトテシン、ルビテカン、ベロテカン、エトポシド、テニポシドおよびトポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ）からなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記ＤＮＡインターカレータが、プロフラビン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、ダクチノマイシンおよびサリドマイドからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記抗有糸分裂剤が、パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）／Ｔａｘｏｌ、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ＢＭＳ−２７５１８３、Ｘｙｏｔａｘ、Ｔｏｃｏｓａｌ、ビノルレビン（ｖｉｎｏｒｌｅｂｉｎｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンゾリジン、エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド（ＶＭ−２６）、イクサベピロン、ラロタキセル、オルタタキセル、テセタキセルおよびイスピネシブからなる群から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目３１）
前記代謝拮抗剤が、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート、Ｘｅｌｏｄａ、Ａｒｒａｎｏｎ、ロイコボリン、ヒドロキシ尿素、チオグアニン（６−ＴＧ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シタラビン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン（２−ＣＤＡ）、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ボルテゾミブ、アミノプテリン、ラルチトレキセド、クロファラビン、エノシタビン、サパシタビンおよびアザシチジンからなる群から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目３２）
前記第２の作用物質が、カルボプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセルおよびエトポシドからなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目３３）
前記癌が転移性であるか、標準の第１選択の癌治療薬に抵抗性であるか、再発性である、項目１９に記載の方法。
（項目３４）
対象における癌を治療する方法であって、
（ａ）癌幹細胞集団を阻害するために、前記対象に第１の抗癌剤を第１の量で投与するステップと、
（ｂ）癌幹細胞ではない複数の癌性細胞を阻害するために、前記対象に第２の抗癌剤を第２の量で投与するステップと
を含む方法。
（項目３５）
ステップ（ａ）が少なくとも１つの癌幹細胞の自己再生を阻害するステップを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
ステップ（ａ）が少なくとも１つの癌幹細胞を死滅させるステップを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
ステップ（ａ）が少なくとも別の癌幹細胞の自己再生を阻害するステップをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記第１の抗癌剤の前記第１の量が、複数の通常の癌細胞も死滅させる、項目３４に記載の方法。
（項目３９）
ステップ（ａ）において癌幹細胞の少なくとも一部のＳｔａｔ３経路活性を阻害する、項目３４に記載の方法。
（項目４０）
前記第１の抗癌剤が、Ｓｔａｔ３タンパク質のリン酸化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の二量体化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の核移行を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質のＤＮＡ結合活性を実質的に阻害すること、およびＳｔａｔ３タンパク質の転写活性を実質的に阻害することからなる群から選択される作用を通してＳｔａｔ３経路活性を阻害する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記第１の抗癌剤が、小分子Ｓｔａｔ３阻害剤、Ｓｔａｔ３に対するＲＮＡｉ剤、Ｓｔａｔ３に対するアンチセンス剤、ペプチド模倣物Ｓｔａｔ３阻害剤、およびＧ−カルテットオリゴデオキシヌクレオチドＳｔａｔ３阻害剤からなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目４２）
前記第１の抗癌剤が、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、および薬学的に許容されるその塩または溶媒和物からなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目４３）
前記癌が、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、黒色腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、肝癌（ｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ）、胃癌、髄芽細胞腫、脳腫瘍および白血病からなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目４４）
前記第２の作用物質が、少なくとも１つの癌に対する標準の第１選択の治療薬である、項目３４に記載の方法。
（項目４５）
前記第２の作用物質が細胞傷害性薬を含む、項目３４に記載の方法。
（項目４６）
前記第２の作用物質が、ＤＮＡ損傷剤、抗有糸分裂剤および代謝拮抗剤からなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目４７）
前記ＤＮＡ損傷剤が、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤およびＤＮＡインターカレータからなる群から選択される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記アルキル化剤が、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロルエタミン、メルファラン、ウラシルマスタード、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、カルボプラチン、シスプラチン、サトラプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、ＥＴ−７４３、ＸＬ１１９（ベカテカリン）、ダカルバジン、クロルメチン、ベンダムスチン、トロホスファミド、ウラムスチン、フォテムスチン、ニムスチン、プレドニムスチン、ラニムスチン、セムスチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、マンノスルファン、トレオスルファン、テモゾロミド、カルボコン、トリアジコン、トリエチレンメラミンおよびプロカルバジンからなる群から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記トポイソメラーゼ阻害剤が、ドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アントラセンジオン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカトマイシン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、カンプトテシン、ルビテカン、ベロテカン、エトポシド、テニポシドおよびトポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ）からなる群から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記ＤＮＡインターカレータが、プロフラビン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、サリドマイドからなる群から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
前記抗有糸分裂剤が、パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）／Ｔａｘｏｌ、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ＢＭＳ−２７５１８３、Ｘｙｏｔａｘ、Ｔｏｃｏｓａｌ、ビノルレビン（ｖｉｎｏｒｌｅｂｉｎｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンゾリジン、エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド（ＶＭ−２６）、イクサベピロン、ラロタキセル、オルタタキセル、テセタキセルおよびイスピネシブからなる群から選択される、項目４６に記載の方法。
（項目５２）
前記代謝拮抗剤が、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート、Ｘｅｌｏｄａ、Ａｒｒａｎｏｎ、ロイコボリン、ヒドロキシ尿素、チオグアニン（６−ＴＧ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シタラビン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン（２−ＣＤＡ）、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ボルテゾミブ、アミノプテリン、ラルチトレキセド、クロファラビン、エノシタビン、サパシタビンおよびアザシチジンからなる群から選択される、項目４６に記載の方法。
（項目５３）
前記第２の作用物質が、カルボプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセルおよびエトポシドからなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目５４）
前記第２の作用物質が対標的剤を含む、項目３４に記載の方法。
（項目５５）
前記第２の作用物質が成長因子受容体標的剤を含む、項目３４に記載の方法。
（項目５６）
前記成長因子受容体標的剤が、キナーゼに関連する成長因子受容体を標的にする抗体を含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記成長因子受容体が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）または血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）からなる群から選択される、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
前記成長因子受容体標的剤が、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、Ｔａｒｃｅｖａ、ＰＤ１５３０３５、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、Ａｖａｓｔｉｎ、パニツムマブ、トラスツズマブおよび抗ｃ−Ｍｅｔ抗体からなる群から選択される、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
前記第２の作用物質がキナーゼ標的剤を含む、項目３４に記載の方法。
（項目６０）
前記キナーゼ標的剤がキナーゼ阻害剤を含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記キナーゼ標的剤がチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含む、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
前記ＴＫＩが、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、Ｓｕｔｅｎｔ（スニチニブ）、ラパチニブ、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、バンデタニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、セジバニブ、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、ゲフィチニブ（Ｉｒｒｅｓｓａ）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、レスタウルチニブ、ＡＲＱ１９７からなる群から選択される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記キナーゼ標的剤が、セフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、ＺＤ６４７４（ＡＺＤ６４７４）、ＥＭＤ−７２０００（マツズマブ）、パニツマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ）、ＩＣＲ−６２、ＣＩ−１０３３（ＰＤ１８３８０５）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、ＡＥＥ７８８（ピロロ−ピリミジン）、ＥＫＢ−５６９、ＥＸＥＬ７６４７／ＥＸＥＬ０９９９、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ソラフィニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、バンデチニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ）、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）、ＰＴＫ７８７（バタラニブ）、パゾパニブ、ＡＺＤ２１７１、エベロリムス、セリシクリブ、ＡＭＧ７０６、アキシチニブ、ＰＤ０３２５９０１、ＰＫＣ−４１２、ＣＥＰ７０１、ＸＬ８８０、ボスチニブ、ＢＩＢＦ１１２０、ＢＩＢＦ１１２０、ニロチニブ、ＡＺＤ６２４４、ＨＫＩ−２７２、ＭＳ−２７５、ＢＩ２５３６、ＧＸ１５−０７０、ＡＺＤ０５３０、エンザスタウリン、ＭＬＮ−５１８およびＡＲＱ１９７からなる群から選択される、項目５９に記載の方法。
（項目６４）
前記第２の作用物質が新脈管形成阻害剤を含む、項目３４に記載の方法。
（項目６５）
前記新脈管形成阻害剤が、ＣＭ１０１、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、血小板因子−４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、新脈管形成抑制ステロイド＋ヘパリン、軟骨由来新脈管形成阻止因子、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、バチマスタット、マリマスタット、アンギオスタチン、エンドスタチン、２−メトキシエストラジオール、テコガラン、トロンボスポンジン、αＶβ３阻害剤、リノミドおよびＡＤＨ−１からなる群から選択される、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記癌が転移性であるか、標準の第１選択の癌治療薬に抵抗性であるか、再発性である、項目３４に記載の方法。
（項目６７）
対象における癌を治療する方法であって、
（ａ）Ｓｔａｔ３経路活性を阻害するために、前記対象に第１の癌幹細胞阻害剤を第１の量で投与するステップと、
（ｂ）異なる経路の活性を阻害するために、前記対象に第２の癌幹細胞阻害剤を第２の量で投与するステップと
を含む方法。
（項目６８）
前記第２の癌幹細胞阻害剤は、ラパチニブである、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記第２の抗癌剤の前記第２の量が、単独で癌幹細胞集団に対して治療的に有効でない、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
前記癌が、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、黒色腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、肝癌（ｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ）、胃癌、髄芽細胞腫、脳腫瘍および白血病からなる群から選択される、項目６７に記載の方法。
（項目７１）
前記癌が転移性であるか、標準の第１選択の癌治療薬に抵抗性であるか、再発性である、項目６７に記載の方法。
（項目７２）
対象における癌を治療する方法であって、
（ａ）２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、および薬学的に許容されるその塩または溶媒和物からなる群から選択される第１の抗癌剤の治療的有効量を前記対象に投与するステップと、
（ｂ）同群から選択されない第２の抗癌剤を投与するステップと
を含む方法。
（項目７３）
前記第２の作用物質が、少なくとも１つの癌に対する標準の第１選択の治療薬である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記第２の作用物質が細胞傷害性薬を含む、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
前記第２の作用物質が、ＤＮＡ損傷剤、抗有糸分裂剤および代謝拮抗剤からなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
（項目７６）
前記ＤＮＡ損傷剤が、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤およびＤＮＡインターカレータからなる群から選択される、項目８４に記載の方法。
（項目７７）
前記アルキル化剤が、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロルエタミン、メルファラン、ウラシルマスタード、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、カルボプラチン、シスプラチン、サトラプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、ＥＴ−７４３、ＸＬ１１９（ベカテカリン）、ダカルバジン、クロルメチン、ベンダムスチン、トロホスファミド、ウラムスチン、フォテムスチン、ニムスチン、プレドニムスチン、ラニムスチン、セムスチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、マンノスルファン、トレオスルファン、テモゾロミド、カルボコン、トリアジコン、トリエチレンメラミンおよびプロカルバジンからなる群から選択される、項目８５に記載の方法。
（項目７８）
前記トポイソメラーゼ阻害剤が、ドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アントラセンジオン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカトマイシン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、カンプトテシン、ルビテカン、ベロテカン、エトポシド、テニポシドおよびトポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ）からなる群から選択される、項目８５に記載の方法。
（項目７９）
前記ＤＮＡインターカレータが、プロフラビン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、サリドマイドからなる群から選択される、項目８５に記載の方法。
（項目８０）
前記抗有糸分裂剤が、パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）／Ｔａｘｏｌ、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ＢＭＳ−２７５１８３、Ｘｙｏｔａｘ、Ｔｏｃｏｓａｌ、ビノルレビン（ｖｉｎｏｒｌｅｂｉｎｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンゾリジン、エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド（ＶＭ−２６）、イクサベピロン、ラロタキセル、オルタタキセル、テセタキセルおよびイスピネシブからなる群から選択される、項目８４に記載の方法。
（項目８１）
前記代謝拮抗剤が、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート、Ｘｅｌｏｄａ、Ａｒｒａｎｏｎ、ロイコボリン、ヒドロキシ尿素、チオグアニン（６−ＴＧ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シタラビン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン（２−ＣＤＡ）、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ボルテゾミブ、アミノプテリン、ラルチトレキセド、クロファラビン、エノシタビン、サパシタビンおよびアザシチジンからなる群から選択される、項目８４に記載の方法。
（項目８２）
前記第２の作用物質が、カルボプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセルおよびエトポシドからなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
（項目８３）
前記第２の作用物質が対標的剤を含む、項目７２に記載の方法。
（項目８４）
前記第２の作用物質が成長因子受容体標的剤を含む、項目７２に記載の方法。
（項目８５）
前記成長因子受容体標的剤が、キナーゼに関連する成長因子受容体を標的にする抗体を含む、項目９３に記載の方法。
（項目８６）
前記成長因子受容体が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）または血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）からなる群から選択される、項目９３に記載の方法。
（項目８７）
前記成長因子受容体標的剤が、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、Ｔａｒｃｅｖａ、ＰＤ１５３０３５、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、Ａｖａｓｔｉｎ、パニツムマブ、トラスツズマブおよび抗ｃ−Ｍｅｔ抗体からなる群から選択される、項目９３に記載の方法。
（項目８８）
前記第２の作用物質がキナーゼ標的剤を含む、項目７２に記載の方法。
（項目８９）
前記キナーゼ標的剤がキナーゼ阻害剤を含む、項目９７に記載の方法。
（項目９０）
前記キナーゼ標的剤がチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含む、項目９７に記載の方法。
（項目９１）
前記ＴＫＩが、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、Ｓｕｔｅｎｔ（スニチニブ）、ラパチニブ、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、バンデタニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、セジバニブ、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、ゲフィチニブ（Ｉｒｒｅｓｓａ）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、レスタウルチニブ、ＡＲＱ１９７からなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
（項目９２）
前記キナーゼ標的剤が、セフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、ＺＤ６４７４（ＡＺＤ６４７４）、ＥＭＤ−７２０００（マツズマブ）、パニツマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ）、ＩＣＲ−６２、ＣＩ−１０３３（ＰＤ１８３８０５）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、ＡＥＥ７８８（ピロロ−ピリミジン）、ＥＫＢ−５６９、ＥＸＥＬ７６４７／ＥＸＥＬ０９９９、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ソラフィニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、バンデチニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ）、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）、ＰＴＫ７８７（バタラニブ）、パゾパニブ、ＡＺＤ２１７１、エベロリムス、セリシクリブ、ＡＭＧ７０６、アキシチニブ、ＰＤ０３２５９０１、ＰＫＣ−４１２、ＣＥＰ７０１、ＸＬ８８０、ボスチニブ、ＢＩＢＦ１１２０、ＢＩＢＦ１１２０、ニロチニブ、ＡＺＤ６２４４、ＨＫＩ−２７２、ＭＳ−２７５、ＢＩ２５３６、ＧＸ１５−０７０、ＡＺＤ０５３０、エンザスタウリン、ＭＬＮ−５１８およびＡＲＱ１９７からなる群から選択される、項目９７に記載の方法。
（項目９３）
前記第２の作用物質が新脈管形成阻害剤を含む、項目７２に記載の方法。
（項目９４）
前記新脈管形成阻害剤が、ＣＭ１０１、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、血小板因子−４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、新脈管形成抑制ステロイド＋ヘパリン、軟骨由来新脈管形成阻止因子、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、バチマスタット、マリマスタット、アンギオスタチン、エンドスタチン、２−メトキシエストラジオール、テコガラン、トロンボスポンジン、αＶβ３阻害剤、リノミドおよびＡＤＨ−１からなる群から選択される、項目１０２に記載の方法。
（項目９５）
前記癌が転移性であるか、標準の第１選択の癌治療薬に抵抗性であるか、再発性である、項目７２に記載の方法。
（項目９６）
前記癌が、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、黒色腫、肉腫、肝癌（ｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍および白血病からなる群から選択される、項目７２に記載の方法。
（項目９７）
前記対象に薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を投与するステップをさらに含む、項目１、１９、３４、６７および７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
前記作用物質の少なくとも１つが、経口、鼻、局所、直腸、膣または非経口の投与、または静脈内（ＩＶ）、皮下もしくは筋肉内の注射からなる群から選択される様式で投与される、項目１、１９、３４、６７および７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記第２の作用物質が、放射線療法剤、生物剤、ホルモン剤、ＨＤＡＣ阻害剤、レチノイド剤、チェックポイント活性化剤、プロテアソーム阻害剤、アジュバント剤および補助剤からなる群から選択される、項目１９、３４および７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記放射線療法剤が放射性物質または放射線増感剤を含む、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記ＤＮＡトポイソメラーゼ調整剤が、ドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アントラセンジオン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカトマイシン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）およびトポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ）からなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
（項目１０２）
前記生物剤が、インターロイキン−２（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球ＣＳＦ（フィルグラスチン）、顆粒球、マクロファージＣＳＦ（サルグラモスチム）、ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ、バチルスカルメット−ゲラン、レバミゾール、オクトレオチド、ＣＰＧ７９０９、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ、ＧＶＡＸ、Ｍｙｖａｘ、Ｆａｖｌｄ、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（レナリドミド）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、Ｍｙｅｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、エンドスタチン、Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブチウキセタン）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、ザノリムマブ、オファツムマブ、ＨＧＳ−ＥＴＲ１、ペルツズマブ、Ｍ２００、ＳＧＮ−３０、マツズマブ、アデカツマブ、デノスマブ、ザルツムマブ、ＭＤＸ−０６０、ニモツズマブ、ＭＯＲＡｂ−００３、Ｖｉｔａｘｉｎ、ＭＤＸ−１０１、ＭＤＸ−０１０、ＤＰＣ４抗体、ＮＦ−１抗体、ＮＦ−２抗体、Ｒｂ抗体、ｐ５３抗体、ＷＴ１抗体、ＢＲＣＡ１抗体、ＢＲＣＡ２抗体、ガングリオシド（ＧＭ２）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原（ＭＡＲＴ−１、ｇａｐ１００、ＭＡＧＥ１，３チロシン）ならびに乳頭腫ウイルスＥ６およびＥ７断片からなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
（項目１０３）
前記ホルモン剤が、ジエチルスチベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｂｅｓｔｒｏｌ）、タモキシフェン、Ａｒｏｍａｓｉｎ、Ｔｏｒｍｉｆｅｎｅ、フルオキシメステロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、ニルタミド、フルタミド、アミノグルテチミド、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）、テトラゾール、ケトコナゾール、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）類似体、酢酸ゴセレリン、ロイプロリド、酢酸メゲストロール、ミフェプリストンおよびプレドニゾン（Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ）からなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
（項目１０４）
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ヒドロキサミド酸サブエロイルアニリド（ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅｈｙｄｒｏｘａｍｉｄｅａｃｉｄ）（ＳＡＨＡ）、ＰＸＤ１０１およびＦＫ２２８からなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
（項目１０５）
前記レチノイド剤が、ＴａｒｇｒｅｔｉｎおよびＤＮ１０１からなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
（項目１０６）
前記チェックポイント活性化剤がＡＲＱ５０１である、項目９９に記載の方法。
（項目１０７）
前記補助剤が、アプレピタント（Ｅｍｅｎｄ）、オンダンセトロン（Ｚｏｆｒａｎ）、ロラゼパム、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ）、ジフェンヒドラミン（Ｂｅｎａｄｒｙｌ）、ラニチジン（Ｚａｎｔａｃ）、シメチジン（Ｔａｇａｍｅｔ）、ラニチジン、ファモチジン、シメチジン、プロクリット、Ｅｐｏｇｅｎ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、Ｎｅｕｍｅｇａ、ロイコボリンおよびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
（項目１０８）
第２の作用物質がＤａｃｏｇｅｎ（デシタビン）、Ｔｅｌｃｙｔａ（カンホスファミド）、ＥＦＡＰＲＯＸＹＮ、ＺａｒｎｅｓｔｒａおよびＩｏｎａｆａｒｎｉｂ、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、イオドキシフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール、エクセメスタン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、酢酸シプロテロン、酢酸ゴセレリン、ロイプロリド、フィナステリド、メタロプロテアーゼ阻害剤、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体機能阻害剤、成長因子抗体、成長因子受容体抗体、ベバシズマブ、セツキシマブ、セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、プリンおよびアデノシン類似体、シトシンアラビノシド、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、チオテパ、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンフルニン、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロン類似体、ディスコデルモリド類似体、エロイテロビン類似体、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、フラボピリドール、プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブおよび生体応答調節剤、アンドロゲン受容体アンタゴニスト、ＬＨ／ＲＨアンタゴニスト、タキサン類似体ならびにエストロゲン受容体アンタゴニストからなる群から選択される、項目１９、３４および７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記癌が、肺癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝癌（ｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ）、頭頸部癌、膵臓癌、脳腫瘍、胃癌および前立腺癌からなる群から選択される、項目１９、３４および７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、および薬学的に許容されるその塩または溶媒和物からなる群から選択される第１の抗癌剤の治療的有効量、ならびに
細胞傷害性薬、対標的剤、放射線療法剤、生物剤、ホルモン剤、ＨＤＡＣ阻害剤、レチノイド剤、チェックポイント活性化剤、プロテアソーム阻害剤、アジュバント剤および補助剤からなる群から選択される第２の抗癌治療薬を含む医薬組成物。
（項目１１１）
薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む、項目１１０に記載の医薬組成物。

