特許 6351629 点眼用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6351629

(24)【登録日】2018年6月15日

(45)【発行日】2018年7月4日

(54)【発明の名称】点眼用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/505 20060101AFI20180625BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20180625BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20180625BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20180625BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20180625BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20180625BHJP

   A61K 31/57 20060101ALI20180625BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20180625BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/505

   A61K47/32

   A61K9/08

   A61K47/02

   A61K47/10

   A61K45/00

   A61K31/57

   A61P27/02

【請求項の数】15

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2015-555360(P2015-555360)

(86)(22)【出願日】2014年1月24日

(65)【公表番号】特表2016-506931(P2016-506931A)

(43)【公表日】2016年3月7日

(86)【国際出願番号】US2014013036

(87)【国際公開番号】WO2014117010

(87)【国際公開日】20140731

【審査請求日】2017年1月24日

(31)【優先権主張番号】61/756,306

(32)【優先日】2013年1月24日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504294145

【氏名又は名称】ライジェル ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】レン ホン

(72)【発明者】

【氏名】サン トーマス

【審査官】 菊池 美香

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭５７−０６７５１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５０７４１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５２５３８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５００９７７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／５０５

Ａ６１Ｋ ９／０８

Ａ６１Ｋ ３１／５７

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ４７／０２

Ａ６１Ｋ ４７／１０

Ａ６１Ｋ ４７／３２

Ａ６１Ｐ ２７／０２

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

(i) 40,000〜60,000の平均分子量を有しかつ400 ppm未満の過酸化物を有する5％ w/vから15％ w/vまでのポリビニルピロリドン；ならびに
(ii) 式

を有する化合物、もしくはその薬学的に許容される塩、N-酸化物、もしくは溶媒和物の有効量、および／または
式

を有する化合物、もしくはその薬学的に許容される塩、N-酸化物、もしくは溶媒和物の有効量
を含む、点眼用組成物。

【請求項2】

緩衝剤および等張化剤をさらに含む、請求項1記載の組成物。

【請求項3】

緩衝剤が20 mM〜30 mMの範囲の濃度を有する、請求項2記載の組成物。

【請求項4】

緩衝剤が、リン酸二水素ナトリウム一水和物およびリン酸水素二ナトリウム無水物を含むリン酸緩衝剤である、請求項3記載の組成物。

【請求項5】

7.0〜8.0の範囲のpHを有する、請求項1記載の組成物。

【請求項6】

等張化剤が、230 mOsm/kg〜320 mOsm/kgの重量オスモル濃度を提供するのに十分な量で存在する、請求項2記載の組成物。

【請求項7】

等張化剤が、1％ w/v〜2％ w/vの範囲の量で存在する、請求項2記載の組成物。

【請求項8】

等張化剤がプロピレングリコールである、請求項2記載の組成物。

【請求項9】

少なくとも一つの追加的な薬理学的活性化合物をさらに含む、請求項1記載の組成物。

【請求項10】

少なくとも一つの追加的な薬理学的活性化合物が、眼の疾患または障害を処置、改善、および／または予防することが可能である、請求項9記載の組成物。

【請求項11】

少なくとも一つの追加的な薬理学的活性化合物が、コルチコステロイド、抗ヒスタミン薬、抗生物質、抗炎症薬、抗ウイルス薬、緑内障薬、またはそれらの組み合わせである、請求項9記載の組成物。

【請求項12】

20 mM〜30 mMの濃度を有する緩衝剤および1％ w/v〜2％ w/vの等張化剤をさらに含む、請求項1記載の組成物。

【請求項13】

7.5％ w/vのポリビニルピロリドンK30を含み、かつ25 mMの濃度を有するリン酸二水素ナトリウム一水和物／リン酸水素二ナトリウム無水物緩衝剤および1.6％ w/vのプロピレングリコールをさらに含む、請求項1記載の組成物。

【請求項14】

(i) 40,000〜60,000の平均分子量を有しかつ400 ppm未満の過酸化物を有する5％ w/vから15％までのポリビニルピロリドン；ならびに
(ii) 式

を有する化合物、もしくはその薬学的に許容される塩、N-酸化物、もしくは溶媒和物の有効量、および／または
式

を有する化合物、もしくはその薬学的に許容される塩、N-酸化物、もしくは溶媒和物の有効量
を含む、眼の疾患または障害の処置に使用するための組成物。

【請求項15】

緩衝剤および等張化剤をさらに含む、請求項14記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. §119(e)の元、2013年1月24日付で出願された米国特許仮出願第61/756,306号のものである先行する出願日の恩典を主張するものであり、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【0002】

分野
本開示は、点眼に適した組成物の具体例、ならびに眼の疾患または障害を処置するための該組成物の作製方法および使用に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
JAK1、JAK2、JAK3およびTYK2を含むJAKキナーゼ(JAnusキナーゼ)は細胞質タンパク質チロシンキナーゼのファミリーである。各々のJAKキナーゼはある特定のサイトカインの受容体に選択性を示すが、複数のJAKキナーゼが特定のサイトカインまたはシグナル伝達経路によって影響を受けうる。研究から、JAK3はさまざまなサイトカイン受容体の共通のガンマ(γc)鎖と相互作用することが示唆されている。JAK3はとりわけ、受容体に選択的に結合し、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15およびIL-21に対するサイトカインシグナル伝達経路の一部である。JAK1は、数ある中でもサイトカインIL-2、IL-4、IL-7、IL-9およびIL-21に対する受容体と相互作用し、その一方でJAK2は、数ある中でもIL-9およびTNF-αに対する受容体と相互作用する。ある特定のサイトカインのその受容体への結合によって(例えば、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15およびIL-21)、受容体のオリゴマー形成が起き、その結果、会合したJAKキナーゼの細胞質側末端を近接させ、JAKキナーゼのチロシン残基のトランスリン酸化を促進することになる。このトランスリン酸化がJAKキナーゼの活性化をもたらす。

【0004】

リン酸化されたJAKキナーゼは、さまざまなSTAT (シグナル伝達性転写因子（Signal Transducer and Activator of Transcription)）タンパク質を結合する。チロシン残基のリン酸化により活性化されるDNA結合タンパク質であるSTATタンパク質は、シグナル伝達分子としても転写因子としても機能し、サイトカイン応答遺伝子のプロモーターに存在する特異的なDNA配列に最終的に結合する。JAK/STATシグナル伝達は、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、例えば移植片(同種移植片)拒絶反応、関節リウマチ、筋萎縮性側索硬化症および多発性硬化症、眼の疾患または障害などの多くの異常な免疫応答の媒介に関与しているほか、白血病およびリンパ腫などの固形悪性病変および血液悪性病変にも関与している。

【0005】

目の疾患および／または障害(例えば、乾性角膜炎または乾性角結膜炎)は特に広まっている臨床的問題の代表である。ドライアイ症候群は蒸発機能不全または涙欠乏のいずれかによって一般に引き起こされる。蒸発機能不全は正常涙腺機能の存在下で生じるが、しかしマイボーム腺機能不全、正常眼瞼機能の喪失、または眼表面の原因(コンタクトレンズの使用もしくは眼アレルギーなど)によって引き起こされる場合がある。涙欠乏は、シェーグレン症候群によって引き起こされ得るが、非シェーグレン症候群もまた、涙欠乏を引き起こす。

【0006】

ドライアイ症状の一般的な原因はシェーグレン症候群であり、これは自己免疫障害であり、これにより、免疫細胞が、涙液および唾液を作る腺を攻撃してこれを損なう。この障害の際だった症状はドライマウスおよびドライアイであるが、シェーグレン症候群が一般的な乾燥を引き起こすことが知られていることから、これらの症状はそれほど限定されていない。シェーグレン症候群は米国において100〜400万人に影響を与えており、この疾患を発症する可能性は女性の方が9倍高い。シェーグレン症候群は原発性病態として、または全身性エリテマトーデス(「紅斑性狼瘡」)もしくは関節リウマチなどの、他の自己免疫疾患に関連した続発性障害として起こりうる。ドライアイ症候群は酒さなどの他の多く見られる障害に関連して認められることが多い。ドライアイ症候群はまた、イソトレチノイン、利尿薬、三環系抗うつ薬、鎮静薬、降圧薬、経口避妊薬、抗ヒスタミン薬、鼻充血除去薬および多くの他のものなどの多くの医薬によく見られる副作用である。

【発明の概要】

【0007】

概要
ある開示される態様は、点眼用組成物に関する。特定の開示される態様において、組成物は、2％ w/vより多いポリビニルピロリドンを含む。いくつかの態様において、ポリビニルピロリドンは、2％ w/vより多くから約15％ w/vまでの範囲の、例えば約5％ w/v〜約10％ w/vの量で存在してもよい。開示される組成物において使用されうるポリビニルピロリドンの例示的な量は、約7.5％ w/vである。いくつかの態様において、ポリビニルピロリドンは、約400 ppm未満の過酸化物を含有する。ポリビニルピロリドンは、約40,000〜少なくとも約60,000の平均分子量を有しうる。

【0008】

開示される組成物の具体例は、緩衝剤および等張化剤などの一つまたは複数の追加的な構成要素をさらに含むことができる。例示的な緩衝剤は、リン酸二水素ナトリウム一水和物、リン酸水素二ナトリウム無水物、またはそれらの組み合わせなどの、リン酸緩衝剤である。いくつかの態様において、緩衝剤は、約20 mM〜約30 mMの濃度を有する。開示される組成物のpHは、典型的に、約7.0〜約8.0の間に維持され、例示的態様は7.5のpHを有する。例示的な等張化剤は、プロピレングリコールである。等張化剤は、約230 mOsm/kg〜約320 mOsm/kgの標的重量オスモル濃度を達成するのに十分な量で存在してもよい。いくつかの態様において、標的重量オスモル濃度は、約250 mOsm/kg〜約320 mOsm/kgの範囲である。望ましい重量オスモル濃度を達成するために、組成物のいくつかの具体例は、約1％ w/v〜約2％ w/vの等張化剤を含み、例示的態様は1.6％ w/vを含む。

【0009】

いくつかの態様において、組成物は、少なくとも一つの薬理学的活性剤をさらに含むことができる。薬理学的活性剤は、眼の疾患または障害を処置、改善、および／または予防できる化合物であることができる。いくつかの態様において、薬理学的活性剤は、化合物Iおよび／または化合物II、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、もしくはN-酸化物などの、本明細書において開示される化合物であることができる。他の開示される態様において、それは、コルチコステロイド、抗ヒスタミン薬、抗生物質、抗炎症薬、抗ウイルス薬、緑内障薬、またはそれらの組み合わせから選択することができる。これらの薬理学的活性剤の組み合わせもまた、使用されてもよい。

【0010】

一つの例示的な組成物は、約7.5％ w/vのK30グレードポリビニルピロリドンと、約25 mMの濃度を有し、かつリン酸二水素ナトリウム一水和物およびリン酸水素二ナトリウム無水物を含むリン酸緩衝剤と、1.6％ w/vのプロピレングリコールとを含む。

【0011】

開示される組成物のいくつかの具体例は、化合物Iおよび／または化合物II（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、もしくはN-酸化物）を含む。

これらの組成物の具体例は、溶解剤、緩衝剤、等張化剤、およびそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。そのような組成物の例示的具体例は、約2 mg/mL〜約 5 mg/mLの化合物I（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物）、約1％ w/v〜約10％ w/vのK30グレードポリビニルピロリドン、約25 mMの濃度を有するリン酸緩衝剤、および300 mOsm/kgの標的オスモル濃度量を達成するのに十分な量のプロピレングリコールを含むことができる。

【0012】

特定の開示される態様において、化合物Iおよび／またはIIは、プロドラッグ（例えば、化合物Iが一つまたは複数の追加的なプロ基を含むことができる）、薬学的に許容される塩、N-酸化物、および水和物などの代替形態において存在してもよい。ある特定の態様において、化合物Iおよび／またはIIは、コリン塩として製剤化されてもよい。化合物Iおよび／またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、もしくはN-酸化物）の有効量は、約1 mg/mL〜約25 mg/mLの範囲であってもよい。ある特定の態様において、化合物Iおよび／またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、もしくはN-酸化物）の有効量は、約2 mg/mL〜約20 mg/mLの範囲である。

【0013】

一つの態様において、そのような化合物Iの組成物は、約0.5％までの化合物IIを含有する。特定の開示される態様において、開示される組成物の物理的および化学的特性は、例え0.5％までの化合物IIであっても、化合物IIの析出を最小化または阻止するように最適化される。しかしながら、開示される組成物は、約300μg/mL未満の量などの適当に限定された量において、この化合物を含んでもよい。

【0014】

開示される組成物は、眼の疾患または障害を処置するのに有用である。例えば、開示される組成物によって処置可能な眼の疾患には、ドライアイ症候群、糖尿病性網膜症、黄斑変性症 ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、緑内障、酒さ、およびそれらの組み合わせが含まれる。特定の開示される態様において、眼の疾患または障害は乾性角膜炎である。別の態様において、開示される組成物は、毛髪の成長を促進するのに有用である。そのように、組成物は、眉毛および／または睫毛の貧毛症を含む脱毛症および貧毛症を、それらの成長を増大させることによって処置するのに有用である。

【0015】

開示される組成物の例示的具体例は、乾性角膜炎を処置するのに使用され、2％ w/vより多い約15％ w/vまでの溶解剤、緩衝剤、および等張化剤を含む。他の態様において、乾性角膜炎は、有効量の、化合物Iおよび／またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、もしくはN-酸化物）、溶解剤、緩衝剤、等張化剤、またはそれらの組み合わせを含む、開示される組成物を用いて処置されてもよい。

