特許 6351633 高分解能の振幅コントラスト撮像

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6351633

(24)【登録日】2018年6月15日

(45)【発行日】2018年7月4日

(54)【発明の名称】高分解能の振幅コントラスト撮像

(51)【国際特許分類】

   H01J 37/244 20060101AFI20180625BHJP

   H01J 37/153 20060101ALI20180625BHJP

   H01J 37/26 20060101ALI20180625BHJP

   H01J 37/22 20060101ALI20180625BHJP

   H01J 37/09 20060101ALI20180625BHJP

   G01N 23/04 20180101ALI20180625BHJP

【ＦＩ】

   H01J37/244

   H01J37/153 A

   H01J37/26

   H01J37/22 501A

   H01J37/22 501Z

   H01J37/09 A

   G01N23/04

【請求項の数】16

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2015-557449(P2015-557449)

(86)(22)【出願日】2014年2月14日

(65)【公表番号】特表2016-511926(P2016-511926A)

(43)【公表日】2016年4月21日

(86)【国際出願番号】EP2014052973

(87)【国際公開番号】WO2014125098

(87)【国際公開日】20140821

【審査請求日】2017年2月9日

(31)【優先権主張番号】1302624.0

(32)【優先日】2013年2月14日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】510214573

【氏名又は名称】ユニフェルシテイト アントウェルペン

【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ａｎｔｗｅｒｐｅｎ

(73)【特許権者】

【識別番号】514084141

【氏名又は名称】エフエーイー・カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＦＥＩ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100125874

【弁理士】

【氏名又は名称】川端 純市

(74)【代理人】

【識別番号】100189544

【弁理士】

【氏名又は名称】柏原 啓伸

(72)【発明者】

【氏名】ディルク・ファン・デイク

(72)【発明者】

【氏名】ウーヴェ・ルッケン

(72)【発明者】

【氏名】ホルガー・シュターク

(72)【発明者】

【氏名】サラ・バルス

【審査官】 右▲高▼ 孝幸

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００３−２４９１８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０４−２３３１５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−２７００５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０１９２９７６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 今野豊彦，ＴＥＭ像の解釈（II），顕微鏡，社団法人 日本顕微鏡学会，２００８年，vol.43, no.3，pp.212-218

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｈ０１Ｊ ３７／２４４

Ｇ０１Ｎ ２３／０４

Ｈ０１Ｊ ３７／０９

Ｈ０１Ｊ ３７／１５３

Ｈ０１Ｊ ３７／２２

Ｈ０１Ｊ ３７／２６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象物の高分解能電子顕微鏡観察を実行する方法であって、
− ソフトマター対象物に、原子レベルの分解能で上記対象物で散乱された熱散漫散乱電子の周波数帯域においてマイクロメートルまたはマイクロメートル以下のオーダの偏差で実質的に一定の伝達関数を用いた球面収差補正を実行する電子顕微鏡を用いて電子ビームを照射することを含む方法において、
上記方法は、
− 内側と外側の半径をもつ環状のリング形状を有する環状暗視野対物絞りを用いて、上記対象物で散乱された上記熱散漫散乱電子を選択すること、
− 上記選択された熱散漫散乱電子を検出すること、および、
− その熱散漫散乱電子から上記対象物の像を導出するために、上記検出された熱散漫散乱電子を用いることを含み、
上記環状暗視野対物絞りの上記内側と上記外側の半径は、上記対象物で散乱された上記熱散漫散乱電子の周波数帯域に対応して選択されている
ことを特徴とする方法。

【請求項2】

請求項１に記載の方法において、
上記対象物はソフトマター対象物である方法。

【請求項3】

請求項１または２に記載の方法において、
上記対象物で散乱された熱散漫散乱電子の周波数帯域は０．５Å^−１と１．０Å^−１との間の範囲を含む方法。

【請求項4】

請求項１から３までのいずれか一つに記載の方法において、さらに、
球面収差定数と電子の波長との積の平方根としてシェルツァー単位を定義したとき、上記照射することは、１．２２シェルツァー単位のデフォーカスを用いて実行される方法。

【請求項5】

請求項４に記載の方法において、
上記デフォーカスは、アンダーフォーカスである方法。

【請求項6】

請求項１から５までのいずれか一つに記載の方法において、
上記対象物が生体である方法。

【請求項7】

請求項１から６までのいずれか一つに記載の方法において、
上記高分解能電子顕微鏡観察を実行することは、断層撮影を実行することを含む方法。

【請求項8】

請求項１から７までのいずれか一つに記載の方法において、
像を導出することは、各原子のインコヒーレントな寄与を独立に最終的な像に対して加えることを含む方法。

【請求項9】

請求項８に記載の方法において、
上記検出された熱散漫散乱電子に基づいて上記対象物の像を導出することは、各原子の上記インコヒーレントな寄与に基づいて独立したサブ像を導出することを含む方法。

【請求項10】

請求項１から９までのいずれか一つに記載の方法において、
上記方法は、３次元対象物の粒子の断層撮影を含み、それによって、予め定められた値１０．９ｎｍよりも小さなデフォーカスをもたらす、上記電子顕微鏡に対して上記対象物内で異なる深さ位置を有する粒子は、同じ撮像条件を用いた同じ撮像ステップにおいて像にされる方法。

【請求項11】

請求項１０に記載の方法において、
この方法は、予め定められた値１０．９ｎｍよりも大きなデフォーカスをもたらす、上記電子顕微鏡に対して上記対象物内で異なる深さ位置を有する粒子を、上記異なる深さ位置によってもたらされたデフォーカス値を取り入れて、異なる撮像条件を用いた分離した撮像ステップにおいて撮像することを含む方法。

【請求項12】

原子レベルの分解能で対象物の高分解能電子顕微鏡観察を実行するシステムであって、
− 上記対象物で散乱された熱散漫散乱電子の周波数帯域においてマイクロメートルまたはマイクロメートル以下のオーダの偏差で実質的に一定の伝達関数を上記システム内に誘導する球面収差補正器を含むシステムにおいて、
上記システムは、
− 内側と外側の半径を有する環状のリング形状を有し、上記対象物で散乱された上記熱散漫散乱電子を選択する環状暗視野対物絞りと、
− 上記選択された上記熱散漫散乱電子を検出する検出部と、
− その熱散漫散乱電子に基づいて上記対象物の像を導出するために、上記検出された熱散漫散乱電子を用いる像プロセッサと、
を含み、
上記環状暗視野対物絞りの上記内側と上記外側の半径は、上記対象物で散乱された上記熱散漫散乱電子の周波数帯域に対応して選択されている
ことを特徴とするシステム。

【請求項13】

請求項１２に記載のシステムにおいて、
上記球面収差補正器は、０．５Å^−１と１．０Å^−１との間の範囲に、一定の伝達関数を有するシステム。

【請求項14】

電子顕微鏡システムでの使用のための環状暗視野対物絞りであって、
上記環状暗視野対物絞りは、内側と外側の半径を有する環状のリング形状を有し、上記内側と上記外側の半径は、対象物で散乱され熱散漫散乱電子の周波数帯域に対応して選択されている環状暗視野対物絞り。