【0017】

したがって、本発明の第１の態様は、異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する障害を有する対象を治療する方法であって、（ａ）異常なＳｔａｔ３経路活性の少なくとも一部を阻害するために、対象に第１の作用物質の第１の量を投与するステップと、（ｂ）対象にシグナル伝達阻害剤を含む第２の作用物質の第２の量を投与するステップとを含む方法を提供する。

【0018】

第１の作用物質は、以下の作用のうちの少なくとも１つを通して、Ｓｔａｔ３経路活性を阻害することができる：Ｓｔａｔ３タンパク質のリン酸化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の二量体化を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質の核移行を実質的に阻害すること、Ｓｔａｔ３タンパク質のＤＮＡ結合活性を実質的に阻害すること、およびＳｔａｔ３タンパク質の転写活性を実質的に阻害すること。

【0019】

一実施形態では、第１の作用物質は、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、その鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体およびその塩または溶媒和物（以下、「本発明の化合物」と称する）からなる群から選択される。

【0020】

本発明の第１の態様の方法によって治療することができる癌以外の障害には、それらに限定されないが、自己免疫疾患、炎症性疾患、炎症性腸疾患、関節炎、喘息および全身性エリテマトーデス、自己免疫脱髄障害、アルツハイマー病、脳卒中、虚血再灌流傷害および多発性硬化症が含まれる。本方法によって治療することができる癌には、それらに限定されないが、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、腎細胞癌、黒色腫、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸癌、肉腫、脳腫瘍、胃癌、多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫が含まれる。これらの癌以外の障害および癌性の障害は、異常なＳｔａｔ３経路活性に関連することが公知である。

【0021】

１つの特徴では、第２の作用物質は対標的剤であり、それは、成長因子受容体標的剤、キナーゼ標的剤または新脈管形成阻害剤であってよい。

【0022】

第２の態様では、本発明は、異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する癌の対象を治療する方法であって、（ａ）異常なＳｔａｔ３経路活性の少なくとも一部を阻害するために、対象に第１の作用物質の第１の量を投与するステップと、（ｂ）対象に第２の抗癌剤の第２の量を投与するステップとを含む方法を提供する。

【0023】

第１の作用物質に関する特徴は、本発明の第１の態様に関して記載される特徴に類似することができるが、第２の抗癌剤は、細胞傷害性薬または化学療法剤であることができる。一実施形態では、第２の作用物質は、少なくとも１つの癌に対する標準の第１選択の治療薬である。

