特許 6348553 ＨＢｓ抗原を検出するための前処理用試薬キットおよびＨＢｓ抗原検出用試薬キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6348553

(24)【登録日】2018年6月8日

(45)【発行日】2018年6月27日

(54)【発明の名称】ＨＢｓ抗原を検出するための前処理用試薬キットおよびＨＢｓ抗原検出用試薬キット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20180618BHJP

   G01N 33/576 20060101ALI20180618BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 501H

   G01N33/576 B

   G01N33/543 501F

【請求項の数】19

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2016-198627(P2016-198627)

(22)【出願日】2016年10月7日

(62)【分割の表示】特願2014-558643(P2014-558643)の分割

【原出願日】2014年1月27日

(65)【公開番号】特開2017-32583(P2017-32583A)

(43)【公開日】2017年2月9日

【審査請求日】2016年10月24日

(31)【優先権主張番号】特願2013-13167(P2013-13167)

(32)【優先日】2013年1月28日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】390014960

【氏名又は名称】シスメックス株式会社

(72)【発明者】

【氏名】山垣内 孝博

(72)【発明者】

【氏名】高馬 卓也

(72)【発明者】

【氏名】丸木 麻里

(72)【発明者】

【氏名】武田 和彦

【審査官】 大瀧 真理

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０３３３６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０８−０５０１３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−１０８９３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−１３３９５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／１１１６２０（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ − ３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

カオトロピック剤を含み、0.024〜0.3 Nの濃度でアルカリ性物質を含有する第１試薬と、
酸性物質を含有する第２試薬と
を含む、HBs抗原を検出するための前処理用試薬キット。

【請求項2】

アルカリ性物質が、強塩基である請求項１に記載の試薬キット。

【請求項3】

強塩基が、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の水酸化物、水素化物およびアミド化物から選択される少なくとも１種である請求項２に記載の試薬キット。

【請求項4】

強塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化マグネシウムから選択される少なくとも１種である請求項２に記載の試薬キット。

【請求項5】

前記第１試薬が、非イオン性界面活性剤をさらに含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の試薬キット。

【請求項6】

前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である請求項５に記載の試薬キット。

【請求項7】

前記ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから選択される少なくとも１種である請求項６に記載の試薬キット。

【請求項8】

前記ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテルである請求項６に記載の試薬キット。

【請求項9】

前記カオトロピック剤が、尿素、グアニジン塩酸塩、サリチル酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素ナトリウム、アセトアミドおよびホルムアミドから選択される少なくとも１種である請求項８に記載の試薬キット。

【請求項10】

前記カオトロピック剤が、尿素である、請求項８に記載の試薬キット。

【請求項11】

前記酸性物質が、クエン酸、酢酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、ギ酸、フマル酸、酒石酸、塩酸および硫酸から選択される少なくとも１種である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の試薬キット。

【請求項12】

前記酸性物質が、クエン酸である、請求項１１に記載の試薬キット。

【請求項13】

前記酸性物質がクエン酸であり、
前記第２試薬中のクエン酸濃度は、0.03〜0.16 Mである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の試薬キット。

【請求項14】

0.024〜0.3 Nの濃度でアルカリ性物質を含有する第１試薬と、
酸性物質を含有する第２試薬と、
HBs抗原と結合する標識抗体を含有する第３試薬と、
担体粒子を含有する第４試薬と、
HBs抗原および該担体粒子と結合する第１抗体を含む第５試薬と、
前記担体粒子とは異なる固相と
を含む、HBs抗原検出用試薬キット。

【請求項15】

アルカリ性物質が、強塩基である請求項１４に記載の試薬キット。

【請求項16】

強塩基が、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の水酸化物、水素化物およびアミド化物から選択される少なくとも１種である請求項１５に記載の試薬キット。

【請求項17】

強塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化マグネシウムから選択される少なくとも１種である請求項１６に記載の試薬キット。

【請求項18】

前記第１試薬が、非イオン性界面活性剤をさらに含む請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の試薬キット。

【請求項19】

前記第１試薬が、カオトロピック剤をさらに含む請求項１４に記載の試薬キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原であるHBs抗原を検出するための試料の前処理方法およびその方法を利用したHBs抗原の検出方法に関する。また、本発明は、HBs抗原を検出するための前処理用試薬キットおよびHBs抗原検出用試薬キットに関する。

【背景技術】

【0002】

Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)により引き起こされる肝臓の疾患である。HBVは、主にエンベロープ部分およびコア部分から構成される球状のウイルスである。エンベロープ部分にはHBs抗原が存在し、コア部分にはゲノムDNA、HBc抗原およびHBe抗原などが存在する。HBVに感染すると、HBs抗原が宿主の血液中に放出され、その量は肝炎の進行に伴って増加する。それゆえ、Ｂ型肝炎の検査では、まず血液中のHBs抗原を測定する。検査の結果、HBs抗原陽性である場合、被験者がHBVに感染していることを示す。反対に、HBs抗原陰性である場合、被験者がHBVに感染していないことを示す。他方で、Ｂ型肝炎の発症後、宿主の体内では、HBs抗原の中和抗体であるHBs抗体が産生されるようになる。Ｂ型肝炎の検査ではHBs抗体も測定することにより、被験者の過去の感染の有無を調べることができる。臨床的には、HBs抗原陰性かつHBs抗体陽性である場合に、Ｂ型肝炎は治癒されたと考えられている。

【0003】

しかしながら、最近の研究によれば、Ｂ型肝炎が治癒しても、HBVの遺伝子の一部が肝臓や末梢単核球に残存していることが明らかとなっている。そして、過去にHBVに感染したことのある悪性腫瘍患者やリウマチ患者に治療のために免疫抑制剤を用いた場合、HBVが再活性化して重症肝炎を引き起こすことが近年知られている。そのような肝炎は「de novo Ｂ型肝炎」と呼ばれ、通常のＢ型肝炎に比べて、劇症化する頻度および死亡率の高いことが明らかとなっている。

【0004】

このようなde novo Ｂ型肝炎の劇症化の予防には、発症の初期に治療を始めることが有効であるとされている。そのためには、ウイルスの再活性化をその初期段階で発見することが重要となる。しかしながら、再活性化の初期段階では、HBVのウイルス量がまだ微量である上に、患者由来のHBs抗体も存在していると考えられる。患者由来のHBs抗体は、HBs抗原と結合して該抗原の検出を妨げる要因であるので、HBVの再活性化の早期発見のためには、非常に高い感度の検査が求められる。

【0005】

HBVの検出感度が高い検査としては、PCR法を利用する検査が知られている。この検査では、HBVのDNAをPCR法で増幅することによってHBVを検出する。しかしながら、一般的には、この検査は、該検査を実施できる機関に検体を送付して行われることが多いので、検査結果を得るまでに時間を要する。また、検査にかかるコストも高い。

【0006】

他方で、免疫学的手法によるHBs抗原の検査は、PCR法による検査に比べて、検査結果を得るまでの時間が短く、またコストも低い。そのような免疫学的手法によるHBs抗原の検出方法として、例えば、特許文献１には、アルカリ剤や界面活性剤などの変性剤を用いて試料を前処理することにより、患者由来のHBs抗体を変性させた後、検出用の所定の抗HBs抗体を用いてHBs抗原を検出する方法が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２００６／０３３３６８号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

