特許 6351864 癌の併用療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6351864

(24)【登録日】2018年6月15日

(45)【発行日】2018年7月4日

(54)【発明の名称】癌の併用療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20180625BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180625BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180625BHJP

   A61K 31/4439 20060101ALI20180625BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20180625BHJP

   A61P 1/00 20060101ALN20180625BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 NZNA

   A61P35/00

   A61P43/00 121

   A61K31/4439

   !C07K16/28

   !A61P1/00

【請求項の数】8

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2017-542862(P2017-542862)

(86)(22)【出願日】2016年8月10日

(65)【公表番号】特表2018-506549(P2018-506549A)

(43)【公表日】2018年3月8日

(86)【国際出願番号】US2016046259

(87)【国際公開番号】WO2017027544

(87)【国際公開日】20170216

【審査請求日】2017年8月15日

(31)【優先権主張番号】62/204,088

(32)【優先日】2015年8月12日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】516183141

【氏名又は名称】イムクローン リミテッド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100147131

【弁理士】

【氏名又は名称】今里 崇之

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】チンサラパリ，サダカール アール．

(72)【発明者】

【氏名】フィシュル，アンソニー エス．

(72)【発明者】

【氏名】ピーク，ヴィクトリア リン

(72)【発明者】

【氏名】ウォルグレン，リチャード エー．

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，ソウ チ ベティ

【審査官】 深草 亜子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５２９０５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第６２５５０８６（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 Lancet Oncol.，２０１４年，Vol.15，p.1224-1235

【文献】 Plos One，２０１３年，Vol.8，e54014

【文献】 ClinicalTrials.gov archive, View of NCT01285037 on 2015_05_17[online]，[retrieved on 2017-12-27]. Retrieved from the Internet:<URL: https://clinicaltrials.gov/archive/NCT01285037/2015_05_17>.

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

Ａ６１Ｋ ３９／３９５−３９／４４

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦＲ２に結合する抗体の有効量と、式：

【化1】

で示される化合物又はその医薬的に許容し得る塩の有効量と、を含む、患者における胃癌を処置するための医薬組成物であって、
前記抗体及び前記化合物又はその医薬的に許容し得る塩が、同時に、分離して又は連続で投与される、医薬組成物。

【請求項2】

前記化合物が、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記抗体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の軽鎖アミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の重鎖アミノ酸配列と、を含む、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

前記化合物又はその塩が、約８０ｍｇ／日〜約１２０ｍｇ／日の用量で投与され、前記抗体が、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの用量で３週間毎に１回投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

胃癌の処置のための、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦＲ２に結合する抗体と、式：

【化2】

で示される化合物又はその医薬的に許容し得る塩と、を含むキット。

【請求項6】

前記抗体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の軽鎖アミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の重鎖アミノ酸配列と、を含み、前記化合物が、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドである、請求項５に記載のキット。

【請求項7】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列を含む抗ＶＥＧＦＲ２抗体と、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容し得る塩と、を含む胃癌の処置のための組合せ薬であって、前記抗体及び前記化合物又はその医薬的に許容し得る塩が、同時に、分離して又は連続で投与される、組合せ薬。

【請求項8】

前記化合物又はその塩が、約８０ｍｇ／日〜約１２０ｍｇ／日の用量で投与され、前記抗体が、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの用量で３週間毎に１回投与される、請求項７に記載の組合せ薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ヒトＶＥＧＦＲ２抗体、好ましくはラムシルマブと、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドとの組合せ、及びその組合せを利用して胃癌などの特定の障害を処置する方法に関する。

【0002】

本発明は、胃癌処置の分野のものである。

【背景技術】

【0003】

ＭＫＮ４５胃癌細胞は、ＭＥＴのゲノム増幅を高レベルで有し、ＭＥＴ経路の構成的活性化をもたらす。

【0004】

ラムシルマブ（Cyramza（登録商標））は、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）に対する完全ヒト型モノクローナル抗体である。固形腫瘍及び非固形腫瘍などの新生物疾患の処置などのためのラムシルマブ 並びにこの化合物を生成及び使用する方法が、国際公開第２００３／０７５８４０号に開示されている。ラムシルマブは、先行のフルオロピリミジン含有若しくはプラチナ含有化学療法の最中又はその後に疾患が進行している、切除不能な又は転移した胃又は胃食道（ＧＥ）接合部腺癌患者の処置のために単独薬剤又はパクリタキセルとの併用として；プラチナを基にした化学療法の最中又はその後に疾患が進行している、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の処置のためにドセタキセルとの併用として；そしてベバシズマブ、オキサリプラチン及びフルオロピリミジンでの先行治療の最中又はその後に疾患が進行している転移性大腸癌（ｍＣＲＣ）患者の処置のためにＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン、フォリン酸、及び５−フルオロウラシル）化学療法との併用として、米国ＦＤＡによって認可されている。

【0005】

Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドは、ＭＥＴに対して活性がある。Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド、並びに癌処置のため、より具体的には胃癌処置のためなどでこの化合物を生成及び使用する方法が、国際公開第２０１０／０１１５３８号に開示されている。さらにＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドは現在、米国における切除不能な癌に関して第一相臨床試験（切除不能な癌の患者におけるＬＹ２８０１６５３の第一相試験、ＮＣＴ０１２８５０３７）で検討されている。この試験の一部の目的は、ラムシルマブと共に投与された場合に胃癌を有する治験登録者へ安全に投与され得る、ＬＹ２８０１６５３の推奨される第二相試験用量を決定することである。
（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01285037?term=LY2801653&rank=2）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

胃癌の治癒は、依然として困難であり、胃癌を処置するのに効果的であることを立証し得るさらなる治療及び異なる治療が求められている。

【0007】

ＶＥＧＦＲ２の阻害剤とＭＥＴ阻害剤との組合せは、当該技術分野で企図されてきたが、驚くべきことに、本発明は、抗ＶＥＧＦＲ２抗体とＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドとの組合せを使用することによって胃癌を処置する方法を、いずれかの薬物の単独によって提供された治療効果に比較して、これらの治療剤の併用による活性から増強された、そして／又は予想外の有益な治療効果を提供する特異的治療レジメンの一部として開示する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の第一の態様によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦＲ２に結合する抗体の有効量と、式：