【0024】

１つの特徴では、抗癌剤はＤＮＡ損傷剤、抗有糸分裂剤および／または代謝拮抗剤である。例えば、ＤＮＡ損傷剤は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤またはＤＮＡインターカレータであることができる。一実施形態では、第２の作用物質は、カルボプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセルまたはエトポシドの１つである。

【0025】

本発明の第２の態様の方法によって治療することができる癌には、異常なＳｔａｔ３経路活性に関連することが公知であるものが含まれ、それらは上で記載されているので、ここでは繰り返さない。

【0026】

癌幹細胞は放射線療法および従来の化学療法に一般に耐性であるので、癌幹細胞を標的にする薬剤は、他の抗癌療法と併用される場合、相乗効果を有するはずである。したがって、本発明の第３の態様によれば、対象の癌を治療する方法は、（ａ）癌幹細胞（ＣＳＣ）集団を阻害するために、対象に第１の抗癌剤の第１の量を投与するステップと、（ｂ）複数の通常の癌細胞を阻害するために、対象に第２の抗癌剤の第２の量を投与するステップとを含む。

【0027】

様々な実施形態では、この方法のステップ（ａ）は、少なくとも１つのＣＳＣの自己再生を阻害し、かつ／または少なくとも１つのＣＳＣを死滅させる。一実施形態では、第１の抗癌剤の第１の量は、複数の通常の癌細胞も死滅させる。一実施形態では、ステップ（ａ）において、癌幹細胞で少なくとも一部のＳｔａｔ３経路活性を阻害する。本発明はＳｔａｔ３経路阻害剤がＣＳＣを効果的に阻害することができるという証拠を提供しているので、第１の抗癌剤は、本発明の第１の態様による方法の第１の作用物質と同じ特徴および特性を共有する。共有される特徴には、例えば、ここで挙げる第１の抗癌剤が標的にすることができるＳｔａｔ３経路の様々な段階が含まれる。様々な実施形態では、第１の抗癌剤は、小分子Ｓｔａｔ３阻害剤、Ｓｔａｔ３に対するＲＮＡｉ剤、Ｓｔａｔ３に対するアンチセンス剤、ペプチド模倣物Ｓｔａｔ３阻害剤、またはＧ−カルテットオリゴデオキシヌクレオチドＳｔａｔ３阻害剤であってよい。

【0028】

この方法によって治療することができる癌は、好ましくは、ＣＳＣを含むことが公知であるかＣＳＣを含むことが確認されているものであり、それらには、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、黒色腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、肝癌（ｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ）、胃癌、髄芽細胞腫、脳腫瘍および白血病が含まれるが、これらに限定されない。

【0029】

本発明の第３の態様による方法の「第２の抗癌剤」は、本発明の第２の態様による方法の同じ「第２の抗癌剤」であることができるが、共有されるすべての特徴をここで繰り返すことはしない。

【0030】

一実施形態では、第２の作用物質は、少なくとも１つの癌に対する標準の第１選択の治療薬である。第２の作用物質は、細胞傷害性薬であることができる。１つの特徴では、抗癌剤はＤＮＡ損傷剤、抗有糸分裂剤および／または代謝拮抗剤である。例えば、ＤＮＡ損傷剤は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤またはＤＮＡインターカレータであることができる。一実施形態では、第２の作用物質は、カルボプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセルまたはエトポシドの１つである。

【0031】

本発明の第４の態様によれば、対象の癌を治療する方法であって、（ａ）Ｓｔａｔ３経路活性を阻害するために、対象に第１の癌幹細胞阻害剤の第１の量を投与するステップと、（ｂ）異なる経路の活性を阻害するために、対象に第２の癌幹細胞阻害剤の第２の量を投与するステップとを含む方法が提供される。

【0032】

一実施形態では、第２の癌幹細胞阻害剤は、ラパチニブである。一部の実施形態では、第２の抗癌剤の第２の量は、それ単独では癌幹細胞集団に対して治療的に有効でない。この方法によって治療することができる癌は、好ましくはＣＳＣを含むことが公知であるかＣＳＣを含むことが確認されているものであり、一部の例は上に記載されている。様々な実施形態では、癌は転移性であるか、標準の第１選択の癌治療薬に抵抗性であるか、再発性である。

【0033】

本発明の第５の態様によれば、対象の癌を治療する方法であって、（ａ）２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、および薬学的に許容されるその塩または溶媒和物からなる群から選択される第１の抗癌剤の治療的有効量を対象に投与するステップと、（ｂ）同群から選択されない第２の抗癌剤を投与するステップとを含む方法が提供される。

【0034】

第２の抗癌剤は、細胞傷害性薬または化学療法剤のいずれか、および対標的剤のいずれかを含む、本発明の他の態様に記載される作用物質のいずれかでよい。

【0035】

第６の態様では、本発明は、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、および薬学的に許容されるその塩または溶媒和物からなる群から選択される第１の抗癌剤の治療的有効量、ならびに、細胞傷害性薬、対標的剤、放射線療法剤、生物剤、ホルモン剤、ＨＤＡＣ阻害剤、レチノイド剤、チェックポイント活性化剤、プロテアソーム阻害剤、アジュバント剤または補助剤からなる群から選択される第２の抗癌治療薬を含む医薬組成物を提供する。

【0036】

一実施形態では、本組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む。

【0037】

本明細書で記載される方法および本発明の実施形態に関連するすべての組成物およびキットを含む他の態様は、示されるか、本発明の以下の詳細な記載から容易に明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】癌幹細胞特異的療法および従来の癌療法の違いを示す図である。

【図2】癌におけるＳｔａｔ３経路を示す図である。

【図3】図３Ａは、Ｓｔａｔ３が、Ｈｏｅｃｈｓｔサイドポピュレーション細胞において構成的に活性であることを示す図である。図３Ｂは、Ｓｔａｔ３が、ＣＤ１３３^＋細胞において構成的に活性であることを示す図である。

【図4】癌幹細胞において、Ｓｔａｔ３のノックダウンがアポトーシスを誘導することを示す図である。

【図5】癌幹細胞において、Ｓｔａｔ３のノックダウンが、癌幹細胞の球体形成性を阻害することを示す図である。

【図6】化合物４０１が、Ｓｔａｔ３の転写活性化活性を阻害することを示す図である。

【図7】図７Ａは、化合物４０１が、核抽出物においてＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を阻害することを示す図である。図７Ｂは、化合物４０１、４１６および４１８が、核抽出物においてＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を阻害することを示す図である。

【図8】図８Ａは、化合物４０１が、異種移植腫瘍組織においてＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を阻害することを示す図である。図８Ｂは、化合物４０１が、異種移植腫瘍組織において、Ｓｔａｔ３下流エフェクターの発現レベルを阻害することを示す図である。

【図9A】Ｈｏｅｃｈｓｔサイドポピュレーションのソーティングおよび分析を示す図である。

【図9B】Ｈｏｅｃｈｓｔサイドポピュレーションが、非サイドポピュレーションと同じ程度に化合物４０１に対して感受性であることを示す図である。

【図10】図１０Ａは、化合物４０１が、Ｈｏｅｃｈｓｔサイドポピュレーション細胞に対してアポトーシス性であることを示す図である。図１０Ｂは、化合物４０１が、ＣＤ１３３^＋細胞に対してアポトーシス性であることを示す図である。

【図11】化合物４０１が、ＣＤ４４^高の球体形成を遮断することを示す図である。

【図12】インビボの化合物４０１による処置が、異種移植された腫瘍細胞の球体形成性を減少させることを示す図である。

【図13】化合物４０１が、ＩＳＭＳモデルにおいて転移を阻害することを示す図である。

【図14】化合物４０１が、Ａ５４９ヒト肺癌細胞においてソラフェニブとの相乗効果を有することを示す図である。

【図15】化合物４０１が、Ａ５４９ヒト肺癌細胞においてエルロチニブとの相乗効果を有することを示す図である。

【図16】化合物４０１が、Ａ５４９ヒト肺癌細胞においてラパチニブとの相乗効果を有することを示す図である。

【図17】化合物４０１が、Ａ５４９ヒト肺癌細胞においてＳｕｔｅｎｔとの相乗効果を有することを示す図である。

【図18】化合物４０１が、Ｐａｃａ−２ヒト膵臓異種移植モデルにおいてゲムシタビンとの相乗効果を有することを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0039】

本明細書で用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことが示されない限り、複数形を含む。例えば、用語「細胞（ａｃｅｌｌ）」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。

【0040】

本明細書で用いるように、用語「単離された」または「精製された」は、その天然の状態で通常それに付随する成分を、実質的にまたは基本的に含まない物質を指す。純度および均一性は、一般的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて決定される。

【0041】

本明細書で用いるように、用語「癌幹細胞」および「ＣＳＣ」は、互換性である。ＣＳＣは哺乳動物性であり、好ましい実施形態では、これらのＣＳＣはヒト起源であるが、それらはそれに限定されるものではない。癌幹細胞は、（１）多大な増殖能力を有し、（２）増殖能力または発達能力が低下した１種類または複数種類の分化した後代を生成する非対称性の細胞分裂が可能であり、そして（３）自己再生または自己維持のための対称性の細胞分裂が可能である、固形腫瘍由来の細胞の集団と定義され、機能的に特徴づけられる。ＣＳＣを特徴づけるための他の一般的な手法は、形態学ならびに、細胞表面マーカー、転写プロフィールおよび薬剤応答の調査を含む。ＣＳＣは、研究文献において、腫瘍／癌開始細胞、癌幹様細胞、幹様癌細胞、高度腫瘍形成性細胞、腫瘍幹細胞、固形腫瘍幹細胞、薬剤耐久細胞（ｄｒｕｇｓｕｒｖｉｖａｌｃｅｌｌ）（ＤＳＣ）、薬剤抵抗性細胞（ＤＲＣ）または超悪性細胞とも呼ばれる。

【0042】

本明細書で用いるように、用語「自己再生」は、それらの数を補充または増加させるために、新しい腫瘍形成性の癌幹細胞を生成する、癌幹細胞の能力を指す。

【0043】

本明細書で用いるように、用語「癌」および「癌性」は、細胞集団が無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すか、記載する。本明細書で用いるように、「癌細胞」および「腫瘍細胞」は、腫瘍細胞集団の大部分を含む非腫瘍形成性細胞と、腫瘍形成性幹細胞（癌幹細胞）の両方を含む、腫瘍に由来する細胞の全集団を指す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病を含むが、これらに限定されない。そのような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｎｃｅｒ）、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌（ｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌（ｌｉｖｅｒ
ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ）および各種の頭頸部癌が含まれる。

【0044】

「腫瘍」は、本明細書で用いるように、良性（非癌性）または、前癌性病変を含む悪性（癌性）の、過剰の細胞成長もしくは増殖から生じる任意の組織塊を指す。

【0045】

「転移」は、本明細書で用いるように、癌が体の原発部位から他の領域に広がるか移って新しい場所に類似した癌性の病巣が発達する過程を指す。「転移性」または「転移する」細胞は、隣接細胞との接着性接触を失い、血流またはリンパを通して疾患の原発部位から移動して、近隣の体構造に侵入する細胞である。

【0046】

本明細書で用いるように、用語「対象」は、それらに限定されないが、ヒト、ヒト以外の霊長類、齧歯動物などを含む、特定の治療のレシピエントとなる任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。一般に、用語「対象」および「患者」は、ヒト対象に関して、本明細書で互換的に用いられる。

【0047】

本明細書で用いる、「治療する」または「治療」または「治療すること」または「軽減する」または「軽減すること」などの用語は、１）診断された病的状態または障害の症状を治癒させ、遅くし、軽くし、および／または診断された病的状態または障害の進行を停止させる治療措置、ならびに、２）標的の病的状態または障害の発達を予防するか遅くする、予防的または防止的措置の両方を指す。したがって、治療が必要な者には、障害をすでに有する者、障害を起こしやすい者、および、障害が予防されるべき者が含まれる。患者が以下の１つまたは複数を示す場合、対象は本発明の方法によって首尾よく「治療される」：癌細胞の数の減少またはその完全な非存在；腫瘍サイズの縮小；軟組織および骨への癌の広がりを含む周辺器官への癌細胞の浸入の阻害または癌細胞の浸入の非存在；腫瘍転移の阻害または非存在；腫瘍増殖の阻害または非存在；特定の癌に関連する１つまたは複数の症状の軽減；罹患率および死亡率の低下；ならびに、生活の質の向上。