【0016】

組成物を投与するための方法もまた、本明細書において開示される。いくつかの態様において、方法は、2％ w/vより多い約15％ w/vまでのポリビニルピロリドンを含む組成物を投与する段階を含む。そのような態様はまた、緩衝剤および等張化剤をさらに含む組成物を投与する段階を含むことができる。他の態様において、方法は、有効量の、化合物Iおよび／またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、もしくはN-酸化物）、溶解剤、緩衝剤、等張化剤、またはそれらの組み合わせを含む組成物を投与する段階に関する。

【0017】

いくつかの態様において、方法は、有効量の開示される組成物の具体例を提供する段階、および開示される組成物を対象の眼に適用する段階を含む。特定の開示される態様において、適用する段階は、局所的な配置または注射を介して、対象の眼を開示される組成物の具体例に曝露することを含む。局所的な配置は、一滴または複数滴の開示される組成物を対象の眼の上に置くことを含みうる。さらに他の態様において、方法は、一つまたは複数の非薬物介入を行う段階をさらに含んでもよい。一つまたは複数の非薬物介入は、涙点閉鎖、角膜を覆う、液体で満たされた層を作り出すスクレラルまたはセミスクレラルコンタクトレンズの対象への取り付け、およびそれらの組み合わせから選択されてもよい。方法は、コルチコステロイド、抗ヒスタミン薬、抗生物質、抗炎症薬、抗ウイルス薬、緑内障薬、またはそれらの組み合わせなどの、一つまたは複数の薬理学的活性剤を投与する段階をさらに含んでもよい。

【0018】

[本発明1001]
2％ w/vより多い約15％ w/vまでのポリビニルピロリドンを含む、点眼用組成物。
[本発明1002]
ポリビニルピロリドンが約40,000〜約60,000の平均分子量を有する、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
ポリビニルピロリドンが約400 ppm未満の過酸化物を含有する、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
ポリビニルピロリドンがK30グレードである、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
ポリビニルピロリドンが、2％ w/vより多い約10％ w/vまでの範囲の量で存在する、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
緩衝剤および等張化剤をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
緩衝剤が約20 mM〜約30 mMの範囲の濃度を有する、本発明1006の組成物。
[本発明1008]
緩衝剤が、リン酸二水素ナトリウム一水和物およびリン酸水素二ナトリウム無水物を含むリン酸緩衝剤である、本発明1006の組成物。
[本発明1009]
約7.0〜約8.0の範囲のpHを有する、本発明1001の組成物。
[本発明1010]
等張化剤が、約230 mOsm/kg〜約320 mOsm/kgの重量オスモル濃度を提供するのに十分な量で存在する、本発明1006の組成物。
[本発明1011]
等張化剤が、約1％ w/v〜約2％ w/vの範囲の量で存在する、本発明1006の組成物。
[本発明1012]
等張化剤がプロピレングリコールである、本発明1006の組成物。
[本発明1013]
少なくとも一つの追加的な薬理学的活性化合物をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1014]
少なくとも一つの追加的な薬理学的活性化合物が、眼の疾患または障害を処置、改善、および／または予防することが可能である、本発明1013の組成物。
[本発明1015]
少なくとも一つの追加的な薬理学的活性化合物が

またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物である、本発明1013の組成物。
[本発明1016]
少なくとも一つの追加的な薬理学的活性化合物が、コルチコステロイド、抗ヒスタミン薬、抗生物質、抗炎症薬、抗ウイルス薬、緑内障薬、またはそれらの組み合わせである、本発明1013の組成物。
[本発明1017]
少なくとも一つの追加的な薬理学的活性化合物が、コルチコステロイド、抗ヒスタミン薬、抗生物質、抗炎症薬、抗ウイルス薬、緑内障薬、式

を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物、またはそれらの組み合わせである、本発明1013の組成物。
[本発明1018]
2％ w/vより多いポリビニルピロリドンを含み、かつ約20 mM〜約30 mMの濃度を有する緩衝剤および1％ w/v〜約2％ w/vの等張化剤をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1019]
約7.5％ w/vのポリビニルピロリドンK30を含み、かつ25 mMの濃度を有するリン酸二水素ナトリウム一水和物／リン酸水素二ナトリウム無水物緩衝剤および1.6％ w/vのプロピレングリコールをさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1020]
眼の疾患または障害を患っている対象への投与のために製剤化された組成物であって、有効量の、式

を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物を含む、組成物。
[本発明1021]
溶解剤、緩衝剤、等張化剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、本発明1020の組成物。
[本発明1022]
溶解剤が、プロピレングリコールモノカプリラート、オレオイルマクロゴール-6グリセリド、オレオイルポリオキシル-6グリセリド、カプリロカプロイルマクロゴール-8グリセリド、カプリロカプロイルポリオキシル-8グリセリド、プロピレングリコールモノラウラート、ポリグリセリル-3ジオレアート、ポリビニルピロリドン、またはそれらの組み合わせから選択される、本発明1020の組成物。
[本発明1023]
化合物、溶解剤、緩衝剤、および等張化剤の物理的および化学的特性が、式

を有する化合物の析出を阻止するように最適化されている、本発明1020の組成物。
[本発明1024]
式

を有する化合物が、約300μg/mL未満の量で存在する、本発明1020の組成物。
[本発明1025]
薬学的に許容される塩がコリン塩である、本発明1020の組成物。
[本発明1026]
化合物の有効量が約1 mg/mL〜約25 mg/mLの範囲である、本発明1020の組成物。
[本発明1027]
化合物の有効量が約2 mg/mL〜約20 mg/mLの範囲である、本発明1020の組成物。
[本発明1028]
眼の疾患または障害が、乾性角膜炎、糖尿病性網膜症、黄斑変性症 ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、緑内障、酒さ、またはそれらの組み合わせから選択される、本発明1020の組成物。
[本発明1029]
約1％ w/v〜約10％ w/vのポリビニルピロリドンK30を含み、かつ約20 mM〜約30 mMの濃度を有するリン酸二水素ナトリウム一水和物／リン酸水素二ナトリウム無水物緩衝剤、約1％ w/v〜約2％ w/vのプロピレングリコール、および約2 mg/mL〜約5 mg/mLの式

を有する化合物をさらに含む、本発明1020の組成物。
[本発明1030]
2％ w/vより多い約15％までのポリビニルピロリドンを含む組成物を対象に投与する段階を含む、眼の疾患または障害を処置するための方法。
[本発明1031]
ポリビニルピロリドンが緩衝剤および等張化剤と組み合わせて添加される、本発明1030の方法。
[本発明1032]
式

を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物を投与する段階をさらに含む、本発明1030の方法。
[本発明1033]
有効量の、式

を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物を含む組成物を対象に投与する段階を含む、眼の疾患または障害を処置するための方法。
[本発明1034]
前記組成物が、溶解剤、緩衝剤、等張化剤、およびそれらの組み合わせをさらに含む、本発明1033の方法。
[本発明1035]
局所的な配置または注射を介して、組成物を対象の眼に適用する段階をさらに含む、本発明1033の方法。
[本発明1036]
局所的な配置が、一滴または複数滴の組成物を対象の眼の上に置くことを含む、本発明1033の方法。
[本発明1037]
涙点閉鎖、角膜を覆う、液体で満たされた層を作り出すスクレラルもしくはセミスクレラルコンタクトレンズの対象への取り付け、またはそれらの組み合わせを行う段階をさらに含む、本発明1033の方法。
[本発明1038]
コルチコステロイド、抗ヒスタミン薬、抗生物質、抗炎症薬、抗ウイルス薬、緑内障薬、またはそれらの組み合わせから選択される、一つまたは複数の薬理学的活性剤を投与する段階をさらに含む、本発明1033の方法。
[本発明1039]
眼の疾患または障害が、ドライアイ症候群、糖尿病性網膜症、黄斑変性症 ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、緑内障、酒さ、またはそれらの組み合わせから選択される、本発明1033の方法。
[本発明1040]
対象が、眼の疾患もしくは障害を患っているか、または眼の疾患もしくは障害と関連する症状を呈している、本発明1033の方法。
本発明の前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図に関連して進行する以下の詳細な説明から、より明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】化合物Iコリン塩の溶解度に対するpHの効果を示す、pHに対する溶解度（μg/mLにおいてlog Sとして表わされる）のグラフである。

【図2】さまざまな異なる温度での、化合物Iコリン塩の化合物IIへの変換速度に対するpHの効果を示す、開示される組成物の具体例の溶液のpHに対する観察された速度係数（対数として）のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0020】

詳細な説明
I．序論
以下の用語の定義は、読者を手助けするために提供され、当業者によって公知であるものとは異なる定義を提供するようにみなされるべきではない。かつ、別の方法で記述されない限り、技術用語は、従来の使用法にしたがって使用される。

【0021】

本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、すべての目的でその全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合は、用語の説明を含み、本明細書が支配することとなる。

【0022】

本明細書において記載されるものと同様または同等の方法および材料を、開示される技術を実施または試験するために使用することができるが、適した方法および材料を、下記に記載する。材料、方法、および実施例は、例証となるだけであり、限定するようには意図されない。

【0023】

本明細書において使用される際、単数形である「一つの」、「ある」、および「その」は、文脈が明らかに別の方法で示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という単語は、文脈が明らかに別の方法で示さない限り、「および」を含むように意図される。また、本明細書において使用される際、「含む(comprise)」という用語は、「含む(include)」を意味する。したがって、「AまたはBを含む(comprising)」とは、A、B、またはAおよびBを含む(including)ことを意味する。

【0024】

本開示のさまざまな態様の概観を促進するために、以下の具体的な用語の説明が提供される。

【0025】

コルチコステロイド：コルチコステロイドは、ストレス応答、免疫応答および炎症の調節、炭水化物代謝、タンパク質異化、血中電解質レベル、ならびに挙動などの広範囲の生理システムに関与するステロイドホルモンである。コルチコステロイドの例としては、コルチゾル、プレドニゾン、およびプレドニゾロンが挙げられる。コルチコステロイドは、経口的、非経口的（例えば注射による）、または目薬での眼における直接局所投与による、を含むさまざまな方法によって対象に投与することができる。コルチコステロイドは、組成物において化合物Iおよび／またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、もしくはN-酸化物）と組み合わされてもよい。

【0026】

乾性角膜炎（または乾性角結膜炎、ドライアイ症候群）：涙液産生の減少または蒸発の増加と関連し、炎症性、非炎症性、外傷性、医原性、薬物誘導性、酒さ関連性、または特発性の起源などのさまざまな病因を有する、ドライアイ状態。

【0027】

非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）：プロスタグランジンの産生を阻害することによって働く抗炎症剤の一種。NSAIDは、抗炎症作用、鎮痛作用、および解熱作用を発揮する。NSAIDの例としては、イブプロフェン、ケトプロフェン、ピロキシカム、ナプロキセン、スリンダク、アスピリン、サブサリチル酸コリン、ジフルニサル、フェノプロフェン、インドメタシン、メクロフェナマート、サルサラート、トルメチン、およびサリチル酸マグネシウムが挙げられる。これらの剤は、経口的、非経口的（例えば注射による）、または目薬での眼における直接局所滴下による、のいずれかで対象に投与することができ、組成物において化合物Iおよび／またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、もしくはN-酸化物）と組み合わされてもよい。

【0028】

対象：ヒトおよび非ヒト対象、例えば哺乳動物を指す。

【0029】

薬学的に許容される塩：親化合物が一つまたは複数の有機および無機の対イオンを含むように修飾されている、親化合物の特定の形態。

【0030】

薬学的有効量（または治療的有効量）：特定の障害もしくは疾患または一つもしくは複数のその症状を処置、改善、または予防するため、および／または疾患もしくは障害の発生を阻止するために十分な化合物の量。

【0031】

正常涙液産生の回復：この語句は、McMonniesとHoのドライアイ質問票における14.5未満の応答スコア、試験結果（例えば、眼科学診療における当業者に知られているようなレッドフェノール、フルオレセインなど）、または指標の組み合わせなどの、標準的な眼科診療において記載されているようなドライアイ症状の停止を指す。

【0032】

涙液産生を有意に増加させる：この語句は、標準的な眼科診療によって測定されるような、涙液産生の統計的に有意な（p＜0.05など）増加を意味する。例えば、涙液産生は、シルマー試験、フェノールレッド綿糸試験、涙液層破壊時間（フルオレセイン染色によるなど）、ローズベンガル染色などによって測定することができる。

【0033】

II．化合物
眼の疾患および／または障害を処置するための化合物およびその組成物が、本明細書において開示される。特定の開示される態様において、そのような化合物は、化合物Iおよび／または化合物II（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、もしくはN-酸化物）であり、その両方が、一つまたは複数の眼の疾患または障害を処置するのに適している。いくつかの態様において、化合物Iおよび／またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、もしくはN-酸化物）は、JAK3および／またはSykキナーゼを阻害することができうる。特定の開示される態様において、化合物Iおよび／またはIIは、薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、または溶媒和物などの、特定の形態において存在してもよい。ある開示される組成物の具体例において使用される化合物は、化合物Iコリン塩などのコリン塩であることができる。

【0034】

下記に示される式を有する化合物Iは、5-フルオロ-N2-(4-メチル-3-プロピオニルアミノスルホニルフェニル)-N4-[4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミンといわれる。

【0035】

下記に示される式を有する化合物IIは、N2-(3-アミノスルホニル-4-メチルフェニル)-5-フルオロ-N4-[4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミンといわれる。