【請求項15】

ソフトマター対象物を撮像するための請求項１２または１３に記載のシステムの使用。

【請求項16】

生体を撮像するための請求項１５に記載のシステムの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、対象物を撮像する分野に関する。より具体的には、本発明は、電子顕微鏡を用いて、生体のようなソフトマター対象物を撮像するための方法およびシステムに関する。

【背景技術】

【0002】

細胞レベルでの生命過程を完全に理解するための探求では、高分解能の生体撮像は重要な役割を果たしている。多くのタンパク質は、異なる複合体の形成に多数回使用されるモジュールとみなされる。ほとんどの複合体について、その機能はまだ不明である。しかし、それらは生きている細胞内の主要なプロセスに関与すること、および、構成タンパク質の構造とダイナミクスの理解は細胞レベルでの生命過程の完全な理解に向けて必要なステップとして要求されることが考えられている。多数のつながりに形成された複合体の大きなサイズとそれらの機能的な前後関係で有り得る動的な変動性は、これらの複合体の大部分をＸ線結晶構造解析の手の届かないところに置き、構造研究の幾つかの技術の一つとして、クライオ電子顕微鏡を残している。特に、単一粒子技術は、それらは分子相互作用を制約されたままにするので、好ましい。

【0003】

単一粒子クライオ電子顕微鏡（ＥＭ）の世界では、信条は、生体は位相差顕微鏡だけを用いて研究され得る位相物体であるということである。電子顕微鏡における位相コントラストを得るための通常の方法は、位相シフトが９０°にほぼ等しくされている空間周波数の通過帯域を生成するように、負のデフォーカス（シェルツァーフォーカス）で球面収差Ｃｓを補正することである。しかし、そのような通過帯域では低空間周波数での位相伝達は非常に悪い。形状に関する情報がこの範囲内にある生体について、それが問題である。

【0004】

可能な解決策は、回折光に対して９０°を超えて中心ビームの位相をシフトできる位相板を開発することである。しかしながら、位相板の開発に投資されてきた全ての努力にもかかわらず、位相板を用いた高分解能撮像の明確な実証は、まだ行われていない。

【0005】

低空間周波数範囲内で位相コントラストを得るためのより実用的な方法は、（２マイクロメートルのオーダの）非常に大きなデフォーカスを用いることによって、また、幾つかのデフォーカス値を結合するとともに、撮像が線形であると仮定することによって欠落ギャップを補償することによる。しかし、強いデフォーカスの欠点は、大きなデフォーカスで、顕微鏡の空間的インコヒーレントが、約４オングストローム程度に分解能を強く制限することである。従って、Ｃｓ補正器の使用は、無機材料のＨＲＥＭでは非常に成功しているけれども、単一粒子クライオＥＭのためには制限された値のものである、と一般的には信じられている。

【発明の概要】

【0006】

本発明の目的は、ソフトマター、例えば生体に適した、良好な撮像技術とシステムを提供することにある。

【0007】

本発明の実施の形態の利点は、球面収差（Ｃｓ）が補正された高分解能電子顕微鏡が、ソフトマター（soft matter）、例えば、生物学的材料の撮像に用いられ得ることを実現していることである。

【0008】

生体のようなソフトマターの熱散漫散乱（ＴＤＳ）電子が使用され得ることが、驚きをもって見出された。ソフトマターのＴＤＳ電子の信号が大きくあり得ることが発見された。何故ならば、その信号は、原子の原子番号だけではなく、結合エネルギに依存する平均２乗変位（ＭＳＤ）の関数だからである。

【0009】

本発明に係る実施形態の利点は、例えば主に熱散漫散乱（ＴＤＳ）電子を含む大角度散乱電子の使用をする、ソフトマター、例えば生体に適した高分解能電子顕微鏡撮像を実行するための方法およびシステムが提供されることである。

【0010】

本発明の実施の形態の利点は、ＴＤＳ散乱は、インコヒーレントであるから、中心ビームに干渉しないことである。したがって、ＴＤＳ散乱は、最も高い分解能で、例えば球面収差（Ｃｓ）補正器で到達され得る平坦な伝達関数（位相シフトゼロ）で、かつ、例えば非常に小さいアンダーフォーカスで、イメージ化され得る振幅コントラストを生成する。

【0011】

本発明に係る実施形態の利点は、１／オングストローム程度の空間周波数（それは、正確に、球面収差（Ｃｓ）補正器で平坦な通過帯域が実現可能な範囲である。）での最適な検出を提供する方法およびシステムが提供されることである。

【0012】

本発明の実施の形態の利点は、上記ＴＤＳ信号は解釈が容易で、かつ「質量厚さ（mass thickness）」においてリニアであり、したがって、断層撮影のために非常に適していることである。

【0013】

本発明の実施の形態の利点は、この撮像技術のために特に最適化された環状暗視野対物絞りが、熱散漫散乱電子を選択するために使用され得ることである。この方法は、或る意味ではＨＡＡＤＦ ＳＴＥＭに匹敵するが、ＨＲＥＭの全ての利点を持つ。

【0014】

上記目的は、本発明による方法及び装置によって達成される。

【0015】

本発明は、対象物の高分解能電子顕微鏡観察を実行する方法であって、
− ソフトマター対象物に、原子レベルの分解能で上記対象物で散乱された熱散漫散乱電子の周波数帯域においてマイクロメートルまたはマイクロメートル以下のオーダの偏差で実質的に一定の伝達関数を用いた球面収差補正を実行する電子顕微鏡を用いて電子ビームを照射することを含む方法において、
上記方法は、
− 内側と外側の半径をもつ環状のリング形状を有する環状暗視野対物絞りを用いて、上記対象物で散乱された上記熱散漫散乱電子を選択すること、
− 上記選択された熱散漫散乱電子を検出すること、および、
− その検出された熱散漫散乱電子から上記対象物の像を導出するために、上記検出された熱散漫散乱電子を用いることを含み、
上記環状暗視野対物絞りの上記内側と上記外側の半径は、上記対象物で散乱された上記熱散漫散乱電子の周波数帯域に対応して選択されている
ことを特徴とする。

【0016】

本発明の実施形態で、実質的に一定の伝達関数に対して参照が行われる場合、参照は、平均の偏差がマイクロメートルまたはそれ以下のオーダである状態に対して行われる。

【0017】

本発明の実施形態によれば、調査中の対象物は、ソフトマター対象物であってもよい（実施形態はこれに限定されないけれども、）。本発明の実施の形態の利点は、開示された方法を用いてタンパク質が調べられ得ることである。それによって、利点は、熱散漫散乱が約１オングストロームであることであり、それはＣｓが補正された電子顕微鏡の手の届くところにある。

【0018】

この方法は、ポリマを研究するために有利に使用され得る。それにもかかわらず、この方法は、無機材料にも適用可能である。

【0019】

本発明の実施の形態の利点は、対象物で散乱された熱散漫散乱電子がその対象物をイメージ化するために用いられることである。上記対象物はソフトマターであってもよい。一実施形態では、それはタンパク質であってもよい。本発明の実施形態は、ソフトマター、例えば生体を原子レベルの分解能でイメージ化する際に、熱散漫散乱が有用であることを本発明者らは認識した、という事実を利用している。

