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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6352908
(24)【登録日】2018年6月15日
(45)【発行日】2018年7月4日
(54)【発明の名称】新規ペプチド及びその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 14/47 20060101AFI20180625BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20180625BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20180625BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20180625BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20180625BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20180625BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20180625BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20180625BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20180625BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20180625BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20180625BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20180625BHJP
【ＦＩ】
C07K14/47ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N5/071
C12P21/02 C
A61K38/16
A61P3/10
A61P1/18
!C12N15/12
【請求項の数】15
【全頁数】32
(21)【出願番号】特願2015-518298(P2015-518298)
(86)(22)【出願日】2014年5月23日
(86)【国際出願番号】JP2014063674
(87)【国際公開番号】WO2014189127
(87)【国際公開日】20141127
【審査請求日】2017年3月22日
(31)【優先権主張番号】特願2013-109801(P2013-109801)
(32)【優先日】2013年5月24日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504013775
【氏名又は名称】学校法人 埼玉医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106002
【弁理士】
【氏名又は名称】正林 真之
(72)【発明者】
【氏名】豊島 秀男
(72)【発明者】
【氏名】岡崎 康司
(72)【発明者】
【氏名】横尾 友隆
(72)【発明者】
【氏名】菅原 泉
【審査官】
竹内 祐樹
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００９／０１３７９４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２００７−２０９２１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
豊島秀男他，消化管ホルモンIBCAPによる膵β細胞分化増殖に与える影響，日本内分泌学会雑誌，２０１３年 ４月 １日，Vol.89, No.1，p.270，P1-12-1
【文献】
横尾友隆他，新規消化管ホルモンIBCAPによる膵β細胞分化・増殖作用の解析，糖尿病，２０１３年 ４月２５日，Vol.56, Supplement1，p.S-198，l-P-422
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列と同等以上の、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する作用及び／又は膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を有する、ペプチド。
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列と同等以上の、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する作用及び／又は膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を有する、ペプチド。
【請求項2】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する作用及び膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を有する、ペプチド。
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する作用及び膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を有する、ペプチド。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクター。
【請求項4】
請求項１又は２に記載のペプチド又は請求項３記載のベクターを含む研究用試薬。
【請求項5】
膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤及び／又は膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導する分化誘導促進剤である請求項４記載の研究用試薬。
【請求項6】
前記膵臓ホルモン産生細胞がα細胞、β細胞、及びδ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項５記載の研究用試薬。
【請求項7】
請求項１又は２に記載のペプチド又は請求項３記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項8】
請求項３に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項9】
請求項８記載の形質転換体を培養して請求項１又は２に記載のペプチドを産生させる工程を含むペプチド産生方法。
【請求項10】
次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１種を含み、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤；
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列と同等以上の膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用を持つペプチド、
（ｂ’）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する作用及び膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を有するペプチド、
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｂ’）いずれかのペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクター。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列と同等以上の膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用を持つペプチド、
（ｂ’）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する作用及び膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を有するペプチド、
（ｃ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｂ’）いずれかのペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクター。
【請求項11】
次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１種を含み、膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導する分化誘導促進剤；
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列と同等以上の膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド、
（ｅ’）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する作用及び膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド、
（ｆ）前記（ｄ）、（ｅ）、（ｅ’）いずれかのペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクター。
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列と同等以上の膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド、
（ｅ’）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する作用及び膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド、
（ｆ）前記（ｄ）、（ｅ）、（ｅ’）いずれかのペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクター。
【請求項12】
膵臓ホルモン産生細胞を培養する培地中に下記（ａ）、（ｂ）、（ｂ’）いずれかのペプチドを添加する工程を含む膵臓ホルモン産生細胞の増殖方法；
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列と同等以上の膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用を持つペプチド、
（ｂ’）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する作用及び膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を有するペプチド。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列と同等以上の膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用を持つペプチド、
（ｂ’）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する作用及び膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を有するペプチド。
【請求項13】
多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、下記（ｄ）、（ｅ）、（ｅ’）いずれかのペプチドを培地中に添加する工程を含む膵臓ホルモン産生細胞の分化形成方法；
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列と同等以上の膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド、
（ｅ’）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する作用及び膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド。
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列と同等以上の膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド、
（ｅ’）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する作用及び膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド。
【請求項14】
請求項１２記載の増殖方法及び／又は請求項１３記載の分化形成方法を含む再生医療型膵臓ホルモン産生細胞群の形成方法。
【請求項15】
前記膵臓ホルモン産生細胞群がα細胞又はβ細胞を含む請求項１４記載の形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規ペプチド、そのペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、及びそれらの用途に関する。【背景技術】
【0002】
膵臓は内分泌細胞と外分泌細胞とを有し、内分泌及び外分泌の両方で重要な役割を担っている器官である。内分泌細胞は膵臓ホルモンを産生・分泌する役割を果たし、α細胞からはグルカゴンが、β細胞からはインスリンが、δ細胞からはソマトスタチンが、ＰＰ細胞からは膵ポリペプチドがそれぞれ分泌されることが知られている。特にインスリンは血糖値低下作用を有し、血糖を正しい濃度に保つ重要な役割を果たす。【0003】
近年、ヒトＴＭ４ＳＦ２０として公知のポリペプチド又はそのフラグメントが膵臓β細胞の増加促進作用を持つことが報告されている（特許文献１を参照）。ヒトＴＭ４ＳＦ２０をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示し、ヒトＴＭ４ＳＦ２０のアミノ酸配列を配列番号３に示す。このポリペプチド又はそのフラグメントは、膵臓β細胞の減少又は死滅を伴う疾患、特に１型糖尿病の治療に用いることが期待されている。【0004】
しかし、特許文献１に記載されているポリペプチド（ヒトＴＭ４ＳＦ２０）は２２９個のアミノ酸残基からなるものであり、実用化のためには鎖長のより短いペプチドが望まれる。特許文献１には、鎖長のより短いペプチドとして１９個のアミノ酸残基からなる３種類のフラグメント（ペプチドＡ，Ｂ，Ｃ）も記載されているが、膵臓β細胞の増加促進作用はそれほど高いものではなかった。ペプチドＡ，Ｂ，Ｃのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４〜６に示す。なお、ペプチドＡ，Ｂ，Ｃのアミノ酸配列は、ヒトＴＭ４ＳＦ２０の９８番目から１１６番目までのアミノ酸配列、７８番目から９６番目までのアミノ酸配列、１６１番目から１７９番目のアミノ酸配列にそれぞれ対応する。【0005】
また近年、誘導多能性幹細胞（以下、「ｉＰＳ細胞」ともいう。）や胚性幹細胞（以下、「ＥＳ細胞」ともいう。）等の多能性幹細胞、あるいは膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞へと分化誘導する方法が数多く報告されている（非特許文献１〜４、特許文献２〜７等を参照）。このような分化誘導方法によって効率的に膵臓ホルモン産生細胞を得ることができれば、膵島移植の代替となる１型糖尿病の治療方法に繋がると期待される。さらに、患者本人由来の多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞を得ることにより、拒絶反応の問題も解消し得ると考えられる。【0006】