【化1】

で示される化合物又はその医薬的に許容可能な塩と、をそのような処置を必要とする胃癌患者に投与することを含む、患者における胃癌を処置する方法が提示される。

【0009】

本発明の別の態様は、胃癌の処置のための、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦＲ２に結合する抗体と、式：

【化2】

で示される化合物又はその医薬的に許容可能な塩と、を含むキットである。

【0010】

本発明の別の態様は、胃癌の処置のための、１種又は複数の医薬的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含むラムシルマブと、１種又は複数の医薬的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含むＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩と、を含むキットである。

【0011】

本発明の好ましい態様において、該化合物は、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドである。

【0012】

本発明の別の好ましい態様において、該抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の軽鎖アミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の重鎖アミノ酸配列と、を含み、該抗体は、ＶＥＧＦＲ２に結合する。

【0013】

本発明の別の好ましい態様において、該抗体は、ラムシルマブである。

【0014】

本発明の別の好ましい態様において、該化合物又はその塩は、約８０ｍｇ／日〜約１２０ｍｇ／日の用量で投与される。

【0015】

本発明の別の好ましい態様において、ラムシルマブは、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの用量で３週間毎に１回投与される。

【0016】

本発明の別の好ましい態様において、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩は、錠剤である。

【0017】

本発明の別の好ましい態様において、該錠剤は、噴霧乾燥分散体によって配合される。

【0018】

本発明の別の態様は、胃癌の処置における同時、分離又は連続使用のための、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、好ましくはラムシルマブと、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩と、を含む組合せである。本発明の好ましい態様において、該化合物又はその塩は、約８０ｍｇ／日〜約１２０ｍｇ／日の用量で投与される。本発明の別の好ましい態様において、ラムシルマブは、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの用量で３週間毎に１回投与される。

【0019】

本発明の別の態様は、胃癌の処置のためにＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩との同時、分離又は連続処置において使用される抗ＶＥＧＦＲ２抗体である。

【0020】

本発明の別の態様は、胃癌の処置のために抗ＶＥＧＦＲ２抗体との同時、分離又は連続処置において使用されるＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩である。

【0021】

本発明の別の好ましい態様において、抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、ラムシルマブである。

【0022】

本発明の別の態様は、胃癌の処置のためにＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩との同時、分離又は連続処置において使用されるラムシルマブである。

【0023】

本発明の別の態様は、胃癌の処置のためにラムシルマブとの同時、分離又は連続処置において使用されるＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩である。

【0024】

本発明の別の態様は、胃癌の処置のための薬剤の製造における抗ＶＥＧＦＲ２抗体の使用であり、該抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩と同時に、分離して、又は連続で投与される。

【0025】

本発明の別の態様は、胃癌の処置のための薬剤の製造におけるＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩の使用であり、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩は、抗ＶＥＧＦＲ２抗体と同時に、分離して、又は連続で投与される。

【0026】

本発明のさらに別の好ましい態様において、抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、ラムシルマブである。

【0027】

本発明の別の態様は、胃癌の処置のためにＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩と併用で同時、分離又は連続使用される抗ＶＥＧＦＲ２抗体である。

【0028】

本発明の別の態様は、胃癌の処置のために抗ＶＥＧＦＲ２抗体と併用で同時、分離又は連続使用されるＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本明細書で用いられる化合物Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドは、国際公開第２０１０／０１１５３８号に開示されており、以下の構造：

【化3】

を有する化合物を指す。

【0030】

この化合物のＣＡＳ登録番号は、１２０６７９９−１５−６である。化合物名には、３−ピリジンカルボキサミド，Ｎ−［３−フルオロ−４−［［１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］オキシ］フェニル］−１−（４−フルオロフェニル）−１，２−ジヒドロ−６−メチル−２−オキソ−；Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド；Ｎ−（３−フルオロ−４−｛［１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］オキシ｝フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド；及びＬＹ２８０１６５３がある。ＬＹ２８０１６５３の代謝産物としては、

【化4】

１−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−［３−フルオロ−４−［［６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］オキシ］フェニル］−６−メチル−２−オキソ−ピリジン−３−カルボキサミド、及び

【化5】

Ｎ−［３−フルオロ−４−［１-メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）インダゾール−５−イル］オキシ−フェニル］−１−（４−フルオロフェニル）−６−（ヒドロキシメチル）−２−オキソ−ピリジン−３−カルボキサミドが挙げられる。

【0031】

本明細書で用いられる用語「ＶＥＧＦＲ２」は、当該技術分野で知られる血管内皮増殖因子受容体２を指す。ＶＥＧＦＲ２は、ＫＤＲとしても知られる。

【0032】

本明細書で用いられる用語「抗ＶＥＧＦＲ２抗体」は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、を含む抗体を指し、該抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、十分な親和性及び特異性でＶＥＧＦＲ２に結合する。幾つかの実施形態において、抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される軽鎖と、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される重鎖と、を含み、十分な親和性及び特異性でＶＥＧＦＲ２に結合する抗体である。本発明の別の実施形態において、抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、ラムシルマブである。選択された抗体は、ＶＥＧＦＲ２に対して十分に強い結合親和性を有する。例えば該抗体は、一般に約１００ｎＭ〜約１ｐＭのＫ_ｄ値でＶＥＧＦＲ２と結合する。抗体親和性は、例えば表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（ＰＣＴ出願国際公開第２００５／０１２３５９号に記載されたBIAcoreアッセイなど）；酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）；及び拮抗アッセイ（例えば、放射線標識された抗原結合アッセイ（ＲＩＡ））によって測定することができる。一実施形態において、Ｋｄは、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、好ましくはラムシルマブを用いて実施されたＲＩＡにより測定される。

【0033】

本明細書で用いられる用語「ラムシルマブ」は、Cyramza（登録商標）、ＩＭＣ−１１２１ｂ、ＣＡＳ登録番号９４７６８７−１３−０としても知られ、各軽鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される該軽鎖２つと、各重鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される該重鎖２つと、を含む抗ＶＥＧＦＲ２抗体を指す。