【0020】

上記ソフトマター対象物で散乱された熱散漫散乱電子の周波数帯域は０．５Å^−１と１．０Å^−１との間の範囲を含んでもよい。さらに、球面収差定数と電子の波長との積の平方根としてシェルツァー単位を定義したとき、上記照射することは、小さな（例えば、１．２２シェルツァー単位の）デフォーカスを用いて実行されてもよい。上記照射することは、小さなアンダーフォーカスを用いて実行されてもよい。

【0021】

上記収差補正Ｃｓは、数マイクロメートルのオーダであり得るし、また、対応するデフォーカスＤは、数ナノメートルのオーダであり得る。収差補正とデフォーカスのための値は、例えば、次のように選択されてもよい。人が到達したい分解能Ｒについて、人は、Ｌを波長として、収差補正（１．６Ｒ）４／（（Ｌ）３）と決定することができる。それから、対応するデフォーカスＤは、ＣｓＬの平方根の１、２倍として決定することができる。

【0024】

上記周波数帯域は０．５オングストローム（−１）と１オングストローム（−１）の間であってもよい。一実施形態では、上記周波数帯域は、σを原子の平均熱変位として、０．５／σと１／σとの間にあるように選択されてもよい。

【0025】

上記ソフトマター対象物は生体であってもよい。

【0026】

高分解能電子顕微鏡観察を実行することは、断層撮影を実行することを含んでいてもよい。

【0027】

像を導出することは、各原子のインコヒーレントな寄与を最終的な像に対して独立に加えることを含んでいてもよい。

【0028】

上記検出された熱散漫散乱電子に基づいて上記対象物の像を導出することは、各原子の上記インコヒーレントな寄与に基づいて独立したサブ像を導出することを含んでいてもよい。

【0029】

上記方法は、３次元対象物の粒子の断層撮影を含み、それによって、予め定められた値１０．９ｎｍよりも小さなデフォーカスをもたらす、上記電子顕微鏡に対して上記対象物内で異なる深さ位置を有する粒子は、同じ撮像条件を用いた同じ撮像ステップにおいて像にされてもよい。

【0030】

上記方法は、予め定められた値１０．９ｎｍよりも大きなデフォーカスをもたらす、上記電子顕微鏡に対して上記対象物内で異なる深さ位置を有する粒子を、上記異なる深さ位置によってもたらされたデフォーカス値を取り入れた異なる撮像条件を用いた分離した撮像ステップにおいて撮像することを含んでもよい。

【0031】

また、本発明は、原子レベルの分解能で対象物の高分解能電子顕微鏡観察を実行するシステムであって、
− 上記対象物で散乱された熱散漫散乱電子の周波数帯域においてマイクロメートルまたはマイクロメートル以下のオーダの偏差で実質的に一定の伝達関数を上記システム内に誘導する球面収差補正器を含むシステムにおいて、
上記システムは、
− 内側と外側の半径を有する環状のリング形状を有し、上記対象物で散乱された上記熱散漫散乱電子を選択する環状暗視野対物絞りと、
− 上記選択された上記熱散漫散乱電子を検出する検出部と、
− その熱散漫散乱電子に基づいて上記対象物の像を導出するために、上記検出された熱散漫散乱電子を用いる像プロセッサと、
を含み、
上記環状暗視野対物絞りの上記内側と上記外側の半径は、上記対象物で散乱された上記熱散漫散乱電子の周波数帯域に対応して選択されている
ことを特徴とする。

【0032】

上記球面収差補正器は、０．５Å^−１と１．０Å^−１との間の範囲に、一定の伝達関数を有していてもよい。

【0035】

本発明はまた、電子顕微鏡システムでの使用のための環状暗視野対物絞りに関し、上記環状暗視野対物絞りは、内側と外側の半径を有する環状のリング形状を有し、上記内側と上記外側の半径は、ソフトマター対象物で散乱された熱散漫散乱電子の周波数帯域に対応して選択されている。

【0036】

本発明は、さらに、ソフトマター対象物を撮像するための上述のようなシステムの使用に関する。

【0037】

本発明は、また、生体のための上述のようなシステムの使用に関する。

【0038】

本発明は、さらに、上述のような方法を用いて得られた電子顕微鏡の像に関する。

【0039】

本発明の特定の好ましい局面は、添付の独立請求項および従属請求項に記載されている。従属請求項からの特徴は、独立請求項の特徴、および、適宜他の従属請求項の特徴と組み合わされてもよく、単に特許請求の範囲に明示されているものだけではない。

【0040】

本発明のこれらおよび他の局面は、以下に記載される実施形態（複数可）から明らかであり、また、実施形態を参照して明らかにされる。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】図１は、本発明の実施形態に係る電子顕微鏡のためのシステムを示す図である。

【図2】図２は、最適なデフォーカスでの伝達関数の虚部を示す図であって、本発明の実施形態の特徴を説明するために使用可能な比較材料を示すものである。

【図3】図３は、強いデフォーカスでの伝達関数の虚部を示す図であって、本発明の実施形態の特徴を説明するために使用可能な比較材料を示すものである。

【図4a】図４ａは、炭素原子の電子の散乱因子の寄与を示す図であって、本発明の実施形態で使用可能な特徴を示すものである。

【図4b】図４ｂは、炭素原子の電子の散乱因子の寄与を示す図であって、本発明の実施形態で使用可能な特徴を示すものである。

【図4c】図４ｃは、炭素原子の電子の散乱因子の寄与を示す図であって、本発明の実施形態で使用可能な特徴を示すものである。

【図4d】図４ｄは、炭素原子の電子の散乱因子の寄与を示す図であって、本発明の実施形態で使用可能な特徴を示すものである。

【図4e】図４ｅは、炭素原子の電子の散乱因子の寄与を示す図であって、本発明の実施形態で使用可能な特徴を示すものである。

【図4f】図４ｆは、炭素原子の電子の散乱因子の寄与を示す図であって、本発明の実施形態で使用可能な特徴を示すものである。

【図5】図５は、複合体の凍結像計算を示す図であって、本発明の実施形態の特徴を示すものである。

【図6】図６は、複合体の凍結像計算を示す図であって、本発明の実施形態の特徴を示すものである。

【図7】図７は、複合体の凍結像計算を示す図であって、本発明の実施形態の特徴を示すものである。

【図8a】図８ａは、環状暗視野絞りを用いた複合体の凍結像計算の一例を示す図であって、本発明の実施形態の特徴を示すものである。

【図8b】図８ｂは、環状暗視野絞りを用いた複合体の凍結像計算の一例を示す図であって、本発明の実施形態の特徴を示すものである。

【図9】図９は、環状暗視野絞りを用いた複合体の凍結像計算の一例を示す図であって、本発明の実施形態の特徴を示すものである。

【0042】

これらの図面は、概略的であり、非限定的である。図面において、幾つかの要素のサイズは誇張され、説明目的のため、スケール通りに描かれていない。

【0043】

請求項における如何なる参照符号も、発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0044】

異なる図面において、同じ参照符号は同じまたは類似の要素を指す。

【発明を実施するための形態】

【0045】

本発明は、特定の実施形態に関して一定の図面を参照して説明されるが、本発明はそれに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。記載された図面は、概略的に過ぎず、非限定的である。図面において、幾つかの要素のサイズは誇張され、説明目的のため、スケール通りに描かれていない。寸法および相対寸法は、本発明の実際の具体化には対応していない。