【0048】

本明細書で用いるように、用語「阻害する」、「阻害すること」およびそれらの文法上の同等物は、生物活性との関連で用いられる場合、生物活性の下方制御を指し、それは、タンパク質の生成または分子のリン酸化などの標的にした機能を低下または除去することができる。特定の実施形態では、阻害は、標的にした活性の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の低下を指すことができる。障害または疾患との関連で用いられる場合、本用語は、症状の発生の予防、症状の軽減、または、疾患、状態もしくは障害の緩和の成功を指す。

【0049】

単数形もしくは複数形であれ、本明細書で用いる「通常の癌細胞」は、癌幹細胞でない癌細胞を指す。

【0050】

本明細書で用いるように、「併用」または「組合せ」の療法または治療は、障害、状態または症状、例えば癌状態を治療するための、少なくとも２つの異なる治療剤の投与を意味する。そのような併用療法は、他の治療剤の投与の前、その間、および／またはその後の、１つの治療剤の投与を含むことができる。治療剤の投与は、最高数週間まで、より一般的には４８時間以内、最も一般的には２４時間以内の時間で分離されてもよい。

【0051】

本明細書で用いるように、用語「薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤」は、１つの器官または体の一部から別の器官または体の一部への、対象の医薬用薬剤の運搬または輸送に関与する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材などの、薬学的に許容される物質、組成物または媒体を意味する。各担体は、その製剤の他の成分と適合するという意味において「許容される」ものでなければならず、患者に有害であってはならない。薬学的に許容される担体の役目を果たすことができる物質の一部の例には、以下のものが含まれる：乳糖、グルコースおよびショ糖などの糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張性の食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに、医薬製剤で使用される他の無毒性適合物質。湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウムおよびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料および香料、防腐剤および抗酸化剤が、組成物に存在してもよい。

【0052】

本発明の化合物は塩を形成することができ、それらも本発明の範囲内である。本明細書で本発明の化合物への言及は、特に明記しない限り、その塩への言及を含むものと理解される。本明細書で使用されるように、用語「塩（複数可）」は、無機および／または有機の酸および塩基と形成される、酸性および／または塩基性の塩を表す。さらに、本発明の化合物が、それらに限定されないがピリジンまたはイミダゾールなどの塩基性の部分、および、それらに限定されないがカルボン酸などの酸性部分の両方を含む場合、双性イオン（「内塩」）を形成することができ、それらは本明細書で用いる用語「塩（複数可）」の範囲に含まれる。薬学的に許容される（すなわち、無毒性で、生理的に許容される）塩が好ましいが、他の塩も、例えば、調製中に使用することができる単離または精製ステップで有用である。本発明の化合物の塩は、例えば、化合物Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩを、酸または塩基のある量（例えば同等量）と、塩がその中で沈殿するような媒体中で反応させて形成するかまたは水性媒体中で反応させ、その後凍結乾燥することによって形成させることができる。

【0053】

本発明の化合物の溶媒和物も、本明細書で企図される。本発明の化合物の溶媒和物には、例えば水和物が含まれる。

【0054】

Ｓｔａｔ３経路のターゲティング
本発明は、Ｓｔａｔ３経路活性の有効な阻害剤である化合物を提供する（実施例２）。Ｓｔａｔ３経路は増殖、生存および他の多くの生物過程を促進するために活性化される潜在性の転写因子であるので、それは、多種多様のヒト癌ならびに、いくつかの自己免疫疾患および炎症性疾患を含む非癌性の障害と関連付けされている（表１）。したがって、本発明は、第１の態様では、異常な、例えば過剰発現するＳｔａｔ３経路活性に関連する障害の併用治療を提供する。具体的には、患者対象に、異常なＳｔａｔ３経路活性の少なくとも一部を阻害する第１の作用物質の第１の量を、さらにはシグナル伝達阻害剤を含む第２の作用物質の第２の量を投与する。様々な実施形態では、異常なＳｔａｔ３経路活性の一部（例えば、２０％、３０％、４０％）、ほとんど（約５０％を超える）または実質的にすべて（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％）が阻害される。第１の量および第２の量の片方または両方が、併用使用の前の、すなわち、障害に対して単独で用いられる場合のそれぞれの作用物質の治療的有効量であってもよく、または、併用による顕著な相乗効果のためにその量より少なくてもよい。第１の作用物質は、Ｓｔａｔ３経路の１つまたは複数の段階を標的にすることができる。一実施形態では、第１の作用物質は、本発明の化合物である。

【0055】

【表1】

第２の作用物質、すなわち、シグナル伝達阻害剤は、異なる経路、関連する経路、または、同じＳｔａｔ３経路内の、第１の作用物質によって阻害される段階と異なる段階を標的にするために用いることができる。通常、併用療法の２つの作用物質が同じ経路を標的にする場合、異なる段階であっても、予想される相乗作用の量は限定される。しかし、下の実施例５で提供されるデータは、本発明の化合物と、おそらく同じ経路の他の段階を標的にする第２の作用物質、例えばチロシンキナーゼおよびＧＦＲ標的剤との間で、驚くほど高い量の相乗作用を示し、予想外の阻害機構が作用していることを示唆する。

【0056】

具体的には、Ｓｔａｔ３は、成長因子受容体チロシンキナーゼ、ＪａｎｕｓキナーゼまたはＳｒｃファミリーキナーゼなどによって媒介される、重要なチロシン残基のリン酸化によって活性化され、チロシンのリン酸化後、Ｓｔａｔ３はホモ二量体を形成し、核に移行し、標的遺伝子のプロモーター領域内の特異的ＤＮＡ応答エレメントに結合し、遺伝子発現を誘導する。本発明の実施例２は、Ｓｔａｔ３経路では、本発明の化合物による阻害作用がＤＮＡ結合段階に対して明白であることを示す。さらに、そのような作用は構成的に活性化されたＳｔａｔ３の上で見られるので、本発明の化合物がＳｔａｔ３タンパク質の二量体化および／または核移行を阻害する可能性がある。したがって、同じＳｔａｔ３経路を標的にするチロシンキナーゼ（ＴＫＩ）標的剤およびＧＦＲ標的剤と組み合わせると、観察された相乗作用の量は、驚くほど高かった。例えば、化合物４０１をＴＫＩソラフェニブと組み合わせたときに、膵臓癌細胞系からの細胞の１００％阻害が達成されたが、個々に投与したときには、化合物４０１およびソラフェニブはどちらも、同じ細胞系の６６％阻害をそれぞれ達成できただけであった−膵臓癌は、Ｓｔａｔ３の過剰発現に関係することが公知である［４４］。実際、化合物４０１と併用されて試験された全４つのＴＫＩは、著しい相乗作用を示した。本発明の好ましい実施形態では、併用治療は、約５０％を超える、または７０％、または９０％の癌細胞の阻害を達成する。

【0057】

本発明のこの第１の態様による方法は、癌または非癌性の障害、好ましくは異常なＳｔａｔ３経路活性に関連することが公知であるものの治療に適用することができる。異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する非癌性障害の例には、それらに限定されないが、自己免疫疾患、炎症性疾患、炎症性腸疾患、関節炎、喘息および全身性エリテマトーデス、自己免疫脱髄障害、アルツハイマー病、脳卒中、虚血再灌流傷害および多発性硬化症が含まれる。異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する癌の例には、それらに限定されないが、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌、腎細胞癌、黒色腫、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸癌、肉腫、脳腫瘍、胃癌、多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫が含まれる。

【0058】

本発明のこの第１の態様による第２の作用物質は、対標的剤、例えば、成長因子受容体標的剤（実施例５のエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）のデータを参照）、キナーゼ標的剤（実施例５のラパチニブ、エルロチニブ、スニチニブおよびソラフェニブのデータを参照）または新脈管形成阻害剤（実施例５のスニチニブおよびソラフェニブのデータを参照）であってよい。

【0059】

一実施形態では、第２の作用物質は、成長因子受容体標的剤、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）または血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）などの、キナーゼに関連する成長因子受容体を標的にする抗体である。例えば、標的剤は、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、ＰＤ１５３０３５、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、Ａｖａｓｔｉｎ、パニツムマブ、トラスツズマブおよび抗ｃ−Ｍｅｔ抗体であってよい。

【0060】

一実施形態では、第２の作用物質はキナーゼ標的剤であり、それは、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）などのキナーゼ阻害剤であってよい。例えば、ＴＫＩは、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、Ｓｕｔｅｎｔ（スニチニブ）、ラパチニブ、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、バンデタニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、セジバニブ、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、ゲフィチニブ（Ｉｒｒｅｓｓａ）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖａｃ）、レスタウルチニブおよび／またはＡＲＱ１９７であってよい。

【0061】

様々な実施形態では、キナーゼ標的剤は、以下の１つである：ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、ＺＤ６４７４（ＡＺＤ６４７４）、ＥＭＤ−７２０００（マツズマブ）、パニツマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ）、ＩＣＲ−６２、ＣＩ−１０３３（ＰＤ１８３８０５）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、ＡＥＥ７８８（ピロロ−ピリミジン）、ＥＫＢ−５６９、Ｅｘｅｌ７６４７／Ｅｘｅｌ０９９９、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ソラフィニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、バンデチニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ）、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）、ＰＴＫ７８７（バタラニブ）、パゾパニブ、ＡＺＤ２１７１、エベロリムス、セリシクリブ（ｓｅｌｉｃｉｃｌｉｂ）、ＡＭＧ７０６、アキシチニブ、ＰＤ０３２５９０１、ＰＫＣ−４１２、ＣＥＰ７０１、ＸＬ８８０、ボスチニブ、ＢＩＢＦ１１２０、ＢＩＢＦ１１２０、ニロチニブ、ＡＺＤ６２４４、ＨＫＩ−２７２、ＭＳ−２７５、ＢＩ２５３６、ＧＸ１５−０７０、ＡＺＤ０５３０、エンザスタウリン、ＭＬＮ−５１８およびＡＲＱ１９７。

【0062】

一実施形態では、第２の作用物質は、以下の１つであってよい新脈管形成阻害剤である：ＣＭ１０１、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、血小板因子−４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、新脈管形成抑制ステロイドプラスヘパリン、軟骨由来新脈管形成阻止因子、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、バチマスタット、マリマスタット、アンギオスタチン、エンドスタチン、２−メトキシエストラジオール、テコガラン、トロンボスポンジン、αＶβ３阻害剤、リノミドおよびＡＤＨ−１。

【0063】

関連する第２の態様では、本発明は、異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する癌の対象を治療する方法であって、（ａ）異常なＳｔａｔ３経路活性の少なくとも一部を阻害するために、対象に第１の作用物質の第１の量を投与するステップと、（ｂ）対象に第２の抗癌剤の第２の量を投与するステップとを含む方法を提供する。この方法で治療することができる癌には、異常なＳｔａｔ３経路活性に関連する、例えば少なくとも一部それによって引き起こされることが公知である癌が含まれ、それらのリストは、本発明の第１の態様に関して上で提供されている。

【0064】

第１の作用物質に関する特徴は、本発明の第１の態様に関して記載される特徴に類似することができるが、第２の抗癌剤は、細胞傷害性薬または化学療法剤であることができる。一実施形態では、第２の作用物質は、少なくとも１つの癌に対する標準の第１選択の治療薬である。本方法で用いられる第１の作用物質および第２の作用物質の量は、併用使用の前のそれぞれの作用物質の治療的有効量またはそれ未満であってよい。