【0034】

本明細書で用いられる用語「ＤＣ１０１」は、マウスにおいて抗ＶＥＧＦＲ２抗体、好ましくはラムシルマブの代用物として実験で用いられ得るマウスＶＥＧＦＲ２に対するラットモノクローナル抗体を指す。例えばWitte L., et al Cancer Metastasis Rev., 17, 155-161, 1998を参照されたい。

【0035】

他に断りがなければ、用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に結合された重鎖（ＨＣ）２つ及び軽鎖（ＬＣ）２つを含む免疫グロブリン分子を指す。各鎖のアミノ末端部分は、含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を介して抗原認識を主に担う約１００〜約１１０アミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を画定する。

【0036】

本明細書で用いられる用語「軽鎖可変領域」又は「ＬＣＶＲ」は、ＣＤＲ及びＦＲのアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖の部分を指す。

【0037】

本明細書で用いられる用語「重鎖可変領域」又は「ＨＣＶＲ」は、ＣＤＲ及びＦＲのアミノ酸配列を含む抗体分子の重鎖の部分を指す。

【0038】

本明細書で用いられる用語「キット」は、第一のコンテナがＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩を含み、第二のコンテナが抗ＶＥＧＦＲ２抗体を含む、少なくとも２つの分離したコンテナを含む包装を指す。「キット」はまた、これらの第一及び第二のコンテナの内容物の全て又は一部を癌患者、好ましくは胃癌患者に投与するための取扱説明書を含み得る。

【0039】

本明細書で用いられる用語「処置すること」、「処置する」、又は「処置」は、安定した疾患を抑制すること、緩徐化すること、停止させること、低減すること、縮小すること、維持すること、又は既存の症状、障害、状態若しくは疾患の進行若しくは重症度を後退させることを指す。

【0040】

本明細書で用いられる用語「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。

【0041】

本明細書で用いられる用語「癌」及び「癌性」は、典型的には未制御な細胞増殖を特徴とする患者の生理学的状態を指す、又はそれを説明する。この定義に含まれるのが、良性及び悪性癌である。「早期ステージの癌」又は「早期ステージの腫瘍」は、切除不能でない若しくは転移性でない、又はステージ０、Ｉ若しくはＩＩの癌と分類される癌を意味する。癌の例としては、胃癌が挙げられるが、これに限定されない。

【0042】

本発明の併用処置の主な利点は、患者が全体として併用処置法から利益を享受するように、顕著な毒性又は有害作用を起こすことなく患者において著しい抗癌作用を生じる能力である。本発明の併用処置の有効性は、非限定的に腫瘍抑制、腫瘍重量又はサイズの縮小、進行までの期間、全生存、無増悪生存、全応答率、応答期間、及び生活の質をはじめとする、癌処置を評価する際に一般に用いられる様々なエンドポイントによって測定され得る。本発明で用いられる治療剤は、原発腫瘍の縮小を伴わずに転移拡大の阻害を誘起し得る、原発腫瘍の縮小を誘発し得る、又は単に腫瘍増殖抑制（tumoristatic）作用を発揮し得る。本発明は、特有の抗腫瘍剤と併用した使用に関するため、例えば血管新生の血漿又は尿マーカの測定、及び放射線画像による応答の測定をはじめとする、本発明の任意の特定の併用療法の有効性を測定する新規なアプローチが、場合により用いられ得る。

【0043】

本明細書で用いられる用語「有効量」は、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩の量又は用量、及び診断又は処置を受けた患者において効果的応答を提供する抗ＶＥＧＦＲ２抗体の量又は用量を指す。

【0044】

本明細書で用いられる用語、薬剤との併用処置に対する患者の「効果的応答」又は患者の「応答性」は、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩と、抗ＶＥＧＦＲ２抗体と、の投与によって患者に付与される臨床又は治療利益を指す。

【0045】

Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩の日用量は通常、約８０ｍｇ／日〜１２０ｍｇ／日の範囲内に含まれる。

【0046】

３週間周期あたりのラムシルマブの投与量は通常、約６〜１２ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約８〜約１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内に含まれる。

【0047】

抗ＶＥＧＦＲ２抗体と併用で、例えば２１日周期で投与される場合に、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩は、約８０ｍｇ／日〜約１２０ｍｇ／日の範囲内で連日投与され、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、好ましくはラムシルマブは、約６〜１２ｍｇ／ｋｇの範囲内で１日目に投与される。

【0048】

遊離塩基のＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドが、好ましい。しかし、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドが、多数の無機及び有機酸のいずれかと反応して、医薬的に許容可能な酸付加塩を形成し得ることは、熟練の読者に理解されよう。そのような医薬的に許容可能な酸付加塩及びそれらを調製するための一般的方法論は、当該技術分野で周知である。例えばP. Stahl, et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (VCHA/Wiley-VCH, 2002); L.D. Bighley, et al., Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 453-499 (1995); S.M. Berge, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 66, 1, (1977)を参照されたい。塩酸塩及びメシル酸塩が、好ましい塩である。メシル酸塩は、特に好ましい塩である。

【0049】

Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩は、当該技術分野で知られる様々な手順（例えば、国際公開第２０１０／０１１５３８号参照）により調製され得る。ラムシルマブは、例えば国際公開第２００３／０７５８４０号の開示により生成され得る。

【0050】

投与経路は、任意の方法で多様に変えることができるが、薬物の物理学的特性、並びに患者及び看護者の簡便性によって限定され得る。好ましくは、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、好ましくはラムシルマブは、静脈内又は皮下投与などの非経口投与用に配合される。好ましくはＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩は、経口投与、又は静脈内若しくは皮下投与などの非経口投与用に配合される。