免疫学的手法によって試料中のHBs抗原を検出する方法では、被験者由来のHBs抗体がHBs抗原の検出の妨げとなるので、これをあらかじめ不活化する必要がある。例えば、特許文献１に記載の方法では、患者由来のHBs抗体を変性させるために、処理時の濃度として0.25〜１Nの水酸化ナトリウムで効果があることが記載されている。他方で、水酸化ナトリウムはHBs抗原にも作用して変性させるので、該抗原の抗原性が失われて、HBs抗原の検出感度が低下することがある。

【0009】

HBVの再活性化の初期段階のように、HBs抗原が微量である上に、被験者由来のHBs抗体も存在していると考えられる試料から該抗原を検出しなければならない場合には、HBs抗原の抗原性を実質的に損なうことなく、被験者由来のHBs抗体を変性させて不活化し、かつ高い感度でのHBs抗原の検出を可能にする方法が求められる。

【0010】

本発明は、このような事情に鑑みて、HBs抗原の抗原性を実質的に損なうことなく、被験者由来のHBs抗体を変性させて不活化し、かつ高い感度でのHBs抗原の検出を可能にする、試料の前処理方法およびHBs抗原の検出方法を提供することを目的とする。また、本発明は、そのような方法に好適に用いることができる、試料の前処理用試薬キットおよびHBs抗原検出用試薬キットを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、驚くべきことに、HBs抗原と被験者由来のHBs抗体とを含む試料を、終濃度0.012〜0.15 Nという極めて低い濃度のアルカリ性物質で処理することにより、被験者由来のHBs抗体の影響を実質的に受けることなく、HBs抗原を高い感度で検出できることを見出して、本発明を完成した。

【0012】

すなわち、本発明は、
HBs抗原を含む疑いのある試料と、アルカリ性物質を含有する前処理液とを、該アルカリ性物質の終濃度が0.012〜0.15 Nとなるように混合することにより、該試料を処理する工程と、
処理工程で得られた試料を、酸性物質を含有する試薬で中和する工程と
を含む、HBs抗原を検出するための試料の前処理方法に好適に用いることができる、HBs抗原を検出するための前処理用試薬キットおよびHBs抗原検出用試薬キットを提供する。

【0013】

また、本発明は、
カオトロピック剤を含み、0.024〜0.3 Nの濃度でアルカリ性物質を含有する第１試薬と、
酸性物質を含有する第２試薬と
を含む、HBs抗原を検出するための前処理用試薬キットを提供する。

【0014】

さらに、本発明は、0.024〜0.3 Nの濃度でアルカリ性物質を含有する第１試薬と、
酸性物質を含有する第２試薬と、
HBs抗原と結合する標識抗体を含有する第３試薬と、
担体粒子を含有する第４試薬と、
HBs抗原および該担体粒子と結合する第１抗体を含む第５試薬と、
前記担体粒子とは異なる固相と
を含む、HBs抗原検出用試薬キットを提供する。

【発明の効果】

【0015】

上記の本発明の試料の前処理方法および該方法を利用する本発明のHBs抗原の検出方法は、試料に含まれる検出対象のHBs抗原を実質的に変性させることなく、HBs抗原の検出を妨げるHBs抗体を不活化することができる。したがって、これらの本発明の方法によれば、HBs抗原が微量である上に、被験者由来のHBs抗体も存在している試料であっても、HBs抗原を感度よく検出することを可能にする。また、本発明の試料の前処理用試薬キットおよびHBs抗原検出用試薬キットは、そのような方法に好適に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】HBV陽性患者の血清(HBV6290-6)をアルカリ性物質の存在下で前処理し、該血清中のHBs抗原を、標識抗体を用いて検出したときの結果(発光強度)を示すグラフである。

【図2】HBV陽性患者の血清(HBV11048-6)をアルカリ性物質の存在下で前処理し、該血清中のHBs抗原を、標識抗体を用いて検出したときの結果(発光強度)を示すグラフである。

【図3】HBV陽性患者の血清(HBV6272-6)をアルカリ性物質の存在下で前処理し、該血清中のHBs抗原を、標識抗体を用いて検出したときの結果(発光強度)を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本明細書において、「前処理」とは、HBs抗原を含む疑いのある試料を該抗原の検出方法に付す前に、該試料を検出に適した状態になるよう処理することを意図する。また、本発明の試料の前処理方法は、例えば、以下で説明する「処理工程」と「中和工程」を用手法で行ってもよいし、あるいは「処理工程」を用手法で行い、「中和工程」を装置で行ってもよい。

【0018】

本発明の試料の前処理方法(以下、「前処理方法」ともいう)では、まず、HBs抗原を含む疑いのある試料と、アルカリ性物質を含有する前処理液とを、該アルカリ性物質の終濃度が0.012〜0.15 Nとなるように混合することにより、該試料を処理する工程を行う(以下、「処理工程」ともいう)。この処理工程では、前処理液に含まれるアルカリ性物質の作用によって、試料中のHBs抗体は変性されて不活化される。

【0019】

なお、処理工程におけるアルカリ性物質の終濃度は、上記の範囲内であれば特に限定されず、例えば、0.012、0.013、0.014、0.015、0.016、0.017、0.018、0.019、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060、0.070、0.080、0.090、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14および0.15 Nが挙げられる。

【0020】

HBs抗原を含む疑いのある試料は、生体試料または該生体試料から調製された試料であれば特に限定されない。そのような生体試料としては、組織、細胞、体液、分泌物および排泄物などが挙げられる。具体的には、全血、血漿、血清、リンパ液、骨髄液、胆汁、胃腸分泌物、精液、唾液、母乳、尿、糞便などが挙げられる。また、生体試料から調製された試料としては、該生体試料の希釈液、懸濁液、抽出液、ホモジネートが挙げられる。例えば、組織または細胞の抽出液、あるいは、組織または細胞のホモジネートが挙げられる。

【0021】

本発明の実施形態において、前処理液中のアルカリ性物質は、当該技術において公知の強塩基が好ましい。そのような強塩基は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の水酸化物、水素化物およびアミド化物から少なくとも１種を選択することができる。それらの中でも、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化マグネシウムが特に好ましい。

【0022】

前処理液中のアルカリ性物質の濃度は、該前処理液と、上記のHBs抗原を含む疑いのある試料とを混合したときに、該アルカリ性物質の終濃度を0.012〜0.15 Nとすることができる濃度であれば、特に限定されない。したがって、試料が液体である場合は、前処理液中のアルカリ性物質の濃度は、該試料と前処理液との混合比(体積比)に応じて適宜設定できる。例えば、試料と前処理液とを、体積比で表して１：１で混合する場合、該前処理液中のアルカリ性物質の濃度は0.024〜0.3 Nとすればよい。本発明の実施形態においては、液体の形態にある試料と、前処理液との混合比は特に限定されないが、好ましくは、体積比で表して１：１〜１：0.5である。

【0023】

本発明の実施形態においては、アルカリ性物質の作用により不活化されたHBs抗体および／またはその他の夾雑物を除去するために、上記の前処理液は、非イオン性界面活性剤をさらに含むことが好ましい。そのような非イオン性界面活性剤は特に限定されないが、好ましくは公知のポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤から選択される。ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル(Brij(登録商標)35、Brij(登録商標)45など)、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル(Triton (登録商標) X-100、Triton(登録商標) X-114、NP-40(登録商標)など)、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween(登録商標)-20、Tween(登録商標)-80など)などが挙げられ、それらのうちの少なくとも１種を用いることができる。それらの中でも、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが特に好ましい。

【0024】

前処理液中の非イオン性界面活性剤の濃度は特に限定されないが、該前処理液と試料とを混合したときにHBs抗原が実質的に変性しない濃度であることが望ましい。例えば、前処理液がBrij(登録商標)35を含む場合、その濃度は、該前処理液と試料とを混合したときに、Brij(登録商標)35の終濃度を0.05〜0.5％とすることができる濃度であればよい。