しかし、これまで報告されている分化誘導方法は、いずれも膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導効率が十分ではなかった。このため、高効率に膵臓ホルモン産生細胞へと分化誘導することが可能な分化誘導方法が望まれている。特に、安全性の観点からは、遺伝子導入を伴わない分化誘導方法であることが好ましい。【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】国際公開第２００９／０１３７９４号
【特許文献2】国際公開第２００７／１０３２８２号
【特許文献3】国際公開第２００５／０６３９７１号
【特許文献4】国際公開第２００９／０４８６７５号
【特許文献5】国際公開第２００７／０５１０３８号
【特許文献6】国際公開第２００６／１０８３６１号
【特許文献7】国際公開第２００８／０６６１９９号
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２４， ｐｐ．１３９２−１４０１（２００６）
【非特許文献2】Ｗｅｉ Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １７， ｐｐ．３３３−３４４（２００７）
【非特許文献3】Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ５３， ｐｐ．１０３０−１０３７（２００４）
【非特許文献4】Ｙｕｙａ Ｋｕｎｉｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ８， ｐｐ．２７４−２８４（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、新規ペプチド、そのペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、及びそれらの用途を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた。その結果、ヒトＴＭ４ＳＦ２０のフラグメントである配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「ベータジェニン（ｂｅｔａｇｅｎｉｎ）」ともいう。）が高い膵臓ホルモン産生細胞増殖促進作用を持ち、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つことを見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成されたものであり、より具体的には以下のとおりである。【0011】
［１］ 配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。【0012】
［２］ 上記［１］に記載のペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクター。【0013】
［３］ 上記［１］に記載のペプチド又は上記［２］に記載のベクターを含む研究用試薬。【0014】
［４］ 膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤及び／又は膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導する分化誘導促進剤である上記［３］に記載の研究用試薬。【0015】
［５］ 上記膵臓ホルモン産生細胞がα細胞、β細胞、及びδ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を含む上記［４］に記載の研究用試薬。【0016】
［６］ 上記［１］に記載のペプチド又は上記［２］に記載のベクターを含む医薬組成物。【0017】
［７］ 上記［２］に記載のベクターで形質転換された形質転換体。【0018】
［８］ 上記［７］に記載の形質転換体を培養して上記［１］に記載のペプチドを産生させる工程を含むペプチド産生方法。【0019】
［９］ 次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１種を含み、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進する膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤；（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用を持つペプチド、
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクター。
【0020】
［１０］ 次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１種を含み、膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導する分化誘導促進剤；（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド、
（ｆ）上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクター。
【0021】
［１１］ 膵臓ホルモン産生細胞を培養する培地中に下記（ａ）又は（ｂ）のペプチドを添加する工程を含む膵臓ホルモン産生細胞の増殖方法；（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用を持つペプチド。
【0022】
［１２］ 多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、下記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドを培地中に添加する工程を含む膵臓ホルモン産生細胞の分化形成方法；（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド。
【0023】
［１３］ 上記［１１］に記載の増殖方法及び／又は上記［１２］に記載の分化形成方法を含む再生医療型膵臓ホルモン産生細胞群の形成方法。【0024】
［１４］ 上記膵臓ホルモン産生細胞群がα細胞又はβ細胞を含む上記［１３］に記載の形成方法。【発明の効果】
【0025】
本発明によれば、新規ペプチド、そのペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれた組換えベクター、その組換えベクターで形質転換された形質転換体、及びそれらの用途を提供することができる。【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ベータジェニン）を培地中に添加した際の膵臓β細胞株の増殖促進作用を示す図である。
【図2】ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１細胞）から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で培地中に配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ベータジェニン）を添加した際の、分化誘導により得られた細胞におけるインスリンの相対発現量を示す図である。
【図3】ヒトｉＰＳ細胞（２００−９細胞、ＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞、又は２５３Ｇ１細胞）から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で培地中に配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ベータジェニン）を添加した際の、分化誘導により得られた細胞におけるＣペプチド陽性細胞又はインスリン陽性細胞の割合を示す図である。
【図4】配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ベータジェニン）、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるポリペプチド（ＩＢＣＡＰ）の発現ベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清（ＩＢＣＡＰ培養上清）、又は空ベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清（Ｍｏｃｋ培養上清）を培地中に添加した際の膵臓β細胞株の増殖促進作用を示す図である。
【図5】配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ベータジェニン）、又は配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチドＡ，Ｂ，Ｃ）を培地中に添加した際の膵臓β細胞株の増殖促進作用を示す図である。
【図6】ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１細胞）から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で培地中に配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ベータジェニン）を添加した際の、分化誘導により得られた細胞におけるインスリンの相対発現量を示す図である。
【図7】ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１細胞）から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で培地中に配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ベータジェニン）を添加した際の、分化誘導により得られた細胞におけるグルカゴンの相対発現量を示す図である。
【図8】ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１細胞）から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で培地中に配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ベータジェニン）を添加した際の、分化誘導により得られた細胞におけるソマトスタチンの相対発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0027】
≪ペプチド≫本発明に係るペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるものである。
【0028】
配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ヒトＴＭ４ＳＦ２０の１７０番目から２２９番目までのアミノ酸配列に対応する。後述のとおり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、高い膵臓ホルモン産生細胞増殖促進作用を持ち、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つものである。なお、膵臓ホルモン産生細胞には、通常、α細胞、β細胞、及びδ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種が含まれる。【0029】
本発明に係るペプチドには、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「改変ペプチド」ともいう。）も包含される。あるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドが元のペプチドの生物学的活性を維持することは、当業者に広く知られた事実である（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１， ｐｐ．５６６２−５６６６（１９８４）；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １０， ｐｐ．６４８７−６５００（１９８２）；Ｗａｎｇ，Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４， ｐｐ．１４３１−１４３３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７９， ｐｐ．６４０９−６４１３（１９８２）等を参照）。【0030】
ここで、１若しくは数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する場合には、置換前後でアミノ酸側鎖の性質が保存されていることが望ましい。アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内のアルファベットはいずれもアミノ酸を一文字表記したものである）。【0031】
１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、及び／又は付加する場合、その数は例えば１〜１２個であってもよく、１〜６個であってもよく、１〜４個であってもよく、１〜２個であってもよい。また、改変ペプチドと元のペプチドとの相同性は、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。
【0032】
≪ベクター≫本発明に係るベクターは、本発明に係るペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたものである。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が用いられ、使用の目的に応じて適宜選択される。
【0033】
≪研究用試薬、医薬組成物≫本発明に係る研究用試薬は、本発明に係るペプチド又は本発明に係るベクターを含むものである。この研究用試薬は、後述する膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤であってもよく、後述する分化誘導促進剤であってもよく、その両方であってもよい。この研究用試薬は、膵臓ホルモン産生細胞を利用する研究や、膵臓ホルモン産生細胞への分化機構の研究等に好適に用いることができる。
【0034】
また、本発明に係る医薬組成物は、本発明に係るペプチド又は本発明に係るベクターを含むものである。後述のとおり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、優れた膵臓ホルモン産生細胞増殖促進作用、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を示し得る。このため、当該医薬組成物は、例えば膵臓β細胞の死滅又は減少を伴う疾患、特に１型糖尿病の治療に用いることができる。例えば、本発明に係るペプチドを公知の方法により製剤化して医薬組成物を調製し、患者に投与することができる。また、本発明に係るベクターを公知の方法により製剤化して医薬組成物を調製し、患者に投与することができる。【0035】
≪形質転換体、ペプチド産生方法≫本発明に係る形質転換体は、本発明に係るベクターで形質転換されたものである。また、本発明に係るペプチド産生方法は、本発明に係る形質転換体を培養して本発明に係るペプチドを産生させる工程を含むものである。
宿主細胞としては、形質転換用のベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。
【0036】