【0051】

例えばＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドは、錠剤に配合され得る。そのような錠剤は、２０％Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド：ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセタートスクシナート（ＨＰＭＣＡＳ）中級（Ｍ）（ＨＰＭＣＡＳ−Ｍ）噴霧乾燥分散体（ＳＤＤ）の組成から生成され得る。２０％Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド：ＨＰＭＣＡＳ−Ｍ ＳＤＤは、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド（１％）、ＨＰＭＣＡＳ−Ｍ（４％）、アセトン（８５．５％）及び精製水（９．５％）を含有する噴霧溶液組成物（ｗｔ％）から生成される。Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの添加前に、該ポリマーをアセトン／水溶液に完全に可溶化することを確実にする。ＳＤＤ組成物を生成するために噴霧乾燥を開始する前に、該ポリマーが溶解していることを目視で確認する。得られたＳＤＤ組成物は、２０％Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド：ＨＰＭＣＡＳ−Ｍ ＳＤＤ（ｍｇ／ｇ）であり、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド（２００ｍｇ／ｇ）及びＨＰＭＣＡＳ−Ｍ（８００ｍｇ／ｇ）である。必要に応じて、薬物の量を、薬物のアッセイを考慮して調整することができる。物質収支を維持する必要があれば、ＨＰＭＣＡＳ−Ｍの重量を、薬物のアッセイにおけるわずかな変動に従って調整することができる。アセトン及び精製水は、処理する際に残留濃度まで除去する。該配合組成物は、例えばＳＤＤのＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド及び他の賦形剤、例えば希釈剤（例えば、微結晶セルロース及びマンニトール）、崩壊剤（例えば、クロスカルメロースナトリウム）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、滑剤（例えば、Syloid二酸化ケイ素）及び／又は滑沢剤（例えば、フマル酸ステアリルナトリウム）を含有し得る。該錠剤の生成は、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドのＳＤＤを製造するための噴霧乾燥と、次のローラー圧縮及び打錠を含む。該錠剤はその後、ＨＰＭＣを基にした着色混合物でフィルムコーティングされる。

【0052】

Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドＳＤＤフィルムコーティング錠（４０ｍｇ有効成分含量）の単位配合物の例示的錠剤を、チャート１に記載する。

【表1】

【0053】

本明細書で用いられる成句「との併用」は、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容可能な塩と、抗ＶＥＧＦＲ２抗体と、の投与を指す。

【実施例】

【0054】

以下の実施例は、非限定的にラムシルマブ（マウスでラムシルマブの代用物として用いられるラット抗マウスモノクローナル抗体ＤＣ１０１を介して）をはじめとする抗ＶＥＧＦＲ２抗体とＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドとの併用の予測されなかった改善を示す。

【0055】

胃癌用のマウス異種移植片モデルＭＫＮ４５においてＤＣ１０１と併用されるＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの抗腫瘍効果

【0056】

Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドを、１０％ＰＥＧ４００／９０％（水中の２０％Captisol（登録商標））中の溶液として配合して、投与の各週に新しく調製する。ＤＣ１０１を、投与の各週にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈する。

【0057】

ＭＫＮ４５細胞を得て、１０％ＦＢＳを補充されたDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（ＤＭＥＭ）において３７℃、５％ＣＯ_２で培養する。ＰＢＳ中におよそ５×１０^６個の細胞を、同容量のMatrigel（BD Bioscience、NJ州Franklin Lakes）と混合し、次に動物の脇腹に皮下移植する。移植後１８日目に、動物を９群に無作為に割り付ける。Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドを、１２ｍｇ／ｋｇで強制経口投与により投与し、ＤＣ１０１を２０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射により投与する。Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの１日１回及びＤＣ１０１の週２回の投与計画による２６日間の連続投与。合計７用量のＤＣ１０１を、試験の過程で投与する。腫瘍体積及び体重を週に２回測定する。試験終了時に、動物をＣＯ_２及び頸椎脱臼で殺処分する。

【0058】

腫瘍体積を対数スケールに変換して、時間及び処置群間で分散を等しくする。SAS（登録商標）ソフトウエア（Version 9.3）でのMIXEDの手順を利用して、対数の体積データを時間及び処置による反復測定の二元配置分散分析で解析する。反復測定の相関モデルは、空間検定力（spatial power）である。各時点で、処置群を対照群と比較する。これと別に、MIXED手順を各処置群について用いて、各時点の調整平均及び標準誤差を計算する。両方の解析によって、各動物内の自己相関、及び試験終了前に動物を除去又は喪失した場合に生じたデータ損失が考慮される。調整平均及び標準誤差を、各処置群で時間に対してプロットする。これらのデータを、２つの処置を併用した場合の相加を上回る効果増大の統計的証拠（「ｓ．ｅ．」）についても解析する。この解析は、SAS（登録商標）ソフトウエア（Version 9.3）を利用して、ビヒクル群、各単独薬剤群、及び各単独薬剤の併用群を用いて、対数の体積に及ぼす２×２交互作用の有意性について検定することによって実施される。この解析を用いて、作用の相乗効果を評価する。

【0059】

体重測定は、様々な処置の耐容性の指標を提供する。体重の統計学的に有意でない減少が、処置によって観察された。ビヒクル対照群の１匹は、潰瘍化した腫瘍があったため安楽死させた。処置関連の死亡は、この試験では報告されなかった。

【0060】

単独療法としてのＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドは、統計学的に有意な抗腫瘍活性を示し、測定最終日（４２日目）のＴ／Ｃ（処置群／対照群）値が４．４％（ｐ＜０．００１）であった。ＤＣ１０１は、いずれかの単独薬で抗腫瘍活性を示し、Ｔ／Ｃ値１５．０％であった（ｐ＜０．００１）。いずれかの薬物単独での低いＴ／Ｃから、いずれかの単独薬での処置がビヒクル対照に比較して腫瘍成長を強力に緩徐化することが示された。これらのいずれかの薬剤単独で処置された動物は、この胃腫瘍モデルにおいて癌処置の「安定した疾患」の臨床的に同等の応答を実現した。Therasse et al. New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. J Natl Cancer Inst. 2000;92:205-216。Eisenhauer et al. New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). Eur J Cancer. 2009;45:228-247。

【0061】

Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドとＤＣ１０１との併用は、ビヒクル対照と比較して腫瘍の退縮（２８．５％）（ｐ＜０．００１）をもたらし、この活性は、単独療法として投与された各分子よりも大きかった。

【0062】

Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドとＤＣ１０１との併用は、相加的であり（表１）、各単独療法と比較して統計学的に異なっていた（表２）。したがって、胃癌などの固形腫瘍タイプにおけるこれらの二剤の併用処置は、相加的で、各単独薬よりもさらに抗腫瘍効果を有することが見出された。より重要なこととして、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドとＤＣ１０１との併用処置によって得られた、対照と比較して２８．５％の腫瘍退縮（腫瘍縮小）効果は、予想外であり、治療上有益であった。胃の固形腫瘍モデルにおけるこれらの二剤のインビボ併用処置は、腫瘍縮小／退縮をもたらし、治療上有益であった。