【0065】

１つの特徴では、抗癌剤はＤＮＡ損傷剤、抗有糸分裂剤および／または代謝拮抗剤である。ＤＮＡ損傷剤は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤および／またはＤＮＡインターカレータであってよい。実施例５に示すように、本発明の化合物４０１を、以下のそれぞれと一緒にＰａｃａ２膵臓癌細胞に加えた：カルボプラチン（ＤＮＡアルキル化剤）、エトポシド（トポイソメラーゼＩＩの阻害剤）、ドキソルビシン（ＤＮＡインターカレータ）、ドセタキセル（抗有糸分裂剤）およびＧｅｍｚａｒ／ゲムシタビン（代謝拮抗剤）。各併用で、かなりの量の相乗作用が見られた。例えば、化合物４０１をＧｅｍｚａｒ／ゲムシタビンと併用した場合、膵臓癌細胞の９６％の阻害が達成されたが、個々に投与した場合、化合物４０１およびＧｅｍｚａｒは、同じ細胞系の６６％および３６％の阻害をそれぞれ達成できただけであった。

【0066】

アルキル化剤は、以下の１つでよい：クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロルエタミン、メルファラン、ウラシルマスタード、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、カルボプラチン、シスプラチン、サトラプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、ＥＴ−７４３、ＸＬ１１９（ベカテカリン）、ダカルバジン、クロルメチン、ベンダムスチン、トロホスファミド、ウラムスチン、ホテムスチン、ニムスチン、プレドニムスチン、ラニムスチン、セムスチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、マンノスルファン、トレオスルファン、テモゾロミド、カルボコン、トリアジコン、トリエチレンメラミンおよびプロカルバジン。

【0067】

トポイソメラーゼ阻害剤は、以下の１つでよい：ドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アントラセンジオン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、ミトキサントロン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカトマイシン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、カンプトテシン、ルビテカン、ベロテカン、エトポシド、テニポシドおよびトポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ）。

【0068】

ＤＮＡインターカレータは、プロフラビン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、ダクチノマイシンおよびサリドマイドであってよい。

【0069】

抗有糸分裂剤は、以下の１つでよい：パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）／Ｔａｘｏｌ、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ＢＭＳ−２７５１８３、Ｘｙｏｔａｘ、Ｔｏｃｏｓａｌ、ビノルレビン（ｖｉｎｏｒｌｅｂｉｎｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンゾリジン、エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド（ＶＭ−２６）、イクサベピロン、ラロタキセル、オルタタキセル、テセタキセル（ｔｅｓｅｔａｘｅｌ）およびイスピネシブ。

【0070】

代謝拮抗剤は、以下の１つでよい：フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート、Ｘｅｌｏｄａ、Ａｒｒａｎｏｎ、ロイコボリン、ヒドロキシ尿素、チオグアニン（６−ＴＧ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シタラビン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン（２−ＣＤＡ）、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ボルテゾミブ、アミノプテリン、ラルチトレキセド、クロファラビン、エノシタビン、サパシタビンおよびアザシチジン。

【0071】

一実施形態では、第２の抗癌剤は、以下の１つである：カルボプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセルおよびエトポシド。この方法は、ＣＳＣの自己再生および生存の両方において重要であると本明細書で証明されるＳｔａｔ３経路を阻害し（実施例１のデータを参照）、ＣＳＣは、基本的に薬剤耐性、腫瘍の再発および転移について役割を担うことがわかっているので、好ましい実施形態では、この方法は治療抵抗性の癌、再発癌および／または転移癌の治療または予防のために用いられる。

【0072】

抗癌化学療法および生物学的療法に関するさらなる議論、および適する治療プロトコルの例は、両方ともＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．からの、ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄＢｉｏｔｈｅｒａｐｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ、第３版（２００１年）、ＣｈａｂｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ編、およびＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、第６版（２００３年）、Ｓｋｅｅｔ編などの書籍で見ることができ；抗癌療法、特に化学療法の処方計画は、ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）、ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ（ｗｗｗ．ａｓｃｏ．ｏｒｇ）およびＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＣａｎｃｅｒＮｅｔｗｏｒｋ（ｗｗｗ．ｎｃｃｎ．ｏｒｇ）によって維持されるものなどのウェブサイトで見ることができる。

【0073】

癌幹細胞のターゲティング
本発明は、本発明の化合物がＣＳＣの自己再生を阻害し、ＣＳＣにアポトーシス性であることを示す、インビトロおよびインビボデータも提供する（実施例３）。さらに、本発明は、転移癌に対する本発明の化合物の効力を実験的に確認する（実施例４）。

【0074】

癌療法（抗癌療法）の目的は、癌細胞が増殖し、侵入し、転移し、究極的にそれらの宿主生物体、例えばヒトまたは他の哺乳動物を死滅させることを阻止することである。細胞増殖は癌細胞だけでなく多くの正常な細胞の特徴であるので、既存の抗癌療法の大部分も、正常な細胞、特にターンオーバー速度の速いもの、例えば骨髄や粘液膜細胞に対して傷害作用を有する。したがって、有効な癌療法は、癌細胞に対して顕著な増殖阻害作用または制御作用を有する一方、宿主の正常細胞に対する傷害作用が最小限である必要がある。

【0075】

最初の有効な抗癌化合物が１９４０年代に臨床試験にかけられて以来、癌再発および薬剤耐性は、癌治療の最も大きい問題のまま残されている。しばしば、症状の退行を得ることができるが、応答はしばしば部分的でかつ短期間だけであり、再発する癌は元の薬剤に対し耐性である傾向がある。これは、現在、癌幹細胞（ＣＳＣ）の存在によって説明することができる。上に述べたように、ＣＳＣは、化学療法剤のすべてとまではいかないがほとんどに元来耐性である、正常な体細胞性幹細胞と同じ種類の生物学的機構をおそらく共有するので、全体の癌腫瘤の中のこの小さい細胞集団は、残りの癌細胞に有効である薬剤および放射線療法を逃れることができる。癌腫瘤において腫瘍形成活性の真の根源であるので、ＣＳＣは、無処置のまま放置されると、癌再成長を再び助けるか、転移を引き起こすことができる。最初の治療は薬剤耐性の癌幹細胞だけを残すので、完全な再成長腫瘍または転移性腫瘍が、最初は「有効」な療法に対して耐性になる可能性は劇的に増加している。

【0076】

現在、抗癌療法は、いくつかの理由のために組合せにより用いられる。第１に、２つ以上の非交差耐性療法による治療は、腫瘍内での耐性クローンの形成を予防することができる。１つの抗癌剤、例えばシスプラチンなどの白金抗癌化合物への耐性は、同じクラスの他の薬剤、例えば他の白金化合物への交差耐性をしばしば伴う。さらに、１つの薬剤による治療が、その薬剤およびそのクラスの他の薬剤にだけでなく、無関係な薬剤にも耐性を与える、多面的薬剤耐性とも呼ばれる多剤耐性もある。第２には、増殖の異なるフェーズの細胞に対して活性である２つ以上の療法の組合せは、活発に分裂する細胞と同様に分裂の遅い細胞を死滅させることができ、そして／または、より活発に分裂する状態に細胞をリクルートし、それらを複数の抗癌療法により感受性にすることができる。第３に、併用は、単一の生化学経路の異なる経路または異なる段階に影響を及ぼすことによって、生化学的増強効果を生むことができる。

【0077】

併用抗癌治療薬のこれらの理論的根拠は、癌幹細胞の確認および特徴づけにおける最近の進歩を考慮していない。併用療法にＣＳＣ特異的療法が組み込まれていないことは、現在の併用療法が、転移性結腸癌および前立腺癌などの一般的な癌を治療することができない理由を説明することができよう。ＣＳＣに対する本発明の化合物の効力を確認する本明細書で提供されるデータ（実施例３）により、本発明は、ＣＳＣ標的剤と通常の癌細胞を標的にする別の作用物質を組み合わせる癌治療方法を考案することができる。さらに、特定の理論によって束縛されることを望まないが、本発明は、現在一部の予備データによって裏付けされているシナリオを先取りする薬剤処方計画を提供し、そのシナリオでは、元のＣＳＣがＣＳＣだけを標的にする単一薬剤療法によって減少するので、無処置のまま放置されるか不十分に治療される一部の通常の癌細胞が回復するかＣＳＣを生成する。

【0078】

癌幹細胞は放射線療法および従来の化学療法に一般に耐性であるので、癌幹細胞を標的にする薬剤は、他の抗癌療法と併用される場合、相乗効果を有するはずである。したがって、本発明は、対象の癌を治療する方法であって、（ａ）癌幹細胞集団を阻害するために対象に第１の抗癌剤の第１の量を投与するステップと、（ｂ）複数の通常の癌細胞を阻害するために、対象に第２の抗癌剤の第２の量を投与するステップとを含む方法を提供する。

【0079】

様々な実施形態では、ＣＳＣの一部（例えば、２０％、３０％、４０％）、ほとんど（約５０％を超える）または実質的にすべて（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％）が阻害される。第１の量および第２の量の片方または両方が、併用使用の前の、すなわち、癌に対して単独で用いられる場合のそれぞれの作用物質の治療的有効量であってもよく、または、併用による顕著な相乗効果のためにその量より少なくてもよい。一実施形態では、第１の作用物質は、本発明の化合物、すなわち、２−（１−ヒドロキシエチル）−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−クロロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチル−７−フルオロ−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−アセチルナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、２−エチル−ナフト［２，３−ｂ］フラン−４，９−ジオン、および薬学的に許容されるその塩または溶媒和物である。

【0080】

本明細書で「第２の抗癌剤」は、上記の方法と同じ「第２の抗癌剤」であってよく、共有されるすべての特徴をここで繰り返すわけではない。１つの特徴では、第２の抗癌剤はＤＮＡ損傷剤、抗有糸分裂剤および／または代謝拮抗剤である。例えば、ＤＮＡ損傷剤は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤またはＤＮＡインターカレータであることができる。適するアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレータ、抗有糸分裂剤および代謝拮抗剤のリストは上に記載しているので、ここでは繰り返さない。本発明の化合物を上の化学療法剤のクラスの各々と併用した癌阻害実験で、かなりの相乗作用が観察された（実施例５を参照）。一実施形態では、第２の作用物質は、カルボプラチン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセルおよびエトポシドの１つである。

【0081】

別の特徴では、第２の抗癌剤は、対標的剤、例えば、成長因子受容体標的剤（実施例５のエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）のデータを参照）、キナーゼ標的剤（実施例５のラパチニブ、エルロチニブ、スニチニブおよびソラフェニブのデータを参照）または新脈管形成阻害剤（実施例５のスニチニブおよびソラフェニブのデータを参照）である。本発明の化合物を上の対標的剤のクラスの各々と併用した癌阻害実験で、かなりの相乗作用が観察された。適する成長因子受容体標的剤、キナーゼ標的剤（特にＴＫＩ）および新脈管形成阻害剤のリストは上に記載されており、ここでは繰り返さない。

【0082】

この方法は、基本的に薬剤耐性、腫瘍の再発および転移の役割を担う腫瘍中のＣＳＣ細胞を特異的に標的にする治療剤を使用するので、好ましい実施形態では、この方法は、治療抵抗性の癌、再発癌および／または転移癌の治療または予防のために用いられる。

【0083】

併用治療でＣＳＣを標的にすることにおいて、１つの戦略は、自己再生および生存などのＣＳＣの重要な生物機能に関係する１つを超える経路を標的にすることを目的にするべきである。そのために、本発明は、対象の癌を治療する方法であって、（ａ）Ｓｔａｔ３経路活性を阻害するために、対象に第１の癌幹細胞阻害剤の第１の量を投与するステップと、（ｂ）異なる経路の活性を阻害するために、対象に第２の癌幹細胞阻害剤の第２の量を投与するステップとを含む方法を提供する。一実施形態では、この方法での第１および／または第２の抗癌剤の量は、単独で癌幹細胞集団に対して治療的に有効でない。しかし、併用を通して達成されるかなりの相乗作用のために、患者から応答を引き出すためにより低い量をこの方法で用いることができる。

