特許 6347833 細胞培養用に適したポリマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6347833

(24)【登録日】2018年6月8日

(45)【発行日】2018年6月27日

(54)【発明の名称】細胞培養用に適したポリマー

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/10 20060101AFI20180618BHJP

   C07K 2/00 20060101ALI20180618BHJP

   C07K 5/09 20060101ALI20180618BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20180618BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20180618BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/10ZNA

   C07K2/00

   C07K5/09

   C07K7/06

   C12N5/077

【請求項の数】15

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2016-526598(P2016-526598)

(86)(22)【出願日】2014年7月16日

(65)【公表番号】特表2016-525106(P2016-525106A)

(43)【公表日】2016年8月22日

(86)【国際出願番号】EP2014065233

(87)【国際公開番号】WO2015007771

(87)【国際公開日】20150122

【審査請求日】2017年4月14日

(31)【優先権主張番号】13003621.3

(32)【優先日】2013年7月18日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】14153952.8

(32)【優先日】2014年2月5日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】516015244

【氏名又は名称】スティヒティング カトリーケ ユニヴェルシテイト

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】ローワン アラン エドワルド

(72)【発明者】

【氏名】エクステーン アケロイド ザスキア ヒレット

(72)【発明者】

【氏名】ウィルソン クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】ヘェォチェス ペトリュス ヨハネス

(72)【発明者】

【氏名】フェイツ ウーター エフ イェー

(72)【発明者】

【氏名】オーステルワイク エフベルト

【審査官】 小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／００７０１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 欧州特許出願公開第２４０４６１８（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１５８２３５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１０／０６４２５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０２１５７３１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５０９４７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Kouwer, P. H. et al.，Responsive biomimetic networks from polyisocyanopeptide hydrogels，Nature，２０１３年 １月３１日，Vol. 493，pp. 651-655

【文献】 Koepf, M. et al.，Preparation and characterization of non-linear poly(ethylene glycol) analogs from oligo(ethylene glycol) functionalized polyisocyanopeptides，European Polymer Journal，２０１３年 ２月 ６日，Vol. 49，pp. 1510-1522

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ ５／００− ５／２８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ

／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたコポリイソシアノペプチドの製造方法であって、
ｉ）オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化され、連結基とグラフトしたイソシアノペプチドの第１のコモノマーと、
オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化され、グラフトしていないイソシアノペプチドの第２のコモノマーを、
前記第１のコモノマーと前記第２のコモノマーのモル比が１：５００〜１：３０となるように共重合する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）により得られたコポリマーにスペーサー単位と細胞接着因子の反応体を加える工程を含み、前記スペーサー単位は一般式Ａ−Ｌ−Ｂにより表され、
前記式中、前記連結基とＡ基は相互に反応して第１のカップリングを形成するように選択され、前記細胞接着因子とＢ基は相互に反応して第２のカップリングを形成するように選択され、
前記第１のカップリング及び前記第２のカップリングは独立してアルキン−アジドカップリング、ジベンゾシクロオクチン−アジドカップリング、オキサノルボルナジエン系アジドカップリング、ビニルスルホン−チオールカップリング、マレイミド−チオールカップリング、メタクリル酸メチル−チオールカップリング、エーテルカップリング、チオエーテルカップリング、ビオチン−ストレプトアビジンカップリング、アミン−カルボン酸カップリングによるアミド結合、アルコール−カルボン酸カップリングによるエステル結合、及びＮＨＳエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）−アミンカップリングから構成される群から選択され、
Ｌ基は主鎖におけるＣ、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される原子間の結合数が１０〜６０である直鎖セグメントである前記方法。

【請求項2】

Ｌ基が、

【化1】

（式中、ｐは１〜１０、好ましくは２〜５である。）、

【化2】

（式中、ｑは１〜９、好ましくは２〜５である。）

【化3】

（式中、ｒは１〜１０、好ましくは２〜５である。）から選択される請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１のカップリングがアルキン−アジドカップリングである請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記第２のカップリングがＮＨＳエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）−アミンカップリング又はマレイミド−アミンカップリングである請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

Ａ基が式（ＶＩＩ）：
式（ＶＩＩ）

【化4】

により表され、式中、
ｎは０〜８であり；
Ｒ³は［（Ｌ）_p−Ｑ］、水素、ハロゲン、Ｃ₁−Ｃ₂₄アルキル基、Ｃ₆−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリール基、Ｃ₇−Ｃ₂₄アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ₇−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリールアルキル基から構成される群から選択され、前記アルキル基は場合によりＯ、Ｎ及びＳから構成される群から選択される１以上のヘテロ原子が介在しており、前記アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は独立してＣ₁−Ｃ₁₂アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニル基、Ｃ₃−Ｃ₁₂シクロアルキル基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルコキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニルオキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニルオキシ基、Ｃ₃−Ｃ₁₂シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基及びシリル基から構成される群から選択される１以上の置換基で独立して場合により置換されており、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は場合により置換されており、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記シクロアルキル基及び前記シクロアルコキシ基は場合によりＯ、Ｎ及びＳから構成される群から選択される１以上のヘテロ原子が介在しており、前記シリル基は式（Ｒ⁴）₃Ｓｉ−により表され、前記式中、Ｒ⁴は独立してＣ₁−Ｃ₁₂アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニル基、Ｃ₃−Ｃ₁₂シクロアルキル基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルコキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニルオキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニルオキシ基及びＣ₃−Ｃ₁₂シクロアルキルオキシ基から構成される群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は場合により置換されており、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記シクロアルキル基及び前記シクロアルコキシ基は場合によりＯ、Ｎ及びＳから構成される群から選択される１以上のヘテロ原子が介在しており；
Ｒ¹は独立して水素、Ｃ₁−Ｃ₂₄アルキル基、Ｃ₆−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリール基、Ｃ₇−Ｃ₂₄アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ₇−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリールアルキル基から構成される群から選択され；
Ｒ²は独立してハロゲン、−ＯＲ⁶、−ＮＯ₂、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ⁶、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルキル基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アリール基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルキルアリール基及びＣ₁−Ｃ₁₂アリールアルキル基から構成される群から選択され、ここでＲ⁶は上記の通りであり、前記アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は場合により置換されている請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記スペーサー単位が式（ＩＸ）：
式（ＩＸ）

【化5】

により表され、式中、
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³及びｎは上記の通りであり、
Ｌは式（Ｘ）：
式（Ｘ）

【化6】

（式中、ｐは２〜５である。）により表される基から選択される請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記スペーサー単位が式（ＸＩ）：
式（ＸＩ）

【化7】

（式中、ｐは２〜５である。）により表される請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記細胞接着因子がＲＧＤやＧＲＧＤＳ等のアミノ酸配列から構成される群から選択される請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記第１のコモノマー及び前記第２のコモノマー上のアルキレングリコール単位数の平均が最低３から最大４までである請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

請求項１から９のいずれか一項に記載の方法により獲得可能なオリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたコポリイソシアノペプチド。

【請求項11】

請求項１０に記載のコポリイソシアノペプチドを１．２〜３．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するハイドロゲルを含み、前記コポリイソシアノペプチドのゲル化温度が１８〜４０℃である細胞培養液。

【請求項12】

前記細胞培養液が内皮細胞と平滑筋細胞の少なくとも１種を含む請求項１１に記載の細胞培養液。

【請求項13】

ａ）請求項１１に記載の細胞培養液を準備する工程と；
ｂ）前記ハイドロゲルのゲル化温度よりも低温で前記細胞培養液に細胞を加える工程と；
ｃ）前記細胞を培養する工程を含む細胞培養方法。

【請求項14】

前記細胞が内皮細胞及び筋細胞である請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

血管前駆細胞系の作製用としての請求項１２に記載の細胞培養液の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は細胞培養液で使用するのに適したポリマーの製造方法に関する。本発明は更に血管前駆細胞系の作製用としての前記細胞培養液の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

これまで、細胞培養用ゲル材料は、天然起源から単離されるものと、完全な合成品がある。コラーゲン等のゲルはラメラ構造を形成する性質があるため、単離して複雑な三次元網目構造を形成することができない。ＥＨＳマウス肉腫細胞に由来するものなどのゲルは純コラーゲンよりも組織に存在する細胞外環境によく似ており、その内側で細胞が増殖・集合して複雑なアーキテクチャーを形成することができる三次元環境も提供する。天然由来のゲル化剤は完全に特性を決定することが難しく、この特性の決定を達成するには集中的なバッチ毎の分析が必要であり、生物由来のゲルは本来変動性であり、汚染の危険、病原体の移動と共に価格が著しく高いという問題がある。生物起源材料には、望ましくない成長因子等の他の微量汚染も付随し、多くの研究グループにとって、容認できない程度まで実験の妨げとなり、また、生体内使用には許容できない。一方、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）コポリマーに由来するもの等の合成由来のゲルは細胞生存率と細胞分化能が低く、グルココルチコイドやトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）等の生物活性剤の混合物を添加する必要がある。合成ゲル化剤を使用すると、生物ゲル化剤に見られる自然変動は概ね解消されるが、同時に天然ゲルに備わる生物活性も得られなくなる。生物活性を維持しながら生物学的変動をなくすことは、未だに完全には実現されていない課題である。
これらのゲルで形成される複雑な生物系を回収することも依然として課題である。伝統的な方法では、トリプシンを利用して細胞を生物表面から剥離したり、ゲルを機械的に分解したり、構造体の表面から手作業で剥離する必要がある。
上記のゲル化性構造体は自然界に遍在せず、侵襲を最小限にした方法で容易に生体内に利用することができない。冷却したカテーテルにより侵襲を最小限にした方法で利用することができる温度応答性材料はＵＳ２０１０／０２１５７３１Ａ１に開示されているもの等の数例が存在する。しかし、これらの材料には上記と同じ欠点があるため、細胞生存率が不良である。
機械的な観点では、全ての生物由来ゲルの性質はペプチドサブユニットの非共有的相互作用により決定される。その結果、細孔寸法と機械的強度は比較的一定となる。合成由来ゲルの場合には架橋の機械的性質と種類は更に一定となる。
ＷＯ２０１１／００７０１２はオリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたポリイソシアノペプチドを含むハイドロゲルを開示している。これらのポリイソシアノペプチドはイソシアノペプチドをオリゴ（アルキレングリコール）側鎖で官能基化した後に、こうしてオリゴアルキレングリコールで官能基化されたイソシアノペプチドを重合することにより製造される。ＷＯ２０１１／００７０１２は組織工学又はニューロン再生用としてこれらのハイドロゲルを使用することを提案している。
公知細胞培養液は用途によっては満足できるが、広範な状況で使用できる細胞培養液が当分野で益々必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

本発明の目的は当分野における上記及び／又は他の必要を満たすような細胞培養液と前記細胞培養液で使用するポリマーを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0004】