【表2】

【表3】

【0063】

ラムシルマブ及びＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド処置の併用は内皮細胞発芽を減少させる

【0064】

インビトロでの細胞に基づくアッセイによって内皮細胞発芽のインビトロ減少を測定する。このアッセイを利用して、内皮細胞発芽に及ぼすＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド及びラムシルマブの影響を測定する。

【0065】

培養フラスコ（Corning # 356486）において、SingleQuotsキット（Lonza # CC-4147）を補充され、さらにFBSサプリメントを最終的に１０％ＦＢＳになるように加えられたEBM2培地（Lonza # CC-3156）中で、ＨＵＶＥＣ（Lonza # C2519A）を５％ＣＯ_２中、３７℃で培養して、第２〜５継代で使用した。ＨＵＶＥＣを培養フラスコから回収して、Hyclone（商標） Dulbecco’s PBS（ＤＰＢＳ）（Fisher Scientific, #SH3026402）で、その後TypeLE Express（Gibco #12605-010）ですすぎ、５ｍＬの加温した培地で懸濁させた。生存可能な細胞の数を、Vi-Cell細胞カウンタ（Beckman）を使用して測定した。Corning培養フラスコにおいて、SingleQuotsキット（Lonza # CC-4126）を補充され、さらにＦＢＳ（Hyclone（商標）# SH3061102）サプリメントを最終的に１０％ＦＢＳになるように加えられたFBM培地（Lonza # CC-3131）中で、ＣＡＦ（肺癌関連線維芽細胞）（Astrand、60093A、Lillyのために特別に調製）を５％ＣＯ_２中、３７℃で培養して、第３〜７継代で使用した。ＣＡＦを培養フラスコから回収して、Hyclone（商標）ＤＰＢＳ（Fisher Scientific, #SH3026402）で、その後TypeLE Express（Gibco #12605-010）ですすぎ、５ｍＬの加温した培地で再懸濁させた。生存可能な細胞の数を、Vi-Cell細胞カウンタ（Beckman）を使用して測定した。

【0066】

乾燥Cytodex（登録商標）ビーズ（Sigma-Aldrich（登録商標）、cat# C3275）０．５ｇを、HyClone（商標）DPBS pH 7.4（Fisher Scientific、cat# SH3026402）５０ｍＬで、室温で少なくとも３時間水和させる。ビーズを含む試験管（Falcon、cat# 352098）を０．５時間毎に穏やかに転倒混和する。上清を廃棄する。ビーズを新しいＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ ５０ｍＬに再懸濁させて、約２０，０００個／ｍＬのビーズを得る。ビーズ懸濁液を１１５℃で１５分間オートクレーブにかけて、使用まで４℃で貯蔵する。

【0067】

ビーズを穏やかに混合して、懸濁液０．５ｍＬ（ビーズおよそ１０，０００個）を５０ｍＬ試験管（Falcon、cat# 352098）に移す。ビーズを加温したEBM2培地（Lonza、cat#CC-3156）＋SingleQuots（商標）（Lonza、cat#CC-4147）１０ｍＬで２回洗浄する。最後の洗浄の後、培地を注意深く除去する。洗浄されたビーズを、総容量２０ｍＬのＨＵＶＥＣ細胞８００万個と混合する。ビーズ及びＨＵＶＥＣ細胞を含む試験管を３７℃及び５％ＣＯ_２のインキュベータに４時間入れて、試験管を数回転倒させることにより２０分毎に穏やかに混和する。インキュベーションの後、ビーズ及びＨＵＶＥＣ細胞をT25フラスコ（Nunc（商標）、cat#156499）に移して、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートする。

【0068】

フィブリノーゲン（Sigma、cat#F4883）をHyClone（商標）DPBSに２ｍｇ／ｍＬで溶解する。アプロチニン（Sigma 、cat#A3428）を０．１５単位／ｍＬの濃度でフィブリノーゲン溶液に添加して、穏やかに混合する。溶液を０．２２μフィルター（Millipore #SCGP00525）でろ過することにより滅菌して、直ちに使用する。

【0069】

T25フラスコ中のＨＵＶＥＣコーティングビーズを、５０ｍＬ試験管に移して、加温されたEBM2培地＋SingleQuots（Lonza、#CC-4147）１０ｍＬを用いて２回洗浄する。培地を穏やかに除去する。ＨＵＶＥＣコーティングビーズ（およそ１０，０００個）を、ＣＡＦ ２００万個と共に滅菌フィブリノーゲン溶液５０ｍＬに再懸濁させる。トロンビン（Sigma #T4393）を滅菌水で５０単位／ｍＬになるように再構成させた。トロンビン溶液０．６単位（１２μｌ）を、２４ウェルプレート（In Vitro Scientific、cat#P24-1.5H-N）の各ウェルに添加して、フィブリノーゲン／ビーズ／ＣＡＦ溶液５００μｌ／ウェルを添加した。溶液を室温で１５分間、その後、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間放置してフィブリンゲルを形成させる。加温されたEBM2培地＋SingleQuots （Lonza、#CC-4147）０．５ｍＬを、各ウェルのフィブリンゲルの最上部に添加して、実験終了まで３〜４日毎に交換する。

【0070】

新方式での発芽アッセイの場合、示された濃度に希釈されたテスト化合物を、各ウェルに添加する。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートして、テスト化合物を含む培地を、アッセイが完了するまで３〜４日毎に交換する。

【0071】

既存方式での発芽アッセイの場合、フィブリンゲル中のＨＵＶＥＣコーティングビーズをテスト化合物の添加前３〜７日間培養すること以外は、方法は新方式の発芽アッセイに関する先の記載と同様である。テスト化合物の処置を７日間継続する。テスト化合物を含む培地を、アッセイが実施されるまで３〜４日毎に交換する。

