特許 6348551 クロマトグラフィーカラムの充填方法、高圧で使用するための充填されたクロマトグラフィーカラム、及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6348551

(24)【登録日】2018年6月8日

(45)【発行日】2018年6月27日

(54)【発明の名称】クロマトグラフィーカラムの充填方法、高圧で使用するための充填されたクロマトグラフィーカラム、及びその使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/56 20060101AFI20180618BHJP

【ＦＩ】

   G01N30/56 A

【請求項の数】8

【外国語出願】

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2016-190692(P2016-190692)

(22)【出願日】2016年9月29日

(65)【公開番号】特開2017-67780(P2017-67780A)

(43)【公開日】2017年4月6日

【審査請求日】2016年9月29日

(31)【優先権主張番号】14/872,139

(32)【優先日】2015年10月1日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】591025358

【氏名又は名称】ダイオネックス コーポレイション

(73)【特許権者】

【識別番号】516293705

【氏名又は名称】サーモ ハイパーシル−キーストーン リミテッド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100086771

【弁理士】

【氏名又は名称】西島 孝喜

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(72)【発明者】

【氏名】シャオドン リウ

(72)【発明者】

【氏名】ジェニファー エム グェン

(72)【発明者】

【氏名】ロナルド エイ シェラン

(72)【発明者】

【氏名】マーク エル トレイシー

【審査官】 高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５２４２４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−１３１３００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０８−０５０１２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５９−０７０９６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５２６９７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０１５１８０８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平０１−１７６２０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６３−１３５８５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０６４０２９５８（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 特開２００６−０７８２３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−２７９５５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−２３０５７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５９−０２８６６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１２７０４４（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／００１７１４９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 J.J. Kirkland，The art and science of forming packed analytical high-performance liquid chromatography columns，Journal of Chromatography A,，米国，２００６年 ５月１２日，1126，P50-57

【文献】 Packing Conditions for Self Pack POROS 20 OH Media，Applied Biosystems Instruction Sheet，１９９７年 １月 １日，P1-3

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３０／５６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

クロマトグラフィーカラムを充填する方法であって、
クロマトグラフィー媒体粒子を、少なくとも９０重量％の水を含む水系スラリー溶液中に分散させてスラリーを形成することと、ここで、前記スラリーは、１００重量部の水に基づいて、少なくとも０．１〜５０重量部の界面活性剤を含み；
前記スラリーを前記カラムに導入することによってクロマトグラフィーカラムを前記クロマトグラフィー媒体粒子で満たすことと；
圧力を加えて前記クロマトグラフィー媒体粒子を前記クロマトグラフィーカラム内に充填することと；を含み、前記圧力が、第１の期間にわたって第１の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれ、また、前記第１の期間の後、第２の期間にわたって前記第１の圧力よりも高い第２の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれ、前記第１の圧力が１００〜１５００バールの範囲内であり、前記第２の圧力が１５００〜６０００バールの範囲内である、前記方法。

【請求項2】

前記水系スラリー溶液が、１００重量％水、または少なくとも９５重量％、もしくは少なくとも９９重量％水である、請求項１に記載の前記方法。

【請求項3】

前記水系スラリー溶液が、１００重量部の水に基づいて、１０重量部以下、または５重量部以下、または１重量部以下の有機溶剤の量で、有機溶剤を含有する、請求項１に記載の前記方法。

【請求項4】

前記水系スラリー溶液が、１００重量部の水に基づいて、
０〜５０重量部の電解質または塩（イオン性界面活性剤以外）と、
０〜１００重量部の酸と、
０〜１００重量部の塩基と、をさらに含む、請求項１に記載の前記方法。

【請求項5】

前記第２の圧力が１５００〜４０００バールの範囲内である、請求項１に記載の前記方法。

【請求項6】

前記第１の期間が０．１〜１００時間の範囲内であり、前記第２の期間が０．１〜１００時間の範囲内である、請求項１に記載の前記方法。

【請求項7】

前記カラムが１０μｍ〜５ｍｍの内径を有し、前記カラムが２０ｍｍ〜１０，０００ｍｍの長さを有する、請求項１に記載の前記方法。

【請求項8】

前記クロマトグラフィー媒体粒子が、１〜５μｍのメジアン粒径を有し、全体的に多孔質または表面的に多孔質である、請求項１に記載の前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液体クロマトグラフィーカラムの技術分野に関する。具体的には、本発明は、高い操作圧、特に１０００バール超に耐え得る、かかるカラムの充填方法に関する。本発明はまた、この方法で充填された液体クロマトグラフィーカラム、及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、化学試料及び生体試料の両方の様々な試料中の分析物の質及び量を判定するために、分析クロマトグラフィー用途において日常的に使用されている。これらのクロマトグラフィー技術において、成分（分析物とも呼ばれる）の混合物を含む試料の分離は、成分の各々が移動相と固定相との間に別々に分配される（すなわち、成分が異なる分配係数を有する）ため、カラム内の固定相を通して液体移動相内に試料を運搬し、それにより、試料をその各成分に分離させることによって達成される。固定相は、最も一般的には、カラム内に充填された粒子の層の形態におけるものである。試料の高い解像度及びスループットを提供するために、典型的には最大６００バールの高い操作圧がＨＰＬＣにおいて用いられる。

【0003】

データの質及び分析のコストに重要である、超高解像度かつ／または超高速スループットの分析を実現するために、低いシステム分散及び極端に高いシステム操作圧（典型的には１０００バール超）の利点を用いる、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）が開発されている。ＵＨＰＬＣカラムは、ＵＨＰＬＣソリューションに非常に重要な要素である。ＵＨＰＬＣ機器の能力を十分活用して超高解像度かつ超高スループットの分析を達成するために、カラムは典型的に、通常２μｍより小さい（例えば１．５μｍの）小粒子を含む固定相媒体で充填される。これらの粒子は、全体的に多孔質（すなわちバルク多孔質）、表面的に多孔質、または非多孔質であり得、該粒子は、特定の用途のために表面修飾される場合がある。このような過酷な操作条件（高圧及び／または高線速度）は、分離カラムが優秀な層安定性を有することを必要とする。

【0004】

従来、ＨＰＬＣカラムは、１つ以上の有機溶剤を使用するプロセス（本明細書では「溶剤充填」）において充填される。しかしながら、この手法には、本発明者らが注目する関連したいくつかの欠点が存在する。第１に、溶剤充填は、１３００バール以上の圧力下で操作され得るＨＰＬＣカラムを提供することができない場合が多く、それにより、ＵＨＰＬＣにおける（例えばＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）ＶＡＮＱＵＩＳＨ（登録商標）Ｈ ＵＨＰＬＣシステムにおける）かかる圧力（例えば１５００バール）の使用が限定されることを本発明者らは見出した。第２に、ほとんどの有機溶剤はある程度毒性かつ／または可燃性であり、したがって操作者に対する健康上及び安全上の問題ならびに環境汚染をもたらす。第３に、有機溶剤の使用は、製造プロセスに関連するコスト及び必要とされる廃棄物処理のために高価である。

【発明の概要】

【0005】

第１の態様によると、先行技術の上記の欠点に対処する、好ましくは液体圧下でのスラリー作製及び／またはカラム充填のための水溶液を使用することを含むカラム充填の方法が提供される。有機溶剤系の充填方法と比較して、この水系の方法は、１０００超、または１３００バール超の操作圧における改善されたカラム安定性（耐久性）、改善された分離性能、及び改善された再現性をもたらすことができることが見出された。この水性充填方法は、溶剤系の方法と比べて改善された生産収率を提供することが見出された。例えば、水性充填方法は、溶剤系の方法の５０％と比較して９０％の収率を提供し得る。性能の改善には、ピークテーリングの低減及び分離効率の上昇が含まれる。これらの利点には、充填プロセスにおける溶剤消費量の大幅な低減（例えば、溶剤使用量の最大９５〜１００％の低減）が付随する。

【0006】

第２の態様によると、多段圧力充填方法を含むカラム充填の方法が提供される。繰り返しになるが、性能の改善は、カラム耐久性の改善、ピークテーリングの低減、及び分離効率の改善を含むことが見出された。

【0007】

本発明は、水系充填及び／または多段圧力充填方法を使用する、ＨＰＬＣでは最大６００バール、ならびにＵＨＰＬＣでは最大１５００バールの操作圧に耐え得るＬＣカラムを充填する方法を提供する。本発明は、最も好ましくは、水溶液及び多段圧力を使用する両方の態様を含むカラム充填の方法を提供する。

【0008】

本発明の実施形態によると、第１の態様では、クロマトグラフィーカラムを充填する方法であって、
クロマトグラフィー媒体粒子を水系スラリー溶液中に分散させてスラリーを形成することと、
スラリーをカラムに導入することによってクロマトグラフィーカラムをクロマトグラフィー媒体粒子で満たすことと、
圧力を加えてクロマトグラフィー媒体粒子をクロマトグラフィーカラム内に充填することと、を含む、方法が提供される。

【0009】

水系スラリー溶液は、好ましくは１００重量％水、または少なくとも９０重量％、もしくは少なくとも９５重量％、もしくは少なくとも９９重量％水である。水系スラリー溶液は、１００重量部の水に基づいて、１００重量部以下、５０重量部以下、または４０重量部以下、または３０重量部以下、または２０重量部以下、または１０重量部以下、または５重量部以下、または１重量部以下の有機溶剤の量で、有機溶剤を含有し得る。