この形質転換体を培養して遺伝子発現させることで、その培養上清から本発明に係るペプチドを得ることができる。ペプチドの分離・精製は、例えば、イオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の、ペプチド化学において通常使用される方法によって行うことができる。なお、化学合成によって本発明に係るペプチドを得ることも当然可能である。
【0037】
≪膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤≫本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤は、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１種を含み、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進することが可能なものである。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用を持つペプチド、
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクター。
【0038】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、高い膵臓ホルモン産生細胞増殖促進作用を持つものである。したがって、このペプチドを膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤に用いることができる。また、膵臓ホルモン産生細胞の増殖促進作用が維持されている限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる改変ペプチドを用いることもできる。置換、欠失、及び／又は付加されるアミノ酸の数、改変ペプチドと元のペプチドとの相同性等については、本発明に係るペプチドについて記載した内容と同様でよい。
さらに、上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターを膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤に用いることもできる。
【0039】
有効成分となるペプチドやベクターは、高度に精製された純品を単独で使用してもよいし、複数種類を混合して使用してもよい。【0040】
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤は、優れた膵臓ホルモン産生細胞増殖促進作用を示し得る。このため、当該増殖促進剤は、例えば膵臓β細胞の死滅又は減少を伴う疾患、特に１型糖尿病の治療に用いることができる。例えば、上記（ａ）や（ｂ）のペプチドを公知の方法により製剤化した医薬組成物を、患者に投与することができる。
また、上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡを適切なベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等）に組み込んだ後、公知の方法により製剤化した医薬組成物を、患者に投与することができる。
【0041】
≪膵臓ホルモン産生細胞の増殖方法≫本発明に係る増殖方法は、膵臓ホルモン産生細胞を培養する培地中に上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドを添加する工程を含むものである。このように上記（ａ）又は（ｂ）を添加することにより、膵臓ホルモン産生細胞の増殖が促進する。培地中におけるペプチドの濃度は、０．０３〜１０ｎＭが好ましく、０．３〜１ｎＭがより好ましい。
【0042】
≪分化誘導促進剤≫本発明に係る分化誘導促進剤は、次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１種を含み、膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導することが可能なものである。
（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つペプチド、
（ｆ）上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクター。
【0043】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、多能性幹細胞や、膵臓組織幹／前駆細胞等の組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つものである。したがって、このペプチドを分化誘導促進剤に用いることができる。また、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用が維持されている限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる改変ペプチドを用いることもできる。置換、欠失、及び／又は付加されるアミノ酸の数、改変ペプチドと元のペプチドとの相同性等については、本発明に係るペプチドについて記載した内容と同様でよい。
さらに、上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターを分化誘導促進剤に用いることもできる。
【0044】
有効成分となるペプチドやベクターは、高度に精製された純品を単独で使用してもよいし、複数種類を混合して使用してもよい。【0045】
なお、多能性幹細胞とは、少なくとも一種類ずつの三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に属する分化細胞に分化する能力（多分化能）のある自己複製可能な幹細胞のことをいい、例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（ＥＣ細胞）、成体多能性幹細胞（ＡＰＳ細胞）等が包含される。また、組織幹／前駆細胞とは、生体内に存在する、多分化能、自己複製能を有する幹／前駆細胞である。
【0046】
本発明に係る分化誘導促進剤は、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を示し得る。このため、当該分化誘導促進剤は、例えば膵臓β細胞の死滅又は減少を伴う疾患、特に１型糖尿病の治療に用いることができる。例えば、上記（ｄ）や（ｅ）のペプチドを公知の方法により製剤化し、患者に投与することができる。
また、上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドをコードするＤＮＡを適切なベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等）に組み込んだ後、公知の方法により製剤化し、患者に投与することができる。
【0047】
また、本発明に係る分化誘導促進剤は、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導する際にも用いることができる。例えば、上記（ｄ）や（ｅ）のペプチドを培地に添加することにより、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導することができる。
【0048】
≪膵臓ホルモン産生細胞の分化形成方法≫本発明に係る分化形成方法は、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドを培地中に添加する工程を含むものである。以下、当該分化形成方法についてさらに説明する。
【0049】
＜多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導＞多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導するには、その分化誘導過程で上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドを培地中に添加すればよい。多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法としては、従来公知の方法を任意に採用することができ、特に限定されない。培地中における上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドの濃度は、１０〜２００ｎｇ／ｍＬが好ましく、５０〜１８０ｎｇ／ｍＬがより好ましく、６０〜１５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0050】
以下、多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法の例として２種類の方法を挙げるが、これらの例に限定されるものではない。【0051】
［第１の分化誘導方法］第１の分化誘導方法は、非特許文献１に記載の方法に準じたものである。この文献は参照により本願に援用する。
第１の分化誘導方法は、下記の工程（Ａ１）〜（Ｅ１）を含む。このうち少なくとも１つの工程で、上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドが培地中に添加される。なお、ある工程に分化誘導促進剤を添加する場合、その工程の最初から添加してもよく、工程の途中から添加してもよい。特に、工程（Ａ１）〜（Ｅ１）の全ての工程で上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドを添加することが好ましい。
（Ａ１）ＴＧＦ−βスーパーファミリー（トランスフォーミング増殖因子β）に属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する工程。
（Ｂ１）上記工程（Ａ１）で得られた細胞をＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）の存在下で培養する工程。
（Ｃ１）上記工程（Ｂ１）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程。
（Ｄ１）上記工程（Ｃ１）で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程。
（Ｅ１）上記工程（Ｄ１）で得られた細胞を、エキセンジン−４、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子−１）、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する工程。
【0052】
（工程（Ａ１））工程（Ａ１）では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する。
【0053】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子としては、アクチビン、ノーダル、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）等が挙げられ、その中でもアクチビンが好ましい。このようなＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子は、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化を促進することが知られている（非特許文献１、特許文献２〜４等を参照）。アクチビンとしては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ等が挙げられ、その中でもアクチビンＡが好ましい。ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、５〜２５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜２００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0054】
また、工程（Ａ１）では、Ｗｎｔ（ウィングレス型ＭＭＴＶ組み込み部位）ファミリーに属する増殖因子を培地中に添加することが好ましい。ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子とともにＷｎｔファミリーに属する増殖因子を添加することにより、胚体内胚葉細胞への分化効率を高めることができる。Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ７ａ等が挙げられ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａが好ましく、Ｗｎｔ３ａがより好ましい。
Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子の濃度は、１〜１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、１０〜５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0055】
なお、工程（Ａ１）では、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子の代わりに、ＧＳＫ−３（グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３）阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ）を添加してもよい。ＧＳＫ−３阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ）は、Ｗｎｔシグナル経路を活性化させることが知られている（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７（３４），ｐｐ．３０９９８−３１００４（２００２））。【0056】
また、工程（Ａ１）では、胚体内胚葉細胞への分化効率を高め得る追加の因子を培地中に添加してもよい。追加の因子としては、例えば、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、ＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）、ＨＧＦ、ＮＧＦ（神経増殖因子）、ＧＤＦ（増殖分化因子）、ＧＬＰ（グルカゴン様ペプチド）、ニコチンアミド、エキセンジン−４、レチノイン酸、エタノールアミン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、ガストリン、ステロイドアルカロイド、銅キレーター（トリエチレンペンタミン等）、フォルスコリン、酪酸ナトリウム、ノギン、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ヘッジホッグ経路阻害剤等が挙げられる。【0057】
培養に用いる容器としては、分化誘導能、機能発現能、生存能等の観点から、生体適合材料を用いたスキャフォールドでコートされた培養プレートが好ましい。スキャフォールドとしては、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ゼラチン、エンタクチン、ポリオルニチン等が挙げられる。市販品としては、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製のＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ等が入手可能である。特に、ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭでコートされた培養プレートを用いることが好ましい。【0058】
培養に用いる培地は、動物細胞の培養に用いることのできる基本培地に、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源やその他の成分を添加して作製される。【0059】