【0036】

化合物Iは、化合物IIのプロドラッグである。化合物Iは、そのプロドラッグ形態において薬理学的に活性を有しうる。他の開示される態様において、化合物Iは、同じく薬理学的に活性を有する化合物IIに変換されうる。プロピオニルプロ基が除去される機序は、重要ではなく、例えば、胃の酸性条件下での加水分解によって引き起こされうる。消化管および／または身体の組織もしくは器官に存在する酵素、例えば、エステラーゼ、アミダーゼ、リポラーゼ、ATPアーゼおよびキナーゼを含むホスファターゼ、肝臓中に見出されるシトクロムP450酵素などもまた、プロピオニル基を除去しうる。組成物の特定の具体例が、眼の疾患または障害を処置するために使用され、したがって、眼に直接投与されてもよい。そのような態様において、化合物Iは、エステラーゼなどの涙液中に見出される酵素によって化合物IIに変換されうる。いくつかの態様において、投与は、局所だけでなく、注射などもまた含みうる。

【0037】

当業者は、本明細書に開示される化合物が互変異性、立体配座異性および／または幾何異性を示しうることを理解するであろう。本発明はこのような化合物の任意の互変異性体、立体配座異性体および／または幾何異性体、ならびにこれらの種々の異なる異性体の混合物を包含することが理解されるべきである。アトロプ異性体は、単結合についての回転障害から生じる立体異性体であり、その回転に対する障壁は、配座異性体の単離を可能にするほど十分に高い(Eliel, E. L.; Wilen, S. H. Stereochemistry of Organic Compounds; Wiley & Sons: New York, 1994; Chapter 14)。アトロプ異性体は、立体性原子の非存在下において対掌性の要素を導入するので重要である。本発明の開示された態様は、例えば、2,4-ピリミジンジアミンコア構造と、それに結合された基との間の結合周囲、または例えばスルホンアミドと、それに結合されたフェニル環との間の結合周囲が制限された回転の場合のアトロプ異性体を包含する。

【0038】

本明細書に開示される化合物は、組成物中に存在し得るか、または対象に塩として投与され得る。このような塩には、薬学的な使用に適した塩(「薬学的に許容される塩」)、獣医学的な使用に適した塩などが含まれる。このような塩は、当技術分野において周知である通りに、酸または塩基に由来してもよい。

【0039】

任意の薬学的に許容される塩が用いられてもよい。特定の開示された化合物は塩基性基、例えばピリミジン窒素原子も、酸性基、例えばスルホンアミドの酸性プロトンならびに/またはピリミジンジアミン系のN2およびN4の窒素原子も有するので、これらの化合物は薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩を形成することができる。一般的に、薬学的に許容される塩は、親化合物の所望の薬理学的活性の一つまたは複数を実質的に保持し、かつヒトへの投与に適した塩である。薬学的に許容される塩としては、無機酸または有機酸とともに形成される酸付加塩が挙げられる。薬学的に許容される酸付加塩の形成に適した無機酸としては、限定ではなく例証として、ハロゲン化水素酸(例えば、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸など)、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。薬学的に許容される酸付加塩の形成に適した有機酸としては、限定ではなく例証として、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、パルミチン酸、安息香酸、3-(4-ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、アルキルスルホン酸(例えば、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、1,2-エタン-ジスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸など)、アリールスルホン酸(例えば、ベンゼンスルホン酸、4-クロロベンゼンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、4-トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸など)、4-メチルビシクロ[2.2.2]-オクタ-2-エン-1-カルボン酸、グルコヘプトン酸、3-フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ターシャリーブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸、キシナホ酸などが挙げられる。

【0040】

薬学的に許容される塩にはまた、親化合物に存在する酸性プロトンが、金属イオン（例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、もしくはアルミニウムイオン）によって置換されているか、または有機塩基と配位結合しているかのいずれかの場合に形成される塩も含まれる。本明細書において記載される例示的な薬学的に許容される無機塩には、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などが含まれる。有機塩基を用いて形成される本化合物の例示的な塩には、非限定的に、アルギニン塩およびリジン塩などのアミノ酸塩；ならびに、例としてコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、N-メチルグルカミン、モルホリン、ピペリジン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミンなどを含む、他の有機塩基から形成されるものが含まれる。

【0041】

本明細書において開示される化合物はまた、溶媒和物（例えば、水和物）、N-酸化物、コリン塩、またはそれらの組み合わせとして、対象に投与されてもよい。

【0042】

III．組成物
本明細書において開示される組成物の具体例は、非限定的に、ドライアイ症候群、糖尿病性網膜症、黄斑変性症 ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、緑内障、酒さ、およびそれらの組み合わせなどの、一つまたは複数の眼の疾患または障害を効率的に処置、改善、および／または予防する。開示される組成物の具体例は、当技術分野において一般に公知である組成物と比較して改善された特徴を示す。いくつかの態様において、改善される特徴には、開示される組成物の具体例に含まれうる化合物（例えば、化合物Iおよび／または化合物II、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物）の物理的および／または化学的安定性、ならびに高濃度のそのような化合物を投与する能力が含まれるが、これらに限定されない。追加的な態様において、望ましい生理学的特性（例えば、無菌、等張、中性pH、保存剤を含まない、など）を維持する能力を、開示される組成物の特定の具体例を用いて達成することができる。

【0043】

いくつかの態様において、開示される組成物は、ポリビニルピロリドンを含んでもよい。ポリビニルピロリドンは、典型的に、2％ w/vより多い量で存在する。ポリビニルピロリドンの最大量は、ポリビニルピロリドンが水に混和性のままであるような任意の量であることができる。使用されうるポリビニルピロリドンの最大量はまた、開示される組成物の粘性が点眼に適しているようであってもよい。特定の開示される態様において、開示される組成物の望ましい粘性は、組成物において使用されるポリビニルピロリドンの量を変えることによって、および／またはポリビニルピロリドンの分子量を変えることによって得られる。例えば、K30グレードポリビニルピロリドンなどの低分子量の重合体ポリビニルピロリドンを、多い量で使用することができる。いくつかの態様において、ポリビニルピロリドンは、約10,000〜少なくとも約60,000、例えば、約20,000〜約60,000、または30,000〜約60,000、または約40,000〜約60,000の範囲の平均分子量を有することができる。いくつかの態様において、使用されるポリビニルピロリドンは、製剤の妥当な安定性を確実にするのに十分低い過酸化物レベルを有する。一つの局面において、ポリビニルピロリドンは、約400 ppm未満の過酸化水素を含有する。

【0044】

いくつかの態様において、ポリビニルピロリドンを含む組成物は、緩衝剤および等張化剤をさらに含むことができる。緩衝剤は、リン酸二水素ナトリウム一水和物、リン酸水素二ナトリウム無水物、またはそれらの組み合わせを含む緩衝剤などの、リン酸緩衝剤であってもよい。緩衝剤は典型的に、約20 mM〜約30 mMの範囲の濃度を有する。緩衝剤は典型的に、約7.0〜約8.0などの望ましいpHを維持するように選択される。ある特定の態様において、pHは、25 mMの濃度を有するリン酸ナトリウム一水和物緩衝剤およびリン酸水素二ナトリウム無水物緩衝剤を用いて、7.5に維持される。

【0045】

等張化剤は、望ましい重量オスモル濃度を提供するように選択される。いくつかの態様において、重量オスモル濃度は、約230 mOsm/kg〜約300 mOsm/kg、例えば約250 mOsm/kg〜約300 mOsm/kgの範囲である。例示的態様において、等張化剤は、プロピレングリコールまたはグリセリンなどの、アルキレンポリオールである。他の適した等張化剤には、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの金属塩；デキストロース、マンニトールなどの炭水化物または糖アルコール；およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、開示される組成物は、約1％ w/v〜約2％ w/vのプロピレングリコールを含む。例示的態様は、1.6％のプロピレングリコールを使用する。

【0046】

例示的な組成物は、2％ w/vより多い約10％ w/vまでのK30グレードポリビニルピロリドン、約25 mMの濃度のリン酸緩衝剤（例えば、リン酸二水素ナトリウム一水和物およびリン酸水素二ナトリウム無水物）、ならびに約1.6％ w/vのプロピレングリコールを含むことができる。これらの例示的な組成物は、典型的に、約7.0〜約8.0の範囲のpHを有し；より典型的には、pHは7.5である。例示的態様は、約275（±45）mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する。

【0047】

他の態様において、開示される組成物は、化合物Iまたは化合物II（または、そのコリン塩などの適した塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物）を含んでもよい。そのような態様はまた、溶解剤、緩衝剤、等張化剤、一つもしくは複数の他の治療用化合物、賦形剤、またはそれらの組み合わせをさらに含むこともできる。

【0048】

化合物IIは、室温で約0.9μg/mLの水溶解度を有し、これが、例えば目薬中で送達されうる化合物の量を限定する。したがって、ある開示される組成物の具体例は、化合物Iのコリン塩を含む。化合物Iのコリン塩は、その遊離酸形態および化合物IIの両方よりも有意に高い水溶解度を有する。したがって、化合物Iコリン塩を、化合物IIを直接用いて送達できるよりも高い濃度の化合物IIを送達するために使用することができる。

【0049】

化合物IIを送達するのに有用な組成物の具体例について、本明細書において開示される特定の特色は、化合物の化学的および／または物理的特性が維持され、かつ有効量の化合物IIを眼に送達できるような組成物の製剤である。例えば、化合物I（または化合物Iコリン塩）は、さまざまな条件下で化合物IIに変換される。化合物IIは化合物I（および特にそのコリン塩）に比べて限定された溶解度を有するため、化合物IIが溶液から析出する可能性がある。ほとんどあるいは全く析出を示さない組成物を提供するために、この過程は好ましくは制御されるべきであり、これは、存在する化合物IIの量を限定することを必要とする。したがって、本明細書において開示される特定の態様は、化合物I（または化合物Iコリン塩）の変換および化合物IIの析出を制御することに関する。例えば、溶液の動態研究が、化合物IIに変換される化合物Iコリン塩の量を決定するために用いられている（図2）。特定の開示される態様において、約5％の化合物Iコリン塩が、pH 8を有する溶液において室温でおよそ16か月保存された場合に、化合物IIに変換されうる。この化学変換は、化合物IIの析出をもたらす可能性がある。開示される組成物のある特定種の態様において存在する化合物IIの量を最小化するためにこれらの化学的および／または物理的特性を制御することが、望ましい組成物の作製を促進することができる；しかしながら、組成物は、許容されるために化合物IIを完全に含まないことを必要とはしない。

【0050】

化合物の化学的性質を操作することによって、化合物Iおよび／または化合物IIの化学的および／または物理的特性が制御または改善されている組成物もまた、開示される。例えば、化合物Iは、強塩基と塩を形成する両性分子であり、したがって、さらに塩形態において使用されてもよい。例示的な組成物は、化合物Iのコリン塩を含み、典型的には1：1コリン塩として調製される。典型的に、コリン塩は、化合物Iおよび／または化合物IIのいずれか一つよりも高い水溶解度を有する。例えば、化合物Iのコリン塩は、水中で約9.1 mg/mLの溶解度を有する。

【0051】

コリン塩は、一水和物などの水和物を形成しうる。コリン塩の高い溶解度を維持するために、コリン塩の水和物形成は、望ましくは、限定されるかまたは実質的に阻止される。化合物Iコリン塩の一水和物形態は、pH 8.8および室温で約5 mg/mLの水溶解度を有し、これは化合物の非水和物形態ほど高くない。したがって、本明細書において開示される一つの局面は、コリン塩一水和物などのコリン塩水和物が限定されるかまたは実質的に阻止される組成物を開発することに関する。

【0052】

化合物Iおよび／または化合物IIを含む組成物の具体例における使用のための、化合物の濃度は、別の問題である。眼部用溶液においては、望ましい性能および／または組成物の特徴を依然として維持しながら、可能な限り高い濃度で治療用化合物を使用することが望ましい可能性がある。特定の開示される態様において、化合物Iおよび／または化合物II（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物）の濃度は、約1 mg/mL〜約25 mg/mL；より典型的には約2 mg/mL〜約20 mg/mL、例えば2 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL、もしくは5 mg/mL、または約5 mg/mL〜約20 mg/mLの範囲でありうる。特定の開示される態様において、開示される組成物のある特定種の態様において使用される化合物Iおよび／または化合物IIの濃度は、インビトロ、インビボ、およびエクスビボの研究などのさまざまな研究由来のデータから推定されうる。データは、動物モデル、またはヒトモデルから得られてもよい。

【0053】

無菌性、等張性、粘性、中性、純度などのような、開示される組成物の具体例の生理学的特性を維持することは、企図される別の要因である。追加的な考慮すべき事項には、保存および／または使用のためのパッケージングに対し組成物を十分安定にすることが含まれる。開示される組成物の望ましい生理学的特性を維持することは、以下のいずれかまたは複数を促進できる追加的な構成要素を含む構成要素を使用することからもたらされうる：溶解度、核形成阻害、化合物安定性、および／または適合性。

【0054】

特定の開示される態様において、開示される組成物は、以下の任意の一つまたは複数を、任意の組み合わせで含んでもよい：ポリビニルピロリドン；一つもしくは複数の溶解度増強剤；本明細書において開示されるような一つもしくは複数の等張化剤；一つもしくは複数の核形成阻害剤；および／または本明細書において開示されるような一つもしくは複数の緩衝剤。