【0025】

本発明の実施形態においては、アルカリ性物質の作用により不活化されたHBs抗体および／またはその他の夾雑物を除去するために、上記の前処理液は、カオトロピック剤をさらに含むことが好ましい。ここで、カオトロピック剤とは、タンパク質の分子構造を不安定化する作用を有する物質である。そのようなカオトロピック剤は特に限定されず、例えば、尿素、グアニジン塩酸塩、サリチル酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素ナトリウム、アセトアミド、ホルムアミドなどが挙げられ、それらのうちの少なくとも１種を用いることができる。それらの中でも、尿素が特に好ましい。

【0026】

前処理液中のカオトロピック剤の濃度は特に限定されないが、該前処理液と試料とを混合したときにHBs抗原が実質的に変性しない濃度であることが望ましい。例えば、前処理液が尿素を含む場合、その濃度は、該前処理液と試料とを混合したときに、尿素の終濃度を0.05〜１Mとすることができる濃度であればよい。

【0027】

本発明の実施形態では、上記工程における処理温度および処理時間は、前処理液の組成、試料の種類、前処理液と試料との混合量などの条件に応じて適宜設定できる。通常は、前処理液と試料とを混合した後、混合物を15〜25℃の温度下で５〜10分間静置すればよい。

【0028】

本発明の前処理方法では、上記の処理工程で得られた試料を、酸性物質を含有する試薬で中和する工程を行う(以下、「中和工程」ともいう)。この中和工程では、中和後の試料のpHが6.5〜８となるように、上記の処理工程で得られた試料と、酸性物質を含有する試薬とを混合することが好ましい。

【0029】

本発明の実施形態において、中和工程で用いられる試薬中の酸性物質の種類は、特に限定されない。そのような酸性物質としては、例えば、クエン酸、酢酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、ギ酸、フマル酸、酒石酸、塩酸および硫酸などが挙げられ、それらのうちの少なくとも１種を用いることができる。それらの中でも、クエン酸が特に好ましい。

【0030】

本発明の実施形態において、試薬中の酸性物質の濃度は、上記の処理工程で得られた試料と、酸性物質を含有する試薬とを混合したときに、得られた試料のpHが6.5〜８となる濃度であれば特に限定されない。そのような濃度は、該酸性物質の種類、処理工程で得られた試料の量などに応じて適宜決定できる。例えば、酸性物質としてクエン酸を用いる場合は、試薬中のクエン酸濃度は0.03〜0.16 Mが好ましい。

【0031】

本発明の実施形態では、中和工程における処理温度および処理時間は特に限定されないが、通常は、上記の処理工程で得られた試料と、酸性物質を含有する試薬とを混合した後、混合物を15〜25℃の温度下で１〜10分間静置すればよい。

【0032】

本発明の実施形態においては、前処理方法を、後述するHBs抗原の検出方法に利用する場合、上記の前処理液、または酸性物質を含有する試薬は、還元剤をさらに含むことが好ましい。この還元剤の存在により、後述する回収工程において、担体粒子の凝集を抑制することができる。そのような還元剤は、タンパク質のジスルフィド結合を解離させる作用を有する還元剤が好ましい。例えば、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウム、ホスフィンなどが挙げられる。それらの中でも、メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトールおよびシステイン塩酸塩が特に好ましい。本発明の実施形態において、前処理液、または酸性物質を含有する試薬における還元剤の濃度は、後述する形成工程に影響を及ぼさない濃度であれば特に限定されない。例えば、メルカプトエチルアミンを用いる場合、その濃度は10〜60 mMが好ましい。

【0033】

本発明の実施形態においては、前処理方法を後述するHBs抗原の検出方法に利用する場合、上記の前処理液、または酸性物質を含有する試薬は、無機塩類をさらに含むことが好ましい。この無機塩類の存在により、後述する回収工程において、担体粒子の凝集を抑制することができる。そのような無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウムなどが挙げられる。それらの中でも、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび硫酸ナトリウムが特に好ましい。本発明の実施形態において、前処理液、または酸性物質を含有する試薬における無機塩類の濃度は、後述する形成工程に影響を及ぼさない濃度であれば特に限定されない。例えば、塩化ナトリウムを用いる場合、その濃度は0.1〜１Mが好ましい。

【0034】

本発明の範囲には、上記の本発明の前処理方法を利用するHBs抗原の検出方法も含まれる。HBs抗原の検出方法としては、公知の免疫測定法であれば特に限定されない。本発明の検出方法では、以下で説明する「転移工程」を含む免疫複合体転移測定法が、本発明の前処理方法を用いて高感度にHBs抗原を検出する上で、特に好ましい。以下に、本発明のHBs抗原の検出方法(以下、「検出方法」ともいう)について説明する。

【0035】

本発明の検出方法では、HBs抗原を含む疑いのある試料を本発明の前処理方法によって処理して得られた試料を用いて、後述する各工程を経てHBs抗原を検出する。したがって、本発明の検出方法におけるHBs抗原を含む疑いのある試料の前処理工程、および、それに続く中和工程の具体的な手順などは、本発明の前処理方法についての説明で述べたことと同様である。

【0036】

上記の２つの工程に続いて、本発明の検出方法では、中和工程で得られた試料に、HBs抗原と結合する標識抗体、担体粒子、並びにHBs抗原および該担体粒子と結合する第１抗体を加えて、HBs抗原、該標識抗体および該第１抗体を含む複合体を上記の担体粒子上に形成させる工程を行う(以下、「形成工程」ともいう)。

【0037】

本発明の実施形態において、HBs抗原と結合する標識抗体(以下、単に「標識抗体」ともいう)は、HBs抗原と特異的に結合することができ、且つ免疫学的手法で慣用される公知の標識物質で標識された抗体であれば特に限定されない。そのような標識抗体は、適当な架橋剤や市販のラベリングキットなどを用いる公知の方法により、抗HBs抗体と標識物質とを結合または連結させることによって作製することができる。なお、標識される抗体は、Fab、F(ab')₂などの抗原結合性抗体フラグメントまたはその誘導体であってもよい。

【0038】

本発明の実施形態において、標識物質は、検出または測定可能なシグナルを発することができる物質であれば特に限定されず、例えば、酵素、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)などの蛍光色素、グリーン蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、¹²⁵I、¹⁴C、³²Pなどが挙げられる。それらの中でも、標識物質としては酵素が特に好ましい。

【0039】

本発明の実施形態において、担体粒子は、免疫学的手法で慣用される公知の粒子から選択することができる。そのような担体粒子としては、例えば、磁性粒子、ラテックス粒子、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられる。それらの中でも、磁性粒子が特に好ましい。ここで、磁性粒子とは、磁性を有する材料を基材として含む粒子である。このような磁性粒子は当該技術において公知であり、基材としてFe₂O₃および／またはFe₃O₄、コバルト、ニッケル、フィライト、マグネタイトなどを含む粒子が挙げられる。