基本培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ハムＦ１２培地、イーグルＭＥＭ培地、グラスゴーＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、ウィリアムＥ培地、フィッシャー培地、マッコイ培地、ＢＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＢＧＪｂ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、あるいはこれらの混合培地等が挙げられる。【0060】
栄養源としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、デンプン、デキストリン等の炭素源；脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール等の炭化水素類；硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源；ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、リン酸塩等の無機塩類；各種ビタミン類；各種アミノ酸類；等が挙げられる。【0061】
その他の成分としては、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；コレラトキシン；インスリン；トランスフェリン；亜セレン酸；アルブミン；２−メルカプトエタノール；血清又は血清代替物；等が挙げられる。インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＩＴＳ−Ｘ、ＩＴＳ−Ａ、ＩＴＳ−Ｇ等が市販品として入手可能である。また、血清代替物としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＢ−２７ＴＭサプリメント、Ｎ−２サプリメント、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ血清代替物等が市販品として入手可能である。【0062】
ここで、工程（Ａ１）における分化効率を高めるためには、培地中のインスリン、ＩＧＦ等の含有量を十分に低くすることが重要であることが知られている（国際公開第２００６／０２０９１９号を参照）。このため、工程（Ａ１）では、無血清培地又は低血清培地を用いることが好ましい（非特許文献１、特許文献２〜４等を参照）。血清濃度は、０〜２％（ｖ／ｖ）が好ましく、０〜１％（ｖ／ｖ）がより好ましく、０〜０．５％（ｖ／ｖ）がさらに好ましい。【0063】
好適な実施形態では、アクチビンＡ、Ｗｎｔ３ａ、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミンを含むジペプチドを添加した、無血清又は低血清のＲＰＭＩ１６４０培地が用いられる。【0064】
工程（Ａ１）の培養期間は例えば１〜６日であり、２〜４日が好ましい。胚体内胚葉細胞への分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化が進行するに従って、幹細胞のマーカー遺伝子であるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＥＣＡＤ等の発現が減少し、胚体内胚葉細胞のマーカー遺伝子であるＳＯＸ１７、ＣＥＲ、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４等の発現が亢進する。
【0065】
なお、胚体内胚葉細胞への分化効率を高めるためには、培地中の血清濃度を低めることが必要であるが、細胞の生存率を高めるためには、培地中の血清濃度を高める方が好ましい。そこで、工程（Ａ１）を、無血清の第１の培地で培養する工程（Ａ１−１）と、低血清の第２の培地で培養する工程（Ａ１−２）とに分けることが好ましい。
【0066】
工程（Ａ１−１）で用いられる第１の培地は、無血清であるほかは上記と同様でよい。すなわち、第１の培地は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子を含有し、その他に、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子を含有していてもよい。この第１の培地は、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子を含有する方が好ましい。【0067】
工程（Ａ１−１）の培養期間は例えば１〜３日であり、１〜２日が好ましい。この培養により、多能性幹細胞から中内胚葉細胞への分化が進行する。中内胚葉細胞への分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。多能性幹細胞から中内胚葉細胞への分化が進行するに従って、幹細胞のマーカー遺伝子であるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＥＣＡＤ等の発現が減少し、中内胚葉細胞のマーカー遺伝子であるＢＲＡ、ＦＧＦ４、ＷＮＴ３、ＮＣＡＤ等の発現が亢進する。
【0068】
工程（Ａ１−２）で用いられる第２の培地は、低血清であるほかは上記と同様でよい。すなわち、第２の培地は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子を含有し、その他に、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子を含有していてもよい。血清濃度は、０．０５〜２％（ｖ／ｖ）が好ましく、０．０５〜１％（ｖ／ｖ）がより好ましく、０．１〜０．５％（ｖ／ｖ）がさらに好ましい。【0069】
工程（Ａ１−２）の培養期間は例えば１〜３日であり、１〜２日が好ましい。この培養により、中内胚葉細胞から胚体内胚葉細胞への分化が進行する。上述したとおり、胚体内胚葉細胞への分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。
【0070】
なお、得られた細胞は、次の工程（Ｂ１）に進む前に、公知の方法で濃縮、単離、及び／又は精製してもよい。【0071】
（工程（Ｂ１））工程（Ｂ１）では、工程（Ａ１）で得られた細胞をＦＧＦの存在下で培養する。
【0072】
ＦＧＦとしては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３等が挙げられ、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０が好ましい。ＦＧＦの濃度は、５〜１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２０〜８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0073】
また、工程（Ｂ１）では、ヘッジホッグ経路阻害剤を培地中に添加することが好ましい。ＦＧＦとともにヘッジホッグ経路阻害剤を添加することにより、分化効率を高めることができる。ヘッジホッグ経路阻害剤としては、ＫＡＡＤ−シクロパミン（２８−［２−［［６−［（３−フェニルプロパノイル）アミノ］ヘキサノイル］アミノ］エチル］−１７β，２３β−エポキシベラトラマン−３−オン）、ＫＡＡＤ−シクロパミンの類似体、ジェルビン（１７，２３β−エポキシ−３β−ヒドロキシベラトラマン−１１−オン）、ジェルビンの類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体等が挙げられ、その中でもＫＡＡＤ−シクロパミンが好ましい。
ヘッジホッグ経路阻害剤の濃度は、０．０１〜５μＭが好ましく、０．０２〜２μＭがより好ましく、０．１〜０．５μｍがさらに好ましい。
【0074】
培養に用いる容器は、工程（Ａ１）と同様でよい。培地は、上述した各因子や培地の血清濃度を除き、工程（Ａ１）と同様でよい。培地の血清濃度は、０．１〜５％（ｖ／ｖ）が好ましく、０．５〜５％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１〜５％（ｖ／ｖ）がさらに好ましい。なお、工程（Ａ１）で低血清培地が用いられる場合、工程（Ｂ１）では、工程（Ａ１）よりも高い血清濃度の培地を用いることが好ましい。
【0075】
好適な実施形態では、ＦＧＦ−１０、ＫＡＡＤ−シクロパミン、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミンを含むジペプチドを添加した、低血清のＲＰＭＩ１６４０培地が用いられる。【0076】
工程（Ｂ１）の培養期間は例えば１〜６日であり、２〜４日が好ましい。分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ４Ａ等の遺伝子の発現が亢進する。
【0077】
なお、得られた細胞は、次の工程（Ｃ１）に進む前に、公知の方法で濃縮、単離、及び／又は精製してもよい。【0078】
（工程（Ｃ１））工程（Ｃ１）では、工程（Ｂ１）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する。
【0079】
レチノイドとしては、レチノール、レチナール、レチノイン酸等が挙げられ、その中でもレチノイン酸が好ましい。レチノイドの濃度は、０．２〜１０μＭが好ましく、０．４〜８μＭがより好ましく、１〜４μＭがさらに好ましい。
【0080】
また、工程（Ｃ１）では、ヘッジホッグ経路阻害剤を培地中に添加することが好ましい。レチノイドとともにヘッジホッグ経路阻害剤を添加することにより、分化効率を高めることができる。ヘッジホッグ経路阻害剤としては、ＫＡＡＤ−シクロパミン、ＫＡＡＤ−シクロパミンの類似体、ジェルビン、ジェルビンの類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体等が挙げられ、その中でもＫＡＡＤ−シクロパミンが好ましい。
ヘッジホッグ経路阻害剤の濃度は、０．０１〜５μＭが好ましく、０．０２〜２μＭがより好ましく、０．１〜０．５μＭがさらに好ましい。
【0081】
また、工程（Ｃ１）では、ＦＧＦを培地中に添加することが好ましい。レチノイドとともにＦＧＦを添加することにより、分化効率を高めることができる。ＦＧＦとしては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３等が挙げられ、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０が好ましい。
ＦＧＦの濃度は、０．５〜５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１〜２５ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２〜１０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0082】
また、工程（Ｃ１）では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子を培地中に添加してもよい。ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、５〜２５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜２００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２０〜１５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0083】
培養に用いる容器は、工程（Ｂ１）と同様でよい。培地は、上述した各因子を除き、基本的に工程（Ｂ１）と同様でよい。ただし、培地には、血清の代わりに血清代替物を添加することが好ましい。血清代替物の市販品としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＢ−２７ＴＭサプリメント、Ｎ−２サプリメント、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ血清代替物等が入手可能であり、その中でもＢ−２７ＴＭサプリメントが好ましい。Ｂ−２７ＴＭサプリメントの濃度は、０．１〜１０％（ｖ／ｖ）が好ましく、０．２〜５％（ｖ／ｖ）がより好ましく、０．４〜２．５％（ｖ／ｖ）がさらに好ましい。なお、このＢ−２７ＴＭサプリメントは、５０倍ストック溶液として市販されているため、Ｂ−２７ＴＭサプリメントの濃度を０．１〜１０％（ｖ／ｖ）とするには、５〜５００倍希釈されるように培地中に添加すればよい。
【0084】
好適な実施形態では、レチノイン酸、ＫＡＡＤ−シクロパミン、ＦＧＦ−１０、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、Ｂ−２７ＴＭサプリメントを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地が用いられる。【0085】
工程（Ｃ１）の培養期間は例えば１〜６日であり、２〜４日が好ましい。分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＨＬＸＢ９等の遺伝子の発現が亢進する。
【0086】
なお、得られた細胞は、次の工程（Ｄ１）に進む前に、公知の方法で濃縮、単離、及び／又は精製してもよい。【0087】
（工程（Ｄ１））工程（Ｄ１）では、工程（Ｃ１）で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する。
【0088】
γ−セクレターゼ阻害剤としては、ＤＡＰＴ（Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシン−ｔｅｒｔ−ブチルエステル）、Ｌ−６８５４５８（［１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロキシ−５−フェネチルペンチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル）等が挙げられ、その中でもＤＡＰＴが好ましい。γ−セクレターゼ阻害剤の濃度は、１〜５０μＭが好ましく、２〜４０μＭがより好ましく、５〜２０μＭがさらに好ましい。
【0089】
また、工程（Ｄ１）では、エキセンジン−４を培地中に添加することが好ましい。γ−セクレターゼ阻害剤とともにエキセンジン−４を添加することにより、分化効率を高めることができる。エキセンジン−４の濃度は、５〜１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２０〜８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0090】
培養に用いる容器や培地は、工程（Ｃ１）と同様でよい。すなわち、培地には血清代替物を添加することが好ましい。【0091】
好適な実施形態では、ＤＡＰＴ、エキセンジン−４、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、Ｂ−２７ＴＭサプリメントを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地が用いられる。【0092】
工程（Ｄ１）の培養期間は例えば１〜６日であり、２〜３日が好ましい。分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、ＮＫＸ６−１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＮＫＸ２−２等の遺伝子の発現が亢進する。
【0093】
なお、得られた細胞は、次の工程（Ｅ１）に進む前に、公知の方法で濃縮、単離、及び／又は精製してもよい。【0094】
（工程（Ｅ１））工程（Ｅ１）では、工程（Ｄ１）で得られた細胞を、エキセンジン−４、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する。