【0046】

さらに、発明の詳細な説明および特許請求の範囲における第１、第２などの用語は、類似の要素を区別するために用いられ、必ずしも、いずれかの時間的、空間的な、ランキングまたは他の仕方で、順序を記述するためではない。そのように用いられる用語は、適切な状況下で交換可能であること、また、本明細書で記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載または例示されたものよりも、他の順序で動作可能である、ということが理解されるべきである。

【0047】

また、特許請求の範囲および発明の詳細な説明における頂部、下などの用語は、説明の目的のために用いられ、必ずしも、相対的な位置を記述するためではない。そのように用いられる用語は、適切な状況下で交換可能であること、また、本明細書で記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載または例示されたものよりも、他の方向で動作可能である、ということが理解されるべきである。

【0048】

特許請求の範囲で使用される「含む（comprising）」という用語は、その後に列挙される手段に限定されると解釈されるべきではないことに留意されたい。それは他の要素又はステップを排除するものではない。それは、参照された通りの述べられた特徴、整数、ステップまたは構成要素の存在を特定するものとして解釈されるべきであり、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ若しくは構成要素またはそれらのグループの存在または追加を排除するものではない。したがって、「手段ＡおよびＢを含むデバイス」という表現の範囲は、成分ＡおよびＢのみからなるデバイスに限定されるべきではない。本発明に関して、単に装置の関連した構成要素がＡおよびＢであることを意味する。

【0049】

本明細書における「一実施形態（one embodiment）」または「或る実施形態（an embodiment）」への言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して様々な箇所で「一実施形態では（in one embodiment）」または「或る実施形態では（in an embodiment）」という句の出現は、必ずしも同じ実施形態にすべて言及するものではないが、言及していてもよい。さらに、上記特定の特徴、構造または特性は、本開示から当業者に明らかであるように、一以上の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせられ得る。

【0050】

同様に、本発明の例示的な実施形態の説明において、本発明の様々な特徴は、時々、開示を合理化し、様々な発明の局面の一つ以上の理解を助ける目的で、単一の実施形態、図、またはその説明が一緒にグループ化されることが理解されるべきである。しかしながら、この開示の方法は、クレームされた発明が、各請求項に明示的に記載されているよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映するものと解釈されるべきではない。むしろ、後述の請求項が反映するように、発明の局面は、単一の前述の開示された実施形態の全ての特徴よりも少ないところにある。したがって、発明の詳細な説明に続く特許請求の範囲は、ここに明示的に本発明の別個の実施形態として独立している各請求項と共に、この発明の詳細な説明に組み込まれれる。

【0051】

さらに、本明細書に記載の幾つかの実施形態は、他の実施形態に含まれた幾つかの特徴（他の特徴ではなく）を含む。一方、異なる実施形態の特徴の組合せは、本発明の範囲内であることが意図され、当業者によって理解されるように、異なる実施形態を形成する。例えば、後述の特許請求の範囲において、クレームされた実施形態のいずれかも、任意の組み合わせで使用され得る。

【0052】

本明細書で提供される説明において、多数の特定の詳細が記載される。しかしながら、本発明の実施形態はこれらの特定の詳細なしに実施され得ることが理解される。他の例、周知の方法、構造、および技術は、この説明の理解を曖昧にしないために詳細には示されていない。

【0053】

本発明の実施の形態において、参照が「Ｃｓ補正」電子顕微鏡に対して行われるなされる一方で、参照がＣｓ補正器を使用して球面収差Ｃｓについて補正された電子顕微鏡に対して行われる。そのようなＣｓ補正器は、減少されたまたは球面収差を実質的に含まない電子顕微鏡をもたらすように、対物レンズの正の収差と組み合わせられる負の球面収差を発生する。

【0054】

本発明の実施形態では、参照が原子レベルまたはオングストロームレベルに対して行われるのに対して、想定される大きさは、０．１〜１０オングストロームの範囲であり、より好ましくは０．１〜５オングストローム、さらにより好ましくは０．１〜３オングストロームの範囲である。

【0055】

第１の局面において、本発明は、ソフトマター対象物の高分解能電子顕微鏡観察を実行するための方法に関する。発明の参考の実施形態では、参照がソフトマターに対して行われる場合、後者は、例えば、生体、または、例えばタンパク質、若しくは、リボゾーム等のタンパク質からなるより大きな生物学的構造のような生物学的物質を含む対象物を含むことができる。また、他の技術で特徴づけることが困難である１０ｎｍ〜１０００ｎｍ以上の範囲のサイズを有するタンパク質を、本発明の実施形態を用いて研究できることが、本発明の実施形態の利点である。また、上記方法は、例えば原子レベルでの撮像のために、高分解能撮像のために有利に使用可能である。本発明の実施形態によれば、上記方法は、ソフトマター対象物を、上記ソフトマター対象物で散乱された熱散漫散乱電子の周波数帯域において実質的に一定の伝達関数を用いた球面収差補正を含む電子顕微鏡を用いて照射することを含む。例えば、このような周波数帯域は、０．５Å^−１と１．０Å^−１との間の範囲の一部若しくは全部を含み、または、その範囲内に含まれていてもよい。本発明の実施形態によれば、上記ソフトマターで散乱された熱散漫散乱（ＴＤＳ）電子は、その後、撮像技術においてこれらを使用するために検出される。本発明の実施形態は、熱散漫散乱が、それに基づいて、研究される対象物の像を導出するための有用な情報を含む、ということが分かったという事実を利用する。熱散漫散乱を低減または回避することよりもむしろ、本発明の実施形態は、さらに、これらの検出された熱散漫散乱電子に基づいて、ソフトマター対象物の像を導出することを含む。これにより、対象物の異なる原子すべてがインコヒーレント散乱を持ち、その結果、典型的には、像を導出することは、最終的な像に対して各原子のインコヒーレントな寄与を独立して加えることを含み得るという事実をもたらす、ということは利点である。したがって、像に向かって検出された信号の解釈は、より実現可能になる。異なる原子を表す異なるサブ像が導出され得、最終的な像は、検出された異なるサブ像の組み合わせであってもよい。

【0056】

実質的に一定の伝達関数を得るために、この方法はまた、小さなデフォーカス、例えばアンダーデフォーカスを適用することを含んでもよい。

【0057】

特定の実施形態では、本方法は、上記照射する間、検出プロセス中に熱散漫散乱電子を選択するための手段を用いることを含む。その方法は、例えば、環状暗視野対物絞りを使用することを含んでもよい。このような絞りは、実質的に環状のリング形状を有し、その環状のリング形状は、適切に選択された内側と外側の半径を有し、その結果、生体で散乱された電子の熱散漫散乱の周波数帯域内から電子が選択され、続いて検出される。