１態様によると、本発明はオリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたコポリイソシアノペプチドの製造方法を提供し、前記方法は、
ｉ）オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化され、連結基とグラフトしたイソシアノペプチドの第１のコモノマーと、
オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化され、グラフトしていないイソシアノペプチドの第２のコモノマーを、
前記第１のコモノマーと前記第２のコモノマーのモル比が１：５００〜１：３０となるように共重合する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）により得られたコポリマーにスペーサー単位と細胞接着因子の反応体を加える工程を含み、前記スペーサー単位は一般式Ａ−Ｌ−Ｂにより表され、
前記式中、前記連結基とＡ基は相互に反応して第１のカップリングを形成するように選択され、前記細胞接着因子とＢ基は相互に反応して第２のカップリングを形成するように選択され、
前記第１のカップリング及び前記第２のカップリングは独立してアルキン−アジドカップリング、ジベンゾシクロオクチン−アジドカップリング、オキサノルボルナジエン系アジドカップリング、ビニルスルホン−チオールカップリング、マレイミド−チオールカップリング、メタクリル酸メチル−チオールカップリング、エーテルカップリング、チオエーテルカップリング、ビオチン−ストレプトアビジンカップリング、アミン−カルボン酸カップリングによるアミド結合、アルコール−カルボン酸カップリングによるエステル結合、及びＮＨＳエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）−アミンカップリングから構成される群から選択され、
Ｌ基は主鎖におけるＣ、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される原子間の結合数が１０〜６０である直鎖セグメントである。

【0005】

前記連結基とＡ基は相互に反応して上記に挙げた、いずれのカップリングでもよい第１のカップリングを形成するように選択される。例えば、アルキン−アジドカップリングを得るためには、前記連結基はアルキンとすることができ、Ａ基はアジドとすることができ、あるいは前記連結基はアジドとすることができ、Ａ基はアルキンとすることができる。上記に挙げたカップリングは当業者に周知であり、これらのカップリングの形成については教科書に記載されている。例えば、ＮＨ₂−ＣＯＯＨカップリングはＥＤＣにより形成することができる。

【0006】

好ましくは、前記第１のカップリングはアルキン−アジドカップリングである。
同様に、前記細胞接着因子とＢ基は相互に反応して上記に挙げた、いずれのカップリングでもよい第２のカップリングを形成するように選択される。好ましくは、前記第２のカップリングはＮＨＳエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）−アミンカップリング又はマレイミド−チオールカップリングである。これはペプチドである前記細胞接着因子のＮ末端とＮＨＳエステルとのカップリング又はペプチドである前記細胞接着因子の末端チオールとマレイミドとのカップリングとすることができる。
Ｌ基は反応性のＡ基とＢ基を連結する直鎖をもつセグメントである。このセグメントはＣ、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される原子の配列により形成される。Ａ基とＢ基に連結される主鎖における原子間の結合数は最低１０から最大６０までである。「主鎖」なる用語はＡ基とＢ基を最短距離で連結する分子鎖を意味するものである。末端Ａ基及びＢ基に連結される主鎖における原子間の結合数は好ましくは最低１２、より好ましくは最低１５である。末端Ａ基及びＢ基に連結される主鎖における原子間の結合数は好ましくは最低５０、より好ましくは最低４０である。
細胞接着因子に結合した細胞を培養するためにはコポリマー主鎖と細胞接着因子の間に所定の最小距離が必要であることが判明した。本発明ではスペーサー単位の存在によりこの距離を提供するが、最低結合数１０により与えられる距離が必要であることが分かった。結合数が１０未満の長さでは十分な細胞増殖が得られないことが判明した。
Ｌ基の好ましい例は、

【化1】

（式中、ｐは１〜１０、好ましくは２〜５である。）、

【化2】

（式中、ｑは１〜９、好ましくは２〜５である。）

【化3】

（式中、ｒは１〜１０、好ましくは２〜５である。）である。
スペーサー単位がこれらの型のＬ基を含むとき、Ａ基、Ｂ基、連結基及び細胞接着因子の種類と寸法に関係なく、特に安定な細胞増殖が確保される。

【0007】

別の態様によると、本発明は本発明の方法により獲得可能なオリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたコポリイソシアノペプチドを提供する。
別の態様によると、本発明はオリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたコポリイソシアノペプチドを濃度１．２〜３．０ｍｇ／ｍＬで含有するハイドロゲルを含む細胞培養液を提供し、前記コポリイソシアノペプチドは、
ｉ）オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化され、連結基とグラフトしたイソシアノペプチドの第１のコモノマーと、
オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化され、グラフトしていないイソシアノペプチドの第２のコモノマーを、
前記第１のコモノマーと前記第２のコモノマーのモル比が１：５００〜１：３０となるように共重合する工程と、
ｉｉ）工程ｉ）により得られたコポリマーにスペーサー単位と細胞接着因子の反応体を加える工程により製造され、前記スペーサー単位は一般式Ａ−Ｌ−Ｂにより表され、
前記式中、前記連結基とＡ基は相互に反応して第１のカップリングを形成するように選択され、前記細胞接着因子とＢ基は相互に反応して第２のカップリングを形成するように選択され、
前記第１のカップリング及び前記第２のカップリングは独立してアルキン−アジドカップリング、ジベンゾシクロオクチン−アジドカップリング、オキサノルボルナジエン系アジドカップリング、ビニルスルホン−チオールカップリング、マレイミド−チオールカップリング、メタクリル酸メチル−チオールカップリング、エーテルカップリング、チオエーテルカップリング、ビオチン−ストレプトアビジンカップリング、アミン−カルボン酸カップリングによるアミド結合、アルコール−カルボン酸カップリングによるエステル結合、及びＮＨＳエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）−アミンカップリングから構成される群から選択され、
Ｌ基は主鎖におけるＣ、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される原子間の結合数が１０〜６０である直鎖セグメントである。

【0008】

本発明者らはハイドロゲルの三次元構造体を構成するポリマー主鎖から所定の距離に配置した細胞接着因子を特定の濃度にした場合のみに最適な細胞増殖が達成されることを意外にも見出した。
細胞接着因子の濃度が低過ぎると、細胞は十分にハイドロゲルに接着しないため、細胞を培養できなくなる。細胞接着因子の濃度が高過ぎると、細胞はゲル内で増殖しない。

【0009】

第１のコモノマーはオリゴ（アルキレングリコール）で官能基化され、連結基とグラフトしたイソシアノペプチドである。連結基の好ましい例としては、アジド（例えばオキサノルボルナジエン系アジド）、アルキン（例えばジベンゾシクロオクチン）、チオール、ビニルスルホン、マレイミド、メタクリル酸メチル、エーテル、ビオチン、ストレプトアビジン、ＮＨ₂、ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨＳエステルが挙げられる。特にアジドが好ましい。
第１のコモノマーの１例を式（Ｉ）に示す（式中、連結基はアジドである。）。
式（Ｉ）

【化4】

第２のコモノマーは、オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化され、連結基又は他の基とグラフトしていないイソシアノペプチドであり、即ち、このイソシアノペプチドの側鎖はオリゴ（アルキレングリコール）から構成される。第２のコモノマーの１例を式（ＩＩ）に示す。
式（ＩＩ）

【化5】

工程（ｉ）では第１のコモノマーと第２のコモノマーを共重合する。第１のコモノマーと第２のコモノマーの比のポリマーに沿って連結基を含み、オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたコポリイソシアノペプチドが得られる。
スペーサー単位を介して細胞接着因子をコポリマーに結合する。先ず、スペーサー単位と細胞接着因子の反応体を作製する。スペーサー単位の１例を式（ＩＩＩ）に示す。
式（ＩＩＩ）

【化6】

（式中、ｐは１〜１０である。）
本例においてＡ基は

【化7】

であり、Ｂ基は

【化8】

であり、Ｌ基は

【化9】

である。
細胞接着因子の１例を式（ＩＶ）に示すが、これはグリシン、Ｌ−アルギニン、グリシン、Ｌ−アスパラギン酸及びセリンから構成されるペンタペプチド（ＧＲＧＤＳ）である。

【化10】

（ＩＩＩ）のスペーサー単位と（ＩＶ）の細胞接着因子の反応体を式（Ｖ）に示す。

【化11】

本発明の工程ｉｉ）では、スペーサー単位と細胞接着因子の反応体（例えば式（Ｖ））を工程ｉ）により得られたコポリマーと反応させる。連結基は反応体のスペーサー単位に対応する部分と反応する。従って、最終的なコポリイソシアノペプチドは第１のコモノマーと第２のコモノマーの比のポリマーに沿って細胞接着単位を含む。最終的なコポリイソシアノペプチドの１例は式（ＶＩ）：

【化12】

により表され、式中、ｍ：ｎは第１のコモノマー対第２のコモノマーの比である。
細胞接着単位はスペーサー単位の使用によりイソシアノペプチドポリマー主鎖から所定の距離に配置される。

【0010】

ハイドロゲルは適切な細胞培養培地でゲル化することにより得られるようなコポリマーから作製される。ハイドロゲルは三次元ハイドロゲルである。ハイドロゲル中のポリマー濃度は１．２〜３．０ｍｇ／ｍＬとする。ハイドロゲル中のポリマー濃度が低過ぎると、細胞はハイドロゲルに接着しない。ハイドロゲル中のポリマー濃度が高過ぎると、ハイドロゲルは過度に剛性になり、細胞がゲル内を移動・増殖できなくなる。
好ましくは、ハイドロゲルはプレート間レオロジー実験により測定した場合に３５℃において１０〜５０００Ｐａ、好ましくは１００〜１０００Ｐａの範囲の弾性率を有する。こうすると、細胞は移動・増殖して細胞網目構造を形成し、例えば血管前駆細胞系等の三次元構造体を形成できる。
本発明は選択的剛性及び温度応答性を備え、空間分布と細胞接着点密度が制御されたハイドロゲルの細胞培養液を提供する。共重合の結果、第１のコモノマーと第２のコモノマーの比のコポリマーに沿って細胞接着基の統計的分布が得られる。第１のコモノマーと第２のコモノマーの比を調整し、ポリイソシアノペプチドのポリマー主鎖に沿う細胞接着因子間の距離を制御することができる。ポリマー主鎖に沿う細胞接着因子間の平均距離は例えば１．１〜６０ｎｍとすることができる。細胞接着因子間の距離をこの範囲にすると、培養する細胞を細胞培養液に定着させるのに適している。より好ましくは、細胞接着因子間の平均距離は８〜３０ｎｍである。
ハイドロゲルは種々の細胞培養培地を含むことができ、細胞培養液は複雑な生物学的足場の形成を可能にすることが判明した。
本発明の細胞培養液は培養細胞の回収が容易であると言う点で極めて有利である。細胞培養液で使用するハイドロゲルは温度応答性であり、即ちゲル化温度よりも低温まで冷却することにより液化する。従って、細胞培養液を冷却するだけで培養細胞の回収を行うことができる。ハイドロゲルの液化後、培養細胞に損傷を与えずに細胞を液体から回収することができる。
十分な結合を維持するようにオリゴアルキレングリコールで官能基化されたイソシアノペプチドに細胞接着因子を直接結合することはできないと判断された。これは本発明に従ってスペーサーを使用することにより解決された。本発明により使用するスペーサー単位は細胞接着因子をイソシアノペプチドのポリマー主鎖から分離し、立体的な妨害を排除する。スペーサーはポリマー主鎖から細胞接着因子の移動を阻止し、移動の阻止により、細胞接着因子はインテグリン結合ポケットに効率的に入り込むことができる。スペーサーは極性、水溶性、生体適合性でインテグリンの活性部位に対して非結合性でなければならないが、補助的な結合を助長できなければならない。第１のモノマーは先ず第２のモノマーを作製してこれを連結基とグラフトすることにより作製することができる。あるいは、第１のモノマーと第２のモノマーを別経路で作製してもよい。