【0084】

一実施形態では、第２の抗癌幹細胞剤は、ラパチニブ（ＩＮＮ）またはラパチニブジトシラート（ＵＳＡＮ）であり、それは、進行した転移性乳癌を有する患者での使用のために、２００７年にＦＤＡによって承認された。ラパチニブは、ＡＴＰ競合的上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）およびＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）二重チロシンキナーゼ阻害剤である。それは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２タンパク質キナーゼドメインのＡＴＰ結合ポケットへの結合によって、受容体自己リン酸化および活性化を阻害する。下の実施例５に示すデータは、Ｐａｃａ２膵臓癌細胞に対して顕著な相乗作用が達成されたことを示す。化合物４０１およびラパチニブの併用前阻害率はそれぞれ３２％および２７％であったが、併用後の阻害率は、２つの率の合計よりも高い７４％まで急上昇した。この方法は、基本的に薬剤耐性、腫瘍の再発および転移の役割を担うＣＳＣにさらなる注意を払うので、好ましい実施形態では、この方法は、治療抵抗性の癌、再発癌および／または転移癌の治療または予防のために用いられる。

【0085】

本発明の製剤には、経口、鼻、局所（口内および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口投与に適するものが含まれる。製剤は単位剤形で都合よく提供することができ、また薬剤学の分野で周知である任意の方法で調製することができる。単一の剤形を生成するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される哺乳動物および特定の投与様式によって異なる。単一の剤形を生成するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果を生成する化合物の量である。一般に、この量は、１００％のうち、例えば、有効成分約１％〜約９９％、約５％〜約７０％、約１０％〜約３０％の範囲である。

【0086】

材料および方法
生物アッセイ
本発明の化合物は、上記のプロトコルによって試験することができる。表２は、プロトコルに記載される化合物のリストを示す。

【0087】

【表2】

細胞培養：Ｈｅｌａ、ＤＵ１４５、Ｈ１２９９、ＤＬＤ１、ＳＷ４８０、Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＬＮ１８、ＨＣＴ１１６、ＨｅｐＧ２、Ｐａｃａ２、Ｐａｎｃ１、ＬＮｃａｐ、ＦａＤｕ、ＨＴ２９およびＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＷｅｓｔＳａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）および５％ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテルシン（ａｍｐｈｏｔｅｒｃｉｎ）Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で維持した。

【0088】

Ｈｏｅｃｈｓｔサイドポピュレーション：サイドポピュレーション（ＳＰ）および非ＳＰ画分を特定、単離するために、トリプシンおよびＥＤＴＡを含む培養皿からＳＷ４８０細胞を取り出し、遠心分離によってペレットにし、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２％ＦＢＳおよび１ｍＭＨＥＰＥＳを含むダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）に３７℃で再懸濁した。次に、細胞を、５μｇ／ｍＬの濃度のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。標識細胞を、単独で、または５０μＭベラパミル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）と一緒に、３７℃で１２０分間インキュベートした。染色の後、細胞を、２％ＦＢＳおよび１ｍＭＨＥＰＥＳを含むＨａｎｋｓの平衡化食塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、４０μｍメッシュフィルターに通し、フローサイトメトリー分析まで４℃に維持した。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素を３５０ｎｍで励起させ、その蛍光を、４５０ＤＦ１０（４５０／２０ｎｍバンドパスフィルター）および６７５ＬＰ（６７５ｎｍロングパスエッジフィルター）の光学フィルターを用いて、２波長で測定した。前方散乱光および側方散乱光のゲーティングはストリンジェントではなく、デブリだけが除外された［１５］。

【0089】

表面マーカーによるＣＳＣ単離：表面マーカー（複数可）、例えばＣＤ４４またはＣＤ１３３の差次的発現に主に基づく腫瘍細胞の選別は、今日まで記載されている大部分の高度の腫瘍形成性のＣＳＣを説明してきた。ＣＤ１３３の単離は、わずかな修正を加えたＲｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉら［２１］の方法に基づく。ＣＤ１３３^＋細胞は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）または磁気ナノ粒子に基づく分離によって単離した。簡潔には、１０^７個の細胞／ｍＬを、ＦＡＣＳに基づく細胞選別のためにＣＤ１３３／１（ＡＣ１３３）−ＰＥで標識、または、磁場に基づく分離のためにＣＤ１３３／１（ＡＣ１３３）−ビオチン（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）で標識したが、標識のためには、製造業者の推奨に従ってＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）ビオチン選択キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いた。非特異的標識を、供給されたＦｃＲブロッキング試薬でブロックし、抗体インキュベーション（１：１１）を、氷上の２％ＦＢＳおよび１ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で１５分間実行した。５回の洗浄をＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）単離のために行い、細胞を５分間の４００×ｇでペレットにし、２×１０^７／ｍＬに再懸濁した後、ＦＡＣＳによって選別した。

【0090】

ＣＤ４４^高細胞を、わずかな修正を加えたＰｏｎｔｉらに記載の方法に従ってＦＡＣＳによって単離した［８１］。簡潔には、増殖培地での３７℃で３０分間の細胞のトリプシン処理および回収の後、細胞を４００×ｇでペレットにし、２％ＦＢＳおよび１ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳに、１×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。次に、細胞を、氷上でＣＤ４４−ＦＩＴＣ（ＢＤＢｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）の１：１００の希釈溶液と１５分間インキュベートした。あるいは、陰性選択のために、ＣＤ２４−ＰＥ（ＢＤＢｉｏｓｃｅｎｃｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）（１：１００）を利用した。３回洗浄の後、細胞を２×１０^６個／ｍＬに再懸濁し、４０μＭメッシュに通した後に選別した。

【0091】

スフィアアッセイ：細胞集団の自己再生能力を測定する信頼できる方法は、血清または接着物が存在しない場合に球体として培養される能力である。球体形成を可能にするために、ＣＤ４４^高ＦａＤｕまたはＨｏｅｃｈｓｔサイドポピュレーション癌幹細胞を、癌幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｂ２７Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ補助剤、２０ｎｇ／ｍｌ
ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌＦＧＦ、４μｇ／ｍｌインスリンおよび０．４％ＢＳＡ）が入った超低接着プレート中で培養した。一般的に、培養の１０〜１４日後に球体形成を鏡検によって評価し、細胞数＞５０の球体を記録した。

【0092】

ルシフェラーゼレポーターアッセイ：製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって記載される通りにリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用いて、ＨｅＬａ細胞をＳｔａｔ３−ルシフェラーゼ（Ｓｔａｔ３−Ｌｕｃ）レポーターベクター（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ州）およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）でコトランスフェクトした。トランスフェクションの後、０．５％ＦＢＳを含む培地で細胞を２４時間維持した。次に、細胞を指示された化合物で３０分間処理し、その後、培地に２５ｎｇ／ｍｌオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を加えた。ＯＳＭの添加の６時間後、細胞を収集し、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって記載されるように、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系を用いて、ホタルおよびｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのレベルを測定した。

【0093】

アポトーシスの分析：化合物によって処理した細胞または処理しなかった細胞を、アネキシンＶ染色のための処理の５時間後に収集した。収集した細胞をＰＢＳで洗浄し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ含有緩衝剤に再懸濁し、製造業者（Ｒｏｃｈｅ）の指示に従って染色した。アネキシンＶ陽性の細胞を、フローサイトメトリーによって判定した。

【0094】

ＳＴＡＴ３ＤＮＡ結合アッセイ：電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を、製造業者（Ｌｉ−ＣｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）によって記載される通りに実施した。簡潔には、製造業者（ＥＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって記載される通りにＮｕｃＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出キットを用いて、核抽出物をＨｅＬａ細胞から作製した。５μｇの核抽出物を、指示された化合物の指示された用量と３０分間プレインキュベートし、その後、ＩＲ７００標識コンセンサスＳｔａｔ３オリゴヌクレオチドと１５分間インキュベートした。次に、試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像システム（Ｌｉ−Ｃｏｒ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて直ちに走査した。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のために、５μｇの核抽出物を、指示された化合物の指示された濃度と３０分間プレインキュベートし、その後、ビオチン化オリゴ（５’−ビオチン−ＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＡＴＣ−３’配列番号１）を加えた。次に、Ｓｔａｔ３−ＤＮＡ複合体を、ストレプトアビジンコート９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で捕捉した。次に、結合した複合体をＳｔａｔ３ポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ）と、続いて抗ウサギＨＲＰ標識二次抗体（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）とインキュベートした。次に、ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加によって結合抗体を可視化し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。

【0095】

細胞生存度判定：３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）分析のために、ウェルにつき１０，０００個の細胞で、細胞を９６ウェルプレートにまいた。プレートにまいてから２４時間後、化合物を指示された用量で細胞に加えた。化合物添加から２２時間後、ＭＴＴを各ウェルに加え（０．５ｍｇ／ｍｌ、最終濃度）、プレートを３７℃でさらに２時間インキュベートした。次に、培地を吸引し、ホルマザン生成物を１００μｌのイソプロピルアルコールに可溶化した。マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの吸光度を５７０ｎｍで測定した。

【0096】

免疫蛍光：指示された時間指示された化合物で処理した細胞は、それぞれアネキシンＶ、切断されたカスパーゼ３またはｓｔａｔ３の検出のために、４％ホルムアルデヒドまたは冷メタノールのいずれかで固定した。カバーガラスを空気乾燥させ、室温で１０分間、ＰＢＳ中に再水和させた。次に、湿気のあるチャンバ内で、室温で１０分間、試料をブロック緩衝剤（ＰＢＳ、５％ＦＢＳ）中でインキュベートした。４℃で一晩、細胞を一次抗体とインキュベートした。洗浄の後、室温で１時間、細胞をＦＩＴＣ標識抗ウサギ抗体の１：５００の希釈溶液とインキュベートした。落射蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）およびＳＰＯＴモザイクＣＣＤカメラを備えたニコンＴＥ２００顕微鏡で、画像を取得した。ポリクローナル抗切断カスパーゼ３抗体（１：１００）は、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡから得た。アネキシンＶ−ＦＩＴＣは、Ｒｏｃｈｅ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから得た。ポリクローナル抗Ｓｔａｔ３抗体は、ＳａｎｔａＣｒｕｚから得た。

【0097】

ＴＰＩＶ（登録商標）技術による遺伝子ノックダウン：ＴＰＩＶ（登録商標）（ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＰａｔｈｗａｙＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＶａｌｉｄａｔｉｏｎ）技術（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＩｎｃ．、Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）は、細菌を先ずトランスフェクトし、次にその細菌を哺乳動物の対象に取り込ませるために用いることができるプラスミドを提供する。細菌溶解の後、ＴＰＩＶ（登録商標）プラスミドによってコードされ、細菌によってプロセシングされるｄｓＲＮＡは、哺乳動物の細胞の細胞質に放出されて標的とする遺伝子ノックダウンをもたらす。ＴＰＩＶ（登録商標）技術は、共同所有される２００８年６月３０日に出願のＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０８／６８８６６に記載され、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、以下のプライマーを用いて、Ｓｔａｔ３に対して有効なｓｉＲＮＡ配列をコードするＴＰＩＶ（登録商標）プラスミドを、ＯｒｉｇｅｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から購入したＳｔａｔ３プラスミドのＰＣＲクローニングによって構築した：
ＴＰＩＶ−Ｓｔａｔ３（３００ｂｐ挿入断片）

【0098】

【化1】

対照プラスミドは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）から購入したｐＧＬ２プラスミドを用いて構築する。

