特許 6349462 可溶性インテイン融合タンパク質、及び生体分子を精製する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6349462

(24)【登録日】2018年6月8日

(45)【発行日】2018年6月27日

(54)【発明の名称】可溶性インテイン融合タンパク質、及び生体分子を精製する方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20180618BHJP

   C07K 17/00 20060101ALI20180618BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20180618BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180618BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180618BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180618BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180618BHJP

   B01D 15/38 20060101ALI20180618BHJP

   C12N 9/50 20060101ALN20180618BHJP

   C12N 11/00 20060101ALN20180618BHJP

   C12N 15/57 20060101ALN20180618BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00ZNA

   C07K17/00

   C12N15/62 Z

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N5/10

   C12N1/21

   B01D15/38

   !C12N9/50

   !C12N11/00

   !C12N15/57

【請求項の数】30

【全頁数】43

(21)【出願番号】特願2017-521137(P2017-521137)

(86)(22)【出願日】2015年10月23日

(65)【公表番号】特表2017-533701(P2017-533701A)

(43)【公表日】2017年11月16日

(86)【国際出願番号】US2015057125

(87)【国際公開番号】WO2016073228

(87)【国際公開日】20160512

【審査請求日】2017年6月27日

(31)【優先権主張番号】62/074,494

(32)【優先日】2014年11月3日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/209,010

(32)【優先日】2015年8月24日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】307043050

【氏名又は名称】メルク パテント ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100095832

【弁理士】

【氏名又は名称】細田 芳徳

(72)【発明者】

【氏名】ジルマン，マーティン

(72)【発明者】

【氏名】オーランド，ジョー

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／０４５６３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１９１４５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１１０３９３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１０６６９９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 GARBE D. et al，Journal of Peptide Science，16(2010)，p.575-581

【文献】 WANG Z. et al，Protein Expression and Purification，82(2012)，p.174-178

【文献】 WOOD D.W. et al，J. Biol. Chem.，Vol.289 No.21(2014 May)，p.14512-14519

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｂ０１Ｄ １５／３８

Ｃ０７Ｋ １７／００

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ １５／６２

Ｃ１２Ｎ ９／５０

Ｃ１２Ｎ １１／００

Ｃ１２Ｎ １５／５７

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＯＲＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペプチド結合により結合したＮ−インテインポリペプチドとＮ−インテイン可溶化パートナーを含む融合タンパク質であって、前記Ｎ−インテイン可溶化パートナーが、１５ｋＤａ未満の分子量、６０未満の脂肪族指数（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ）値、及び−１未満の疎水度大規模平均値を有し、前記可溶化パートナーの非存在下で発現されたＮ−インテインポリペプチドと比較して前記Ｎ−インテインポリペプチドの可溶性を増大させ、Ｃ−インテインポリペプチドと複合体化した場合のＮ−インテインポリペプチドの触媒活性を維持する、融合タンパク質。

【請求項2】

前記Ｎ−インテインポリペプチドが、ＧＰ４１−１ Ｎ−インテイン（配列番号１）、又はその変異体であり、前記ＧＰ４１−１ Ｎ−インテインの変異体は、配列番号１のＧＰ４１−１ Ｎ−インテインに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記変異体は、Ｃ−インテインポリペプチドと混合した場合に、Ｃ−インテインポリペプチドとインテイン複合体を形成し、前記複合体は、インテイン活性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記ＧＰ４１−１ Ｎ−インテインの変異体が、配列番号１の７位、６５位及び８９位にシステイン残基以外のアミノ酸を有する、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記ＧＰ４１−１ Ｎ−インテインの変異体が、配列番号１の７位にアラニン、６５位にトレオニン残基又はアラニン残基、並びに８９位にメチオニン残基、リシン残基又はアスパラギン残基のいずれかを有する、請求項３に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記Ｎ−インテインポリペプチドが、前記融合タンパク質と固体支持体の結合のために用いられるアミノ酸を欠失している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記融合タンパク質と固体支持体の結合のために用いられる前記アミノ酸が、システインである、請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

前記Ｎ−インテインポリペプチドが、配列番号１〜８及び２９〜５６から選択される配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

前記Ｎ−インテイン可溶化パートナーが、前記Ｎ−インテインポリペプチドのＮ末端に結合される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

前記Ｎ−インテイン可溶化パートナーが、前記Ｎ−インテインポリペプチドのＣ末端に結合される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

前記Ｎ−インテイン可溶化パートナーが、Ｎ−インテイン可溶化パートナー１３８（配列番号１５）、又はその変異体であり、前記Ｎ−インテイン可溶化パートナー１３８の変異体が、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

前記融合タンパク質が、産生される前記融合タンパク質の２５質量％未満が封入体内に存在する条件下で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

前記融合タンパク質が、検出可能な標識を含むように修飾される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

前記検出可能な標識が、蛍光色素である、請求項１２に記載の融合タンパク質。

【請求項14】

前記融合タンパク質が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｉｚｅ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉｎｉａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ＳＦ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、又はＨＥＫ２９３細胞において発現される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項15】

請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項16】

前記核酸が、発現ベクター中に含まれる、請求項１５に記載の核酸。

【請求項17】

前記核酸が、プラスミド中に含まれる、請求項１５に記載の核酸。

【請求項18】

請求項１５、１６又は１７に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項19】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１８に記載の宿主細胞。

【請求項20】

固体支持体に結合された請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。

【請求項21】

前記固体支持体が、クロマトグラフィー樹脂である、請求項２０に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。

【請求項22】

前記クロマトグラフィー樹脂が、親水性ポリビニルエーテルベースを含む、請求項２１に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。

【請求項23】

前記固体支持体が、ビーズ、中空繊維、中実繊維、パッド、ゲル、膜、カセット、カラム、チップ、スライド、プレート又はモノリスである、請求項２０に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。

【請求項24】

前記固体支持体が、磁気ビーズである、請求項２３に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。

【請求項25】

前記固体支持体が、多孔性ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン又はこれらの誘導体を含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。

【請求項26】

前記マトリックスが、前記融合タンパク質と固体支持体の間にスペーサ分子をさらに含む、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。

【請求項27】

前記融合タンパク質が、前記Ｎ−インテイン可溶化パートナーの単一部位で前記固体支持体に結合される、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。

【請求項28】

前記融合タンパク質が、前記Ｎ−インテイン可溶化パートナーの２つ以上の部位で前記固体支持体に結合される、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。

【請求項29】

前記融合タンパク質中の前記Ｎ−インテインポリペプチドは、前記融合タンパク質が前記固体支持体に結合されているとき、活性を維持する、請求項２０〜２８のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。

【請求項30】

前記融合タンパク質中の前記Ｎ−インテインポリペプチドは、前記融合タンパク質が前記固体支持体に結合されているとき、前記固体支持体から離れる方向に配向される、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリックス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月３日に出願された米国仮特許出願第６２／０７４，４９４号明細書及び２０１５年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／２０９，０１０号明細書の利益を請求する。上記出願の教示内容全体は、参照により本明細書に組み込むものとする。

【0002】

本発明は、Ｎ−インテインポリペプチドとＮ−インテイン可溶化パートナーを含む融合タンパク質、こうした融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックス、並びに特に工業規模の、タンパク質精製及びペプチド連結プロセスにおいて上記の融合タンパク質を使用する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

目的のタンパク質をアフィニティタグでタグ付けするステップを含むタンパク質精製方法は、研究開発用途のために研究室で広く使用されているが、大規模な製造作業には非実用的であることがわかっている。バイオプロセシング工業では、最終産物がタグを含まないことを確実にするために、切断可能なアフィニティタグだけが使用されており、タグは、生産工程中に、典型的には部位特異的プロテアーゼを用いて除去しなければならない。アフィニティタグの除去には、さらに別の処理ステップを必要とし、これによって、特に工業規模で、コスト及び時間が実質的に増加する。さらに、非効率的な切断及び部位外の切断によって、それぞれタグ及び短いタンパク質断片を保持するタンパク質が最終タンパク質産物に混入することになり、これは、バイオプロセシング用途では許容されない。

【0004】

従って、改善されたアフィニティクロマトグラフィー試薬、及び工業条件下でタンパク質の大規模精製を可能にする方法を開発することが求められる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

インテインは、プロテアーゼ及びリガーゼ活性の両方を含む１クラスの自己触媒酵素である。「分断インテイン」と呼ばれる１クラスのインテインは、Ｎ−インテイン及びＣ−インテインと呼ばれる２つの相補的ハーフインテインを含み、これらは、選択的且つ極めて密接に結合して、活性インテイン酵素を形成する（Ｓｈａｈ Ｎ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５：１８６７３−１８６８１；Ｄａｓｓａ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３７：２５６０−２５７３（２００９））。

【0006】

大規模な精製プロセスでのインテイン（分断インテインを含む）の使用は、これまで従来の技術に記載されている（例えば、国際公開第２０１３／０４５６３２号パンフレットを参照）。さらに、粗混合物からの目的のタンパク質のクロマトグラフィー分離のための分断インテインの使用もこれまでに記載されている（例えば、中国特許出願公開番号１０１８８４９１０号明細書；Ｇｕａｎ Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１０：２４７１−２４８１（２０１３）；Ｌｕ Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ，１２１８：２５５３−２５６０（２０１１））。

【0007】

しかしながら、大規模なタンパク質精製プロセスにおけるインテインの使用は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの一般的発現系に発現される場合、その難溶性により阻まれている。さらには、効率的な工業規模のタンパク質精製プロセスに不可欠である、固体支持体に共有結合するインテインベースのアフィニティリガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスは記載されていない。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、Ｃ−インテインポリペプチドを含む第２の融合タンパク質との結合により、活性インテイン複合体を形成することができるＮ−インテインポリペプチドを含む可溶性融合タンパク質を提供する。Ｎ−インテインポリペプチドを含む融合タンパク質を、固体支持体に共有結合させることにより、大規模なバイオプロセシング用途に好適なアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを生成することができる。

【0009】

従って、一実施形態において、本発明は、ペプチド結合により結合したＮ−インテインポリペプチドとＮ−インテイン可溶化パートナーを含む融合タンパク質に関する。この実施形態の特定の態様では、Ｎ−インテイン可溶化パートナーは、約１５ｋＤａ未満の分子量、約６０未満の脂肪族指数値、及び−１未満の疎水度大規模平均値を有し、Ｎ−インテインポリペプチドの可溶性を増大（例えば、増加及び／又は促進）する。この実施形態の別の態様では、Ｎ−インテイン可溶化パートナーは、配列番号１５を含む。この実施形態のさらに別の態様では、Ｎ−インテインポリペプチドは、ＧＰ４１−１Ｎ−インテイン（配列番号１）、又はその変異体である。

【0010】

別の実施形態において、本発明は、固体支持体に結合した、Ｎ−インテインポリペプチドとＮ−インテイン可溶化パートナーを含む融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスに関する。この実施形態の特定の態様では、固体支持体は、親水性ポリビニルエーテルベースを含むクロマトグラフィー樹脂である。

【0011】

さらに別の実施形態において、本発明は、サンプル中の標的分子をアフィニティ精製する方法に関する。この実施形態の一態様では、本方法は、ａ）ポリペプチド結合により標的分子に結合したＣ−インテインポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を含有するサンプルを用意するステップ；ｂ）第２の融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスと上記サンプルを接触させるステップ（ここで、第２の融合タンパク質は、第１の融合タンパク質中のＣ−インテインポリペプチドが、第２の融合タンパク質中のＮ−インテインポリペプチドと選択的に結合して、不活性であるインテイン複合体を形成する条件下で、Ｎ−インテインポリペプチドの可溶性を促進するＮ−インテイン可溶化パートナーと、ペプチド結合により結合したＮ−インテインポリペプチドを含む）；ｃ）不活性インテイン複合体を含有するアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、非結合混入物を除去するステップ；ｄ）インテイン複合体が活性となり、Ｃ−インテインポリペプチドから標的分子を切断する条件に、インテイン複合体を曝露するステップ；並びにｅ）切断された標的分子を回収するステップを含む。

【0012】

また別の実施形態では、本発明は、アフィニティ精製での使用に好適である、触媒として活性のインテイン複合体のスクリーニング方法に関する。この実施形態の一態様では、本方法は、ａ）（例えば、ペプチド結合又はリンカー分子により）標的分子に結合したＣ−インテインポリペプチドを含む第１の融合タンパク質と、（例えば、ポリペプチド結合又はリンカー分子により）Ｎ−インテイン可溶化パートナーと結合したＮ−インテインポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を、第１の融合タンパク質中のＣ−インテインポリペプチドが第２の融合タンパク質中のＮ−インテインポリペプチドと選択的に結合して、インテイン複合体を形成する条件下で、接触させるステップ；並びにｂ）インテイン活性を支持する条件下で、標的分子が、Ｃ−インテインポリペプチドから切断されているか否かを決定するステップを含み、ここで、切断された標的分子の存在は、触媒活性インテイン複合体を示している。