【0040】

本発明の実施形態において、HBs抗原および担体粒子と結合する第１抗体(以下、単に「第１抗体」ともいう)は、上記の標識抗体が結合するHBs抗原のエピトープとは異なるエピトープと抗原抗体反応によって特異的に結合し、且つ上記の担体粒子と結合可能な抗体であれば、特に限定されない。ここで、該第１抗体と担体粒子との結合様式は、解離可能な結合であれば特に限定されず、例えば、物理的吸着、イオン結合などが挙げられる。また、第１抗体と担体粒子との間を介在する物質を用いて、両者を結合させることもできる。そのような物質としては、互いに特異的に結合し、且つ解離可能な２つの物質の組み合わせが好ましい(便宜上、２つの物質をそれぞれ「物質Ａ」および「物質Ｂ」という)。例えば、物質Ａを「担体粒子との結合部位」として第１抗体に結合させ、物質Ｂを担体粒子に結合させることにより、物質Ａと物質Ｂとの親和性を利用して、第１抗体と担体粒子とを結合させることができる。そのような物質Ａおよび物質Ｂの組み合わせは当該技術において公知であり、例えば、抗原(HBs抗原を除く)とその抗体、リガンドとその受容体、オリゴヌクレオチドとその相補鎖、ビオチン(またはデスチオビオチン)とアビジン(またはストレプトアビジン)、ニッケルとヒスチジンタグ、グルタチオンとグルタチオン-S-トランスフェラーゼといった組み合わせが挙げられる。なお、抗原とその抗体の組み合わせとしては、ハプテンと抗ハプテン抗体、および、ビオチン(またはデスチオビオチン)と抗ビオチン抗体(また抗デスチオビオチン抗体)が好ましい。また、ハプテンと抗ハプテン抗体の組み合わせとしては、2, 4-ジニトロフェノール(DNP)と抗DNP抗体が特に好ましい。

【0041】

本発明の実施形態においては、上記の物質Ａおよび物質Ｂのうち、どちらを第１抗体または担体粒子に結合させるかは特に限定されないが、抗原とその抗体の組み合わせを用いる場合は、該抗原を第１抗体に結合させ、該抗原に対する抗体を担体粒子に結合させることが好ましい。なお、上記の物質を抗体および担体粒子に結合させる方法は、当該技術において公知である。例えば、抗体とビオチンとを結合させる場合は、該抗体中のアミノ基またはチオール基と反応する架橋剤(例えば、マレイミド、N-ヒドロキシスクシンイミドなど)を用いる方法が知られている。また、上記の物質と担体粒子とを結合させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法などが知られている。

【0042】

本発明の好ましい実施形態においては、担体粒子として、第１抗体と結合する第２抗体を固定した担体粒子を用いることにより、第２抗体を介して第１抗体と担体粒子とを結合させる。ここで、第１抗体と第２抗体との結合様式は、解離可能な結合であることが望ましい。例えば、ハプテン(例えば、DNPなど)またはビオチン(もしくはデスチオビオチン)を結合させた第１抗体と、該ハプテンまたはビオチン(もしくはデスチオビオチン)と特異的に結合する第２抗体を固定した担体粒子を用いることが好ましい。この場合では、ハプテンまたはビオチン(もしくはデスチオビオチン)と特異的に結合する抗体を、第１抗体に結合する第２抗体として用いている。特に好ましい実施形態においては、DNPを結合させた第１抗体と、抗DNP抗体を固定した担体粒子を用いる。

【0043】

この形成工程では、HBs抗原と上記の標識抗体とが抗原抗体反応により結合して、ここに上記の第１抗体が抗原抗体反応によって、さらに結合することで、「標識抗体−HBs抗原−第１抗体」を含む複合体が形成される。そして、該複合体に含まれる第１抗体と、担体粒子とが結合することにより、該担体粒子上に「標識抗体−HBs抗原−第１抗体」を含む複合体が形成される。本発明の好ましい実施形態では、担体粒子として、第１抗体と結合する第２抗体を固定した担体粒子を用いることにより、該担体粒子上に「標識抗体−HBs抗原−第１抗体−第２抗体」を含む複合体が形成される。

【0044】

本発明の実施形態においては、標識抗体、担体粒子および第１抗体の添加量は特に限定されず、試料の量などに応じて適宜決定できる。また、標識抗体、第１抗体および担体粒子をそれぞれ順番に試料に添加してもよいし、全てを同時に添加してもよい。ここで、標識抗体、第１抗体および担体粒子をそれぞれ順番に試料に添加する場合、標識抗体および第１抗体はいずれを先に添加してもよいが、担体粒子はこれらの抗体の後に添加することが好ましい。あるいは、第１抗体と担体粒子とは、形成工程を行う前にあらかじめ結合させていてもよい。

【0045】

本発明の実施形態では、形成工程における反応温度および反応時間は特に限定されないが、通常は、20〜45℃の温度下で15〜30分間静置するか、または穏やかに撹拌すればよい。なお、標識抗体、第１抗体および担体粒子をそれぞれ順番に試料に添加する場合、各剤を添加するたびに反応時間を設定してもよい。

【0046】

本発明の検出方法では、上記の形成工程で得られた試料中の担体粒子を選択的に回収する工程を行う(以下、「回収工程」ともいう)。該試料中には、上記の複合体を形成させた担体粒子の他に、前処理液の構成成分、余剰の標識抗体および第１抗体などの夾雑物が存在するが、この回収工程では、該担体粒子はそのような夾雑物から分離して回収される。したがって、この回収工程により、後述する測定工程に悪影響を及ぼす夾雑物を除くことができる。

【0047】

試料中の担体粒子を選択的に回収する方法自体は当該技術において公知であり、用いた担体粒子の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、磁性粒子を用いた場合、磁気分離により、試料中の担体粒子を選択的に回収することができる。具体的には、形成工程で得られた試料が入った容器の壁面に磁石を近づけて、試料中の磁性粒子を容器の壁面に固定させ、液相を吸引除去することにより、該粒子を選択的に回収することができる。また、ゼラチン粒子またはラテックス粒子を用いた場合、遠心分離によって該粒子を沈殿させた後、液相を吸引除去することにより選択的に回収することができる。

【0048】

本発明の実施形態においては、回収工程は、回収した担体粒子を洗浄する工程をさらに含むことができる。担体粒子の洗浄は、例えば、回収した担体粒子に洗浄液を添加して懸濁した後、該担体粒子を、上記のようにして洗浄液から選択的に回収することにより行うことができる。洗浄液としては、担体粒子上に形成された複合体を損なわない緩衝液が好ましい。そのような洗浄液としては、界面活性剤を含む緩衝液が特に好ましく、例えば、TBS-T(0.05％ Tween20含有Tris緩衝生理食塩水)およびPBST(0.05％ Tween20含有リン酸緩衝生理食塩水)などが挙げられる。また、HISCL洗浄液(シスメックス株式会社製)などの市販の洗浄液を用いることもできる。

【0049】

本発明の検出方法では、上記の回収工程で得られた担体粒子上の複合体を遊離させて、該担体粒子とは異なる固相に転移させる工程を行う(以下、「転移工程」ともいう)。ここで、担体粒子上の複合体を遊離させる方法自体は、当該技術において公知である。例えば、形成工程で得られた複合体中の第１抗体と、担体粒子との結合を解離させることができる物質を遊離剤として用いる方法が挙げられる。そのような遊離剤は当該技術において公知であり、第１抗体と担体粒子との結合様式に応じて適宜選択することができる。例えば、複合体中の第１抗体と、担体粒子とが物理的吸着により結合している場合は、遊離剤として、界面活性剤を含む溶液を用いることで、該複合体を遊離させることができる。また、イオン結合の場合は、イオンを含む溶液を用いることで該複合体を遊離させることができる。