【0095】
エキセンジン−４、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、及びニコチンアミドとしては、そのうちの２種以上を添加することが好ましく、３種以上を添加することがより好ましい。エキセンジン−４の濃度は、５〜１５０ｎＭが好ましく、１０〜１００ｎＭがより好ましく、２０〜８０ｎＭがさらに好ましい。
ＨＧＦの濃度は、５〜１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２０〜８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
ＩＧＦ−１の濃度は、５〜１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２０〜８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
ニコチンアミドの濃度は、１〜３０ｍＭが好ましく、３〜２０ｍＭがより好ましく、５〜１５ｍＭがさらに好ましい。
【0096】
培養に用いる容器や培地は、工程（Ｄ１）と同様でよい。すなわち、培地には血清代替物を添加することが好ましい。【0097】
好適な実施形態では、エキセンジン−４、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、Ｂ−２７ＴＭサプリメントを添加した、無血清のＣＭＲＬ１０６６培地が用いられる。【0098】
工程（Ｅ１）の培養期間は例えば３〜２０日であり、３〜１０日が好ましい。この工程（Ｅ１）により、膵臓ホルモン産生細胞が得られる。
膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導の進行は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の膵臓ホルモンの産生を確認するほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰＹ等のうち、少なくとも１つの遺伝子の発現が亢進する。
【0099】
［第２の分化誘導方法］第２の分化誘導方法は、非特許文献４に記載の方法に準じたものである。この文献は参照により本願に援用する。
第２の分化誘導方法は、下記の工程（Ａ２）〜（Ｄ２）を含む。このうち少なくとも１つの工程で、上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドが培地中に添加される。なお、ある工程に分化誘導促進剤を添加する場合、その工程の最初から添加してもよく、工程の途中から添加してもよい。上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドを添加する工程は、工程（Ｃ２）〜（Ｄ２）の少なくとも１つの工程であってもよいが、工程（Ａ２）〜（Ｄ２）の全ての工程で上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドを添加することが好ましい。
（Ａ２）ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子と、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子及びＧＳＫ−３（グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３）阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する工程。
（Ｂ２）上記工程（Ａ２）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程。
（Ｃ２）上記工程（Ｂ２）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程。
（Ｄ２）上記工程（Ｃ２）で得られた細胞を、ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）増加剤、デキサメタゾン、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する工程。
【0100】
（工程（Ａ２））工程（Ａ２）では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子と、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子及びＧＳＫ−３阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する。
【0101】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子としては、アクチビン、ノーダル、ＢＭＰ等が挙げられ、その中でもアクチビンが好ましい。アクチビンとしては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ等が挙げられ、その中でもアクチビンＡが好ましい。ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、５〜２５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜２００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0102】
Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ７ａ等が挙げられ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａが好ましく、Ｗｎｔ３ａがより好ましい。Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子の濃度は、１〜１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、１０〜５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0103】
ＧＳＫ−３阻害剤としては、ＧＳＫ−３α阻害剤及びＧＳＫ−３β阻害剤のいずれを用いてもよいが、ＧＳＫ−３β阻害剤を用いることが好ましい。具体例としては、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル）、ＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、インジルビン−３’−モノオキシム（３−［（３Ｅ）−３−（ヒドロキシイミノ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−２−イリデン］−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−２−オン）、ケンパウロン（７，８−ジヒドロ−９−ブロモインドロ［３，２−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−オン）等が挙げられ、その中でもＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。ＧＳＫ−３阻害剤の濃度は、０．０１〜２０μＭが好ましく、０．１〜２０μＭがより好ましく、１〜５μＭがさらに好ましい。
【0104】
また、工程（Ａ２）では、分化効率を高め得る追加の因子を培地中に添加してもよい。追加の因子としては、例えば、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＧＤＦ、ＧＬＰ、ニコチンアミド、エキセンジン−４、レチノイン酸、エタノールアミン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、ガストリン、ステロイドアルカロイド、銅キレーター（トリエチレンペンタミン等）、フォルスコリン、酪酸ナトリウム、ノギン、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ヘッジホッグ経路阻害剤等が挙げられる。【0105】
培養に用いる容器としては、分化誘導能、機能発現能、生存能等の観点から、生体適合材料を用いたスキャフォールドでコートされた培養プレートが好ましい。スキャフォールドとしては、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ゼラチン、エンタクチン、ポリオルニチン等が挙げられる。市販品としては、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製のＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ等が入手可能である。特に、ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭでコートされた培養プレートを用いることが好ましい。【0106】
培養に用いる培地は、動物細胞の培養に用いることのできる基本培地に、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源やその他の成分を添加して作製される。【0107】
基本培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ハムＦ１２培地、イーグルＭＥＭ培地、グラスゴーＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、ウィリアムＥ培地、フィッシャー培地、マッコイ培地、ＢＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＢＧＪｂ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、あるいはこれらの混合培地等が挙げられる。【0108】
栄養源としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、デンプン、デキストリン等の炭素源；脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール等の炭化水素類；硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源；ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、リン酸塩等の無機塩類；各種ビタミン類；各種アミノ酸類；等が挙げられる。【0109】
その他の成分としては、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；コレラトキシン；インスリン；トランスフェリン；亜セレン酸；アルブミン；２−メルカプトエタノール；血清又は血清代替物；等が挙げられる。インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＩＴＳ−Ｘ、ＩＴＳ−Ａ、ＩＴＳ−Ｇ等が市販品として入手可能である。また、血清代替物としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＢ−２７ＴＭサプリメント、Ｎ−２サプリメント、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ血清代替物等が市販品として入手可能である。【0110】
ここで、工程（Ａ２）における分化効率を高めるためには、培地中のインスリン、ＩＧＦ等の含有量を十分に低くすることが重要であることが知られている。このため、工程（Ａ２）では、無血清培地又は低血清培地を用いることが好ましい。血清濃度は、０〜３％（ｖ／ｖ）が好ましく、０〜２％（ｖ／ｖ）がより好ましい。【0111】
好適な実施形態では、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した低血清のＲＰＭＩ１６４０培地が用いられる。工程（Ａ２）の培養期間は例えば１〜３日であり、１〜２日が好ましい。
【0112】
（工程（Ｂ２））工程（Ｂ２）では、工程（Ａ２）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する。
【0113】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子としては、アクチビン、ノーダル、ＢＭＰ等が挙げられ、その中でもアクチビンが好ましい。アクチビンとしては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ等が挙げられ、その中でもアクチビンＡが好ましい。ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、５〜２５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜２００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0114】
培養に用いる容器や培地は、工程（Ａ２）と同様でよい。すなわち、好適な実施形態では、アクチビンＡを添加した低血清のＲＰＭＩ１６４０培地が用いられる。工程（Ｂ２）の培養期間は例えば１〜４日であり、１〜３日が好ましい。
【0115】
（工程（Ｃ２））工程（Ｃ２）では、工程（Ｂ２）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する。
【0116】
レチノイドとしては、レチノール、レチナール、レチノイン酸等が挙げられ、その中でもレチノイン酸が好ましい。レチノイドの濃度は、０．２〜１０μＭが好ましく、０．４〜８μＭがより好ましく、１〜４μＭがさらに好ましい。
【0117】
また、工程（Ｃ２）では、ＢＭＰ受容体阻害剤を培地中に添加することが好ましい。ＢＭＰ受容体阻害剤としては、ドルソモルフィン（６−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−３−（４−ピリジル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、ＬＤＮ−１９３１８９（４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン）等が挙げられ、その中でもドルソモルフィンが好ましい。
ＢＭＰ受容体阻害剤の濃度は、０．２〜５μＭが好ましく、０．３〜３μＭがより好ましく、０．５〜２μＭがさらに好ましい。
【0118】
また、工程（Ｃ２）では、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤を培地中に添加することが好ましい。ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＳＢ５２５３３４（６−［２−（１，１−ジメチルエチル）−５−（６−メチル−１，２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］キノキサリン）、ＬＹ３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］キノリン）等が挙げられ、その中でもＳＢ４３１５４２が好ましい。また、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤としては、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製のＡｌｋ５インヒビターＩＩを用いることも可能である。
ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤の濃度は、１〜５０μＭが好ましく、２〜３０μＭがより好ましく、５〜２０μＭがさらに好ましい。
【0119】
