特許 6353500 ＤＫＫ１抗体およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6353500

(24)【登録日】2018年6月15日

(45)【発行日】2018年7月4日

(54)【発明の名称】ＤＫＫ１抗体およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20180625BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20180625BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20180625BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20180625BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61P19/08

   !C12N15/13

【請求項の数】15

【外国語出願】

【全頁数】94

(21)【出願番号】特願2016-175266(P2016-175266)

(22)【出願日】2016年9月8日

(62)【分割の表示】特願2013-536812(P2013-536812)の分割

【原出願日】2011年10月27日

(65)【公開番号】特開2017-43619(P2017-43619A)

(43)【公開日】2017年3月2日

【審査請求日】2016年9月29日

(31)【優先権主張番号】61/407,128

(32)【優先日】2010年10月27日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウイリアム・グリーソン・リチヤーズ

(72)【発明者】

【氏名】シエン・セン・ルウ

(72)【発明者】

【氏名】ホワ・ジユウ・コー

(72)【発明者】

【氏名】チヤオヤン・リー

(72)【発明者】

【氏名】フレデリツク・ダブリユ・ジエイコブセン

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５０８８８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５２３４２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH，２００９年，Vol.24, No.3，pp.425-436

【文献】 H. Glantschnig et al.，Fully Human anti-DKK1 Antibodies Increase Bone Formation and Resolve Osteopenia in Mouse Models of E，J Bone Miner Res，２００８年，Vol.23 (Suppl 1)，p.S60

【文献】 M. Grisanti et al.，Dkk-1 Inhibition Increases Bone Mineral Density in Rodents.，J Bone Miner Res，２００６年，Vol.21 (Suppl 1)，p.S25

【文献】 GLANTSCHNIG H. et al.，J Biol Chem.，２０１０年１０月 ７日，Vol.285, No.51，pp.40135-40147

【文献】 BLOOD，２００７年，Vol.109, No.5，pp.2106-2111

【文献】 JOURNAL OF ORTHOPAEDIC RESEARCH，２０１０年 ７月，Vol.28，pp.928-936

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ １９／０８

Ｃ１２Ｎ １５／１３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２２３〜２２８のアミノ酸配列を、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１〜３および重鎖ＣＤＲ１〜３として含み、ヒトＤＫＫ１に結合し、ヒトＤＫＫ１活性を阻害する、抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

配列番号９４および９６に示されるアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖可変部および重鎖可変部として含み、ヒトＤＫＫ１に結合する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

配列番号２のアミノ酸２２１〜２３６および／または２４６〜２６２の不連続エピトープに特異的に結合する、請求項１または２に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

エピトープが高次構造的である、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

Ｋｒｅｍｉｎ２のヒトＤＫＫ１への結合を遮断する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項6】

２．５１０Ｅ−０４（１／ｓ）以下のＫｄでヒトＤＫＫ１と結合する、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項7】

患者において骨塩密度を増加させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項8】

１×１０^−７Ｍ未満の親和性を有し、ＤＫＫ１活性を阻害する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体を含む、骨障害を治療するための薬学的組成物。

【請求項9】

骨障害が、骨折である、請求項８に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、薬学的組成物。

【請求項11】

薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体のうちの１つ以上と組み合わされる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項12】

骨折修復を加速させるための薬学的組成物であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＫＫ１抗体またはその抗原結合断片およびスクレロスチン抗体またはその抗原結合断片の組み合わせを含む、薬学的組成物。

【請求項13】

前記ＤＫＫ１抗体またはその抗原結合断片及びスクレロスチン抗体またはその抗原結合断片が、同時に投与される、請求項１２に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

前記ＤＫＫ１抗体またはその抗原結合断片及びスクレロスチン抗体またはその抗原結合断片が、骨折から１日以内に投与される、請求項１３に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

前記ＤＫＫ１抗体またはその抗原結合断片及びスクレロスチン抗体またはその抗原結合断片が、二重特異性または多特異性の成分である、請求項１２に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１０年１０月２７日に出願された米国仮出願第６１／４０７，１２８号の利益を主張し、これは参照によって本明細書に組み込まれる。