【0050】

第１抗体と担体粒子とが、上記の物質Ａと物質Ｂとの親和性を利用して結合している場合にも、該物質Ａと物質Ｂとの結合を解離させることができる物質を遊離剤として用いることにより、複合体を遊離させることができる。そのような遊離剤も当該技術において公知であり、物質Ａと物質Ｂとの組み合わせに応じて適宜選択することができる。例えば、ハプテンと抗ハプテン抗体の結合の場合は、遊離剤として該ハプテンまたはその誘導体を用いることができる。また、ビオチン(またはデスチオビオチン)とアビジン(またはストレプトアビジン)との結合の場合は、遊離剤としてビオチンを用いることができる。

【0051】

上記の形成工程において得られた複合体が、第１抗体と第２抗体との結合を介して担体粒子に結合している場合は、遊離剤として、第２抗体が特異的に認識する抗原を用いることにより、該複合体を遊離させることができる。

【0052】

遊離剤を用いて複合体を遊離させる場合、処理温度および処理時間は特に限定されないが、通常は、20〜45℃の温度下で３〜８分間静置するか、または穏やかに撹拌すればよい。

【0053】

転移工程では、上記のようにして担体粒子から遊離させた複合体を、担体粒子とは異なる固相と接触させて結合させることにより、該複合体を該固相に転移させる。ここで、本明細書において、「担体粒子とは異なる固相」とは、上記の形成工程にて添加されたときから存在する担体粒子とは別の固相を意味する(以下、単に「固相」ともいう)。すなわち、この転移工程では、遊離した複合体が、形成工程にて添加されたときから存在する担体粒子に再び結合することを意図していない。したがって、本発明の実施形態においては、担体粒子から遊離させた複合体を回収して、新たに用意した固相と接触させることが好ましい。例えば、担体粒子から複合体を遊離させた後、上記の回収工程と同様にして該担体粒子を容器の壁面または底部に固定させる。そして、該複合体を含む液相を回収して、これを上記の固相と接触させることができる。

【0054】

本発明の実施形態において、担体粒子とは異なる固相は、上記の複合体と結合可能な固相であれば特に限定されず、免疫学的手法で慣用される公知の固相から選択することができる。そのような固相の材料としては、例えば、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)、シリコーン、アガロース、ゼラチン、赤血球、シリカゲル、ガラス、不活性アルミナ、磁性体などが挙げられる。また、これらの１種または２種以上を組み合わせてもよい。固相の形状としては、例えば、マイクロタイタープレート、試験管、粒子などが挙げられ、それらの中でも粒子が特に好ましい。

【0055】

本発明の実施形態において、固相と複合体との結合様式は特に限定されないが、複合体中の第１抗体と固相との間を介在する物質を用いて両者を結合させることが好ましい。そのような物質としては、上記の物質Ａおよび物質Ｂの組み合わせが挙げられる。例えば、物質Ａを「固相との結合部位」としてあらかじめ第１抗体に結合させておき、物質Ｂを固相に結合させることにより、物質Ａと物質Ｂとの親和性を利用して、複合体中の第１抗体と固相とを結合させることができる。そのような物質Ａおよび物質Ｂの組み合わせとしては、ビオチン(またはデスチオビオチン)とアビジン(またはストレプトアビジン)が好ましい。なお、第１抗体と固相との結合のための物質Ａおよび物質Ｂの組み合わせは、該第１抗体と担体粒子との結合のための組み合わせとは異なっていることが好ましい。例えば、DNPおよびビオチンを結合させた第１抗体と、抗DNP抗体を固定した担体粒子と、抗ビオチン抗体を固定した固相とを用いることが挙げられる。

【0056】

複合体を固相に転移させるための処理温度および処理時間は特に限定されないが、通常は、20〜45℃の温度下で１〜30分間静置するか、または穏やかに撹拌すればよい。特に、固相の形状が粒子である場合、１〜５分間静置するか、または穏やかに撹拌すればよい。

【0057】

本発明の検出方法では、上記の転移工程で得られた固相上の複合体に含まれる標識抗体の標識を測定する工程を行う(以下、「測定工程」ともいう)。ここで、標識抗体の標識を測定する方法自体は当該技術において公知である。本発明の実施形態においては、上記の標識抗体に用いた標識物質に由来するシグナルの種類に応じた適切な測定方法を選択することができる。例えば、該標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。そのような測定装置としては、分光光度計、ルミノメータなどが挙げられる。

【0058】

なお、酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択することができる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質としては、CDP-Star(登録商標)(4-クロロ-3-(メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2'-(5'-クロロ)トリクシロ[3. 3. 1. 1^{3, 7}]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)、CSPD(登録商標)(3-(4-メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 1^{3, 7}]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)などの化学発光基質；p-ニトロフェニルホスフェート、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、4-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド(NBT)、ヨードニトロテトラゾリウム(INT)などの発光基質；4-メチルウムベリフェニル・ホスフェート(4MUP)などの蛍光基質；5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、5-ブロモ-6-クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、p-ニトロフェニルリンなどの発色基質が挙げられる。

【0059】

標識物質が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定することができる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダなどの公知の装置を用いて測定することができる。

【0060】

本発明の検出方法では、上記の測定工程で得られた結果に基づいて、上記の試料中のHBs抗原を検出する工程を行う(以下、「検出工程」ともいう)。具体的には、測定工程において、複合体中の標識抗体に由来する標識が測定された場合に、被験者から得た試料においてHBs抗原が検出されたこととなる。反対に、該標識が測定されなかった場合に、被験者から得た試料においてHBs抗原が検出されなかったこととなる。本発明の実施形態においては、陰性対照および陽性対照として、それぞれHBs抗原を含まない試料(例えば、健常者から得た生体試料)、および、HBs抗原を含む試料(例えば、Ｂ型肝炎患者から得た生体試料)を用いることが好ましい。

【0061】

本発明の実施形態においては、測定工程で得られた測定値と、予め設定した閾値とを比較して、被験者から得た試料中のHBs抗原を検出してもよい。すなわち、測定値が閾値と同じかまたは閾値よりも大きい場合、被験者から得た試料においてHBs抗原が検出されたこととなる。反対に、測定値が閾値よりも小さい場合、被験者から得た試料においてHBs抗原が検出されなかったこととなる。なお、閾値は次のようにして設定することができる。まず、HBs抗原を含まない試料およびHBs抗原を含む試料を用いて、本発明の検出方法の測定工程までの手順にしたがって、それぞれの測定値を取得する。なお、各試料はそれぞれ複数検体あることが好ましい。そして、HBs抗原を含む試料の群と、HBs抗原を含まない試料の群とを区別可能な値を閾値として設定することができる。そのような閾値としては、例えば、HBs抗原を含む試料の群と、HBs抗原を含まない試料の群とを二等分できる中央値が挙げられる。

【0062】

本発明の範囲には、本発明の前処理方法および検出方法に好適に用いることができる、前処理用試薬キットも含まれる。以下に、本発明のHBs抗原を検出するための前処理用試薬キット(以下、「試薬キット」ともいう)について説明する。

【0063】

本発明の試薬キットは、アルカリ性物質を含有する第１試薬と、酸性物質を含有する第２試薬とを含む。ここで、本発明の試薬キットの第１試薬および第２試薬は、それぞれ、本発明の前処理方法で用いられる「アルカリ性物質を含有する前処理液」および「酸性物質を含有する試薬」に相当する試薬である。したがって、本発明の試薬キットの第１試薬および第２試薬の組成および使用方法などは、本発明の前処理方法で用いられる前処理液、および酸性物質を含有する試薬についての説明で述べたことと同様である。