【0058】

上述の方法は、有利に、断層撮影を行うために適用されてもよい。言い換えれば、この方法は、３次元の対象物を撮像するために使用され得る。一実施形態では、所定の値よりも小さなデフォーカスをもたらす、上記電子顕微鏡に対して上記対象物内で異なる深さ位置を有する粒子は、同じ撮像条件を用いた同じ撮像ステップにおいて像にされる。他の実施形態では、所定の値よりも大きなデフォーカスをもたらす、上記電子顕微鏡に対して上記対象物内で異なる深さ位置を有する粒子は、上記異なる深さ位置によってもたらされたデフォーカス値を取り入れて、異なる撮像条件を用いた分離した撮像ステップで撮像され又は導出されるだろう。そのことの特徴および利点は、本発明の実施形態はこれに限定されないが、以下でさらに説明されるだろう。

【0059】

一局面では、本発明は、ソフトマター対象物の高分解能電子顕微鏡観察を実行するためのシステムに関する。このようなシステムは、典型的には、電子顕微鏡と呼ばれることがある。本発明の実施形態は、電子顕微鏡の特定のタイプに限定されるものではないが、本発明は、有利に、高分解能電子顕微鏡に関する。本発明の実施形態によれば、上記電子顕微鏡は、球面収差を補正するための球面収差Ｃｓ補正器を備える。これにより、その補正器は、システム内に、ソフトマター対象物で散乱された熱散漫散乱電子の周波数帯域において実質的に一定の伝達関数を誘導するようになっている。一例では、伝達関数は、０．５Å^−１と１．０Å^−１との間の範囲内で実質的に一定である。上に示されたように、Ｃｓ補正器は、対物レンズの正の収差と結合する負の球面収差を生成して、球面収差が低減された又は球面収差を実質的に含まない電子顕微鏡をもたらす。Ｃｓ補正器の例は、例えば、四重極−八極レンズまたは六重極レンズであってもよい。

【0060】

本発明の実施形態によれば、上記システムは、ソフトマターで散乱された熱散漫散乱電子を検出するようになっている検出器または検出システムを含む。さらにまた、上記システムは、上記検出された熱散漫散乱電子に基づいて、ソフトマター対象物の像を導出するための、像処理システムとも呼ばれる、像プロセッサを備える。幾つかの実施形態において、このようなプロセッサは、各原子のインコヒーレントな寄与を独立に最終的な像に対して加えることによって像を導出するようになっていてもよい。だから、上記プロセッサは、分離した原子の各々を表す異なるサブ像を導出してもよい。さらに、本発明の実施形態に係るシステムは、図１に例として示されているように、標準およびオプションの機能を備えていてもよい。実施形態はこれに限定されない。

【0061】

図１は、本発明の実施形態に係る電子顕微鏡の概略的な例を示している（本発明の実施形態による方法およびシステムは、これに限定されないけれども）。概略的に図１に示されている高分解能電子顕微鏡１は、高電圧発生装置５によって電力供給される電子源３を備え、また、レンズ電力供給源９によって電力供給される幾つかのレンズを備えている。本発明の実施形態によれば、上記球面収差補正器１０も、上記システムに含まれている。また、電子顕微鏡１は検出システム１１を備え、検出された情報は像処理システム１３に印加される。電子ビーム１５は対象物１７に入射する。対象物１７の高分解能像は、僅かに異なるデフォーカス値でもって像平面１９に記録され得る。実際には、そのビームは、光源３によって生成され、試料を通過する。その後、そのビームは、対物レンズを通過する。本発明の実施形態では、球面収差補正器は、対物レンズ内に埋め込まれている。そのビームが対物レンズを通過した後、そのビームは、対物レンズの焦点面に配置されている絞りを通過する。その後、ビームは、投影レンズ（図示せず）によって像平面（その上に検出システムが配置されている）上に結像される。

【0062】

特定の実施形態では、システムはさらに、このように熱散漫散乱電子を選択するための環状暗視野対物絞り３１を備える。環状暗視野対物絞り３１は、内側半径と外側半径とを有する環状のリング形状を有し、上記内側と上記外側の半径は、ソフトマター対象物で散乱された熱散漫散乱電子の周波数帯域に対応して選択されている。また、環状絞りなしの実施形態も想定されるけれども、コヒーレントな寄与があるから、このような実施形態は、撮像をより困難にする。

【0063】

また、本発明の実施形態によるシステムは、本発明に記載の方法に従って断層撮影処理を実行するためのコントローラを含むことができる。

【0064】

また、一局面では、本発明は、上述の方法の実施形態において用いられる又は実施形態による処理ステップを実行するための像処理プロセッサ１３に関する。

【0065】

さらに別の局面では、本発明は、電子顕微鏡システムで使用するための環状暗視野対物絞りに関する。その環状暗視野対物絞りは、内側半径と外側半径を有する環状のリング形状の絞りを含み、それによって、上記内側と上記外側の半径が選択されて、電子顕微鏡システムにおける検出のために熱散漫散乱電子が選択される。だから、上記内側と上記外側の半径は、絞りがソフトマター対象物で散乱された熱散漫散乱電子の周波数帯域に対応するように、選択され得る。このような範囲は、０．５Å^−１と１．０Å^−１との間の範囲の一部若しくは全部に対応し、または、その範囲の一部を含んでいてもよい。

【0066】

さらに別の局面では、本発明は、ソフトマター対象物、例えば生体の撮像を行うための上述のようなシステムの使用に関する。上記使用を通して、または上記方法を適用して得られた電子顕微鏡の像は、本開示の範囲内に入る。

【0067】

理論に縛られることを望まないが、本発明の実施形態の特徴及び局面は、次のような理論的考察に基づき得る（本発明の実施形態は、それによって限定されない。）。

【0068】

まず、位相物体を撮像するための従来の一般に認められた基本的、理論的な原理が議論される。

【0069】

或る単一の原子は位相物体として振る舞うという仮定からスタートすると、原子の透過後、波動関数は、

である。ここで、

（比例定数から離れて）は、投影された原子の静電ポテンシャルに等しい。

は投影平面内に取られている。

【0070】

それから、式（１）は、第２次まで展開される。簡単のため、実空間ベクトル

が省略されている。

【0071】

電子顕微鏡を透過した後、像面における波動関数は、

である。Ｔは、電子顕微鏡の複素点広がり関数であり、伝達関数のフーリエ変換の変換である。式（２）及び（３）から、人は、

を有し、また、像強度として、人は、

を有する。ここで、ＩｍＴ及びＲｅＴはそれぞれＴの虚部、実部である。

【0072】

電子顕微鏡のコヒーレント伝達関数は、式（４）で与えられる。

であり、

である。ここで、Ｃ_ｓは球面収差定数、λは電子の波長、ｇは空間周波数、εはデフォーカスである。

である。

【0073】

をグレイザー（Glaser）単位

で書き、また、デフォーカスεをシェルツァー（Scherzer）単位

で書くことによって、無次元単位で

を表現することは便利である。その結果、

となる。

【0074】

高分解能電子顕微鏡ＨＲＥＭでは、球面収差による位相シフトは、電子顕微鏡を部分的にアンダーフォーカスすることによって補償される。最適なデフォーカスは、
ε＝−１．２２
である。