【0011】

第１のコモノマーと第２のコモノマーのモル比は１：５００〜１：３０とする。第１のコモノマーと第２のコモノマーのモル比は１：４００〜１：３５、１：３００〜１：４０又は１：２００〜１：４５が好ましい。第１のコモノマーと第２のコモノマーの比をこの範囲にすると、ポリマー主鎖に沿う細胞接着単位間の平均距離が８〜３０ｎｍとできる。
好ましくは、オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたコポリイソシアノペプチドはゲル化温度が１８〜４０℃である。ゲル化温度はハイドロゲル中のポリマー濃度に依存しない。他方、ポリマーの側鎖におけるオリゴアルキレングリコール単位数に依存する。

【0012】

以下、本発明を更に詳細に説明する。
コモノマー
オリゴ（アルキレングリコール）単位によるイソシアノペプチドの官能基化。
前記モノマーはＣ末端を目的のオリゴ（アルキレングリコール）分子鎖で置換したジ、トリ、テトラ又はそれ以上のペプチドモチーフを基礎とすることが好ましい。前記分子鎖は直鎖、分岐鎖又はデンドロナイズドオリゴ（アルキレンオキシド）を基礎とすることができる。好ましくは、前記分子鎖は直鎖であり、エチレングリコールから構成される。
ペプチドセグメントは天然もしくは非天然アミノ酸及び拡張アミノ酸又はその混合物の配列により決定される種々の組成とすることができる。
前記モノマーは適切なオリゴ（アルキレングリコール）断片から誘導される。多段階ペプチドカップリングストラテジーを使用し、目的のアミノ酸を順次導入する。目的のペプチド配列の導入後、ペプチドセグメントのＮ末端を適切なホルミル化法でホルミル化する。このホルミル化としては、ホルミル塩、ギ酸、又は他のホルミル化剤による生成物の処理が挙げられる。
ホルミル化ストラテジーの数例を挙げると、ギ酸塩（例えばギ酸ナトリウム又はギ酸カリウム）、ギ酸アルキル（例えばギ酸メチル、ギ酸エチル又はギ酸プロピル）、ギ酸、クロラール及び誘導体を利用することができる。次にホルムアミドを適切な脱水剤で処理することによりイソシアニドを形成する。脱水ストラテジーの１例を挙げると、ジホスゲンを使用する。同じく使用することができる脱水剤の数例を挙げると、ホスゲン及び誘導体（ジホスゲン、トリホスゲン）、カルボジイミド、塩化トシル、オキシ塩化リン、トリフェニルホスフィン／四塩化炭素が挙げられる［Ｍ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊ．Ｍａｒｃｈ“Ｍａｒｃｈ’ｓ ａｄｖａｎｃｅｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ ｅｄｓ．，２００１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，ｐｐ１３５０−１３５１及びその引用文献］。

【0013】

側鎖（アルキレングリコール）
適切なアルキレングリコールの例は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール又はペンチレングリコールである。アルキレングリコールはエチレングリコールが好ましい。
有利なオリゴエチレングリコール単位を以下に示す。一般に、オリゴなる用語は＜１０の数を意味する。

【化13】

重合後に水溶性材料となるようにイソシアノペプチドを最低３個のエチレングリコール単位で官能基化することが好ましい。
本発明の第２のコモノマーはグラフトしていない上記のようなオリゴ（アルキレングリコール）イソシアノペプチドである。
第１のコモノマーはアルキレングリコール単位数が同数のイソシアノペプチドから構成してもよいし、アルキレングリコール単位数の異なるイソシアノペプチドの混合物でもよい。同様に、第２のコモノマーはアルキレングリコール単位数が同数のイソシアノペプチドから構成してもよいし、アルキレングリコール単位数の異なるイソシアノペプチドの混合物でもよい。
第１のコモノマー及び第２のコモノマーはオリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたイソシアノペプチドであり、即ちイソシアノペプチド上のアルキレングリコール単位数は１〜１０である。好ましくは、第１のコモノマー及び第２のコモノマー上のアルキレングリコール単位数の平均は最低３から最大４までである。
第１のコモノマー及び第２のコモノマー上のアルキレングリコール単位の平均はアルキレングリコール単位数の異なるイソシアノペプチドの混合物を第２のコモノマーとして使用することにより調整するのが一般的である。好ましい実施形態において、第１のコモノマーはアルキレングリコール単位数３のイソシアノペプチドであり、第２のコモノマーはアルキレングリコール単位数３のイソシアノペプチドとアルキレングリコール単位数４のイソシアノペプチドの混合物である。
第１のコモノマー及び第２のコモノマー上のアルキレングリコール単位数の平均は３とすることができる。その場合には通常では１５〜２５℃のゲル化温度が得られる。第１のコモノマー及び第２のコモノマー上のアルキレングリコール単位数の平均は＞３から最大３．５まででもよい。その場合には通常では１８〜３５℃のゲル化温度が得られる。第１のコモノマー及び第２のコモノマー上のアルキレングリコール単位数の平均は＞３．５から最大５まででもよい。その場合には通常では２５〜５０℃のゲル化温度が得られる。
好ましくは、オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたコポリイソシアノペプチドはレオロジー測定により測定した場合に温度３５℃における弾性率が１０〜５０００Ｐａ、好ましくは１００〜１０００Ｐａである。第１のコモノマー及び第２のコモノマー上のアルキレングリコール単位数の平均が最低３から最大５までであるとき、ハイドロゲルはこのような剛性度をもつ。

【0014】

重合
連結基とグラフトしたオリゴ（アルキレングリコール）イソシアノペプチドモノマー（第１のコモノマー）と、連結基とグラフトしていないオリゴ（アルキレングリコール）イソシアノペプチドモノマー（第２のコモノマー）を混合した後、共重合する。
共重合は非極性溶媒の存在下で実施することが好ましい。適切な非極性溶媒は飽和炭化水素溶媒及び芳香族炭化水素溶媒又はその混合物から構成される群から選択することができる。非極性溶媒の例は、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、２−メチルブタン、２−メチルヘキサン、シクロヘキサン、及びトルエン、ベンゼンキシレン又はその混合物である。トルエンを重合で使用することが好ましい。オリゴ（エチレングリコール）部分のエチレングリコール単位数が最低３であるオリゴ（エチレングリコール）イソシアノペプチドの重合法にはトルエンを選択することが好ましい。
重合は触媒の存在下で実施することが好ましい。触媒はニッケル（ＩＩ）塩が好ましい。Ｎｉ（ＩＩ）塩の例はハロゲン化ニッケル（ＩＩ）（例えば塩化ニッケル（ＩＩ））、過塩素酸ニッケル（ＩＩ）又は過塩素酸テトラキス（ｔｅｒｔ−ブチルイソシアニド）ニッケル（ＩＩ）である。
重合媒体に可溶性であるか又は重合媒体に混和性の適切な溶媒に最初から溶解しているのであれば、他の錯体及びニッケル塩を使用してもよい。オリゴ（アルキレングリコール）イソシアノペプチドを重合するために使用することができる所定の触媒系に関する一般情報については、Ｓｕｇｉｎｏｍｅ Ｍ．；Ｉｔｏ Ｙ；Ａｄｖ Ｐｏｌｙｍ ＳＣ１ ２００４，１７１，７７−１３６；Ｎｏｌｔｅ Ｒ．Ｊ．Ｍ．；Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．１９９４，２３（１），１１−１９を参照することができる。
３０ｍｍｏｌ／Ｌを上回るようにモノマー濃度を選択し、１／１００〜１／１００００となるように触媒／モノマー比を選択することが好ましい。ニッケル（ＩＩ）の量が少ないほど（触媒／モノマー比＜１／１０００）、その後にポリマーをマクロハイドロゲル化剤として利用するのに望ましい実質重合度［平均ＤＰ＞５００］を示す材料を製造することができる。
代表的な１例では、触媒対モノマーのモル比が１：５０から１：１００，０００までとなるように、モノマーを非極性有機溶媒又は混合溶媒に溶解したミリモル溶液をニッケル（ＩＩ）触媒の極性溶媒溶液に加える。密閉雰囲気下で混合液を２〜２４時間激しく撹拌する。完了したら反応混合液を蒸発させ、粗生成物を有機溶媒に溶解し、ジエチルエーテル又は同様の非相溶性有機溶媒で沈殿させ、目的の生成物を得る。

【0015】

スペーサー単位と細胞接着因子の反応体と連結基とのグラフト
スペーサー単位
末端Ａ基及びＢ基は脱保護又は活性化工程の必要なしにその後の化合物の合成が可能となるように選択することが好ましい。
スペーサー単位のＡ基の好ましい例としては、アジド（例えば、オキサノルボルナジエン系アジド）、アルキン（例えば、ジベンゾシクロオクチン）、チオール、ビニルスルホン、マレイミド、メタクリル酸メチル、エーテル、ビオチン、ストレプトアビジン、ＮＨ₂、ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨＳエステルが挙げられる。特にアルキンが好ましい。
スペーサー単位のＢ基の好ましい例としては、アジド（例えばオキサノルボルナジエン系アジド）、アルキン（例えばジベンゾシクロオクチン）、チオール、ビニルスルホン、マレイミド、メタクリル酸メチル、エーテル、ビオチン、ストレプトアビジン、ＮＨ₂、ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨＳエステルが挙げられる。特にＮＨＳエステル又はマレイミドが好ましい。
好ましくは、スペーサー単位のＡ基は式（ＶＩＩ）：
式（ＶＩＩ）

【化14】

により表され、式中、
ｎは０〜８であり；
Ｒ³は［（Ｌ）_p−Ｑ］、水素、ハロゲン、Ｃ₁−Ｃ₂₄アルキル基、Ｃ₆−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリール基、Ｃ₇−Ｃ₂₄アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ₇−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリールアルキル基から構成される群から選択され、前記アルキル基は場合によりＯ、Ｎ及びＳから構成される群から選択される１以上のヘテロ原子が介在しており、前記アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は独立してＣ₁−Ｃ₁₂アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニル基、Ｃ₃−Ｃ₁₂シクロアルキル基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルコキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニルオキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニルオキシ基、Ｃ₃−Ｃ₁₂シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基及びシリル基から構成される群から選択される１以上の置換基で独立して場合により置換されており、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は場合により置換されており、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記シクロアルキル基及び前記シクロアルコキシ基は場合によりＯ、Ｎ及びＳから構成される群から選択される１以上のヘテロ原子が介在しており、前記シリル基は式（Ｒ⁴）₃Ｓｉ−により表され、前記式中、Ｒ⁴は独立してＣ₁−Ｃ₁₂アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニル基、Ｃ₃−Ｃ₁₂シクロアルキル基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルコキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニルオキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニルオキシ基及びＣ₃−Ｃ₁₂シクロアルキルオキシ基から構成される群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は場合により置換されており、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記シクロアルキル基及び前記シクロアルコキシ基は場合によりＯ、Ｎ及びＳから構成される群から選択される１以上のヘテロ原子が介在しており；
Ｒ¹は独立して水素、Ｃ₁−Ｃ₂₄アルキル基、Ｃ₆−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリール基、Ｃ₇−Ｃ₂₄アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ₇−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリールアルキル基から構成される群から選択され；
Ｒ²は独立してハロゲン、−ＯＲ⁶、−ＮＯ₂、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ⁶、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルキル基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アリール基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルキルアリール基及びＣ₁−Ｃ₁₂アリールアルキル基から構成される群から選択され、ここでＲ⁶は上記の通りであり、前記アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は場合により置換されている。
好ましくは、ｎ＝０である。
好ましくは、Ｒ¹は水素である。
好ましくは、Ｒ³は水素である。
好ましくは、スペーサー単位のＢ基は式（ＶＩＩＩ）：
式（ＶＩＩＩ）