【0099】

ＴＰＩＶ−ＧＬ２（３００ｂｐ挿入断片）

【0100】

【化2】

化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬＹＳｅ細菌（５０〜１００μｌ）を、製造業者の説明書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従って、対照プラスミドまたは１００ｎｇのＳｔａｔ３標的ＴＰＩＶ（登録商標）のプラスミドで形質転換した。次に、単一のコロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＢＨＩ培地に接種し、３７℃で一晩増殖させた。翌日、一晩培養物のそれぞれの５ｍｌを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む新しいＢＨＩ培地で１：４０に希釈し、さらなる２〜４時間（ＯＤ_６００＝０．５まで）増殖させた。次に、各培養物をＩＰＴＧ（１ｍＭの最終濃度）で２〜４時間処理して、細菌によってカクテルｓｉＲＮＡにプロセシングされるであろう長い二本鎖ＲＮＡの転写を誘導した。ＩＰＴＧ誘導の後、各培養物中の細菌総数を、ＯＤ_６００値（１ｍｌ培養物につき８×１０^８個の細菌数は、ＯＤ_６００＝１を有する）を測ることによって計算した。次に、細胞処理のための細菌数を、細胞集密度および適当な反応容量で必要とされた感染多重度（ＭＯＩ；細菌数対細胞数が２０：１〜２０００：１の試行範囲）に従って計算した。経験則として、１０００：１のＭＯＩについて３×１０^８／ｍｌになるように反応容量を選択するべきである。次に、必要とされた細菌培養物の容量を、４℃で１０分間、２５００ｇで遠心分離し、細菌感染させる細胞のために用いた無血清培地と、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧとでペレットを１回洗浄し、細菌感染（バクトフェクション（ｂａｃｔｏｆｅｃｔｉｏｎ））に必要とされた密度で同じ培地に再懸濁した。

【0101】

同時に、癌細胞または癌幹細胞を単離した。バクトフェクションの３０分前に、細胞培地を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを含む２ｍｌの新しい無血清培地で置換した。次に、上で調製した細菌を、３７℃で２時間、所望のＭＯＩで細胞に加えた。

【0102】

感染期間の後、無血清細胞培地を用いて細胞を３回洗浄した。次に、細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む２ｍｌの新しい完全細胞培地で２時間インキュベートして、あらゆる残存細胞外細菌を死滅させた。アンピシリンおよびゲンタマイシンによる処理の後、細胞を、１０μｇ／ｍｌのオフロキサシンを含む３ｍｌの新しい完全ＲＰＭＩ１６４０培地でインキュベートして、あらゆる細胞内細菌を死滅させた。次に、標的遺伝子のサイレンシングの程度および生じた表現型を調査するために、細胞を様々な時間に収集または分析した。

【0103】

生前評価：各動物の健康状態の検査も、毎日行った。体重は、３日ごとに検査した。食べ物および水は、施設の動物飼育手順に従って、毎日供給した。２０％を超える死亡率をもたらす処理、および、または、２０％を超える体重の減少は、有毒とみなした。結果を、平均腫瘍容積（ｍｍ^３）±ＳＥで表す。０．０５未満のＰ値は、統計学的に関連があるとみなす。

【0104】

動物飼育：４〜５週齢の雄または雌の胸腺欠損ヌードマウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を、試験開始前の少なくとも１週間、動物飼育施設に順応させた。利用した実験手順のすべては、ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙＳｏｃｉｅｔｙおよびＧｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓによって概説され、ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＩｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅに承認されてもいるガイドラインに一致していた。動物は、制御された温度（６８°Ｆ〜７２°Ｆ）、光（１２時間明暗周期）および湿度（４５〜５５％）の部屋内の、床が木材チップのケージに、４匹の群で収容した。実験の間、動物には、水および食物を自由摂取させた。

【0105】

脾臓内ヌードマウスモデル系（ＩＳＭＳモデル）：雌のヌードマウスに麻酔をかけ、無菌条件の下で、左側腹部を切開して脾臓を露出させた。０．１ｍｌＰＢＳ中の１００万個のヒト結腸癌ＨＴ２９細胞を、２７ゲージ針を用いて脾被膜下に注入した。脾臓を腹膜腔に戻して、切開を閉じた。処置は、移植の翌日に開始され、試験日までであった。処置計画は、腹腔内を介する５ｑｄ／週である。死にかけているとき、または注射の３０日後に、マウスを犠牲にした。脾臓および肝臓を取り出して検査し、腫瘍病巣数を記録した。

【実施例】

【0106】

（実施例１）
抗癌幹細胞標的としてのＳｔａｔ３の同定
ＣＳＣにおいて、Ｓｔａｔ３のノックダウンはアポトーシスを誘導する。癌幹細胞がＳｔａｔ３を発現するかどうか、そしてＳｔａｔ３が構成的に活性であるかどうかを決定するために、本発明者らは免疫蛍光顕微鏡法を実施し、免疫蛍光顕微鏡法は稀有な細胞集団の分析を可能にするだけでなく、タンパク質の局在についての、そして染色と表現型（すなわちアポトーシス）とを関連付ける能力についてのさらなる情報もまた提供する。ＳＷ４８０結腸癌細胞からＦＡＣＳにより単離されたＮＳＰ細胞およびＳＰ細胞中のｐ−Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ３の免疫蛍光検出の後に、本発明者らは、Ｓｔａｔ３が実際にＳＰ細胞中に存在し、核において適度に富化されていると判定した（図３Ａ）。さらに、本発明者らは、ｐ−Ｓｔａｔ３の染色がＮＳＰ細胞よりもＳＰ細胞中で増加していることを観察し、ＳＰ細胞が、生存のためにＳｔａｔ３により強く頼ることができることが示唆された。

【0107】

Ｓｔａｔ３の状態を、ＦａＤｕヒト頭頸部癌細胞およびＬＮ１８ヒトグリア芽腫細胞から単離されたＣＤ１３３^＋細胞においてさらに評価した。図３Ｂに示すように、Ｓｔａｔ３は、これらの細胞においてもまた構成的に活性である。総合的に、これらのデータは、標的としてのＳｔａｔ３が癌幹細胞にとって特に重要であることを示唆する。

【0108】

次に本発明者らは、ＴＰＩＶ（登録商標）を使用して、ＣＳＣにおけるＳｔａｔ３のノックダウンの効果を試験した。免疫蛍光分析により、新鮮に単離されたＣＳＣ（ＳＰ）において感染から２４時間以内にＳｔａｔ３の有意な減少が達成され得たことが明らかになり（図４Ａ）、Ｓｔａｔ３標的化ＴＰＩＶ（登録商標）プラスミドにより処理された細胞の大部分が感染２４時間以内にアポトーシスとなり、一方、対照ＴＰＩＶ（登録商標）プラスミドは、対照の未感染の細胞を上回るレベルまでアポトーシスを誘導しなかったことが見出された（図４Ｂ）。これらのデータは、癌幹細胞が生存のためにＳｔａｔ３に依存していることを実証する。

【0109】

ＣＳＣにおけるＳｔａｔ３のノックダウンは、ＣＳＣの球体形成性を阻害する。ＣＤ４４^高／ＣＤ２４^低ＦａＤｕまたはＨｏｅｓｃｈｓｔのサイドポピュレーション癌幹細胞をＦＡＣＳにより単離し、超低接着プレートにおいて、癌幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｂ２７Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ添加物、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ、４μｇ／ｍＬのインスリンおよび０．４％のＢＳＡ）中で培養し、球体を形成させた。一次球体を回収し、トリプシンで分散させ、９６ウェルの超低接着プレートに分注し、その後ＴＰＩＶ（登録商標）処理した。細菌を、ＭＯＩが１０００で投与し、２時間後抗生物質カクテル（ｐｅｎｓｔｒｅｐ、ゲンタマイシン、オフロキサシン（ｏｆｌａｘａｃｉｎ））を加えた。球体形成を、培養１０〜１４日後に評価した。代表的な球体の画像を、トリパンブルーの添加前（図５、左上のパネル）または後に記録し、死細胞を同定した（図５、左下のパネル）。相対的球体形成性を、図５の右のパネルに示した。データは、癌幹細胞におけるＳｔａｔ３のノックダウンが、球体形成性を阻害したことを明らかに示し、Ｓｔａｔ３が、癌幹細胞のカギとなる自己再生因子であることを実証している。

【0110】

（実施例２）
Ｓｔａｔ３経路の活性を阻害する化合物の同定
Ｓｔａｔ３の転写活性の阻害。化合物を、細胞においてＳｔａｔ３の転写活性化活性を阻害するそれらの能力に関して、Ｓｔａｔ３−ルシフェラーゼ（Ｓｔａｔ３−ｌｕｃ）レポーター構築体を使用して試験した。Ｓｔａｔ３−ｌｕｃを形質移入した細胞を、血清低減培地で培養し、その後表示の化合物を３０分間加えた。その後、細胞を、２５ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）を用いて６時間刺激し、続いてＳｔａｔ３−ｌｕｃレポーター活性を検出した。細胞を化合物４０１と共にインキュベートすると、ＯＳＭ刺激性Ｓｔａｔ３レポーターの活性が阻害された（図６、左のパネル）。Ｊａｋ−Ｓｔａｔ経路の阻害剤として公知であるＡＧ４９０は、Ｓｔａｔ３の阻害に関する陽性対照に挙げられる。遺伝毒性作用の対照として挙げられるエトポシドは、Ｓｔａｔ３をほとんど、または全く阻害しないことが示された。本発明の化合物としてのナフトキノンの代わりにナフタレンである化合物１００１は、非常に高い濃度であってもＯＳＭ刺激性Ｓｔａｔ３レポーターの活性を阻害しなかった（図６、右のパネル）。

【0111】

さらなる化合物を、Ｓｔａｔ３ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験し、結果を表３に要約する。

【0112】

【表3】

Ｓｔａｔ３ＤＮＡ結合活性の阻害。チロシン７０５残基のリン酸化により検出されるような、構成的に活性化されたＳｔａｔ３を含有する、ＨｅＬａ細胞由来の核抽出物を、Ｓｔａｔ３ＥＭＳＡの実施に使用し、Ｓｔａｔ３のＤＮＡ結合活性をモニターした。核抽出物を、表示の化合物と共にインキュベートし、その後ＩＲ７００標識Ｓｔａｔ３コンセンサスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。Ｓｔａｔ３とオリゴヌクレオチドの結合を、ゲル電気泳動およびＬｉＣｏｒＯｄｙｓｓｅｙ赤外線走査装置を使用した検出によりモニターした。Ｓｔａｔ３の低下したバンドを、抗Ｓｔａｔ３抗体によるスーパーシフト（図７Ａ、左のパネル）およびＳｔａｔ３ペプチドによる用量依存性阻害（図７Ａ、中央のパネル）によって同定し確認した。Ｓｔａｔ３のＤＮＡ結合の用量依存性阻害を、標識プローブと化合物４０１とのインキュベーションの後で観察した（図７Ａ、右のパネル）。

【0113】

ＥＭＳＡアッセイにおいてさらなる化合物を試験した。図７Ｂに示すように、化合物４０１、４１６および４１８は、Ｓｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を阻害できる。

【0114】

異種移植腫瘍組織におけるＳｔａｔ３下流エフェクターの阻害。化合物４０１またはビヒクルの対照により処理し、４時間後に収穫した異種移植されたＰａｃａ２腫瘍から、抽出物を調製した。サンプルを、ウェスタンブロットおよびＥＭＳＡにより分析し、Ｓｔａｔ３下流エフェクターの発現レベルおよびＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を評価した。化合物４０１により処理したサンプル（Ｔ）は、対照（Ｖ）よりもＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性が減少することが示された（図８Ａ）。さらに、化合物４０１による処理は、Ｓｔａｔ３の下流エフェクターである、サイクリンＤ１およびサバイビン（図８Ｂ）の発現レベルの減少をもたらした。

【0115】

（実施例３）
癌幹細胞を標的とする化合物の同定
癌幹細胞に対してアポトーシス性である化合物の同定。癌幹細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔを活発に流出させることが実証されているので、ＳＷ４８０細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いて染色し、サイドポピュレーション（図９Ａに示した、左のパネルのゲートエリア）を識別し、癌幹細胞を富化した。このサイドポピュレーションは、癌幹細胞が富化されていることを確認するために、一連の対照ＳＷ４８０細胞を、まずＡＢＣ輸送体の阻害剤であるベラパミルを用いて処理し、その後Ｈｏｅｃｈｓｔを用いて染色した。図９Ａの右のパネルに示すように、ベラパミル処理により、サイドポピュレーションの欠損がもたらされる。