【0075】

図２は、最適なデフォーカス時の伝達関数の虚部Ｉｍ（ｇ）を示している。上記空間周波数は、グレイザー^−１単位（１Ｇｌ＝Ｃ_ｓ^１／４λ^１／４）で表される。この例では、最適なデフォーカスは１．２２シェルツァー単位（１Ｓｃｈ＝Ｃ_ｓ^１／５λ^１／２）に等しい。一時的なインコヒーレンス（減衰エンベロープ）のために、０．１Ｓｃｈのデフォーカス広がりがあると仮定された。今、伝達関数は約π／２の位相シフトを有する通過帯域を示している。この通過帯域の半値幅（ＦＷＭＨ）は、近似的にｇ_ｍｉｎ＝０．５とｇ_ｍａｘ＝１．５との間に広がり、最も高い空間周波数はｇ＝１．６付近にあり、それは０．６５Ｇｌの分解能を生む。

【0076】

フーリエ空間での通過帯域内の空間周波数について、私たちは、近似的に

を有する。その結果、

となる。

【0077】

したがって、第１次では、コントラストは、投影された静電ポテンシャルを直接明らかにする。原子は黒であり、ホールは白であるべきである。しかし、ｇ＝０．５よりも下では、低い空間周波数は低コントラストで伝送される。これは、タンパク質の単一粒子電子断層撮影法のような生物学的構造をイメージ化するについての欠点である。その場合、上記低い空間周波数は、対象物の実際の３次元構造に関する殆どの情報を搬送する。

【0078】

最適なフォーカスで３００ＫｅＶで運転される非補正のＨＲＥＭ（Ｃ_ｓ＝３ｍｍ）について、通過帯域は０．１２Å^−１と０．３Å^−１との間に延びる。

【0079】

しかし、最適なフォーカスで運転される、球面収差補正（Ｃ_ｓ＝１０μｍ）を有するＨＲＥＭについて、通過帯域は０．５Å^−１と１．６Å^−１との間に延びる。

【0080】

従来は、このことが、位相差電子顕微鏡では、Ｃｓ補正が無益であるという結論を導いてきた。

【0081】

図３の例によって示されるように、コントラストを向上させる一般的な手法は、非常に大きなデフォーカス値を使用することである。図３は、２０Ｓｃｈの強いアンダーフォーカスでの伝達関数の虚部Ｉｍ（ｇ）を示している。これは、高分解能端部での損失を犠牲にして、低い空間周波数についてのコントラストを向上させている。したがって、結果は、特に空間的インコヒーレンスの影響のせいで、高分解能が失われることになっている。この理由のために、人は、Ｃｓ補正補正電子顕微鏡であっても、高分解能に達することができない、と一般に信じられている。

【0082】

代替案は、

および

となるように、９０°（因子−ｉ）にわたって中心ビームの位相をシフトさせる静電位相板を開発することである。その結果、コントラストは、再び投影された電位に直線的になる。しかし、これまで、位相板が高分解能の位相コントラストのために確実に機能することは、実証されていない。

【0083】

顕微鏡の空間的および時間的インコヒーレンスを含めるための唯一の正しい方法は、フォーカス広がり内の異なるフォーカス値、および、入射ビーム円錐内の異なるビーム傾斜にわたって、像強度を平均化することによる。

【0084】

フーリエ空間では、平均化〈Ｔ〉_Ｍは、より高い空間周波数を減少させる減衰エンベロープを生じる。

ここで、時間的インコヒーレンスのための減衰エンベロープは、Δをデフォーカス広がりとして、

によって与えられる。空間的インコヒーレンスのためには、αを入射ビーム円錐の半角とし、∇を空間周波数

に関する位相のグラディエントとして、

によって与えられる。

【0085】

大きなデフォーカス（ミクロンオーダ）の場合には、空間的インコヒーレンスの減衰エンベロープは、デフォーカスによって支配され、

となる。これは、最大の空間周波数（１／ｅ値）を

までに遮断する。

【0086】

ビーム発散の半角が０．１ｍｒａｄである非常に大きなデフォーカス（２ミクロン）の場合には、我々は、

を有する。したがって、

に線形である式（１４）内の全ての項は、非常に強く減衰される。

【0087】

それが、強いデフォーカスによる位相コントラストは、高分解能を得られず、Ｃｓ補正から利益を得られない、と考えられている理由である。

【0088】

しかし、

であるから、これらの議論は、最高の空間周波数が必ずしも減少されていないことになっている非線形項については成り立たない。

【0089】

実際に起こることは、情報がＴの大きな空間周波数を通して漏れ得て、像強度に寄与するということである。その後、平均化するとき、この強度は消えない。しかしながら、電子顕微鏡が強くデフォーカスされていれば、この情報は強く非局在化されて、像の背景に入る。しかし、電子顕微鏡が最適なデフォーカスで動作され、Ｃｓを許すならば、人は、この非線形の寄与を高分解能でイメージ化するように、通過帯域をこれらの空間周波数に正確にシフトさせることができる。

【0090】

そして、この項はインコヒーレントに付加されているので、我々は、π／２の位相シフトを必要とすることなく、振幅コントラストを生成することができる。通過帯域内の位相シフトが略一定であることは、十分である。これは、非線形の寄与は、生体をイメージ化することが要求されるような低い空間周波数に寄与する、ということに留意すべきである。

【0091】

現実には、像の記録の間、対象物の原子は、未だ存在しないが、それらは平均位置の周りで振動している。一般に、これは、像のコントラストに僅かな影響のみを有するように、大きな角度の散乱を、したがって、高い空間周波数をも低減する、と考えられている。

【0092】

後述するように、大きな角度の散乱、したがって、高い空間周波数は、像のコントラストに大きな影響を有する。

【0093】

簡単のため、投影された静電ポテンシャル

を有する１つの特定の原子の場合を考えてみよう。

【0094】

フーリエ空間では、静止した原子の散乱因子

は、モット−ベーテ（Mott-Bethe）の式で与えられる。

ｇが増加するにつれて、この因子の「テール（tail）」はゆっくりとのみ減少する（それは、原子の核の静電ポテンシャルの特異点の結果である。）、ということに注意されたい。

【0095】

原子がその平衡位置の周りに振動するので、我々は一種の平均化されたポテンシャルを定義することができる。

ここで、

は、原子位置の位置分布である。〈 〉は、異なる原子位置にわたる平均値を表している。

【0096】

すると、フーリエ変換は、

を生ずる。位置分布関数が平均２乗変位σを有するガウス分布である場合、我々は、

を有する。

【0097】

それのフーリエ変換

も、ガウス分布である。

【0098】

フーリエ空間では、原子の散乱因子

は、次にガウス型「デバイ−ウォーラー（Debye-Waller）」因子によって乗算される。

【0099】

通常、電子回折理論で作られるエラーは、原子がそれらの熱平均値で置換されているかのように、原子の電子散乱因子がデバイ−ウォーラー因子によって系統的に乗算されることである。この近似は、Ｘ線回折から借りられてきた。Ｘ線回折では、結晶格子の全ての原子が建設的に、回折された波に線形的に干渉する（フーリエ変換）。この線形性が線形の平均化と交換するので、回折されたビームは一種の平均化された原子を「見る」。しかし、この近似は、電子線回折には有効ではない。実際に、あるゆる電子が静止した原子（凍結された原子）を見て、異なる原子位置にわたる平均化が、像または回折パターンの検出のレベルで行われなければならない。原子はその中心に非常にシャープなポテンシャルを有しているので、電子はかなり高角度で散乱する。この高角度散乱は、平均で消えない。他方、もし原子がデバイ−ウォーラー因子によって「ぼけ」るならば、高角度散乱が人為的に低減され、その結果、熱散漫散乱が過小評価される。