【0010】

水系スラリー溶液は、好ましくは、１００重量部の水に基づいて、
０〜５０重量部、または０〜４０重量部、または０〜３０重量部、または０〜２０重量部、または０〜１０重量部、または０〜５重量部、または０〜１重量部の界面活性剤と、
０〜５０重量部、または０〜４０重量部、または０〜３０重量部、または０〜２０重量部、または０〜１０重量部、または０〜５重量部、または０〜１重量部の電解質もしくは塩（イオン性界面活性剤以外）と、
０〜１００重量部、または０〜５０重量部、または０〜３０重量部、または０〜２０重量部、または０〜１０重量部、または０〜５重量部、または０〜１重量部の酸と、
０〜１００重量部、または０〜５０重量部、または０〜３０重量部、または０〜２０重量部、または０〜１０重量部、または０〜５重量部、または０〜１重量部の塩基と、をさらに含む。

【0011】

加圧力は、好ましくは、ある期間にわたって少なくとも５００バール、または少なくとも８００バール、または少なくとも１０００バール、または少なくとも１３００バール、または少なくとも１５００バール、または少なくとも２０００バールの圧力を含む。

【0012】

この圧力は、好ましくは、第１の期間にわたって第１の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれ、また、第１の期間の後、第２の期間にわたって第１の圧力よりも高い第２の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれる。

【0013】

本発明の実施形態によると、第２の態様では、クロマトグラフィーカラムを充填する方法であって、クロマトグラフィー媒体粒子をスラリー溶液中に分散させてスラリーを形成することと、スラリーをカラムに導入することによりクロマトグラフィーカラムをクロマトグラフィー媒体粒子で満たすことと、圧力を加えてクロマトグラフィー媒体粒子をクロマトグラフィーカラム内に充填することと、を含む、方法が提供され、この圧力は、第１の期間にわたって第１の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれ、また、第１の期間の後、第２の期間にわたって第１の圧力よりも高い第２の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれる。

【0014】

第１の圧力は、好ましくは、１００〜１５００バール、または１００〜１３００バール、または１００〜１０００バール、または３００〜１０００バール、または５００〜１０００バールの範囲内であり、第２の圧力は、好ましくは、１５００〜６０００バール、または１５００〜５０００バール、または１５００〜４０００バール、または１５００〜３０００バールの範囲内である。第１の圧力は、好ましくは、１００〜１５００バールの範囲内であり、第２の圧力は、好ましくは、１５００〜４０００バールまたは１５００〜４０００バールの範囲内である。

【0015】

第１の期間は、好ましくは、０．１〜１００時間、または０．２〜５０時間の範囲内であり、第２の期間は、好ましくは、０．１〜１００時間、または０．２〜５０時間の範囲内である。

【0016】

カラムは、好ましくは、１０μｍ〜５ｍｍ、または１００μｍ〜５ｍｍの内径を有し、カラムは、好ましくは、２０ｍｍ〜１０，０００ｍｍ、または２０ｍｍ〜１，０００ｍｍの長さを有する。クロマトグラフィー媒体粒子は、好ましくは、１〜５μｍのメジアン粒径を有し、好ましくは、全体的に多孔質または表面的に多孔質である。

【0017】

別の態様における本発明は、少なくとも５００バール、または少なくとも１０００バール、または少なくとも１３００バール、または少なくとも１５００バールの液体圧における操作のための液体クロマトグラフィーカラムを提供し、クロマトグラフィー媒体粒子は、水系スラリー溶液からカラム内に充填されている。このカラムの充填は、好ましくは、本発明の第１の態様に従う。

【0018】

さらに別の態様における本発明は、少なくとも５００バール、または少なくとも１０００バール、または少なくとも１３００バール、または少なくとも１５００バールの液体圧における操作のための液体クロマトグラフィーカラムを提供し、第１の期間にわたって第１の圧力で実質的に一定であり、また、第１の期間の後、第２の期間にわたって第１の圧力よりも高い第２の圧力で実質的に一定であり、かつ実質的に一定に保たれる加圧力下で、クロマトグラフィー媒体粒子がスラリー溶液からカラム内に充填されている。このカラムの充填は、好ましくは、本発明の第２の態様に従う。

【0019】

本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、現時点で好ましい本発明の実施形態を例示し、本明細書と合わせて本発明の特徴を説明する役割を果たす。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】一充填プロセスを実行するための一装置を概略的に示す。

【図2】媒体１（１．５μｍの表面的に多孔質のシリカ系Ｃ１８）粒子が充填された１００×２．１ｍｍのカラムでのカラム充填頑強性試験に関する典型的な圧力トレースを示す。

【図3】実施例１及び２の水系充填方法（クロマトグラムａ）及び溶剤系充填方法（クロマトグラムｂ）の両方を使用して、２４００バールで媒体１（１．５μｍの表面的に多孔質のシリカ系Ｃ１８）粒子が充填された１００×２．１ｍｍの２つのカラム間のカラム性能比較を示す。クロマトグラムｂに対するピーク形状の相対差を例示する目的で、クロマトグラムａをｙ軸上で下方に移動させたことに留意されたい。

【図4a】水系充填方法を使用して、８２０バールで媒体１（１．５μｍの表面的に多孔質のシリカ系Ｃ１８）粒子が充填された５０×２．１ｍｍのカラム（実施例３）での頑強性試験の前及び後のカラム性能結果（それぞれ、クロマトグラムａ及びクロマトグラムｂ）を示す。クロマトグラムｂに対するピーク形状の相対差を例示する目的で、クロマトグラムｂをｙ軸上で上方に移動させたことに留意されたい。

【図4b】水系充填方法を使用して、２４００バールで媒体１（１．５μｍの表面的に多孔質のシリカ系Ｃ１８）粒子が充填された５０×２．１ｍｍのカラム（実施例４）での頑強性試験の前及び後のカラム性能結果（それぞれ、クロマトグラムａ及びクロマトグラムｂ）を示す。ピーク形状の可能性のある差をクロマトグラムａと比較する目的で、クロマトグラムｂをｙ軸上で上方に移動させたことに留意されたい。

【図5】実施例１において２４００バールで２段階の水系充填方法を使用して、媒体１（１．５μｍの表面的に多孔質のシリカ系Ｃ１８）粒子が充填された１００×２．１ｍｍのカラムでの頑強性試験の前及び後のカラム性能結果（それぞれ、クロマトグラムａ及びクロマトグラムｂ）を示す。ピーク形状の可能性のある差をクロマトグラムｂと比較する目的で、クロマトグラムａをｙ軸上で下方に移動させたことに留意されたい。

【図6】２４００バールで２段階の水系充填方法を使用して、媒体２（１．９μｍの多孔質シリカ系Ｃ１８）粒子が充填された２００×２．１ｍｍのカラム（上記の実施例５）での頑強性試験の前及び後のカラム性能結果（それぞれ、クロマトグラムａ及びクロマトグラムｂ）を示す。ピーク形状の可能性のある差をクロマトグラムａと比較する目的で、クロマトグラムｂをｙ軸上で上方に移動させたことに留意されたい。

【図7a】実施例６の溶剤系充填方法を使用して、２４００バールで媒体２（１．９μｍの多孔質シリカ系Ｃ１８）粒子が充填された１５０×２．１ｍｍのカラムでの頑強性試験の前及び後のカラム性能結果（それぞれ、クロマトグラムａ及びクロマトグラムｂ）を示す。ピーク形状の可能性のある差をクロマトグラムａと比較する目的で、クロマトグラムｂをｙ軸上で上方に移動させたことに留意されたい。

【図7b】実施例７の２段階の水系方法を使用して、２４００バールで媒体２（１．９μｍの多孔質シリカ系Ｃ１８）粒子が充填された１５０×２．１ｍｍのカラムでの頑強性試験の前及び後のカラム性能結果（それぞれ、クロマトグラムａ及びクロマトグラムｂ）を示す。ピーク形状の可能性のある差をクロマトグラムａと比較する目的で、クロマトグラムｂをｙ軸上で上方に移動させたことに留意されたい。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以降、本発明の様々な好ましい特徴、実施形態、及び実施例をより詳細に記載する。

【0022】

第１の態様において本発明は、好ましくは、クロマトグラフィー媒体粒子を、少なくとも５０重量％の水を含有するスラリー溶液中に分散させることを含む。カラムを満たすのに十分な重量のクロマトグラフィー媒体粒子が分散される。それにより、スラリーが形成される。スラリー溶液は、好ましくは少なくとも６０重量％、または少なくとも７０重量％、または少なくとも８０重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％、または少なくとも９９重量％の水を含有する。この水は、好ましくは脱イオン（Ｄ．Ｉ．）水である。スラリー溶液は、任意選択だが好ましくは１つ以上の添加物を含む。添加物は、界面活性剤、塩などの電解質、酸、及び／または塩基から選択され得る。スラリー溶液は、任意選択により、１００重量部の水に基づいて、好ましくは有機溶剤の重量により１００重量部以下、５０重量部以下、または４０重量部以下、または３０重量部以下、または２０重量部以下、より好ましくは１０重量部以下、または５重量部以下、または１重量部以下の量で有機溶剤を含有し得る。