【0013】

本発明のＮ−インテイン融合タンパク質は、可溶性を改善すると共に、触媒活性を増大したことから、対応するＣ−インテインと組み合わせると、大規模なタンパク質精製（例えば、アフィニティクロマトグラフィー）並びに修飾プロセス（例えば、ペプチド切断及び連結反応）を実施するための試薬として有用である。

【0014】

特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１枚の図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開の複写は、要請及び必要料金の支払い後に特許庁により提供される。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】本発明の例示的なアフィニティ精製方法を示す概略図である。この方法は、固体支持体（表面）に結合されるＮ−インテイン可溶化パートナーと融合したＮ−インテインポリペプチドを有する融合タンパク質を含む、本発明の例示的なアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを使用する。アフィニティ精製クロマトグラフィーマトリックス中のＮ−インテインに相補的なＣ−インテインを含む第２の融合タンパク質を、精製しようとする標的タンパク質（目的のタンパク質）及び発現に必要ないずれか他の要素、例えば、分泌シグナルなどに融合させる。図１Ａは、Ｃ−インテイン融合タンパク質とＮ−インテインアフィニティクロマトグラフィーマトリックスの結合前の様々な構成要素を示す。図１Ｂは、インテイン結合のための適切な条件（例えば、ｐＨ、塩、酸化／還元）下で、Ｎ−インテインアフィニティクロマトグラフィーマトリックスに結合したＣ−インテイン融合タンパク質を示す。図１Ｃは、インテイン複合体の触媒活性のための適切な条件下で、Ｎ−及びＣ−エクステインがそれぞれの融合タンパク質から切断された後の構成要素を示す。

【図2】図２Ａ、ＧＰ４１−１Ｎ−インテインのＮ末端（ＳＯＬＰ−ＮＩＮＴ）又はＣ末端（ＮＩＮＴ−ＳＯＬＰ）のいずれかに融合した３つの候補Ｎ−インテイン可溶化パートナー（４６、２０６、２４６；表２を参照）の触媒活性（切断速度）に対する融合物極性の作用を示すグラフである。図２Ｂ、ＧＰ４１−１Ｎ−インテインのＮ末端（ＳＯＬＰ−ＮＩＮＴ）又はＣ末端（ＮＩＮＴ−ＳＯＬＰ）のいずれかに融合した３つの候補Ｎ−インテイン可溶化パートナー（４６、２０６、２４６）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質発現に対する融合物極性の作用を示すグラフである。

【図3】ＧＰ４１−１Ｎ−インテインのＣ末端に融合した７つの候補可溶化パートナー（４６、２０６、２４６、５１、１３８、３４２、３６８）の基質切断速度及び可溶性発現力価を示すグラフである。

【図4】候補可溶化パートナーの物理的性質計算値と、Ｎ−インテインのＣ末端に融合した可溶化パートナーを含む融合タンパク質の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における総（力価）又は可溶性（可溶性力価）発現のいずれかとの相関を示すグラフである。ｍｗ：分子量；ｐＩ：等電点；ＡＩ：脂肪族指数；ＧＲＡＶＹ：疎水度大規模平均。

【図5】特定のアミノ酸が、ＧＰ４１−１インテインの６５位のシステインに対応する残基で、およそ百のＧＰ４１−１相同体に見出される頻度を示すチャートである。

【図6】可溶化パートナー１３８と、２つの中央に位置する、６５位及び８９位の天然のシステイン残基を含む野生型ＧＰ４１−１Ｎ−インテイン、又は６５位及び８９位システイン残基の一方又は両方に対するアミノ酸置換を含有するＧＰ４１−１Ｎ−インテインの変異体との融合タンパク質の触媒活性（切断速度）を示すグラフである。

【図7】可溶化パートナー１３８のためのＮＭＲ溶液構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ構造１ＲＹＫ）を示す。このタンパク質は、４つのαヘリックスドメインを含み、球状であり、長い非構造コイルを有し、これが、Ｎ−インテインのカルボキシ末端との連結（丸で囲んだ領域；Ｎ−インテインは示していない）を形成する。黄色のハイライトで示すループ領域ＧＫＬ及びＧＹＱは、可溶化パートナー１３８（１３８＿ＧＫＬ２２ＧＣＫＬ、１３８＿ＧＹＱ４８ＧＣＹＱ、及び１３８＿ＧＹＱ４８ＧＣＧＹＱ）の新たなバージョン（

【化1】

）を作製するためのシステイン残基挿入のためにターゲティングされた。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明の実施形態例の説明を以下に行う。

【0017】

Ｉ．定義
本開示をさらにわかりやすくするために、初めにいくつかの用語を定義する。さらなる定義は、詳細な説明全体を通じて記載する。別に定義されない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語は全て、本発明が関連する技術分野の通常の技術者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。

【0018】

用語「目的の生体分子」及び「標的分子」は、本明細書において置き換え可能に用いられ、生物学的分子（例えば、タンパク質）、材料若しくは高分子集合体を指し、これは、例えば、混合物（例えば、粗タンパク質混合物）から精製されるか、又は取り出される。例示的な目的の生体分子として、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体）を含む組換えペプチド及びタンパク質、ワクチン、ウイルス、並びに他の高分子集合体、例えば、生体分子及び合成成分の両方を含有し得るウイルス様粒子及びナノ粒子が挙げられる。例として、目的の生体分子は、以下のものを含み得る：タンパク質及び生体分子集合体（例えば、組換えＤＮＡ技術により生成される）、例えば、ホルモン（例えば、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、組織プラスミノーゲン活性化因子）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びｍＡｂ−誘導体（例えば、二重特異性ｍＡｂ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、サメ（ｓｈａｒｋ）及びラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体）、スカフォールド由来治療薬（例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アンチカリン）、治療用酵素（例えば、αガラクトシダーゼＡ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ）、毒素（例えば、ボツリヌス菌、ＣＲＭ１９７、リシン）、組換え体ワクチン（例えば、炭疽、ジフテリア、破傷風、肺炎、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス）、ウイルス様粒子（例えば、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマ、インフルエンザ、パルボウイルス、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）ウイルス）、並びに工業用酵素（例えば、パパイン、ブロメライン、トリプシン、プロテイナーゼＫ、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（商標）酵素、ＤＥＮＥＲＡＳＥ（商標）酵素、ウレアーゼ、ペプシンなど）及び診断試薬（例えば、グルコース及び乳酸デヒドロゲナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、制限酵素、ハイブリドーマ由来酵素など）。特定の実施形態では、標的分子は、治療標的に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。

【0019】

用語「融合タンパク質」は、ペプチド結合によって結合された２つ以上の異種ポリペプチドの全部又は一部を含む、天然、合成、半合成若しくは組換え単一タンパク質分子を指す。

【0020】

用語「ペプチド（性）」は、本明細書で使用されるとき、長さが、２アミノ酸長より長いペプチド及びタンパク質を指し、これは、非アミノ酸分子（例えば、発色団、薬剤、毒素、イメージング用造影剤など）も含み得る。

【0021】

用語「ポリペプチド」は、特定の長さではなく、アミノ酸のポリマーを指し；従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。

【0022】

用語「分断インテイン」は、本明細書で使用されるとき、天然から単離されるか、又は組換えＤＮＡ技術により作製されるタンパク質を指し、これは、以下の特性を有する：（１）タンパク質は、高い親和性及び選択性で相互作用する２つのハーフ部分で存在し；（２）２つのハーフ部分は、触媒活性に必要なあらゆるインテイン配列を含んでいなければならないと共に、付加された非インテインペプチド配列も含有してもよく；（３）タンパク質は、２つのハーフ部分が密接に結合したときだけ酵素活性を有し；並びに（４）酵素活性は、部位選択的ペプチド切断又は連結であり、これは、非インテインペプチド配列からインテイン配列を分離するか、又は連続的線状若しくは環状タンパク質に非インテインペプチド配列を連結する上で役立つ。

【0023】

用語「相補的インテイン」は、本明細書において、分断インテインペアのＮ−インテイン及びＣ−インテイン部分を指すために用いられる。

【0024】

用語「Ｎ−インテイン」は、本明細書で使用されるとき、単一のインテインポリペプチドのＮ末端部分と相同性を有するインテインポリペプチドを指し、これは、相補的Ｃ−インテインと結合して、活性インテイン酵素を形成する。

【0025】

用語「Ｃ−インテイン」は、本明細書で使用されるとき、単一のインテインポリペプチドのＣ末端部分と相同性を有するインテインポリペプチドを指し、これは、相補的Ｎ−インテインと結合して、活性インテイン酵素を形成する。

【0026】

用語「エクステイン」は、本明細書で使用されるとき、天然でＮ−及びＣ−インテインに融合するＮ−及びＣ末端ペプチド配列を指し、これらは、分断インテインの酵素作用によって操作（例えば、切断又は連結）される。

【0027】

用語「リガンド」は、本明細書で使用されるとき、特に、クロマトグラフィー樹脂などの表面と結合すると、別のものとの強力且つ選択的な相互作用が可能な分子を指す。一部の実施形態では、リガンドは、本明細書に記載するＮ−インテイン融合タンパク質であってもよい。

【0028】

用語「可溶化パートナー」は、本明細書で使用されるとき、Ｎ−インテインと融合すると、可溶化パートナーの非存在下で発現された可溶性Ｎ−インテインの量と比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現される可溶性Ｎ−インテインの量を増大（例えば、増加、促進又は維持）するタンパク質を指す。例えば、様々な実施形態において、可溶化パートナーとの融合タンパク質としてＮ−インテインを発現すると、可溶化パートナーなしで発現した場合のインテインの可溶性と比較して、少なくとも約１０％（例えば、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれ以上）Ｎ−インテインの可溶性を増加することができる。

【0029】

一実施形態では、可溶化パートナーＥ（配列番号２５）をＮ−インテインに融合させ、これによって得られる融合タンパク質の可溶性を用いて、実験ベースラインを賦与する。これは、特に、Ｎ−インテインのみが可溶性又は安定性でない場合に有用である。

【0030】

用語「親分子」又は「野生型（ｗｔ）対応物」又は「ｗｔタンパク質」又は「ｗｔドメイン」は、本明細書で使用されるとき、その実質的にネイティブな形態の対応するタンパク質（例えば、Ｎ−インテイン、Ｎ−インテイン可溶化パートナー）、又はタンパク質のドメインを指すことが意図され、これは、一般に、本明細書では対照として用いられる。

【0031】

用語「配列同一性」は、２つのヌクレオチド若しくはアミノ酸配列が、任意選択で、例えば、デフォルトギャップ加重を用いたプログラムＧＡＰ若しくはＢＥＳＴＦＩＴなどにより、最適にアラインメントされるとき、少なくとも７０％配列同一性、又は少なくとも８０％配列同一性、又は少なくとも８５％配列同一性、又は少なくとも９０％配列同一性、又は少なくとも９５％若しくはそれ以上の配列同一性を有することを意味する。配列比較のために、典型的には一方の配列は、試験配列が比較される基準配列（例えば、親配列）として役立つ。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び基準配列をコンピュータに入力し、必要であれば、配列座標を指定した後、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一性のパーセントを計算する。

【0032】

比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の部分相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法の検索により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる履行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は視覚検査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）により、実施することができる。配列同一性のパーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これについては、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から一般に入手可能である（米国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）ＮＣＢＩインターネットサーバから一般に閲覧可能）。典型的に、デフォルトプログラムパラメータを用いて、配列比較を実施することができるが、カスタマイズしたパラメータを使用することもできる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）参照）。

【0033】

用語「クロマトグラフィー」は、本明細書で使用されるとき、混合物中の他の分子から目的の標的分子を分離して、それを単離することができる動的分離技術を指す。典型的には、クロマトグラフィー法において、移動相（液体又は気体）が、目的の標的分子を含有するサンプルを、固定相（通常、固体）媒体にわたって、又はそれを介して輸送する。固定相に対する分配又は親和性の差によって様々な分子を分離するが、移動相は、様々な時点で異なる分子を含有する。

【0034】

用語「アフィニティクロマトグラフィー」は、本明細書で使用されるとき、一様式のクロマトグラフィーを指し、ここで、分離しようとする標的分子は、標的分子と特異的に相互作用する分子（例えば、Ｎ−インテイン及びＮ−インテイン可溶化因子を含む本発明のアフィニティクロマトグラフィーリガンド）との相互作用により分離される。一実施形態では、アフィニティクロマトグラフィーは、本明細書に記載する通り、Ｎ−インテインベースのリガンドを担持する固体支持体への標的分子（例えば、免疫グロブリン又はＦｃ含有タンパク質）を含有するサンプルの添加を含む。