【0072】

アッセイが終了したら、プレートを４％ＰＦＡ（Electron Microscopy Sciences #15710）０．５ｍＬにおいて４℃で一晩固定し、ＰＢＳで１回洗浄して、０．５％Triton（商標）X-100 （Sigma-Aldrich、cat#T9284）／ＰＢＳ ０．５ｍＬを４℃で１０分間透過させて、室温の１００ｍＭグリシン（Bio-Rad、cat#161-0718）／ＰＢＳで３回洗浄する。プレートを、ＰＢＳ＋１０％ヤギ血清（Invitrogen #16210）中に０．１％ＢＳＡ（Gibco、cat#15260-037）、０．２％ Triton（商標）X-100、０．０５％ Tween-20（Thermo Scientific、cat#28320） を含有する１ｍＬ／ウェルＩＦ緩衝液でブロックする。内皮細胞を、ＩＦ緩衝液＋１０％ヤギ血清中に１：１００のＰＢＳ ５００ｍＬで再構成されたヒツジ抗ヒトＣＤ３１抗体（R&D Systems＃BAF806）で染色する。ＳＭＡ陽性細胞を、ＩＦ緩衝液＋１０％ヤギ血清中に１：２００の抗α平滑筋アクチン抗体Ｃｙ３抗体（Sigma、cat#C6198）で染色する。染色溶液を、各ウェルに５００μＬ／ウェル添加する。プレートを４℃で一晩保持する。染色溶液を翌日除去し、ＩＦ緩衝液を用いてプレートをそれぞれ０．５ｍＬで３回洗浄する。ＩＦ緩衝液＋１０％ヤギ血清中に１：２００の二次抗体Alexa Fluor（登録商標）488ロバ抗ヒツジＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Molecular Probes #A-11015）を添加して、室温で１時間インキュベートする。ＩＦ緩衝液を用いてプレートを３回洗浄し、いずれの非結合二次抗体も除去する。５ｍｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩）（Invitrogen#D1306）をＰＢＳで１：１００００に希釈し、各ウェルに０．５ｍＬ添加して、室温で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳで２回洗浄して、２倍対物レンズを用いたCellInsight （Thermo Scientific）装置でプレートをスキャンすることによって、ＣＤ３１陽性内皮発芽部及びＳＭＡ陽性細胞の全長を画像化する。画像データは、CellInsight（ＣＤ３１ 緑色；ＳＭＡ 赤色）から直接得て、数値データをJMP（SAS）で解析した。

【0073】

Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド処置は、ＶＥＧＦ−Ａ依存性及びＶＥＧＦ−Ａ非依存性の内皮発芽を、統計学的に有意に減少させた。

【0074】

Mabry, R, et al, MAbs. 2010 Jan-Feb;2（1):20-34及びNakatsu, MN, Meth Enzymol. 2008;443:65-82に記載された、ＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞）及びＣＡＦ細胞（培養肺癌関連線維芽細胞）を用いた改変インビトロ共培養血管新生アッセイを用いて、内皮細胞発芽に及ぼすＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの影響を評価する。ＣＡＦ、及びＨＵＶＥＣをコーティングしたCytodexビーズをフィブリンゲルに包埋し、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）陽性ペリサイトで覆われた内皮発芽部を形成させる。１週間の間、内皮細胞は、一連の表現型変化を受けて、ＳＭＡ陽性細胞で覆われた内皮細胞発芽部の安定した相互結合網を得る。内皮発芽は、７〜１０日までは培地中のＣＡＦ由来ＶＥＧＦ−Ａに依存し、その後、発芽部の伸長及び安定性は、ＶＥＧＦ−Ａへの依存性が低下する。

【0075】

ラムシルマブ（１０μｇ／ｍｌ）によるアッセイ開始時（新方式、０〜７日目）のＶＥＧＦ−Ａシグナル伝達の阻害は、内皮発芽の有意な阻害を導いた（４倍の低下）。血管新生の治療的阻害を模倣するために、ラムシルマブでの処置を、内皮発芽部及びペリサイト被覆が形成された後７日目に開始する（既存方式）。ラムシルマブ（１０μｇ／ｍｌ）によるあらかじめ形成された発芽部の処置は、効果が低く、内皮発芽を１．４倍減少させるに過ぎなかった。ＶＥＧＦＲ２阻害と同様に、アッセイ開始時のＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの添加（新方式、０〜７日目）は、用量依存的に内皮発芽を強力に阻害した。テストされた最高濃度である３００ｎＭのＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドは、内皮発芽を７．５倍減少させた。ＶＥＧＦＲ２阻害への感受性が有意に低い、あらかじめ形成された発芽部の、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドでの処置（既存方式）は、内皮発芽の有意な減少を導いた（２．７倍）。これらの結果は、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドがＶＥＧＦ−Ａ依存性及びＶＥＧＦ−Ａ非依存性の内皮発芽を強力に阻害することを実証した。ＭＥＴ特異性阻害剤ＰＦ０４２１７９０３（ＬＳＮ２９００２９６）は、発芽がＶＥＧＦ−Ａ依存性である（０〜７日目）アッセイ（新方式）の開始時に添加された場合には内皮発芽の阻害に関して活性が低く、発芽部の伸長及び安定性に関してＶＥＧＦ−Ａへの依存性が低い（７〜１４日目）あらかじめ形成された発芽部に添加された場合（既存方式）、ＰＦ０４２１７９０３は内皮発芽の阻害に関して不活性であった。これらのデータは、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの抗血管新生活性がＭＥＴ依存性でないことを示唆している。

【0076】

Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドは、１４日目までの発芽を阻害したが、ラムシルマブは、７日目までの発芽のみを阻害した。対照（ＰＦ４２１７９０４）は、効果を有さなかった。

【0077】

ラムシルマブは、特異的ＶＥＧＦＲ２阻害剤であり、予測通り、内皮発芽がＶＥＧＦ−Ａ依存性である最初の７日間に、このアッセイで内皮発芽の減少を実証した。ＭＥＴ特異性阻害剤ＰＦ４２１７９０３は、このアッセイの１４日間はずっと、このアッセイにおける効果をほとんど、又は全く示さず、ＭＥＴがこの血管モデルにおいて役割を担わないこと、及びＭＥＴがＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドのオンコキナーゼターゲットの１つであることが示された。このアッセイのデータから、Ｔｉｅ２（通称ＴＥＫ）、ＡＸＬ、ＰＤＧＦＲＡ、及びＭＥＲＴＫなど、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの他のターゲットの１つ又は複数が、この血管新生アッセイの１４日間ずっと内皮発芽の阻害を誘発していたことが示唆された。したがってＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの抗血管新生活性は、ラムシルマブと異なっており、癌処置におけるこれら二剤の併用がさらなる処置利益を提供することが裏づけられる。