【化15】

により表される。
好ましくは、スペーサー単位は式（ＶＩＩ）のＡ基と式（ＶＩＩＩ）のＢ基を含む。
適切なスペーサー単位の例としては、式（ＩＸ）：
式（ＩＸ）

【化16】

により表される化合物が挙げられ、
式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³及びｎは上記の通りであり、
Ｌは好ましくは式（Ｘ−１）、（Ｘ−２）、（Ｘ−３）：
式（Ｘ−１）

【化17】

（式中、ｐは１〜１０、好ましくは２〜５である。）、
式（Ｘ−２）

【化18】

（式中、ｑは１〜９、好ましくは２〜５である。）
式（Ｘ−３）

【化19】

（式中、ｒは１〜１０、好ましくは２〜５である。）
により表される基から選択される。
好ましくは、スペーサー単位は式（ＸＩ）：
は式（ＸＩ）

【化20】

により表され、式中、ｐは１〜１０、好ましくは２〜５、より好ましくは２である。
適切なスペーサー単位の他の例としては、本願に援用するＷＯ２０１１／１３６６４５に記載されている縮合シクロオクチン化合物が挙げられる。従って、可能なスペーサー単位は式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩｃ）：

【化21】

の化合物から選択され、式中、
ｎは０〜８であり；
ｐは０又は１であり；
Ｒ³は［（Ｌ）_p−Ｑ］、水素、ハロゲン、Ｃ₁−Ｃ₂₄アルキル基、Ｃ₆−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリール基、Ｃ₇−Ｃ₂₄アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ₇−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリールアルキル基から構成される群から選択され、前記アルキル基は場合によりＯ、Ｎ及びＳから構成される群から選択される１以上のヘテロ原子が介在しており、前記アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は独立してＣ₁−Ｃ₁₂アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニル基、Ｃ₃−Ｃ₁₂シクロアルキル基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルコキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニルオキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニルオキシ基、Ｃ₃−Ｃ₁₂シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基及びシリル基から構成される群から選択される１以上の置換基で独立して場合により置換されており、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は場合により置換されており、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記シクロアルキル基及び前記シクロアルコキシ基は場合によりＯ、Ｎ及びＳから構成される群から選択される１以上のヘテロ原子が介在しており、前記シリル基は式（Ｒ⁴）₃Ｓｉ−により表され、前記式中、Ｒ⁴は独立してＣ₁−Ｃ₁₂アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニル基、Ｃ₃−Ｃ₁₂シクロアルキル基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルコキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニルオキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニルオキシ基及びＣ₃−Ｃ₁₂シクロアルキルオキシ基から構成される群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は場合により置換されており、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記シクロアルキル基及び前記シクロアルコキシ基は場合によりＯ、Ｎ及びＳから構成される群から選択される１以上のヘテロ原子が介在しており；
Ｌは直鎖又は分岐鎖Ｃ₁−Ｃ₂₄アルキレン基、Ｃ₂−Ｃ₂₄アルケニレン基、Ｃ₂−Ｃ₂₄アルキニレン基、Ｃ₃−Ｃ₂₄シクロアルキレン基、Ｃ₅−Ｃ₂₄シクロアルケニレン基、Ｃ₈−Ｃ₂₄シクロアルキニレン基、Ｃ₇−Ｃ₂₄アルキル（ヘテロ）アリーレン基、Ｃ₇−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリールアルキレン基、Ｃ₈−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリールアルケニレン基、Ｃ₉−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリールアルキニレン基から選択される連結基であり、前記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキル（ヘテロ）アリーレン基、（ヘテロ）アリールアルキレン基、（ヘテロ）アリールアルケニレン基及び（ヘテロ）アリールアルキニレン基は場合により独立してＣ₁−Ｃ₁₂アルキル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニル基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニル基、Ｃ₃−Ｃ₁₂シクロアルキル基、Ｃ₅−Ｃ₁₂シクロアルケニル基、Ｃ₈−Ｃ₁₂シクロアルキニル基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルコキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルケニルオキシ基、Ｃ₂−Ｃ₁₂アルキニルオキシ基、Ｃ₃−Ｃ₁₂シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基及びシリル基から構成される群から選択される１以上の置換基で置換されており、前記シリル基は式（Ｒ⁴）₃Ｓｉ−により表すことができ、前記式中、Ｒ⁴は上記の通りであり；
Ｑは水素、ハロゲン、Ｒ⁶、−ＣＨ＝Ｃ（Ｒ⁶）₂、−Ｃ≡ＣＲ⁶、−［Ｃ（Ｒ⁶）₂Ｃ（Ｒ⁶）₂Ｏ］_q−Ｒ⁶（式中、ｑは〜２００の範囲である。）、−ＣＮ、−Ｎ₃、−ＮＣＸ、−ＸＣＮ、−ＸＲ⁶、−Ｎ（Ｒ⁶）₂、−＋Ｎ（Ｒ⁶）₃、−Ｃ（Ｘ）Ｎ（Ｒ⁶）₂、−Ｃ（Ｒ⁶）₂ＸＲ⁶、−Ｃ（Ｘ）Ｒ⁶、−Ｃ（Ｘ）ＸＲ⁶、−Ｓ（Ｏ）Ｒ⁶、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ⁶、−Ｓ（Ｏ）ＯＲ⁶、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ⁶、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ⁶）₂、−Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ⁶）₂、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ⁶、−ＯＳ（Ｏ）₂Ｒ⁶、−ＯＳ（Ｏ）ＯＲ⁶、−ＯＳ（Ｏ）₂ＯＲ⁶、−Ｐ（Ｏ）（Ｒ⁶）（ＯＲ⁶）、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ⁶）₂、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ⁶）₂、−Ｓｉ（Ｒ⁶）₃、−ＸＣ（Ｘ）Ｒ⁶、−ＸＣ（Ｘ）ＸＲ⁶、−ＸＣ（Ｘ）Ｎ（Ｒ⁶）₂、−Ｎ（Ｒ⁶）Ｃ（Ｘ）Ｒ⁶、−Ｎ（Ｒ⁶）Ｃ（Ｘ）ＸＲ⁶及び−Ｎ（Ｒ⁶）Ｃ（Ｘ）Ｎ（Ｒ⁶）₂から構成される群から選択される官能基であり、ここでＸは酸素又は硫黄であり、Ｒ⁶は独立して水素、ハロゲン、Ｃ₁−Ｃ₂₄アルキル基、Ｃ₆−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリール基、Ｃ₇−Ｃ₂₄アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ₇−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリールアルキル基から構成される群から選択され；
Ｒ¹は独立して水素、Ｃ₁−Ｃ₂₄アルキル基、Ｃ₆−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリール基、Ｃ₇−Ｃ₂₄アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ₇−Ｃ₂₄（ヘテロ）アリールアルキル基から構成される群から選択され；
Ｒ²は独立してハロゲン、−ＯＲ⁶、−ＮＯ₂、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ⁶、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルキル基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アリール基、Ｃ₁−Ｃ₁₂アルキルアリール基及びＣ₁−Ｃ₁₂アリールアルキル基から構成される群から選択され、ここでＲ⁶は上記の通りであり、前記アルキル基、アリール基、アルキルアリール基及びアリールアルキル基は場合により置換されている。

【0016】

細胞接着因子
細胞接着因子は細胞がゲルに結合するのを助ける。細胞接着因子はアミノ酸配列が好ましい。本発明で有利に使用することができるアミノ酸の例はＮ−保護アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンである。適切なアミノ酸配列としては、ＲＧＤ、ＧＲＧＤＳ、ＩＫＶＡＶ、ＫＱＡＧＤＶ及びＧＲＧＤＳＰ等のペプチドが挙げられる。細胞接着因子はＶＧＥＦやＢＦＧＦ等の成長因子でもよい。細胞接着因子は糖タンパク質やムチンでもよい。
スペーサー単位と細胞接着因子を反応させる。銅フリーＳＰＡＡＣ反応により反応体をコポリマーの連結基にグラフトすることができる。