【0002】

本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。この配列表は、２０１１年９月２１日に作成された７２．１ｋｂの大きさのＡ−１５７４−ＷＯ−ＰＣＴ＿ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔと題されたファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

本発明は、ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）タンパク質の選択的結合剤、より具体的には、ＤＫＫ１タンパク質への選択的結合を媒介する抗体および抗原結合ドメインおよびＣＤＲ領域に関する。

【背景技術】

【0004】

個人の生涯にわたり、骨量に対して２、３の異なる段階の変化が生じる（Ｒｉｇｇｓ，Ｗｅｓｔ Ｊ．Ｍｅｄ．１５４：６３ ７７（１９９１）を参照）。第１の段階は男性と女性の両方に起こり、ピーク骨量に到達するまで進行する。この第１の段階は、軟骨内の成長板の直線的な成長と、ある速度の骨膜付着による橈骨の成長を通して達成される。第２の段階は、３０歳頃に海綿骨（椎骨および骨盤により一般的に見られる平らな骨）で、そして４０歳頃に皮質骨（例えば、主に肢等の長骨に見られる）で始まり、老齢まで継続する。この段階は、緩徐な骨量減少によって特徴付けられ、男性と女性の両方に起こる。女性では第３の骨量減少段階も生じ、これは閉経後のエストロゲン欠乏に起因する可能性が最も高い。この段階の間だけで、女性は、皮質骨および骨梁内区画からさらなる骨量を失う恐れがある（Ｒｉｇｇｓ、上記を参照）。

【0005】

骨塩量の減少は、多種多様な状態によって引き起こされ得、医学上の重大な問題を生じさせる場合がある。例えば、骨粗鬆症は、ヒトにおける衰弱性疾患であり、骨格の骨量と塩密度の著しい低下、骨微細構造の分解を含めた骨の構造上の劣化、ならびに罹患した個体における骨脆弱性（即ち、骨強度の低下）および骨折しやすさの対応する増大によって特徴付けられる。通常、ヒトにおける骨粗鬆症に先行して、米国における約２５００万人の人々に見られる状態である臨床的な骨減少症（骨塩密度が１標準偏差より大きいが、若年成人の骨の平均値を下回る２．５標準偏差未満である）が起こる。米国ではさらに７００〜８００万人の患者が臨床的な骨粗鬆症であると診断されている（成熟した若年成人の骨の平均値を下回る２．５標準偏差より大きい骨塩密度として定義される）。ヒト集団における骨粗鬆症の頻度は、年齢と共に増大する。白人の間では、骨粗鬆症は、女性に圧倒的に多く、米国においては、骨粗鬆症患者プールの８０％を占める。高齢者における骨格の骨の脆弱性および骨折しやすさの増大は、この集団における偶発的な転倒の危険性がより高いことによって悪化する。骨粗鬆症に伴う最も一般的な損傷には、腰、手首、および椎骨の骨折がある。股関節の骨折は特に、患者にとって極めて厄介であり、費用がかかり、また女性とっては、高い死亡率および罹患率と関連している。

【0006】

骨粗鬆症は、骨量低下による骨折のリスクが増大すると見なされているが、骨格障害のための現在利用可能な治療には成人の骨密度を増大させ得るものがほとんどなく、現在利用可能な治療の大部分は主に、新たな骨形成を刺激するというよりもさらなる骨吸収の阻害に効き目がある。エストロゲンは現在、骨量減少を遅延させるために処方されている。しかしながら、患者に何らかの長期の利点があるか、またエストロゲンが７５歳を超える患者に対して何らかの効果を示すかをめぐるいくつかの論議が存在する。カルシトニン、ビタミンＫを含むオステオカルシン、またはビタミンＤを含むもしくは含まない高用量の食事性カルシウムが閉経後の女性のために提案されている。しかしながら、高用量のカルシウムは望ましくない胃腸の副作用を有することが多く、血清および尿のカルシウム濃度を持続的にモニターしなければならない（例えば、Ｋｈｏｓｌａ ａｎｄ Ｒｉｇｇｓ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７０：９７８９８２，１９９５）。