【0078】

Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドは新方式及び既存方式において索形成（Cord Formation）を阻害する

【0079】

ＶＥＧＦ−Ａによる索形成アッセイを、Falcon et al., J Hematol Oncol. 2013;6:31に従ってマイクロタイタープレートで実施する。該アッセイを、新方式（血管新生誘導性の脂肪由来幹細胞（「ＡＤＳＣ」）及びヒト内皮コロニー形成細胞（「ＥＣＦＣ」）共培養索形成アッセイ）及び既存方式（既存のＡＤＳＣ及びＥＣＦＣ共培養索形成アッセイ）として実施する。

【0080】

新方式アッセイでは、ＡＤＳＣ及びＥＣＦＣを、AngioKit（商標）最適化培地（Cell Systems Biology）で共培養する。ＡＤＳＣを９６ウェルプレートに１００μＬのウェルあたり４００００〜５００００個の細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートする。翌日、培地を除去して、培地５０〜１００μＬのウェルあたり４０００〜５０００個のＥＣＦＣを、ＡＤＳＣ単層の上部に播種して、３７℃、５％ＣＯ_２で３〜６時間インキュベートした後、２０ｎｇ／ｍＬ及びテスト化合物を添加する。共培養物を７日間発育させ、その時点で細胞を固定、染色し、スキャン装置で画像化する。索の面積を定量する。

【0081】

既存方式のアッセイでは、ＡＤＳＣ及びＥＣＦＣの共培養物を、新方式アッセイに関して先に記載された通り播種する。ＥＣＦＣを付着させた後、２０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ−Ａを用いて索状網目構造を刺激し、確定させる。４日目に培地を交換して、示された濃度のテスト化合物の存在下又は非存在下で新鮮なＶＥＧＦ−Ａを含ませる。テスト化合物の添加後に、培養物をさらに３〜４日発育させて、その後、細胞を固定、染色し、先に記載された通り画像化して、網目構造の破壊又は索状物の退縮を検査する。

【0082】

ラムシルマブは、このアッセイの新方式では効果的であることが示されたが（ＩＣ_５０＝０．４８μｇ／ｍＬ（Ｓ．Ｄ．０．３０、ｎ＝３）［０．４８μｇ／ｍＬ＝３．２ｎＭ］、既存方式では示されなかった（ＩＣ_５０＞１０μｇ／ｍＬ）。Falcon et al, J Hematol Oncol. 2013;6:31を参照されたい。抗ＶＥＧＦＲ２活性を有する小分子マルチキナーゼ阻害剤スニチニブは、このアッセイの新方式では効果的であることが示されたが（ＩＣ_５０＝０．０３８μＭ；Ｓ．Ｄ．０．０１３、ｎ＝３）、既存方式では示されなかった。Falcon et al, J Hematol Oncol. 2013;6:31を参照されたい。

【0083】

Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドは、新方式（ＩＣ_５０＝０．０１３μＭ；Ｓ．Ｄ．０．００７、ｎ＝５）及び既存方式（ＩＣ_５０＝０．０１６μＭ ０．０１１、ｎ＝４）の両方で強力な活性を示した。

【0084】

対照ＭＥＴ特異性阻害剤を、このアッセイで評価する。対照ＭＥＴ特異性阻害剤は、新方式ではわずかな活性のみを示し（ＩＣ_５０＝５．６１μＭ；Ｓ．Ｄ．１．８０、ｎ＝２）、既存方式では活性を全く示さなかった（ＩＣ_５０＞１０μＭ；ｎ＝２）。このことから、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの抗血管新生活性が、ＭＥＴへの活性によらないことが示唆された。

【0085】

ラムシルマブは、特異的ＶＥＧＦＲ２阻害剤であり、予測された通り、索形成がＶＥＧＦ−Ａ依存性の場合に新方式での索形成アッセイで減少が示される。ＭＥＴ特異性阻害剤ＰＦ４２１７９０３は、新方式又は既存方式の両方でこのアッセイにおける効果をほとんど、又は全く示さず、ＭＥＴがこの血管モデルにおいて役割を担わず、ＭＥＴがＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドのオンコキナーゼターゲットの1つであることが示された。このアッセイのデータから、Ｔｉｅ２（通称ＴＥＫ）、ＡＸＬ、ＰＤＧＦＲＡ、及びＭＥＲＴＫなど、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの他のターゲットの１つ又は複数が新方式及び既存方式での索形成の阻害に関与することが示唆された。したがってＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの抗血管新生活性は、ラムシルマブと異なっており、癌処置におけるこれら二剤の併用がさらなる処置利益を提供することが裏づけられる。

【0086】

ＶＥＧＦ−Ａによって誘導されたマウス耳血管モデルにおけるＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドとＤＣ１０１との併用

【0087】

抗血管新生化合物を評価するためのマウス耳血管モデルを、Nagy et al. Methods Enzymol. 2008;444:43-64に従って設定する。マウスの耳にネズミＶＥＧＦ−Ａのコード配列を含むアデノウイルスベクターを注射することを介して、ＶＥＧＦ−Ａ（血管内皮増殖因子Ａ）によりマウスの耳において血管を誘導した。

【0088】

ＤＣ１０１を４０ｍｇ／ｋｇで週に２回、腹腔内注射により投与する。Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドを、１２ｍｇ／ｋｇで１日１回経口投与する。５日目の結果については、該化合物又はビヒクル対照が、１〜５日目に投与される。２０日目の結果については、該化合物又はビヒクル対照が、１０〜２０日目に投与される。６０日目の結果については、該化合物又はビヒクルが５０〜６０日目に投与される。Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドは、Ｈ_２Ｏ中の２０％Captisol（登録商標）の９０％中の１０％ＰＥＧ４００の溶液として配合され、各投与週に新たに調製する。ＤＣ１０１は、各投与週にＰＢＳで希釈する。ビヒクル対照は、１日１回経口投与される、Ｈ_２Ｏ中の２０％Captisol（登録商標）の９０％中の１０％ＰＥＧ４００である。