【0055】

特定の開示される組成物は、化合物Iおよび／または化合物IIの溶解度を、そのような化合物を含む態様において増大させるための一つまたは複数の溶解度増強剤を含むことができる。例示的な溶解度増強剤には、溶解剤（例えば、プロピレングリコールモノカプリラート、オレオイルマクロゴール-6グリセリド、オレオイルポリオキシル-6グリセリド、カプリロカプロイルマクロゴール-8グリセリド、カプリロカプロイルポリオキシル-8グリセリド、プロピレングリコールモノラウラート、ポリグリセリル-3ジオレアート、ポリビニルピロリドン［本明細書においてPVPまたはポビドンということができる］、またはそれらの組み合わせ）；共溶媒（例えば、一つの適した例がPEG 400であるPEGエーテルなどの、ポリアルキレングリコール）；および界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー、ポリオキシル40ステアラート、ポリオキシルヒマシ油、チロキサポール、tritonおよびソルビタンモノラウラート、特に、PS 80、チロキサポール、MYS-40、またはそれらの組み合わせ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0056】

さまざまな量の溶解度増強剤が、化合物Iおよび／または化合物II（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物）を含む組成物の態様において使用されてもよい。例えば、ゼロより多い約15％（w/wもしくはw/v）までの、または約1％（w/wもしくはw/v）〜約15％（w/wもしくはw/v）の溶解剤（例えば、プロピレングリコールモノカプリラート、オレオイルマクロゴール-6グリセリド、オレオイルポリオキシル-6グリセリド、カプリロカプロイルマクロゴール-8グリセリド、カプリロカプロイルポリオキシル-8グリセリド、プロピレングリコールモノラウラート、ポリグリセリル-3ジオレアート、ポリビニルピロリドン）が使用されてもよいが、より典型的には約5％（w/wまたはw/v）〜約10％（w/wまたはw/v）、さらにより典型的には約7.5％（w/wまたはw/v）〜約10％（w/wまたはw/v）が使用される。共溶媒は、約0.25％（w/wまたはw/v）〜約2.5％（w/wまたはw/v）、より典型的には約0.5％（w/wまたはw/v）〜約2.25％（w/wまたはw/v）、さらにより典型的には約0.5％（w/wまたはw/v）〜約2％（w/wまたはw/v）の範囲の量で使用されてもよい。界面活性剤の量は、典型的には約0.2％（w/wまたはw/v）〜約1.5％（w/wまたはw/v）、より典型的には約0.3％（w/wまたはw/v）〜約1.25％（w/wまたはw/v）、およびさらにより典型的には約0.5％（w/wまたはw/v）〜約1％（w/wまたはw/v）の範囲である。

【0057】

開示される組成物の具体例はまた、等張化剤を含んでもよい。開示される組成物の具体例を形成するのに有用な例示的な等張化剤は、プロピレングリコール、グリセリンなどのようなアルキレンポリオール；塩化ナトリウム、塩化カリウムなどのような金属塩；デキストロース、マンニトールなどのような炭水化物または糖アルコール；およびそれらの組み合わせから選択されてもよい。特定の開示される態様において、等張化剤は、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、またはそれらの組み合わせである。特定の開示される態様において、等張化剤の量は、約1％（w/wまたはw/v）〜約2％（w/wまたはw/v）、より典型的には約1.2％（w/wまたはw/v）〜約1.8％（w/wまたはw/v）、およびさらにより典型的には約1.3％（w/wまたはw/v）〜約1.7％（w/wまたはw/v）の範囲である。

【0058】

開示される組成物の具体例は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）などの核形成阻害剤をさらに含んでもよい。核形成阻害剤は、核形成を排除、または少なくとも実質的に阻害し、したがって化合物Iおよび／または化合物IIの溶液からの析出を阻止するために使用される。使用される核形成阻害剤の量は、約0.1％（w/wまたはw/v）〜約1.5％（w/wまたはw/v）、より典型的には約0.25％（w/wまたはw/v）〜約1％（w/wまたはw/v）、およびさらにより典型的には約0.25％（w/wまたはw/v）〜約0.75％（w/wまたはw/v）の範囲であってもよい。

【0059】

開示される組成物のある特定の態様のpHもまた、化合物Iおよび／または化合物IIの溶解度を増大させるように、および／またはその最大安定性を維持するように変更されてもよい。化合物Iコリン塩の溶解度に対するpHの効果を、図1によって提供する。特定の開示される態様において、pHは、眼の刺激および不快感を回避するために、可能な限り生理学的pH（7.4）に近いように維持される。開示される組成物の具体例は、望ましいpHを維持するために緩衝剤（例えば、リン酸二水素ナトリウムまたはリン酸水素二ナトリウムなどのリン酸緩衝剤）をさらに含んでもよい。典型的には、緩衝剤の刺激作用を低減するために、緩衝剤の強度は最小化される。開示される組成物研究において使用された例示的な構成要素を、下記の表1に提供する。

【0060】

（表１）眼部用溶液組成物のための賦形剤

【0061】

ある開示される組成物についての例示的な産物プロファイルを、下記の表2に提供する。

【0062】

（表２）眼部用溶液についての標的産物プロファイル

【0063】

いくつかの態様において、化合物IIを生成させるため、および本明細書において開示されるある特定の組成物の物理的安定性に対する化合物IIの影響を評定するために、室温と比べて上昇した温度への曝露によって、組成物の具体例が、化学的および／または物理的安定性について試験されてもよい。物理的安定性は、ある期間、組成物をさまざまな温度で保存することによって、評定されてもよい。例えば、開示される組成物の具体例は、約2℃〜約8℃の範囲の温度で保存されてもよい。あるいは、化合物Iおよび／または化合物IIは、室温で保存されてもよい。特定の開示される態様において、化合物Iおよび／または化合物IIは、これらの温度のうちの任意の温度で約5週間保存されてもよい。

【0064】

開示される組成物の具体例の物理的および／または化学的安定性は、約40℃〜約100℃；より典型的には約40℃〜約80℃の範囲の温度などの、室温より上の温度で組成物を加熱することによって、試験されてもよい。組成物の具体例はまた、組成物の安定性を判定するためにさまざまな温度サイクル条件に供されてもよい。特定の温度サイクル条件には、凍結／融解条件、凍結／加熱条件、冷却／加熱条件、またはそれらの組み合わせが含まれる。さまざまな開示される組成物の具体例は、特定の温度パラメータの少なくとも一つのサイクルを用いて、凍結／融解条件（例えば、約-20℃〜室温）、凍結／加熱条件（例えば、約-20℃〜約50℃）、および冷却／加熱条件（例えば、約5℃〜約40℃）に曝露された。

【0065】

開示される組成物は、何らかの量の化合物IIが形成されているかを判定するために、ある期間、本明細書において開示される温度で加熱され、かつ／または、室温で保存されてもよい。特定の開示される態様において、開示される組成物は、約1日〜約8週間；より典型的には約3日〜約4週間、加熱されてもよい。特定の開示される態様において、化合物IIは析出せず、他の態様において、約7％未満などの最小量の析出が観察される。析出の検出は、目視観察または偏光顕微鏡法によって行ってもよい。

【0066】

IV．化合物IおよびIIならびにそれらの誘導体の合成
化合物IおよびII、ならびに塩III〜VIIを、下記の通りに、または下記の合成との類似により合成した。代替の合成は当業者によって理解されよう。

【実施例】

【0067】

実施例1

【0068】

II: N2-(3-アミノスルホニル-4-メチルフェニル)-5-フルオロ-N4-[4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミン
4-ニトロフェノール(1.00 g, 7.19 mmol)、臭化プロパルギル(トルエン中80 wt %; 0.788 mL, 7.09 mmol)およびK₂CO₃ (1.08 g, 7.84 mmol)を混ぜ合わせ、アセトン(16.0 mL)中60℃で18時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、水(200 mL)で希釈した。4-(プロパ-2-イニルオキシ)ニトロベンゼンを吸引ろ過により白色の固形物として分離した(1.12 g)。

【0069】

4-(プロパ-2-イニルオキシ)ニトロベンゼン(0.910 g, 5.13 mmol)、鉄(1.42 g, 25.3 mmol)およびNH₄Cl (0.719 g, 12.8 mmol)をEtOH/水(1:1, 55 mL)中70℃で15分間激しく撹拌した。反応混合物を珪藻土を通して熱ろ過し、真空で濃縮した。残留物を10% 2 Nアンモニア性メタノールのジクロロメタン液に懸濁し、超音波処理し、珪藻土に通してろ過した。濃縮により4-(プロパ-2-イニルオキシ)アニリンを油状物として得て、これをさらには精製せずに用いた。

【0070】

4-(プロパ-2-イニルオキシ)アニリン(0.750 g, 5.10 mmol)および2,4-ジクロロ-5-フルオロピリミジン(1.27 g, 0.760 mmol, Sigma-Aldrich of Milwaukee, Wisconsin, USAから市販されている)をMeOH/水(4:1, 35 mL)中、室温で18時間撹拌した。反応混合物をEtOAc (200 mL)で希釈し、1 N HCl (50 mL)および塩水(50 mL)で洗浄した。有機層を乾燥し(MgSO₄)、ろ過し、真空で濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサンをEtOAc:ヘキサン(1:10)に勾配)により精製して、2-クロロ-5-フルオロ-N4-[4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル]-4-ピリミジンアミンを淡褐色の固形物(0.514 g)として得た。

【0071】

2-クロロ-5-フルオロ-N4-[4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル]-4-ピリミジンアミン(0.514 g, 1.85 mmol)、3-(アミノスルホニル)-4-メチルアニリン(0.689 g, 3.70 mmol, 市販されている2-メチル-5-ニトロベンゼンスルホンアミドの還元によって作製され、または下記の通りに合成された)およびトリフルオロ酢酸(0.186 mL, 2.41 mmol)を密閉バイアル中でiPrOH (6.0 mL)と混合し、3時間100℃で加熱した。反応混合物を室温に冷却し、1 N HCl (80 mL)で希釈した。N2-(3-アミノスルホニル-4-メチルフェニル)-5-フルオロ-N4-[4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミン(II)を吸引ろ過により白色の固形物として分離した(0.703 g)。

【0072】

I: 5-フルオロ-N2-(4-メチル-3-プロピオニルアミノスルホニルフェニル)-N4-[4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミン
N2-(3-アミノスルホニル-4-メチルフェニル)-5-フルオロ-N4-[4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミン, II, (0.200 g, 0.467 mmol)、DMAP (40 mg, 0.33 mmol))およびトリエチルアミン(0.118 mL, 0.847 mmol)をTHF (6.0 mL)中で撹拌した。無水プロピオン酸(0.180 mL, 1.40 mmol)を溶液に滴加した。反応混合物を室温で終夜撹拌した。溶液を酢酸エチル(50 mL)で希釈し、水(5×25 mL)および塩水(10 mL)で洗浄した。有機層を乾燥し(MgSO₄)、ろ過し、蒸発させた。残留物を酢酸エチル(25 mL)に懸濁し、超音波処理し、固形物をろ過により集めて、5-フルオロ-N2-(4-メチル-3-プロピオニルアミノスルホニルフェニル)-N4-[4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミン, I, (0.20 g)を得た。

【0073】

III: 5-フルオロ-N2-(4-メチル-3-プロピオニルアミノスルホニルフェニル)-N4-[4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミン一ナトリウム塩
5-フルオロ-N2-(4-メチル-3-プロピオニルアミノスルホニルフェニル)-N4-[4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミン, I, (0.125 g, 0.258 mmol)をアセトニトリル(1.5 mL)および水(1.5 mL)に懸濁し、氷浴中で冷却した。1 N NaOH水溶液(0.260 mL)を滴加した。反応混合物を、透明になるまで撹拌し、グラスウールに通してろ過し、凍結乾燥してIのナトリウム塩を得た。

【0074】

以下の化合物を上記と同様の様式で作製した。

【0075】

IV: 5-フルオロ-N2-[4-メチル-3-(N-プロピオニルアミノスルホニル)フェニル]-N4-[4-(2-プロピニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミンカリウム塩

【0076】

V: 5-フルオロ-N2-[4-メチル-3-(N-プロピオニルアミノスルホニル)フェニル]-N4-[4-(2-プロピニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミンカルシウム塩

【0077】

VI: 5-フルオロ-N2-[4-メチル-3-(N-プロピオニルアミノスルホニル)フェニル]-N4-[4-(2-プロピニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミンアルギニン塩

【0078】

VII: 5-フルオロ-N2-[4-メチル-3-(N-プロピオニルアミノスルホニル)フェニル]-N4-[4-(2-プロピニルオキシ)フェニル]-2,4-ピリミジンジアミンコリン塩

【0079】

実施例2

【0080】

5-アミノ-2-メチルベンゼンスルホンアミド
4-メチルニトロベンゼン(20 mmol)をクロロスルホン酸(5.29 mL, 80 mmol)により0℃で処理し、次いで、均一溶液を室温に戻した後に、この溶液を110℃で24時間撹拌した。得られたスラリーを次いで、氷水(100 gm)に注ぎ、ジエチルエーテル(3×75 mL)で抽出し、有機相を水(75 mL)で洗浄し、次に無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次に溶媒を減圧下で除去して粗スルホニルクロリドを得て、これを酢酸エチルに溶解し、室温で終夜、水酸化アンモニウムとともに撹拌した。酢酸エチル層を分離した後に、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を混ぜ合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。得られた油状物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン、その後ヘキサン中10%、20%、最大で50%までの酢酸エチル)により精製して、3-アミノスルホニル-4-メチルニトロベンゼン、LCMS: 純度: 95%; MS (m/e): 217 (MH+)を得た。