【0064】

本発明の別の実施形態においては、上記の前処理用試薬キットと、HBs抗原の検出に用いられる試薬などとを組み合わせて、HBs抗原検出用試薬キットとすることができる。すなわち、本発明のHBs抗原検出用試薬キットは、
アルカリ性物質を含有する第１試薬と、
酸性物質を含有する第２試薬と、
HBs抗原と結合する標識抗体を含有する第３試薬と、
担体粒子を含有する第４試薬と、
HBs抗原および該担体粒子と結合する第１抗体を含む第５試薬と、
該担体粒子とは異なる固相と
を含む。

【0065】

上記の第３試薬に含まれる「HBs抗原と結合する標識抗体」、第４試薬に含まれる「担体粒子」、第５試薬に含まれる「HBs抗原および担体粒子と結合する第１抗体」および「担体粒子とは異なる固相」は、それぞれ、本発明の検出方法に用いられる標識抗体、第１抗体、担体粒子および固相に相当する。したがって、本発明のHBs検出用試薬キットの標識抗体、第１抗体、担体粒子および固相の種類、構造、使用方法などについては、本発明の検出方法についての説明で述べたことと同様である。

【0066】

本発明の実施形態においては、第３試薬、第４試薬および第５試薬は、適当な緩衝液をさらに含んでいてもよい。そのような緩衝液はpH6.5〜８にて緩衝作用を有する緩衝液であれば特に限定されず、例えばリン酸緩衝液(PBS)、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液(TEA)、グッド緩衝液などが挙げられる。グッド緩衝液としては、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、HEPES、HEPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPSなどの緩衝液が挙げられる。また、本発明の実施形態においては、緩衝液は、必要に応じて、タンパク質安定化剤(BSAなど)、防腐剤(アジ化ナトリウム、フェニルメタンスルホニルフルオリドなど)、無機塩類(塩化マグネシウム、塩化亜鉛など)といった公知の添加物を含んでいてもよい。

【0067】

以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0068】

実施例１ セロコンバージョンパネルを用いた前処理効果の検討
１．材料
(１)試料
HBV陽性患者から得たセロコンバージョンパネル(PHM935B：Boston Biomedica, Inc.)を試料として用いた。このセロコンバージョンパネルは、１人のHBV陽性患者から定期的に採取した血清であり、各血清に含まれるHBs抗体の濃度は既知である。本実施例では、各試料を血清番号27〜32により識別する。血清番号30〜32の試料は、HBs抗体濃度が増加しており、セロコンバージョンしたと考えられる血清である。なお、陽性対照としてHISCL HBsAg キャリブレータ(HBs抗原濃度0.025 IU/mL：シスメックス株式会社)、および陰性対照として健常人血清(国際バイオ株式会社)を用いた。

【0069】

(２)前処理液(第１試薬)
水酸化ナトリウム(ナカライテスク株式会社)を0.3 N、Brij(登録商標)35(和光純薬工業株式会社)を0.4％、および尿素(キシダ化学株式会社)を1.2 Mの濃度で含む水溶液を、前処理液として用いた。
(３)酸性物質を含む試薬(第２試薬)
クエン酸(キシダ化学株式会社)を0.11 M、NaCl(マナック株式会社)およびメルカプトエチルアミン(ナカライテスク株式会社)を20 mMの濃度で含む水溶液を、酸性物質を含む試薬として用いた。

【0070】

(４)標識抗体試薬(第３試薬)
標識抗体として、アルカリフォスファターゼ(ALP)で標識された抗HBs抗体フラグメントを２種類用いた(以下、それぞれ「ALP標識HBs85Fab'」および「ALP標識HBs149Fab'」という)。ここで、ALP標識HBs149Fab'は、受託番号FERM BP-10583で、2006年3月27日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(郵便番号２９２−０８１８、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室)に受託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体から作製した。ALP標識HBs85Fab'は、受託番号NITE BP-1483で、2012年12月13日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(郵便番号２９２−０８１８、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室)に受託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体から作製した。具体的な標識抗体試薬の作製手順は、次のとおりである。各モノクローナル抗体をペプシン消化および還元して、Fab'フラグメントを得た。また、ALP(オリエンタル酵母株式会社)をEMCS(N-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド)(株式会社同仁化学研究所)を用いてマレイミド化した。そして、該フラグメントと、マレイミド化したALPとを混合して反応させることで、標識抗体を得た。得られた標識抗体を、希釈液(0.1 M MES (pH6.5)、0.15 M NaCl、1.0％ BSA、0.1％ NaN₃、10 mM MgCl₂、１mM ZnCl₂)で希釈した。各標識抗体の希釈液を１：１で混合して、標識抗体試薬(ALP濃度0.4 U/mL)を調製した。

【0071】

(５)担体粒子試薬(第４試薬)
磁性粒子(Micromer M：Micromod社製)に、第２抗体としての抗DNP抗体(DNP-1753)を固定化させて、担体粒子を得た。得られた担体粒子を希釈液(0.1 M MES (pH6.5)、0.15 M NaCl、0.25％ BSA、0.1％ NaN₃)で希釈して、担体粒子試薬(粒子濃度0.5％)を調製した（以下、「磁性粒子試薬」とも呼ぶ）。ここで、磁性粒子への抗体の固定化は、Sulfo-SMCC(ピアス社)を用いて行った。なお、上記のDNP-1753抗体は、受託番号NITE P-845で、2009年11月25日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体である。

【0072】

(６)第１抗体試薬(第５試薬)
第１抗体として、ビオチンおよびDNPで修飾された抗HBs抗体を２種類用いた(以下、それぞれ「Biotin／DNP標識HBs1053」および「Biotin／DNP標識HBs628」という)。ここで、Biotin／DNP標識HBs1053は、受託番号FERM BP-10582で、2006年3月27日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センターに受託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体から作製した。Biotin／DNP標識HBs628は、受託番号NITE BP-1484で、2012年12月13日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体から作製した。具体的な標識抗体試薬の作製手順は、次のとおりである。ビオチン化試薬(EZ-Link(登録商標)Sulfo-NHS-LC-Biotin Reagents：ピアス社)をBSA(Proliant社)に添加して、次いでDNP標識試薬(DNP-X acid SE：ABD Bioquest社)を添加することで、ビオチンおよびDNPで修飾されたBSA(Biotin／DNP標識BSA)を調製した。Biotin/DNP標識BSAを、EMCS(同仁化学)を用いてマレイミド化した。そして、上記の各モノクローナル抗体と、マレイミド化したBiotin/DNP標識BSAとを混合して反応させることで、第１抗体を得た。得られた第１抗体を、希釈液(0.1 M MES (pH6.5)、0.15 M NaCl、1.0％ BSA、0.1％ NaN₃)で希釈した。各抗体の希釈液を１：１で混合して、第１抗体試薬(各抗体濃度0.5μg/mL)を調製した。

【0073】

(７)遊離剤
第１抗体に結合したDNPと、第２抗体との結合を解離するための遊離剤として、DNP-Lys溶液を用いた。このDNP-Lys溶液は、N-(2, 4-ジニトロフェニル)-L-リジン(東京化成工業株式会社)を、終濃度５mMとなるように希釈液(0.1 M MES (pH6.5)、0.25％ BSA、0.1％ NaN₃)で希釈して調製した。
(８)固相
上記の担体粒子とは異なる固相として、ストレプトアビジン固定化マイクロプレート(Nunc社)を用いた。