【0035】

用語「アフィニティマトリックス」又は「アフィニティクロマトグラフィーマトリックス」は、本明細書で使用されるとき、アフィニティクロマトグラフィーリガンド（例えば、Ｎ−インテイン融合タンパク質又はそのドメイン）が結合したクロマトグラフィー支持体を指す。リガンドは、アフィニティ相互作用により目的の分子（例えば、相補的Ｃ−インテイン融合タンパク質）に結合することができ、この分子は、混合物から精製されるか、又は取り出される。

【0036】

用語「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」又は「抗体」（本明細書では置き換え可能に使用される）は、２つの重鎖と２つの軽鎖から構成される４−ポリペプチド鎖基本構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は、例えば、鎖間ジスルフィド結合により安定化され、これは、抗原に特異的に結合する能力を有する。用語「一本鎖免疫グロブリン」又は「一本鎖抗体」（本明細書では置き換え可能に使用される）は、１つの重鎖と１つの軽鎖から構成される２−ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は、例えば、鎖間ペプチドリンカーにより安定化され、これは、抗原に特異的に結合する能力を有する。用語「ドメイン」は、例えば、β．シート及び／又は鎖間ジスルフィド結合により安定化される、ペプチドループ（例えば、３〜４ペプチドループ）を含む重鎖又は軽鎖ポリペプチドの球状領域を指す。ドメインはさらに、本明細書において、「定常」又は「可変」とも呼ばれるが、これは、「定常」ドメインの場合には、様々なクラスメンバーのドメイン内の配列変化の相対的欠如に、又は「可変」ドメインの場合には、様々なクラスメンバーのドメイン内の有意な配列変化に基づくものである。抗体又はポリペプチド「ドメイン」は、当技術分野において、抗体又はポリペプチド「領域」と置き換え可能に称されることが多い。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域又は「ＣＬ」ドメインと置き換え可能に称される。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域又は「ＣＨ」ドメインと置き換え可能に称される。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域又は「ＶＬ」ドメインと置き換え可能に称される。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域又は「ＶＨ」ドメインと置き換え可能に称される。

【0037】

「抗体」又は「免疫グロブリン」は、モノクローナル又はポリクローナルのいずれでもよく、単量体又は多量体形態で存在してよく、例えば、五量体形態で存在するＩｇＭ抗体及び／又は単量体、二量体若しくは多量体で存在するＩｇＡ抗体であってもよい。用語「断片」は、インタクトな若しくは完全な抗体又は抗体鎖に比べて少ないアミノ酸残基を含む抗体又は抗体鎖の一部若しくは部分を指す。断片は、インタクトな若しくは完全な抗体又は抗体鎖の化学的若しくは酵素的処理によって取得することができる。断片はまた、組換え手段によって得ることもできる。例示的な断片として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ及び／又はＦｖ断片が挙げられる。

【0038】

用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は、本明細書において置き換え可能に用いられ、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオシドのいずれかの多量体形態を指す。これらの用語は、一本鎖、二本鎖若しくは三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいは、プリン及びピリミジン塩基、又は他の天然のヌクレオチド塩基、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。ポリヌクレオチドの骨格は、糖及びリン酸基（典型的には、ＲＮＡ若しくはＤＮＡに見出され得る通り）、あるいは修飾若しくは置換された糖又はリン酸基を含んでもよい。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成して、適切な条件下でこれらの鎖をアニーリングするか、又は適切なプライマーと共にＤＮＡポリメラーゼを用いて、相補鎖を新たに合成するかの、いずれかによる化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から取得することもできる。核酸分子は、例えば、遺伝子若しくは遺伝子断片、１つ又は複数のエキソン、１つ又は複数のイントロン、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーといった多様な形態を取ることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチド、ウラシル、フルオロリボース及びチオエートなどのその他の糖及び連結基、並びにヌクレオチド分枝を含み得る。本明細書で使用されるとき、「ＤＮＡ」又は「ヌクレオチド配列」は、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧだけではなく、メチル化ヌクレオチドなどの塩基の類似体若しくは修飾形態、非荷電結合及びチオエートなどのヌクレオチド間修飾、糖類似体の使用、並びにポリアミドなどの修飾及び／又は別の骨格構造のいずれかも含む。特定の実施形態では、核酸は、本明細書に記載する通り、Ｎ−インテイン融合タンパク質又はその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0039】

ＩＩ．インテインベースの融合タンパク質
インテインは、１９９０年に発見され、これらの分子の天然の生活環において機能するプロテアーゼ及びリガーゼ活性の両方を含む１クラスの自己触媒酵素である。インテイン試薬は、ペプチド基質の切断、連結、及び環状化に有用性を有することが見出されている。１９９８年、「分断インテイン」と呼ばれる新規クラスのインテインが発見され、この酵素は、Ｎ−インテイン及びＣ−インテイン（相補的ハーフインテイン）と呼ばれる２つの部分として天然に存在する。分断インテインは、多種多様な下等原核生物に見出されている（Ｚｅｔｔｌｅｒ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５５３：９０９−９１４（２００９）；Ｄａｓｓａ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６：３２２−３３０（２００７）；Ｃｈｏｉ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５５６：１０９３−１１０６（２００６）；Ｃａｓｐｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，．５０：１５６９−１５７７（２００３）；Ｌｉｕ Ｘ．及びＹａｎｇ Ｊ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７５：２６３１５−２６３１８（２００３）；Ｗｕ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．５：９２２６−９２３１（１９９８））が、真核生物において分断インテインは一切見出されていない（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｉｎｂａｓｅ／ｌｉｓｔ．ｐｈｐ）により維持されるインテインデータベースを参照のこと）。いずれもエクステイン配列との連結に関して、極めて高速且つかなり乱交雑である２つの分断インテインが近年明らかにされている。一方のクラスは、Ｎｐｕ ＤｎａＥインテイン（Ｉｗａｉ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５５０：１８５３−１８５８（２００６）；Ｚｅｔｔｌｅｒ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５５３：９０９−９１４（２００９））であり、他方のクラスは、メタゲノムデータから同定されたＧＰ４１分断インテイン（Ｃａｒｖａｊａｌ−Ｖａｌｌｅｊｏｓ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：２８６８６−２８６９６（２０１２）；国際公開第２０１３０４５６３２号パンフレット）である。

【0040】

エクステイン（インテイン活性により結合される２つのハーフタンパク質）が結合したＮ−及びＣ−インテインは、複数のドメイン間相互作用により極めて特異的且つ密接に結合して、活性インテイン酵素を形成する（Ｓｈａｈ Ｎ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５：１８６７３−１８６８１；Ｄａｓｓａ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３７：２５６０−２５７３（２００９））。第１クラスのインテインに存在するリガーゼ及びプロテアーゼ活性に加えて、分断インテインは、Ｎ−及びＣ−インテインドメインの密接且つ選択的相互作用のために、アフィニティ分離に有用である。

【0041】

本発明は、本明細書では可溶化パートナーと呼ばれる特定の異種タンパク質との融合タンパク質としてインテインポリペプチドを発現させると、インテインの可溶性が増大することから、インテインは、小規模又は大規模で実施され得るアフィニティクロマトグラフィー並びにその他のタンパク質精製及び修飾用途のための試薬として好適になるという発見に一部基づく。より具体的には、本発明は、相補的Ｃ−インテインポリペプチドと結合することにより、活性インテイン複合体を形成することができるＮ−インテインポリペプチドとＮ−インテイン可溶化パートナーとを含む高度に可溶性の融合タンパク質を提供する。本発明はまた、Ｃ−インテインと標的分子を含む融合タンパク質も提供し、ここで、融合タンパク質は、相補的Ｎ−インテインポリペプチド及びＮ−インテイン可溶化パートナーを含む別の融合タンパク質と結合することができる。

【0042】

従って、一実施形態では、本発明は、Ｎ−インテインポリペプチド及びＮ−インテイン可溶化パートナーの全部又は一部を含む融合タンパク質に関する。様々なＮ−インテインポリペプチドが当技術分野で知られている。例示的なＮ−インテインとして、表１に示すＮ−インテイン及び本明細書の他所に記載する他のＮ−インテインが挙げられる。本明細書に開示するＮ−インテイン及び当技術分野で公知の他のＮ−インテイン、並びに野生型Ｎ−インテインに対して少なくとも約７５％配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列同一性）を有するＮ−インテインの変異体が、本明細書に記載する融合タンパク質に含まれ得る。

【0043】

インテインＮ−末端ドメインの第１アミノ酸は、典型的に高度に保存され、タンパク質スプライシング反応に重要となり得る。しかし、一部の実施形態では、インテインＮ−末端ドメインの第１アミノ酸（例えば、システイン、セリン）は、インテイン及び異種ポリペプチドの間の切断を防止又は低減するアミノ酸（例えば、システイン若しくはセリン以外のアミノ酸）で置換することができる。具体的な実施形態では、インテインＮ−末端ドメイン内の第１アミノ酸をアラニンで置換する。

【0044】

特定の実施形態では、本明細書に記載するＮ−インテイン融合タンパク質は、野生型ＧＰ４１−１Ｎ−インテイン（配列番号１若しくは配列番号２９）又はその変異体を含む。好適な変異体ＧＰ４１−１Ｎ−インテインは、野生型Ｎ−インテイン（配列番号１）に対して少なくとも約７５％配列同一性（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性）を有する。本発明の融合タンパク質に含有させるための変異体ＧＰ４１−１Ｎ−インテインの具体的な例として、本明細書で配列番号２〜８が付与されるＧＰ４１−１変異体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＧＰ４１−１Ｎ−インテイン変異体は、システイン残基が欠失している。具体的な実施形態では、ＧＰ４１−１Ｎ−インテインに天然に存在する１つ又は複数のシステイン残基が欠失している。別の実施形態では、ＧＰ４１−１Ｎ−インテインに天然に存在する１つ又は複数のシステイン残基（配列番号１の７位、６５位及び８９位）が、別のアミノ酸残基（例えば、トレオニン、リシン、又はアスパラギン）で置換されている。一実施形態では、配列番号１のＧＰ４１−１Ｎ−インテインの６５位に天然に存在するシステイン残基が、別のアミノ酸残基（例えば、セリン、トレオニン）で置換されている。具体的な実施形態では、配列番号１の６５位のシステイン残基が、トレオニンで置換されている。また別の実施形態では、配列番号１のＧＰ４１−１Ｎ−インテインの８９位に天然に存在するシステイン残基が、別のアミノ酸残基（例えば、メチオニン、チロシン）で置換されている。具体的な実施形態では、配列番号１の８９位のシステイン残基が、メチオニンで置換されている。一部の実施形態では、ＧＰ４１−１変異体は、ＧＰ４１−１ＮＩＮＴΔＡ＿ＴＭＮ−インテイン変異体（配列番号６）又はＧＰ４１−１ＮＩＮＴΔＡ＿ＴＫＮ−インテイン変異体（配列番号８）である。

【0045】

一部の実施形態では、いくつか又は全部のシステイン残基を欠失したＧＰ４１−１Ｎ−インテイン変異体の連結又は切断反応は、天然のＧＰ４１−１Ｎ−インテインに比して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、若しくは少なくとも１０倍である。切断又は連結いずれかのインテイン活性は、一般に、還元条件下でＳＤＳゲル電気泳動を用いて分析することができる（例えば、Ｚｅｔｔｌｅｒ Ｊ．，Ｓｃｈｕｅｔｚ Ｖ．，Ｍｏｏｔｚ Ｈ．Ｄ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８３：９０９−９１４，２００９；Ａｒａｎｋｏ Ａ．Ｓ．，Ｚｕｅｇｅｒ Ｓ，Ｂｕｃｈｉｎｇｅｒ Ｅ，Ｉｗａｉ Ｈ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４：ｅ５１８５，２００９）。手短には、インテイン反応、一般に、経時変化は、還元剤（例えば、ジチオトレイトール又はβ−メルカプトエタノール）を含有するＳＤＳゲルローディングバッファーの添加により停止し、サンプルを沸騰して十分に変性させた後、適切なタンパク質サイズマーカと一緒にポリアクリルアミドゲル上にロードする。電気泳動が完了した後、反応物中のタンパク質をその分子量に基づいて分離してから、伝統的又は蛍光色素で染色することにより視覚化してもよい。時間の関数としての様々な中間体及び産物の量を比重法及び強度により時間の関数として定量することができ、曲線当てはめプログラムの適用によって酵素速度（ｋｏｂｓ）に変換する。

