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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6353452
(24)【登録日】2018年6月15日
(45)【発行日】2018年7月4日
(54)【発明の名称】多能性幹細胞の調製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20180625BHJP
C12N 5/02 20060101ALI20180625BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20180625BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20180625BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20180625BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
C12N5/02
A61P43/00 101
A61P43/00 105
A61K35/545
A61L27/38 300
【請求項の数】5
【全頁数】44
(21)【出願番号】特願2015-535314(P2015-535314)
(86)(22)【出願日】2014年9月3日
(86)【国際出願番号】JP2014004524
(87)【国際公開番号】WO2015033558
(87)【国際公開日】20150312
【審査請求日】2017年5月24日
(31)【優先権主張番号】特願2013-182945(P2013-182945)
(32)【優先日】2013年9月4日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2014-102539(P2014-102539)
(32)【優先日】2014年5月16日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000149435
【氏名又は名称】株式会社大塚製薬工場
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100102255
【弁理士】
【氏名又は名称】小澤 誠次
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100188352
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 一弘
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100198074
【弁理士】
【氏名又は名称】山村 昭裕
(72)【発明者】
【氏名】岡入 梨沙
(72)【発明者】
【氏名】西村 益浩
(72)【発明者】
【氏名】和田 圭樹
【審査官】
中村 勇介
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１２／１３３９４２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１１／００７９００（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００６／０８５６１２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００８／１５０００１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１２／０６３８７０（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ１／００−７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物間葉系幹細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞塊を形成させる工程を備えた、多能性幹細胞の調製方法であって、
前記浮遊培養を、以下の（Ａ）又は（Ｂ）を含む溶液中で行うことを特徴とする
前記調製方法。
（Ａ）ジェランガム若しくはその誘導体又はそれらの塩；
（Ｂ）デキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩；
前記浮遊培養を、以下の（Ａ）又は（Ｂ）を含む溶液中で行うことを特徴とする
前記調製方法。
（Ａ）ジェランガム若しくはその誘導体又はそれらの塩；
（Ｂ）デキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩；
【請求項2】
哺乳動物間葉系幹細胞がヒト骨髄間葉系幹細胞又はヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の調製方法。
【請求項3】
多能性幹細胞がＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、又はＳｏｘ２を発現していることを特徴とする請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項4】
浮遊培養を、血清又は血清代替物を含まない生理的水溶液中で行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の調製方法。
【請求項5】
請求項１〜４のいずれかに記載の調製方法で得られた多能性幹細胞に分化処理を施す工程を備えたことを特徴とする多能性幹細胞の分化誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、哺乳動物間葉系幹細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞塊を形成させる工程を備えた多能性幹細胞の調製方法や、かかる調製方法により得られた多能性幹細胞や、かかる多能性幹細胞を含む、臓器又は組織の機能低下若しくは機能障害の改善剤や、上記多能性幹細胞の分化誘導方法等に関する。【背景技術】
【0002】
多能性幹細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる能力を有する細胞であり、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）はその代表例である。ヒトＥＳ細胞はこの性質を利用して再生医療への応用が期待されているが、分化させたＥＳ細胞の移植により、拒絶反応が惹起してしまうという問題がある。【0003】
近年、山中らのグループにより、マウス体細胞用いて４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−ｍｙｃ）の発現により脱分化を誘導し、ＥＳ細胞に近い多能性や増殖能を有する細胞（誘導多能性幹細胞）、いわゆるｉＰＳ細胞の開発が報告され（非特許文献１）、その後、ヒトの分化細胞からもｉＰＳ細胞を作製できることが報告されている（非特許文献２）。かかるヒトｉＰＳ細胞は、治療対象となる患者由来の細胞を用いて作製できることから、拒絶反応のない人工臓器作製のためのツールとして期待されている。しかしながら、ｉＰＳ細胞のin vivoでの挙動を解析すると、ｉＰＳ細胞は必ずしもＥＳ細胞と同じ性質を有する細胞ではない可能性が示唆されている。例えば、ｉＰＳ細胞を用いてキメラマウスを作製したところ、約２０％の個体において腫瘍形成が観察された。これはＥＳ細胞を用いた同様の実験よりも有意に高い数値である。【0004】
この腫瘍形成リスクが高いという問題を解決するため、癌遺伝子として知られているｃ−ｍｙｃを用いず、３因子（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、及びＫｌｆ４遺伝子）のみからｉＰＳ細胞を作製し、かかるｉＰＳ細胞を用いてキメラマウスを作製すると、腫瘍形成リスクを抑制できることが報告された（非特許文献３、４）。しかしながら、ヒトｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を臨床応用する場合、腫瘍形成リスクは限りなくゼロに近いことが求められる。このため、ｉＰＳ細胞を臨床応用する場合、依然として腫瘍化するリスクが問題とされている。【0005】
他方、多能性幹細胞を生体組織から直接単離する研究も進められている。ヒト骨髄間葉系細胞を、トリプシンや低酸素処理などのストレスを与えることによりストレス耐性の多能性幹細胞を選択したり、あるいは多能性幹細胞の表面抗原であるＳＳＥＡ−３の発現を指標として多能性幹細胞を選択し、さらに浮遊培養を重なることにより、多能性幹細胞を単離できることが報告された（特許文献１、非特許文献５）。しかしながら、かかる方法では細胞ストレスを与えることやＳＳＥＡ−３の発現を指標として多能性幹細胞を選択する操作が必要となるため、時間対効果や費用対効果の面から改善の余地があった。【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許第５１８５４４３号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Takahashi, K. et al., Cell. 126: 663-676 (2006)
【非特許文献2】Takahashi, K. et al., Cell. 131: 861-872 (2007)
【非特許文献3】Nakagawa, M. et al., Nat Biotechnol 26: 101-106 (2008)
【非特許文献4】Wering, M. et al., Cell Stem Cell 2: 10-12 (2008)
【非特許文献5】Kuroda, Y. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 107: 8639-8643 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の課題は、多能性を有し、かつ腫瘍化リスクが極めて低い細胞を、安価に且つ簡便に調製できる方法を提供することにある。【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、ヒト骨髄間葉系幹細胞（Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow；ｈＭＳＣ-ＢＭ）及びヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（Human Adipose Tissue-derived Mesenchymal Stem Cell；ｈＡＴ−ＭＳＣ）（「ヒト脂肪細胞由来幹細胞［Human Adipose-derived Stem Cells；ｈＡＤＳＣ］」ともいう。）や、ヒト接着性成熟細胞７種（ヒトヘパトサイト細胞［ｈＨＥＰ細胞］、ヒト臍帯静脈内皮細胞［ＨＵＶＥＣ細胞］、ヒト皮膚微小リンパ管内皮細胞［ＨＭＶＥＣ細胞］、ヒト表皮角化細胞［ＮＨＥＫ細胞］、ヒト気管支上皮細胞［ＮＨＢＥ細胞］、ヒトメラノサイト細胞［ＮＨＥＭ細胞］、及びヒト平滑筋細胞［ＵＡＳＭＣ細胞］）及びヒト接着性前駆細胞３種（ヒト皮膚線維芽細胞［ＮＨＤＦ細胞］、ヒト骨格筋筋芽細胞［ＨＳＭＭ細胞］、及びヒト骨芽細胞［ＮＨＯｓｔ細胞］）を浮遊培養し、細胞塊（スフェロイド［Spheroid］）を形成させたところ、多能性幹細胞のマーカータンパク質が発現する多能性幹細胞を誘導（あるいは単離）できることを見いだした。また、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞を、輸液（無血清培養液）中や、ジェランガム又はデキストランを含有する培養液中でスフェロイド培養を行うと、多能性獲得の効率が高まることを確認した。また、調製したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドの多分化能について解析したところ、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドは、３つの胚（外胚葉、内胚葉、中胚葉）由来の細胞へ分化する能力（多分化能）を有する細胞であることも確認した。さらに、調製したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドやｈＡＤＳＣ細胞のスフェロイドは、腫瘍化リスクが極めて低い細胞であることを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。【0010】
すなわち、本発明は（１）哺乳動物間葉系幹細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞塊を形成させる工程を備えたことを特徴とする多能性幹細胞の調製方法（以下、「本件調製方法１」ということがある）や、（２）哺乳動物間葉系幹細胞がヒト骨髄間葉系幹細胞又はヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞であることを特徴とする上記（１）に記載の調製方法や、（３）多能性幹細胞がＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、又はＳｏｘ２を発現していることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の調製方法や、（４）浮遊培養を、（Ａ）ジェランガム若しくはその誘導体又はそれらの塩；又は（Ｂ）デキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩；を含む溶液中で行うことを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の調製方法や、（５）浮遊培養を血清又は血清代替物を含まない生理的水溶液中で行うことを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の調製方法に関する。【0011】
また、本発明は（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の調製方法により得られる多能性幹細胞に関する。【0012】
また、本発明は（７）哺乳動物間葉系幹細胞を浮遊培養することにより得られた多能性幹細胞や、（８）哺乳動物間葉系幹細胞がヒト骨髄間葉系幹細胞又はヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞であることを特徴とする上記（７）に記載の多能性幹細胞や、（９）Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、又はＳｏｘ２を発現していることを特徴とする上記（７）又は（８）に記載の多能性幹細胞や、（１０）浮遊培養を、（Ａ）ジェランガム若しくはその誘導体又はそれらの塩；又は（Ｂ）デキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩；を含む溶液中で行うことを特徴とする上記（７）〜（９）のいずれかに記載の多能性幹細胞や、（１１）浮遊培養を血清又は血清代替物を含まない生理的水溶液中で行うことを特徴とする上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の多能性幹細胞に関する。（以上（６）〜（１１）の多能性幹細胞を、以下「本件多能性幹細胞１」ということがある。）【0013】
また、本発明は（１２）上記（６）〜（１１）のいずれかに記載の多能性幹細胞を含む、臓器又は組織の機能低下若しくは障害の改善剤（以下、「本件改善剤１」ということがある）に関する。【0014】