【0017】

ポリマーの一般的性質
本発明で使用するポリイソシアノペプチドは明確な構造を示し、例えば図１のようにオリゴ（アルキレングリコール）で被覆された完全なβシート螺旋構造を示す。この構造は実質的に各窒素がペプチドペンダント基で置換された螺旋ポリ（イミン）コアを含む。ポリ（イミン）主鎖の疑似４₁螺旋対称性により、ｎ番目の窒素にグラフトした全ペンダント基はｎ＋４番目の位置にグラフトした対応するペンダント基による分子内βシート様充填に関与する。ペプチドセグメントは更に、前記構造の外側シェルを形成するオリゴ（アルキレングリコール）置換基を付けられている。得られる材料の水溶解度は適切なオリゴ（エチレングリコール）置換基の選択に直接相関する。最後に、ポリマー鎖の螺旋の向きはイミン基に結合したアミノ酸のキラリティーにより決定される。
本発明で使用するポリイソシアノペプチドは得られるポリマーに構造欠陥が最小限又は皆無である。最小限なる用語はポリマー主鎖に正しく結合している正しい側鎖が９６％を上回るという意味に解釈すべきであり、例えば９７％、９８％、９９％、９９．５％又は更には１００％である。
換言するならば、官能基化されたモノマーの直接重合により、得られる材料では側鎖のグラフト密度に関する構造欠陥の発生が最小限になる。
本発明で使用するポリイソシアノペプチドは重合度が高く、［ＤＰ］＞５００であり、持続長が長く、均質で安定な水溶性螺旋ポリマーとすることができる。
本発明はオリゴアルキレンで官能基化されたポリイソシアノペプチドを含む均質なハイドロゲルと共に、エチレングリコール単位数の異なるオリゴアルキレンで官能基化されたポリイソシアノペプチドの混合物を含む不均質なハイドロゲルも提供する。
こうして得られるオリゴアルキレンで官能基化されたポリイソシアノペプチドはゲル化温度を調整可能な高強度の熱可逆性ハイドロゲルを形成することが可能である。水を物理的にゲル化するために、本発明のポリ［オリゴ（エチレングリコール）］イソシアノペプチドは重合度［ＤＰ］＞５００であることが好ましい。
適切な細胞培養培地でゲル化することにより得られるコポリマーからハイドロゲルを作製する。前記ハイドロゲルは三次元ハイドロゲルである。ハイドロゲル中のポリマー濃度は１．２〜３．０ｍｇ／ｍＬとする。ハイドロゲル中のポリマー濃度が低過ぎると、ハイドロゲルは脆弱過ぎて細胞三次元網目構造の成長を助長できない。ハイドロゲル中のポリマー濃度が高過ぎると、ハイドロゲルは過度に剛性になり、細胞がゲル内を移動・増殖できなくなる。
好ましくは、ハイドロゲルはレオロジー実験により測定した場合に３５℃における弾性率が１０〜５０００Ｐａである。こうすると、細胞は移動・増殖して例えば血管前駆細胞系等の三次元細胞構造体を形成できる。
本発明で使用するオリゴ（アルキレングリコール）ポリイソシアノペプチドから得られるハイドロゲルはゲル化後に形成される網目構造が高度に構造化されている点において、従来報告されているポリマー系のハイドロゲルの大半と相違する。この網目構造は横方向に凝集したポリマー鎖のねじれた束から構成される。この構成は低分子量ハイドロゲル化剤のゲル化後に形成されるフィブリル状の網目構造の構造に似ている。この現象はポリイソシアノペプチドの持続長が長く、元の会合方法に好都合であるためであると推定される。会合はオリゴ（アルキレングリコール）側鎖親水性の温度誘導性調節により誘発され、このような調節は完全に可逆的な現象であるため、オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたポリイソシアノペプチドの完全に熱可逆的な凝集／分離を生じる。
物理的ポリマーハイドロゲルの古典的説明としては、高濃度溶液中における絡み合い網目構造鎖の形成、スピノーダル分解による浸透網目構造の形成、微結晶形成、及びオリゴ（アルキレングリコール）ポリイソシアノペプチドの推定会合方法とは一見異なるミセル網目構造又はラメラ構造の形成が記載されている。
オリゴ（アルキレングリコール）ポリイソシアノペプチドから得られるハイドロゲルは、直径約５ｎｍのポリマー繊維が横方向に会合してねじれた束となり、ポリマーハイドロゲル網目構造の基盤を形成することにより得られる。この結果、高度に多孔質の構造となり、細孔寸法を直径５０ｎｍまで広げることができる。
エチレングリコール側鎖の温度感受性挙動により、本発明で使用するポリマーは明白なＬＣＳＴ転移を示す。所定のオリゴ（アルキレングリコール）ポリイソシアノペプチドでは、溶液のイオン強度を変える（塩効果）ことにより、あるいはより一般的にはポリマーの全体的な溶媒和状態を調節することが可能な任意化合物の添加によりこの温度を調節することができる。酸又は主鎖螺旋の高次構造変化を生じることが可能な任意化合物を利用してポリ（イソシアニド）主鎖、即ちその高次構造に働きかけることにより、材料のＬＣＳＴを更に調節することができる。
ポリマーのＬＣＳＴを調節する別の方法は異なるオリゴ（アルキレングリコール）側鎖をもつモノマーを共重合する方法である。例えば、トリ（エチレングリコール）イソシアノジアラニンとテトラ（エチレングリコール）イソシアノジアラニンの比を変えて混合物を重合すると、ミリＱ水中で得られるコポリマーのゲル化温度を２２℃から６０℃の間で調節することができた。
ポリマー鎖長はゲル化に影響を与えることが分かっている。重合度の低い分子鎖ほどゲルを形成するよりも沈降する傾向が強かった。これは分子鎖の一般構造を変えずに親水性を変化させることができる剛性又は半可撓性ポリマーの一般的な効果であると予想される（即ち剛性構造では、分子鎖は崩壊せず、他の分子鎖と横方向に凝集してより長い繊維を形成する）。
得られるゲルの光学的性質についてもポリマー長の影響があることが認められた。重合度の低い分子鎖から製造したハイドロゲルほど濁り易い、即ち不透明になり易いことが分かった。平均重合度が上がると、ハイドロゲルの不透明度は低下し、最終的に完全に光学的に透明な材料が得られた。
ゲル温度はある程度まで調節することができ、２５℃で安定な構造化ゲルを形成することができるので、酵素又は細胞を封入してその活性を生体外で維持するために使用することができる新規バイオミメティックマトリックスが得られる。
本発明で使用するポリマーは何らかの興味深い有利な性質をもつように思われた。ポリマーの長さと剛性により、ゲルは場合によっては９９．００〜９９．９８％が水から構成された。これは大きな体積にするためにほんの僅かな材料しか必要としないことを意味する。ポリマー鎖１本は直径約４ナノメートル及び分子量２，５００，０００Ｄａであると思われた。多分散指数（ＰＤＩ）は１．６であり、平均鎖長は５００ｎｍ〜２μｍであった。これらのポリマーはどちらかというと剛性であり、持続長７０〜９０ｎｍであった。ペプチド断片キラリティーに応じて左巻きと右巻きの螺旋を得ることも可能であった（光学活性材料）。本発明者らは細孔寸法をポリマー濃度により１００〜２５０ｎｍにまで制御した明確なフィブリル網目構造を作製することもできた。分子鎖に反応性側基を効率的に導入することも可能であった。従って、これらのポリマーは生体分子の足場として使用することができる。本発明者らは細孔寸法が濃度により制御されることを見出した。
生体分子の例は生体物質、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、糖類、炭水化物、リポタンパク質、脂質、糖脂質、シリカ、薬物、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ビタミン、栄養素、加水分解物、多糖類、単糖類、組換えペプチド、ムチン、酵素、生物有機化合物、組換え生体分子、抗体、ホルモン、成長因子、受容体、造影剤、サイトカイン、並びにその断片及び修飾物である。

【0018】

細胞培養液
本発明の細胞培養液は上記のようなハイドロゲルを含む。細胞培養液は三次元多孔質足場である。
本発明は更に本発明の細胞培養液の作製方法を提供し、前記方法は、
ａ）オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたコポリイソシアノペプチドを準備する工程と
ｂ）前記オリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたコポリイソシアノペプチドを細胞培養培地と混合し、ハイドロゲルを得る工程を含む。
細胞培養液は原則として（動物）細胞の培養に適した任意型の細胞培養培地で作製することができる。適切な細胞培養培地は本発明の方法で使用する細胞の増殖と分化を助長する。
細胞培養培地と細胞培養条件を選択するためのガイドラインは周知であり、例えばＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ（ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０００，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓの第８章及び第９章と、Ｄｏｙｌｅ，Ａ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．Ｂ．，Ｎｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｇ．Ｃｅｌｌ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ １９９３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓに記載されている。
一般に、（哺乳動物）細胞用細胞培養培地は塩類、アミノ酸、ビタミン、脂質、界面活性剤、緩衝剤、成長因子、ホルモン、サイトカイン、微量元素、炭水化物及び他の有機栄養物を緩衝生理食塩水に溶解したものである。塩類の例としては、マグネシウム塩（例えばＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、ＭｇＳＯ₄及びＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）、鉄塩（例えばＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）、カリウム塩（例えばＫＨ₂ＰＯ₄、ＫＣｌ）、ナトリウム塩（例えばＮａＨ₂ＰＯ₄、Ｎａ₂ＨＰＯ₄）及びカルシウム塩（例えばＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ）が挙げられる。アミノ酸の例はタンパク質を構成する全２０種の公知アミノ酸（例えばヒスチジン、グルタミン、スレオニン、セリン、メチオニン）である。ビタミンの例としては、アスコルビン酸塩、ビオチン、塩化コリン、ミオイノシトール、Ｄ−パントテン酸塩、リボフラビンが挙げられる。脂質の例としては、脂肪酸（例えばリノール酸及びオレイン酸）、大豆ペプトン及びエタノールアミンが挙げられる。界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ ８０とＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８が挙げられる。緩衝剤の１例はＨＥＰＥＳである。成長因子／ホルモン／サイトカインの例としては、ＩＧＦ、ヒドロコルチゾン及び（組換え）インスリンが挙げられる。微量元素の例は当業者に公知であり、Ｚｎ、Ｍｇ及びＳｅが挙げられる。炭水化物の例としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース及びピルビン酸塩が挙げられる。
培地には成長因子、代謝物等を添加してもよい。
適切な培地の例としては、胎仔ウシ血清、ヒドロコルチゾン、ｈＦＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ及びＧＡ−１０００を添加済みの内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ−２，Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）と、胎仔ウシ血清、平滑筋細胞増殖サプリメント及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むサプリメントを添加した平滑筋細胞培地（ＳＭＣＭ，ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）が挙げられる。
細胞を培養する最適条件は当業者が容易に決定することができる。例えば、細胞培養培地のｐＨ、温度、溶存酸素濃度及び浸透圧は原則として限定されず、選択する細胞の種類によって異なる。細胞の増殖と生産性に最適となるようにｐＨ、温度、溶存酸素濃度及び浸透圧を選択することが好ましい。最適なｐＨ、温度、溶存酸素濃度及び浸透圧を決定する方法は当業者に公知である。通常では、最適ｐＨは６．６〜７．６であり、最適温度は３０〜３９℃、例えば温度３６〜３８℃、好ましくは温度約３７℃であり、最適浸透圧は２６０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇである。
本発明は更に細胞の培養方法を提供し、前記方法は、
ａ）本発明の細胞培養液を準備する工程と、
ｂ）ハイドロゲルのゲル化温度よりも低温で前記細胞培養液に細胞を加える工程と、
ｃ）前記細胞を培養する工程を含む。
１態様によると、本発明はオリゴ（アルキレングリコール）で官能基化されたコポリイソシアノペプチドを含有するハイドロゲルと、内皮細胞及び平滑筋細胞の少なくとも１種を含む細胞培養液を提供する。
前記細胞は内皮細胞と平滑筋細胞の共培養物であることが好ましい。前記細胞の濃度は例えば２，０００個／ｍＬ〜１，０００，０００個／ｍＬとすることができる。その結果、例えば血管系等の三次元構造体を得ることができる。
本発明は更に血管前駆細胞系の作製用としての本発明の細胞培養液の使用を提供する。
以上、例証の目的で本発明を詳細に説明したが、当然のことながら、以上の詳細な説明は単に例証を目的とし、特許請求の範囲に記載する発明の趣旨と範囲から逸脱しない限り、当業者は変更を加えることができる。
なお、本発明は本願に記載する構成要素の可能な全ての組合せに関するが、特許請求の範囲に記載する構成要素の組合せが特に好ましい。
また、「含む」なる用語は他の要素の存在を排除するものではない。しかし、当然のことながら、所定の成分を含む生成物に関する記載はこれらの成分から構成される生成物も開示するものである。同様に、当然のことながら、所定の工程を含む方法に関する記載はこれらの工程から構成される方法も開示するものである。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ジアラニン単位を基礎とするポリイソシアノペプチドをオリゴアルキレンで官能基化した螺旋構造の模式図を示す（中央上）。主鎖折り畳みは側鎖の積み重ねられたアミド結合間で螺旋の内側に形成される水素結合網目構造により安定化される（中央下）。この二次構造はＡＦＭにより可視化されるような非常に剛性の分子鎖となる（右）。

【図2】第１のモノマーの１例の製造経路の１例を示すスキームである。

【図3】第２のモノマーの１例の製造経路の１例を示すスキームである。

【実施例】

【0020】

実験
材料：トルエンはナトリウムを用いて蒸留した。ジクロロメタンは五酸化リンを用いて蒸留した。Ｎ−メチルモルホリンは使用前にナトリウムを用いて新たに蒸留した。水はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｉｌｌｉＱシステムで精製した（ミリＱ水１８．２ＭΩ）。他の全薬品は入手時の状態で使用した。カラムクロマトグラフィーはＢａｋｅｒ社製シリカゲル（０．０６０〜０．２００ｍｍ）を使用して実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析はＭｅｒｃｋ社製のシリカ６０Ｆ₂₅₄をコーティングしたガラスで実施し、ニンヒドリン又は塩基性ＫＭｎＯ₄水溶液を使用して化合物を可視化した。全ガラス器具類は使用前に０．５Ｍ ＮａＯＨに浸した。