【0116】

Ｈｏｅｃｈｓｔのサイドポピュレーションに対する化合物４０１のＩＣ_５０をＭＴＴアッセイにおいて評価し、非サイドポピュレーションに対するＩＣ_５０と比較した。結果は、サイドポピュレーションは非サイドポピュレーションと同程度に、化合物４０１に対して感受性であることを示す（図９Ｂ、右のパネル）。しかしサイドポピュレーションは非サイドポピュレーションより、ドキソルビシンに対して非常に抵抗性であり（図９Ｂ、左のパネル）、さきの出版物と一致する［７、８２］。これらのデータは、化合物４０１が癌幹細胞を死滅させることを示唆する。

【0117】

Ｈｏｅｃｈｓｔのサイドポピュレーション細胞を、化合物４０１を用いて処理し、細胞死の様式をアネキシンＶ（アポトーシスの早期マーカー）染色により評価した。結果は、死にかけている細胞がアネキシンＶ陽性であり（図１０Ａ）、化合物４０１が癌幹細胞に対してアポトーシス性であることを実証している。

【0118】

または、本発明者らは、ＣＤ１３３（共通の癌幹細胞表面マーカーの１つ）抗体磁気ビーズプルダウンを実施し、癌幹細胞を富化した。その後、ＣＤ１３３^＋細胞を、化合物４０１を用いて処理し、続いて切断カスパーゼ３（アポトーシスの顕著な特徴）に対する抗体を用いて染色した。図１０Ｂに示すように、化合物４０１による処理後、ＣＤ１３３^＋細胞の多くは切断カスパーゼ３陽性になり、化合物４０１が癌幹細胞に対してアポトーシス性であることを裏付ける。

【0119】

インビトロでＣＳＣの球体形成性を阻害する化合物の同定。癌幹細胞の顕著な特徴の１つは、それらの自己再生能力である。細胞集団の自己再生能力を測定する信頼性のある方法は、血清または接着物が存在しない状態で、球体として培養される能力である。他の対標的薬または化学療法剤と化合物４０１の能力を比較するために、ＦＡＣＳにより単離されたＣＤ４４^高ＣＳＣを球体として７２時間成長させ、その後一連の治療薬でチャレンジした。被験薬剤の中で、化合物４０１のみが球体の増殖の防止に有効であった（図１１）。球体は、同様のアッセイにおける細胞死に関するそれらのＩＣ_５０濃度のおよそ１０倍で用いたにもかかわらず、ドキソルビシンおよびドセタキセルに抵抗性であることに留意されたい。Ｔａｒｃｅｖａ、ＳｕｔｅｎｔおよびＧｌｅｅｖｅｃを、報告されたそれらの治療濃度のおよそ３倍で加えた。このことは、癌幹細胞は従来の化学療法薬および対標的薬に対して抵抗性であるが、化合物４０１はそれらの成長の阻害に非常に有効であるということを実証する。

【0120】

インビボでＣＳＣの球体形成性を阻害する化合物の同定。６週齢の雌の無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスを、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）より入手した。マウスに、０．２ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中の６×１０^６のＦａＤｕ癌細胞またはＰａｃａ２癌細胞を、側部の皮下に注入した。異種移植片が約２００ｍｍ^３のサイズに達した後に、Ｐａｃａ２異種移植腫瘍を担持する動物に対し、ビヒクル、ゲムシタビン（１２０ｍｇ／ｋｇ、週に２回）または化合物４０１（２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを、犠牲にする前の１週間、ｉｐで投与し、ＦａＤｕ異種移植腫瘍を担持する動物に、ビヒクル、カルボプラチン（３０ｍｇ／ｋｇ）または化合物４０１（２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを犠牲にする前の２週間ｉｐを介して毎日投与した。その後Ｐａｃａ２細胞およびＦａＤｕ細胞それぞれに関して腫瘍を回収した。動物を犠牲にし、腫瘍を無菌除去した後で、単一細胞懸濁液を得た。簡潔に言うと、腫瘍を滅菌の外科用メスを用いて０．１ｍｍ^３の断片に刻み、その後１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ／ＨＢＳＳにおいて１５〜３０分、一定の撹拌を行いながら消化した。４０μｍメッシュのフィルターを通した後で、細胞懸濁液を１ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ上に層にし、１４４０×ｇで３０分間遠心分離した後に界面層を回収することによって、ＲＢＣ、死細胞および細胞のデブリを除去した。その後、生細胞を数え、球体を形成するそれらの能力を測定するために使用した。細胞を、超低接着９６ウェルプレートに、癌幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｂ２７Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ添加物、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ、４μｇ／ｍＬのインスリンおよび０．４％のＢＳＡ）中に１００細胞／ウェルの密度で分注した。新鮮な培地を３日ごとに加え、球体の形成を１０〜１４日後の培養物で決定した。＞５０細胞の球体を数えた。実験の終わりにトリパンブルーを加え、死細胞を同定した。図１２に示すように、標準的化学療法剤のゲムシタビン（上のパネル）およびカルボプラチン（下のパネル）は癌幹細胞を富化したことが、球体形成性の増加から明らかであった。対照的に、球体形成性の減少により明らかなように、化合物４０１による処理は、癌幹細胞を減少させた。

【0121】

（実施例４）
抗転移効力
化合物４０１を、ＩＳＭＳモデルでの転移を阻害するその能力に関して、さらに試験した。脾臓内ヌードマウスモデル系（ＩＳＭＳモデル）は、この技術により肝臓に実験的転移を起こすことができるので結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）の悪性挙動の研究に適している。このモデルにおいて、０．１ｍｌのＰＢＳ中の１００万個のＨＴ２９細胞を、ヌードマウスの脾被膜下に注入した。脾臓を、腹膜腔内に戻し、切開部を閉じた。死にかけているときまたは注入３０日後にマウスを犠牲にした。脾臓および肝臓を取り出し、試験し、腫瘍病巣の数を記録した。マウスを、２つの群に分け、対照群にビヒクルを与え（ｎ＝４）、他の群には２０ｍｇ／ｋｇの化合物４０１を与えた（ｎ＝４）。薬剤を、ｉ．ｓ．注入後の２日目から開始して３０日目まで、ｉｐ．を介して５日／週投与した。一次腫瘍および転移肝臓腫瘍の数を顕微鏡によって評価した。代表的写真を、図１３に示す。ビヒクルを用いた対照群において、脾臓に一次腫瘍の重大な負荷があった（図１３、左上のパネル）。重度の自然発生の肝転移も観察された（図１３、右上のパネル）。化合物４０１による処置は、一次腫瘍病巣の数および自然発生肝転移をかなり減少させた（図１３、下のパネル）。

【0122】

（実施例５）
組合せの活性
Ｐａｃａ２ヒト膵臓癌細胞、Ａ５４９ヒト肺癌細胞およびＨｅｐＧ２ヒト肝癌（ｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒ）細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬグルタミンを含有するダルベッコ変法イーグル培地において培養した。化合物４０１およびＳｕｔｅｎｔは、ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃによって合成された。カルボプラチン、ドキソルビシン、ドセタキセル、エトポシドをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手し、水またはＤＭＳＯに、１０ｍＭで溶解した。エルロニチブは、ＡｍｅｒｉｃａｎＣｕｓｔｏｍＣｈｅｍｉｃａｌｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）由来であった。ゲムシタビンは、ＥｌｉＬｉｌｌｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）由来の、２０ｍＭのストック水溶液であった。ソラフェニブは、ＬＫＴ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）由来であった。ラパチニブは、ＬＣＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）から入手した。特に明記しない限り、すべての化合物は、ＤＭＳＯに１０ｍＭで可溶化し、−２０℃においてアリコート分割した。指数関数的に成長するＰａｃａ２膵臓癌細胞を、１，０００細胞／ウェルで、６ウェルプレートに播種し、２４時間接着させた。漸増濃度の個別の薬剤およびそれらを併用して、培地に加えさらに２４時間置いた。２４時間曝露した後、薬剤を取り除き、新鮮な培地を加えさらに１０〜１４日間置いて、コロニーを形成させた。細胞を固定し、ＧＩＥＭＳＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて染色した。５０細胞を超えるコロニーを、生存として数え、細胞生存のパーセンテージを未処理対照に対して正規化した。結果は、二重実験の平均である。または、ＭＴＴアッセイを、Ａ５４９細胞およびＨｅｐＧ２細胞において処理７２時間後に実施した。

【0123】

本発明者らのデータは、被験薬剤と併用したすべての場合において、化合物４０１が有益な効果を有することを実証する。中でもチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）との併用が、最も優れた結果を示した。例えば図１４に示すように、化合物４０１は、ソラフェニブとの併用でヒト肺Ａ５４９細胞において７２時間の時点で相乗効果を有する。同様に、図１５から１７は、化合物４０１がエルロチニブ、ラパチニブおよびスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））との併用で、ヒト肺Ａ５４９細胞において７２時間の時点でそれぞれ相乗効果を有することを示す。データの残りを表４に要約し、化合物４０１が被験薬剤と併用したすべての場合において、有益な効果を示したことを実証する。

【0124】

【表4】

さらに、本発明者らは、ヒト膵臓癌異種移植モデルにおいて化合物４０１とゲムシタビンとの併用効果を試験した。簡潔に言うと、雌の無胸腺ヌードマウス（Ｎｃｒ）に８×１０^６のＭＩＡＰａＣａ−２ヒト膵臓癌細胞を皮下に接種し、腫瘍をおよそ１５０ｍｍ^３のサイズまで成長させた。動物を、６匹の動物／群の４群にランダム化し、対照であるビヒクル、臨床製剤（２０％Ｇｅｌｕｃｉｒｅ）の１００ｍｇ／ｋｇの化合物４０１を、経口で毎日、１２０ｍｇ／ｋｇ（ＰＢＳ中）のゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））を腹腔内に３日ごとにまたは両方で処置した。マウスを計２週間処置し、腫瘍の平均体積を分析した。

【0125】

図１８に示すように、化合物４０１（１００ｍｇ／ｋｇ）またはゲムシタビン（１２０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを単独で用いた処置は、処置期間に同じ程度に腫瘍の成長を遅らせた。化合物４０１（１００ｍｇ／ｋｇ）とゲムシタビン（１２０ｍｇ／ｋｇ）とを併用して処置した動物は、腫瘍成長に関して相乗効果を示した。いずれの処置計画に関しても、有意な毒性は認められなかった。本発明者らのデータは、化合物４０１とゲムシタビンとの併用が、膵臓癌の治療において臨床的に有益であることを示唆する。

【0126】

本明細書に引用されているすべての参考文献は、各個々の出版物または特許または特許出願が、あたかもすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのような同じ程度で、適用法により認められる範囲で、そしてすべての目的のためにそれらの全体を参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた出版物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲内において、本明細書は、このような矛盾材料のいずれにも優先する、そして／または勝るよう意図されている。

【0127】

本明細書および特許請求の範囲に使用される成分、反応条件、分析結果などの量を表すすべての数字は、「約」という用語によりすべての場合に修飾されていると理解するべきである。したがって、反することを特に明記しない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において記載される数値パラメーターは、本発明により得られることを追求される所望の特性に依存して変動可能な近似値である。少なくとも、特許請求の範囲と同等の原理の適用を限定するつもりはないが、各数値パラメーターは、有効数字および普通の丸め法の数字を考慮して解釈されるべきである。

【0128】

当業者には明らかなように、本発明の改良および変形は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく実行可能である。本明細書に記載の特定の実施形態は単に例の目的で提示しており、決して限定することを意味するものではない。本明細書および実施例は単なる例示として考えるべきであり、本発明の真の範囲および精神は下記の特許請求の範囲により示されることを意味する。

【0129】

参考文献：

【0130】

【数1】