【0023】

いくつかの実施形態では、スラリー溶液は、１００重量％の水を含み得る。したがって、この文脈において溶液という用語は、その厳密な意味で１つ以上の成分を含有する水を意味するだけではなく、いくつかの実施形態では純粋な（１００％）水を意味するようにも使用されていることが理解されるであろう。ある特定の好ましい実施形態では、スラリー溶液は、９０〜１００重量％の水及び０〜１０重量％の溶剤を含み得る。

【0024】

水及び任意選択の溶剤に加えて、スラリー溶液は、（１００重量部の水に基づいて）

【0025】

０〜５０重量部、好ましくは０〜４０重量部、より好ましくは０〜３０重量部、最も好ましくは０〜２０重量部、または０〜１０重量部、または０〜５重量部、または０〜１重量部の界面活性剤と、

【0026】

０〜５０重量部、好ましくは０〜４０重量部、より好ましくは０〜３０重量部、最も好ましくは０〜２０重量部、または０〜１０重量部、または０〜５重量部、または０〜１重量部の電解質もしくは塩（イオン性界面活性剤以外）と、

【0027】

０〜１００重量部、好ましくは０〜５０重量部、より好ましくは０〜３０重量部、最も好ましくは０〜２０重量部、または０〜１０重量部、または０〜５重量部、または０〜１重量部の酸と、

【0028】

０〜１００重量部、好ましくは０〜５０重量部、より好ましくは０〜３０重量部、最も好ましくは０〜２０重量部、または０〜１０重量部、または０〜５重量部、または０〜１重量部の塩基と、をさらに含み得る。

【0029】

最も好ましくは、界面活性剤、例えば０．１〜５０重量部、好ましくは０．１〜４０重量部、より好ましくは０．１〜３０重量部、最も好ましくは０．１〜２０重量部、または０．１〜１０重量部、または０．１〜５重量部、または０．１〜１重量部の界面活性剤が存在する。

【0030】

好ましいスラリー溶液及び／または充填溶液の組成物の１つは、

【0031】

少なくとも９０重量％の水と、１００重量部の水に基づいて、
０〜１０重量部の有機溶剤と、
０〜１０重量部の界面活性剤（特に０．１〜１０重量部の界面活性剤）と、
０〜１０重量部の電解質または塩と、
０〜１０重量部の酸と、
０〜１０重量部の塩基と、を含む。

【0032】

別の好ましいスラリー溶液及び／または充填溶液の組成物は、

【0033】

少なくとも９５重量％の水と、１００重量部の水に基づいて、
０〜５重量部の有機溶剤と、
０〜５重量部の界面活性剤（特に０．１〜１重量部の界面活性剤）と、
０〜５重量部の電解質または塩と、
０〜５重量部の酸と、
０〜５重量部の塩基と、を含む。

【0034】

この溶剤は有機溶剤であり、種類は特に限定されない。好ましくは、溶剤は、以下の一覧：メタノール、エタノール、イソ−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、ヘキサン、ヘプタン類、シクロヘキサンなどからの１つ以上の溶剤の選択を含む（しかしこれらに限定されない）。

【0035】

添加物は、例えば、酸類、塩基類、界面活性剤類、塩類、またはこれらの物質の任意の組み合わせから選択される任意の１つ以上の添加物であってよい。

【0036】

好ましい酸には、酢酸、ギ酸、メタンスルホン酸、硫酸、リン酸類、硝酸、及びクエン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などが含まれる。

【0037】

好ましい塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、ナトリウム、炭酸カリウムなどが含まれる。

【0038】

好ましい界面活性剤には、異なる分子量を有し得るポリエチレングリコール、デシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、アルキルエトキシレート類、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、塩化セチルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、が含まれる。界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、非イオン性、及び／または両性の界面活性剤であってよい。

【0039】

好ましい塩類には、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、リン酸ナトリウム類及び／またはリン酸カリウム類、硫酸ナトリウム類及び／または硫酸カリウム類、酢酸ナトリウム、ギ酸ナトリウムなどが含まれる。

【0040】

したがって、本発明は水系スラリー溶液及び充填溶液を使用するカラム充填方法を提供することが分かる。スラリー溶液及び充填溶液は、各々独立して、
純水か、
記載されたような添加物を含有する水溶液か、
含水量が混合物の少なくとも５０重量％である、水と溶剤との混合物か、または
含水量が混合物の少なくとも５０重量％であり、記載されたような添加物をさらに含有する、水と溶剤との混合物、であってよい。

【0041】

好ましくは第１の態様と組み合わせられる第２の態様において本発明は、好ましくは、第１の圧力で行われる第１の充填段階（すなわち「第１の充填」）、続いて、第１の圧力よりも高い第２の圧力で行われる第２の充填段階（すなわち「第２の充填」）を含む。このように、本発明は、２段階または少なくとも２段階の充填プロセスを提供する。このプロセスは、図１を参照することにより一実施形態に例示される。圧力下での充填、例えば第１の充填段階の前に、本方法は好ましくは、ＨＰＬＣまたはＵＨＰＬＣカラムなどの空のカラム本体（２）の一端部（４）を、充填リザーバー（６）に、任意選択によりアダプタ（８）を介して取り付けることを含み、このカラムは、媒体をカラム内に保持するように他方の端部上に装着される端部装着具（１０）を（好ましくはフリットなどの媒体支持体と合わせて）有する。本明細書においてこの配置は、充填ステーション、または（このような配置が２つ以上使用される場合）第１の充填ステーションと称される。カラムは、好ましくは、下端部上の端部装着具（１０）、及び上端部（４）に取り付けられた充填リザーバー（６）と実質的に垂直に位置付けられる。好ましくは本方法は、好ましくは本明細書に記載されるスラリーであるが必ずしもそうではない、クロマトグラフィー媒体粒子を含有する調製されたスラリーを、充填リザーバー（６）内に移送すること、続いて、本明細書において「充填溶液」または「後押し用溶液（ｐｕｓｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」と称される溶液、例えばさらなるスラリー溶液（例えば、クロマトグラフィー媒体粒子を実質的に含まない溶液単独）をつぎ足すことをさらに含む。後押し用溶液は、さらなるリザーバー（１２）から充填リザーバー（６）に供給されてもよい。それによって、充填リザーバーからのスラリーがカラム（２）を満たす。あるいは、スラリー移送プロセスを省くために、スラリーを充填リザーバー内で形成してもよい。媒体を含有するスラリー溶液及び充填溶液の両方が、好ましくは水系である、すなわち、少なくとも５０重量％の水、好ましくは前述の量の水及び他の成分を含有する。しかしながら、この２段階または少なくとも２段階の充填プロセスは、溶剤系スラリーのカラム充填にも有益であり得る。

【0042】

その場合本方法は、好ましくは、典型的にはポンプ（１４）の手段によりカラム（２）及びリザーバー（６）内のスラリーに圧力を加えて充填を開始させること（すなわち、第１の充填段階）により進行する。この方法で、スラリー溶液がカラムにポンプで通され、スラリーからの媒体粒子が、カラムの他方の端部（１０）、すなわちスラリーが導入される端部の他方の端部上の、フリットなどの媒体支持体によりカラム内に保持される。圧力は、好ましくは、緩徐から高速への圧力勾配を含む圧力勾配を用いて第１の充填段階において加えられる。媒体粒子を含むスラリーがカラム内に充填されるにつれて、充填溶液がさらなる圧力を粒子に加える。この圧力は、好ましくは、上昇して第１の圧力に到達した後、第１の充填時間にわたって第１の圧力に保たれる。第１の圧力は、好ましくは、１００〜１５００バール、または１００〜１３００バール、より好ましくは１００〜１０００バール、または３００〜１０００バール、または５００〜１０００バールの範囲内である。いくつかの実施形態では、第１の充填圧力は、６００〜９００バール、または７００〜９００バールの範囲内である。第１の充填時間（第１の圧力が加えられる時間）は、好ましくは、０．１〜１００時間、より好ましくは０．２〜５０時間、最も好ましくは０．３〜４８時間の範囲内である。

【0043】

第１の充填段階の後に、特に、より高い第２の充填段階の圧力に充填リザーバーが耐えることができない場合、カラムが充填リザーバーから切り離され、より高い圧力が加えられ得る第２の充填ステーションに移動させられ、カラムが第２の段階のためにポンプ及び後押し用溶液の供給源に直接接続されることが好ましい。第２の充填ステーションに使用されるポンプは、第１の充填段階に使用されるポンプと同じか、または異なっていてもよい。第２の段階のための他の充填ステーションにカラムを移動させる前に、カラムから圧力が解放される。次いで、カラムは、さらなる充填のために他の充填ステーションに移動させられ得る。しかしながら、より高い圧力、例えば第２の充填段階で使用されるＵＨＰＬＣ圧力に充填リザーバーが耐え得る場合、第２の圧力は、第１の段階で、かつ好ましくは圧力を実質的に低下させることなく加えられ得る。