【0046】

【表1】

【0047】

典型的には、Ｎ−インテインポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの一般的発現系に発現される場合、難溶性である。本発明は、例えば、Ｎ−インテインの可溶性を増加する（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現される場合）Ｎ−インテイン可溶化パートナーとの融合タンパク質としてＮ−インテインを発現することによって、上記の問題を回避する。好ましくは、Ｎ−インテイン可溶化パートナーは、発現系（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））での産生後に、得られる融合タンパク質の約２５質量％未満が封入体中に存在するように、Ｎ−インテインポリペプチドの可溶性を増加する。発現系での産生後の封入体中に存在する発現タンパク質の質量パーセンテージは、標準的技術及び試薬を用いて、当業者が容易に決定することができる。

【0048】

当業者は、当技術分野で公知の技術及び本明細書に記載する技術を用いて、所与のＮ−インテインの可溶性を増加し得る可溶化パートナー候補を容易に選択することができる。例えば、発現系（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））での過剰発現後に可溶性産物を産生する確率は、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＨａｒｒｉｓｏｎのアルゴリズム（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ＤＬ及びＨａｒｒｉｓｏｎ ＲＧ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４４３，１９９１）を用いて計算することができる。タンパク質が、機能性分泌シグナルを含むか否かの予測は、デンマーク工科大学生物学配列解析センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｔ ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）から入手可能なＳｉｇｎａｌＰ ４．１アルゴリズムを用いて実施することができる。また、本明細書に開示する実施例１〜３に記載される方法も参照されたい。最後に、最大インテイン触媒活性を可能にすると共に、可溶性の最適な増大ももたらす可溶化パートナーは、実験スクリーニングによって候補可溶化パートナーから選択しなければならない。

【0049】

特定の物理的性質を有するＮ−インテイン可溶化パートナーは、本発明の融合タンパク質への含有に特に好適である。こうした物理的性質として、限定はしないが、約１５ｋＤａ未満の分子量、約６０未満の脂肪族指数（ＡＩ）、及び−１未満のＧＲＡＶＹ値が挙げられる。これらの特性の各々は、当業者が、標準的アッセイ及び技術、例えば、バイオインフォマティクスツールのＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＥｘＰａＳｙスイートの一部である、オンラインＰｒｏｔＰａｒａｍツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）を用いて、所与の可溶化パートナーについて決定することができる。

【0050】

線状ポリペプチド配列の疎水度大規模平均（Ｇｒａｎｄ Ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）（ＧＲＡＶＹ）（Ｋｙｔｅ Ｊ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ ＲＦ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５，１９８２）は、全アミノ酸の疎水度値の合計を配列中の残基の数で割ったものとして計算する。正のスコアが高いほど、高い疎水性を意味する。この計算は、カイト・ドーリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）スケールに基づいて行う。ＧＲＡＶＹは、タンパク質の疎水度特性を示す簡単な方法である。

【0051】

【表2】

【0052】

様々な実施形態では、本明細書に記載するＮ−インテイン融合タンパク質は、−１未満のＧＲＡＶＹ値を有する。

【0053】

タンパク質の脂肪族指数（Ｉｋａｉ，ＡＪ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８８：１８９５，１９８０）は、脂肪族側鎖（アラニン、バリン、イソロイシン、及びロイシン）が占める相対量として定義される。これは、球状タンパク質の熱安定性増加についてのプラスの因子とみなされ得る。タンパク質の脂肪族指数は、次の式に従って計算される：脂肪族指数＝Ｘ（Ａｌａ）＋ａ＊Ｘ（Ｖａｌ）＋ｂ＊（Ｘ（Ｉｌｅ）＋Ｘ（Ｌｅｕ））。＊係数ａ及びｂは、アラニンの側鎖に対するバリン側鎖（ａ＝２．９）及びＬｅｕ／Ｉｌｅ側鎖（ｂ＝３．９）の相対量である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における過剰発現後に可溶性産物を産生する確率は、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＨａｒｒｉｓｏｎのアルゴリズム（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ＤＬ及びＨａｒｒｉｓｏｎ ＲＧ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４４３，１９９１）を用いて計算することができる。他の利用可能なアルゴリズムが、必ずしも同様の結果をもたらすとは限らない。様々な実施形態では、本明細書に記載するＮ−インテイン融合タンパク質は、約６０未満の脂肪族指数（ＡＩ）、及び−１未満のＧＲＡＶＹ値を有する。

【0054】

Ｎ−インテイン可溶化パートナーは、約１５ｋＤａ未満の分子量、約６０未満の脂肪族指数を有するのが好ましい。

【0055】

特定のＮ−インテイン可溶化パートナーの例を表２に開示する。

【0056】

【表3】

【0057】

【表4】

【0058】

【表5】

【0059】

具体的な実施形態では、Ｎ−インテイン可溶化パートナーは、可溶化パートナー１３８（配列番号１５）、その変異体（例えば、可溶化パートナー１３８ＧＫＬ２２ＧＣＫＬ（配列番号１６）；可溶化パートナー１３８ＧＹＱ４８ＧＣＹＱ（配列番号１７）；可溶化パートナー１３８ＧＹＱ４８ＧＣＧＹ（配列番号１８）の全部若しくは一部であるか、又はそれを含む。

【0060】

融合、又はキメラタンパク質を調製する方法は、当技術分野では公知であり、限定はしないが、標準的組換えＤＮＡ技術が挙げられる。例えば、従来の技術によって、様々なタンパク質配列（例えば、Ｎ−インテイン及びＮ−インテイン可溶化パートナー；Ｃ−インテイン及び標的分子）をコードするＤＮＡ断片を互いにフレーム内で連結する。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成装置などの従来の技術により合成することができる。あるいは、アンカープライマーを用いて、核酸断片のＰＣＲ増幅を実施することもでき、これによって、２つの連続した核酸断片の間に相補的な突出部が生じ、その後、これをアニーリングして、再増幅することにより、キメラ核酸配列を生成することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２を参照）。さらに、既に融合部分（例えば、ＧＳＴ部分、Ｆｃ部分）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。

【0061】

一時的又は安定的にトランスフェクト若しくは形質転換した原核又は真核生物宿主細胞若しくは生物において、コード核酸から融合タンパク質を発現するのが好ましい。組換え宿主細胞の発現のための一般的宿主細胞又は生物として、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｉｚｅ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉｎｉａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、ＳＦ９細胞、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＸＢ１１細胞）、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、並びにウシ及びヤギなどの全動物が挙げられる。発現されたＮ−インテイン融合タンパク質は、従来の分離及びクロマトグラフィー法、例えば、深層濾過による分類、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィーによる精製、並びに限外濾過による濃縮などを用いて、混入細胞タンパク質から精製することができる。

【0062】

異種タンパク質（例えば、Ｎ−インテイン可溶化パートナー、標的分子）をインテインポリペプチドのいずれかの末端に融合させることができる。一実施形態では、Ｎ−インテイン可溶化パートナーをＮ−インテインポリペプチドのＮ末端に結合させる。別の実施形態では、Ｎ−インテイン可溶化パートナーをＮ−インテインポリペプチドのＣ末端に結合させる。

【0063】

一部の実施形態では、ペプチド結合を介して、インテインポリペプチド（例えば、Ｎ−インテイン、Ｃ−インテイン）と異種タンパク質（例えば、Ｎ−インテイン可溶化パートナー、標的分子）を直接連結する。別の実施形態では、融合タンパク質は、インテインポリペプチド（例えば、Ｎ−インテイン、Ｃ−インテイン）と異種タンパク質（例えば、Ｎ−インテイン可溶化パートナー、標的分子）との間に、スペーサ、又はリンカー、分子を含む。好適なスペーサ／リンカー分子は、当技術分野において公知である。

【0064】

本明細書で記載する融合タンパク質では、インテインＮ末端ドメインは、直接（例えば、ペプチド結合を介して）又は間接的（例えば、リンカーアミノ酸配列）のいずれかで異種ポリペプチドと融合させることができる。従って、一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、直接又は間接的のいずれかでインテインＮ末端ドメインのＮ末端と融合させることができる。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドの最初のアミノ酸は、以下：Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＧＩｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｈｅ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ及びＰｒｏからなる群から選択される。

【0065】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、異種ポリペプチドとインテイン配列との間にリンカーを含む。例えば、融合タンパク質は、異種タンパク質のＣ末端とインテインのＮ末端ドメインのＮ末端との間にリンカーを含むことができる。リンカーは、例えば、約１〜約１０アミノ酸長であってよい。一部の実施形態では、リンカーは、約１〜約５アミノ酸長であってよい。例えば、リンカーは、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸を含んでよい。一部の実施形態では、異種ポリペプチドとインテインのＮ末端ドメインのＮ末端を接触させるリンカーの最後のアミノ酸は、以下：Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＧＩｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ及びＰｒｏからなる群から選択される。

【0066】

一部の実施形態では、リンカーは、エクステイン配列を含んでもよい。一部の実施形態では、リンカーは、ネイティブエクステイン配列を含んでもよい。一部の実施形態では、エクステインは、国際公開第２０１３４５６３２号パンフレットからの配列番号４、８、１３、１７、２１、２５、３５、及び３９からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、エクステインのアミノ酸を含むリンカーは、例えば、配列番号４、８、１３、１７、２１、２５、３５、及び３９からなる群から選択される配列の最初（すなわち、Ｎ末端）の約１〜約５アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号４、８、１３、１７、２１、２５、３５、及び３９からなる群から選択される配列の約１、２、３、４、又は５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、インテインドメイン、及び天然で一緒に見出されるエクステインドメイン（例えば、ＧＰ４１−１Ｎ−インテイン及びＧＰ４１−１Ｃ−インテイン）を含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、インテインドメイン、及び天然ではその特定のインテインドメインと一緒に見出されないエクステインドメイン（本明細書では「異種エクステインドメイン」とも呼ばれる）を含む。例として、融合タンパク質は、ＧＰ４１−１インテインドメインとＩＭＰＤＨエクステインドメインを含んでもよい。

【0067】

本発明の融合タンパク質は、任意選択で、１つ又は複数の検出可能な標識をさらに含んでもよい。本発明に従う使用に好適な標識は、当技術分野で公知であり、一般に、その化学的性質によって、また直接若しくは間接的手段のいずれによるかにかかわらず、タンパク質の検出を可能にする識別可能なシグナルを賦与する任意の分子を含む。従って、例えば、融合タンパク質は、従来の方法で、例えば、特定のリポータ分子、発蛍光団、放射性材料、又は酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ）などで標識してもよい。具体的な実施形態では、融合タンパク質は、検出可能な標識として、１種又は複数種の蛍光色素を含む。検出可能な標識を含有させるようにタンパク質を修飾するための標準的方法は、当技術分野において公知である。

【0068】

様々な実施形態において、本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、こうした核酸を含む発現ベクター、及びこうした発現ベクターを担持する宿主細胞にも関する。

【0069】

ＩＩＩ．Ｎ−インテイン融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックス
Ｎ−インテインポリペプチド及びＮ−インテイン可溶化パートナーを含有する本明細書に記載の融合タンパク質は、中でも、アフィニティクロマトグラフィー用途のためのリガンドとして有用である。従って、本発明は、いくつかの実施形態では、固体支持体に結合した、Ｎ−インテインポリペプチド及びＮ−インテイン可溶化パートナーを含む融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを提供する。

【0070】

特定の実施形態では、固体支持体は、クロマトグラフィー樹脂である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、親水性ポリビニルエーテルベースを含む。親水性ポリビニルエーテルベースを含む好適なクロマトグラフィー樹脂として、限定はしないが、ＥＳＨＭＵＮＯ（登録商標）樹脂（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）がある。

【0071】

別の実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、合成メタクリレートベースのポリマー媒体（例えば、粒度が約２０〜４０μｍ又は約４０〜９０μｍのビーズ）である。一部の実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、カルボン酸官能基を有する。カルボン酸官能基を有する好適なクロマトグラフィー樹脂として、限定はしないが、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＣＯＯ樹脂（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）がある。

【0072】

本発明のアフィニティクロマトグラフィーマトリックスのための他の好適な固体支持体は、例えば、多孔性ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール及びポリスチレン、並びにこれらの誘導体（例えば、これらの合金）を挙げることができる。