また、本発明は（１３）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の調製方法で得られた多能性幹細胞に分化処理を施す工程を備えたことを特徴とする多能性幹細胞の分化誘導方法（以下、「本件分化誘導方法１」ということがある）に関する。【0015】
また本発明の実施の他の形態として、〔１〕哺乳動物接着性成熟細胞又は哺乳動物接着性前駆細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞塊を形成させる工程を備えたことを特徴とする多能性幹細胞の調製方法（以下、「本件調製方法２」ということがある）や、〔２〕多能性幹細胞がＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、又はＳｏｘ２を発現していることを特徴とする上記〔１〕に記載の調製方法や、〔３〕浮遊培養を、（Ａ）ジェランガム若しくはその誘導体又はそれらの塩；又は（Ｂ）デキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩；を含む溶液中で行うことを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の調製方法や、〔４〕浮遊培養を、血清又は血清代替物を含まない生理的水溶液中で行うことを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の調製方法を挙げることができる。【0016】
また、本発明の実施の他の形態として、〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の調製方法により得られる多能性幹細胞を挙げることができる。【0017】
また本発明の実施の他の形態として、〔６〕哺乳動物接着性成熟細胞又は哺乳動物接着性前駆細胞を浮遊培養することにより得られた多能性幹細胞や、〔７〕Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、又はＳｏｘ２を発現していることを特徴とする上記〔６〕に記載の多能性幹細胞や、〔８〕浮遊培養を、（Ａ）ジェランガム若しくはその誘導体又はそれらの塩；又は（Ｂ）デキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩；を含む溶液中で行うことを特徴とする上記〔６〕又は〔７〕に記載の多能性幹細胞や、〔９〕浮遊培養を、血清又は血清代替物を含まない生理的水溶液中で行うことを特徴とする上記〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の多能性幹細胞を挙げることができる。（以上〔５〕〜〔９〕の多能性幹細胞を、以下「本件多能性幹細胞２」ということがある。）【0018】
また、本発明の実施の他の形態として、〔１０〕上記〔５〕〜〔９〕のいずれかに記載の多能性幹細胞を含む、臓器又は組織の機能低下若しくは障害の改善剤（以下、「本件改善剤２」ということがある）を挙げることができる。【0019】
また本発明の実施の他の形態として、〔１１〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の調製方法で調製した多能性幹細胞に分化処理を施す工程を備えたことを特徴とする多能性幹細胞の分化誘導方法（以下、「本件分化誘導方法２」ということがある）を挙げることができる。【0020】
また本発明の他の実施形態として、本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２を、臓器又は組織の機能低下若しくは障害を有する患者に投与することを含む、前記患者の治療方法を挙げることができる。【0021】
また本発明の他の実施形態として、哺乳動物間葉系幹細胞を浮遊培養することにより得られる細胞の多能性幹細胞としての使用や、哺乳動物接着性成熟細胞又は哺乳動物接着性前駆細胞を浮遊培養することにより得られる細胞の多能性幹細胞としての使用を挙げることができる。【0022】
また本発明の他の実施形態として、臓器又は組織の機能低下若しくは障害の改善（治療）剤としての使用のための本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２を挙げることができる。【0023】
また本発明の他の実施形態として、臓器又は組織の機能低下若しくは障害の改善（治療）剤の製造のための本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２の使用を挙げることができる。【発明の効果】
【0024】
本件調製方法１及び本件調製方法２を用いると、本件多能性幹細胞１及び本件多能性幹細胞２、すなわち、多能性を有し、かつ腫瘍化リスクが極めて低い細胞を得ることができ、心不全、インスリン依存性糖尿病、パーキンソン病、脊髄損傷などの疾患の安全な治療に有用である。また、本件多能性幹細胞１及び本件多能性幹細胞２は、浮遊培養により調製することができるため、細胞へ遺伝子導入してｉＰＳ細胞を調製する場合と比べ、比較的短時間で簡便かつ大量に細胞を調製することができる点で優れている。【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】接着培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞（上段）と、スフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞（下段）における多能性幹細胞マーカータンパク質（Ｎａｎｏｇ）の発現を解析した結果を示す図である。左図は、位相差画像を示し、右図は蛍光画像を示す。
【図2】接着培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞（上段）と、スフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞（下段）における多能性幹細胞マーカータンパク質（Ｏｃｔ３／４）の発現を解析した結果を示す図である。左図は、位相差画像を示し、右図は蛍光画像を示す。
【図3】接着培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞（上段）と、スフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞（下段）における多能性幹細胞マーカータンパク質（Ｓｏｘ２）の発現を解析した結果を示す図である。左図は、位相差画像を示し、右図は蛍光画像を示す。
【図4】接着培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞（上段）と、スフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞（下段）における多能性幹細胞マーカータンパク質（ＳＳＥＡ３）の発現を解析した結果を示す図である。左図は、位相差画像を示し、右図は蛍光画像を示す。
【図5】接着培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞と、スフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞における３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ［左上段］、Ｏｃｔ３／４［右上段］、及びＳｏｘ２［左下段］）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図6】接着培養したｈＡＤＳＣ細胞（上段）と、スフェロイド培養したｈＡＤＳＣ細胞（下段）における多能性幹細胞マーカータンパク質（Ｎａｎｏｇ）の発現を解析した結果を示す図である。左図は、位相差画像を示し、右図は蛍光画像を示す。
【図7】接着培養したｈＡＤＳＣ細胞（上段）と、スフェロイド培養したｈＡＤＳＣ細胞（下段）における多能性幹細胞マーカータンパク質（Ｏｃｔ３／４）の発現を解析した結果を示す図である。左図は、位相差画像を示し、右図は蛍光画像を示す。
【図8】接着培養したｈＡＤＳＣ細胞（上段）と、スフェロイド培養したｈＡＤＳＣ細胞（下段）における多能性幹細胞マーカータンパク質（Ｓｏｘ２）の発現を解析した結果を示す図である。左図は、位相差画像を示し、右図は蛍光画像を示す。
【図9】接着培養したｈＡＤＳＣ細胞（上段）と、スフェロイド培養したｈＡＤＳＣ細胞（下段）における多能性幹細胞マーカータンパク質（ＳＳＥＡ３）の発現を解析した結果を示す図である。左図は、位相差画像を示し、右図は蛍光画像を示す。
【図10】接着培養したｈＡＤＳＣ細胞と、スフェロイド培養したｈＡＤＳＣ細胞における３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ［左上段］、Ｏｃｔ３／４［右上段］、及びＳｏｘ２［左下段］）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図11】スフェロイド培養した細胞（ｈＭＳＣ-ＢＭ並びに接着性成熟細胞７種［ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、ＮＨＥＫ、ｈＨＥＰ、ＮＨＢＥ、ＮＨＥＭ、及びＵＡＳＭＣ細胞］及び接着性前駆細胞３種［ＮＨＤＦ、ＨＳＭＭ、及びＮＨＯｓｔ細胞］）の顕微鏡画像を示す図である。図中のスケールバーは、５００μｍを示す。
【図12】接着培養した細胞（ｈＭＳＣ-ＢＭ並びに上記接着性成熟細胞７種及び上記接着性前駆細胞３種）と、スフェロイド培養した細胞（ｈＭＳＣ-ＢＭ並びに上記接着性成熟細胞７種及び上記接着性前駆細胞３種）における多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｏｃｔ３／４）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図13】接着培養した細胞（ｈＭＳＣ-ＢＭ並びに上記接着性成熟細胞７種及び上記接着性前駆細胞３種）と、スフェロイド培養した細胞（ｈＭＳＣ-ＢＭ並びに上記接着性成熟細胞７種及び上記接着性前駆細胞３種）における多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図14】接着培養した細胞（ｈＭＳＣ-ＢＭ並びに上記接着性成熟細胞７種及び上記接着性前駆細胞３種）と、スフェロイド培養した細胞（ｈＭＳＣ-ＢＭ並びに上記接着性成熟細胞７種及び上記接着性前駆細胞３種）における多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｓｏｘ２）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図15】接着性成熟細胞６種（ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、ＮＨＥＫ、ＮＨＢＥ、ＮＨＥＭ、及びＵＡＳＭＣ細胞）及び接着性前駆細胞３種（ＮＨＤＦ、ＨＳＭＭ、及びＮＨＯｓｔ細胞）の専用培養液中でスフェロイド培養した上記接着性成熟細胞６種及び上記接着性前駆細胞３種と、ＭＳＣＢＭ培養液中でスフェロイド培養した上記接着性成熟細胞６種及び上記接着性前駆細胞３種における多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｏｃｔ３／４）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図16】上記接着性成熟細胞６種及び上記接着性前駆細胞３種の専用培養液中でスフェロイド培養した上記接着性成熟細胞６種及び上記接着性前駆細胞３種と、ＭＳＣＢＭ培養液中でスフェロイド培養した上記接着性成熟細胞６種及び上記接着性前駆細胞３種における多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図17】上記接着性成熟細胞６種及び上記接着性前駆細胞３種の専用培養液中でスフェロイド培養した上記接着性成熟細胞６種及び上記接着性前駆細胞３種と、ＭＳＣＢＭ培養液中でスフェロイド培養した上記接着性成熟細胞６種及び上記接着性前駆細胞３種における多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｓｏｘ２）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図18】ＭＳＣＢＭ培養液中でスフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞と、輸液中でスフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞における多能性幹細胞マーカー遺伝子３種（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図19】図１９Ａは、ＨＵＶＥＣ培養用培養液中でスフェロイド培養したＨＵＶＥＣ細胞の位相差画像（左図）と、輸液中でスフェロイド培養したＨＵＶＥＣ細胞の位相差画像（右図）である。図１９Ｂは、ＨＵＶＥＣ培養用培養液中でスフェロイド培養したＨＵＶＥＣ細胞と、輸液中でスフェロイド培養したＨＵＶＥＣ細胞における多能性幹細胞マーカー遺伝子３種（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である（平均値±標準偏差、［ｎ＝３］）。
【図20】図２０Ａは、ＮＨＥＫ培養用培養液中でスフェロイド培養したＮＨＥＫ細胞の位相差画像（左図）と、輸液中でスフェロイド培養したＮＨＥＫ細胞の位相差画像（右図）である。図２０Ｂは、ＮＨＥＫ培養用培養液中でスフェロイド培養したＮＨＥＫ細胞と、輸液中でスフェロイド培養したＮＨＥＫ細胞における多能性幹細胞マーカー遺伝子３種（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である（平均値±標準偏差、［ｎ＝３］）。
【図21】図２１Ａは、ジェランガムを含む培養液中でスフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞における多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。図２１Ｂは、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、ジェランガム、グァーガム、キサンタンガム、又はデキストランを含む培養液中でスフェロイド培養し、多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図22】ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）を添加した培養液を用いた浮遊培養（以下、「神経分化誘導法１」という）（非特許文献５及び本実施例参照）による神経細胞（外胚葉由来細胞）への分化誘導処理した後、神経細胞マーカータンパク質（ネスチン）の発現を解析した結果（図２２Ａ）と、細胞の形態を顕微鏡で観察した結果（図２２Ｂ）を示す図である。
【図23】ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、Ｎｏｇｇｉｎを添加した培養液を用いた接着培養（以下、「神経分化誘導法２」という）（文献「Wada, et al., PLoS One. 4(8):e6722(2009)」及び本実施例参照）による神経細胞への分化誘導処理した後、神経細胞マーカータンパク質（βチューブリン３）の発現を解析した結果（図２３Ａ）と、細胞の形態を顕微鏡で観察した結果（図２３Ｂ）を示す図である。