【0081】

3-アミノスルホニル-4-メチルニトロベンゼンのジクロロメタンおよびメタノール溶液に10% Pd/Cを加え、混合物を水素雰囲気下、15分間50 psiで振盪した。混合物を珪藻土に通してろ過し、ろ過ケーキをメタノールで洗浄した。混ぜ合わせた有機溶媒を減圧下で濃縮して粗生成物を得て、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル:ヘキサン 1:1)によりさらに精製して、3-アミノスルホニル-4-メチルアニリン、LCMS: 純度: 87%; MS (m/e): 187 (MH+)を得た。

【0082】

V．開示される組成物の具体例を作製する方法
開示される組成物は、開示される構成要素を適切な量で組み合わせることによって作製されてもよい。特定の開示される態様は、化合物Iまたは化合物Iコリン塩を含む組成物に関する。いくつかの開示される態様において、組成物の具体例はまた、限定された量の化合物II（例えば、約300μg/mL未満）を含んでもよい。適した組成物の具体例はまた、化合物I、化合物Iコリン塩、または化合物IIを必要としない組成物も含む。これらの態様において、組成物は、ポリビニルピロリドンを含むことができる。いくつかの態様は、緩衝剤および等張化剤をさらに含むことができる。例示的な組成物は、ポリビニルピロリドン、リン酸緩衝剤、およびプロピレングリコールを含む。

【0083】

化合物Iおよび／または化合物IIを含む開示される組成物の具体例は、ビヒクル溶液ならびに化合物Iおよび／または化合物IIを含む溶液などの、二つの別々の溶液を調製することによって作製されてもよい。ビヒクルは、標的量の組成物の各構成要素（化合物I以外）を容器中に順次秤量すること、およびその後、溶媒、典型的には水を添加することによって作製することができる。典型的には、構成要素を混合して溶解度を確実にするために、標的量の約2/3などの、標的量未満の量の溶媒を添加する。pHは、NaOH溶液（ビヒクルをより塩基性にするため）またはHCl溶液（ビヒクルをより酸性にするため）などの適切な溶液を用いて調整してもよい。典型的には、pHを、7.5 +/- 0.1にまたは約7.6〜約7.8に調整する。撹拌およびpH調整の後で、標的最終重量を達成するために、残りの量の溶媒を添加してもよい。特定の開示される態様において、ビヒクルの密度は約1.02 g/mLである。

【0084】

ビヒクルを作製した後、化合物Iおよび／または化合物IIを含む溶液を、溶液を撹拌しながらゆっくりとビヒクルに添加してもよい。化合物Iおよび／または化合物IIが撹拌で完全には溶解しない場合、その時は音波処理を用いて溶解を促進してもよい。7.5 +/- 0.1のpHを達成するために、上記で開示される方法を用いてpHを調整してもよい。化合物Iおよび／または化合物IIを含まない態様が、さらなる操作なしで使用されてもよい。

【0085】

標的重量オスモル濃度を達成するために、組成物の重量オスモル濃度を調整してもよい。例えば、重量オスモル濃度を、308 mOsm/kgの涙液重量オスモル濃度の標的範囲内であるように調整してもよい。開示される組成物の具体例の重量オスモル濃度は、ある量のNaClまたはプロピレングリコールを添加することによって、調整してもよい。添加されるべきNaClまたはプロピレングリコールの量は、開示される組成物において使用される各構成要素の重量オスモル濃度を決定するために、下記の式Iを用いること、およびその後、標的重量オスモル濃度（例えば、300 mOsm/kgまたは275 (±45) mOsm/kg）から各構成要素の重量オスモル濃度を差し引くことによって、決定してもよい。
成分の重量オスモル濃度＝g/Lでの量×（i価）×1000/分子量＝mOsml/Kg （I）

【0086】

開示される組成物を、試料にストレスを加えることによって、化学的および／または物理的安定性について試験してもよい。この種類の試験のために使用される試料は、開示される組成物を滅菌すること、例えば、開示される組成物をミクロフィルター（例えば、0.2ミクロンフィルター）に通過させ、その後ある量の滅菌された組成物をガラスアンプルに移し、その後密封することによって、調製することができる。アンプル中に存在する試料にその後、さまざまな温度でストレスを加える。例えば、外見および不純物プロファイルを分析するために、異なる時点でストレスを加えた後、試料を分析する。

【0087】

本明細書において開示されるさまざまな賦形剤を、開示される組成物の具体例を形成するために添加することができる。これらの賦形剤は、個々の構成要素、混合物、溶液、およびまたは懸濁液として添加することができる。表3は、本明細書において開示される局所眼部用組成物を形成するのに有用な賦形剤の例を提供する。

【0088】

（表３）本眼部用組成物における使用のための例示的な賦形剤

【0089】

VI．開示される組成物を使用する方法
開示される組成物の具体例は、一つまたは複数の眼の疾患または障害を処置、改善、または予防するために使用されてもよい。いくつかの態様において、ポリビニルピロリドンを含む組成物が、そのような疾患または障害を処置するために使用されてもよい。そのような組成物は、緩衝剤および等張化剤をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、化合物Iおよび／または化合物II（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物）を含む組成物が、そのような疾患または障害を処置するために使用されてもよい。これらの態様において、化合物Iおよび／またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物）の、本明細書において開示される眼の疾患または障害を処置、改善、および／または予防する能力は、そのような化合物の、JAKキナーゼの強力かつ選択的な阻害剤として作用する能力に帰する可能性があり、JAK3を含有するサイトカインシグナル伝達経路に特に選択的でありうる。開示される組成物のある特定種の態様は、JAKキナーゼ活性、JAKキナーゼが役割を担うシグナル伝達カスケード、およびそのようなシグナル伝達カスケードによってもたらされる生物学的応答を調節または阻害するために、各種のインビトロ、インビボ、およびエクスビボの状況で使用されてもよい。例えば、開示される組成物の具体例は、インビトロまたはインビボのいずれかで、JAKキナーゼを発現する実質的に任意の細胞型（例えば、JAK3が大部分に発現している造血細胞）において、JAKキナーゼを阻害するために使用されてもよい。本明細書において開示されるある特定の組成物はまた、JAKキナーゼ、特にJAK3が役割を担うシグナル伝達カスケードを調節するために使用されてもよい。そのようなJAK依存性のシグナル伝達カスケードは、例えば、IL-4、IL-7、IL-5、IL-9、IL-15およびIL-21、またはIL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15およびIL-21受容体シグナル伝達カスケードなどの、共通γ鎖を含むサイトカイン受容体のシグナル伝達カスケードを含むが、これらに限定されない。化合物Iおよび／またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、もしくはN-酸化物）はまた、そのようなJAK依存性のシグナル伝達カスケードによって影響を受ける細胞応答または生物学的応答を調節するため、特に阻害するために、インビトロまたはインビボで使用されてもよい。そのような細胞応答または生物学的応答は、IL-4/ラモス（ramos）CD23の上方制御、IL-2媒介性のT細胞増殖などを含むが、これらに限定されない。重要なことに、化合物Iおよび／またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、もしくはN-酸化物）は、JAKキナーゼ活性によって全体的または部分的に媒介される疾患の処置または予防に対する治療的アプローチとして、インビボでJAKキナーゼを阻害するために使用されてもよい。そのような疾患は、「JAKキナーゼ媒介性疾患」といわれる。

【0090】

特定の動作理論に限定されるわけではないが、眼の障害の処置、改善、および／または予防は、少なくとも部分的に、本明細書において開示される組成物の構成要素に起因すると、現在考えられている。いくつかの態様において、眼の疾患または障害は、少なくとも部分的に、JAKキナーゼによって媒介されている可能性があり、したがって、化合物Iおよび／または化合物IIを含む組成物の具体例を用いて処置されうる。いくつかの態様において、開示される組成物の具体例を用いて処置または予防することができる眼の疾患または障害は、ドライアイ症候群、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、緑内障、交感性眼炎および（眼の）酒さを含むがこれらに限定されない、眼の疾患および障害を含む。

【0091】

乾性角結膜炎（KCS）、乾性角膜炎、乾燥症候群、または眼球乾燥症として別に知られているドライアイ症候群（DES）は、ヒトおよびいくつかの動物においてよく見出される、涙液産生の減少または涙液層蒸発の増加によって引き起こされる眼の疾患である。ブドウ膜炎または虹彩毛様体炎は、眼の中間層（「ブドウ膜」）の炎症を指し、一般的な用法においては、眼の内部に影響を与える任意の炎症過程を指しうる。アレルギー性結膜炎は、アレルギーによる結膜（眼の白色部分を覆う膜）の炎症である。緑内障は、視神経に影響を与える疾患群を指し、特徴的パターンでは網膜神経節細胞の喪失、すなわち一種の視神経症を伴う。眼内圧の上昇が、緑内障を発症する有意なリスク因子であり（22 mmHgまたは2.9 kPaより上）、炎症過程、例えばブドウ膜炎は、この眼内圧の上昇を引き起こしうる。酒さは、顔面紅斑を特徴とする慢性炎症状態であるが、眼および鼻（鼻瘤）に影響を与えうる。開示される組成物の具体例は、そのような眼の疾患および／または障害を処置するために使用されてもよい。一つの態様において、眼の疾患および／または障害は、ドライアイ症候群、糖尿病性網膜症、黄斑変性症 ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、緑内障、酒さ、およびそれらの組み合わせから選択される。一つの態様において、眼の疾患および／または障害はドライアイ症候群である。別の態様において、眼の疾患および／または障害はブドウ膜炎である。一つの態様において、眼の疾患および／または障害はアレルギー性結膜炎である。一つの態様において、眼の疾患および／または障害は緑内障である。別の態様において、眼の疾患および／または障害は酒さである。

【0092】

開示される組成物を投与するための方法の具体例が、本明細書において開示される。方法は、有効量の組成物を提供する段階、および組成物を対象の眼に適用する段階を含んでもよい。組成物の開示される具体例の任意のものが使用されてもよい。ある特定の態様において、組成物を適用する段階は、局所的な配置または注射を介して、対象の眼を組成物に曝露することを含む。局所的な配置は、典型的に、一滴または複数滴の組成物を対象の眼の上に置くことに関する。

【0093】

開示される組成物の具体例を投与する段階を含む、眼の疾患または障害を処置するための方法もまた、本明細書において開示される。方法は、一つまたは複数の非薬物介入を行う段階をさらに含んでもよい。特定の開示される態様において、一つまたは複数の非薬物介入は、涙点閉鎖、角膜を覆う、液体で満たされた層を作り出すスクレラルまたはセミスクレラルのコンタクトレンズの対象への取り付け、およびそれらの組み合わせから選択されてもよい。開示される方法はまた、コルチコステロイド、抗ヒスタミン薬、抗生物質、抗炎症薬、抗ウイルス薬、緑内障薬、およびそれらの組み合わせから選択されうる、一つまたは複数の薬理学的活性剤を投与する段階をさらに含んでもよい。

【0094】

特定の開示される態様は、本明細書において開示される組成物の具体例の任意の一つ、および、分離可能なまたは一体型の点滴器を装備していてもよい、組成物を収納する容器を含むキットに関する。

【0095】

開示される組成物の具体例は、単独で投与されてもよいし、または、眼の疾患および／または障害を処置するのに有用な他の剤と組み合わせて投与されてもよい。特定の開示される態様において、開示される組成物は、わずかな例を挙げると、ステロイド、膜安定化薬、5-リポキシゲナーゼ（5LO）阻害剤、ロイコトリエン合成および受容体阻害剤、IgEアイソタイプスイッチングまたはIgE合成、IgGアイソタイプスイッチングまたはIgG合成の阻害剤、β-アゴニスト、トリプターゼ阻害剤、アスピリン、シクロオキシゲナーゼ（COX）阻害剤、メトトレキサート、抗TNF薬、rituxan、PD4阻害剤、p38阻害剤、PDE4阻害剤、ならびに抗ヒスタミン薬などの、他の障害または疾病を処置するのに有用な剤と組み合わせて投与されてもよい。

【0096】

開示される組成物の具体例を投与する段階と組み合わせて使用されうる特定の免疫抑制療法は、例えば、メルカプトプリン；プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロンなどのコルチコステロイド；シクロホスファミドなどのアルキル化剤；シクロスポリン、シロリムス、およびタクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤；ミコフェノラート、ミコフェノール酸モフェチル、およびアザチオプリンなどのイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（IMPDH）の阻害剤；ならびに、さまざまな抗体（例えば、抗リンパ球グロブリン（ALG）、抗胸腺細胞グロブリン（ATG）、モノクローナル抗T細胞抗体（OKT3））および放射線照射を含む、レシピエントの液性免疫応答を無傷のままにしながら細胞性免疫を抑制するように設計された剤を含む。これらのさまざまな剤は、市販の薬物の形態に添付の処方情報において指定されているように（2006年版のThe Physician's Desk Reference中の処方情報もまた参照されたい）、その標準的または一般的な投与量にしたがって使用することができ、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。