培養に用いる容器は、工程（Ｂ２）と同様でよい。培地は、上述した各因子を除き、基本的に工程（Ｂ２）と同様でよい。ただし、培地には、血清の代わりに血清代替物を添加することが好ましい。血清代替物の市販品としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＢ−２７ＴＭサプリメント、Ｎ−２サプリメント、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ血清代替物等が入手可能であり、その中でもＢ−２７ＴＭサプリメントが好ましい。Ｂ−２７ＴＭサプリメントの濃度は、０．１〜１０％（ｖ／ｖ）が好ましく、０．２〜５％（ｖ／ｖ）がより好ましく、０．４〜２．５％（ｖ／ｖ）がさらに好ましい。なお、このＢ−２７ＴＭサプリメントは、５０倍ストック溶液として市販されているため、Ｂ−２７ＴＭサプリメントの濃度を０．１〜１０％（ｖ／ｖ）とするには、５〜５００倍希釈されるように培地中に添加すればよい。
【0120】
好適な実施形態では、レチノイン酸、ドルソモルフィン、ＳＢ４３１５４２、Ｂ−２７ＴＭサプリメントを添加した、無血清のＩＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地が用いられる。工程（Ｃ２）の培養期間は例えば５〜９日であり、６〜８日が好ましい。
【0121】
（工程（Ｄ２））工程（Ｄ２）では、工程（Ｃ２）で得られた細胞を、ｃＡＭＰ増加剤、デキサメタゾン、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する。
【0122】
ｃＡＭＰ増加剤、デキサメタゾン、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤、及びニコチンアミドとしては、そのうちの２種以上を添加することが好ましく、３種以上を添加することがより好ましい。【0123】
ｃＡＭＰ増加剤としては、フォルスコリン等のアデニル酸シクラーゼ活性化剤；３−イソブチル−１−メチルキサンチン等のホスホジエステラーゼ阻害剤；ジブチリルｃＡＭＰ等のｃＡＭＰアナログ；等が挙げられ、その中でもフォルスコリンが好ましい。ｃＡＭＰ増加剤の濃度は、１〜５０μＭが好ましく、２〜３０μＭがより好ましく、５〜２０μＭがさらに好ましい。
【0124】
デキサメタゾンの濃度は、１〜５０μＭが好ましく、２〜３０μＭがより好ましく、５〜２０μＭがさらに好ましい。【0125】
ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ３６４９４７等が挙げられ、その中でもＳＢ４３１５４２が好ましい。また、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤としては、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製のＡｌｋ５インヒビターＩＩを用いることも可能である。ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤の濃度は、１〜５０μＭが好ましく、２〜３０μＭがより好ましく、５〜２０μＭがさらに好ましい。
【0126】
ニコチンアミドの濃度は、１〜３０ｍＭが好ましく、３〜２０ｍＭがより好ましく、５〜１５ｍＭがさらに好ましい。【0127】
培養に用いる容器や培地は、工程（Ｃ２）と同様でよい。すなわち、培地には血清代替物を添加することが好ましい。【0128】
好適な実施形態では、フォルスコリン、デキサメタゾン、Ａｌｋ５インヒビターＩＩ、ニコチンアミド、Ｂ−２７ＴＭサプリメントを添加した、無血清のＩＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地が用いられる。工程（Ｄ２）の培養期間は例えば９〜１３日であり、１０〜１２日が好ましい。
【0129】
この工程（Ｄ２）により、膵臓ホルモン産生細胞が得られる。膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導の進行は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の膵臓ホルモンの産生を確認するほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化が進行するに従って、膵臓ホルモン産生細胞のマーカー遺伝子であるＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰＹ等のうち、少なくとも１つの遺伝子の発現が亢進する。
【0130】
＜膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導＞膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導するには、その分化誘導過程で上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドを培地中に添加すればよい。膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法としては、従来公知の方法を任意に採用することができ、特に限定されない。培地中における上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドの濃度は、１０〜２００ｎｇ／ｍＬが好ましく、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬがより好ましく、６０〜１２０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0131】
以下、膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法の一例について説明するが、この例に限定されるものではない。【0132】
以下の分化誘導方法は、非特許文献２に記載の方法に準じたものである。この文献は参照により本願に援用する。この分化誘導方法は、下記の工程（Ａ３）〜（Ｅ３）を含む。このうち少なくとも１つの工程で、上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドが培地中に添加される。なお、ある工程に分化誘導促進剤を添加する場合、その工程の最初から添加してもよく、工程の途中から添加してもよい。上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドを添加する工程は、工程（Ｄ３）〜（Ｅ３）の少なくとも１つの工程であってもよいが、工程（Ａ３）〜（Ｅ３）の全ての工程で上記（ｄ）又は（ｅ）のペプチドを添加することが好ましい。
（Ａ３）ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、ＦＧＦ、及びニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹／前駆細胞を培養する工程。
（Ｂ３）上記工程（Ａ３）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程。
（Ｃ３）上記工程（Ｂ３）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程。
（Ｄ３）上記工程（Ｃ３）で得られた細胞をＦＧＦの存在下で培養する工程。
（Ｅ３）上記工程（Ｄ３）で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する工程。
【0133】
（工程（Ａ３））工程（Ａ３）では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、ＦＧＦ、ニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹／前駆細胞を培養する。
【0134】
培養に用いる容器としては、分化誘導能、機能発現能、生存能等の観点から、生体適合材料を用いたスキャフォールドでコートされた培養プレートが好ましい。スキャフォールドとしては、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ゼラチン、エンタクチン、ポリオルニチン等が挙げられる。市販品としては、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製のＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ等が入手可能である。特に、ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭでコートされた培養プレートを用いることが好ましい。【0135】
培養に用いる培地は、動物細胞の培養に用いることのできる基本培地に、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源やその他の成分を添加して作製される。【0136】
基本培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ハムＦ１２培地、イーグルＭＥＭ培地、グラスゴーＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、ウィリアムＥ培地、フィッシャー培地、マッコイ培地、ＢＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＢＧＪｂ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、あるいはこれらの混合培地等が挙げられる。【0137】
栄養源としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、デンプン、デキストリン等の炭素源；脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール等の炭化水素類；硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源；ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、リン酸塩等の無機塩類；各種ビタミン類；各種アミノ酸類；等が挙げられる。【0138】
その他の成分としては、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；コレラトキシン；インスリン；トランスフェリン；亜セレン酸；２−メルカプトエタノール；アルブミン；血清又は血清代替物；等が挙げられる。インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＩＴＳ−Ｘ、ＩＴＳ−Ａ、ＩＴＳ−Ｇ等が市販品として入手可能である。また、血清代替物としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＢ−２７ＴＭサプリメント、Ｎ−２サプリメント、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ血清代替物等が市販品として入手可能である。【0139】
好適な実施形態では、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、２−メルカプトエタノール、アルブミンを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２が用いられる。インスリンの濃度は、２〜３０μｇ／ｍＬが好ましく、５〜２０μｇ／ｍＬがより好ましい。トランスフェリンの濃度は、１〜２０μｇ／ｍＬが好ましく、３〜１０μｇ／ｍＬがより好ましい。亜セレン酸の濃度は、１〜２０ｎｇ／ｍＬが好ましく、５〜２０ｎｇ／ｍＬがより好ましい。２−メルカプトエタノールの濃度は、５０〜２００μＭが好ましく、５０〜１００μＭがより好ましい。アルブミンの濃度は、１〜１０ｎｇ／ｍＬが好ましく、２〜５ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
工程（Ａ３）の培養期間は例えば１〜３日であり、１〜２日が好ましい。
【0140】
（工程（Ｂ３））工程（Ｂ３）では、工程（Ａ３）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する。
【0141】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子としては、アクチビン、ノーダル、ＢＭＰ等が挙げられ、その中でもアクチビンが好ましい。アクチビンとしては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ等が挙げられ、その中でもアクチビンＡが好ましい。ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、５〜２５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜２００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0142】
培養に用いる容器は、工程（Ａ３）と同様でよい。培地は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子を添加することを除き、工程（Ａ３）と同様でよい。すなわち、好適な実施形態では、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、２−メルカプトエタノール、アルブミンを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２が用いられる。工程（Ｂ３）の培養期間は例えば２〜６日であり、３〜５日が好ましい。
【0143】
（工程（Ｃ３））工程（Ｃ３）では、工程（Ｂ３）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する。
【0144】
レチノイドとしては、レチノール、レチナール、レチノイン酸等が挙げられ、その中でも全トランス型レチノイン酸が好ましい。レチノイドの濃度は、０．２〜１０μＭが好ましく、０．４〜８μＭがより好ましく、１〜４μＭがさらに好ましい。
【0145】
培養に用いる容器は、工程（Ａ３）と同様でよい。培地は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子を添加することを除き、工程（Ａ３）と同様でよい。好適な実施形態では、全トランス型レチノイン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、２−メルカプトエタノール、アルブミンを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２が用いられる。
工程（Ｃ３）の培養期間は例えば２〜６日であり、３〜５日が好ましい。
【0146】
（工程（Ｄ３））工程（Ｄ３）では、工程（Ｃ３）で得られた細胞をＦＧＦの存在下で培養する。
【0147】
ＦＧＦとしては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３等が挙げられ、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０が好ましい。ＦＧＦの濃度は、１〜３０ｎｇ／ｍＬが好ましく、２〜２０ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５〜１５ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0148】
培養に用いる容器は、工程（Ａ３）と同様でよい。培地は、ＦＧＦを添加することを除き、基本的に工程（Ｃ３）と同様でよい。好適な実施形態では、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、アルブミンを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２が用いられる。