【0044】

本方法は、好ましくは、第２の圧力を加えること（１つのステーション上で充填が行われる場合、好ましくは、第１の圧力から第２の圧力に到達するように上昇させることによる）、及び第２の充填時間にわたって第２の圧力に保つことにより進行する。第２の圧力は、好ましくは、２００〜６０００バール、より好ましくは２００〜５０００バール、または２００〜４０００バール、最も好ましくは５００〜４０００バールまたは５００〜３０００バールの範囲内である。いくつかの実施形態では、第２の圧力は、好ましくは、１５００〜６０００バール、より好ましくは１５００〜５０００バール、または１５００〜４０００バール、最も好ましくは１５００〜４０００バールまたは１５００〜３０００バールの範囲内である。いくつかの実施形態では、第２の充填圧力は、２０００〜４０００バール、または２０００〜３０００バールの範囲内である。第２の充填時間（第２の圧力が加えられる時間）は、好ましくは、０．１〜１００時間、より好ましくは０．２〜５０時間の範囲内である。好ましくは、第２の充填圧力は、使用中のカラムの最大操作圧超である。第２の段階は、ＵＨＰＬＣ条件における繰り返しの使用に対して媒体粒子の充填層を安定化させる際に重要な役割を果たすことが見出された。任意選択により、第３の充填段階などが、好ましくは以前の（第２の）段階よりもなお高い圧力における第３の充填圧力で、第３の充填時間などにわたって行われてもよい。第３の充填圧力は、例えば、３００〜６０００バール、または５００〜５０００バール、または５００〜４０００バールの範囲内であってよい。これらの充填ステップは、同じ充填ステーションまたは異なる充填ステーション上で行われてよい。充填プロセス（第１及び第２の段階）は、室温または周囲温度、最大約８０摂氏度で行われ得る。

【0045】

充填後、カラムに、第１の装着具のそれ他方の端部において第２の端部装着具を（好ましくはフリットなどの媒体支持体と合わせて）装着し、クロマトグラフィー性能を試験することができる。充填されたカラムは、好ましくは、使用前に洗浄に供される。

【0046】

本発明の方法により生産されるＨＰＬＣ及びＵＨＰＬＣカラム製品は、４００〜２０００バールの圧力下で、好ましくは１０００超、または１３００超、または１５００バール超の操作圧で操作され得る。カラム本体は典型的には管状であり、充填され得る典型的なカラムの内径は、１０μｍ〜５ｍｍ、または１００μｍ〜５ｍｍ、または１ｍｍ〜５ｍｍであってよい。充填され得る典型的なカラムの長さは、２０ｍｍ〜１０，０００ｍｍ、または２０ｍｍ〜１，０００ｍｍ、または２０ｍｍ〜５００ｍｍ、または２０ｍｍ〜２００ｍｍ、または５０ｍｍ〜１５０ｍｍであってよい。好ましくは、カラム寸法は、ｘが０．０５〜１０ｍｍであり、ｙが２０〜１０００ｍｍである、任意の組み合わせの内径ｘｍｍ×長さｙｍｍであってよい。カラム本体は、典型的には鋼カラム、通常はステンレス鋼である。

【0047】

クロマトグラフィー媒体は、好ましくは微粒子媒体であり、媒体の粒子は典型的かつ好ましくは実質的に球状であるが、いくつかの実施形態では形状が不規則であってもよい。該粒子は、狭い粒度分布を有するのが好ましい。

【0048】

媒体粒子は、多孔質（全体的に、すなわちバルク多孔質の）粒子、表面的に多孔質の粒子、または非多孔質粒子であってよい。該粒子は、シリカ及び／または金属酸化物であってよい。該粒子は、好ましくは、シリカ、シリカ−有機ハイブリッド、または有機ポリマー粒子のうち任意の１つ以上から選択される。

【0049】

ある特定の実施例では、該粒子は、本質的に「単分散性」または本質的に「均一分散性（ｈｏｍｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）」であり、これは、粒子の過半数（例えば、粒子の８０、９０、または９５％）の粒径が、メジアン粒径（Ｄ₅₀）を下回ってまたはそれを超えて実質的に変動しない（例えば、１０％以上変動しない）ことを示す。例示的な単分散性粒子集団では、粒子の９０％が、約０．９×Ｄ₅₀〜約１．１×Ｄ₅₀の平均粒径を有する。これは、クロマトグラフィー用途に有益である。単分散の粒子が好ましいが、より広い粒径分布を有する粒子は多くの用途で有用であり得る。

【0050】

クロマトグラフィー媒体の粒子は、典型的には、好ましくはメジアン粒径が０．１μｍ以上のミクロ粒子である。より好ましくは、該粒子は、直径０．１〜１００μｍ、もしくは０．１〜５０μｍ、もしくは０．１〜２０μｍ、またはさらにより好ましくは直径０．１〜１０μｍ、もしくは０．１〜５μｍ、もしくは直径０．１〜３μｍ、またはより一層好ましくは直径０．１〜２μｍ、特に０．２〜５μｍ、もしくは０．２〜３μｍ、もしくは０．２〜２μｍ、もしくは０．５〜５μｍ、もしくは０．５〜３μｍ、もしくは０．５〜２μｍ、もしくは１〜５μｍ、もしくは１〜３μｍ、または最も好ましくは直径１〜２μｍである。

【0051】

クロマトグラフィー媒体の粒子は、多孔質粒子（全体的に多孔質、すなわちバルク多孔質、もしくは表面的に多孔質の粒子を含む）、または非多孔質粒子であってよい。

【0052】

クロマトグラフィー媒体として多孔質粒子が使用されるとき、粒子の細孔は任意の大きさであってよい。公称の細孔径は、典型的には、オングストローム（１０^-10ｍ、Å）の単位の直径として測定される。細孔径分布（ＰＳＤ）は、ＢＪＨ（Ｂａｒｒｅｔｔ Ｊｏｙｎｅｒ−Ｈａｌｅｎｄａ）方法を使用して吸着データから計算され、平均細孔径（Ｗ_BJH）は、ＰＳＤの最大値と定義される。一例では、細孔の平均径すなわち直径は、約１〜約５０００Å、特に約５０〜約５０００Åである。別の例では、細孔の平均直径は、約１０〜約５０００Å、約１０〜約４０００Å、約１０〜約３０００Å、約１０〜約２０００Å、約１０〜約１０００Å、約１０〜約８００Å、約１０〜約６００Å、約１０〜約５００Å、約１０〜約４００Å、約１０〜約３００Å、約１０〜約２００Å、約１０〜約１００Å、約２０〜約２０００Å、約２０〜約１０００Å、約２０〜約５００Å、約２０〜約３００Å、約２０〜約２００Å、約２０〜約１００Å、約３０〜約２０００Å、約３０〜約１０００Å、約３０〜約５００Å、約３０〜約３００Å、約３０〜約２００Å、約３０〜約１００Å、約４０〜約２０００Å、約４０〜約１０００Å、約４０〜約５００Å、約４０〜約３００Å、約４０〜約２００Å、約４０〜約１００Å、約５０〜約２０００Å、約５０〜約１０００Å、約５０〜約５００Å、約５０〜約３００Å、約５０〜約２００Å、約５０〜約１００Å、約６０〜約２０００Å、約６０〜約１０００Å、約６０〜約５００Å、約６０〜約３００Å、約６０〜約２００Å、約６０〜約１００Å、約７０〜約２０００Å、約７０〜約１０００Å、約７０〜約５００Å、約７０〜約３００Å、約７０〜約２００Å、約７０〜約１００Å、約８０〜約２０００Å、約８０〜約１０００Å、約８０〜約５００Å、約８０〜約３００Å、約８０〜約２００Å、約１００〜約２００Å、約１００〜約３００Å、約１００〜約４００Å、約１００〜約５００Å、約２００〜約５００Å、または約２００〜約６００Åである。好ましくは、平均細孔径（直径）は、約３０〜約２０００Å、より好ましくは約８０〜約１０００Åである。最も好ましくは、平均細孔径（直径）は、約８０〜約３００Åである。

【0053】

多孔質微粒子クロマトグラフィー媒体の（ＢＥＴ）比表面積は、典型的には約０．１〜約２，０００ｍ²／ｇ、最も典型的には約０．１〜約１，０００ｍ²／ｇである。例えば、微粒子材料の比表面積は、約１〜約１，０００ｍ²／ｇ、約１〜約８００ｍ²／ｇ、約１〜約６００ｍ²／ｇ、約１〜約５００ｍ²／ｇ、約１〜約４００ｍ²／ｇ、約１〜約２００ｍ²／ｇ、または約１〜約１００ｍ²／ｇである。別の例では、材料の比表面積は、約１０〜約１，０００ｍ²／ｇ、約１０〜約８００ｍ²／ｇ、約１０〜約６００ｍ²／ｇ、約１０〜約５００ｍ²／ｇ、約１０〜約４００ｍ²／ｇ、約１０〜約２００ｍ²／ｇ、または約１０〜約１００ｍ²／ｇである。別の例では、材料の比表面積は、約５０〜約１，０００ｍ²／ｇ、約５０〜約８００ｍ²／ｇ、約５０〜約６００ｍ²／ｇ、約５０〜約５００ｍ²／ｇ、約５０〜約４００ｍ²／ｇ、約５０〜約２００ｍ²／ｇ、または約５０〜約１００ｍ²／ｇである。好ましくは、微粒子材料の比表面積は、約１〜約５００ｍ²／ｇ、または約１０〜約５００ｍ²／ｇ（特に約５０〜約５００ｍ²／ｇ）である。別の例では、比表面積はより好ましくは約１０〜約１００ｍ²／ｇである。