【図24】ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを神経細胞への分化誘導処理後、神経前駆細胞マーカー遺伝子２種（Musashi［図２４Ａ］及びＭＡＰ２［図２４Ｂ］）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【図25】図２５Ａ及びＢは、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、それぞれ浮遊培養及び接着培養による肝細胞（内胚葉由来細胞）への分化誘導処理後、肝細胞マーカータンパク質（ＡＦＰ）の発現を解析した結果を示す図である。図２５Ｃは、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、浮遊培養による肝細胞への分化誘導処理後、細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図26】図２６Ａは、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、接着培養による心筋細胞（中胚葉由来細胞）への分化誘導処理後、細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を示す図である。図２６Ｂは、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、浮遊培養及び接着培養による心筋細胞への分化誘導処理後、心筋細胞マーカー遺伝子（ＧＡＴＡ４）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
本件多能性幹細胞１は、哺乳動物間葉系幹細胞を浮遊培養することにより得られた細胞塊（スフェロイド［Spheroid］）（以下、「本件多能性幹細胞塊１」ということがある）を形成する細胞であり、通常多能性幹細胞として使用するために用いる。また、本件多能性幹細胞２は、哺乳動物接着性成熟細胞又は哺乳動物接着性前駆細胞を浮遊培養することにより得られた細胞塊（スフェロイド）（以下、「本件多能性幹細胞塊２」ということがある）を形成する細胞であり、通常多能性幹細胞として使用するために用いる。本発明において、「多能性幹細胞として使用するために用いる」とは、生体内の細胞に対してパラクライン（傍分泌）効果を与えることを目的として用いる（移植する）ことの他、生体内において、３胚葉（外胚葉、内胚葉、中胚葉）に由来する細胞へ分化させることを目的として用いる（移植する）ことや、上記３胚葉に由来する目的の細胞へインビトロで分化させるために用いることを意味する。また、本発明において、多能性幹細胞として使用するための細胞とは、「多能性幹細胞として使用するため」という用途が限定された細胞を意味する。【0027】
本発明の哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類などを例示することができ、中でもマウス、ブタ、又はヒトが好ましく、本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２を再生医療に用いる場合、特にヒトを好適に例示することができる。【0028】
本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２は、それ自体では個体になることができないが、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有し、かつ哺乳動物に移植した場合の腫瘍化リスクがない、或いは極めて低い細胞であり、哺乳動物に移植した場合の腫瘍化リスクが高い、胚性幹細胞（embryonic stem cells：ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cells：ＥＧ細胞）、生殖細胞系列幹細胞（germline stem cells：ＧＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞；induced pluripotent stem cell）等の多能性幹細胞や、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する複能性幹細胞や、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する単能性幹細胞（前駆細胞）とは異なる。【0029】
本発明において、「浮遊培養」とは、細胞又は細胞塊（スフェロイド［Spheroid］）、すなわち細胞が多数集合して形成された３次元構造（球状やぶどうの房状）を有する細胞の塊を培養器に接着させない条件で培養（スフェロイド培養）することを意味する。【0030】
本願明細書において、「接着性成熟細胞」とは、足場に接着することで生存、増殖、物質生産を行なうことができる足場依存性であり、かつ分化が終了（完了）した細胞を意味し、通常の培養条件下では脱分化せず、安定に分化状態が維持される性質を有する。すなわち、上記接着性成熟細胞には、心筋細胞、血管内皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、皮膚線維細胞、骨格筋細胞、骨細胞、ヘパトサイト（肝）細胞、臍帯静脈内皮細胞、皮膚微小リンパ管内皮細胞、表皮角化細胞、気管支上皮細胞、メラノサイト細胞、平滑筋細胞、象牙細胞等の成熟細胞が含まれるが、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ＧＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞等の複能性幹細胞、心筋前駆細胞、血管内皮前駆細胞、神経前駆細胞、脂肪前駆細胞、皮膚線維芽細胞、骨格筋筋芽細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞等の単能性幹細胞（前駆細胞）などの幹細胞や、赤血球、白血球（好中球、単球、リンパ球、マクロファージ等）などの浮遊性細胞は含まれない。【0031】
本願明細書において、「接着性前駆細胞」とは、足場に接着することで生存、増殖、物質生産を行なうことができる足場依存性であり、かつ特定の組織や細胞へ分化する細胞を意味する。すなわち、上記接着性前駆細胞には、上記単能性幹細胞（前駆細胞）は含まれるが、上記多能性幹細胞、上記複能性幹細胞、上記成熟細胞、及び上記浮遊性細胞は含まれない。【0032】
本件多能性幹細胞１及び本件多能性幹細胞２は、多能性（多分化能）を有するものであり、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ３、ＴＲＡ−１−６０等の多能性マーカーの発現により、より特徴付けられる。哺乳動物間葉系幹細胞を通常培養（接着培養）した場合、多能性マーカーは発現しないため、通常培養した哺乳動物間葉系幹細胞における多能性マーカーの発現量（以下、「コントロールの発現量」という）と比べ、本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２における多能性マーカーの発現量は増加する。例えば、本件多能性幹細胞１におけるＮａｎｏｇ遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、コントロールの発現量と比べ、通常２倍以上、好ましくは８倍以上、より好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは３０倍以上、さらにより好ましくは５０倍以上増加する。また、本件多能性幹細胞１におけるＯｃｔ３／４遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、コントロールの発現量と比べ、通常２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、さらに好ましくは４．５倍以上、さらにより好ましくは５倍以上、特に好ましくは５．５倍以上、最も好ましくは６倍以上増加する。また、本件多能性幹細胞１におけるＳｏｘ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、コントロールの発現量と比べ、通常２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、さらに好ましくは４．５倍以上、さらにより好ましくは５倍以上、特に好ましくは５．５倍以上、最も好ましくは６倍以上増加する。また、本件多能性幹細胞２におけるＮａｎｏｇ遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、コントロールの発現量と比べ、通常２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは９倍以上、さらに好ましくは１５倍以上、さらにより好ましくは２０倍以上、特に好ましくは１００倍以上、最も好ましくは１０００倍以上増加する。また、本件多能性幹細胞２におけるＯｃｔ３／４遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、コントロールの発現量と比べ、通常１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上、さらにより好ましくは１０倍以上、特に好ましくは５０倍以上、最も好ましくは１０００倍以上増加する。本件多能性幹細胞２におけるＳｏｘ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、コントロールの発現量と比べ、通常１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは４倍以上、さらにより好ましくは１０倍以上、特に好ましくは５０倍以上、最も好ましくは１０００倍以上増加する。【0033】
本発明の哺乳動物間葉系幹細胞としては、骨髄や骨膜由来、末梢血由来、臍帯血、又は脂肪組織由来であり、かつ間充織組織系の組織（脂肪組織、軟骨組織、骨組織など）に分化可能な幹細胞であれば特に制限されないが、生体組織からの細胞の採取が容易であり、採取した後の培養方法が確立されている点から、哺乳動物骨髄間葉系幹細胞が好ましく、また、生体から余剰組織として採取することが容易であり、採取する際の侵襲性が低いという点から、脂肪組織由来間葉系幹細胞が好ましい。【0034】
本件改善剤１及び本件改善剤２は、それぞれ本件多能性幹細胞１及び本件多能性幹細胞２、すなわち、多能性を有し、かつ腫瘍化リスクが極めて低い細胞を有効成分として含むものであり、臓器又は組織の機能低下若しくは障害を改善（治療）する作用を有する。【0035】
上記臓器又は組織としては、脳、肺、肝臓、腎臓、心臓、腸（大腸、小腸、結腸等）、膵臓、骨（骨髄）、皮膚等を挙げることができる。【0036】
上記臓器又は組織の機能低下若しくは障害としては、具体的に、腫心不全、インスリン依存性糖尿病、パーキンソン病、脊髄損傷、皮膚炎を挙げることができる。【0037】
本件改善剤１や本件改善剤２に含まれる本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２の細胞数としては、移植の対象となる疾患部位や、臓器又は組織の機能低下レベル若しくは機能障害レベルにより異なるため、また、局所投与の場合と全身投与の場合とで異なるため、一概に特定することはできないが、通常１×１０〜１×１０１１である。【0038】
本件改善剤１及び本件改善剤２を上記臓器又は組織の機能低下若しくは障害を有する患者に投与する方法としては、カテーテルを用いて挿入する、冠動静脈内や直接疾患原因の臓器・組織へ注入する、静脈に注射する等の方法を挙げることができる。【0039】
本件調製方法１に用いる哺乳動物骨髄間葉系幹細胞は、骨髄が存在する、上腕骨、肋骨、大腿骨、脛骨などの長骨や、手根骨、足根骨などの短骨や、頭頂骨、肩甲骨、骨盤（腸骨）などの扁平骨から採取することができるが、多量の細胞が採取でき、また採取が容易であるため、大腿骨、脛骨又は骨盤（腸骨）から採取することが好ましい。【0040】
本件調製方法１に用いる哺乳動物脂肪組織由来間葉系幹細胞は、脂肪組織が存在する皮下組織や内臓組織から採取することができるが、多量の細胞が採取でき、また採取が容易であるという点から、皮下組織から採取することが好ましい。【0041】
生体組織から定法により採取した哺乳動物間葉系幹細胞は、初代培養法に準ずる方法で接着培養することにより単離することができる。【0042】
上記哺乳動物接着性成熟細胞や哺乳動物接着性前駆細胞は、皮膚（表皮、真皮、皮下組織等）、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、血管、脳、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、毛等の臓器や組織から定法により採取し、初代培養法に準ずる方法で接着培養することにより単離することができる。【0043】
本件調製方法１や本件調製方法２において、哺乳動物間葉系幹細胞、哺乳動物接着性成熟細胞、及び哺乳動物接着性前駆細胞は、通常０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の血清（ウシ胎児血清［Fetal bovine serum；ＦＢＳ］、子牛血清［Calf bovine serum；ＣＳ］等）を含有する動物細胞培養用培養液（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９など）中で接着培養するが、細胞の性質（特性）に合わせて最適化された培養液中で接着培養してもよく、かかる培養液としては、具体的には、本実施例や本参考例で用いた培養液（ＭＳＣＢＭ培養液、ＡＤＳＣ−ＢＭ培養液、ｈＨＥＰ培養用培養液、ＨＵＶＥＣ培養用培養液、ＨＭＶＥＣ培養用培養液、ＮＨＥＫ培養用培養液、ＮＨＤＦ培養用培養液、ＮＨＢＥ培養用培養液、ＨＳＭＭ培養用培養液、ＮＨＥＭ培養用培養液、ＵＡＳＭＣ培養用培養液、及びＮＨＯｓｔ培養用培養液）を挙げることができる。【0044】
上記接着培養は、ガラス製又はプラスチック製のマルチウエルプレート、培養皿（シャーレ、ディッシュ）、フラスコなどの培養器を用いて行うことができ、ここでプラスチック製の培養器には、細胞が接着しやすいようにポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの親水性ポリマーや、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ニドジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フィブリノーゲン、コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジンなどの細胞接着分子で表面処理されたものが含まれる。親水性ポリマーや細胞接着分子で表面処理された培養器は、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。親水性ポリマーで表面処理された培養器の市販品としては、例えば細胞培養フラスコ（ＴＰＰ社製）、ペトリディッシュ（ＴＰＰ社製）、プライマリア カルチャーウェア（日本ＢＤ社製）などを挙げることができ、細胞接着分子で表面処理された培養器の市販品としては、例えばＢＤ バイオコート ラミニンコート製品（日本ＢＤ社製）、バイオコート ポリ−Ｄ−リジン／ラミニン ディッシュ（コスモバイオ社製）、バイオコート ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン プレート（コスモバイオ社製）、バイオコート ラミニン／フィブロネクチン プレート（コスモバイオ社製）などを挙げることができる。また、ガラス製の培養器の市販品としては、チャンバースライドII（ＩＷＡＫＩ社製）、ＢＤ Falconカルチャースライド（日本ＢＤ社製）、チャンバースライド（松波硝子工業社製）などを挙げることができる。哺乳動物間葉系幹細胞は、培養器に接着して増殖する性質を有するため、浮遊して増殖する造血性幹細胞と分離することができる。【0045】