【0097】

アザチオプリンは商標名AZASANでSalix Pharmaceuticals, Inc.から現在入手可能であり；メルカプトプリンは商標名PURINETHOLでGate Pharmaceuticals, Inc.から現在入手可能であり；プレドニゾンおよびプレドニゾロンはRoxane Laboratories, Inc.から現在入手可能であり；メチルプレドニゾロンはPfizerから現在入手可能であり；シロリムス（ラパマイシン）は商標名RAPAMUNEでPfizerから現在入手可能であり；タクロリムスは商標名PROGRAFでFujisawaから現在入手可能であり；シクロスポリンは商標名SANDIMMUNEでNovartisから、および商標名GENGRAFでAbbottから現在入手可能であり；ミコフェノール酸モフェチルおよびミコフェノール酸などのIMPDH阻害剤は、商標名CELLCEPTでRocheから、および商標名MYFORTICでNovartisから現在入手可能であり；アザチオプリンは商標名IMURANでGlaxo Smith Klineから現在入手可能であり；ならびに抗体は、商標名ORTHOCLONEでOrtho Biotechから、商標名SIMULECT（バシリキシマブ）でNovartisから、および商標名ZENAPAX（ダクリズマブ）でRocheから現在入手可能である。

【0098】

一つの態様において、開示される組成物の具体例は、抗ヒスタミン薬、抗生物質、抗炎症薬、抗ウイルス薬、および緑内障薬と組み合わせてか、または補助的にかのいずれかで、投与することができる。一般的な抗ヒスタミン薬は、livostin、patanol、クロモリン、alomideを含む。フェニラミンなどの、作用が弱いがより軽度の症例において非常に役立つ、眼用の処方箋が不要な抗ヒスタミン薬もある。眼において使用される一般的な抗生物質の例は、スルファセタミド、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、シプロフロキサシン、およびオフロキサシンである。コルチコステロイド（時には「ステロイド」といわれる）は、副腎によって産生される天然物質に類似しており、多種多様な眼の問題に対して非常に有効な抗炎症薬である。コルチコステロイドは、眼において安全に使用することができ、プレドニゾンのような経口ステロイドと関連するリスクの大部分を保有しない。眼を処置するために使用されるコルチコステロイドは、プレドニゾロン、フルオロメトロン、およびデキサメタゾンを含むが、これらに限定されない。眼用の非ステロイド性抗炎症薬は、イブプロフェン、ジクロフェナク、ケトロラク、およびフルルビプロフェンを含むが、これらに限定されない。一般的な抗ウイルス眼薬は、トリフルオロチミジン、アデニン、アラビノシド、およびイドクスウリジンを含むが、これらに限定されない。緑内障薬は、典型的に、失明を結果としてもたらす視神経への損傷を阻止するために、眼の内部の液圧である眼の眼内圧を低減することを試みる。これらの薬は、眼において産生される体液の量を減少させること、眼の天然の排液管を通って出る体液の量を増加させること、または体液が眼を去るための追加的な経路を提供することによって、圧力を低下させうる。これらの効果を組み合わせて、一つの薬だけで可能であるよりもさらにいっそう圧力を低下させることができるため、しばしば、一つより多い緑内障薬が同時に使用されることになる。一般的な緑内障薬は、チモロール、メチプラノロール、カルテオロール、ベタキソロール、およびレボブノロールなどのβ遮断薬；ラタノプロストなどのプロスタグランジン類似体；ピロカルピンおよびカルバコールなどのコリン作動性アゴニスト；ブロモニジンおよびiopidineなどのαアゴニスト；ドルゾラミドなどの炭酸脱水素酵素阻害剤；ならびにエピネフリンおよびジピベフリンなどのアドレナリン作動性アゴニストを含むが、これらに限定されない。

【0099】

開示される組成物の具体例で処置される対象は、眼の疾患および／または障害の存在を示唆する臨床所見または眼科検査に基づいて選抜される。例えば、対象は、眼の不快なまたは焼けるような感覚を訴える可能性がある。重症例では、羞明またはかすみ目が存在する可能性さえある。例えば、酒さ性ざ瘡、放射線療法、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、もしくは強皮症、または他の自己免疫障害の既存の診断を有する患者においては、患者の病歴もまた、ドライアイを示唆しうる。マイボーム腺炎、結膜拡張、涙液メニスカスの減少、涙液細片の増加、粘液ストランド（mucus strand）、または乾性角結膜炎と一致する染色パターンを検出するために、細隙灯での生体顕微鏡検査が典型的に行われる。10秒未満の涙液層破壊時間がまた評価されてもよく、特許請求される剤での処置から恩恵を受けると考えられる対象をより客観的に特定するために、シルマー試験が頻繁に行われる。特定の群の患者、例えば、涙腺からの涙液産生が減少している患者（例えば、免疫媒介性障害または他の障害による涙腺の機能低下を示唆するシルマー試験を有している患者）が、処置のために選抜されてもよい。

【0100】

開示される組成物は、眼の疾患を処置、改善、および／または予防するために必要とされる頻度で、目薬を用いて眼に滴下されてもよい。例えば、開示される組成物は、1日に2回、3回、4回、またはそれより多く投与されてもよい。処置は、少なくとも1週間、1か月間、または1年間継続してもよく、一部の対象において、処置は複数年に及んでもよい。

【0101】

特定の症例において、対象は、薬学的介入、非薬学的介入、またはそれらの組み合わせとの併用処置のために選抜される。例えば、涙点閉鎖が、眼からの涙液の流出を減少させるために行われ、他方で、特許請求される組成物が、涙腺の涙液産生を増加させる。さらに別の例は、角膜を覆う、液体で満たされた層を作り出すスクレラルまたはセミスクレラルコンタクトレンズの対象への取り付けである。

【0102】

開示される組成物の具体例を、ドライアイと関連する状態などの別の状態を処置する別の剤と組み合わせる組み合わせ療法もまた、提供される。いくつかの例において、対象は、ドライアイと関連する基礎障害と診断され、組み合わせ療法が対象に施与される。一つの例において、対象は、酢酸プレドニゾロン眼部用懸濁液1％などの、コルチコステロイドの局所適用に応答性であると考えられる、マイボーム腺炎を有することが見出される。開示される組成物の構成要素を、プレドニゾロン組成物中に懸濁し、1日に2〜4回眼に滴下することができる。他の例において、ドライアイは、季節性アレルギーまたは他の炎症状態と関連しており、目薬は、抗ヒスタミン薬（フェニラミン、エメダスチン、もしくはアゼラスチンなど）、充血除去剤（塩酸テトラヒドロゾリンもしくはナファゾリンなど）、または非ステロイド性抗炎症剤（ネパフェナクもしくはケトロラクなど）、コルチコステロイド（フルオロメトロンもしくはロテプレドノールなど）、肥満細胞安定剤（アゼラスチン、cromal、エメダスチン、ケトチフェン、ロドキサミド、ネドクロミル、オロパタジン、もしくはペミロラストなど）を含む組成物と共にまたはその中で投与される。ドライアイが感染性細菌状態（マイボーム腺感染症または角膜感染症など）と関連する場合には、目薬は、適切な抗生物質（シプロフロキサシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、オフロキサシン、スルファセタミド、トブラマイシン、またはモキシフロキサシンなど）を含有しうる複合組成物と共にまたはその中で投与される。ドライアイがウイルス感染症と関連する場合には、目薬は、トリフルリジンまたはイドクスウリジンなどの抗ウイルス剤を有する複合組成物と共にまたはその中で投与される。

【0103】

組み合わせ療法の別の例は、刺激された眼および毛細血管拡張症を伴う顔面紅斑を呈した後に眼の酒さと診断される対象である。対象は、開示される組成物の具体例を含む目薬で処置され、かつ対象はまた、経口抗生物質、例えばミノサイクリンなどのテトラサイクリン抗生物質で処置される。

【0104】

別の例において、対象は、ドライアイおよび別の既存の自己免疫障害を呈し、開示される組成物を含む目薬で処置される。対象はまた、漸減用量のプレドニゾロンなどの全身（例えば）経口コルチコステロイド療法で処置される。

【0105】

一つの局面において、処置は、ドライアイ症候群を患っている対象の状態の改善を結果としてもたらす。この改善は、下角膜フルオレセイン染色の低減、シルマー試験の改善、またはドライアイ症候群の兆候および／もしくは症状の改善のうちの一つまたは複数によって実証されうる。そのような改善は、例として、眼表面疾患指数、眼快適指数などを用いて測定されうる。

【0106】

VII．製造例
全般的な材料：
・化合物Iコリン塩
・ポビドン（PVPまたはポリビニルピロリドン）K30、USP/EP
・プロピレングリコール（PG）、USP/EP
・リン酸二水素ナトリウム、一水和物（NaH₂PO₄・H₂O）、USP/EP
・リン酸水素二ナトリウム、無水物（Na₂HPO₄）、USP/EP
・精製水、USP
・10N水酸化ナトリウム（NaOH）および10N塩酸（HCl）
・滅菌ポリエーテルスルホン（PES）膜フィルター（0.2μmの孔サイズ）

【0107】

装置：天秤、磁気撹拌機または機械的混合機、ガラスまたはステンレス鋼の容器、pHメーター、浸透圧計、および種々雑多な実験室用品。

【0108】

ビヒクル調製：
必要とされる量のおよそ2/3の水を適した容器中に移して、室温で撹拌した。必要とされる量のPVPを、混合しながら、少量の部分ずつ水に添加した。透明の溶液に達するまで、混合を室温で継続した。必要とされる量のNaH₂PO₄・H₂OおよびNa₂HPO₄を容器中に添加して、透明な溶液に達するまで室温で混合した。水を、標的重量の約95％になるように添加して、十分に混合した。pHを、NaOHまたはHClで7.5 +/- 0.1に調整してもよい。PG（約1.75％）を、300 +/- 10 mOsm/kgの重量オスモル濃度を達成するように添加した。十分な量の水（QS）を、標的重量を達成するように添加して（例えば、製剤の密度が1.02 g/mLであると、100 mLの製剤の標的重量は102 gである）、完全に混合した。ビヒクルを、0.2μmのPESフィルターで濾過した。

【0109】

化合物Iおよび／またはIIを含む組成物のための例示的な調製法：
製剤を、N₂保護の下で調製した。必要とされる量のおよそ2/3の水を適した容器中に移して、室温で撹拌した。必要とされる量のPVPを、混合しながら、少量の部分ずつ水に添加した。透明の溶液に達するまで、混合を室温で継続した。必要とされる量のNaH₂PO₄・H₂OおよびNa₂HPO₄を容器中に添加して、透明な溶液に達するまで室温で混合した。水を、標的重量の約95％になるように添加して、十分に混合した。必要とされる量の化合物Iコリン塩を、撹拌しながらゆっくりと容器中に添加した。撹拌速度を高に調整してもよく、透明な溶液に達するまで撹拌を室温で継続した（およそ30分）。pHを測定して、必要な場合はNaOHまたはHClで7.5 +/- 0.1に調整することができる。析出が形成した場合は、すべての析出が溶解して透明な溶液に達するまで、撹拌を継続するべきである。PG（約1.6％（w/v）のPGが、標的重量オスモル濃度を達成するために必要である）を、300 +/- 10 mOsm/kgの重量オスモル濃度を達成するように添加した。十分な量の水（QS）を、標的重量を達成するように添加して（上記のように）、完全に混合した。製剤を次に、0.2μmのPESフィルターで濾過した。

【0110】

クロマトグラフィー分析
化合物Iコリン塩の定量化のために、RAM-1038を用いる。HPLC条件は、以下のように要約される。
移動相A： 水中、0.05％ TFA
移動相B： アセトニトリル中、0.05％ TFA
HPLCカラム：Waters SymmetryShield（商標）RP18、3.5μm、4.6×150 mm
カラム温度：30℃
検出： 260 nm
実行時間： 45分
流速： 1.0 mL/分
注入量： 20μL
希釈剤： 40％アセトニトリル‐60％水
勾配プロファイル：

^＊化合物Iコリン塩の保持時間はおよそ19分である。

【0111】

特定の開示される組成物の具体例を、本明細書において開示されるような望ましい特徴への準拠について試験した。本セクションにおいて議論される例示的態様は、化合物Iのコリン塩を含む組成物に関する；しかしながら、開示される組成物はまた、本明細書において開示される任意の他の化合物を用いて作製されてもよいし、または、そのような化合物なしで（例えば、化合物Iおよび／またはII、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、N-酸化物、もしくは溶媒和物なしで）作製されてもよい。

【0112】

一つの態様において、組成物を、10 mMの化合物I（化合物Iコリン塩ではなく化合物Iに基づいて算出された濃度）を用いて10 mMリン酸緩衝剤中で作製した。変動する量のPVP K30、PEG 400、およびさまざまな界面活性剤を、化合物Iの複数の異なる溶液に添加した。さらに、開示される組成物のさまざまな具体例の重量オスモル濃度を調整するために、プロピレングリコールおよび／またはNaClを等張化剤として用いた。さまざまな具体例の完全な説明およびこの特定の具体例において使用されたその構成要素を、表4に提供する。

【0113】

（表４）評定のために調製された組成物

【0114】

この特定の態様における組成物のすべての試料を、およそ5週間、約2℃〜約8℃、または室温のいずれかで保存した。これらの条件下で、10％ PVPおよび1％の界面活性剤を含む組成物の具体例（試料11〜13）は、透明淡黄色溶液のままであった。これらの結果を、表5に提供する。

【0115】

（表５）ストレスを加えた組成物およびストレスを加えていない組成物の物理的外見

^＊PPT：観察された析出

【0116】

またこの態様において、さまざまな異なる組成物の具体例に、3日間まで80℃でストレスを加えた。もしある場合には化合物IIの析出のレベルを測定するために、これらの組成物の具体例を、ストレスを加える前および後にHPLCを用いて分析した。2％ PVP、MYS40またはPS80のいずれか、および1％ PEG400を含むこの例示的な組成物の具体例は、ストレスを加えた後に析出を示したため、これらの試料は妥当な安定性を提供しなかった。開示される組成物の他の具体例の結果を、下記の表6に提供する。