【0073】

固体支持体として用いられる多孔質材料は、親水性化合物、疎水性化合物、疎油性化合物、親油性化合物又はこれらの組み合わせから成るものでもよい。多孔質材料は、ポリマー又はコポリマーから成るものであってもよい。好適な多孔質材料の例として、限定はしないが、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、例えば、ナイロン、例えば、アガロース及びセルロースなどの多糖、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、フルオロカーボンのポリマー、例えば、ポリ（テトラフルオロエチレン−コ−ペルフルオロ（アルキルビニルエーテル））、ガラス、シリカ、ジルコニア、チタニア、セラミック、金属及びそれらの合金が挙げられる。

【0074】

多孔質材料は、有機若しくは無機分子又は有機及び無機分子の組み合わせを含んでもよく、また、タンパク質と共有結合するために、反応、例えば、さらなる化学修飾のための共有結合に好適な１つ又は複数の官能基、例えば、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、カルボニル基、又はカルボン酸基を含んでもよい。別の実施形態では、多孔質材料は、官能基を含有しないが、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ酸基、カルボニル基、又はカルボン酸基などの官能基を担持する材料層で被覆することができる。

【0075】

一部の実施形態では、従来のアフィニティ分離マトリックスを使用し、これは、例えば、有機性であり、親水性表面を、使用する水性媒体に曝露する、例えば、それらの外側面、及びもし存在すれば内側面のヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボニル（−ＣＨＯ、又はＲＣＯ−Ｒ’）、カルボキサミド（−ＣＯＮＨ_２、恐らくＮ−置換形態）、アミノ（−ＮＨ_２、恐らく置換形態）、オリゴ−若しくはポリエチレンオキシ基を暴露するポリマーを基材とする。一実施形態では、ポリマーは、例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロースなどの多糖を基材としてもよく、これらは、好適な多孔性及び剛性を賦与するために、例えば、ビスエポキシド、エピハロヒドリン、臭化アリル、アリルグリシジルエーテル、１，２，３−トリハロ置換低級炭化水素と架橋されているのが有利である。別の実施形態では、固体支持体は、多孔質アガロースビーズを含む。本発明で使用される様々な支持体は、当技術分野で公知の標準的方法、例えば、Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３−３９８（１９６４）に記載されている逆懸濁ゲル化に従って容易に調製することができる。あるいは、ベースマトリックスは、市販の製品、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ ｍｅｄｉａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などであってもよい。一部の実施形態では、大規模な分離に特に有利なのは、支持体を改変してその剛性を高めることにより、高流量に対してマトリックスを好適にすることである。

【0076】

あるいは、固体支持体は、合成ポリマー、例えば、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどを基材としてもよい。ジビニル及びモノビニル置換ベンゼンを基材とするマトリックスなどの疎水性ポリマーの場合には、マトリックスの表面を親水化して、上に定義する通りの親水基を周囲の水性液体に暴露させることが多い。こうしたポリマーは、標準的方法に従って容易に生成することができ、例えば、Ａｒｓｈａｄｙ，Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０（９），７０−７５（１９８８）を参照されたい。あるいは、市販の製品、例えば、ＳＯＵＲＣＥ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＰＯＲＯＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてもよい。

【0077】

また別の実施形態では、固体支持体は、無機性質の支持体、例えば、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン及びこれらの合金を含む。無機マトリックスの表面は、好適な反応基を有するように、修飾されることが多い。例として、ＣＭジルコニア（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ−ＢｉｏＳｅｐｒａ（Ｃｅｒｇｙｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ））及びＣＰＧ（登録商標）支持体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。

【0078】

一部の実施形態では、固体支持体は、例えば、多孔性ガラスの形態のジルコニア、チタニア又はシリカを基材としてもよく、これらは、反応基を含有する、及び／又は腐食剤浸漬に耐えるように修飾して、リガンドと結合させてもよい。

【0079】

例示的な固体支持体フォーマットとして、限定はしないが、ビーズ（球状若しくは不定形）、中空繊維、中実繊維、パッド、ゲル、膜、カセット、カラム、チップ、スライド、プレート又はモノリスが挙げられる。

【0080】

一実施形態では、マトリックスのフォーマットに関して、これは、多孔質モノリスの形態をしている。別の実施形態では、マトリックスは、ビーズ状又は粒子形態をしており、これらは、多孔質又は非多孔質のいずれであってもよい。ビーズ状又は粒子形態のマトリックスは、充填層として、又は懸濁形態で使用することができる。懸濁形態は、拡張層及び純粋懸濁体として知られるものを含み、その中で粒子又はビーズは自由に移動する。モノリス、充填層及び拡張層の場合、一般に、分離手順の後に、濃度勾配を有する従来のクロマトグラフィーを行う。純粋懸濁体の場合には、バッチ方式を使用する。また、表面、チップ、キャピラリー、又はフィルタなどの形態の固体支持体を使用してもよい。

【0081】

マトリックスはまた、カートリッジ内の膜の形態であってもよい。膜は、フラットシート、螺旋、又は中空繊維形態であってよい。

【0082】

一実施形態では、固体支持体は、可溶性支持体、例えば、可溶性ポリマー又は水溶性ポリマーであってよい。例示的な可溶性支持体として、限定はしないが、バイオ−ポリマー、例えば、タンパク質又は核酸が挙げられる。ポリマーはまた、合成可溶性ポリマーであってもよく、このようなポリマーとして、例えば、限定はしないが、負荷電基（カルボン酸若しくはスルホン酸）、正荷電基（第４級アミン、第３級アミン、第２級若しくは第１級基）、疎水基（フェニル若しくはブチル基）、親水基（ヒドロキシル、若しくはアミノ基）又はこれらの組み合わせを含有するポリマーが挙げられる。例示的な合成可溶性ポリマーは、国際公開第２００８０９１７４０号パンフレット及び米国特許出願公開第２００８０２５５０２７号明細書に見出すことができ、これらの各々の教示内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0083】

一部の実施形態では、固体支持体は、アビジン分子（例えば、ストレプトアビジン）を含み、また、Ｎ−インテイン融合タンパク質は、ビオチンタグ（例えば、融合タンパク質の可溶化パートナーと共有結合するビオチン分子）を含むことができ、これにより、融合タンパク質と固体支持体の結合が、アビジン及びビオチン分子の相互作用によって達成されるようにする。

【0084】

本発明のＮ−インテイン融合タンパク質は、融合タンパク質のただ１つの部位（１点結合）又は融合タンパク質の２つ以上の部位（多点結合）において固体支持体に結合することができる。融合タンパク質を固体支持体に結合させる場合、融合タンパク質のＮ−インテインポリペプチドは、固体支持体から離れる方向に配向される。例えば、ユニークな反応性アミノ酸基（例えば、システイン残基）を、可溶化パートナー内で、Ｎ−インテインドメインの活性領域とは離れた位置に配置して、Ｎ−インテインが固体支持体から離れる方向に向かうことを確実にすることができる。

【0085】

固体支持体との結合に関与する融合タンパク質中の部位（例えば、ユニークなアミノ酸基）は、Ｎ−インテイン可溶化パートナーにだけ配置されるのが好ましい。従って、これを達成するためには、ユニークな反応性部位をもたらすアミノ酸（例えば、システイン）を除去するように、例えば、Ｎ−インテイン中のどこで行うかにかかわらず、こうしたアミノ酸の欠失又は置換により、Ｎ−インテインポリペプチドを修飾することが必要な場合もある。タンパク質中のアミノ酸を欠失させる、又は置換する方法は、当技術分野で公知である。

【0086】

固定化したＮ−インテイン融合タンパク質は、カラム又はマルチウェルクロマトグラフィー分離に好適である場合もあるし、又は磁界の適用により溶液から融合タンパク質を捕捉できるように、常磁性であってもよい。

【0087】

支持体、例えば、当技術分野で公知の、及び本明細書に記載のものなどの固体支持体に本明細書に記載の融合タンパク質を結合するために、任意の好適な技術を用いることができる。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質中に存在する例えば、チオール、アミノ及び／又はカルボキシ基を使用する従来のカップリング技術によって、支持体に結合させてもよい。例えば、ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などは、公知のカップリング試薬である。一部の実施形態では、支持体と融合タンパク質との間にスペーサを導入することにより、融合タンパク質の利用可能性を改善すると共に、融合タンパク質と支持体の化学的結合を促進する。

【0088】

Ｎ−インテイン融合タンパク質と支持体の結合は、そのほとんどが当技術分野で公知の多種多様な方法、並びに本明細書に記載の方法によって達成することができる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５１−１３６（１９９２）を参照されたい。例えば、タンパク質リガンドは、固体支持体又はタンパク質リガンドのいずれかの面で、活性基を介して固体支持体に結合させることができ、こうした基として、例えば、ヒドロキシル、チオール、エポキシド、アミノ、カルボニル、エポキシド、又はカルボン酸基が挙げられる。結合は、公知の化学、例えば、限定はしないが、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、エポキシ（ビスオキシラン）活性化、及び還元的アミノ化の使用が挙げられる。

【0089】

特定の実施形態では、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）又はアミノ（−ＮＨ_２）基を有するクロマトグラフィー樹脂（例えば、ビーズ）を使用する。別の実施形態では、クロマトグラフィー樹脂はまた、ヒドロキシル（−ＯＨ）基及び／又はその他の官能基を有し、これらは、−ＣＯＯＨ又は−ＮＨ_２又は−ＯＨに変換することができる。

【0090】

一部の実施形態では、チオール指向性タンパク質カップリングを用いて、本発明のＮ−インテイン融合タンパク質を固体支持体に結合させることができる。チオール指向タンパク質カップリングは、文献に記載されている。例えば、Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ １８６，ｐｐ．５５８−５６１（１９８９）を参照されたい。マレイミドは、ｐＨ７．０〜７．５でチオール基と選択的に反応することがわかっている。ｐＨ＞８では、これらは、アミン基とも反応する可能性があり、さらには、加水分解する傾向がある（Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００８；Ｉａｎ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｔ．Ｚ．Ｓｐｅｎｃｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０１０）。ｐＨ８未満の場合、ヨードアセトアミドも、チオール基に対して高度に選択性である（Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００８；Ｉａｎ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｔ．Ｚ．Ｓｐｅｎｃｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２０１０）。しかしながら、ヨードアセトアミドは、本来、光不安定性であり、市販されているリンカーのほとんどが不水溶性であり、及び／又は非常に高価である。チオール基に対するヨードアセトアミドの選択性は、マレイミドほど優れていないため、大規模製造には、一般にマレイミドの方が適している。

【0091】

一部の実施形態では、Ｎ−インテインリガンドは、可溶化ドメイン内の単一の利用可能なスルフヒドリル基を介して、ＡＭＰ又はヨードアセトアミド活性化ＦＧ−ＣＯＯに結合することができる。誘導体化樹脂のリガンド密度は、溶液からのＣ−インテインを担持する融合タンパク質の欠失を測定することにより計算することができる。これまで、１ｍｇ／リットルのＦＧ−ＣＯＯという最適化されていないＮ−インテインリガンド密度が達成されている。

【0092】

また、多くのタンパク質をエポキシ活性化樹脂、例えば、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）エポキシに結合させることにも成功している。エポキシドは、第１級アミノ基、ヒドロキシル、及びスルフヒドリル基と反応して、非常に安定したアフィニティマトリックスをもたらす（ＰＶ Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ １９９３．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７：４３９−５２）。

【0093】

一部の実施形態では、介在リンカーを介して、タンパク質リガンドを固体支持体に結合させることができる。リンカーは、連結部分に結合する少なくとも１つの官能基を含んでもよい。連結部分は、官能基に結合することができる任意の分子を含み得る。例えば、連結部分は、アルキル、アルケニル又はアルキニル基のいずれかを含み得る。連結部分は、１〜３０炭素原子の炭素鎖を含み得る。一部の実施形態では、リンカーは、３０超の炭素原子から成るものでもよい。連結部分は、窒素、酸素及びイオウなどの少なくとも１個のヘテロ原子を含んでもよい。連結部分は、分岐鎖、非分岐鎖又は環状鎖から成るものでもよい。連結部分は、２つ以上の官能基で置換してもよい。

【0094】

固体支持体にタンパク質リガンドを結合させるための適切なバッファー条件の選択は、十分に当業者の技能の範囲内である。好適なバッファーとしては、炭酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩及び酢酸塩バッファーなどの非アミン含有バッファーが挙げられる。結合化学を用いる場合には、バッファーの塩濃度は、使用する結合基に左右されることになる。例えば、塩濃度は、５ｎＭ〜１００ｍＭの範囲であってもよい。荷電種を用いる場合には、塩濃度は、少なくとも５ｎＭで、しかも０．１Ｍ未満、少なくとも５ｎＭで、しかも０．０１Ｍ未満、少なくとも５ｎＭで、しかも０．００１Ｍ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、塩濃度は、０．０１Ｍであってもよい。疎水性種を使用する場合には、高い塩濃度が通常望ましい。従って、塩濃度は、０．００１Ｍ超、０．０１Ｍ超、又は０．１Ｍ超であってよい。