上記接着培養は、哺乳動物間葉系幹細胞、哺乳動物接着性成熟細胞、及び哺乳動物接着性前駆細胞の培養に適した条件で実施することができ、培養に適用される培養温度は、通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは３７℃である。培養時のＣＯ２濃度は、通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約５％である。培養時の湿度は、通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％である。また、必要に応じて培養液を交換してもよい。【0046】
哺乳動物間葉系幹細胞が単離されたことは、ＣＤ１０６、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ７１などの間葉系幹細胞で発現するマーカータンパク質（ポジティブマーカー）の発現が検出されることや、ＣＤ３１、ＣＤ１８、ＣＤ５６、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０などの間葉系幹細胞で発現しないマーカータンパク質（ネガティブマーカー）の発現が検出されないことを指標に確認することができる。また、単離した哺乳動物間葉系幹細胞は慣用の方法を用いて凍結保存することができる。【0047】
哺乳動物間葉系幹細胞、哺乳動物接着性成熟細胞、及び哺乳動物接着性前駆細胞の浮遊培養は、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）や、ハイドロゲルや、ＭＰＣポリマー（2-Methacryloylethyl Phosphoryl Choline）などで表面がコーティングされた低接着性の培養器や、上記細胞接着分子でコーティングされていない非接着性の培養器上で細胞を浮遊培養することにより行うことができる。【0048】
上記低接着性の培養器や非接着性の培養器は、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販の低接着性の培養器としては、例えばＥＺＳＰＨＥＲＥ（スフェロイド形成培養用容器）（IWAKI社製）、ＮＣＰ（NanoCulture Plate）（SCIVAX Life Sciences社製）、ＵＬＡ（超低接着表面）培養容器（CORNING社製）の市販品を挙げることができ、市販の非接着性の培養器としては、例えば浮遊培養用ペトリディッシュ（Nunc社製）、浮遊細胞培養用シャーレ（住友ベークライト社製）、ノントリートメントプレート（BD Falcon社製）の市販品を挙げることができる。【0049】
哺乳動物間葉系幹細胞、哺乳動物接着性成熟細胞、及び哺乳動物接着性前駆細胞の浮遊培養は、本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２の細胞塊が形成できる溶液中で行う。かかる溶液としては、例えば、０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の血清（ＦＢＳ、ＣＳ等）を含有する動物細胞培養用培養液（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等）、血清代替物を適量（例えば、１〜３０％）添加した上記動物細胞培養用培養液、本実施例や本参考例で用いた培養液（ＭＳＣＢＭ培養液、ＡＤＳＣ−ＢＭ培養液、ｈＨＥＰ培養用培養液、ＨＵＶＥＣ培養用培養液、ＨＭＶＥＣ培養用培養液、ＮＨＥＫ培養用培養液、ＮＨＤＦ培養用培養液、ＮＨＢＥ培養用培養液、ＨＳＭＭ培養用培養液、ＮＨＥＭ培養用培養液、ＵＡＳＭＣ培養用培養液、ＮＨＯｓｔ培養用培養液、ｈＭＳＣ培養用培養液）などの血清又は血清代替物（血清代替成分）を含む培養液や、生理食塩水、緩衝効果のある生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水［Phosphate buffered saline；ＰＢＳ］、トリス緩衝生理食塩水［Tris Buffered Saline；ＴＢＳ］、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等）、リンゲル液（乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等）、５％グルコース水溶液、上記動物細胞培養用培養液、等張剤（ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム等）、本実施例で用いた輸液などの血清又は血清代替物（血清代替成分）を含まない生理的水溶液を挙げることができ、血清又は血清代替物（血清代替成分）を含まない生理的水溶液が好ましく、具体的に、本実施例で用いた輸液を挙げることができる。ジェランガムやデキストランを補充した場合、多能性獲得の効率が高まるため、ジェランガム若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「ジェランガム類」ということがある）と、デキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「デキストラン類」ということがある）のいずれか一方又は両方を含有する上記溶液が好ましい。【0050】
本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２の細胞塊をデキストラン存在下で浮遊培養した場合、多能性獲得の効率が高まるため、本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２の細胞塊を形成させる工程の後に、さらに本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２の細胞塊を、デキストラン類を含有する上記溶液中で浮遊培養する工程を備えた本件調製方法１や本件調製方法２が好ましい。【0051】
上記ジェランガム類におけるジェランガムとしては、直鎖状のヘテロ多糖類であり、グルコース、グルクロン酸、グルコース及びラムノースの４つの糖に由来する繰り返し単位から構成されているものであれば特に制限されず、脱アシル型ジェランガムとネイティブ型ジェランガムを挙げることができる。かかる脱アシル型ジェランガムとしては、ケルコゲル（登録商標）等が市販されており、ネイティブ型ジェランガムとしては、ケルコゲル（登録商標）ＬＴ１００、ケルコゲル（登録商標）ＨＭ、ケルコゲル（登録商標）ＨＴ等が市販されている。本発明において、脱アシル型ジェランガムが好ましい。【0052】
上記ジェランガム類におけるジェランガム誘導体としては、ジェランガムに対してエステル化、有機又は無機の酸の塩の添加等の標準の化学反応を行うことによって得られる生成物であればよく、具体的にはウェランガムを挙げることができる。【0053】
上記ジェランガム類におけるジェランガム又はその誘導体の塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩や、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩や、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩などを挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用は、ジェランガムの場合と同効なものが好ましい。これらの塩類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。【0054】
上記溶液中のジェランガム類の濃度は、通常０．００１〜１．０（ｗ／ｖ）％の範囲内であり、好ましくは０．００５〜０．２（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．０１〜０．２（ｗ／ｖ）％である。【0055】
上記デキストラン類におけるデキストランとしては、Ｄ−グルコースからなる多糖（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎであって、α１→６結合を主鎖とするものであれば特に制限されず、デキストランの重量平均分子量（Ｍｗ）としては、例えば、デキストラン４０（Ｍｗ＝４００００）、デキストラン７０（Ｍｗ＝７００００）などを挙げることができる。これらデキストランは、化学合成、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法で製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、低分子デキストランＬ注(大塚製薬工場社製)、デキストラン７０（東京化成工業社製）などの市販品を挙げることができる。【0056】
上記デキストラン類におけるデキストラン誘導体としては、デキストラン硫酸、カルボキシル化デキストラン、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン等を挙げることができる。【0057】
上記デキストラン類におけるデキストラン又はその誘導体の塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩や、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩や、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩などを挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用は、デキストランの場合と同効なものが好ましい。これらの塩類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。【0058】
上記溶液中のデキストラン類の濃度は、通常、０．１（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは、０．５（ｗ／ｖ）％以上、より好ましくは１．０（ｗ／ｖ）％以上である。また、細胞の生存率への悪影響を回避する観点から、上記溶液中のデキストラン類の濃度は、例えば２０（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは１５（ｗ／ｖ）％以下、より好ましくは１２（ｗ／ｖ）％以下、さらに好ましくは１０（ｗ／ｖ）％以下である。したがって、上記溶液中のデキストラン類の濃度は、例えば、０．１〜２０（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．５〜１５（ｗ／ｖ）％、より好ましくは１．０〜１２（ｗ／ｖ）％、さらに好ましくは１．０〜１０（ｗ／ｖ）％である。【0059】
上記血清又は血清代替物を含む培養液や、上記血清又は血清代替物を含まない生理的水溶液には、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、サリチレート）、アミノ酸（例えば、グルタミン、アラニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、チロシン等の非必須アミノ酸）、ビタミン類（例えば、塩化コリン、パントテン酸、葉酸、ニコチンアミド、塩酸ピリドキサル、リボフラビン、塩酸チアミン、アスコルビン酸、ビオチン、イノシトール等）、多糖類（例えば、グァーガム、キサンタンガム等）、溶解補助剤、保存剤、酸化防止剤などの添加物を必要に応じて適宜補充してもよい。【0060】
本発明において、「血清代替物」とは、血清の代わりに細胞を培養・増殖させるために用いるもの（成分）であり、血清と同様の効果を有するものを意味する。血清代替物としては、具体的には、市販のＢ２７サプリメント（−インスリン）（Life Technologies社製）、Ｎ２サプリメント（Life Technologies社製）、Ｂ２７サプリメント（Life Technologies社製）、Knockout Serum Replacement（Invitrogen社製）等を挙げることができる。【0061】
浮遊培養を行う培養条件は、本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２のスフェロイドが形成できる培養条件（温度、時間、細胞濃度等）であれば適宜選択することができる。例えば、浮遊培養開始時の細胞濃度は、通常１×１０〜１×１０８であり、好ましくは１×１０２〜１×１０６であり、より好ましくは１×１０３〜１×１０５である。培養に適用される培養温度は、通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは３７℃である。培養時のＣＯ２濃度は、通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約５％である。培養時の湿度は、通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％である。また、必要に応じて培養液を交換してもよい。培養時間としては、本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２が十分な割合で調製できる期間であればよく、通常５時間〜４週間であり、好ましくは１日〜３週間であり、より好ましくは３日〜２週間である。【0062】
本件調製方法１や本件調製方法２を用いて、調製された細胞が多能性であることは、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ３、ＴＲＡ−１−６０等の多能性マーカーの発現が検出されることを指標に確認することができる。多能性マーカーの発現を検出する方法としては、細胞の全ＲＮＡを抽出・精製し、多能性マーカー遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法や、細胞の全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、多能性マーカー遺伝子のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法などの定量ＰＣＲ法で検出する方法や、細胞の全ＲＮＡを精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）などでｃＤＮＡをラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体などで間接的にｃＤＮＡを標識した後、ガラス、シリコン、プラスチックなどのハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、多能性マーカー遺伝子のｃＤＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法の他、多能性マーカータンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法（免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロッティング法など）を挙げることができる。【0063】