【0117】

（表６）特定の組成物の分析結果

【0118】

この一つの態様は、以下の結論を支持する結果を提供した。第一に、少なくとも5％のPVP K30が、化合物Iの10 mM（化合物Iコリン塩ではなく化合物Iに基づいて算出された濃度）での安定性を維持するために必要であることが確定された。また、界面活性剤は、化合物Iコリン塩および／または化合物IIの溶解度を維持するのに有用であることが判明した；しかしながら、PS 80およびチロキサポールが、MYS40よりも有効であった。組成物の具体例のpHは、10 mM緩衝剤を用いては維持されなかった；したがって、緩衝剤濃度を最終組成物において増大させるべきであることが確定された。さらに、この特定の態様は、2年間室温で保存されている組成物において形成されると考えられるものと実質的に同等の化合物IIの量を潜在的に生じるであろうストレスを加える条件を決定するための、適切な方法を提供する手助けをした。

【0119】

別の態様において、緩衝剤濃度を増大させ、PVP K30の量を10％で維持した。5％ PVP K30を含む対照試料もまた、以前の態様の結果を確認するために使用した。この他の態様において、化合物Iの濃度は、約2 mM〜約10 mM（化合物Iコリン塩ではなく化合物Iに基づいて算出された濃度）の範囲であり、組成物において使用される他の構成要素は、PEG400、PS 80、およびチロキサポールのさまざまな組み合わせを含んだ。組成物のさまざまな具体例を、表7に提供する。

【0120】

（表７）評定のために調製された組成物

【0121】

この他の態様において、組成物の安定性、および極端な条件に耐える能力を判定するために、さまざまな組成物の具体例を、さまざまな温度サイクル研究に供した。例えば、10サイクルの凍結／融解（-20℃〜RT）、8サイクルの凍結／加熱（-20℃〜50℃）および10サイクルの冷却／加熱（5℃〜40℃）を用いた。二つの試料の試料3および4に、さまざまな温度サイクル研究に曝露する前のおよそ7日間、80℃でストレスを加えた。驚くべきことに、10 mMの化合物I（化合物Iコリン塩ではなく化合物Iに基づいて算出された濃度）を含む組成物の多くが、析出を示さず、温度サイクル研究後に約7％（約290μg/mL）のみの化合物IIを含有していた（表8）。さらに、試料3および4は、事前のストレスを加える条件の後でさえも、析出を伴わず透明黄色溶液のままであった（表9）。この特定の態様において得られた重要な結果によって、本明細書において開示されるような使用に適した組成物は、PVP、PS 80、チロキサポール、およびPEG400を含有することができ、PVPの量は5％より多いことが、示唆される。

【0122】

（表８）温度サイクル研究後の調製された組成物の分析結果

【0123】

（表９）80℃で7日間ストレスを加えるおよび10サイクルの温度サイクル後の、組成物番号3および番号4の分析結果

【0124】

さらに別の態様において、開示される組成物に他の構成要素を添加する効果を判定した。開示される組成物の特定の具体例において、核形成阻害剤を添加した。核形成阻害剤を添加して、ある特定の組成物の具体例において化合物Iコリン塩および／または化合物IIの析出の量を減少させたか否かを評定する。この態様において分析した試料組成物を、表10に提供する。

【0125】

（表１０）評定のために調製された組成物

【0126】

驚くべきことに、1％の核形成阻害剤であるHPMC E5を含む試料組成物は、単に室温で一晩保存した後に、析出を示した。これらの試料（試料12〜16）のさらなる分析は行わなかった。試料1〜11および17を、60℃で14日間および80℃で6日間ストレスを加えることによって、さらに評定した。続いて、これらの試料を、5サイクルの凍結／加熱（-20℃〜50℃）に供した。これらの試料は、析出を示さず、透明黄色溶液のままであった。

【0127】

このさらなる態様から、特定の量のHPMC核形成阻害剤は、驚くべきことに、開示される組成物の物理的および／または化学的特性を維持する手助けをしなかったことが確定された。さらに、開示される組成物のこれらの具体例によって、PEG400が存在しなかった場合でさえも、PVPの量を約7.5％に低減できたことが示された。したがって、この他の態様は、最も少ない数の賦形剤と組み合わせる、開示される組成物における使用に適した可能な最小PVP量を決定するための基礎を提供した。

【0128】

さらに別の態様において、核形成阻害剤であるHPMC E5の、組成物の化学的および／または物理的特性を維持する手助けをする能力を再び分析した；しかしながら、組成物に添加した核形成阻害剤の量を、約0.25％に減少させた。この特定の態様において使用された他の構成要素を、表11に提供する。

【0129】

（表１１）評定のために調製された組成物

【0130】

この特定の態様において検討されたさまざまな試料組成物に、60℃で14日間のストレスを加え、その後、室温で少なくとも4週間保存した。再び、0.25％の核形成阻害剤を含む試料は、60℃で14日間ストレスを加えた後に析出を示した。したがって、核形成阻害剤は、少量であっても、開示される組成物の化学的および／または物理的特性を維持するための実行可能な選択肢であるようには見られなかった。このさらなる態様はまた、より高い濃度の化合物Iを、提供されるPVP K30の量の必要な対応する増大なしで使用できたこと、および、ある特定の組成物の具体例において化合物Iコリン塩および／または化合物IIの溶解度を維持するために他の賦形剤は不必要であったことの、驚くべき結果を提供した。

【0131】

化合物Iの量が10 mg/mL（化合物Iコリン塩ではなく化合物Iに基づいて算出された濃度）に維持された、別のラウンドの組成物を試験した。80℃でのストレスを6日間加え、それに続いて5サイクルの冷却／加熱（約5℃〜約40℃）を行った。開示される組成物はすべて、透明黄色溶液のままであった。この態様の特定の構成要素を、表12に提供する。

【0132】

（表１２）評定のために調製された組成物

【0133】

これらのさまざまな組成物試験ラウンドの知見に基づいて、開示される形成物の例示的具体例を決定し、下記の表13に提供する。特定の組成物の具体例は、約1 mg/mL〜約10 mg/mLの化合物Iまたはそのコリン塩を含むことができる。例示的態様は、2 mg/mLまたは5 mg/mLの化合物Iコリン塩を使用することに関する。

【0134】

（表１３）化合物Iの眼部用プロトタイプ組成物

【0135】

（表１４）追加的な組成物の具体例

^aプロピレングリコールを、製剤の重量オスモル濃度を275 +/- 45 mOsm/kgに調整するための等張化剤として使用する。
^bプラセボの密度は、20〜25℃で1.0246 g/mLである。

【0136】

（表１５）追加的な組成物の具体例

^aAPIは、化合物Iコリンである。APIの量を、所定のロットの重量純度にしたがって調整するべきである。1.213 mgの化合物Iコリン＝1 mgの化合物I。
^bプロピレングリコールを、製剤の重量オスモル濃度を275 +/- 45 mOsm/kgに調整するための等張化剤として使用する。
^c製剤の密度は、20〜25℃で1.0284 g/mLである。

【0137】

（表１６）追加的な組成物の具体例

^aAPIは、化合物Iコリンである。APIの量を、所定のロットの重量純度にしたがって調整するべきである。1.213 mgの化合物Iコリン＝1 mgの化合物I。
^bプロピレングリコールを、製剤の重量オスモル濃度を275 +/- 45 mOsm/kgに調整するための等張化剤として使用する。
^c製剤の密度は、20〜25℃で1.0269 g/mLである。

【0138】

（表１７）追加的な組成物の具体例

^aAPIは、化合物Iコリンである。APIの量を、所定のロットの重量純度にしたがって調整しなければならない。1.213 mgの化合物Iコリン＝1 mgの化合物I。
^bプロピレングリコールを、製剤の重量オスモル濃度を275 +/- 45 mOsm/kgに調整するための等張化剤として使用する。
^c製剤の密度は、20〜25℃で1.0268 g/mLである。

【0139】

IL-4で刺激されたラモスB細胞株のアッセイ法
JAK阻害をアッセイする手段の一つは、下流の遺伝子産物の上方制御に対する化合物IおよびIIの効果の検出である。ラモス/IL4アッセイ法においては、B細胞をサイトカインのインターロイキン-4 (IL-4)で刺激し、JAKファミリーキナーゼのJAK1およびJAK3のリン酸化を通じてJAK/Stat経路の活性化をもたらし、このことが次には、転写因子Stat-6をリン酸化し活性化する。活性化Stat-6により上方制御される遺伝子の一つが、低親和性IgE受容体CD23である。JAK1およびJAK3キナーゼに対する阻害剤(例えば、本明細書において記載される2,4-置換ピリミジンジアミン化合物)の効果を調べるため、ヒトラモスB細胞をヒトIL-4により刺激する。刺激から20〜24時間後、CD23の上方制御がないか細胞を染色し、フローサイトメトリー(FACS)により分析する。対照条件に比べて、存在するCD23の量の低減により、試験化合物の活性がJAK キナーゼ経路を阻害することが示唆される。このタイプの例示的なアッセイ法を以下でさらに詳細に記載している。

【0140】

サイトカインのインターロイキン-4 (IL-4)で刺激したB細胞は、JAKファミリーキナーゼのJAK-1およびJAK-3のリン酸化を通じてJAK/Stat経路を活性化し、このことが次に、転写因子Stat-6をリン酸化し活性化する。活性化Stat-6により上方制御される遺伝子の一つが、低親和性IgE受容体CD23である。JAKファミリーキナーゼに対する阻害剤の効果を調べるため、ヒト ラモスB細胞をヒトIL-4により刺激する。

【0141】

ラモスB細胞株はATCC (ATCCカタログ番号CRL-1596)から入手した。この細胞をATCC増殖プロトコルにしたがい、熱不活化した10%ウシ胎仔血清(FBS) (JRH Biosciences, Inc, Lenexa, Kansas, カタログ番号12106-500M)の入ったRPMI 1640 (Cellgro, MediaTech, Inc., Herndon, VA, カタログ番号10-040-CM)中で培養した。細胞を3.5×10⁵個の密度で維持した。実験前日に、ラモスB細胞を細胞3.5×10⁵個/mLに希釈して、確実にそれらが対数増殖期にあるようにした。

【0142】

細胞を、遠心沈殿し、5%血清入りのRPMIに懸濁した。96ウェル組織培養プレート中にて1ポイントあたり細胞5×10⁴個を使用した。細胞を37℃のインキュベータ中で1時間、化合物またはDMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, カタログ番号D2650)ビヒクル対照とともにプレインキュベートした。次いで、細胞を20〜24時間、終濃度50単位/mLのIL-4 (Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ, カタログ番号200-04)により刺激した。その後、細胞を、遠心沈殿し、抗CD23-PE (BD Pharmingen, San Diego, CA, カタログ番号555711)で染色し、FACSにより解析した。San Jose, CaliforniaのBecton Dickinson Biosciencesから購入した、BD LSR I System Flow Cytometerを用いて検出を行った。このアッセイ法に基づき算出されたIC₅₀を表18に示す。

【0143】

IL-2により刺激した初代ヒトT細胞の増殖アッセイ法
本明細書において記載される化合物Iおよび／またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、またはN-オキシド）のJAK活性は、初代ヒトT細胞の増殖応答に対する、本明細書において記載されるこれらの化合物の効果をアッセイすることでさらに特徴付けることができる。このアッセイ法においては、末梢血から得られ、かつT細胞受容体およびCD28の刺激を通じて前活性化された初代ヒトT細胞は、サイトカインのインターロイキン-2 (IL-2)に応答して培養液中で増殖する。この増殖応答は、転写因子Stat-5をリン酸化かつ活性化するJAK1およびJAK3チロシンキナーゼの活性化に依存する。初代ヒトT細胞を72時間IL-2の存在下で化合物Iおよび/またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、またはN-オキシド）とともにインキュベートし、アッセイ法のエンドポイントで、細胞内ATP濃度を測定して細胞生存度を評価する。対照条件に比べて細胞増殖の低減は、JAKキナーゼ経路の阻害を示唆する。このタイプの例示的なアッセイ法を以下でさらに詳細に記載している。

【0144】

末梢血から得られ、かつT細胞受容体およびCD28の刺激を通じて前活性化された初代ヒトT細胞は、サイトカインのインターロイキン-2 (IL-2)に応答してインビトロで増殖する。この増殖応答は、転写因子Stat-5をリン酸化かつ活性化するJAK-1およびJAK-3チロシンキナーゼの活性化に依存する。

【0145】

ヒト初代T細胞を次の通りに調製した。全血を、健常ボランティアから採取し、PBSと1:1混合し、2:1の血液/PBS:フィコール比にてフィコールハイパック(Ficoll Hypaque) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, カタログ番号17-1440-03)に重層し、1750 rpmにて4℃で30分間遠心分離した。血清:フィコール界面のリンパ球を、回収し、5倍容量のPBSで2回洗浄した。細胞を、40 U/mLの組換えIL2 (R and D Systems, Minneapolis, MN, カタログ番号202-IL (20 μg))の入ったイッセル(Yssel's)培地(Gemini Bio-products, Woodland, CA, カタログ番号400-103)に再懸濁し、1 μg/mLの抗CD3 (BD Pharmingen, San Diego, CA, カタログ番号555336)および5 μg/mLの抗CD28 (Immunotech, Beckman Coulter of Brea California, カタログ番号IM1376)により予めコーティングしておいたフラスコの中に播種した。初代T細胞を、3〜4日間刺激し、次いで新鮮なフラスコに移し、10% FBSおよび40 U/mLのIL-2入りのRPMI中で維持した。