【0095】

一部の実施形態では、結合化学を用いる場合、０℃〜９９℃の温度で反応を実施する。いくつかの実施形態では、反応方法は、６０℃未満、４０℃未満、２０℃未満、又は１０℃未満の温度で実施する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、約４℃で実施する。別の実施形態では、反応方法は、２０℃の温度で実施する。

【0096】

他の実施形態では、Ｎ−インテイン融合タンパク質は、適切な架橋又は縮合剤と組み合わせた様々な改変剤（膜、ポリマー表面、蛍光又は他の検出標識）と合わせて、Ｎ−インテイン融合タンパク質と改変剤を含有する共有結合付加物を形成することができる。

【0097】

ＩＶ．本発明のインテインベースの融合タンパク質を使用する方法
Ｎ−インテインポリペプチドとＮ−インテイン可溶化パートナーを含有する本明細書に記載の融合タンパク質、及びこうした融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスは、中でも、以下に詳しく説明するように、アフィニティ精製、アフィニティ精製での使用に好適な活性分断インテイン複合体のスクリーニング方法、並びにペプチド切断及び連結方法に有用である。

【0098】

従って、本発明は、いくつかの実施形態において、サンプル中の標的分子をアフィニティ精製する方法に関する。この実施形態の一態様において、本方法は、ａ）ポリペプチド結合により標的分子に結合したＣ−インテインポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を含有するサンプルを用意するステップ；ｂ）第２の融合タンパク質を含むアフィニティクロマトグラフィーマトリックスと上記サンプルを接触させるステップ（ここで、第２の融合タンパク質は、第１の融合タンパク質中のＣ−インテインポリペプチドが第２の融合タンパク質中のＮ−インテインポリペプチドと選択的に結合して、不活性であるインテイン複合体を形成する条件下で、Ｎ−インテインポリペプチドの可溶性を促進するＮ−インテイン可溶化パートナーと、ペプチド結合により結合したＮ−インテインポリペプチドを含む）；ｃ）不活性インテイン複合体を含有するアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを洗浄して、非結合混入物を除去するステップ；ｄ）インテイン複合体が活性となり、Ｃ−インテインポリペプチドから標的分子を切断する条件に、インテイン複合体を曝露するステップ；並びにｅ）切断された標的分子を回収するステップを含む。

【0099】

Ｎ−インテイン可溶化パートナーに結合したＮ−インテインポリペプチドを含む融合タンパク質は、本明細書の他所で記載されるＮ−インテイン融合タンパク質のいずれかを含み得る。

【0100】

標的分子に結合したＣ−インテインポリペプチドを含む融合タンパク質を含有するサンプルは、任意の好適なサンプル（例えば、生物学的サンプル）であってよい。一実施形態では、サンプルは、粗タンパク質調製物又は混合物（例えば、細胞抽出物）である。

【0101】

標的分子は、目的とする任意の生体分子であってよい。例として、目的の生体分子は、タンパク質及び生体分子集合体（例えば、組換えＤＮＡ技術により生成される）、例えば、ホルモン（例えば、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、組織プラスミノーゲン活性化因子）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びｍＡｂ−誘導体（例えば、二重特異性ｍＡｂ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、サメ（ｓｈａｒｋ）及びラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体）、スカフォールド由来治療薬（例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アンチカリン）、治療用酵素（例えば、αガラクトシダーゼＡ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ）、毒素（例えば、ボツリヌス菌、ＣＲＭ１９７、リシン）、組換え体ワクチン（例えば、炭疽、ジフテリア、破傷風、肺炎、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス）、ウイルス様粒子（例えば、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマ、インフルエンザ、パルボウイルス、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）ウイルス）、並びに工業用酵素（例えば、パパイン、ブロメライン、トリプシン、プロテイナーゼＫ、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（商標）酵素、ＤＥＮＥＲＡＳＥ（商標）酵素、ウレアーゼ、ペプシンなど）及び診断試薬（例えば、グルコース及び乳酸デヒドロゲナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、制限酵素、ハイブリドーマ由来酵素など）。特定の実施形態では、標的分子は、治療標的に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。

【0102】

使用する特定のインテイン（例えば、シアノバクテリア（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種（Ｓｓｐ）ＤｎａＢ、ノストック・パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）（Ｎｐｕ）ＤｎａＥ、ＧＰ４１−１）に応じて、ロード、洗浄、切断、及び溶離条件は大きく異なる。それでもなお、特定のインテインの大まかなロード、洗浄、切断、及び溶離条件は、当業者が容易に決定することができる。特定のインテインについて好適な条件（例えば、カオトロピック及び還元／酸化剤の濃度、金属イオン（例えば、亜鉛、カルシウム、ストロンチウム、マグネシウム、マンガン）、体積排除剤（例えば、ＰＥＧ、ＰＶＰ、デキストラン）、デタージェント、塩、温度、及びｐＨ）として、限定はしないが、以下に記載する条件が挙げられる。特に、ＧＰ４１−１インテインの場合、活性は、６〜１０の範囲のｐＨに比較的左右されないことがわかっている（Ｃａｒｖａｊａｌ−Ｖａｌｌｅｊｏｓ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：２８６８６−２８６９６（２０１２））。

【0103】

所与のインテインについて、第１融合タンパク質中のＣ−インテインポリペプチドが、第２融合タンパク質中のＮ−インテインポリペプチドに選択的に結合して、触媒不活性のインテイン複合体を形成する条件は、当業者が決定することができる。一般に、工業規模のプロセスの場合、クロマトグラフィー分離工程中の温度の変更は、これにより、全体を通してカラム及び充填温度を均一にすることを確実にするために、時間のかかる平衡ステップが生じることから、非実用的と考えられる。例示的な結合条件として、以下のものがある：ａ）約４〜２５℃の範囲の温度、及び５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ＝７を含むバッファー（例えば、ＧＰ４１−１の場合、Ｃａｒｖａｊａｌ−Ｖａｌｌｅｊｏｓ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：２８６８６−２８６９６（２０１２）を参照）；ｂ）約４〜２５℃の温度範囲、及び５０ｍＭ ＮａＡｃ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝５を含むバッファー（例えば、ＤｎａＢインテインの場合、Ｌｕ Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ，１２１８：２５５３−２５６０（２０１１）を参照）；並びにｃ）約４〜２５℃の範囲の温度、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．５ｍｍ 塩化亜鉛、ｐＨ＝８を含むバッファー（例えば、Ｎｐｕ ＤｎａＥの場合、Ｇｕａｎ Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１０：２４７１−２４８１（２０１３）を参照)。

【0104】

同様に、インテイン複合体の触媒活性を促進する条件は、使用されるインテインに応じて変動し得るが、これは、当業者が決定することができる。触媒インテイン活性を促進するための例示的な条件として、以下のもがある：ａ）５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｂ）０．３Ｍ Ｌ−アルギニン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ＝６．５を含むバッファー；及びｃ）０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ＝８．０を含むバッファー。

【0105】

この実施形態の態様では、本方法は、本発明のアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを洗浄、再生、及び／又は保存するステップをさらに含み得る。典型的には、アフィニティクロマトグラフィーマトリックスは、マトリックスの組成に応じて、アルカリ又は酸性条件下で洗浄することができる。アフィニティマトリックスを洗浄、再生、及び／又は保存するのに好適な条件は、当業者が決定することができる。

【0106】

本発明の例示的なアフィニティ精製方法を本明細書に開示する図１及び実施例１０に記載する。

【0107】

また別の実施形態では、本発明は、アフィニティ精製での使用に好適な、触媒活性インテイン複合体のスクリーニング方法に関する。この実施形態の一態様では、本方法は、ａ）ポリペプチド結合により標的分子に結合したＣ−インテインポリペプチドを含む第１の融合タンパク質と、ポリペプチド結合によりＮ−インテイン可溶化パートナーと結合したＮ−インテインポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を、第１の融合タンパク質中のＣ−インテインポリペプチドが第２の融合タンパク質中のＮ−インテインポリペプチドと選択的に結合して、インテイン複合体を形成する条件下で、接触させるステップ；並びにｂ）インテイン活性を支持する条件下で、標的分子が、Ｃ−インテインポリペプチドから切断されているか否かを決定するステップを含み、ここで、切断された標的分子の存在は、触媒活性インテイン複合体を示している。

【0108】

この実施形態の方法に使用するＮ−インテイン及びＣ−インテインは、相補的分断インテインの任意のペア、例えば、本明細書に開示する分断インテインペア（例えば、ＧＰ４１−１Ｎ−インテイン及びＣ−インテイン）であってよい。

【0109】

第１融合タンパク質中のＣ−インテインポリペプチドが、第２融合タンパク質中のＮ−インテインポリペプチドに選択的に結合して、触媒として不活性のインテイン複合体を形成する条件は、使用するインテインに応じて変動し得るが、これは、当業者が決定することができる。例示的な条件として、以下のもがある：ａ）約４〜２５℃の範囲の温度、及び１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ 塩化亜鉛、ｐＨ＝９を含むバッファー；ｂ）約４〜２５℃の温度範囲、５０ｍＭ ＮａＡｃ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝５を含むバッファー；及びｃ）約４〜２５℃の範囲の温度、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８を含むバッファー。

【0110】

標的分子は、任意の好適な標的分子であってよく、例えば、限定はしないが、本明細書に開示する標的分子のいずれかが挙げられる。

【実施例】

【0111】

実施例１：ＧＰ４１−１Ｎ−インテインの候補可溶化パートナーの特性決定の選択
４０００＋既知エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）タンパク質のセットを使用し、以下の基準を用いて、試験のために７つの可溶化パートナー（表２を参照、配列番号１１〜１５、１９、２０）を選択した：
（１）選択タンパク質は、システイン残基が欠失している；
（２）選択タンパク質は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に過剰発現させると、可溶性であると予測された；
（３）選択タンパク質は、１１ｋＤａ未満の分子量を有した；
（４）選択タンパク質は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、分泌されないと予測されたか、又は分泌されないことがわかっていた；
（５）タンパク質相互作用に関する情報が入手可能である場合、選択タンパク質は、多量体ではなく単量体であった；
（６）タンパク質機能に関する情報が入手可能である場合、選択タンパク質は、天然では調節性又は毒性ではなかった、すなわち、主要細胞経路の制御に関与しないか、又はそれら（例えば、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ）を過剰発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の死を引き起こす傾向もなかった；並びに
（７）既知のＮＭＲ又はＸ線結晶構造を有するタンパク質が優先された。

【0112】

表３は、この試験で評価されたインテイン及び可溶化パートナーについての物理的性質（分子量（ｍｗ）、等電ｐＨ（ｐＩ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における可溶性発現の確率、タンパク質が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に分泌されると予測されるか否か、疎水度大規模平均（Ｇｒａｎｄ Ａｖｅｒａｇｅ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）（ＧＲＡＶＹ）、及び脂肪族指数（Ａｌｉｐｈａｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ）（ＡＩ））を掲載するが、これらは、一般に入手可能なアルゴリズムを用いて計算されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における過剰発現時の可溶性の確率と分泌の見込みの予測を除いて、物理的パラメータの全ては、バイオインフォマティクスツールのＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＥｘＰａＳｙスイートの一部である、オンラインＰｒｏｔＰａｒａｍツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）を用いて計算された。分子量は、ダルトンで表示されている。各タンパク質のｐＩは、タンパク質が正味電荷を持たないｐＨ値である。等電点（ｐＩ）は、タンパク質の正味電荷がゼロであるｐＨである。タンパク質の場合、等電点は、主として、次の７つの荷電アミノ酸に左右される：グルタミン酸（δ−カルボキシル基）、アスパラギン酸（β−カルボキシル基）、システイン（チオール基）、チロシン（フェノール基）、ヒスチジン（イミダゾール側鎖）、リシン（ε−アンモニウム基）及びアルギニン（グアニジニウム基）。それに加えて、タンパク質末端基（ＮＨ２ｉＣＯＯＨ）の電荷を考慮に入れるべきである。これらの各々は、ｐＫと呼ばれる固有の酸解離定数を有する。さらに、タンパク質の正味電荷は、溶液（バッファー）ｐＨと密接な関係にある。このことを念頭に置いて、ヘンダーソン・ハッセルバッハ（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ）の式を用いて、特定のｐＨにおけるタンパク質電荷を計算することができる。