本件調製方法１や本件調製方法２において、高純度な本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２の細胞懸濁液を調製する場合、本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２の細胞塊を、細胞分散液（トリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロナーゼ、ペプシン、エラスターゼ、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ等）や、ピペットやピペットマンを用いて細胞懸濁液を調製し、多能性幹細胞の細胞表面マーカー（ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ−３等）に対する抗体を用いた蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）や、蛍光物質やビオチン、アビジン等の標識物質で標識した上記多能性幹細胞の細胞表面マーカーに対する抗体と、かかる標識物質に対する抗体とＭＡＣＳビーズ（磁性ビーズ）とのコンジュゲート抗体とを用いた自動磁気細胞分離装置（ａｕｔｏＭＡＣＳ）により単離処理を施す。上記蛍光物質としては、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７等を挙げることができる。【0064】
本件分化誘導方法１や本件分化誘導方法２としては、本件調製方法１や本件調製方法２を用いて調製した本件多能性幹細胞１や本件多能性幹細胞２に分化処理を施す工程を備えた方法であれば特に制限されないが、分化効率を高めるために、調製した細胞塊（本件多能性幹細胞塊１や本件多能性幹細胞塊２）に分化処理を施す前に、上記細胞分散液で処理したり、ピペットやピペットマンを用いて、多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞の状態に懸濁する工程と、単一細胞を浮遊培養し、細胞塊を形成させる工程をさらに備えた方法が好ましい。単一細胞を浮遊培養するときの溶液や培養条件は上述のとおりである。本願明細書において、「単一細胞の状態」とは、他の細胞と寄り集まって塊を形成していないこと（即ち、凝集していない状態）を意味する。多能性幹細胞中に含まれる単一細胞の状態の細胞の割合は、通常７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上、特に好ましくは１００％である。単一細胞の状態の細胞の割合は、懸濁液中の多能性幹細胞を顕微鏡下で観察し、無作為に選択された複数個（例えば、１０００個）の細胞について凝集の有無を調べることにより確認することができる。【0065】
上記分化処理は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、胚様体（ＥＢ）細胞等の多能性幹細胞で報告されている分化処理方法を参考に任意の細胞への分化誘導法を用いて適宜行うことができ、例えば、神経幹細胞への分化誘導は、文献（特開２００２−２９１４６９号公報）に記載された方法にしたがって行うことができ、神経分化誘導法１（非特許文献５及び本実施例参照）や、神経分化誘導法２（文献「Wada, et al., PLoS One. 4(8):e6722(2009)」及び本実施例参照）により行うことができ、膵幹様細胞への分化誘導は、文献（特開２００４−１２１１６５号公報）に記載された方法にしたがって行うことができ、造血細胞への分化誘導は、文献（特表２００３−５０５００６号公報、国際公開第９９／０６４５６５号パンフレット）に記載された方法にしたがって行うことができ、筋細胞への分化誘導は、文献（Boheler K.R, et al, Circ. Res. 91,189-201, 2002）に記載された方法にしたがって行うことができ、肝細胞への分化誘導は、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）を添加した培養液を用いた浮遊培養又は接着培養（本実施例参照）により行うことができ、心筋細胞への分化誘導は、文献（Klug M. G, et al, J. Clin. Invest. 98, 216-224, 1996、Muller M, et al, FASEB. J. 14, 2540-2548, 2000）に記載された方法にしたがって行うことができ、血管内皮細胞や血管平滑筋細胞への分化誘導は、文献（Vittet D, et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6273-6278, 1997、Bloch W, et al, J. Cell Biol. 139, 265-278, 1997、Yamashita J, et al, Nature 408, 92-96, 2000、Feraud O, et al,Lab. Invest. 81, 1669-1681, 2001）に記載された方法にしたがって行うことができ、脂肪細胞への分化誘導は、脂肪細胞誘導用培養液（Lonza社製、PT-3004）を用いた浮遊培養又は接着培養（本実施例参照）により行うことができ、網膜細胞への分化誘導は、文献（Ikeda H, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA102, 11331-11336, 2005、Osakada F, et al, Nat. Biotechnol. 26, 215-224, 2008、Osakada F, et al, Nat. Protoc. 4, 811-824, 2009、Hirami Y, et al, Neurosci. Lett.458, 126-131, 2009、Osakada F, et al, J Cell Sci 122, 3169-3179, 2009）に記載された方法にしたがって行うことができ、樹状細胞への分化誘導は、文献（Senju S, Haruta M, Matsunaga Y, et al, Stem Cells 27, 1021-1031, 2009）に記載された方法にしたがって行うことができる。【0066】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。【実施例1】
【0067】
１．ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞をスフェロイド培養すると、多能性幹細胞マーカーを発現する細胞が得られることの確認１−１ 方法
１−１−１ ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞の培養とスフェロイド培養方法
〔１〕７５ｃｍ２のフラスコに、間葉系幹細胞添加因子セット（Lonza社製、PT-4105）を加えたＭＳＣＢＭ（Mesenchymal Stem Cell Basal Medium）（Lonza社製、PT-3238）（以下、「ＭＳＣＢＭ培養液」という）１６ｍＬを添加し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で培養液の加温・平衡化を行った（３０分以上）。
〔２〕ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞（Lonza社製）を液体窒素から取り出し、３７℃の湯浴器中で迅速に融解した。
〔３〕融解した細胞を、予め５ｍＬＭＳＣＢＭ培養液を入れておいた１５ｍＬ遠心管に移し混和した。
〔４〕５００ｇ、５分間、２２℃で遠心処理を行った。
〔５〕上清を除き、１ｍＬＭＳＣＢＭ培養液を加え、ピペッティングすることにより、細胞を懸濁した。
〔６〕さらに９ｍＬＭＳＣＢＭ培養液を加えて撹拌した。
〔７〕細胞数をカウントし、７５ｃｍ２フラスコに播種した（４．０×１０５細胞／フラスコ）。
〔８〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で細胞培養を行った。
〔９〕３日又は４日おきに培養液を交換した。
〔１０〕８０％コンフルエント程度になったら培養液をアスピレーターで吸引し、１０ｍＬＰＢＳを加え細胞を洗浄した。
〔１１〕ＰＢＳを除き、トリプシン／ＥＤＴＡ（Lonza社製）を３．７５ｍＬ程度加え、顕微鏡で細胞の状態を確認しながら室温で５分間トリプシン処理を行った後、９０％以下の細胞が剥離しなかった場合は、さらに３〜１０分間トリプシン処理を行った。
〔１２〕室温のＭＳＣＢＭ培養液をトリプシン／ＥＤＴＡと等量加え、トリプシン処理を止めた後、ピペッティングで細胞を剥離し、１５ｍＬチューブに回収した。
〔１３〕６００ｇ、５分間、室温で遠心処理を行った。
〔１４〕上清を除き、１ｍＬＭＳＣＢＭ培養液を加え、ピペッティングすることにより、細胞を懸濁した。
〔１５〕さらに９ｍＬＭＳＣＢＭ培養液を加えて撹拌した。
〔１６〕細胞数をカウントし、７５ｃｍ２フラスコに播種した（３．７５〜４．５×１０５細胞／フラスコ）。
〔１７〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で細胞培養を行った。
〔１８〕３日又は４日おきに培養液を交換した。
〔１９〕解析に用いる上で十分な細胞数（０．３〜１×１０８細胞）となるまで、工程〔１０〕〜［１８］を繰り返した。
〔２０〕８０％コンフルエント程度になったら培養液をアスピレーターで吸引し、１０ｍＬＰＢＳを加え細胞を洗浄した。
〔２１〕ＰＢＳを除き、トリプシン／ＥＤＴＡ（Lonza社製）を３．７５ｍＬ程度加え、顕微鏡で細胞の状態を確認しながら室温で５分間トリプシン処理を行った後、９０％以下の細胞が剥離しなかった場合は、さらに３〜１０分間トリプシン処理を行った。
〔２２〕室温のＭＳＣＢＭ培養液をトリプシン／ＥＤＴＡと等量加え、トリプシン処理を止めた後、ピペッティングで細胞を剥離し、１５ｍＬチューブに回収した。
〔２３〕６００ｇ、５分間、室温で遠心処理を行った。
〔２４〕上清を除き、１ｍＬＭＳＣＢＭ培養液を加え、ピペッティングすることにより、細胞を懸濁した。
〔２５〕さらに９ｍＬＭＳＣＢＭ培養液を加えて撹拌した。
〔２６〕細胞数をカウントし、低接着性の１００ｍｍディッシュ（Corning社製）及び９６ウェルプレート（Corning社製）に播種し（１．０×１０６細胞／ディッシュ及び１．０×１０４細胞／プレート）、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で７日間スフェロイド培養を行った。
【0068】
１−１−２ 免疫蛍光染色法〔１〕上記「１−１−１ ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞の培養とスフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがって９６ウェルプレートでスフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞を、１．５ｍＬチューブに回収した。なお、コントロールとしてチャンバースライド（IWAKI社製）にて接着培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞は、剥離せずに以下同様の操作を行った。
〔２〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔３〕上清を除き、０．５〜１ｍＬ４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳを加え、細胞の固定処理を行った（１５分間、室温）。
〔４〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔５〕上清を除き、１〜１．５ｍＬＰＢＳを加え、細胞の洗浄処理を行った（５分間、室温）。
〔６〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔７〕工程〔５〕〜［６］を２回繰り返した。
〔８〕上清を除き、０．５〜１ｍＬTriton／ＰＢＳを加え、細胞の透過処理を行った（５分間、室温）。
〔９〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔１０〕上清を除き、１〜１．５ｍＬＰＢＳを加え、細胞の洗浄処理を行った（５分間、室温）。
〔１１〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔１２〕工程〔１０〕〜［１１］を１回繰り返した。
〔１３〕上清を除き、１ｍＬブロッキング溶液（５％正常血清／ＰＢＳ又は３％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を加え、細胞のブロッキング処理を行った（１〜２時間、室温）。
〔１４〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔１５〕上清を除き、４種類の多能性幹細胞マーカータンパク質（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＳＳＥＡ３）の発現を検出するために、０．５〜１ｍＬ１次抗体溶液（抗Ｎａｎｏｇ抗体［Cell signaling technology社製、＃4903S、１／８００倍希釈］、抗Ｏｃｔ４抗体［Cell signaling technology社製、＃2750S、１／４００倍希釈］、抗Ｓｏｘ２抗体［Cell signaling technology社製、＃3579S、１／４００倍希釈］、又は抗ＳＳＥＡ３抗体［Millipore社製、A488、１／２００倍希釈］）を加え、細胞の１次抗体反応処理を行った（一晩、４℃）。
〔１６〕上清を除き、１〜１．５ｍＬＰＢＳを加え、細胞の洗浄処理を行った（５分間、室温）。
〔１７〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔１８〕工程〔１６〕〜［１７］を２回繰り返した。
〔１９〕上清を除き、０．５〜１ｍＬ２次抗体溶液（Alexa Fluor 488抗ラビット抗体［Invitrogen社製、A21206、１／１０００倍希釈］、Alexa Fluor 555抗ラビット抗体［Invitrogen社製、A21428、１／１０００倍希釈］、又はAlexa Fluor 488抗マウス抗体［Invitrogen社製、A21202、１／１０００倍希釈］）を加え、細胞の２次抗体反応処理を行った（１〜２時間、室温）。
〔２０〕上清を除き、１〜１．５ｍＬＰＢＳを加え、細胞の洗浄処理を行った（５分間、室温）。
〔２１〕スフェロイド培養した細胞塊は、チューブ底に沈むまで静置した。
〔２２〕工程〔２０〕〜［２１］を２回繰り返した。
〔２３〕上清を除き、１〜１．５ｍＬＰＢＳを加え、スライドグラス上に細胞塊を静置後、又は、接着培養のチャンバースライド上部の剥離後、Fluoromount（Diagnostic BioSystem社製）を滴下しカバーグラスをかけ封入し、免疫蛍光染色用の細胞試料を作製した。
〔２４〕Axio Observer（Carl Zeiss社製）を用いて、細胞試料における蛍光画像と位相
差画像を取得した。解析ソフトには、Axio Vision（Carl Zeiss社製）を使用した。
【0069】
１−１−３ ｍＲＮＡの発現解析〔１〕上記「１−１−１ ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞の培養とスフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがって１００ｍｍディッシュでスフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞を、１５ｍＬ遠心管に回収した。なお、コントロールとして接着培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞を回収し、以下同様の操作を行った。
〔２〕細胞における全ＲＮＡの抽出は、RNeasy Mini Kit（Qiagen社製）及びQIA shredder（Qiagen社製）を用いて製品付属のプロトコールにしたがって行った。
〔３〕抽出した全ＲＮＡの濃度は、NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて測定した。
〔４〕全ＲＮＡを２０μｇ／ｍＬに調整し、９６ウェルプレート（Fast 96 well Reaction plate［Applied Biosystems社製、＃4309169］）に３μＬ／ウェルとなるように分注した。