【0021】

実施例１
（１）コポリマーの製造
（１．１）第１のコモノマーの製造
図２のスキームに従い、連結基とグラフトした第１のコモノマーを合成した。

【0022】

１．１．１．４−メチルベンゼンスルホン酸２−（２−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（Ｓ１）の合成
テトラエチレングリコール（２８．５ｍＬ，１６４．３ｍｍｏｌ）をピリジン５０ｍＬに溶解した。次に溶液を撹拌下に０℃まで冷却した。アルゴンを溶液に１５分間バブリングした。溶液に撹拌下に塩化トシル（２１．９３ｇ，１１５ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。混合液を更に室温で１２時間撹拌した。反応混合液を１０％クエン酸５０ｍＬで希釈した。混合液をクロロホルム２５０ｍＬで３回抽出した。有機層を合わせて無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、減圧蒸発させた。得られた黄色油状物をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，０．０６０〜０．２００ｍｍ；溶離液酢酸エチル）により精製し、Ｓ１を淡黄色油状物として得た（１１．６９ｇ，３３．６ｍｍｏｌ，２９％）；Ｒ_f＝０．４（酢酸エチル）。
ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ^-1，ＡＴＲ）３４４２（Ｏ−Ｈ），２８７０（Ｃ−Ｈ），１５９７（Ｎ−Ｈ），１４５３（Ｃ−Ｈ），１３５２（Ｓ＝Ｏ），１１７５（Ｓ＝Ｏ），１０９６（Ｃ−Ｏ）；¹Ｈ ＮＭＲ δ_H（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；Ｍｅ₄Ｓｉ）７．８０（ｄｄ，Ｊ＝７．８１Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ_Ar−），７．３３（ｄ，Ｊ＝７．３５Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ_Ar−Ｓ），４．１７（ｍ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−），３．６５（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨ₂−），２．４５（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ₃）；¹³Ｃ ＮＭＲ δ_C（７５ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；Ｍｅ₄Ｓｉ）２１．１６（１Ｃ，ＣＣＨ₃），６１．０（１Ｃ，ＣＯＨ），６８．１３（１Ｃ，ＣＯＳ），６９．０（１Ｃ，ＯＣＨ₂），７０．０，７０．１，７０．１，７０．２（４Ｃ，ＯＣＨ₂），７０．８，７２．０（２Ｃ，ＯＣＨ₂），１２７．５（２Ｃ，ＣＨＣＣＨ），１２９．５（２Ｃ，ＣＨＣＣＨ），１３９．７（１Ｃ，ＣＣＨ₃），１４４．５（１Ｃ，ＣＨＣＳ）。

【0023】

１．１．２．２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸（Ｒ）−２−（２−（２−（２−（トシルオキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（Ｓ２）の合成
新たに蒸留したＣＨ₂Ｃｌ₂ ２５ｍＬに化合物Ｓ１（５．２３ｇ，１５．０１ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｌ）−アラニン（２．８６ｇ，１５．０１ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．１９８ｇ，１．６５ｍｍｏｌ）を溶解し、撹拌下に０℃まで冷却した。ＤＣＣ（３．１２ｇ，１５．０１ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。混合液は黄変し、０℃で１時間撹拌後、室温で３時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾別し、酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，０．０６０〜０．２００ｍｍ；溶離液１％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）を使用して粗生成物を精製し、Ｓ２を薄いオレンジ色の油状物として得た（５．４９ｇ，１１．４ｍｍｏｌ，７６％）；Ｒ_f＝０．４（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）。
ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ^-1，ＡＴＲ）２９２４（Ｃ−Ｈ），１７４５（Ｃ＝Ｏエステル），１７１２（Ｃ＝Ｏアミド），１５９７（Ｎ−Ｈ），１４５２（Ｃ−Ｈ），１３５２（Ｓ＝Ｏ），１１７３（Ｓ＝Ｏ），１１２０（Ｃ−Ｏ）；¹Ｈ ＮＭＲ δ_H（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；Ｍｅ₄Ｓｉ）７．７９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ_Ar−），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ_Ar−），５．０２（ｓ，１Ｈ，−ＮＨ−），４．２８（ｍ，３Ｈ，−ＣＨ（ＣＨ₃）−，ＣＯＯＣＨ₂−），４．１５（ｍ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−），３．６９（ｍ，１４Ｈ，Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−），２．４４（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ₃），１．４４（ｓ，９Ｈ，−ＯＣ（ＣＨ₃）₃），１．３７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ，−ＣＨ（ＣＨ₃）−）；¹³Ｃ ＮＭＲ δ_C（７５ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；Ｍｅ₄Ｓｉ）１８．８（１Ｃ，ＣＨＣＨ₃），２１．７（１Ｃ，ＣＣＨ₃），２８．４（３Ｃ，Ｃ（ＣＨ₃）₃），４９．４（１Ｃ，Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨＮＨ），６４．５（１Ｃ，Ｂｏｃ−ＯＣＨ₂），６８．９（２Ｃ，ＯＣＨ₂），６９．４（１Ｃ，ＯＣＨ₂），７０．７（４Ｃ，ＯＣＨ₂），８０．３（１Ｃ，Ｃ（ＣＨ₃）₃），１２８．２（２Ｃ，ＣＨＣＣＨ），１３０．０（２Ｃ，ＣＨＣＣＨ），１４５．０（１Ｃ，ＣＣＨ₃），１５５．４（１Ｃ，ＣＨＣＳ），１７３．６（１Ｃ，ＣＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ），１７６．７（１Ｃ，ＣＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］⁺計算値５４２．２；実測値５４２．２。

【0024】

１．１．３．２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパンアミド）プロパン酸（Ｒ）−２−（２−（２−（２−（トシルオキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（Ｓ３）の合成
化合物Ｓ２（５．９４ｇ，１１．４ｍｍｏｌ）をＨＣｌ飽和酢酸エチル６０ｍＬに溶解し、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、ＣＨ₂Ｃｌ₂ ３０ｍＬとｎ−ＢｕＯＨ １ｍＬを加えた後に蒸発させることにより過剰のＨＣｌを除去した。ＣＨ₂Ｃｌ₂ ３×３０ｍＬとの共沸蒸留により残留ｎ−ＢｕＯＨを除去した。得られたＳ２のＨＣｌ塩、Ｎ−Ｂｏｃ−（Ｄ）−アラニン（２．１４ｇ，１１．４ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（１．７４ｇ，１１．４ｍｍｏｌ）を新たに蒸留したＣＨ₂Ｃｌ₂ ４０ｍＬに溶解した。ＤＩＰＥＡ（２ｍＬ，１１．４ｍｍｏｌ）を滴下し、全成分が溶解するまで混合液を室温で撹拌した。溶液を０℃まで冷却し、ＤＣＣ（２．３５ｇ，１１．４ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。白色沈殿が形成され、混合液を０℃で１時間撹拌後、室温で３時間撹拌した。沈殿を濾別し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で洗浄し、溶媒を減圧蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，０．０６０〜０．２００ｍｍ；溶離液２％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）を使用して粗生成物を精製し、Ｓ３を淡黄色油状物として得た（３．３７ｇ，５．７ｍｍｏｌ，５２％）；Ｒ_f＝０．３（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）。
ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ^-1，ＡＴＲ）２８７６（Ｃ−Ｈ），１７４０（Ｃ＝Ｏエステル），１７１８（Ｃ＝Ｏアミド），１６６７（Ｎ−Ｈ），１５２２（Ｎ−Ｈ），１４５２（Ｃ−Ｈ），１３６５（Ｓ＝Ｏ），１１６１（Ｓ＝Ｏ），１１０５（Ｃ−Ｏ）；¹Ｈ ＮＭＲ δ_H（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；Ｍｅ₄Ｓｉ）７．８０（ｄ，Ｊ＝８．４，２Ｈ，−ＣＨ_Ar−Ｃ−Ｓ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．１，２Ｈ，−ＣＨ_Ar−），６．９１（ｓ，１Ｈ，−ＮＨ），５．００（ｓ，１Ｈ，−ＮＨ），４．５８（ｍ，１Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）−），４．２８（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＯＣＨ₂−），４．１４（ｍ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−），３．６１（ｍ，１２Ｈ，−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₃−），２．４５（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ₃），１．４５（ｓ，９Ｈ，−ＯＣ（ＣＨ₃）₃），１．４０（ｄ，Ｊ＝７．２，３Ｈ，−ＣＨ（ＣＨ₃）−），１．３５（ｄ，Ｊ＝７．２，３Ｈ，−ＣＨ（ＣＨ₃）−）；¹³Ｃ ＮＭＲ δ_C（７５ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；Ｍｅ₄Ｓｉ）１８．２（２Ｃ，ＣＨＣＨ₃），２１．７（１Ｃ，ＣＣＨ₃），２８．４（３Ｃ，Ｃ（ＣＨ₃）₃），４７．２（１Ｃ，ＮＣＨ），５０．０（１Ｃ，ＮＣＨ），６４．５（１Ｃ，Ｂｏｃ−ＯＣＨ₂），６８．７（２Ｃ，ＯＣＨ₂），６９．３（１Ｃ，ＯＣＨ₂），７０．６（４Ｃ，ＯＣＨ₂），８０．２（１Ｃ，Ｃ（ＣＨ₃）₃），１２８．０（２Ｃ，ＣＨＣＣＨ），１２９．９（２Ｃ，ＣＨＣＣＨ），１３３．１（１Ｃ ＣＣＨ₃），１４４．９（１Ｃ，ＣＨＣＳ），１７２．７（２Ｃ，Ｃ＝Ｏ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］⁺計算値６１３．２；実測値６１３．１。

【0025】

１．１．４．２−（（Ｓ）−２−ホルムアミドプロパンアミド）プロパン酸（Ｒ）−２−（２−（２−（２−（トシルオキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（Ｓ４）の合成
化合物Ｓ２について記載したと同一手順に従って化合物Ｓ３（１．７０ｇ，２．８５ｍｍｏｌ）を脱保護し、それ以上精製せずに使用した。粗生成物をギ酸エチル２５ｍＬに溶解した。ギ酸ナトリウム（０．９７ｇ，１４．２５ｍｍｏｌ）を加え、混合液を６６℃に８時間加熱した。混合液を室温まで冷却し、固形分を濾別した。溶媒を減圧蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，０．０６０〜０．２００ｍｍ；溶離液４％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）を使用して粗生成物を精製し、Ｓ４を薄黄色油状物として得た（０．７９ｇ，１．５２ｍｍｏｌ，５４％）；Ｒ_f＝０．３（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）。
ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ^-1，ＡＴＲ）２８７３（Ｃ−Ｈ），１７３８（Ｃ＝Ｏ），１６５３（Ｎ−Ｈ），１５３２（Ｎ−Ｈ），１４５２（Ｃ−Ｈ），１３５２（Ｓ＝Ｏ），１１７４（Ｓ＝Ｏ），１０９７（Ｃ−Ｏ）；¹Ｈ ＮＭＲ δ_H（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；Ｍｅ₄Ｓｉ）８．１８（ｓ，１Ｈ，ＨＣ（Ｏ）ＮＨ−），７．７９（ｄ，Ｊ＝８．４，２Ｈ，−ＣＨ_Ar−Ｃ−Ｓ），７．３５（ｄ，Ｊ＝８．７，２Ｈ，−ＣＨ_Ar−），６．７８（ｓ，１Ｈ，−ＮＨ），６．５５（ｓ，１Ｈ，−ＮＨ），４．５５（ｍ，２Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）−），４．３０（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＯＣＨ₂−），４．１３（ｍ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−），３．６１（ｍ，１２Ｈ，−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₃−），２．４４（ｓ，３Ｈ，−ＣＨ₃），１．４２（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ（ＣＨ₃）−）；¹³ＣＮＭＲ δ_C（７５ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；Ｍｅ₄Ｓｉ）１７．９（１Ｃ，ＣＨＣＨ₃），１８．２（１Ｃ，ＣＨＣＨ₃），２１．７（１Ｃ，ＣＣＨ₃），４７．２（１Ｃ，Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＨＮＣＨ），４８．１（１Ｃ，ＨＮＨＣ（Ｃ＝Ｏ）），６４．５（１Ｃ，ＯＣＨ₂），６８．７（２Ｃ，ＯＣＨ₂），６９．３（１Ｃ，ＯＣＨ₂），７０．６（４Ｃ，ＯＣＨ₂），１２８．０（２Ｃ，ＣＨＣＣＨ），１２９．９（２Ｃ，ＣＨＣＣＨ），１３３．１（１Ｃ，ＣＣＨ₃），１４４．９（１Ｃ，ＣＨＣＣＨ），１６１．０（１Ｃ，Ｈ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ）），１７２．６（１Ｃ，ＣＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ），１７３．２（１Ｃ，ＣＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］⁺計算値５４１．２；実測値５４１．２。