【0113】

【表6】

【0114】

線状ポリペプチド配列の疎水度大規模平均（Ｇｒａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）（ＧＲＡＶＹ）（Ｋｙｔｅ Ｊａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ＲＦ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５，１９８２）は、全アミノ酸の疎水度値の合計を配列中の残基の数で割ったものとして計算する。正のスコアが高いほど、高い疎水性を示す。この計算は、カイト・ドーリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）スケールに基づいて行う。ＧＲＡＶＹは、タンパクの疎水特性を表す簡単な方法である。

【0115】

【表7】

【0116】

タンパク質の脂肪族指数（Ｉｋａｉ，ＡＪ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８８：１８９５，１９８０）は、脂肪族側鎖（アラニン、バリン、イソロイシン、及びロイシン）が占める相対量として定義される。これは、球状タンパク質の熱安定性増加についてのプラスの因子とみなされ得る。タンパク質の脂肪族指数は、次の式に従って計算される：脂肪族指数＝Ｘ（Ａｌａ）＋ａ＊Ｘ（Ｖａｌ）＋ｂ＊（Ｘ（Ｉｌｅ）＋Ｘ（Ｌｅｕ））。＊係数ａ及びｂは、アラニンの側鎖に対するバリン側鎖（ａ＝２．９）及びＬｅｕ／Ｉｌｅ側鎖（ｂ＝３．９）の相対量である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における過剰発現後に可溶性産物を産生する確率は、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＨａｒｒｉｓｏｎのアルゴリズム（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ＤＬ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＲＧ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４４３，１９９１）を用いて計算することができる。他の利用可能なアルゴリズムが、必ずしも同様の結果をもたらすとは限らない。

【0117】

タンパク質が、機能性分泌シグナルを含むか否かの予測は、デンマーク工科大学生物学配列解析センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｔ ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）から入手可能なＳｉｇｎａｌＰ ４．１アルゴリズムを用いて実施することができる。

【0118】

【表8】

【0119】

実施例２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質発現構築物の作製
可溶化パートナー候補４６、２０６及び２４６のコード配列を担持するプラスミド構築物を、ＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣのアミノ又はカルボキシ末端アミノ酸のいずれかを介して、ＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣのコード配列と融合させた後、ＤＮＡ２．０からのｐＪ４１４のバージョンに挿入した。これらの構築物を、従来の方法を用いて、コンピテントＢＬ２１ＤＥ３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した後、アンピシリン抵抗性コロニーを単離した。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）を用いて、予想サイズのタンパク質の産生を確認した。

【0120】

６つの構築物の各々の形質転換体は、対応する構築物によるＢＬ２１ＤＥ３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のグリセロールストックからの、１００ｕｇのアンピシリン／ｍＬ含有２ｍＬＬＢ（ＬＢ＋Ａｍｐ）中で培養した。この前接種材料を３７℃及び２５０ｒｐｍで一晩増殖させた後、これを用いて、２００ｍＬのＬＢ＋Ａｍｐ（１％接種材料）を接種した。この培養物を、３７℃及び２５０ｒｐｍで、０．５〜０．６のＯＤ_６００までインキュベートした。０．４ｍＭ ＩＰＴＧの添加によりタンパク質発現を誘導した。温度を３０℃まで下げてから、この温度及び２５０ｒｐｍで５時間にわたり培養物をインキュベートした。その後、遠心分離（４５００ｇ、２５分、４℃）により細胞を回収し、上清を廃棄して、さらなるタンパク質精製のために細胞ペレットを−８０℃で維持した。

【0121】

試験基質タンパク質ＣＩＮＴ＿ＴＲＸのコード領域をｐＳＡＢＡＤ９２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＨＭ０７０２４７）にクローン化した後、コンピテントＢＬ２１ＤＥ３細胞に形質転換した。成功した形質転換体をＬｕｒｉａブロス及び５０ｕｇ／ｍｌカルベネシリン（ＬＢ＋Ｃ）上で単離した。ＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて、予想サイズのタンパク質の産生を確認した。３つのＢＬ２１クローン／構築物の各々のグリセロールストックは、−８０℃で保存する。

【0122】

少量の凍結ＢＬ２１グリセロールストックを用いて、３７℃、２５０ｒｐｍでＬＢ＋Ｃ中の５ｍｌの培養物に接種した。翌日、０．１ｍｌの一晩増殖させた培養物を用いて、１０ｍｌのＬＢ＋Ｃに接種し、この培養物を、３７℃及び２５０ｒｐｍで、０．６〜０．９のＯＤ_６００までインキュベートした。０．０２％アラビノースを用いて、２８℃、２５０ｒｐｍで５時間にわたり培養物を誘導した。誘導後、遠心分離（４５００ｇ、２５分、４℃）により細胞を回収し、上清を廃棄して、さらなるタンパク質精製のために細胞ペレットを−８０℃で維持した。

【0123】

実施例３：可溶性及び不溶性比並びに発現タンパク質の総量の決定
各構築物について発現収率及び可溶性：不溶性比を決定するために、前述の通り培養した同等のバイオマスに対応する増殖培養物のアリコートを４℃、５０００ｇで１５分間遠心分離した。培養物上澄みを廃棄した後、５０ｍＭトリスｐＨ８、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ−１００から構成される可溶化バッファー２００ｕＬ中に細胞を再懸濁させた。細胞を音波処理（１０バースト×３、Ｂｒａｎｓｏｎ ２５０ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ、各シリーズの間に、サンプルを冷却させるための時間を置く）により破砕した。可溶性及び不溶性画分を分離するために、サンプルを１６０００ｇ及び４℃で１０分間遠心分離した。可溶性画分は個別のチューブに取り出し、不溶性画分は、音波処理により２００μＬの同じ可溶化バッファー中に再懸濁させた（前の音波処理と同じパラメータを用いて）。

【0124】

基準として定量ＢＳＡの曲線を使用する比重分析を用いて、クマシー染色後のＳＤＳＰＡＧＥゲル後に、細胞ライゼート中の組換えタンパク質を定量した。ＢＳＡ標準曲線（０．２から１．２ｕｇまでの６ポイント）と一緒に、クローン当たり３つの異なるサンプル量をロードした。「Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ」（ＢｉｏＲａｄ）ソフトウェアを用いて、比重法によりタンパク質バンドの強度を決定した。ＢＳＡ／組換えタンパク質分子量比を考慮して、各タンパク質について補正率を適用する。

【0125】

精製タンパク質の濃度は、算出された消光係数と、２８０ｎｍで計算されたそれらの吸光度を用いて決定した。

【0126】

実施例４：発現タンパク質の精製
全体を通じて切断基質として用いたＣ−インテイン融合タンパク質ＣＩＮＴ＿ＴＲＸを精製するために、このタンパク質を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５×Ｃｅｌｌｙｔｉｃ Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び２０ｍＭイミダゾールを含有するバッファー中に再懸濁させた。３０％パルス活性化サイクルで、細胞を氷上で２０分間音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ ２５０ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）後、４℃、３４５００ｇで３０分間遠心分離した。Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムで、製造者の指示に従い、上澄みから可溶性Ｃ−インテイン融合タンパク質を精製した。精製Ｃ−インテイン融合タンパク質を含有する溶離画分をプールし、２ｍＭ ＤＴＴの存在下、切断バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール；ＣＢ）に対して透析した後、−８０℃でアリコート中に保存した。

【0127】

Ｎ−インテイン融合物は、発現構築物を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からネイティブ条件下で精製した。細胞ペレットを、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するバッファー中に再懸濁させた。次に、３０％パルス活性化サイクルで、細胞を氷上で２０分間音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ ２５０ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）後、４℃、３４５００ｇで３０分間遠心分離した。前述した通り、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ ＨＰカラムでＮ−インテイン融合物の可溶性画分を精製した。精製タンパク質を含有する溶離画分をプールし、２ｍＭ ＤＴＴの存在下、ＣＢに対して透析した後、−８０℃でアリコート中に保存した。

【0128】

実施例５：発現タンパク質の切断速度の決定
以前記載されている（Ｃａｒｖａｊａｌ−Ｖａｌｌｅｊｏｓ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：２８６８６，２０１２）通り、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応を実施した。手短には、精製したＮ−及びＣ−融合タンパク質を、対応する試験条件下で個別に、短時間プレインキュベートした。切断反応は、５μＭの等モル濃度の切断バッファー中で、相補的Ｎ−及びＣ−インテイン融合タンパク質を混合することによって開始した。本発明に関する実験の場合、切断パートナーは、常にＣＩＮＴ＿ＴＲＸであった。特定の時間間隔でアリコートを取り出し、８％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）及び２０％β−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）を含有するＳＤＳ ＰＡＧＥバッファーの添加により反応を停止した後、５分間沸騰させた。ＳＤＳ ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳからの４〜１２％ビス−トリスゲル）により、反応生成物を定量した後、クマシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）（Ｓｉｇｍａ）染色を実施した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（ＢｉｏＲａｄ）プログラムを用いて、比重法によりタンパク質バンドの相対強度を決定した。対応する分子量に従って、様々な切断生成物を正規化した。切断生成物とインテインタグ付き前駆体ＣＩＮＴ＿ＴＲＸの比から、タンパク質切断のパーセンテージを計算した。

【0129】

ＧｒａＦｉｔソフトウェア（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）を用いて、データを式Ｐ＝Ｐ_０（１−ｅ^−ｋｔ）（Ｐは、時点ｔで形成された切断Ｃ−インテイン融合生成物の量であり、Ｐ_０は、得ることができる切断生成物の最大量（収量）であり、ｅは、オイラー（Ｅｕｌｅｒ）の定数であり、ｋは、観測された速度である）に当てはめることにより、定速（ｋｏｂｓ）を決定した。２つの相補的インテイン断片の高速結合後に、Ｃ−インテイン融合タンパク質の切断が、単分子反応と同様に進行するという仮定で、全ての反応物は、不可逆の、前定常状態、及び一次プロセスとして処理した。

【0130】

実施例６：ＮＩＮＴ可溶化パートナーの最適位置及び特性の決定
可溶化パートナー候補のＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣ融合物は、全ての可溶化パートナーについて、考えられる配向の両方で（すなわち、ＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣのＮ又はＣ末端のいずれかに融合させた）作製した。得られる６つの構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させて、産生されたタンパク質を、前述した通りに、産生総量及び可溶性に関して分析した。さらに、各構築物からのタンパク質を精製し、精製ＣＩＮＴ＿ＴＲＸを基質として用いて、切断の速度を決定した。この分析の結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。ＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣのＮ末端への可溶化パートナーの融合は、試験した全ての構築物について、Ｃ末端への可溶化パートナーの融合よりも高い量のタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生するが、切断速度を測定すると、この傾向の逆転が見られる。これらの試験を実施中に、様々な分断インテイン系を用いて発表された論文は、可溶化パートナーの位置とＮ−インテイン及びＮ−インテイン活性の間の類似の関係を実証したが、これは、融合物が反対の極性で作製されるとき、エクステインドメイン同士の立体障害の可能性が大きくなることを示す、既知の構造情報を参照して説明された（Ｇｕａｎ Ｄ，Ｒａｍｉｒｅｚ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｚ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１０：２４７１，２０１３）。

【0131】

この研究は延長されて、サイズ及び等電点（ｐＩ）に関して以前明らかにされた可溶化パートナーとは異なる、追加の可溶化パートナー５１、１３８、３４２、及び３６８（表２及び３参照）を含んだ。これらの全ては、可溶化パートナー４６、２０６、及び２４６で以前示される通り、ＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣのカルボキシル末端に融合して、最も高い触媒活性を有する融合物をもたらした。これらの構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させ、精製してから、前述した通り、切断速度について分析した。これらの分析結果を図３に示す。可溶化パートナー２４６が最も高い活性を有するが、触媒活性と可溶性発現の間の最良の妥協点は、可溶化パートナー１３８に観察された。

【0132】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現中のＮ−インテインの可溶化のために有効となる可溶化パートナー１３８の特性を理解するために、表３の候補可溶化の各々について算出したタンパク質パラメータを表４に示す可溶性力価と相関させた。これらのパラメータのいずれも、発現全体と強力に相関していなかったが、ＡＩ及びＧＲＡＶＹ値の両方が、可溶性力価との負の相関を示した。

【0133】

実施例７：ＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣにおけるシステイン残基の置換のためのアミノ酸の選択
天然の供給源から単離したＧＰ４１−１Ｎ−インテインは、３つのシステイン残基を含有するが、１つは、本発明の親構築物であるＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣを賦与するために、事前に置換されている。ＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣ内に含まれる、残り２つのシステイン残基は置換のためにターゲティングして、ユニークな反応性システイン残基を、後の固定化又は他の修飾のために可溶化ドメインに導入することができるようにした。