【0100】

完全結晶の場合には、

が結晶の対称性を明らかにし、

が回折パターンのブラッグ（Bragg）ピークを明らかにする。非線形項（結晶性を乱す）は、散漫な強度背景を生成する。したがって、熱散漫散乱（ＴＤＳ）の項になる。

【0101】

図４ａ〜図４ｆは、炭素原子の電子散乱因子の寄与を示している。それによって、異なるＲＭＳについて、トータル４０２、コヒーレント４０４、インコヒーレント４０６の電子散乱の寄与が与えられている。図４ａ〜図４ｆは、σの様々な値について、すなわち、σ＝０．１Å、σ＝０．３Å、σ＝０．５Åについて、

のプロットを示している。非常に低いσ（０．１Å）（無機結晶について典型的である）については、インコヒーレントな寄与は比較的小さく、フーリエ空間内で非常に広い領域にわたって分布している。しかし、非常に大きなσ（０．５Å）（ソフトマターについて典型的である）については、インコヒーレントな寄与は、コヒーレントな寄与に匹敵し、比較的低い空間周波数（０．５Å^−１）でピークに達している。

【0102】

トータルのインコヒーレント（ＴＤＳ）の強度は、Ｉ＝Ｃσ^２Ｚ^２で与えられる。それは、ソフトマターにおける軽い原子のために重要であることができるように、Ｚ^２に比例するだけではなく、原子の平均２乗変位σ^２に比例する。

【0103】

像強度の式（６）に戻る。

【0104】

異なる原子位置〈 〉_Ａにわたって、像強度が平均化される場合、人は、

を得る。式（２３）から、人は、

および、したがって、

を得る。その結果、

となる。式（１５）を式（２６）と組み合わせると、

になる。

【0105】

人が、低いＣｓを有する高分解能モードで、かつ最適なフォーカスで、電子顕微鏡を操作した場合、減衰エンベロープと

における低い空間周波数の低下との組み合わせは、特に大きな平均変位を有する生体の原子について、式（３２）における項Ｉｍ《Ｔ》の寄与を大幅に低下させるだろう。

【0106】

それから、式（１４）中の項Ｖ^２＊Ｒｅ〈Ｔ〉は低い空間周波数に寄与するが、

の強い減衰のせいで、高い空間周波数は依然として抑制されるだろう。

【0107】

しかしながら、この項〈〈｜Ｖ×Ｔ｜^２〉_Ｍ〉_Ａは、依然として非常に高分解能のコントラストを与えることができる。

【0108】

これは以下のように見ることができる。

と定義すると、

となる。

【0109】

フーリエ空間では、これは、

であり、これは、上述のように、熱散漫散乱を表す。

【0110】

人は、今、

を有している。

【0111】

畳み込みは周波数帯域を広げているけれども、減衰エンベロープ

のせいで、第１項は依然として低い空間周波数に限定されている。

【0112】

しかし、第２項は、高い空間周波数においてはるかに重要である。実際に、ＷはＴＤＳ電子の寄与であるので、それは依然として非常に大きな角度で散乱する。

【0113】

図５は、この寄与は、ｇ＝１Å付近でピークに達していることを示している。図５は、複合体Δｆ＝０．０、Δ＝０．０、α＝０．０の凍結原子像計算を示している。トータル（黒色の曲線）、弾性（赤色の曲線）、および非弾性（青色の曲線）の、異なるＲＭＳについての回転的平均パワースペクトルは、ａ）σ＝０．１Å、ｂ）σ＝０．３Å、ｃ）σ＝０．５Å、Δｆ＝１０．９ｎｍである。

【0114】

Ｗ＊Ｔの情報は、依然として像内に非局在化され得る。しかし、この非局在化は位相伝達

のグラディエントに比例するので、〈〈｜Ｗ×Ｔ｜^２〉〉_Ｍ，Ａの寄与が非常に高い分解能を得ることができるように、ＴＤＳ電子の周波数帯域

にわたって

を一定に維持することによって、それは最小限に抑えられ得る。

【0115】

〈〈｜Ｗ×Ｔ｜^２〉〉_Ｍ，Ａの寄与だけを選択することが可能である。

【0116】

これは、環状暗視野絞りを使用し、また、ＴＤＳ寄与の周波数帯域と一致するように、内側と外側の半径を選択することによって、また、位相がこの帯域にわたって略一定である位相伝達関数を合わせることによって、なされ得る。

【0117】

最適な半径は、対象物の原子の平均２乗変位に依存している。しかし、この帯域は、Ｃｓ補正器の使用を必要とする０．５Å^−１と１．０Å^−１との間の範囲に幾分か位置していることが期待され得る。

【0118】

図６および図７は、それぞれａＨｂｐＳ複合体の暗視野像の明視野のシミュレーションを示している。これから、暗視野ＡＤＦ振幅像は、高いコントラストと原子分解能の両方をもたらすことが明らかである。図６について、使用された電子顕微鏡のパラメータは、加速電圧（Ｅ０＝３００ＫｅＶ）、デフォーカス広がり（＝３．２ｎｍ）、半収束角度ｍｒａｄ）、球面収差（Ｃ_ｓ＝０．０４ｍｍ）、デフォーカス（ｆ＝１０．９ｎｍ）である。デフォーカス広がり（時間的インコヒーレンス）は、異なるデフォーカス値での像強度を追加することによって正しく補正される。図７について、そこでは環状暗視野絞り（ｇ_ｍｉｎ＝０．５Å^−１、ｇ_ｍａｘ＝２．０^−１）を用いた凍結原子像計算が示されている。使用された電子顕微鏡のパラメータは、加速電圧（Ｅ０＝３００ＫｅＶ）、デフォーカス広がり（＝３．２ｎｍ）、半収束角度ｍｒａｄ）、球面収差（Ｃ_ｓ＝０．０４ｍｍ）、デフォーカス（ｆ＝１０．９ｎｍ）である。デフォーカス広がり（時間的インコヒーレンス）は、異なるデフォーカス値での像強度を追加することによって正しく補正される。