【0026】

１．１．５．２−（（Ｓ）−２−ホルムアミドプロパンアミド）プロパン酸（Ｒ）−２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（Ｓ５）の合成
化合物Ｓ４（０．５５０ｇ，１．０６ｍｍｏｌ）を無水ＥｔＯＨ ４０ｍＬに溶解した。アジ化ナトリウム（０．３８ｇ，５．９ｍｍｏｌ）を加え、混合液を一晩還流した。室温まで冷却したら、固形分を濾別し、濾液を減圧乾燥した。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂，０．０６０〜０．２００ｍｍ；溶離液４％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）を使用して粗生成物を精製し、Ｓ５を淡いオレンジ色の油状物として得た（０．３２ｇ，０．８２ｍｍｏｌ，７８％）；Ｒ_f＝０．４（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）。
ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ^-1，ＡＴＲ）３３０９（Ｎ−Ｈ），２８７５（Ｃ−Ｈ），２１０５（Ｎ３），１７３７（Ｃ＝Ｏ），１６５１（Ｎ−Ｈ），１５２９（Ｎ−Ｈ），１４５３（Ｃ−Ｈ），１１３３（Ｃ−Ｏ）；¹Ｈ ＮＭＲ δ_H（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；Ｍｅ₄Ｓｉ）８．２０（ｓ，１Ｈ，ＨＣ（Ｏ）ＮＨ−），６．８４（ｓ，１Ｈ，−ＮＨ），６．６０（ｓ，１Ｈ，−ＮＨ），４．６０（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）），４．２６（ｍ，２Ｈ，−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ₂−），３．６８（ｍ，１２Ｈ，（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₃−），３．４０（ｍ，２Ｈ，Ｎ₃ＣＨ₂−），１．４２（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ（ＣＨ₃）−）；¹³Ｃ ＮＭＲ δ_C（７５ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；Ｍｅ₄Ｓｉ）１７．９（１Ｃ，ＣＨ₃），１８．２（１Ｃ，ＣＨ₃），４７．４（１Ｃ，ＣＨ₂Ｎ₃），４８．４（１Ｃ，Ｈ（Ｃ＝Ｏ）ＨＮＣＨ），５０．７（１Ｃ，ＨＮＣ（ＣＨ₃）Ｃ＝Ｏ），６９．０（１Ｃ，ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ），７０．１（１Ｃ，ＯＣＨ₂ＣＨ₂），７０．６（２Ｃ，ＯＣＨ₂），７０．７（２Ｃ，ＯＣＨ₂），１６１．４（１Ｃ，Ｈ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ），１７２．７（１Ｃ，ＣＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ），１７２．９（１Ｃ，ＣＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］⁺計算値４１２．２；実測値４１２．２。

【0027】

１．１．６．２−（（Ｓ）−２−イソシアノプロパンアミド）プロパン酸（Ｒ）−２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（１）の合成
新たに蒸留したＣＨ₂Ｃｌ₂ １５０ｍＬに化合物Ｓ５（２２１ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）とＮ−メチルモルホリン（０．２４ｍＬ，２．２７ｍｍｏｌ）を溶解し、アルゴン雰囲気下で−４０℃（ドライアセトン浴）まで冷却した。新たに蒸留したＣＨ₂Ｃｌ₂ １０ｍＬに溶解したジホスゲン（０．０４８ｍＬ，０．３９８ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン下で１時間かけて滴下した。ジホスゲンを加えながら混合液を撹拌し、厳密に−４０℃に維持した。混合液が黄変し始めたら、過剰の重炭酸ナトリウム（５ｇ）で反応を迅速にクエンチした。クエンチした混合液を−４０℃で５分間撹拌した。反応混合液をショートシリカカラムプラグ（ＳｉＯ₂，０．０６０〜０．２００ｍｍ）に通した。プラグにはＣＨ₂Ｃｌ₂を充填したが、目的化合物はＣＨ₂Ｃｌ₂／アセトニトリル（３：１）で溶出させ、１を淡黄色油状物として得た（４８．１ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ，２７％）；Ｒ_f＝０．５（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）。
ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ¹，ＡＴＲ）３３１８（Ｎ−Ｈ），２８７５（Ｃ−Ｈ），２１４２（Ｃ≡Ｎ），２１０５（Ｎ３），１７４４（Ｃ＝Ｏ），１５４０（Ｎ−Ｈ），１４５３（Ｃ−Ｈ），１１２３（Ｃ−Ｏ）；¹Ｈ ＮＭＲ δ_H（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；Ｍｅ₄Ｓｉ）７．００（ｂｄ，１Ｈ，−ＮＨ−），４．５９（ｍ，１Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）Ｃ（Ｏ）Ｏ−），４．３２（ｍ，３Ｈ，（−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−），−Ｃ≡ＮＣＨ（ＣＨ₃）Ｃ（Ｏ）ＮＨ−），３．６７（ｍ，１２Ｈ，−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）₃），３．３９（ｍ，２Ｈ，Ｎ₃ＣＨ₂−），１．６５（ｄ，Ｊ＝７．２，３Ｈ，Ｃ≡ＮＣＨ（ＣＨ₃）Ｃ（Ｏ）−），１．４８（ｄ，Ｊ＝７．２，３Ｈ，Ｃ≡ＮＣＨ（ＣＨ₃）Ｃ（Ｏ）−）；¹³Ｃ ＮＭＲ δ_C（７５ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃；Ｍｅ₄Ｓｉ）１７０．６９（１Ｃ，ＣＨ（ＣＨ₃）Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ₂），１６５．７２（１Ｃ，ＣＨ（ＣＨ₃）Ｃ（Ｏ）ＮＨ），７０．６９，７０．６５，７０．６１，７０．５６，７０．０２，６８．８１（１Ｃ，ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ），５０．６６（１Ｃ，ＣＨ₂Ｎ₃），４８．５６（Ｃ≡ＮＣＨ），１９．６６，１８．０４（１Ｃ，ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＯ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］⁺（Ｃ₁₅Ｈ₂₅Ｎ₅Ｏ₆Ｎａ），計算値３９４．１７；実測値３９４．１。

【0028】

（２．１）第２のコモノマーの製造
図３のスキームに従い、連結基とグラフトしていない第２のコモノマーを合成した。
２．１．１ ２−アミノプロパン酸２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル（Ｓ６）の合成
メトキシトリエチレングリコール（２５ｍｌ，１５６．２１ｍｍｏｌ）、Ｌ−アラニン（２１．８５ｇ，２４５．２５ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（３２．６９ｇ，１７１．８３ｍｍｏｌ）及びトルエン２５０ｍｌを丸底フラスコに加えた。反応混合液を１２６℃で４時間還流した。固形沈殿を濾別し、溶媒を減圧蒸発させた。次に生成物をクロロホルム３００ｍｌに溶解し、有機層をＮａＨＣＯ₃（飽和）で３回抽出した。その後、水層をクロロホルムで２回抽出した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、溶媒を減圧蒸発させ、収率６２％で２２．６９ｇのＳ６を得た。
２．１．２ ２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル（Ｓ７）の合成
Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ（１８．２５ｇ，９６．４４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．１ｇ，０．８ｍｍｏｌ）、ＤｉＰＥＡ（１．７ｍｌ，９．６４ｍｍｏｌ），ＨｏＢｔ（１４．７７ｇ，９６．４４ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（２１．８９ｇ，１０６．０８ｍｍｏｌ）、Ｓ６（２２．６９ｇ，９６．４４ｍｍｏｌ）及びＣＨ₂Ｃｌ₂ ２５０ｍｌを混合し、氷浴で０℃まで冷却し、３時間撹拌した。その後、混合液を室温まで昇温し、１５時間撹拌した。固形分を濾別し、生成物をクロロホルム２００ｍｌに溶解し、溶液をクエン酸で３回抽出した。水層をクロロホルム（１×２００ｍｌ）で洗浄した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で２回洗浄し、水層をクロロホルムで更に２回抽出した。有機層を合わせてＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、溶媒を減圧蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（２％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）を使用して粗生成物を精製し、収率５２％で２０．４ｇのＳ７を得た。
Ｒ_f＝０．５３（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）：δ＝６．７７（ｓ，１Ｈ，−ＮＨＣＨ−）；５．０９（ｓ，１Ｈ，−ＮＨＣＨ）−；４．６０（ｑ，１Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）−）；４．３１−４．２８（ｍ，３Ｈ，−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−，−ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＯＯ−）；３．７０−３．５６（ｍ，１０Ｈ，−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₂−）；３．３８（ｓ，１Ｈ，−ＯＣＨ₃）；１．４６（ｓ，９Ｈ，−ＯＣ（ＣＨ₃）₃）；１．４１（ｄ，３Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）−；１．３８（ｄ，３Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）−）。
Ｓ７（１３．１５ｇ，３２．３５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル２０ｍｌに溶解し、４Ｍ ＨＣｌジオキサン溶液２０ｍｌで処理した。混合液を室温で１時間撹拌した。ＴＬＣにより出発化合物をチェックした後、４Ｍ ＨＣｌジオキサン溶液を更に２０ｍｌ加え、溶液を室温で更に１時間撹拌した。ＤＣＭ ２０ｍＬを加えて残留ｔ−ＢｕＯＨを除去し、減圧除去した。この手順を３回繰返した。

【0029】

２．１．３ ２−ホルムアミドプロパン酸２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル（Ｓ８）の合成
Ｓ７のＨＣｌ塩（１３．１５ｇ，３２．３３ｍｍｏｌ）とギ酸ナトリウム（８．７６ｇ，１２９．３３ｍｍｏｌ）をギ酸エチル２５０ｍｌに溶解した。反応混合液を６６℃で１４時間煮沸した。沈殿を濾別し、溶媒を減圧蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（４％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）を使用して粗生成物を精製し、収率５６％で６．０４ｇのＳ８を得た。
Ｒ_f＝０．５４（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）：δ＝８．２３（ｓ，１Ｈ，ＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）；６．９４（ｄ，１Ｈ，−ＮＨＣＨ−）；６．７９（ｄ，１Ｈ，−ＮＨＣＨ−；４．５７（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）−，−ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）−）；４．２６（ｍ，２Ｈ，−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ₂−）；３．６７−３．５４（ｍ，１０Ｈ，−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）₃−）；３．４３（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ₃）；１．４５（ｔ，６Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）−，−ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）−。