【0054】

非多孔質粒子の場合、比表面積は好ましくは約０．５〜１０ｍ²／ｇである。非多孔質粒子の場合、メジアン粒径は、好ましくは、０．１〜５μｍ、好ましくは０．１〜２μｍ、より好ましくは０．１〜２μｍである。

【0055】

本発明のカラム充填方法は、以下のいずれをも含むがこれらに限定されない、異なる種類の微粒子クロマトグラフィー媒体に適用され得る：
逆相媒体（疎水性表面）
ＨＩＬＩＣまたは順相媒体（親水性表面）
イオン交換相媒体（荷電表面）
荷電表面と組み合わさった混合モード相媒体（疎水性（または親水性）。

【0056】

本発明により生産される液体クロマトグラフィーカラムは、好ましくは、高圧及び超高圧における繰り返しの使用に対して高い頑強性を有する。カラム効率（１メートル当たりの理論段数、Ｎ／ｍ）は、好ましくは、カラムに加えられる圧力を２分間０バールと３分間１５００バールとの間で１００回往復させる頑強性試験の後に１０％未満変化する。ピークテーリング係数は、好ましくは、頑強性試験の後に１５％未満変化する（典型的には上昇する）。背圧は、好ましくは、頑強性試験の後に１０％未満変化する（典型的には上昇する）。

【実施例】

【0057】

一般的手順
以降、カラムを充填するための例示的な一般的手順、続いて具体的な実施例を記載する。これらは本発明の範囲に対して非限定的である。

【0058】

好ましくは、全体的に多孔質または表面的に多孔質の微粒子クロマトグラフィー媒体が充填に使用される。

【0059】

ステップ１：０．２μｍまたは０．５μｍのフリットなどのフリットを有するカラム本体と、一端部上の端部装着具とを組み立て、他方の端部を、充填ポンプに接続されているカラム充填リザーバーに接続されたアダプタに取り付ける。このカラムを、カラムの下端部上の端部装着具、ならびに上端部上のアダプタ及びカラム充填リザーバーと垂直に位置付ける。この充填ポンプは、好適には、定圧ポンプまたは定流量ポンプであってよい。この充填ポンプは、水系、または、メタノール、イソ−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、ヘキサン、ヘプタン類、及びその他、ならびにこれらのうち任意の２つ以上の混合物などの有機溶剤系であってよい充填溶液すなわち後押し用溶液を含むボトルまたはリザーバーを備える。しかしながら、本発明の態様に従って、水系の後押し用溶液、例えば、純水；界面活性剤、塩、酸、及び／もしくは塩基などの添加物を含有する水溶液；水と溶剤との混合物（水は少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも９０重量％である）；または、溶剤と、酸、塩基、界面活性剤、及び／もしくは塩などの添加物を含有する水溶液との混合物（水は混合物の少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも９０重量％である）のうちの１つなどを使用することが好ましい。

【0060】

ステップ２：クロマトグラフィー媒体粒子の適量、すなわちカラムを満たすための量を測定する。該粒子は、多孔質、表面的に多孔質、または非多孔質であってよい。該粒子は、純シリカ、有機−シリカハイブリッド、金属酸化物、有機ポリマー系粒子から選択されるべきである。粒径は、０．５〜１０μｍ、好ましくは１〜５μｍ、最も好ましくは１〜２μｍであるべきである。次いで、媒体粒子は、不均一分散のスラリーが得られるまでスラリー溶液中に分散され得る。スラリー溶液は、水系、または、メタノール、イソ−プロパノール、アセトン、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、ヘキサン、ヘプタン類、及びその他、ならびにこれらのうち任意の２つ以上の混合物などの有機溶剤系であってよい。しかしながら、本明細書に記載される態様に従って、水系の後押し用溶液、例えば、純水；界面活性剤、塩、酸、及び／もしくは塩基などの添加物を含有する水溶液；水と溶剤との混合物（この混合物は少なくとも５０重量％水、好ましくは少なくとも９０重量％水である）；または、溶剤と、酸、塩基、界面活性剤、及び／もしくは塩などの添加物を含有する水溶液との混合物（この混合物は少なくとも５０重量％水、好ましくは少なくとも９０重量％水である）のうちの１つなどを使用することが好ましい。

【0061】

ステップ３：ステップ２から得られたスラリーを、充填リザーバーの底部に空のカラムが取り付けられている充填リザーバー内に注ぐ。粒子のスラリーは、この段階で（すなわち、ポンプ圧が加えられる前に）、重力によって空のカラム内に落ちる。次いで、充填リザーバーはキャップで閉じられ得る。

【0062】

ステップ４−第１の充填段階：選択された第１の圧力を加えるように制御された充填ポンプを用い、後押し用溶液を充填リザーバー及びカラム充填物に押し通し、この圧力を、ある特定の期間にわたって、選択された圧力で一定に保つ。十分に充填された層を形成するために、１００〜１５００バールの範囲内で選択された圧力が加えられる。選択された圧力は、急激または緩やかな圧力変化であり得る圧力勾配によって到達され、次いで、到達された選択された圧力を、２０分間〜４８時間（好ましくは２〜２５時間、または５〜１０時間、例えば約１５時間）の範囲内の期間にわたって保つことが続く。

【0063】

ステップ５−第２の充填段階：充填ポンプを用い、より高い第２の圧力を加えて、後押し用溶液を充填リザーバー及びカラム充填物に押し通す。これは、カラム内の充填層をさらに安定化させることが見出された。より高い第２の圧力は、２００〜４０００バールの範囲内であるべきであり、充填圧力をより高い圧力に上昇させること、続いて、この圧力を、２０分間〜４８時間（好ましくは０．５〜２５時間、特に０．５〜５時間、または０．５〜１時間）の範囲内のある特定の期間にわたって、より高い第２の圧力で一定に保つことによって到達される。

【0064】

ステップ６：この圧力を解放し、カラムを係脱し、フリット及び端部装着具をカラムの他方の端部上に置く。

【0065】

ステップ７：充填されたカラムを、洗浄溶剤または溶液で、例えばアセトニトリルで洗浄し、次いで、好ましくは使用及び／または試験前に移動相で洗浄する。

【0066】

以下の実施例では、２種類のクロマトグラフィー媒体をカラム内に充填した。
媒体１：１．５μｍの表面的に多孔質のシリカ系Ｃ１８粒子、及び
媒体２：１．９μｍの全体的に多孔質のシリカ系Ｃ１８粒子。

【0067】

実施例１−水系充填方法を使用して媒体１を１００×２．１ｍｍのカラム内に充填する
０．４５ｇの媒体１粒子を、２０ｍＬのスラリー溶液（重量比により０．５：０．５：９９のドデシル硫酸ナトリウム／エタノール／水）中に懸濁させた。得られたスラリーを、下端部に第１のフリット及び端部装着具が装着された１００×２．１ｍｍのブランクカラムに取り付けられた充填リザーバー内に注いだ。リザーバーキャップを閉じた後、後押し用溶液として水を用いて、圧力を６００〜１０００バールの範囲に上昇させた。この充填圧力を２〜２４時間にわたって同じ圧力（８００バール）に保った後、この充填圧力を１５００〜３０００バールの範囲に上昇させ、０．５〜２４時間にわたって同じ圧力（２４００バール）に保った。この圧力を解放し、第２のフリット及び端部装着具を充填リザーバーの代わりにカラム上で組み立てた。このカラムを、２０カラム体積の１００％のアセトニトリルで洗浄した。カラム性能を試験し、試験結果を図３ａのクロマトグラムａに示す（クロマトグラフィー性能）。カラムを頑強性試験に供する前及び後にもカラム性能を試験し、これを、それぞれ図５のクロマトグラムａ及びｂに示す（頑強性）。

【0068】

実施例２−溶剤系充填方法を使用して媒体１を１００×２．１ｍｍのカラム内に充填する
０．４５ｇの媒体１粒子を、２０ｍＬのスラリー溶液（重量比により１０：９０のメタノール／クロロホルム）中に懸濁させた。得られたスラリーを、下端部に第１のフリット及び端部装着具が装着された１００×２．１ｍｍのブランクカラムに取り付けられた充填リザーバー内に注いだ。リザーバーキャップを閉じた後、後押し用溶液としてメタノールを用いて、圧力を６００〜１０００バールの範囲に上昇させた。この充填圧力を２〜２４時間にわたって同じ圧力（８００バール）に保った後、この充填圧力を１５００〜３０００バールの範囲に上昇させ、０．５〜２４時間にわたって同じ圧力（２４００バール）に保った。この圧力を解放し、第２のフリット及び端部装着具を充填リザーバーの代わりにカラム上で組み立てた。このカラムを、２０カラム体積の１００％のアセトニトリルで洗浄した。次いで、カラム性能を試験し、試験結果を図３のクロマトグラムｂに示す。

【0069】

行ったクロマトグラフィー試験評価（カラム性能試験）及びカラム頑強性試験評価の詳細を以下に提示する。

【0070】

実施例３ ８２０バールで水系充填方法を使用して媒体１を５０×２．１ｍｍのカラム内に充填する
０．２５ｇの媒体１粒子を、２０ｍＬのスラリー溶液（重量比により０．２５：０．２５：９５．５のドデシル硫酸ナトリウム／エタノール／水）中に懸濁させた。得られたスラリーを、５０×２．１ｍｍのブランクカラムに取り付けられた充填リザーバー内に注いだ。リザーバーキャップを閉じた後、後押し用溶液として水を用いて、圧力を６００〜１０００バールの範囲に上昇させた。この充填圧力を２〜２４時間（この実施例では１５時間）にわたって同じ圧力（８２０バール）に保った後、この圧力を開放し、フリット及び端部装着具を充填リザーバーの代わりにカラム上で組み立てた。このカラムを、２０カラム体積の１００％のアセトニトリルで洗浄した。カラムを頑強性試験に供する前及び後にもカラム性能を試験し、これを、それぞれ図４ａのクロマトグラムａ及びｂに示す。