【0074】

２．試料の前処理
(１)処理工程
試料(60μL)と前処理液(50μL)とを混合して、室温にて７分間インキュベーションすることにより、該試料を、終濃度約0.136 Nの水酸化ナトリウムの存在下で処理した。
(２)中和工程
上記の処理工程で得られた試料と、酸性物質を含む試薬(50μL)とを混合して、室温にて８分間インキュベーションすることにより、該試料を中和した。なお、中和後の試料のpHをpH試験紙(Whatman社)により調べ、pHが７〜7.5であることを確認した。
(３)比較用試料の調製
前処理の効果を検討するために、上記の処理工程および中和工程に付さない比較用試料を調製した。すなわち、上記の各試料(60μL)とHISCL検体希釈液(シスメックス株式会社)(100μL)とを混合して、比較用試料を得た。

【0075】

３．HBs抗原の検出
(１)形成工程
中和工程で得られた試料(160μL)と、標識抗体試薬(100μL)とを、反応キュベット(HISCL用反応キュベット：シスメックス株式会社製)内で混合し、42℃で８分間インキュベーションした。この反応キュベットに、第１抗体試薬(100μL)を添加し、42℃で８分間インキュベーションした。さらに、この反応キュベットに、磁性粒子試薬(50μL)を添加し、42℃で10分間インキュベーションして、形成工程を行った。また、上記の前処理工程を行わなかった比較用試料についても、同様の操作を行った。
(２)回収工程
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットに、集磁装置(MINITUBE MAG SEPARATOR：SPHERO TECH社製)を用いて磁気分離を行い、該キュベット内の上清を除去することにより、担体粒子を回収した。この反応キュベットに洗浄液(350μL)(HISCL洗浄液：シスメックス株式会社)を添加し、再び磁気分離を行って担体粒子を洗浄した。同様の洗浄操作を２回繰り返して、担体粒子を回収した。

【0076】

(３)転移工程
回収工程で得られた試料を含む反応キュベットに、遊離剤(40μL)を添加し、42℃で５分間インキュベーションした。次に、上記の集磁装置を用いて磁気分離を行い、上清を回収して固相に移した。該固相を室温で20分間インキュベーションすることにより、転移工程を実施した。そして、固相から上清を除去し、HISCL洗浄液(300μL)を添加し、再び上清を除去することにより洗浄を行った。同様の洗浄操作を５回繰り返した。
(４)測定工程
転移工程で得られた固相に、HISCL R4試薬(17.5μL)とHISCL R5試薬(17.5μL)(シスメックス株式会社)を添加し、42℃で5分間インキュベートした。そして、OPTIMA (BMG LABTECH社)を用いて、発光強度(counts)の測定(３sec at gain 3960)を行った。測定結果を、以下の表１に示す。

【0077】

【表1】

【0078】

(５)検出工程
陽性対照および陰性対照についての測定結果より、本発明のHBs抗原の検出方法では試料中のHBs抗原を検出できることがわかる。被験者に由来するHBs抗体の濃度が低い血清番号27〜29の試料については、本発明の前処理方法を行わなくても、HBs抗原を検出することができた。しかしながら、HBs抗体の濃度が増加している血清番号27〜29の試料については、本発明の前処理方法を行ったときの発光強度は、行わなかったときの発光強度の約２倍となっていた。したがって、本発明の前処理方法により、被験者に由来するHBs抗体の影響を排除して、HBs抗原を検出することが可能となる。

【0079】

参考例１ HBs抗原の検出方法の感度の検討
１．試料
HBV陽性患者から得た血清(HBV6292-11：Zepto Metrix社)を段階的に希釈して血清希釈液を作製し、これらを試料として用いた。各試料に含まれるHBs抗原の濃度は既知である。本実施例では、これらを試料番号７〜12により識別する。なお、陽性対照としてHISCL HBsAgキャリブレータ(HBs抗原濃度0.025 IU/mL：シスメックス株式会社)、および陰性対照として健常人血清(国際バイオ株式会社)を用いた。

【0080】

２．検出感度の検討
試料として上記の血清希釈液を用いたこと以外は、実施例１と同様に前処理および検出の手順を行って、該試料についてHBs抗原を検出した。結果を以下の表２に示す。なお、表中の「S／N比」は、以下の式により算出される値である。
(S／N比)＝｛(試料の発光強度)−(陰性対照の発光強度)｝／(陰性対照の発光強度)

【0081】

【表2】

【0082】

表２より、本発明のHBs検出方法では、HBs抗原濃度が0.00046 IU/mLというHBs抗原が微量の試料であっても、HBs抗原を検出できることがわかった。ここで、従来のHBs抗原検出用試薬を用いた方法では、HBs抗原濃度0.05 IU/mLが最小検出感度であるとされている。したがって、本発明のHBs抗原の検出方法は、従来試薬を用いた方法よりも、検出感度が約100倍高い方法であることが示唆された。

【0083】

参考例２ 前処理液によるHBs抗原への影響の検討
１．材料
(１)試料
HISCL HBsAg キャリブレータ(シスメックス株式会社)を試料として用いた。該試料に含まれるHBs抗原の濃度は既知である。なお、陰性対照として健常人血清(国際バイオ株式会社)を用いた。
(２)前処理液
実施例１で用いた前処理液と比較するために、各成分の濃度を増加させた比較用前処理液を調製した。すなわち、水酸化ナトリウム(ナカライテスク株式会社)を0.5 N、Brij(登録商標)35(和光純薬工業株式会社)を４％、および尿素(キシダ化学株式会社)を６Mの濃度で含む水溶液を、比較用前処理液として用いた。

【0084】

２．HBs抗原への影響の検討
試料として上記の血清を用いたこと、および、前処理液として実施例１の前処理液または上記の比較用前処理液を用いたこと以外は、実施例１と同様に前処理および検出の手順を行って、該試料についてHBs抗原を検出した。すなわち、試料の前処理の処理工程において、試料を終濃度0.136 Nまたは0.227Nの水酸化ナトリウムの存在下で処理した。結果を以下の表３に示す。

【0085】

【表3】

【0086】

表３より、比較用前処理液を用いた検出方法でも試料中のHBs抗原を検出することは可能であるが、S／N比は、実施例１の前処理液を用いた本発明の検出方法に比べて、著しく減少していた。これは、比較用前処理液によりHBs抗原が変性されて、その抗原性が失われていることを示唆する。これに対して、本発明の前処理方法を利用するHBs抗原の検出方法では、S／N比は高い値となっており、前処理液によるHBs抗原への影響は小さいと考えられる。

【0087】

実施例２ セロコンバージョンパネルを用いた前処理効果の検討(２)
１．材料
(１)試料
HBV陽性患者から得た血清(HBV11000-9：Zepto Metrix社)を段階的に希釈して血清希釈液を作製し、これらを試料として用いた。本実施例では、これらの試料を試料番号１〜４により識別する。各試料に含まれるHBs抗原の濃度は既知である。なお、該HBV陽性患者から得た血清は、健常人血清(HBs抗体を約23.4 mIU/mLの濃度で含有)で希釈した。

【0088】

HBV陽性患者から得た血清(HBV11048-6：Zepto Metrix社)を段階的に希釈して血清希釈液を作製し、これらを試料として用いた。本実施例では、これらの試料を試料番号５〜８により識別する。各試料に含まれるHBs抗原の濃度は既知である。なお、該HBV陽性患者から得た血清は、健常人血清(HBs抗体を約23.4 mIU/mLの濃度で含有)で希釈した。

【0089】

(２)前処理液
水酸化ナトリウム(ナカライテスク株式会社)を0.03 N、Brij(登録商標)35(和光純薬工業株式会社)を0.4％、および尿素(キシダ化学株式会社)を1.2 Mの濃度で含む水溶液を、前処理液として用いた。