【0030】

２．１．４ ２−イソシアノプロパン酸２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル（２）の合成
Ｓ８（６．０４ｇ，１８．０６ｍｍｏｌ）をＮ₂で１時間脱気した。次に新たに蒸留したＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍｌ）にＮＭＭ（５ｍｌ，４５．１５ｍｍｏｌ）を溶解し、溶液に加えた。反応混合液を−４０℃（ドライアイス／イソプロパノール）まで冷却した。ジホスゲン（１．５２ｍｌ，１２．６４ｍｍｏｌ）のＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍｌ）溶液を２時間かけて滴下した。黄色−オレンジ色になるまで反応混合液を撹拌し、ＮａＨＣＯ₃（３ｇ）でクエンチした。カラムクロマトグラフィー（１：２ ＡＣＮ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）を使用して粗生成物を精製し、収率５１％で３．３４ｇの２を得た。
Ｒ_f＝０．５０（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）：δ＝７．００（ｄ，１Ｈ，−ＮＨ−）；４．５８（ｍ，１Ｈ，Ｃ≡ＮＣＨ（ＣＨ₃）Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）；４．２８（ｍ，２Ｈ，−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ−）；４．２６（ｍ，１Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）Ｃ（Ｏ）Ｏ−）；３．７４−３．５３（ｍ，１０Ｈ，−ＯＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）₃ＯＣＨ₃）；３．４１（ｓ，３Ｈ，−ＯＣＨ₃）；１．６７（ｄ，３Ｈ，Ｃ≡ＮＣＨ（ＣＨ₃）Ｃ（Ｏ）−）；１．４９（ｄ，３Ｈ，−ＮＨＣＨ（ＣＨ₃）Ｃ（Ｏ）Ｏ−）。

【0031】

（３）重合
蒸留したトルエン２ｍＬに化合物２（例えば１００当量）と化合物１（１当量）を溶解した。Ｎｉ（Ｃｌ₂Ｏ₄）₂・６Ｈ₂Ｏ ３９ｍｇを無水エタノール１０ｍＬとトルエン９０ｍＬに溶解することにより１ｍＭの触媒ストック溶液を調製した。合計モノマーモル×１０^-4に等しい体積をピペットでモノマーに加えた。モノマーの最終濃度が２５ｍｇ／ｍＬとなるように、蒸留したトルエンで混合液を希釈した。乾燥用ＣａＣｌ₂管を取付けたフラスコで混合液を室温で７２時間撹拌した。ポリマーをジイソプロピルエーテルで沈殿させて単離した。この沈殿サイクルを３回繰返し、収率４４〜９２％を得た。固有粘度、レオロジー（Ｇ’）及び円二色性を測定することによりポリマーを分析し、溶液からマイカ上にドロップキャストし、ＡＦＭにより可視化した。

【0032】

（４）スペーサー単位／細胞接着単位とコポリマーとのグラフト
ペプチド（ＧＲＧＤＳ）をｐＨ８．４の硼酸緩衝液に最終濃度２ｍｇ／ｍＬまで溶解した。式（ＩＩＩ）により表されるスペーサー単位（ＢＣＮ−ＮＨＳ）をペプチド溶液に対して１：１のモル比で加え、１８℃で３００ｒｐｍにて１時間混合後、１００μＬずつ凍結した。式（Ｖ）により表されるＢＣＮ−ＧＲＧＤＳが得られた。ＭＳ計算値［Ｃ₃₉Ｈ₆₂Ｎ₁₀Ｏ₁₅］：９１０．４；実測値：９１１．５。
前工程で得られたポリイソシアニド（ＰＩＣ）をＡＣＮに２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ポリイソシアニド主鎖中のアジドコモノマーのモル当量に対して適切な体積のＢＣＮ−ＧＲＧＤＳをこのＰＩＣ溶液に加えた。混合液を４℃で７２時間撹拌した。ＰＩＣ−ペプチドをジイソプロピルエーテルで沈殿させることにより精製した。沈殿剤をデカントし、ポリイソシアニド−ペプチドを再溶解し、ＤＣＭからジイソプロピルエーテルに沈殿させた。

【0033】

（５）コポリマーからハイドロゲルの調製
この時点以降は、ポリイソシアノペプチドが無菌状態に維持されるように注意した。全器具は使用前にエタノールをスプレーした。ＰＩＣ−ペプチドコンジュゲートを滅菌遠心管に直接配量した。紫外線を５分間照射することにより遠心管を更に滅菌した。培地中のポリマーの最終希釈濃度が３．２ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＩＣ−ペプチドを滅菌細胞培養培地で覆い、４℃で２４時間膨潤させた。２４時間後に、遠心管の底に膨潤したゲル様物質が得られた。膨潤したＰＩＣ−ペプチドコンジュゲートを４℃で７２時間撹拌後、均質な溶液が得られた。得られた溶液は臨界温度を越えると急激な粘度変化を示した。
培地中のＰＩＣ−ペプチドコンジュゲートは４〜７℃で２０カ月まで安定であり、凍結した場合には更に長期間となった。
適切な剛性度と濃度の脈管新生誘導コンストラクトを作製するために、目的の最終ポリマー濃度である２．０ｍｇ／ｍＬとするのに適切な量の培地で３．２ｍｇ／ｍＬのゲルのストック溶液を希釈した。

【0034】

（６）細胞を含むハイドロゲルの調製
（６−１）細胞を含む細胞培地の調製
胎仔ウシ血清、ヒドロコルチゾン、ｈＦＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、ｈＥＧＦ及びＧＡ−１０００を添加済みの内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ−２，Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）でＨＵＶＥＣ（ＡＣＴＴ，ＰＣＳ−１００−０１０，ＵＳＡ）を増殖させた。胎仔ウシ血清、平滑筋細胞増殖サプリメント及びペニシリン／ストレプトマイシン９を含むサプリメントを添加した平滑筋細胞培地（ＳＭＣＭ，ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）でＨｂＳＭＣ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，４３１０，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を増殖させた。これらの２種類の細胞種をＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）で５％ ＣＯ₂下に３７℃にて増殖させた。培地を週３回交換し、細胞をトリプシン処理により回収した。ＨｂＳＭＣの８継代培養物とＨＵＶＥＣの９継代培養物を全実験で使用した。
（６−２）細胞を含む細胞培地とハイドロゲルの混合
脈管新生誘導コンストラクトを作製するために、工程（Ｂ）で得られた温度応答性ＰＩＣ−ペプチドコンジュゲートの溶液の温度を０℃まで低下させ、ゲルから液体への転移を誘導した。次に、工程（６−１）で得られたＨＵＶＥＣとＨｂＳＭＣの両者を含む細胞懸濁液と液化ゲルのアリコートを細胞５００，０００個／ｍｌの目的濃度となるように混合した。次にこれらのゲル−細胞懸濁液の２００μｌアリコートを２４ウェルインサート（メンブレン細孔寸法０．２μｍ）に移し、３７℃に３０分間保温し、ゲルを固化させた。

【0035】

（７）血管前駆細胞系を形成するための細胞培養
細胞は３日以内にハイドロゲルに付着し、７日以内に脈管新生が認められることが確認された。
作製した脈管新生誘導コンストラクトを適切な混合培地で５％ ＣＯ₂下に３７℃で１４日間培養した。脈管新生コンストラクトの進行が認められた。

【0036】

比較実験２（低ポリマー濃度）
工程（５）におけるポリマー濃度を２．０ｍｇ／ｍＬではなく１．０ｍｇ／ｍＬとした以外は実施例１と同様に実施した。
工程（７）では、ゲルの固化後に細胞は２４ウェルインサートの底に徐々に沈んだ。細胞の発芽の多少の群発が認められたが、形成された構造体は品質が不良であった。３日後に実験を終了した。血管前駆細胞系は形成されなかった。

【0037】

比較実験３（高ポリマー濃度）
工程（５）におけるポリマー濃度を２．０ｍｇ／ｍＬではなく３．２ｍｇ／ｍＬとした以外は実施例１と同様に実施した。
工程（７）では、非常にゆっくりであったが、脈管新生コンストラクトの進行が認められた。細胞は２４ウェルインサートに懸濁したままであった。細胞は１〜７日目は球形のままであり、その後、発芽の開始が認められた。１４日後に実験を終了した。形成された細胞構造体は品質が不良なようであり、血管前駆細胞系は形成されなかった。ハイドロゲルの剛性度が高いため、これらの特定細胞はゲル内で効率的に移動／増殖できないものと思われた。
実施例１と比較実験２及び３を比較すると、脈管新生コンストラクトの形成にはハイドロゲルにおけるコポリマーの濃度が重要であると結論することができる。適切な濃度範囲は１．２〜３．０ｍｇ／ｍＬである。

【0038】

比較実験４（ＧＲＧＤＳ過少）
工程（３）にける化合物１と化合物２の比を１：１００ではなく１：５５０とした以外は実施例１と同様に実施した。
工程（７）では、ゲルの固化後に細胞は長期間球形のままであり、発芽はあまり認められず、２１日後に脈管新生誘導は完了しなかった。血管前駆細胞系は形成されなかった。

【0039】

比較実験５（ＧＲＧＤＳ過多）
工程（３）における化合物２と化合物１の比を１：１００ではなく１：２５とした以外は実施例１と同様に実施した。
工程（７）では、ゲルの固化後に無制御で無統制の細胞増殖が認められ、形成された構造体は血管前駆細胞系に相当しなかった。

【0040】

比較実験６（ＧＲＧＤＳ過多）
工程（３）における化合物２と化合物１の比を１：１００ではなく１：１０とした以外は実施例１と同様に実施した。
工程（５）では、ＰＩＣ−ペプチドを無菌細胞培養培地で覆った後にゲル様物質が得られず、実験を終了した。
実施例１と比較実験４及び５を比較すると、脈管新生コンストラクトの形成にはＧＲＧＤＳとグラフト重合したコモノマーの比が重要であると結論することができる。適切な比は１：５５０〜１：５０である。

【0041】

実験７
実施例１の工程５で得られたハイドロゲルの弾性率を次のように測定した。
機器。レオロジー測定はペルチェ素子による温度制御付き≒２０ｍＬクエット構成のＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ａｒｅｓ Ｇ２レオメーターを使用して実施した。脱イオン水（２０ｍＬ）に適量のポリマーを混合し、均質な溶液が得られるまで時間をかけて（最低２４時間）混合液を通常通りにボルテックスすることにより試料を調製した。早期ゲル形成を避けるように冷蔵（４℃）条件下でＰＩＣ溶液を調製した。０．５〜５Ｈｚの種々の周波数で４％の歪み下に直線応答レジームの測定を実施した。原稿に表示されたデータを１Ｈｚで記録した。昇温速度２℃／分で温度スキャンを記録した。生物学的に相応する培地における測定はＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＲ−１で４０ｍｍアルミニウム平行プレートを使用し、ギャップ７５０μｍ及び試料１ｍＬに設定して実施した。ペルチェ素子と蒸発ガードを使用して温度制御した。ＤＭＥＭに適量のポリマーを混合し、均質な溶液が得られるまで（最低４８時間）４℃で通常通りに連続的に撹拌することによりＰＩＣ試料を調製した。ＰＩＣ溶液を直接使用するか又は、試料メモリー効果を避けるように測定を実施できるようになるまで凍結した。マトリゲルは業者から入手したまま使用し、フィブリンゲルはＦＢＳを添加したＤＭＥＭにフィブリノーゲンを溶解することにより調製し、測定前に３７℃で２時間ゲル化させた。１Ｈｚ〜の種々の周波数で２％の歪み下に直線応答レジームの測定を実施した。昇温又は降温速度２℃／分で温度スキャンを記録した。
弾性率は５〜１５℃の温度範囲で実質的に一定であり、測定値は１Ｐａ前後であった。弾性率は２３℃までに１００Ｐａ前後まで増加した。弾性率は３５℃までに５００Ｐａ前後まで増加した。

【図1】

【図2】

【図3】