〔５〕３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、及びＳｏｘ２）のｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲにより検出するために、TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit（Applied Biosystems社製、＃4309169）を用いて以下の１）〜６）からなる反応液を調製し、全ＲＮＡを分注した９６ウェルプレートへ滴下した。なお、内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。
１）Rnase-free water；０．５μＬ
２）2X Master Mix without UNG；１０μＬ（１×）
３）40X MultiScribe and RNase Inhibitor Mix；０．５μＬ
４）Forward Primer；２．０μＬ（３００ｎＭ）
５）Reverse Primer；２．０μＬ（９００ｎＭ）
６）TaqMan Probe；２．０μＬ（２００ｎＭ）
【0070】
上記３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット（上記「Forward Primer」及び「Reverse Primer」）の塩基配列や、その増幅（ＰＣＲ）産物にハイブリダイズするプローブ（上記「TaqMan Probe」）の塩基配列は、表１に示す。【0071】
【表1】
【0072】
〔６〕工程〔５〕で調製した全ＲＮＡと反応液との混合液を用いて、ABI PRISM 7000 Sequence Detection system (Applied Biosystems社製)によるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、以下の１）〜３）に示した条件で行った。１）４８℃、３０分を１サイクル（ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応）
２）９５℃、１０分を１サイクル（ポリメラーゼの活性化）
３）９５℃、１５秒と６０℃、１分の往復を４０サイクル（「Forward Primer」及び「Reverse Primer」によるｃＤＮＡの増幅）
〔７〕Baselineソフトウェア(Applied Biosystems社製)を用いてＰＣＲ産物が一定量になるＰＣＲのサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を測定し、比較Ｃｔ法（delta delta Ｃｔ法）によりＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物のＣｔ値を基準とした上記３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物のＣｔ値の相対値を求め、かかるＣｔ値の相対値から、上記３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子のｃＤＮＡの相対量、すなわち上記３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡの相対量を算出した（図５及び１０の縦軸参照）。
【0073】
１−２ 結果免疫蛍光染色法を用いて４種類の多能性幹細胞マーカータンパク質（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＳＳＥＡ３）の発現を検出したところ、コントロールの接着培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞においては、上記４種類の多能性幹細胞マーカータンパク質の発現は検出されなかったのに対して、スフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞においては、上記４種類の多能性幹細胞マーカータンパク質が検出された（図１〜４参照）。
【0074】
また、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、及びＳｏｘ２）のｍＲＮＡの発現量を検出・定量したところ、スフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞におけるＮａｎｏｇ及びＯｃｔ３／４のｍＲＮＡの発現量は、コントロールの接着培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞と比べ、それぞれ５７．８倍及び４３．３倍と大幅に増加していた（図５参照）。また、Ｓｏｘ２のｍＲＮＡの発現量は、コントロールの接着培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞では検出されなかったのに対して、スフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞では検出された（図５参照）。これらの結果は、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞をスフェロイド培養すると、多能性幹細胞マーカーを発現する細胞を誘導（あるいは単離）できることを示している。【実施例2】
【0075】
２．ｈＡＤＳＣ細胞をスフェロイド培養すると、多能性幹細胞マーカーを発現する細胞が得られることの確認２−１ 方法
２−１−１ ｈＡＤＳＣ細胞の培養とスフェロイド培養方法
〔１〕７５ｃｍ２のフラスコに、ヒト脂肪由来幹細胞添加因子セット（Lonza社製、PT-4503）を加えたＡＤＳＣ−ＢＭ（Adipose Derived Stem Cell Basal Medium）（Lonza社製、PT-3273）（以下、「ＡＤＳＣ−ＢＭ培養液」という）１５ｍＬを添加し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で培養液の加温・平衡化を行った（２０〜３０分以上）。
〔２〕ｈＡＤＳＣ細胞（Lonza社製）を液体窒素から取り出し、３７℃の湯浴器中で迅速に融解した。
〔３〕融解した細胞を、予め５ｍＬＡＤＳＣ−ＢＭ培養液を入れておいた１５ｍＬ遠心管に移し混和した。
〔４〕２１０ｇ、５分間、２２℃で遠心処理を行った。
〔５〕上清を除き、１ｍＬＡＤＳＣ−ＢＭ培養液を加え、ピペッティングすることにより、細胞を懸濁した。
〔６〕さらに９ｍＬＡＤＳＣ−ＢＭ培養液を加えて撹拌した。
〔７〕細胞数をカウントし、７５ｃｍ２フラスコに播種した（３．７５×１０５細胞／フラスコ）。
〔８〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で細胞培養を行った。
〔９〕３日又は４日おきに培養液を交換した。
〔１０〕９０％コンフルエント程度になったら培養液をアスピレーターで吸引し、５ｍＬHEPES buffer（Lonza社製）を加え細胞を洗浄した。
〔１１〕HEPES bufferを除き、トリプシン／ＥＤＴＡ（Lonza社製）を３．７５ｍＬ程度加え、顕微鏡で細胞の状態を確認しながら３７℃で３〜５分間トリプシン処理を行った後、９０％以下の細胞が剥離しなかった場合は、さらに２分間トリプシン処理を行った。
〔１２〕室温のＴＮＳ（Trypsin Neutralization Solution）（Lonza社製）をトリプシン／ＥＤＴＡの２倍量加え、トリプシン処理を止めた後、ピペッティングで細胞を剥離し、１５ｍＬチューブに回収した。
〔１３〕２１０ｇ、５分間、室温で遠心処理を行った。
〔１４〕上清を除き、１ｍＬＡＤＳＣ−ＢＭ培養液を加え、ピペッティングすることにより、細胞を懸濁した。
〔１５〕さらに９ｍＬＡＤＳＣ−ＢＭ培養液を加えて撹拌した。
〔１６〕細胞数をカウントし、７５ｃｍ２フラスコに播種した（３．７５〜４．５×１０５細胞／フラスコ）。
〔１７〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で細胞培養を行った。
〔１８〕３日又は４日おきに培養液を交換した。
〔１９〕解析に用いる上で十分な細胞数（０．３〜１×１０８細胞）となるまで、工程〔１０〕〜［１８］を繰り返した。
〔２０〕９０％コンフルエント程度になったら培養液をアスピレーターで吸引し、１０ｍＬＰＢＳを加え細胞を洗浄した。
〔２１〕ＰＢＳを除き、トリプシン／ＥＤＴＡ（Lonza社製）を３．７５ｍＬ程度加え、顕微鏡で細胞の状態を確認しながら３７℃で３〜５分間トリプシン処理を行った後、９０％以下の細胞が剥離しなかった場合は、さらに２分間トリプシン処理を行った。
〔２２〕室温のＴＮＳ（Lonza社製）をトリプシン／ＥＤＴＡの２倍量加え、トリプシン処理を止めた後、ピペッティングで細胞を剥離し、１５ｍＬチューブに回収した。
〔２３〕２１０ｇ、５分間、室温で遠心処理を行った。
〔２４〕上清を除き、１ｍＬＡＤＳＣ−ＢＭ培養液を加え、ピペッティングすることにより、細胞を懸濁した。
〔２５〕さらに９ｍＬＡＤＳＣ−ＢＭ培養液を加えて撹拌した。
〔２６〕細胞数をカウントし、低接着性の１００ｍｍディッシュ（Corning社製）及び９６ウェルプレート（Corning社製）に播種し（１．０×１０６細胞／ディッシュ及び１．０×１０４細胞／プレート）、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で７日間スフェロイド培養を行った。
【0076】
２−１−２ 免疫蛍光染色法上記「２−１−１ ｈＡＤＳＣ細胞の培養とスフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがって９６ウェルプレートでスフェロイド培養したｈＡＤＳＣ細胞を、上記「１−１−２ 免疫蛍光染色法」に記載の方法にしたがって解析した。なお、コントロールとして接着培養したｈＡＤＳＣ細胞を用いた。
【0077】
２−１−３ ｍＲＮＡの発現解析上記「１−１−１ ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞の培養とスフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがって１００ｍｍディッシュでスフェロイド培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞を、上記「１−１−３ ｍＲＮＡの発現解析」に記載の方法にしたがって解析した。なお、コントロールとして接着培養したｈＡＤＳＣ細胞を用いた。
【0078】
２−２ 結果免疫蛍光染色法を用いて４種類の多能性幹細胞マーカータンパク質（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＳＳＥＡ３）の発現を検出したところ、コントロールの接着培養したｈＡＤＳＣ細胞においては、上記４種類の多能性幹細胞マーカータンパク質の発現は検出されなかったのに対して、スフェロイド培養したｈＡＤＳＣ細胞においては、上記４種類の多能性幹細胞マーカータンパク質が検出された（図６〜９参照）。
【0079】
また、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、及びＳｏｘ２）のｍＲＮＡの発現量を検出・定量したところ、スフェロイド培養したｈＡＤＳＣ細胞におけるＮａｎｏｇ及びＯｃｔ３／４のｍＲＮＡの発現量は、コントロールの接着培養したｈＡＤＳＣ細胞と比べ、それぞれ２３．６倍及び２４．０倍と大幅に増加していた（図１０参照）。また、Ｓｏｘ２のｍＲＮＡの発現量は、コントロールの接着培養したｈＡＤＳＣ細胞では検出されなかったのに対して、スフェロイド培養したｈＡＤＳＣ細胞では検出された（図１０参照）。これらの結果は、ｈＡＤＳＣ細胞をスフェロイド培養すると、多能性幹細胞マーカーを発現する細胞を誘導（あるいは単離）できることを示している。【0080】
［参考例１］３．接着性成熟細胞及び前駆細胞をスフェロイド培養すると、多能性幹細胞マーカーを発現する細胞が得られることの確認
３−１ 方法
３−１−１ スフェロイド培養方法
［ｈＨＥＰ細胞（接着性成熟細胞１種）］
〔１〕ｈＨＥＰ細胞（In Vitro Technologies, Inc社製）を液体窒素から取り出し、３７℃の湯浴器中で迅速に融解した。
〔２〕細胞を５０ｍＬの遠心管に移した。
〔３〕ｈＨＥＰ細胞の専用培養液（ｈＨＥＰ培養用培養液）（表２参照）２５ｍＬ（氷冷）をゆっくりと滴下した。
〔４〕４℃で遠心した（５０×ｇ、３分）。
〔５〕上清を捨て、氷冷したｈＨＥＰ培養用培養液を５ｍＬ添加した。
〔６〕細胞数をカウントし、低接着性の９６ウェルプレート（Corning社製）に播種し（１．０×１０４細胞／ウェル）、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で７日間スフェロイド培養した（図１１の「ｈＨＥＰ」参照）。なお、コントロールとして、接着性の２４ウェルプレート（旭テクノグラス社製）に播種し（１．０×１０５細胞／ウェル）、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で７日間接着培養を行った。
【0081】
［ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、ＮＨＥＫ、ＮＨＢＥ、ＮＨＥＭ、及びＵＡＳＭＣ細胞（接着性成熟細胞６種）、並びにＮＨＤＦ、ＨＳＭＭ、及びＮＨＯｓｔ細胞（接着性前駆細胞３種）］〔１〕７５ｃｍ２のフラスコのそれぞれに、上記接着性成熟細胞６種及び接着性前駆細胞３種の専用培養液（ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、ＮＨＥＫ、ＮＨＤＦ、ＮＨＢＥ、ＨＳＭＭ、ＮＨＥＭ、ＵＡＳＭＣ、及びＮＨＯｓｔ培養用培養液）（表２参照）１６ｍＬを添加し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で培養液の加温・平衡化を行った（３０分以上）。
〔２〕上記接着性成熟細胞６種及び接着性前駆細胞３種（すべてLonza社製）を液体窒素から取り出し、３７℃の湯浴器中で迅速に融解し、上記９種類の細胞専用の培養液を添加した７５ｃｍ２フラスコに播種した（２５００〜１００００細胞／ｃｍ２）。
〔３〕播種後２４時間以内に培養液を交換し、以後１日〜３日おきに培養液を交換した。〔４〕培養液を取り除き、１５ｍＬのＨＢＳＳ（Lonza社製）を加えた。細胞をリンス後、ＨＢＳＳを取り除いた。なお、ＨＳＭＭ細胞については、ＨＢＳＳの代わりにＤＰＢＳ（−）を、また、ＮＨＥＭ細胞については、ＨＢＳＳの代わりにＰＢＳ（−）を用いた。〔５〕トリプシン／ＥＤＴＡ（Lonza社製）を６ｍＬ加え，５分間処理した。
〔６〕ＴＮＳ（Lonza社製）を１２ｍＬ加え、中和した。
〔７〕５０ｍＬの遠心管に入れた。
〔８〕各フラスコそれぞれにＨＢＳＳを５ｍＬ加え，洗い込んだ。なお、ＨＳＭＭ細胞については、ＨＢＳＳの代わりにＤＰＢＳ（−）を、また、ＮＨＥＭ細胞については、ＨＢＳＳの代わりにＰＢＳ（−）を用いた。
〔９〕２２０×ｇ、５分、室温で遠心処理し、上清を捨て、氷冷培地（フラスコ１枚から回収した細胞につき４〜６ｍＬ）を添加した。なお、ＮＨＥＭ細胞については、推奨プロトコールに従い、工程〔９〕は行わなかった。
〔１０〕細胞数をカウントし、７５ｃｍ２フラスコに播種した（２５００〜１００００細胞／ｃｍ２）。
〔１１〕１日〜３日おきに培養液を交換した。
〔１２〕解析に用いるまで、工程〔４〕〜［１１］を繰り返した。
〔１３〕工程〔４〕〜〔９〕と同じ作業を行った。
〔１４〕細胞数をカウントし、低接着性の９６ウェルプレート（Corning社製）に播種し（１．０×１０４細胞／ウェル）、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で７日間スフェロイド培養を行った（図１１の「ＨＵＶＥＣ」、「ＨＭＶＥＣ」、「ＮＨＥＫ」、「ＮＨＤＦ」、「ＮＨＢＥ」、「ＨＳＭＭ」、「ＮＨＥＭ」、「ＵＡＳＭＣ」、及び「ＮＨＯｓｔ」参照）。なお、コントロールとして、接着性の２４ウェルプレート（Corning社製）に播種し（１．０×１０５細胞／ウェル）、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で７日間接着培養を行った。