【0071】

実施例４ ２４００バールで水系充填方法を使用して媒体１を５０×２．１ｍｍのカラム内に充填する
０．２５ｇの媒体１粒子を、２０ｍＬのスラリー溶液（重量比により０．２５：０．２５：９９．５のドデシル硫酸ナトリウム／エタノール／水）中に懸濁させた。得られたスラリーを、５０×２．１ｍｍのブランクカラムに取り付けられた充填リザーバー内に注いだ。リザーバーキャップを閉じた後、後押し用溶液として水を用いて、圧力を６００〜１０００バールの範囲に上昇させた。この充填圧力を２〜２４時間（この実施例では１５時間）にわたって同じ圧力（８００バール）に保った後、この充填圧力を１５００〜３０００バールの範囲に上昇させ、０．５〜２４時間（この実施例では１時間）にわたって同じ圧力（２４００バール）に保った。次いで、この圧力を解放し、フリット及び端部装着具をカラム上で組み立てた。このカラムを、２０カラム体積の１００％のアセトニトリルで洗浄した。カラムを頑強性試験に供する前及び後にもカラム性能を試験し、これを、それぞれ図４ｂのクロマトグラムａ及びｂに示す。

【0072】

実施例５−２段階の水系充填方法を使用して２４００バールで媒体２を２００×２．１ｍｍのカラム内に充填する
０．６０ｇの媒体２粒子を、２０ｍＬのスラリー溶液（重量比により０．５：０．２５：９９．２５のドデシル硫酸ナトリウム／エタノール／水）中に懸濁させた。得られたスラリーを、２００×２．１ｍｍのブランクカラムに取り付けられた充填リザーバー内に注いだ。リザーバーキャップを閉じた後、後押し用溶液として水を用いて、圧力を６００〜１０００バールの範囲に上昇させた。この充填圧力を２〜２４時間（１５時間）にわたって同じ圧力に保った後、この充填圧力を１５００〜３０００バールの範囲に上昇させ、０．５〜２４時間（１時間）にわたって同じ圧力に保った。次いで、この圧力を解放し、フリット及び端部装着具をカラム上で組み立てた。このカラムを、２０カラム体積の１００％のアセトニトリルで洗浄した。カラムを頑強性試験に供する前及び後にもカラム性能を試験し、これを、それぞれ図６のクロマトグラムａ及びｂに示す。

【0073】

実施例６−２段階の溶剤系充填方法を使用して２４００バールで媒体２を１５０×２．１ｍｍのカラム内に充填する
０．４２ｇの媒体２粒子を、２０ｍＬのスラリー溶液（重量比により１０：９０のメタノール／クロロホルム）中に懸濁させた。得られたスラリーを、１５０×２．１ｍｍのブランクカラムに取り付けられた充填リザーバー内に注いだ。リザーバーキャップを閉じた後、後押し用溶液としてメタノールを用いて、圧力を６００〜１０００バールの範囲に上昇させた。この充填圧力を２〜２４時間にわたって同じ圧力に保った後、この充填圧力を１５００〜３０００バールの範囲に上昇させ、０．５〜２４時間にわたって同じ圧力に保った。次いで、この圧力を解放し、フリット及び端部装着具をカラム上で組み立てた。このカラムを、２０カラム体積の１００％のアセトニトリルで洗浄した。カラムを頑強性試験に供する前及び後にもカラム性能を試験し、これを、それぞれ図７ａのクロマトグラムａ及びｂに示す。

【0074】

実施例７−２段階の水系充填方法を使用して２４００バールで媒体２（１．９μｍの全体的に多孔質のシリカ系Ｃ１８）粒子を１５０×２．１ｍｍのカラム内に充填する
０．４２ｇの媒体２粒子を、２０ｍＬのスラリー溶液（重量比により０．５：０．２５：９７．２５のドデシル硫酸ナトリウム／エタノール／水）中に懸濁させた。得られたスラリーを、１５０×２．１ｍｍのブランクカラムに取り付けられた充填リザーバー内に注いだ。リザーバーキャップを閉じた後、後押し用溶液として水を用いて、圧力を６００〜１０００バールの範囲に上昇させた。この充填圧力を２〜２４時間にわたって同じ圧力に保った後、この充填圧力を１５００〜３０００バールの範囲に上昇させ、０．５〜２４時間にわたって同じ圧力に保った。次いで、この圧力を解放し、フリット及び端部装着具をカラム上で組み立てた。このカラムを、２０カラム体積の１００％のアセトニトリルで洗浄した。カラムを頑強性試験に供する前及び後にもカラム性能を試験し、これを、それぞれ図７ｂのクロマトグラムａ及びｂに示す。

【0075】

クロマトグラフィー試験評価
カラム性能試験
中性の疎水性プローブ（ｏ−キシレン）を用いて、効率及びピークテーリング係数についてカラム性能を査定した。クロマトグラフィー条件は、以下に提示されるとおりであった。

【0076】

カラム：媒体１（１．５μｍの表面的に多孔質のシリカ系Ｃ１８）
寸法：２．１×５０ｍｍ、２．１×１００ｍｍ、及び２．１×１５０ｍｍ
移動相：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝５０／５０（ｖ／ｖ）
温度：３０℃
流速：０．４０ｍＬ／分
注入体積：１μＬ
検出：ＵＶ（２５４ｎｍ）

【0077】

試料組成：
１．テオフィリン（０．００８ｍｇ／ｍＬ
２．ｏ−ニトロアニリン（０．０２５ｍｇ／ｍＬ）
３．安息香酸メチル（０．１８ｍｇ／ｍＬ）
４．フェネトール（０．３０ｍｇ／ｍＬ）
５．ｏ−キシレン（０．４８ｍｇ／ｍＬ）

【0078】

カラム：媒体２（１．９μｍの全体的に多孔質のシリカ系Ｃ１８）
寸法：２．１×５０ｍｍ、２．１×１００ｍｍ、２．１×１５０−ｍｍ、及び２．１×２００−ｍｍ
移動相：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝５０／５０（ｖ／ｖ）
温度：３０℃
流速：０．５０ｍＬ／分
注入体積：１μＬ
検出：ＵＶ（２５４ｎｍ）

【0079】

試料組成：
１．テオフィリン（０．０３２ｍｇ／ｍＬ
２．ｏ−ニトロアニリン（０．１０ｍｇ／ｍＬ）
３．安息香酸メチル（０．７１ｍｇ／ｍＬ）
４．フェネトール（０１．２ｍｇ／ｍＬ）
５．ｏ−キシレン（１．９２ｍｇ／ｍＬ）

【0080】

それぞれの媒体についてのカラム性能試験の結果を、図３、４ａ、４ｂ、５、６、７ａ、及び７ｂに示す。

【0081】

カラム充填頑強性評価（ＵＨＰＬＣ条件模擬実験）
カラム充填の質を、以下の方法によって査定した。

【0082】

１．新たに充填されたカラム上でカラム性能試験を行った。

【0083】

２．１５００バールの定格圧力のＵＨＰＬＣ機器上で、カラム圧力を、０（２分間保持）と１５００バール（３分間保持）との間で１００回往復させた。図２は、典型的な圧力トレースを示す。

【0084】

３．このカラム性能試験を繰り返した。

【0085】

この頑強性試験の特定条件は次のとおりであった。

【0086】

カラム：媒体１（表面的に多孔質のＣ１８、１．５μｍ）
寸法：２．１×１００ｍｍ
移動相：５０／５０のＡ：Ｂ
Ａ：水
Ｂ：アセトニトリル
温度：３０℃
試料：なし
注入体積：なし
検出：圧力（バール）
流速：３分間１５００バールにおいて各回０．６７５ｍＬ／分、
２分間０バールにおいて０ｍＬ／分
（１００回；図１に示される１０）

【0087】

図２は、媒体１（１．５μｍの表面的に多孔質のシリカ系Ｃ１８）粒子が充填された１００×２．１ｍｍのカラムでのカラム充填頑強性試験に関する典型的な圧力トレースを示す。

【0088】

図３は、実施例１及び２の水系充填方法及び溶剤系充填方法の両方を使用して、２４００バールで媒体１（１．５μｍの表面的に多孔質のシリカ系Ｃ１８）粒子が充填された１００×２．１ｍｍの２つのカラム間のカラム性能比較を示す。水性充填方法が、著しいテーリングが見られる溶剤充填と比較して改善された充填の質を提供することは明らかである。

【0089】

図４ａ及び４ｂは、水系充填方法を使用して、８２０バール（上記の実施例３）及び２４００バール（上記の実施例４）で媒体１（１．５μｍの表面的に多孔質のシリカ系Ｃ１８）粒子が充填された２つの５０×２．１ｍｍのカラムでの頑強性試験の前及び後のカラム性能結果を示す。両方のカラムが良好な性能試験結果を最初は示すが、続く頑強性試験は、より低い圧力での１段階充填には重度のピーク分裂があるのに対して、より高い圧力（２４００バール）での圧密ステップを用いて充填されたカラムが、カラム効率の減少が３％未満である優れたカラム充填の質をもたらすことを明らかにする。