【0146】

初代T細胞を、PBSで2回洗浄してIL-2を除去し、細胞2×10⁶個/mLでイッセル培地に再懸濁した。80 U/mLのIL-2を含有する細胞懸濁液50 μLを、平底96ウェル黒色プレートの各ウェルに添加した。未刺激の対照の場合、IL-2をプレートの最終列から除いた。化合物を、ジメチルスルホキシド(DMSO, 純度99.7%, 細胞培養試験済み, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, カタログ番号D2650)中、3倍希釈で5 mMから連続的に希釈し、その後イッセル培地中1:250で希釈した。1ウェルあたり2×化合物50 μLを二通り添加し、細胞を37℃で72時間増殖させた。

【0147】

増殖は、CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay (Promega)を用いて測定した。このアッセイ法では、代謝的に活性な細胞の指標として、存在するATPの定量化に基づき培養液中の生存細胞の数を判定する。この基質を、融解し、室温に到達させた。Cell Titer-Glo試薬および希釈剤を一緒に混合した後に、100 μLを各ウェルに添加した。プレートを回転式振盪機上で2分間混合して溶解を誘導し、室温でさらに10分間インキュベートしてシグナルを平衡化させた。検出は、Perkin Elmer, Shelton, CTから購入したWallac Victor2 1420マルチラベルカウンタを用いて行った。このアッセイ法の結果に基づいて計算したIC₅₀を表18に示す。

【0148】

IFNγにより刺激したA549上皮細胞株
本明細書において記載される化合物Iおよび／またはII（またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物、またはN-オキシド）のJAK活性は、A549肺上皮細胞およびU937細胞に対するこれらの化合物の効果をアッセイすることで特徴付けることもできる。A549肺上皮細胞およびU937細胞は、種々の異なる刺激に応答してICAM-1 (CD54)の表面発現を上方制御する。それゆえ、ICAM-1発現を読出しに用いて、異なるシグナル伝達経路に対する試験化合物の効果を同細胞型において評価することができる。IL-1βによる刺激はIL-1β受容体を通じてTRAF6/NFκB経路を活性化し、ICAM-1の上方制御を引き起こす。IFNγはJAK1/JAK2経路の活性化を通じてICAM-1の上方制御を誘導する。ICAM-1の上方制御を化合物の用量曲線にわたってフローサイトメトリーにより定量化することができ、EC₅₀値を算出する。このタイプの例示的なアッセイ法を以下でさらに詳細に記載している。

【0149】

A549肺上皮細胞は、種々の異なる刺激に応答して、ICAM-1 (CD54)の表面発現を上方制御する。それゆえ、ICAM-1発現を読出しに用いて、異なるシグナル伝達経路に対する化合物の効果を同細胞型において評価することができる。IFNγはJAK/Stat経路の活性化を通じてICAM-1を上方制御する。本実施例においては、IFNγによるICAM-1の上方制御を評価した。

【0150】

A549肺上皮がん細胞株はAmerican Type Culture Collectionから得た。日常的な培養は、10%ウシ胎仔血清、100 I.U.のペニシリンおよび100 ng/mLのストレプトマイシン入りのF12K培地(Mediatech Inc., Lenexa, KS, カタログ番号10-025-CV) (F12k完全培地)を用いたものであった。細胞を37℃で5% CO₂の加湿雰囲気中でインキュベートした。アッセイ法で用いる前に、A549細胞を、PBSで洗浄し、細胞を持ち上げるためにトリプシン(Mediatech Inc., カタログ番号25-052-CI)処理した。トリプシン細胞懸濁液をF12K完全培地により中和し、遠心分離して細胞をペレットにした。細胞ペレットを、2.0×10⁵/mLの濃度でF12K完全培地に再懸濁した。細胞を平底組織培養プレート中、1ウェルあたり20,000個、総量100 μLで播種し、終夜接着させた。

【0151】

2日目に、A549細胞を1時間、2,4-置換ピリミジンジアミン試験化合物またはDMSO (対照) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, カタログ番号D2650)とともにプレインキュベートした。次いで、細胞をIFNγ (75 ng/mL) (Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ, カタログ番号300-02)により刺激し、24時間インキュベートさせた。試験化合物の最終用量範囲は、5% FBS、0.3% DMSO含有F12K培地200 μL中にて30 μM〜14 nMであった。

【0152】

3日目に、細胞培地を除去し、細胞を200 μL PBS (リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄した。細胞を引き離すために各ウェルをトリプシン処理し、次にF12K完全培地200 μLの添加によって中和した。細胞を、ペレットにし、4℃で20分間、APC結合マウス抗ヒトICAM-1 (CD54) (BD Pharmingen, San Diego, CA, カタログ番号559771)抗体で染色した。細胞を、氷冷FACS緩衝液(PBS + 2% FBS)で洗浄し、表面のICAM-1発現をフローサイトメトリーにより解析した。検出は、San Jose, CaliforniaのBD Biosciencesから購入したBD LSR I System Flow Cytometerを用いて行った。事象を作動中の散乱(live scatter)に対してゲート開閉し、幾何平均を計算した(Becton-Dickinson CellQuestソフトウェア第3.3版, Franklin Lakes, NJ)。幾何平均を化合物濃度に対しプロットして、用量反応曲線を作成した。このアッセイ法の結果に基づいて計算したIC₅₀を表18に示す。

【0153】

U937 IFNγ ICAM1 FACSアッセイ法
U937ヒト単球細胞は、種々の異なる刺激に応答してICAM-1 (CD54)の表面発現を上方制御する。それゆえ、ICAM-1発現を読出しに用いて、異なるシグナル伝達経路に対する化合物の効果を同細胞型において評価することができる。IFNγは、JAK/Stat経路の活性化を通じてICAM-1を上方制御する。本実施例においては、IFNγによるICAM-1の上方制御を評価した。

【0154】

U937ヒト単球細胞株を、Rockville MarylandのATCC, カタログ番号CRL-1593.2より入手し、10% (v/v) FCS含有のRPMI-1640培地中で培養した。U937細胞を10% RPMI中で増殖させた。その後、細胞を96ウェル平底プレート中、160 μLあたり細胞100,000個の濃度でプレーティングした。次いで、試験化合物を以下の通りに希釈した。10 mMの試験化合物を、DMSO中1：5で希釈し(DMSO 12 μL中に10 mMの試験化合物3 μL)、引き続きDMSO中で試験化合物の1：3の連続希釈を行った(試験化合物6 μLをDMSO 12 μLに連続的に希釈して3倍希釈物を得た)。その後、試験化合物4 μLを10% RPMI 76 μLに移し、10×溶液(100 μMの試験化合物, 5% DMSO)を得た。対照ウェルの場合、DMSO 4 μLを10% RPMI 76 μLに希釈した。

【0155】

アッセイ法は、8ポイント(10 μlからの、8回の3倍希釈濃度)により、かつ刺激条件下DMSOのみの4ウェル(対照ウェル)および未刺激条件下DMSOのみの4ウェルにより二つ組で行った。

【0156】

希釈済み化合物のプレートをマルチメック(Brea, CaliforniaのBeckman Coulter)により2回混合し、その後、希釈化合物20 μLを細胞160 μL含有の96ウェルプレートに移し、これをその後、低速で2回再び混合した。その後、細胞および化合物を5% CO₂、37℃で30分間プレインキュベートした。

【0157】

10% RPMI中ヒトIFNγの100 ng/mL溶液を調製することにより、10×刺激混合物を作製した。その後、細胞および化合物をIFNγ刺激混合物20 μLにより刺激して、10 ng/mL IFNγ、10 μMの試験化合物および0.5% DMSOの終濃度を得た。細胞を5% CO₂、37℃で18〜24時間刺激の条件下で保持した。

【0158】

細胞を、染色のため96ウェル丸底プレートに移し、その後、染色手順の間、氷上に保持した。細胞を4℃で5分間1000 rpmにて遠心沈殿し、その後、上清を除去した。上清の除去後、FACS緩衝液100 μLあたりAPC結合マウス抗ヒトICAM-1抗体1 μLを添加した。細胞をその後、30分間、暗所中にて氷上でインキュベートした。インキュベーション後、FACS緩衝液150 μLを添加し、細胞を4℃で5分間1000 rpmにて遠心分離し、その後、上清を除去した。上清の除去後、FACS緩衝液200 μLを添加し、細胞を再懸濁した。懸濁後、細胞を4℃で5分間1000 rpmにて遠心分離した。次いで、FACS緩衝液150 μL中での細胞の再懸濁の前に、上清を除去した。

【0159】

検出は、San Jose, CaliforniaのBD Biosciencesから購入したBD LSR I System Flow Cytometerを用いて行った。生細胞を作動中の散乱に対してゲート開閉し、ICAM-APCの幾何平均を測定した(Becton-Dickinson CellQuestソフトウェア第3.3版, Franklin Lakes, NJ)。生細胞%とICAM-1発現の両方を分析した。試験化合物のアッセイ法を活性公知の対照化合物と並行して行った。対照化合物のEC₅₀は、典型的には、40〜100 nMである。このアッセイ法の結果に基づいて計算したIC₅₀を表18に示す。

【0160】

（表１８）アッセイ結果

【0161】

誘発性ドライアイのマウスモデル
本実施例では、ドライアイのマウスモデルでの症状の処置について記載する。注射用生理食塩水(動物1匹当たり1〜1.5 mL)中に2.5 mg/mLのスコポラミン(Sigma-Aldrich)を含む、注射液を調製した。正常C57マウスの後肢に交互に2.5時間ごと4回スコポラミン溶液200〜250 μLを注射する。マウスを特別な檻(正面および背面に穴の開いた)に入れ、フードの中に入れる。送風機を各檻の前に置き、5日連続で終夜16時間作動させる。涙液産生の測定を毎日行い、5日間の終了時にマウスは全て、ドライ誘発されたと見なす。動物を2週間のあいだ1日に1回、本明細書に開示される組成物の具体例の任意のものにより1 μLで処置してもよい。涙液産生を測定し、処置の結果は正常涙液産生値の一部または全部の回復によって測定される。

【0162】

涙液産生は定量的手段、または動物の角膜の定性評価のいずれかによって測定することができ、例えば、処置した眼のフルオレセインまたはローズベンガル染色パターンの生体顕微鏡検査によって行うことができる。そのような染色の低減はドライアイ状態の処置の成功を示す。

【0163】

他の動物モデル
モデルの状態において見られる自己反応性リンパ球の初期活性化および浸潤を模倣する、いくつかのシェーグレン症候群モデルが開発されている。非肥満糖尿病(NOD)マウスモデルは、涙腺、ならびに膵臓、顎下腺および甲状腺を含む他の臓器において主にCD4⁺ Th1細胞のリンパ球浸潤を示す。雄性NODマウスは8週齢から涙腺の顕著な炎症性病変を示すのに対し、雌性NODマウスは30週齢まで何らの変化も示さない。Takahashi et al., High incidence of autoimmune dacryoadenitis in male non-obese diabetic (NOD) mice depending on sex steroid. Clin Exp Immunol. 1997;109:555-561。シェーグレン症候群MRL/MpJ-fas⁺/fas⁺ (MRL/+)およびMRL/MpJ-fas^lpr/fas^lpr (MRL/lpr)マウスモデルは、CD4⁺ T細胞の優位によって特徴付けられる涙腺浸潤物を示す。Van Blokland and Versnel, Pathogenesis of Sjogren's syndrome: characteristics of different mouse models for autoimmune exocrinopathy. Clin Immunol. 2002;103:111-124。

【0164】

マウスと比べてウサギでは露出した眼表面が広いため、涙液層破壊時間および眼表面のフルオレセインまたはローズベンガル染色などの標準的なドライアイ臨床試験は、ウサギでは、より簡単に行われる。シェーグレン症候群に似ているウサギでの自己免疫疾患は、反対側の切除涙腺から得た上皮細胞との培養で増殖された自家末梢血リンパ球を涙腺へ注射することにより誘発することができる。

【0165】

この動物モデルおよび他の動物モデルを、本明細書において開示される組成物を試験するために使用してもよい。開示される組成物を動物に投与し、涙液産生の増加の証拠またはドライアイの減少の証拠について眼を検査してもよい。

【0166】

いくつかの態様において、対象に、7.5％ w/vのK30グレードポリビニルピロリドン、約25 mMの濃度を有するリン酸緩衝剤、および1.6％ w/vのプロピレングリコールを含む組成物を投与する。対象は、ドライアイ症候群と関連する一つまたは複数の症状を患っているため、またはドライアイ症候群と診断されたために、選抜される。特定の開示される態様において、対象が患う（または症状を示す）ドライアイ症候群が、処置、改善、または予防される。例えば、いくつかの態様において、対象は、対象の眼の物理的状態の改善（例えば、涙液産生の増加または蒸発の減少）を示す。いくつかの態様において、対象は、下角膜フルオレセイン染色の低減、シルマー試験の改善、またはドライアイ症候群の兆候および／もしくは症状の改善を実証する。そのような改善は、眼表面疾患指数、眼快適指数、または同様の試験を用いて測定される。

【0167】

開示される発明の原理が適用されうる多くの可能な態様を考慮すると、例証された態様は本発明の好ましい例であるだけであり、本発明の範囲を限定すると受け取られるべきではないことが、認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの請求項の範囲および精神内に入るすべてを、本発明者らの発明として特許請求する。

【図1】

【図2】