【0134】

ＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣ中の２つのシステイン残基を置換して、やはり安定且つ機能性のインテインをもたらすことができるアミノ酸を同定するために、いくつかの系統樹解析を実施し、そこで、タンパク質配列をアラインメントして、配列番号１の６５位及び８９位に天然に存在するアミノ酸変異体を調べた。類似インテインのこれらの位置に存在する他のアミノ酸による、ＧＰ４１−１における天然の内部システインの置換は、天然の選択がこれらの変異体が天然に持続することを可能していることから、機能性及び／又は安定なＧＰ４１−１変異体をもたらすと予想された。ＧＰ４１インテインクラスのＮ−インテイン（１、２、３、４、５、６；Ｄａｓｓａ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３７：２５６０−２５７３（２００９））でこうした解析を実施すると、配列番号１の６５位及び８９位の２つのシステイン残基が、高度に保存されていることが判明し、これは、これらのシステインが、ＧＰ４１−１インテインの活性及び／又は安定性に有害に作用し得ることを示唆している。しかし、さらにやや分岐したタンパク質（インテイン機能を含んでも、又は含まなくてもよい）を含むように解析を拡張すれば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リン酸レギュロンのｐｈｏＨ遺伝子に対して相同性を有する多くのタンパク質が同定される。ＢＬＡＳＴ検索ツールを用いて、ＧｅｎＢａｎｋからおよそ百の相同体が得られ、フリーウエアツールのＢｉｏＥｄｉｔ（Ｈａｌｌ ＴＡ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４１：９５，１９９９）を用いたＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムでアラインメントした。この解析の結果を表５に示すが、ここで、位置の番号付与は、ＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣ（配列番号２）に基づく。この解析から、トレオニン及びアラニンが、６５位に頻繁に出現し、リシン、メチオニン及びアスパラギン酸が、８９位に頻繁に出現することが明らかであり、これは、これらの天然に存在するアミノ酸による天然のシステインの置換が、安定したタンパク質をもたらすであろうことを示している。

【0135】

実施例８：最適な特性のＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣアミノ酸のスクリーニング
表４に示すアミノ酸置換を含むＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣ（配列番号２）に基づく構築物を作製、発現、精製した後、前述した通り、触媒活性について特性決定した。

【0136】

各構築物から作製されたＮ−インテイン融合タンパク質の切断速度測定値を図６に示す。ＮＩＮＴΔＡ＿ＣＣ親（＋ｃｎｔ）を比較のために左側に示す。６５位及び８９位のアミノ酸を図面の下に示す。６５位のトレオニン残基は、親より有意に高い活性を有するＮ−インテイン融合タンパク質をもたらす。試験した構築物のうち、６５位のトレオニンと８９位のメチオニンを有するＮ−インテイン融合物は、親構築物より３倍速い触媒速度を有する構築物をもたらした。

【0137】

【表9】

【0138】

実施例９：可溶化パートナー１３８へのユニークなシステイン残基の導入のための戦略
その触媒活性を低減することなく、Ｎ−インテイン融合タンパク質の化学修飾を可能にするために、最終的な修飾の部位は、Ｎ−インテインの活性部位から可能な限り離れて除去すべきである。可溶化パートナー１３８についての構造情報がない場合、適切な手法は、ＧＰ４１−１Ｎ−インテインについて上に記載したように（実施例７を参照）、系統樹解析を実施し、高い可変性を示すタンパク質の領域を決定し、システインの挿入によってこれらを修飾した後、得られる全ての構築物を試験することである。しかしながら、可溶化パートナー１３８（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ構想１ＲＹＫ）について入手可能なＮＭＲ溶液構造は存在し、これは図７に示す。タンパク質は、４つのαヘリックスドメインを含み、球状であり、長い非構造コイルを有し、これが、Ｎ−インテインのカルボキシ末端との連結（丸で囲んだ領域；Ｎ−インテインは示していない）を形成する。黄色のハイライトで示すループ領域ＧＫＬ及びＧＹＱは、可溶化パートナー１３８（１３８＿ＧＫＬ２２ＧＣＫＬ（配列番号１６）、１３８＿ＧＹＱ４８ＧＣＹＱ（配列番号１７）、及び１３８＿ＧＹＱ４８ＧＣＧＹＱ（配列番号１８））の新たなバージョン（

【化2】

）を作製するためのシステイン残基挿入のためにターゲティングされた。

【0139】

実施例１０：Ｎ−インテイン融合タンパク質（リガンド）とクロマトグラフィー樹脂の結合
ＧＰ４１−１変異体ＮＩＮＴΔＡ＿ＴＭ（配列番号６）のカルボキシル末端に融合した可溶化パートナー１３８＿ＧＹＱ４８ＧＣＧＹＱ（配列番号１８）を含有する可溶性融合タンパク質を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてコード核酸から発現させた後、従来の分離方法を用いて、混入細胞タンパク質から分離する。

【0140】

次に、標準的方法を用いて、融合タンパク質の可溶化パートナードメインにおけるユニークな反応性システイン部位を介して、精製Ｎ−インテイン融合タンパク質をＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）又はＥＳＨＭＵＮＯ（登録商標）クロマトグラフィー樹脂（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と結合させる。

【0141】

活性化のための調製では、５ｍｌの湿潤ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＣＯＯ（ＦＧ−ＣＯＯ）樹脂をＤＩ水で１回、次にブフナー（Ｂｕｅｃｈｎｅｒ）漏斗中のｐＨ＝６．５の１５０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳバッファー）で３回洗浄した後、ショット（Ｓｃｈｏｔｔ）ガラス瓶に移す。０．１０３５ｇｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を３ｍｌのＭＥＳバッファーに溶解させた後、ＦＧ−ＣＯＯに添加する。混合物を室温で２分間インキュベートする。４ｍｌのＭＥＳバッファー中の０．１３７２ｇｍのＮ−（３−アミノプロピル）マレイミドトリフルオロ酢酸（ＡＰＭ）の溶液を添加して、混合物を攪拌しながら、室温で一晩保持する。１Ｍ ＮａＯＨの滴定により、ｐＨを６．５に維持する。保存のために、１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有の２０％エタノール中に活性化樹脂を再懸濁させた後、冷蔵庫内で保存する。官能化の分析のために、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するｐＨ＝７．２の１００ｍＭリン酸バッファー（ＰＯバッファー）中で、活性化樹脂の５０％ｖ／ｖ溶液を調製する。０．５ｍｌの活性化ＦＧ−ＣＯＯを、ＰＯバッファー中の１ｍＬの２０４ｕＭ塩酸システイン溶液と混合した後、１時間にわたりインキュベートする。負の対照として、ＡＭＰによって活性化していないＦＧ−ＣＯＯのサンプルを並行して処理する。次に、樹脂をＰＯバッファーで入念に洗浄してから、０．５Ｍ ＮａＣｌ中に再懸濁させて、エルマン（Ｅｌｌｍａｎｎ）試薬（５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸））及び公知の方法を用いた遊離スルフヒドリル基の分析に付す。この分析を用いて、乾燥樹脂１グラム当たり４００μモルのリガンド密度を決定する。

【0142】

実施例１１：インテイン融合タンパク質を用いたチオレドキシンのアフィニティ精製
本明細書の実施例１０に従って調製した、固定化Ｎ−インテイン融合タンパク質を含有する樹脂を標準的クロマトグラフィーカラムに充填した後、ＧＰ４１−１ Ｃ−インテインのカルボキシ末端に融合した標的分子チオレドキシンを含む、ＣＩＮＴ＿ＴＲＸ融合タンパク質（配列番号１０）を含有する粗タンパク質混合物を、固定化Ｎ−インテイン融合タンパク質含有のカラムに４〜２５℃の温度で添加した後、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ＝９を含むロードバッファーを用いて、インテイン触媒作用を起こさずに、ＧＰ４１−１ Ｎ−及びＣ−インテインドメイン同士の強力な相互作用を可能にする。

【0143】

続いて、デタージェント（例えば、トリトンＸ１００、ＮＤ４０）又は塩（例えば、酢酸塩、リン酸塩、塩化物、ナトリウム、アンモニウム、又はカリウムの硫酸塩）を含有する洗浄バッファーを用いて、ロードしたカラムを洗浄することにより、非結合及び弱結合の混入物を除去する。

【0144】

Ｃ−インテイン融合タンパク質のチオレドキシン部分の切断及び溶離は、切断バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の添加により達成される。次に、切断されたチオレドキシンを溶出液中で回収する。

【0145】

【表10】

【0146】

【表11】

【0147】

その他の例示的Ｎ−インテイン配列
ｇｐ４１−２
ＣＬＤＬＫＴＱＶＱＴＱＱＧＬＫＤＩＳＮＩＱＶＧＤＬＶＬ（配列番号４２）
ｇｐ４１−３
ＣＬＤＬＫＴＱＶＱＴＰＱＧＭＫＥＩＳＮＩＱＶＧＤＬＶＬＳＮＴＧＹＮＥＶＬＮＶＦＰＫＳＫＫＫＳ（配列番号４３）
ｇｐ４１−４

【化3】

ｇｐ４１−５

【化4】

ｇｐ４１−６
ＳＹＫＩＴＬＥＤＧＫＥＩＩＣＳＥＥＨＬＦＰＴＱＮＧＥＶＮＩＫＧＧＬＫＥＧＭＣＬＹＶＫＥ（配列番号４６）
ｇｐ４１−７
ＭＭＬＫＫＩＬＫＩＥＥＬＤＥＲＥＬＩＤＩＥＶＳＧＮＨ（配列番号４７）
ＮｒｄＡ−１

【化5】

ＮｒｄＡ−４

【化6】

ＮｒｄＡ−５

【化7】

ＮｒｄＡ−６
ＹＶＣＳＲＤＤＴＴＧＦＫＬＩＣＴＰＤＨＭＩＹＴＫＮＲＧＹＩＭＡＫＹＬＫＥＤＤＥＬＬＩＮＥＩＨＬＰＴ（配列番号５１）
ＮｒｄＪ−１

【化8】

ＮｒｄＪ−２

【化9】

【0148】

その他の例示的Ｃ−インテイン配列
ｇｐ４１−９
ＭＩＭＫＮＲＥＲＦＩＴＥＫＩＬＮＩＥＥＩＤＤＤＬＴＶＤＩＧＭＤＮＥＤＨＹＦＶＡＮＤＩＬＴＨＮＴ（配列番号５４）
ＩＭＰＤＨ−２
ＭＫＦＴＬＥＰＩＴＫＩＤＳＹＥＶＴＡＥＰＶＹＤＩＥＶＥＮＤＨＳＦＣＶＥＮＧＦＶＶＨＮＳ（配列番号５５）
ＩＭＰＤＨ−３
ＭＫＦＫＬＶＥＩＴＳＫＥＴＦＮＹＳＧＱ−ＶＨＤＬＴＶＥＤＤＨＳＹＳＩ−ＮＮＩＶＶＨＮＳ（配列番号５６）、
ＮｒｄＡ−３
ＭＬＫＩＥＹＬＥＥＥＩＰＶＹＤＩＴＶＥＥＴＨＮＦＦＡＮＤＩＬＩＨＮＣ（配列番号５７）、
ＮｒｄＡ−５
ＭＬＫＩＥＹＬＥＥＥＩＰＶＹＤＩＴＶＥＧＴＨＮＬＡＹＳＬ（配列番号５８）、
ＮｒｄＡ−６
ＭＧＩＫＩＲＫＬＥＱＮＲＶＹＤＩＫＶＥＫＩＩＩＦＣＮＮＩＬＶＨＮＣ（配列番号５９）、及び
ＮｒｄＪ−１
ＭＥＡＫＴＹＩＧＫＬＫＳＲＫＩＶＳＮＥＤＴＹＤＩＱＴＳＴＨＮＦＦＡＮＤＩＬＶＨＮＳ（配列番号６０）。

【0149】

本明細書で引用した全ての特許、公開出願及び参照文献の関連教示内容は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。

【0150】

別に記載のない限り、特許請求の範囲を含め、本明細書で使用される成分の量、発現条件、処理条件などの表す全ての数は、全ての事例で、用語「約」によって修正されるものとして理解すべきである。従って、反対のことが記載されていない限り、数値パラメータは、近似値であり、本発明により取得することが求められる所望の特性に応じて変動し得る。別に記載のない限り、要素のシリーズに先立つ用語「少なくとも」は、上記シリーズの全ての要素を指すものと理解すべきである。当業者であれば、常用的な実験を用いるだけで、本明細書に記載する本発明の具体的な実施形態の多くの同等物を認識するか、又は確認することができよう。こうした同等物は、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。

【0151】

本発明をその実施形態例を参照にしながら具体的に示し、説明してきたが、当業者には、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、それらの形態及び詳細に様々な変更が加えられ得ることを理解されよう。
にこれらを使用する方法に関する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]