【0090】

図５は、２４００バールで２段階の水系充填方法を使用して、媒体１（１．５μｍの表面的に多孔質のシリカ系Ｃ１８）粒子が充填された１００×２．１ｍｍのカラム（上記の実施例１）での頑強性試験の前及び後のカラム性能結果を示す。長期間にわたり０〜１５００バールの間を変動した後、カラム性能は良好なままである（例えば、効率の減少が１０％未満である）。

【0091】

図６は、２４００バールで２段階の水系充填方法を使用して、媒体２（１．９μｍの多孔質シリカ系Ｃ１８）粒子が充填された２００×２．１ｍｍのカラム（上記の実施例５）での頑強性試験の前及び後のカラム性能結果を示す。長期間にわたり０〜１５００バールの間を変動した後、カラム性能は良好なままである。

【0092】

図７ａ及び７ｂは、２段階の溶剤系充填方法（図７ａのクロマトグラムａ及びｂ）及び水系充填方法（図７ｂのクロマトグラムａ及びｂ）を使用して、２４００バールで媒体２（１．９μｍの多孔質シリカ系Ｃ１８）粒子が充填された１５０×２．１ｍｍの２つのカラム（それぞれ実施例６及び７）での頑強性試験の前及び後のカラム性能結果を示す。両方のカラムが良好な性能試験結果を最初は示すが、続く頑強性試験は、溶剤充填で充填されたカラム（頑強性試験後に３５％の効率損失）と比較して、水性充填方法で充填されたカラムが、カラム効率の減少が４％未満である優れたカラム充填の質をもたらしたことを明らかにした。

【0093】

さらなる実験データを以下の表１に提供する。

【表1】

【0094】

上記の説明から、本発明が以下の番号の条項に従って提供され得ることが分かる。

【0095】

クロマトグラフィーカラムを充填する方法であって、
クロマトグラフィー媒体粒子を水系スラリー溶液中に分散させてスラリーを形成することと、
スラリーをカラムに導入することによってクロマトグラフィーカラムをクロマトグラフィー媒体粒子で満たすことと、
圧力を加えてクロマトグラフィー媒体粒子をクロマトグラフィーカラム内に充填することと、を含む、方法。

【0096】

水系スラリー溶液が、１００重量％水、または少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％、または少なくとも９９重量％水である、条項ｉに記載の方法。

【0097】

水系スラリー溶液が、１００重量部の水に基づいて、１００重量部以下、５０重量部以下、または４０重量部以下、または３０重量部以下、または２０重量部以下、または１０重量部以下、または５重量部以下、または１重量部以下の有機溶剤の量で、有機溶剤を含有する、任意の前項に記載の方法。

【0098】

水系スラリー溶液が、１００重量部の水に基づいて、
０〜５０重量部、または０〜４０重量部、または０〜３０重量部、または０〜２０重量部、または０〜１０重量部、または０〜５重量部、または０〜１重量部の界面活性剤と、
０〜５０重量部、または０〜４０重量部、または０〜３０重量部、または０〜２０重量部、または０〜１０重量部、または０〜５重量部、または０〜１重量部の電解質もしくは塩（イオン性界面活性剤以外）と、
０〜１００重量部、または０〜５０重量部、または０〜３０重量部、または０〜２０重量部、または０〜１０重量部、または０〜５重量部、または０〜１重量部の酸と、
０〜１００重量部、または０〜５０重量部、または０〜３０重量部、または０〜２０重量部、または０〜１０重量部、または０〜５重量部、または０〜１重量部の塩基と、をさらに含む、任意の前項に記載の方法。

【0099】

加圧力が、ある期間にわたって少なくとも５００バール、または少なくとも８００バール、または少なくとも１０００バール、または少なくとも１３００バール、または少なくとも１５００バール、または少なくとも２０００バールの圧力を含む、任意の前項に記載の方法。

【0100】

圧力が、第１の期間にわたって第１の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれ、また、第１の期間の後、第２の期間にわたって第１の圧力よりも高い第２の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれる、任意の前項に記載の方法。

【0101】

第１の圧力が、１００〜１５００バール、または１００〜１３００バール、または１００〜１０００バール、または３００〜１０００バール、または５００〜１０００バールの範囲内であり、第２の圧力が、１５００〜６０００バール、または１５００〜５０００バール、または１５００〜４０００バール、または１５００〜３０００バールの範囲内である、任意の前項に記載の方法。

【0102】

第１の圧力が、１００〜１５００バールの範囲内であり、第２の圧力が、１５００〜４０００バールまたは１５００〜４０００バールの範囲内である、任意の前項に記載の方法。

【0103】

第１の期間が、０．１〜１００時間、または０．２〜５０時間の範囲内であり、第２の期間が、０．１〜１００時間、または０．２〜５０時間の範囲内である、任意の前項に記載の方法。

【0104】

カラムが、１０μｍ〜５ｍｍ、または１００μｍ〜５ｍｍの内径を有し、カラムが、２０ｍｍ〜１０，０００ｍｍ、または２０ｍｍ〜１，０００ｍｍの長さを有する、任意の前項に記載の方法。

【0105】

クロマトグラフィー媒体粒子が、１〜５μｍのメジアン粒径を有し、全体的に多孔質または表面的に多孔質である、任意の前項に記載の方法。

【0106】

クロマトグラフィーカラムを充填する方法であって、
クロマトグラフィー媒体粒子をスラリー溶液中に分散させてスラリーを形成することと、
スラリーをカラムに導入することによってクロマトグラフィーカラムをクロマトグラフィー媒体粒子で満たすことと、
圧力を加えてクロマトグラフィー媒体粒子をクロマトグラフィーカラム内に充填することと、を含み、この圧力が、第１の期間にわたって第１の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれ、また、第１の期間の後、第２の期間にわたって第１の圧力よりも高い第２の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれる、方法。

【0107】

第１の圧力が、１００〜１５００バール、または１００〜１３００バール、または１００〜１０００バール、または３００〜１０００バール、または５００〜１０００バールの範囲内であり、第２の圧力が、１５００〜６０００バール、または１５００〜５０００バール、または１５００〜４０００バール、または１５００〜３０００バールの範囲内である、条項ｘｉｉに記載の方法。

【0108】

第１の圧力が、１００〜１５００バールの範囲内であり、第２の圧力が、１５００〜４０００バールまたは１５００〜３０００バールの範囲内である、条項ｘｉｉ〜ｘｉｉｉのいずれかに記載の方法。

【0109】

第１の期間が０．１〜１００時間の範囲内であり、第２の期間が０．１〜１００時間の範囲内である、条項ｘｉｉ〜ｘｉｖのいずれかに記載の方法。

【0110】

カラムが、１０μｍ〜５ｍｍ、または１００μｍ〜５ｍｍの内径を有し、カラムが、２０ｍｍ〜１０，０００ｍｍ、または２０ｍｍ〜１，０００ｍｍの長さを有する、条項ｘｉｉ〜ｘｖのいずれかに記載の方法。

【0111】

クロマトグラフィー媒体粒子が、１〜５μｍのメジアン粒径を有し、全体的に多孔質または表面的に多孔質である、条項ｘｉｉ〜ｘｖｉのいずれかに記載の方法。

【0112】

少なくとも５００バール、または少なくとも１０００バール、または少なくとも１３００バール、または少なくとも１５００バールの液体圧における操作のための液体クロマトグラフィーカラムであって、クロマトグラフィー媒体粒子が、水系スラリー溶液からカラム内に充填されている、液体クロマトグラフィーカラム。

【0113】

第１の期間にわたって第１の圧力で実質的に一定であり、また、第１の期間の後、第２の期間にわたって第１の圧力よりも高い第２の圧力で実質的に一定であり、かつ実質的に一定に保たれる加圧力下で、クロマトグラフィー媒体粒子が水系スラリー溶液からカラム内に充填されている、条項ｘｖｉｉｉに記載の液体クロマトグラフィーカラム。

【0114】

少なくとも５００バール、または少なくとも１０００バール、または少なくとも１３００バール、または少なくとも１５００バールの液体圧における操作のための液体クロマトグラフィーカラムであって、第１の期間にわたって第１の圧力で実質的に一定であり、また、第１の期間の後、第２の期間にわたって第１の圧力よりも高い第２の圧力で実質的に一定であり、かつ実質的に一定に保たれる加圧力下で、クロマトグラフィー媒体粒子がスラリー溶液からカラム内に充填されている、液体クロマトグラフィーカラム。

【0115】

カラム効率（１メートル当たりの理論段数、Ｎ／ｍ）が、カラムに加えられる圧力が２分間０バールと３分間１５００バールとの間で１００回往復した後に１０％未満変化する、条項ｘｖｉｉｉ〜ｘｘのいずれかに記載の液体クロマトグラフィーカラム。

【0116】

ピークテーリング係数が、カラムに加えられる圧力が２分間０バールと３分間１５００バールとの間で１００回往復した後に１５％未満変化（上昇）する、条項ｘｖｉｉｉ〜ｘｘｉのいずれかに記載の液体クロマトグラフィーカラム。