工程（Ｄ３）の培養期間は例えば１〜５日であり、２〜４日が好ましい。
【0149】
（工程（Ｅ３））工程（Ｅ３）では、工程（Ｄ３）で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する。
ニコチンアミドの濃度は、１〜３０ｍＭが好ましく、３〜２０ｍＭがより好ましく、５〜１５ｍＭがさらに好ましい。
【0150】
また、工程（Ｅ３）では、ＦＧＦを培地中に添加することが好ましい。ＦＧＦとしては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３等が挙げられ、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０が好ましい。
ＦＧＦの濃度は、１〜３０ｎｇ／ｍＬが好ましく、２〜２０ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５〜１５ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【0151】
培養に用いる容器は、工程（Ａ３）と同様でよい。培地は、ニコチンアミドを添加することを除き、基本的に工程（Ｄ３）と同様でよい。好適な実施形態では、ニコチンアミド、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、アルブミンを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２が用いられる。
工程（Ｅ３）の培養期間は例えば３〜２０日であり、３〜１０日が好ましい。
【0152】
この工程（Ｅ３）により、膵臓ホルモン産生細胞が得られる。膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導の進行は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の膵臓ホルモンの産生を確認するほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化が進行するに従って、膵臓ホルモン産生細胞のマーカー遺伝子であるＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰＹ等のうち、少なくとも１つの遺伝子の発現が亢進する。
【0153】
≪再生医療型膵臓ホルモン産生細胞群の形成方法≫本発明に係る再生医療型膵臓ホルモン産生細胞群の形成方法は、本発明に係る増殖方法及び／又は本発明に係る分化形成方法を含むものである。
上記のとおり、本発明に係る分化形成方法によれば、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞へと効率的に分化誘導することができる。また、本発明に係る増殖方法によれば、膵臓ホルモン産生細胞の増殖を促進することができる。したがって、これらを単独又は組み合わせることにより、再生医療に好適な膵臓ホルモン産生細胞群を形成することができる。この膵臓ホルモン産生細胞群は、膵島様細胞塊であってもよく、膵島様細胞シートであってもよい。また、膵臓ホルモン産生細胞群は、α細胞又はβ細胞を含むことが好ましい。
【実施例】
【0154】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。【0155】
＜実施例１：膵臓β細胞の増殖促進（１）＞膵臓β細胞株としては、大阪大学のＤｒ．Ｍｉｙａｚａｋｉから供与されたＭＩＮ６細胞を用いた。ＭＩＮ６細胞は、１５％（ｖ／ｖ） ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地中で維持した。
【0156】
まず、コラーゲンコートされた８ウェルスライドチャンバー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ， 製品番号３５４６３０）にＭＩＮ６細胞を１×１０４個／ウェルの細胞密度でプレーティングした。２４時間後、０．５％（ｖ／ｖ） ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地に交換し、７２時間の血清飢餓を行った。なお、血清飢餓の開始から４８時間後に新しい培地に交換した。その後、血清飢餓の開始から７２時間後の培地に、化学合成した配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ベータジェニン）を最終濃度０．３ｎＭ又は１ｎＭとなるように添加した。コントロールとしては、ベータジェニンの溶媒であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加量が等量になるように添加した。【0157】
ベータジェニン又はＤＭＳＯを添加してから２４時間後に、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）を最終濃度１０μＭとなるように添加し、２時間培養した。そして、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴＴＭ Ｅｄｕ Ａｌｅｘａ ＦｌｏｕｒＴＭ ５９４ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， 製品番号Ｃ１０３３９）を用い、添付の説明書に従って細胞増殖アッセイを行った。細胞に取り込まれたＥｄＵをＡｌｅｘａ ＦｌｏｕｒＴＭ ５９４を用いて赤色の蛍光として可視化し、蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察した。コントロールにおける蛍光強度を１．０とした場合の相対ＥｄＵ蛍光強度を図１に示す。
【0158】
図１に示すように、ベータジェニンを添加することにより、相対ＥｄＵ蛍光強度が２．７〜２．８倍に増大した。この結果から、ベータジェニンを培地中に添加することにより、ＭＩＮ６細胞の増殖が促進することが分かる。
【0159】
＜実施例２：ヒトｉＰＳ細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導（１）＞ヒトｉＰＳ細胞としては、理化学研究所のセルバンクから購入した２５３Ｇ１細胞、埼玉医科大学のＤｒ．Ｍｉｔａｎｉから供与されたＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞、及びＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞にレポーター遺伝子を導入したクローンである２００−９細胞を用いた。ＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞は、センダイウイルスを用いてＴＩＧ−３細胞に４因子（ＯＣＴ遺伝子、ＫＬＦ遺伝子、ＳＯＸ遺伝子、ＭＹＣ遺伝子）を導入することにより、産業技術総合研究所にて樹立されたものである（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２８６， ｐｐ．４７６０−４７７１（２０１１））。
これらの細胞は、４ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２（Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔｅｍ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク）を添加したＥＳ細胞用培地（ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、２０％ ＫＳＲ、非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５．２ｍＭ ＮａＯＨ）中で、マイトマイシンＣで処理されたＳＮＬ７６／７細胞（ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）とともに培養・維持した。細胞の剥離にはＣＴＫ（０．２５％ トリプシン、１ｍｇ／ｍＬ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ、２０％ ＫＳＲ、１ｍＭ ＣａＣｌ２ ｉｎ ＰＢＳ）を用い、１：３〜１：４の割合で希釈して継代培養した。
【0160】
分化誘導を開始する３日前にトリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、６．３×１０４個／ｃｍ２の細胞密度でプレーティングし、１０μＭ Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ）、４ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２、及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＥＳ細胞用培地中で、マイトマイシンＣで処理されたＳＴＯ細胞とともに１日間培養した。その後、４ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２、及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＥＳ細胞用培地中でさらに２日間培養した。【0161】
分化誘導の開始初日に、２％（ｖ／ｖ） ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡ（ＳＢＩ）、及び３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク）に培地交換し、１日間培養した（工程（Ａ２））。【0162】
次いで、２％（ｖ／ｖ） ＦＢＳ、及び１００ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に培地交換し、２日間培養した（工程（Ｂ２））。【0163】
次いで、１％（ｖ／ｖ） Ｂ−２７ＴＭサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μＭ ドルソモルフィン（Ｃａｌｂｉｉｏｃｈｅｍ）、２μＭ レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）、及び１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ）を添加したＩＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｇｉｂｃｏ）に培地交換し、７日間培養した（工程（Ｃ２））。【0164】
最後に、１％（ｖ／ｖ） Ｂ−２７ＴＭサプリメント、１０μＭ フォルスコリン（Ｗａｋｏ）、１０μＭ デキサメタゾン（Ｗａｋｏ）、５μＭ Ａｌｋ５インヒビターＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭ ニコチンアミド（Ｗａｋｏ）、及び３ｎＭ ベータジェニンを添加したＩＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地に培地交換し、１１日間培養した（工程（Ｄ２））。コントロールとしては、ベータジェニンの溶媒であるＤＭＳＯを添加量が等量になるように添加した。【0165】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析）上記の工程（Ａ２）〜（Ｄ２）を経て２５３Ｇ１細胞から得られた細胞（ベータジェニン添加群、コントロール群のそれぞれについてｎ＝２）について、インスリンの遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで確認した。具体的には、まず、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＢｉｏＳｃｒｉｐｔＴＭ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）により逆転写反応を行った後、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量的ＰＣＲ分析を行った。プライマー配列を以下に示す。
ＨｓＩＮＳ＿３１Ｆ：ＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＡＣＴＧＴ（配列番号７）
ＨｓＩＮＳ＿１４９Ｒ：ＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＴＴＣＡＣＡＡＡＧＧ（配列番号８）
【0166】
ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、ＢｉｏＤｏｃ−Ｉｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＭｂｉｏ）により可視化した。【0167】
工程（Ｄ２）を経て得られた細胞におけるインスリンの発現量をそれぞれ図２に示す。この図２は、分化誘導開始から１０日目の細胞におけるインスリンの発現量を１とした場合の相対発現量を示したものである。【0168】
図２に示すように、ベータジェニンを添加することによりインスリンの発現量が増大した。この結果から、ベータジェニンを培地中に添加することにより、ヒトｉＰＳ細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導効率が向上することが分かる。
【0169】
（免疫染色）上記の工程（Ａ２）〜（Ｄ２）を経て２００−９細胞、ＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞、又は２５３Ｇ１細胞から得られた細胞について、４％ パラホルムアルデヒドを用いて５分間固定し、ＰＢＳで洗浄後、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳでさらに１５分間洗浄した。洗浄後、４％ ヤギ血清／ＰＢＳを用いて２０分間ブロッキング処理を行った。１次抗体としては、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ（抗体希釈液）で１００倍希釈したラビット抗Ｃペプチド抗体（ＣＳＴジャパン）、及び抗体希釈液で４００倍希釈したモルモット抗インスリン抗体（Ｄａｋｏ）を用い、３７℃で２時間又は４℃で一晩処理した。１次抗体で処理した後、ＰＢＳを用いた５分間の洗浄を３回繰り返した。２次抗体としては、Ａｌｅｘａ ＦｌｏｕｒＴＭ ４８８及びＡｌｅｘａ ＦｌｏｕｒＴＭ ５６８を抗体希釈液で２００〜５００倍に希釈して用い、室温にて１時間反応させた。２次抗体で処理した後、ＰＢＳを用いた５分間の洗浄を３回繰り返した。その後、１〜２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で１０分間処理し、ＰＢＳで洗浄した。
【0170】
そして、イメージアナライザーであるＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＣペプチド陽性細胞又はインスリン陽性細胞の割合（％）を求めた。結果を図３に示す。【0171】
図３に示すように、ヒトｉＰＳ細胞として２００−９細胞、ＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞、２５３Ｇ１細胞のいずれを用いた場合にも、ベータジェニンを添加することによりＣペプチド陽性細胞又はインスリン陽性細胞の割合が増大した。この結果から、ベータジェニンを培地中に添加することにより、ヒトｉＰＳ細胞から膵臓ホルモン産生細胞（β細胞）への分化誘導効率が向上することが分かる。
【0172】
＜実施例３：膵臓β細胞の増殖促進（２）＞膵臓β細胞株としては、大阪大学のＤｒ．Ｍｉｙａｚａｋｉから供与されたＭＩＮ６細胞を用いた。ＭＩＮ６細胞は、１５％（ｖ／ｖ） ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地中で維持した。
【0173】
膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤としては、化学合成したベータジェニンの濃度が９７％となるようにＤＭＳＯに溶解したＤＭＳＯ溶液を準備した。【0174】
また、比較のため、以下のようにして、ＩＢＣＡＰ培養上清及びＭｏｃｋ培養上清を準備した。まず、５％ＦＣＳ及び抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ培地で継代培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍディッシュに１×１０６個プレーティングした。その翌日、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるポリペプチド（ヒトＴＭ４ＳＦ２０に相当。以下、「ＩＢＣＡＰ」という。）の発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ＩＢＣＡＰ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＩＢＣＡＰを強制発現させた。その２４時間後に培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に交換し、さらにその２４時間後に培養上清を回収し、ＩＢＣＡＰ培養上清として以後の実験に用いた。
また、空ベクター（ｐＣＡＧＧＳ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、上記と同様にして培養上清を回収し、Ｍｏｃｋ培養上清として以後の実験に用いた。
【0175】
膵臓β細胞の増殖促進を確認するに際しては、まず、コラーゲンコートされた８ウェルスライドチャンバー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ， 製品番号３５４６３０）にＭＩＮ６細胞を１×１０４個／ウェルの細胞密度でプレーティングした。２４時間後、０．５％（ｖ／ｖ） ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地に交換し、７２時間の血清飢餓を行った。なお、血清飢餓の開始から４８時間後に新しい培地に交換した。その後、血清飢餓の開始から７２時間後の培地に、ベータジェニンのＤＭＳＯ溶液をベータジェニンの最終濃度が１ｎＭとなるように添加した。コントロールとしては、ベータジェニンのＤＭＳＯ溶液の代わりにＤＭＳＯのみを、添加量が等量になるように添加した。
また、比較のため、ベータジェニンのＤＭＳＯ溶液の代わりにＩＢＣＡＰ培養上清又はＭｏｃｋ培養上清を、各ウェルあたり０．５μＬ添加した。
【0176】
ベータジェニンのＤＭＳＯ溶液等を添加してから２４時間後に、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）を最終濃度１０μＭとなるように添加し、２時間培養した。そして、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴＴＭ Ｅｄｕ Ａｌｅｘａ ＦｌｏｕｒＴＭ ５９４ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， 製品番号Ｃ１０３３９）を用い、添付の説明書に従って細胞増殖アッセイを行った。細胞に取り込まれたＥｄＵをＡｌｅｘａ ＦｌｏｕｒＴＭ ５９４を用いて赤色の蛍光として可視化し、蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察した。ベータジェニンのＤＭＳＯ溶液、ＩＢＣＡＰ培養上清、Ｍｏｃｋ培養上清を添加した場合の蛍光強度からコントロールにおける蛍光強度を減じ、かつ、Ｍｏｃｋ培養上清を添加した場合の蛍光強度を１．０としたときの相対ＥｄＵ蛍光強度を図４に示す。
【0177】
図４に示すように、ベータジェニンを添加した場合には、ＩＢＣＡＰ培養上清、Ｍｏｃｋ培養上清を添加した場合と比較して、相対ＥｄＵ蛍光強度が顕著に増大した。この結果から、ベータジェニンを培地中に添加した場合の方がＩＢＣＡＰ培養上清、Ｍｏｃｋ培養上清を添加した場合よりもＭＩＮ６細胞の増殖が顕著に亢進することが分かる。
【0178】
＜実施例４：膵臓β細胞の増殖促進（３）＞膵臓β細胞株としては、大阪大学のＤｒ．Ｍｉｙａｚａｋｉから供与されたＭＩＮ６細胞を用いた。ＭＩＮ６細胞は、１５％（ｖ／ｖ） ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地中で維持した。
【0179】
膵臓ホルモン産生細胞増殖促進剤としては、化学合成したベータジェニンの濃度が９７％となるようにＤＭＳＯに溶解したＤＭＳＯ溶液を準備した。また、比較のため、配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドＡ，Ｂ，Ｃを化学合成して準備した。
【0180】
膵臓β細胞の増殖促進を確認するに際しては、まず、コラーゲンコートされた８ウェルスライドチャンバー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ， 製品番号３５４６３０）にＭＩＮ６細胞を１×１０４個／ウェルの細胞密度でプレーティングした。２４時間後、０．５％（ｖ／ｖ） ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地に交換し、７２時間の血清飢餓を行った。なお、血清飢餓の開始から４８時間後に新しい培地に交換した。その後、血清飢餓の開始から７２時間後の培地に、ベータジェニンのＤＭＳＯ溶液をベータジェニンの最終濃度が１ｎＭとなるように添加した。コントロールとしては、ベータジェニンのＤＭＳＯ溶液の代わりにＤＭＳＯのみを、添加量が等量になるように添加した。
また、比較のため、ベータジェニンのＤＭＳＯ溶液の代わりにペプチドＡ，Ｂ，Ｃを、最終濃度が３ｎＭ又は５ｎＭとなるように添加した。
【0181】
ベータジェニンのＤＭＳＯ溶液又はペプチドＡ，Ｂ，Ｃを添加してから２４時間後に、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）を最終濃度１０μＭとなるように添加し、２時間培養した。そして、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴＴＭ Ｅｄｕ Ａｌｅｘａ ＦｌｏｕｒＴＭ ５９４ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， 製品番号Ｃ１０３３９）を用い、添付の説明書に従って細胞増殖アッセイを行った。細胞に取り込まれたＥｄＵをＡｌｅｘａ ＦｌｏｕｒＴＭ ５９４を用いて赤色の蛍光として可視化し、蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察した。白黒化し、さらに白黒反転させた蛍光顕微鏡像を図５に示す。なお、白黒化及び白黒反転の操作により、ＥｄＵが取り込まれた赤色の蛍光部分は濃い黒色部分として確認できるようになる。
【0182】
図５に示すように、ベータジェニンを添加した場合には、ペプチドＡ，Ｂ，Ｃを添加した場合と比較して、濃い黒色部分が顕著に多く観察された。この結果から、ベータジェニンとペプチドＡ，Ｂ，ＣとはいずれもヒトＴＭ４ＳＦ２０のフラグメントであるにも関わらず、ベータジェニンを添加した場合の方がペプチドＡ，Ｂ，Ｃを添加した場合よりもＭＩＮ６細胞の増殖が顕著に亢進することが分かる。
【0183】
＜実施例５：ヒトｉＰＳ細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導（２）＞ヒトｉＰＳ細胞としては、理化学研究所のセルバンクから購入した２５３Ｇ１細胞を用いた。この細胞は、４ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２（Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔｅｍ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク）を添加したＥＳ細胞用培地（ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、２０％ ＫＳＲ、非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５．２ｍＭ ＮａＯＨ）中で、マイトマイシンＣで処理されたＳＮＬ７６／７細胞（ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）とともに培養・維持した。細胞の剥離にはＣＴＫ（０．２５％ トリプシン、１ｍｇ／ｍＬ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ、２０％ ＫＳＲ、１ｍＭ ＣａＣｌ２ ｉｎ ＰＢＳ）を用い、１：３〜１：４の割合で希釈して継代培養した。
【0184】
分化誘導を開始する３日前にトリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、６．３×１０４個／ｃｍ２の細胞密度でプレーティングし、１０μＭ Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ）、４ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２、及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＥＳ細胞用培地中で、マイトマイシンＣで処理されたＳＴＯ細胞とともに１日間培養した。その後、４ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ−２、及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＥＳ細胞用培地中でさらに２日間培養した。【0185】
分化誘導の開始初日に、２％（ｖ／ｖ） ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡ（ＳＢＩ）、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ）、及び１ｎＭ ベータジェニンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク）に培地交換し、１日間培養した（工程（Ａ２））。【0186】
次いで、２％（ｖ／ｖ） ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡ、及び１ｎＭ ベータジェニンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に培地交換し、２日間培養した（工程（Ｂ２））。【0187】
次いで、１％（ｖ／ｖ） Ｂ−２７ＴＭサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μＭ ドルソモルフィン（Ｃａｌｂｉｉｏｃｈｅｍ）、２μＭ レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）、１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ）、及び１ｎＭ ベータジェニンを添加したＩＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地（Ｇｉｂｃｏ）に培地交換し、７日間培養した（工程（Ｃ２））。【0188】
最後に、１％（ｖ／ｖ） Ｂ−２７ＴＭサプリメント、１０μＭ フォルスコリン（Ｗａｋｏ）、１０μＭ デキサメタゾン（Ｗａｋｏ）、５μＭ Ａｌｋ５インヒビターＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０μＭ ニコチンアミド（Ｗａｋｏ）、及び１ｎＭ ベータジェニンを添加したＩＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地に培地交換し、１１日間培養した（工程（Ｄ２））。コントロールとしては、ベータジェニンの溶媒であるアセトニトリル（ＡＣＮ）を添加量が等量になるように添加した。【0189】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析）上記の工程（Ａ２）〜（Ｄ２）を経て２５３Ｇ１細胞から得られた細胞（ベータジェニン添加群、コントロール群のそれぞれについてｎ＝３）について、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンの遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで確認した。具体的には、まず、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＢｉｏＳｃｒｉｐｔＴＭ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）により逆転写反応を行った後、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｒｏｃｈｅ）により定量的ＰＣＲ分析を行った。なお、内在性コントロールとして、ＧＡＰＤＨの遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで確認した。プライマー配列を以下に示す。
ＨｓＩＮＳ＿３１Ｆ：ＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＡＣＴＧＴ（配列番号７）
ＨｓＩＮＳ＿１４９Ｒ：ＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＴＴＣＡＣＡＡＡＧＧ（配列番号８）
ＨｓＧＣＧ＿２６４Ｆ：ＧＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡ（配列番号９）
ＨｓＧＣＧ＿３６８Ｒ：ＣＣＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＡＡＴＧＡＴ（配列番号１０）
ＨｓＳＳＴ＿２０６Ｆ：ＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＡＧＴＴＴＣ（配列番号１１）
ＨｓＳＳＴ＿３１３Ｒ：ＴＣＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＡＧ（配列番号１２）
ｈＧＡＰＤＨ−Ｆ：ＡＴＧＴＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡ（配列番号１３）
ｈＧＡＰＤＨ−Ｒ：ＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡ（配列番号１４）
【0190】
ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、ＢｉｏＤｏｃ−Ｉｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＭｂｉｏ）により可視化した。【0191】
工程（Ｄ２）を経て得られた細胞におけるインスリン、グルカゴン、ソマトスタチンの発現量をそれぞれ図６〜図８に示す。この図６〜図８は、ＧＡＰＤＨ遺伝子遺伝子にて補正を行い、分化誘導初日の細胞におけるインスリン、グルカゴン、ソマトスタチンの発現量を１とした場合の相対発現量を示したものである。【0192】
図６〜図８に示すように、ベータジェニンを添加することにより、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンの発現量が増大した。この結果から、ベータジェニンを培地中に添加することにより、ヒトｉＰＳ細胞から膵臓ホルモン産生細胞（α細胞、β細胞、δ細胞）への分化誘導効率が向上することが分かる。
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]