【0082】
［ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞］ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイド培養は、上記「１−１−１ ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞の培養とスフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがって、低接着性の９６ウェルプレート（Corning社製）中で行った（図１１の「ｈＭＳＣ-ＢＭ」参照）。なお、コントロールとして、接着性の２４ウェルプレート（Corning社製）に播種し（１．０×１０５細胞／ウェル）、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で７日間接着培養を行った。
【0083】
【表2】
【0084】
３−１−２ ｍＲＮＡの発現解析〔１〕上記「３−１−１ スフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがってスフェロイド培養した細胞（接着性成熟細胞７種［ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、ＮＨＥＫ、ｈＨＥＰ、ＮＨＢＥ、ＮＨＥＭ、及びＵＡＳＭＣ細胞］及び接着性前駆細胞３種［ＮＨＤＦ、ＨＳＭＭ、及びＮＨＯｓｔ細胞］については１６ウェル分、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞については２４ウェル分）と、コントロールとして接着培養した細胞（上記接着性成熟細胞７種及び接着性前駆細胞３種については４ウェル分、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞については１２ウェル分）を、それぞれ１．５ｍＬチューブに回収した。
〔２〕細胞における全ＲＮＡの抽出は、RNeasy Mini Kit（Qiagen社製）及びQIA shredder（Qiagen社製）を用いて製品付属のプロトコールにしたがって行った。
〔３〕抽出した全ＲＮＡの濃度は、NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて測定した。
〔４〕全ＲＮＡを２０μｇ／ｍＬに調整し、９６ウェルプレート（Fast 96 well Reaction plate［Applied Biosystems社製、＃4309169］）に３μＬ／ウェル（６０ｎｇＲＮＡ）となるように分注した。
〔５〕多能性幹細胞マーカー遺伝子３種（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、及びＳｏｘ２）のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲにより検出するために、TaqMan RNA-to-CTTM 1-Step Kit（Applied Biosystems社製、＃4392938）を用いて以下の１）〜６）からなる反応液を調製し、全ＲＮＡを分注した９６ウェルプレートへ滴下した。なお、内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。
１）Rnase-free water；０．５μＬ
２）2X TaqMan RT-PCR Mix；１０μＬ（１×）
３）40X TaqMan RT Enzyme Mix；０．５μＬ
４）Forward Primer；２．０μＬ（９００ｎＭ）
５）Reverse Primer；２．０μＬ（９００ｎＭ）
６）TaqMan Probe；２．０μＬ（２００ｎＭ）
【0085】
上記マーカー遺伝子４種及びＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット（上記「Forward Primer」及び「Reverse Primer」）の塩基配列や、その増幅（ＰＣＲ）産物にハイブリダイズするプローブ（上記「TaqMan Probe」）の塩基配列は、表１に示す。【0086】
〔６〕工程〔５〕で調製した全ＲＮＡと反応液との混合液を用いて、ABI PRISM 7000 Sequence Detection system (Applied Biosystems社製)によるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、以下の１）〜３）に示した条件で行った。１）４８℃、１５分を１サイクル（ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応）
２）９５℃、１０分を１サイクル（ポリメラーゼの活性化）
３）９５℃、１５秒と６０℃、１分の往復を４０サイクル（「Forward Primer」及び「Reverse Primer」によるｃＤＮＡの増幅）
〔７〕Baselineソフトウェア(Applied Biosystems社製)を用いてＰＣＲ産物が一定量になるＰＣＲのサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を測定し、比較Ｃｔ法（delta delta Ｃｔ法）によりＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物のＣｔ値を基準とした上記マーカー遺伝子４種のｃＤＮＡ増幅産物のＣｔ値の相対値を求め、かかるＣｔ値の相対値から、上記マーカー遺伝子４種のｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の相対量を算出した（図１２〜１４の縦軸、表３〜５参照）。
【0087】
【表3】
【0088】
【表4】
【0089】
【表5】
【0090】
３−２ 結果ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、及びＳｏｘ２）のｍＲＮＡの発現量を検出・定量したところ、スフェロイド培養したすべての細胞（ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞及び接着性成熟細胞７種及び接着性前駆細胞３種）におけるＮａｎｏｇ及びＯｃｔ３／４のｍＲＮＡの発現量は、コントロールの接着培養した細胞の発現量と比べ、大幅に増加していた（図１２〜１４、表３〜５参照）。これらの結果は、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞等の間葉系幹細胞はもちろんのこと、分化が完了した接着性成熟細胞や特定の組織や細胞へ分化する接着性前駆細胞であっても、スフェロイド培養すると、多能性幹細胞マーカーを発現する細胞を誘導（あるいは単離）できることを示している。
【0091】
［参考例２］４．接着性成熟細胞及び前駆細胞をスフェロイド培養するときの培養液の検討１
接着性成熟細胞６種（ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、ＮＨＥＫ、ＮＨＢＥ、ＮＨＥＭ、及びＵＡＳＭＣ細胞）及び接着性前駆細胞３種（ＮＨＤＦ、ＨＳＭＭ、及びＮＨＯｓｔ細胞）をＭＳＣＢＭ培養液等のＭＳＣ培養用培養液中で培養した場合に、多能性幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルに変化が見られるかどうかを解析した。培養液を各細胞専用の培養液からＭＳＣＢＭ培養液へ変更し、上記参考例１記載の方法により上記接着性成熟細胞６種及び接着性前駆細胞３種をスフェロイド培養したところ、すべての接着性成熟細胞において、各種細胞専用の培養液中でスフェロイド培養するよりも、ＭＳＣＢＭ培養液中でスフェロイド培養をした方が、３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、及びＳｏｘ２）のｍＲＮＡの発現レベルが高いことが示された（図１５〜１７、表６〜８参照）。これらの結果は、接着性成熟細胞や接着性前駆細胞をＭＳＣＢＭ培養液中でスフェロイド培養した方が、各細胞専用の培養液中でスフェロイド培養するよりも、より多能性獲得の効率が高まることを示している。
【0092】
【表6】
【0093】
【表7】
【0094】
【表8】
【実施例3】
【0095】
５．ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞をスフェロイド培養するときの培養液の検討１ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞を無血清の生理的水溶液で培養した場合に、多能性幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルに変化が見られるかどうかを解析した。ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞を、ＭＳＣＢＭ培養液に代えて輸液（エルネオパ２号輸液［大塚製薬工場社製］をビカネイト輸液［大塚製薬工場社製］にて１００倍希釈したもの）中でスフェロイド培養したところ、３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、及びＳｏｘ２）のｍＲＮＡの発現レベルが増加することが示された（図１８、表９参照）。これらの結果は、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞等の間葉系幹細胞を輸液等の無血清の生理的水溶液中でスフェロイド培養した方が、ＭＳＣＢＭ培養液等の間葉系幹細胞培養用培養液中でスフェロイド培養するよりも、多能性獲得の効率が高まることを示している。
【0096】
【表9】
【0097】
［参考例３］６．接着性成熟細胞をスフェロイド培養するときの培養液の検討２
接着性成熟細胞を無血清の生理的水溶液で培養した場合に、多能性幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルに変化が見られるかどうかを解析した。ＨＵＶＥＣ細胞を、ＨＵＶＥＣ培養用培養液に代えて輸液（エルネオパ２号輸液［大塚製薬工場社製］をビカネイト輸液［大塚製薬工場社製］にて１００倍希釈したもの）中で６日間スフェロイド培養したところ（図１９Ａ参照）、３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、及びＳｏｘ２）のｍＲＮＡの発現レベルが増加することが示された（図１９Ｂ、表１０参照）。また、ＮＨＥＫ細胞を、ＮＨＥＫ培養用培養液に代えて上記輸液中で６日間スフェロイド培養した場合（図２０Ａ参照）も同様に、３種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、及びＳｏｘ２）のｍＲＮＡの発現レベルが増加することが示された（図２０Ｂ、表１１参照）。これらの結果は、接着性成熟細胞を輸液等の無血清の生理的水溶液中でスフェロイド培養した方が、細胞専用培養液中でスフェロイド培養するよりも、多能性獲得の効率が高まることを示している。
【0098】
【表10】
【0099】
【表11】
【実施例4】
【0100】
７．ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞をスフェロイド培養するときの培養液の検討２ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞を、多糖類を用いて培養液の粘性を向上させることにより完全浮遊状態で培養させたときに、多能性幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルに変化が見られるかどうかを解析した。ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞を、ジェランガム（０．０２％脱アシル化ジェランガム［三晶社製、CG-LA］）を含むＭＳＣＢＭ培養液中で７日間スフェロイド培養した場合、ジェランガムを含まないＭＳＣＢＭ培養液中でスフェロイド培養した場合と比べ、多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ）のｍＲＮＡの発現レベルが増加することが示された（図２１Ａ参照）。この結果は、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞を、ジェランガムを含む培養液中でスフェロイド培養することにより、スフェロイドの浮遊状態を向上させ、多能性獲得の効率が高まったと推測される。
【0101】
また、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞を上記実施例１記載の方法により９６ウェルプレート中で１日間スフェロイド培養し、スフェロイドを形成させた後、ジェランガム（０．０２％脱アシル化ジェランガム［ケルコゲル；登録商標］［三晶社製、CG-LA］）、グァーガム（０．０２％グァーガム［三栄源エフ・エフ・アイ社製、D-2029］）、キサンタンガム（０．０２％キサンタンガム［三栄源エフ・エフ・アイ社製、NXG-C］）、又はデキストラン（１０％デキストラン４０［名糖産業社製］）を含むＭＳＣＢＭ培養液中で７日間スフェロイド培養したところ（図２１Ｂ参照）、デキストランを含むＭＳＣＢＭ培養液中でスフェロイド培養した場合、デキストランを含まないＭＳＣＢＭ培養液中でスフェロイド培養した場合よりも、多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ）のｍＲＮＡの発現レベルが増加することが示された（図２１Ｂ参照）。この結果から、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、デキストランを含む培養液中でスフェロイド培養することにより、スフェロイドの浮遊状態を向上させ、多能性獲得の効率が高まったと推測される。【実施例5】
【0102】
８．ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドの多分化能の解析ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドの多分化能について解析するために、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、以下の「８−１−１ スフェロイド培養後の継代培養方法」に記載の方法にしたがって継代培養（スフェロイド培養）した後、以下の「８−１−２ 浮遊培養による分化誘導方法」、又は「８−１−３ 接着培養による分化誘導方法」に記載の方法にしたがって４種類の臓器・組織（神経、肝臓、心筋、及び脂肪）細胞への分化誘導処理を行った。
【0103】
８−１ 方法８−１−１ スフェロイド培養後の継代培養方法
〔１〕上記「１−１−１ ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞の培養とスフェロイド培養方法」に記載の方法にしたがって調製したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイド（９６ウェルプレート１枚分）を、５０ｍＬチューブに回収した。
〔２〕５分間室温で静置した後、スフェロイドを吸わないようにかつ培養液の残量が１ｍＬ以下になるようにゆっくりと上清（培養液）を除いた。
〔３〕３０ｍＬＰＢＳ(-)（Life Technologies社製、14190144)を加え、５分間静置した後、同様にゆっくりと上清（培養液）を除いた。