【0117】

背圧が、カラムに加えられる圧力が２分間０バールと３分間１５００バールとの間で１００回往復した後に１０％未満変化（上昇）する、条項ｘｖｉｉｉ〜ｘｘｉｉのいずれかに記載の液体クロマトグラフィーカラム。

【0118】

特許請求の範囲を含め、本明細書において使用される場合、文脈による別段の指示がない限り、本明細書における用語の単数形は複数形を含むものと見なされるものとし、その逆も同様である。例えば、文脈による別段の指示がない限り、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」などの単数形の言及は、「１つ以上」を意味する。

【0119】

本明細書の説明及び特許請求の範囲の全体にわたり、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という語、ならびにこれらの語の変形、例えば「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、ならびに「など（ｅｔｃ．）」は、「限定されないが含む」ことを意味し、他の成分を除外することを意図しない（かつ除外しない）。

【0120】

本発明の前述の実施形態への変更が、依然として本発明の範囲内にありながら行われ得ることは理解されるであろう。本明細書に開示される各特徴は、別段の記載がない限り、同一、等価、または同様の目的を果たす代替的な特徴と置き換えられてもよい。したがって、別段の記載がない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の等価または同様の特徴の一例に過ぎない。

【0121】

本明細書において提供されるありとあらゆる例、または例示的な言葉（「例えば（ｆｏｒ ｉｎｓｔａｎｃｅ）」、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」、「例えば（ｅ．ｇ．）」及び同様の言葉）は、本発明をより良好に例示することのみを意図するものであり、別段の主張がない限り、本発明の範囲の限定を示すものではない。本明細書中のいかなる言葉も、特許請求されていない任意の要素を、本発明の実践に対して必須であるものとして示すものと解釈されるべきではない。

【0122】

本明細書に記載されるいかなるステップも、別段の記載がない限り、または文脈が別段必要としない限り、任意の順序で、または同時に行われてよい。

【0123】

本明細書に開示される特徴の全ては、かかる特徴及び／またはステップの少なくとも一部が相互排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わされてよい。特に、本発明の好ましい特徴は、本発明の全ての態様に適用可能であり、任意の組み合わせで使用されてよい。同様に、非本質的な組み合わせで記載される特徴は、別々に（組み合わせずに）使用されてよい。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕クロマトグラフィーカラムを充填する方法であって、
クロマトグラフィー媒体粒子を水系スラリー溶液中に分散させてスラリーを形成することと、
前記スラリーを前記カラムに導入することによってクロマトグラフィーカラムを前記クロマトグラフィー媒体粒子で満たすことと、
圧力を加えて前記クロマトグラフィー媒体粒子を前記クロマトグラフィーカラム内に充填することと、を含む、前記方法。
〔２〕前記水系スラリー溶液が、１００重量％水、または少なくとも９０重量％、もしくは少なくとも９５重量％、もしくは少なくとも９９重量％水である、前記〔１〕に記載の前記方法。
〔３〕前記水系スラリー溶液が、１００重量部の水に基づいて、１００重量部以下、５０重量部以下、または４０重量部以下、または３０重量部以下、または２０重量部以下、または１０重量部以下、または５重量部以下、または１重量部以下の有機溶剤の量で、有機溶剤を含有する、前記〔１〕に記載の前記方法。
〔４〕前記水系スラリー溶液が、１００重量部の水に基づいて、
０〜５０重量部の界面活性剤と、
０〜５０重量部の電解質または塩（イオン性界面活性剤以外）と、
０〜１００重量部の酸と、
０〜１００重量部の塩基と、をさらに含む、前記〔１〕に記載の前記方法。
〔５〕前記加圧力が、ある期間にわたって少なくとも５００バールの圧力を含む、前記〔１〕に記載の前記方法。
〔６〕前記圧力が、第１の期間にわたって第１の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれ、また、前記第１の期間の後、第２の期間にわたって前記第１の圧力よりも高い第２の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれる、前記〔１〕に記載の前記方法。
〔７〕前記第１の圧力が１００〜１５００バールの範囲内であり、前記第２の圧力が１５００〜６０００バールの範囲内である、前記〔６〕に記載の前記方法。
〔８〕前記第１の圧力が１００〜１５００バールの範囲内であり、前記第２の圧力が１５００〜４０００バールの範囲内である、前記〔７〕に記載の前記方法。
〔９〕前記第１の期間が０．１〜１００時間の範囲内であり、前記第２の期間が０．１〜１００時間の範囲内である、前記〔６〕に記載の前記方法。
〔１０〕前記カラムが１０μｍ〜５ｍｍの内径を有し、前記カラムが２０ｍｍ〜１０，０００ｍｍの長さを有する、前記〔１〕に記載の前記方法。
〔１１〕前記クロマトグラフィー媒体粒子が、１〜５μｍのメジアン粒径を有し、全体的に多孔質または表面的に多孔質である、前記〔１〕に記載の前記方法。
〔１２〕クロマトグラフィーカラムを充填する方法であって、
クロマトグラフィー媒体粒子をスラリー溶液中に分散させてスラリーを形成することと、
前記スラリーを前記カラムに導入することによってクロマトグラフィーカラムを前記クロマトグラフィー媒体粒子で満たすことと、
圧力を加えて前記クロマトグラフィー媒体粒子を前記クロマトグラフィーカラム内に充填することと、を含み、前記圧力が、第１の期間にわたって第１の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれ、また、前記第１の期間の後、第２の期間にわたって前記第１の圧力よりも高い第２の圧力で加えられ、かつ実質的に一定に保たれる、前記方法。
〔１３〕前記第１の圧力が１００〜１５００バールの範囲内であり、前記第２の圧力が１５００〜６０００バールの範囲内である、前記〔１２〕に記載の前記方法。
〔１４〕前記第１の圧力が１００〜１５００バールの範囲内であり、前記第２の圧力が１５００〜４０００バールの範囲内である、前記〔１３〕に記載の前記方法。
〔１５〕前記第１の期間が０．１〜１００時間の範囲内であり、前記第２の期間が０．１〜１００時間の範囲内である、前記〔１３〕に記載の前記方法。
〔１６〕前記カラムが１０μｍ〜５ｍｍの内径を有し、前記カラムが２０ｍｍ〜１０，０００ｍｍの長さを有する、前記〔１２〕に記載の前記方法。
〔１７〕前記クロマトグラフィー媒体粒子が、１〜５μｍのメジアン粒径を有し、全体的に多孔質または表面的に多孔質である、前記〔１２〕に記載の前記方法。
〔１８〕少なくとも５００バールの液体圧における操作のための液体クロマトグラフィーカラムであって、クロマトグラフィー媒体粒子を含むカラム本体を備え、前記クロマトグラフィー媒体粒子が水系スラリー溶液から前記カラム内に充填されている、前記液体クロマトグラフィーカラム。
〔１９〕第１の期間にわたって第１の圧力で実質的に一定であり、また、前記第１の期間の後、第２の期間にわたって前記第１の圧力よりも高い第２の圧力で実質的に一定であり、かつ実質的に一定に保たれる加圧力下で、クロマトグラフィー媒体粒子が前記水系スラリー溶液から前記カラム内に充填されている、前記〔１８〕に記載の前記液体クロマトグラフィーカラム。
〔２０〕カラム効率（１メートル当たりの理論段数、Ｎ／ｍ）が、前記カラムに加えられる圧力が２分間０バールと３分間１５００バールとの間で１００回往復した後に１０％未満変化する、前記〔１８〕に記載の前記液体クロマトグラフィーカラム。
〔２１〕ピークテーリング係数が、前記カラムに加えられる圧力が２分間０バールと３分間１５００バールとの間で１００回往復した後に１５％未満上昇する、前記〔１８〕に記載の前記液体クロマトグラフィーカラム。
〔２２〕背圧が、前記カラムに加えられる圧力が２分間０バールと３分間１５００バールとの間で１００回往復した後に１０％未満上昇する、前記〔１８〕に記載の前記液体クロマトグラフィーカラム。
〔２３〕少なくとも５００バールの液体圧における操作のための液体クロマトグラフィーカラムであって、第１の期間にわたって第１の圧力で実質的に一定であり、また、前記第１の期間の後、第２の期間にわたって前記第１の圧力よりも高い第２の圧力で実質的に一定であり、かつ実質的に一定に保たれる加圧力下で、クロマトグラフィー媒体粒子がスラリー溶液から前記カラム内に充填されている、前記液体クロマトグラフィーカラム。
〔２４〕前記カラム効率（１メートル当たりの理論段数、Ｎ／ｍ）が、前記カラムに加えられる圧力が２分間０バールと３分間１５００バールとの間で１００回往復した後に１０％未満変化する、前記〔２３〕に記載の前記液体クロマトグラフィーカラム。
〔２５〕前記ピークテーリング係数が、前記カラムに加えられる圧力が２分間０バールと３分間１５００バールとの間で１００回往復した後に１５％未満上昇する、前記〔２３〕に記載の前記液体クロマトグラフィーカラム。
〔２６〕前記背圧が、前記カラムに加えられる圧力が２分間０バールと３分間１５００バールとの間で１００回往復した後に１０％未満上昇する、前記〔２３〕に記載の前記液体クロマトグラフィーカラム。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図5】

【図6】

【図7a】

【図7b】