【0119】

原子の組み立てのために、人は、

を有する。

を原子の像波のＴＤＳ部分と呼ぼう。

式（２２）から、人は、

を有する。強度について、人は、今、

を有する。また、独立した原子の運動（アインシュタインモデル（Einstein Model））を仮定すると、人は、

を有する。その結果、

となる。

【0120】

その後、各原子のインコヒーレントな寄与は、独立して最終的な像に追加される。

【0121】

この結果は、高分解能の像の解釈を簡素化し、それは断層再構成アルゴリズムに非常に適している。

【0122】

一実施形態では、通常の投影近似では、あらゆる原子が像に対して同一の寄与を有すると仮定されているが、３次元対象物では、原子が異なる鉛直位置、したがって僅かに異なるデフォーカスを有する、ということが考慮される。式（３４）から要求されるように、通過帯域は、インコヒーレントピーク（図３）を越えて略一定でなければならない。上記から、次のように、通過帯域は、Δε＝０．５Ｓｃｈのオーダのデフォーカスで、幾分かのシフトを可能にすることができる。最適なデフォーカスで、Ｃ_ｓ＝１０μｍ、３００ＫｅＶの場合、我々は、Δε＝２ｎｍを有する。しかし、インコヒーレント強度が約０．５Å^−１でピークを示すので、我々は、Ｃ_ｓ＝１００μｍ、それからΔε＝６ｎｍを使用でき、その結果、要件は依然として最大１２ｎｍまでの厚さの粒子に対して満たされる。この条件が満たされない場合、人は、断層撮影スキームの第２の実行で、このデフォーカス効果を補正することができる。

【0123】

ＴＤＳ電子を用いて高分解能の像を得ることが可能であることが示された。その像のコントラストは振幅コントラストである。ソフトマターについてであっても、そのコントラストは非常に高くなり得る。平坦な伝達関数で、小さなデフォーカス、および、Ｃｓ補正がなされた電子顕微鏡、および、適切な絞りを用いて、撮像がなされた場合、分解能は、電子顕微鏡の限界に近づくことができる。さらに、あらゆる原子がそれ自身の像強度に独立して寄与し、そのことが像の解釈を容易にし、断層撮影スキームに適切になる。

【0124】

さらなる例として、熱散漫散乱の例が議論される。その例は、ソフトマターのＴＤＳ電子の信号は比較的大きくあり得る、ということを示している。何故ならば、その信号は、原子の原子番号だけでなく、平均２乗変位（ＭＳＤ）の関数だからである。ＴＤＳ散乱はインコヒーレントであり、したがって、中心ビームと干渉せず、その結果、最高の分解能を得るように非常に低いＣｓを小さなアンダーフォーカスとを組み合わせることによって、ＴＤＳ散乱は振幅のコントラストを生成し、それは位相伝達関数が平坦にされ得る空間周波数で最大となる。さらに、ＴＤＳの信号は、「質量厚さ（mass-thickness）」内で線形であり、解釈するのが容易で、その結果、それは断層撮影のために非常に適している。また、特に、この撮像技術のために最適化された環状暗視野対物絞りを用いることが提案されている。或る意味では、この方法は、ＨＡＡＤＦ ＳＴＭに匹敵するが、ＨＥＲＭの全ての利点を有する。

【0125】

実際の対象物では、原子は静止しているのではなく、それらは平均位置の周りに振動している。これは、一般に、デバイ−ウォーラー因子（像のコントラストに僅かな影響で、大きな散乱角度での散乱を低減する）を用いて適切に記載することができると考えられている。しかし、これは、撮像目的のために有利に利用することができる誤解である。（その原子の）平衡位置の周りに振動する単一原子の撮像を考えてみよう。弱い位相近似では、単一原子のＨＥＲＭ像強度は、

によって与えられる。ここで、Ｖは原子のポテンシャルであり、Ｗ＝Ｖ−〈Ｖ〉は原子変位に起因するＴＤＳを記述し、Ｔは顕微鏡の点広がり関数である。＊は畳み込みを表し、〈 〉_Ａは原子位置にわたった平均化を表している。〈 〉_Ｍは、顕微鏡にわたって、インコヒーレンスを平均化することを表し、したがって、生体のように大きな平均変位を有する原子のための分解能を特に低減するように、〈Ｔ〉内の線形項の減衰エンベロープを引き起こす。他方、Ｗ＊Ｔの非線形のＴＤＳの寄与は、それでも、大きな空間周波数で強い信号を与えることができる。Ｔにおける位相振動のせいで、それは像内で非局在化され得る。しかし、この非局在化は、伝達関数の通過帯域を、図８ａ及び図８ｂに示すようにｇ＝１Å付近でピークに達するこの空間周波数までシフトすることによって、最小化され得る。トータル信号４０２、コヒーレント信号４０４、および、インコヒーレント信号４０６を表す信号が示されている。

【0126】

ＴＤＳの寄与と合う環状暗視野絞り［２］を用いることによって、また、位相がこのピークを越えて略一定であるようにＣｓとデフォーカスを最適化することによって、ＴＤＳ信号のみを選択することができる。図８ａおよび図８ｂはＨｂｐＳ複合体の回転平均パワースペクトルを示している。図８ａは３００ＫｅＶでの回折パターンを示し、また、図８ｂはデフラクトグラムを示している（Ｅ０＝３００ＫｅＶ、Δ＝３．２ｎｍ、α＝０．２ｍｒａｄ、Ｃ_ｓ＝０．０４ｍｍ、Δｆ＝１０．９ｎｍ）。図９は、ＨｂｐＳ複合体の、ａ）トータル、ｂ）コヒーレント、および、ｃ）インコヒーレントの強度の暗視野像のシミュレーションを示している。図８ａ、図８ｂおよび図９から、このＴＤＳ撮像モードは、高いコントラストと原子の分解能との両方をもたらすことが明らかである。我々が原子の運動は無相関（アインシュタインモデル）であると仮定した場合、各原子のＴＤＳの寄与はインコヒーレントに最終的な像に（独立して）加えられる。そのことは、高分解能像の解釈を簡素化し、それは断層撮影の再構成アルゴリズムに非常に適している。また、３Ｄ対象物内の原子のデフォーカスにおける僅かな相違を補正することも可能である。図８ａおよび図８ｂでは、環状暗視野絞り（ｇ_ｍｉｎ＝０．５Å^−１、ｇ_ｍａｘ＝２．０^−１）を用いた、複合体ＨｂｐＳの凍結原子像計算が示されている。以下のパラメータが使用されている：ａ）３００ＫｅＶでの回折、および、ｂ）電子顕微鏡パラメータのためのデフラクトグラム（Ｅ０＝３００ＫｅＶ、Δ＝３．２ｎｍ、α＝０．２ｍｒａｄ、Ｃ_ｓ＝０．０４ｍｍ、Δｆ＝１０．９ｎｍ）。ＲＭＳ（σ）＝０．５Åについての、トータル、コヒーレント、および、インコヒーレントの回転平均パワースペクトルが示されている。図９は、環状暗視野絞り（ｇ_ｍｉｎ＝０．５Å^−１、ｇ_ｍａｘ＝２．０^−１）を用いた、複合体ＨｂｐＳの凍結原子像計算を示している。それによって、次の電子顕微鏡パラメータが使用されている：加速電圧（Ｅ０＝３００ＫｅＶ）、デフォーカス広がり（Δ＝３．２ｎｍ）、半収束角度（α＝０．２ｍｒａｄ）、球面収差（Ｃ_ｓ＝０．０４ｍｍル）、デフォーカス（Δｆ＝１０．９ｎｍ）。ａ）トータルの強度、ｂ）コヒーレントの強度の寄与、および、ｃ）インコヒーレントの強度の寄与である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図4e】

【図4f】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8a】

【図8b】

【図9a)】

【図9b)】

【図9c)】