【0089】

併用処置、ビヒクル対照又は各単独薬剤の影響を評価して、QuantiGene Plex 2.0アッセイキットを用い、製造業者のプロトコルに従って、５０の異なる血管マーカの発現で評価及び定量した。

【0090】

併用が対照と有意に異なり、影響の規模が大きく（併用−対照及び併用−予測される相加的応答が１．０を超える、又は−１．０未満である）、相乗効果のｐ値が有意である（＜０．０５）場合には、相乗効果が決定される。ｐ値をビヒクル対照と比較し、Bonferroni法で調整する。

【0091】

併用処置によって相乗的に影響を受けたマーカは、後期（６０日目）のもので、内皮よりもペリサイトにより多いマーカである（表１）。ペリサイトのマーカは、Ａｃｔａ２、Ｃｓｐｇ４（ＮＧ２）、Ｎｏｔｃｈ １及びＮｏｔｃｈ ３、並びにそれらのリガンド（ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、Ｊａｇ２）、並びにＰＤＧＦＢである。これは、併用が早期血管形成を減少させること、並びに早期及び後期血管をリモデリングすること、並びに正常血管を安定化させることにおける効果を示す点で一致している。

【表4】

【0092】

併用が対照と有意に異なり、影響の規模が大きく（併用−対照及び併用−予測される相加的応答が１．０を超える、又は−１．０未満である）、単独薬剤の１つが対照と有意に異ならず、ｐ値が予測される相加的応答と比較して併用に関して有意でない場合には、相加性が決定される。ｐ値をビヒクル対照と比較し、Bonferroni法で調整する。

【0093】

併用によって相乗的に影響を受けず相加的に影響を受けたマーカは、早期（５日目）〜後期（６０日目）に均等に分布していた（表２）。これらのマーカは、内皮マーカ（例えば、ＣＤ３４、ＰＥＣＡＭ１、ｖｗｆ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＶＥＧＲ２及びそのリガンドＶＥＧＦＡ）とペリサイトマーカ（例えば、Ａｃｔａ２、Ｃｓｐｇ４（ＮＧ２）、Ｎｏｔｃｈ １及びＮｏｔｃｈ ３、並びにそれらのリガンド（ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、Ｊａｇ２））との均一混合物でもあった。これらは、５〜６０日目の全試験期間を通した併用効果と一致している。

【0094】

ラムシルマブとＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドとの併用は、マウス耳ＶＥＧＦ誘導血管新生モデルにおいてインビボで相乗的な抗血管新生活性をもたらした。

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【0095】

配列表

SEQ ID NO: 1
DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYD ASNLDTGVPSRFSGSGSGTYFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKAFPPTFGG GTKVDIK

SEQ ID NO: 2
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSS ISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVT
DAFDIWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO: 3
DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYD
ASNLDTGVPSRFSGSGSGTYFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKAFPPTFGG GTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG
LSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 4
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSS ISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVT
DAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVLPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP
EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

本発明は以下を提供する。
［１］
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦＲ２に結合する抗体の有効量と、式：

【化1】

で示される化合物又はその医薬的に許容し得る塩と、をそのような処置を必要とする胃癌患者に投与することを含む、患者における胃癌を処置する方法。
［２］
前記化合物が、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドである、請求項１に記載の方法。
［３］
前記抗体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の軽鎖アミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の重鎖アミノ酸配列と、を含み、前記抗体が、ＶＥＧＦＲ２に結合する、請求項１に記載の方法。
［４］
前記抗体が、ラムシルマブである、請求項３に記載の方法。
［５］
前記化合物又はその塩が、約８０ｍｇ／日〜約１２０ｍｇ／日の用量で投与される、請求項１に記載の方法。
［６］
ラムシルマブが、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの用量で３週間毎に１回投与される、請求項４に記載の方法。
［７］
胃癌の処置のための、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦＲ２に結合する抗体と、式：

【化2】

で示される化合物又はその医薬的に許容し得る塩と、を含むキット。
［８］
前記抗体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の軽鎖アミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の重鎖アミノ酸配列と、を含み、前記抗体が、ＶＥＧＦＲ２に結合する、請求項７に記載のキット。
［９］
前記抗体が、ラムシルマブである、請求項８に記載のキット。
［１０］
前記化合物が、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドである、請求項９に記載のキット。
［１１］
胃癌の処置のための、１種又は複数の医薬的に許容し得る担体、希釈剤又は賦形剤を含むラムシルマブと、１種又は複数の医薬的に許容し得る担体、希釈剤又は賦形剤を含むＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容し得る塩と、を含むキット。
［１２］
Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容し得る塩が、錠剤である、請求項１１に記載のキット。
［１３］
噴霧乾燥分散体によって配合される、請求項１２に記載の錠剤。
［１４］
胃癌の処置における同時、分離又は連続使用のための、抗ＶＥＧＦＲ２抗体と、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容し得る塩と、を含む併用。
［１５］
前記化合物又はその塩が、約８０ｍｇ／日〜約１２０ｍｇ／日の用量で投与される、請求項１４に記載の方法。
［１６］
ラムシルマブが、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇの用量で３週間毎に１回投与される、請求項１４に記載の方法。
［１７］
胃癌の処置のためにＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容し得る塩との同時、分離又は連続処置において使用される抗ＶＥＧＦＲ２抗体。
［１８］
胃癌の処置のために抗ＶＥＧＦＲ２抗体との同時、分離又は連続処置において使用されるＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容し得る塩。
［１９］
前記抗ＶＥＧＦＲ２抗体が、ラムシルマブである、請求項１５又は１６に記載の処置。
［２０］
胃癌の処置のためにＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容し得る塩との同時、分離又は連続処置において使用されるラムシルマブ。
［２１］
胃癌の処置のためにラムシルマブとの同時、分離又は連続処置において使用されるＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容し得る塩。
［２２］
胃癌の処置のための薬剤の製造における抗ＶＥＧＦＲ２抗体の使用であって、前記抗ＶＥＧＦＲ２抗体が、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容し得る塩と同時に、分離して、又は連続で投与される、使用。
［２３］
胃癌の処置のための薬剤の製造におけるＮ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容し得る塩の使用であって、Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド又はその医薬的に許容し得る塩が、抗ＶＥＧＦＲ２抗体と同時に、分離して、又は連続で投与される、使用。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]