〔４〕２ｍＬトリプシン／ＥＤＴＡ（Lonza社製）を加え、３７℃ウォーターバス中で１０分間静置した。
〔５〕２ｍＬｈＭＳＣ-ＢＭ培養液（Lonza社製、PT-3001）を加え、トリプシン処理を止めた後、Ｐ１０００ピペットで３〜５回ゆっくりとスフェロイドを分散させた。
〔６〕６００ｇ、５分間、室温で遠心処理し、上清の除き、５ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ（ReproCELL社製、RCHEOT002）を加えたReproFF（ReproCELL社製、RCHEMD004）（以下、「ＦＦ＋ｂＦＧＦ培養液」という）１０ｍＬを添加し、細胞を懸濁した。
〔７〕９６ウェルプレート（Corning社製）に播種し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で継代培養（スフェロイド培養）を行った。
〔８〕４日後に、１ウェルあたり７０μＬのＦＦ＋ｂＦＧＦ培養液を除き、新しいＦＦ＋ｂＦＧＦ培養液１００μＬを加えることにより培養液を交換し、さらに７日間継代培養（スフェロイド培養）を行った。
【0104】
８−１−２ 浮遊培養による分化誘導方法〔１〕上記「８−１−１ スフェロイド培養後の継代培養方法」に記載の方法にしたがって調製したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、１ウェルあたり７０μＬのＦＦ＋ｂＦＧＦ培養液を除き、新しい５種類の分化誘導用培養液（表１２〜１６参照）１００μＬを加えた。
〔２〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で７日間浮遊培養した。
〔３〕１ウェルあたり８０μＬの培養液を除き、新しい５種類の分化誘導用培養液（表１２〜１６参照）１００μＬを加えた後、さらに７日間浮遊培養した。なお、その後、免疫染色法及びOil Red染色法による解析を行うサンプルについては、７日間浮遊培養後、細胞を９６ウェルプレート（TPP社製、92096）に播種し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１日間接着培養した。
【0105】
８−１−３ 接着培養による分化誘導方法〔１〕上記「８−１−１ スフェロイド培養後の継代培養方法」に記載の方法にしたがって調製したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイド（９６ウェルプレート１枚分）を、５０ｍＬチューブに回収した。
〔２〕５分間室温で静置した後、スフェロイドを吸わないようにかつ培養液の残量が１ｍＬ以下になるようにゆっくりと上清（培養液）を除いた。
〔３〕新しい５種類の分化誘導用培養液（表１２〜１６参照）３０ｍＬを加え、６ウェルプレート（TPP社製、92006）に播種し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で７日間接着培養した。なお、９６ウェルプレート１枚から６ウェルプレートで２ウェル分程度を目安とした。
〔４〕培養液の８割相当を新しい培養液と交換し、さらに７日間接着培養した。
【0106】
【表12】
【0107】
【表13】
【0108】
【表14】
【0109】
【表15】
【0110】
【表16】
【0111】
８−１−４ 免疫蛍光染色法上記「８−１−２ 浮遊培養による分化誘導方法」及び「８−１−３ 接着培養による分化誘導方法」に記載の方法にしたがって分化誘導した細胞について、上記「１−１−２ 免疫蛍光染色法」に記載の方法にしたがって３種類の分化マーカータンパク質（βチューブリン３［神経細胞マーカー］、ネスチン［神経細胞マーカー］、及びＡＦＰ［肝細胞マーカー］）の発現を解析した。なお、コントロールとして分化誘導前の細胞（ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイド）を用いた。上記３種類の分化マーカータンパク質の検出に用いた１次抗体及び２次抗体を以下の表１７に示す。
【0112】
【表17】
【0113】
８−１−５ Oil Red染色法〔１〕上記「８−１−２ 浮遊培養による分化誘導方法」及び「８−１−３ 接着培養による分化誘導方法」に記載の方法にしたがって脂肪細胞へ分化誘導した細胞について、ウェルから培養液を除いた。
〔２〕ＰＢＳに１０％（ｖ/ｖ）量のホルマリンを添加し、ｐＨ７．４に調整した後（１０％ホルマリン［和光純薬工業社製］/ＰＢＳ［ｐＨ７．４］)、４℃保管した。
〔３〕イソプロパノール（和光純薬工業社製）に、０．５％（ｖ/ｖ）量のOil red O（和光純薬工業社製）を添加し、スターラーを用いてよく攪拌して０．５％Oil red O/Isopropanol溶液を作製した。
〔４〕培養液が入った状態で２：１の割合になるように冷１０％ホルマリン／ＰＢＳ（２５０μＬ／ウェル程度）を添加し、室温で２０分間インキュベートした。
〔５〕０．５％Oil red O/Isopropanol溶液と蒸留水を３：２の割合で混合し、室温で１０分間インキュベートした。
〔６〕培養液を除き、新たに冷１０％ホルマリン／ＰＢＳを４００μＬ添加し、室温で1時間インキュベートした。
〔７〕ホルマリン溶液を除去し、細胞が剥離しないように気をつけながら２回蒸留水（大塚製薬工場社製）で洗った。ウェル内に残った蒸留水はピペットを用いて除去した。
〔８〕染色後、蒸留水で２回洗った。
〔９〕Olympus IX-70（オリンパス社製）を用いて細胞画像を取得した。
【0114】
８−１−６ ｍＲＮＡの発現解析上記「８−１−２ 浮遊培養による分化誘導方法」及び「８−１−３ 接着培養による分化誘導方法」に記載の方法にしたがって分化誘導した細胞について、上記「３−１−２ ｍＲＮＡの発現解析」に記載の方法にしたがって４種類の分化マーカー遺伝子（Musashi［神経前駆細胞マーカー］、ＭＡＰ２［神経細胞マーカー］、ＧＡＴＡ４［心筋細胞マーカー］、及びＬＰＬ［脂肪細胞マーカー］）のｍＲＮＡの発現解析を行った。なお、コントロールとして分化誘導前の細胞（継代培養前及び継代培養後のｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイド）を用いた。上記５種類の分化マーカー遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット（「Forward Primer」及び「Reverse Primer」）の塩基配列や、その増幅（ＰＣＲ）産物にハイブリダイズするプローブ（「TaqMan Probe」）の塩基配列は、表１８に示す。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物に対する上記５種類の分化マーカー遺伝子のｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の相対量は、図２４、２６Ｂ、及び２７Ｄ、並びに表１９〜２１に示す。
【0115】
【表18】
【0116】
【表19】
【0117】
【表20】
【0118】
【表21】
【0119】
８−２ 結果ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、神経分化誘導法１を用いた浮遊培養による神経細胞（外胚葉由来細胞）への分化誘導処理を行った結果、神経細胞マーカータンパク質（ネスチン）を発現し（図２２Ａ参照）、神経前駆細胞マーカー遺伝子（Musashi）（図２４Ａの「神経分化誘導法１ 浮遊」、表１９参照）及び神経細胞マーカー遺伝子（ＭＡＰ２）（図２４Ｂの「神経分化誘導法１ 浮遊」、表１９参照）のｍＲＮＡを発現する神経細胞（図２２Ｂ参照）へ分化することが示された。また、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、神経分化誘導法２を用いた接着培養による神経細胞への分化誘導処理を行った場合も同様に、神経細胞マーカータンパク質（βチューブリン３）を発現し（図２３Ａ参照）、神経前駆細胞マーカー遺伝子（Musashi）（図２４Ａの「神経分化誘導法２ 接着」参照）及び神経細胞マーカー遺伝子（ＭＡＰ２）（図２４Ｂの「神経分化誘導法２ 接着」参照）のｍＲＮＡを発現する神経細胞（図２３Ｂ参照）へ分化することが示された。
また、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、浮遊培養及び接着培養による肝細胞（内胚葉由来細胞）への分化誘導処理を行った結果、肝細胞マーカータンパク質（ＡＦＰ）を発現する（図２５Ａ参照）肝細胞（図２５Ｃ参照）へ分化することが示された。
また、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、浮遊培養及び接着培養による心筋細胞（中胚葉由来細胞）への分化誘導処理を行った結果、心筋細胞マーカー遺伝子（ＧＡＴＡ４）のｍＲＮＡを発現する（図２６Ｂ、表２０参照）心筋細胞（図２６Ａ参照）へ分化することが示された。
さらに、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドを、浮遊培養及び接着培養による脂肪細胞（中胚葉由来細胞）への分化誘導処理を行った結果、脂肪滴が検出され（図２７Ｂ及びＣ参照）、脂肪細胞マーカー遺伝子（ＬＰＬ）のｍＲＮＡを発現する（図２７Ｄ、表２１参照）脂肪細胞（図２７Ａ参照）へ分化することが示された。
以上の結果は、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドは、３つの胚（外胚葉、内胚葉、中胚葉）由来の細胞へ分化する能力（多分化能）を有する細胞であることを示している。
【0120】
［参考例４］９．接着性成熟細胞のスフェロイドの多分化能の解析
接着性成熟細胞のスフェロイドの多分化能について解析するために、接着性成熟細胞２種（ＮＨＥＫ及びＨＵＶＥＣ細胞）を９６ウェルプレートに播種し、ＭＳＣＢＭ培養液中で７日間スフェロイド培養することにより接着性成熟細胞のスフェロイドを調製し、調製した接着性成熟細胞のスフェロイドをＦＦ＋ｂＦＧＦ培養液中で１週間スフェロイド培養した後、チャンバースライド（TPP社製、92006）で神経分化誘導法１により神経細胞への分化誘導処理を３週間接着培養を行った後、１次抗体（抗ＴＵＪ１抗体［Millipore社製、MAB1637、１００倍希釈］）及び２次抗体（Alexa Fluor 555抗ラビット抗体［Invitrogen社製、A21422、１／１０００倍希釈］）を用い、上記「１−１−２ 免疫蛍光染色法」に記載の方法にしたがって神経細胞マーカー（ＴＵＪ１）の発現解析を行った。その結果、神経細胞への分化誘導処理を行ったＮＨＥＫ及びＨＵＶＥＣ細胞のスフェロイドは、神経細胞マーカータンパク質（ＴＵＪ１）を発現する神経細胞へ分化することが示された（図２８参照）。この結果は、ＮＨＥＫ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞等の接着性成熟細胞のスフェロイドは、少なくとも外胚葉由来の細胞へ分化する能力を有する細胞であることを示している。
【実施例6】
【0121】
１０．ｈＭＳＣ-ＢＭやｈＡＤＳＣ細胞のスフェロイドのテラトーマ形成能の有無の解析ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は無限の増殖能と全能性を有しているため、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を未分化状態で移植するとテラトーマ（奇形腫）が形成されることが知られている（文献「Gropp, et al., PLoS One 7(9):(2012)」参照）。そこで、ｈＭＳＣ-ＢＭやｈＡＤＳＣ細胞のスフェロイドを移植したときに、テラトーマが形成されるかどうか解析を行った。
【0122】
１０−１ 方法上記実施例１記載の方法にしたがって調製したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞（１×１０６細胞）のスフェロイド、及び上記実施例２記載の方法にしたがって調製したｈＡＤＳＣ細胞（１×１０６細胞）のスフェロイドのそれぞれを、０．２ｍＬＰＢＳに懸濁し、メスのマウス（NOD.CB17-Prkdcscid/J）（日本チャールス・リバー社製）の脇腹皮下に注射筒を用いて移植した（それぞれ、「MSC Spheroid群」、及び「ADSC Spheroid群」）。なお、コントロールとして、マウスＥＳ細胞（１×１０６細胞）（Millipore社製、CMSCC050-2A［SCC050］）、接着培養したｈＭＳＣ-ＢＭ細胞（１×１０６細胞）、及び接着培養したｈＡＤＳＣ細胞（１×１０６細胞）のそれぞれを、０．２ｍＬＰＢＳに懸濁し、メスのマウス（NOD.CB17-Prkdcscid/J）（日本チャールス・リバー社製）の脇腹皮下に注射筒を用いて移植した（それぞれ、「Positive Control群」、「MSC Normal群」、及び「ADSC Normal群」）。また、ＰＢＳを移植し、細胞未移植のコントロール実験（Sham群）も行った。移植後、１２週間目にマウスを頚椎脱臼法により安楽致死させ、テラトーマが形成された場合はテラトーマを摘出し、テラトーマが形成されなかった場合には移植部位を摘出した。摘出した組織は、１０％中性緩衝ホルマリン液で浸漬固定し、パラフィン包埋を行った。パラフィン包埋した組織をスライスし、２種類の染色法（ヘマトキシリン・エオジン染色［ＨＥ］法、及びビメンチン染色法）を用いて染色し、電子キャリパーを用いた顕微鏡観察により腫瘍の長径（Ｌ）と短径（Ｗ）を測定した。得られた腫瘍の長径（Ｌ）と短径（Ｗ）の値を、式「腫瘍体積（ｍｍ３）＝Ｌ×Ｗ２×１／２」に入力することにより腫瘍体積を算出した（表２２参照）。
【0123】
１０−２ 結果マウスＥＳ細胞を移植した場合、全ての移植マウス（ｎ＝８）において移植後３週間目でテラトーマが形成されていたのに対し、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドやｈＡＤＳＣ細胞のスフェロイドを移植した場合、テラトーマ形成は認められなかった。また、病理解析の結果、マウスＥＳ細胞を移植して形成されたテラトーマは、全て未分化な神経組織、消化管、筋肉等の３胚葉成分から構成されていた（「Teratoma、immature」）のに対し、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞のスフェロイドやｈＡＤＳＣ細胞のスフェロイドを移植したマウスにおいては、腫瘍、細胞塊等は認められなかった（表２２参照）。なお、ADSC Normal群のAnimal No.27マウス（表２２参照）において腫れが確認されたが、解剖してみると腫瘍形成は認められず、腹膜と脂肪が他のマウスよりも多く検出された。以上の結果から、ｈＭＳＣ-ＢＭ細胞やｈＡＤＳＣ細胞等の間葉系幹細胞のスフェロイドは、腫瘍化リスクが極めて低い細胞であることを示している。
【0124】
【表22】
【産業上の利用可能性】
【0125】
本発明によると、腫瘍化リスクが極めて低い安全性の高い移植用細胞を、安価で且つ簡便に提供することができるため、再生医療の安全性の向上や費用軽減に資する。また、本件調製方法１や本件調製方法２により得られた多能性幹細胞を各組織や細胞へ分化させ、医薬品、化粧品、農薬、食品などの安全性の評価や効力評価、機能評価に利用できる。更に、浮遊培養を血清又は血清代替物を含まないヒトの体内に投与可能な液（医薬品、医療機器など）の単品もしくは混合液からなる生理的水溶液中で行うことにより、培養に用いた生理的水溶液中に移植用細胞を懸濁したままヒトに投与するために必要な生理的水溶液の安全性評価（前臨床試験、臨床試験など）を省略できる。【図1】
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【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]