【0090】

２．試料の前処理
(１)処理工程
試料(120μL)と前処理液 (100μL)とを混合して、室温にて７分間インキュベーションすることにより、該試料を、終濃度0.014 Nの水酸化ナトリウムの存在下で処理した。
(２)中和工程
上記の処理工程で得られた試料と、実施例１と同じ酸性物質を含む試薬(80μL)とを混合して、室温にて５分間インキュベーションすることにより、該試料を中和した。

【0091】

３．HBs抗原の検出
(１)形成工程
中和工程で得られた試料(300μL)と、実施例１と同じ標識抗体試薬(100μL)とを、反応キュベット(HISCL用反応キュベット：シスメックス株式会社製)内で混合し、42℃で９分間インキュベーションした。この反応キュベットに、実施例１と同じ第１抗体試薬(100μL)を添加し、42℃で９分間インキュベーションした。さらに、この反応キュベットに、実施例１と同じ担体粒子試薬(75μL)を添加し、42℃で10分間インキュベーションして、形成工程を行った。

【0092】

(２)回収工程
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットに、集磁装置(MINITUBE MAG SEPARATOR：SPHERO TECH社製)を用いて磁気分離を行い、該キュベット内の上清を除去することにより、担体粒子を回収した。この反応キュベットに洗浄液を添加し、再び磁気分離を行って担体粒子を洗浄した。ここでは、600μLの洗浄液による洗浄を２回、150μLの洗浄液による洗浄を１回行った。なお、この工程で用いた洗浄液は、HISCL洗浄液(シスメックス株式会社)にNaClを添加してNaCl濃度を0.4 Mにして得た。

【0093】

(３)転移工程
回収工程で得られた試料を含む反応キュベットに、実施例１と同じ遊離剤(33μL)を添加し、38℃で５分間インキュベーションした。次に、上記の集磁装置を用いて磁気分離を行い、上清33μLを回収した。これ以降、測定工程まではHISCL2000i(シスメックス株式会社製)を用いて行った。具体的にHISCL2000iでは以下のことを行った。まず、回収した上清に実施例１と同じ担体粒子試薬(60μL)を添加し、42℃で約６分間インキュベーションすることにより、転移工程を実施した。なお、本実施例では、ここで添加した担体粒子試薬中の磁性粒子が、固相に該当する。そして、固相から上清を除去し、上記(２)の回収工程で用いた洗浄液(300μL)を添加し、再び上清を除去することにより洗浄を行った。同様の洗浄操作を５回繰り返した。

【0094】

(４)測定工程
転移工程で得られた固相に、HISCL R4試薬(50μL)とHISCL R5試薬(100μL)(シスメックス株式会社)を添加し、42℃で５分間インキュベートした。そして、発光強度(counts)の測定を行った。測定結果を、以下の表４および表５に示す。

【0095】

【表4】

【0096】

【表5】

【0097】

表４および表５に示されるように、２ＳＤ法により、本発明のHBsの検出方法では、セロコンバージョンパネルから調製したHBs抗体含有試料において、HBs抗原濃度が0.0002 IU/mLとHBs抗原が微量であっても、HBs抗原を検出できることがわかった。

【0098】

実施例３ 前処理液のアルカリ性物質の濃度の違いによるHBs抗原の感度への影響の検討
１．材料
(１)試料
HBV陽性患者から得た３種類の血清(HBV6290-6、HBV11048-6およびHBV6272-6：いずれもZepto Metrix社より入手)を試料として用いた。

【0099】

(２)前処理液
(i)前処理液１
水酸化ナトリウム(ナカライテスク株式会社)を0.15 N、Brij(登録商標)35(和光純薬工業株式会社)を0.4％、および尿素(キシダ化学株式会社)を1.2 Mの濃度で含む水溶液を、前処理液１として用いた。

【0100】

(ii)前処理液２
水酸化ナトリウム(ナカライテスク株式会社)を0.625 N、Brij(登録商標)35(和光純薬工業株式会社)を0.4％、および尿素(キシダ化学株式会社)を1.2 Mの濃度で含む水溶液を、前処理液２として用いた。

【0101】

２．試料の前処理
(１)処理工程
試料(120μL)と前処理液１(100μL)とを混合して、室温にて７分間インキュベーションすることにより、該試料を、終濃度0.06 Nの水酸化ナトリウムの存在下で処理した。また、同じ試料に対し、前処理液１に代えて、前処理液２を用いて同様の操作を行った。すなわち、試料(120μL)と前処理液２(80μL)とを混合して、室温にて７分間インキュベーションすることにより、該試料を、終濃度0.25 Nの水酸化ナトリウムの存在下で処理した。
(２)中和工程
上記の処理工程で得られた試料と、実施例１と同じ酸性物質を含む試薬(80μL)とを混合して、室温にて５分間インキュベーションすることにより、該試料を中和した。

【0102】

３．HBs抗原の検出
(１)形成工程
中和工程で得られた試料(300μL)と、実施例１と同じ標識抗体試薬(100μL)とを、反応キュベット(HISCL用反応キュベット：シスメックス株式会社製)内で混合し、42℃で９分間インキュベーションした。この反応キュベットに、実施例１と同じ第１抗体試薬(100μL)を添加し、42℃で９分間インキュベーションした。さらに、この反応キュベットに、実施例１と同じ担体粒子試薬(75μL)を添加し、42℃で10分間インキュベーションして、形成工程を行った。

【0103】

(２)回収工程
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットに、集磁装置(MINITUBE MAG SEPARATOR：SPHERO TECH社製)を用いて磁気分離を行い、該キュベット内の上清を除去することにより、担体粒子を回収した。この反応キュベットに洗浄液を添加し、再び磁気分離を行って担体粒子を洗浄した。ここでは、600μLの洗浄液による洗浄を２回、150μLの洗浄液による洗浄を１回行った。なお、この工程で用いた洗浄液は、HISCL洗浄液(シスメックス株式会社)にNaClを添加してNaCl濃度を0.4 Mにして得た。

【0104】

(３)転移工程
回収工程で得られた試料を含む反応キュベットに、実施例１と同じ遊離剤(33μL)を添加し、38℃で５分間インキュベーションした。次に、上記の集磁装置を用いて磁気分離を行い、上清33μLを回収した。これ以降、測定工程まではHISCL2000i(シスメックス株式会社製)を用いて行った。具体的にHISCL2000iでは以下のことを行った。まず、回収した上清に実施例１と同じ担体粒子試薬(60μL)を添加し、42℃で約６分間インキュベーションすることにより、転移工程を実施した。なお、本実施例では、ここで添加した担体粒子試薬中の磁性粒子が、固相に該当する。そして、固相から上清を除去し、上記(２)の回収工程で用いた洗浄液(300μL)を添加し、再び上清を除去することにより洗浄を行った。同様の洗浄操作を５回繰り返した。

【0105】

(４)測定工程
転移工程で得られた固相に、HISCL R4試薬(50μL)とHISCL R5試薬(100μL)(シスメックス株式会社)を添加し、42℃で５分間インキュベートした。そして、発光強度(counts)の測定を行った。また、上記の前処理液２で処理した試料についても、前処理液１で処理した試料と同様の検出操作を行った。測定結果を、図１〜図３に示す。

【0106】

図１〜図３より、前処理液１を用いた本発明のHBs抗原の検出方法では、前処理液２のようなアルカリ物質の濃度が高い前処理液を用いたHBs抗原の検出方法に比べて、2.5倍以上の発光強度が得られた。よって、本発明のHBs抗原の検出方法によって、HBs抗原をより高感度に検出することができることがわかった。

【0107】

本出願は、２０１３年１月２８日に出願された日本国特許出願特願２０１３−０１３１６７号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】