【0007】

骨粗鬆症への現在の他の治療的アプローチには、ビスホスホネート（例えば、Ｆｏｓａｍａｘ（商標）、Ａｃｔｏｎｅｌ（商標）、Ｂｏｎｖｉｖａ（商標）、Ｚｏｍｅｔａ（商標）、オルパドロネート、ネリドロネート、スケリッド（ｓｋｅｌｉｄ）、ボネフォス）、副甲状腺ホルモン、カルシウム分解物（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃ）、タンパク質同化ステロイド、ランタン塩およびストロンチウム塩、ならびにフッ化ナトリウムが挙げられる。しかしながら、そのような治療薬は、望ましくない副作用を伴うことが多い（Ｋｈｏｓｌａ ａｎｄ Ｒｉｇｇｓ、上記参照）。

【0008】

Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）は、骨発生および骨形成における中心的な役割を担うＷｎｔシグナル伝達経路の負の調節因子であることが分かっている、タンパク質のｄｉｃｋｋｏｐｆファミリーのメンバーである（例えば、Ｇｌｉｎｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：３５７−６２（１９９８）、Ｆｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４（２７）：１９４６５−７２（１９９９）、Ｚｏｒｎ，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：Ｒ５９２−９５（２００１）、およびＫｒｕｐｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２３８：３０１−１３（１９９９）を参照）。ＤＫＫ１は、Ｗｎｔ共受容体ＬＲＰ５またはＬＲＰ６およびクレメン（ｋｒｅｍｅｎ）タンパク質との相互作用を通じてＷｎｔシグナル伝達を阻害する（例えば、Ｂａｆｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：６８３（２００１）、Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１（１７）：３２１（２００１）、Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１７：６６４（２００２）、およびＳｅｍｅｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：９５１−６１（２００１）を参照。ＬＲＰ５（ＬＲＰ６）およびクレメンタンパク質に結合させることによって、ＤＫＫ１は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６がＷｎｔ経路のメンバーと結合することを防いで、Ｗｎｔ媒介シグナル変換を防ぎ、次いで骨形成阻害に至る。

【0009】

ＤＫＫ１受容体ＬＲＰ５／６は、骨質量を調節する上で重要なタンパク質である（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０７：５１３−２３（２００１）、Ｐａｔｅｌ，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３４６（２０）：１５７２（２００２）を参照）。低骨質量によって特徴付けられる常染色体性劣性障害（骨粗鬆症−偽性膠腫症候群、または「ＯＰＰＧ」）は、ＬＲＰ５における機能喪失変異が原因であるものとして確認されている（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１）。さらに、ＬＲＰ５における機能獲得変異により、ヒトにおいて常染色体優性の高骨質量を生じさせることが示されている（Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．７０（１）：１１−１９，２００２）。高骨質量を生じさせるＬＲＰ５における同じ変異は、ＤＫＫ１の能力を妨害してＬＲＰ５シグナル伝達を阻害することができる（例えば、Ｂｏｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ．３４６（２０）：１５１３−１５２１，２００２を参照）。したがって、ＤＫＫ１は、骨沈着の負の調節因子であるとして特徴付けられるのが相応である。

【0010】

骨の過成長および強くて緻密な骨によって示される骨格の疾患である硬結性骨化症では、ＳＯＳＴ遺伝子産物であるスクレロスチンが欠如している（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６８：５７７ ５８９，２００１、Ｂａｌｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０：５３７ ５４３，２００１）。スクレロスチン阻害剤は、骨鉱化の速度を増加させ、ひいては、骨塩密度を増大させることが示されている（Ｐａｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．２０１０ Ｊｕｎ、プリントに先んじて電子公開）。同様に、ＤＫＫ１は、骨形成の調節、特に、骨折修復、ならびに骨量減少と関連する様々な他の疾患（例えば、癌および糖尿病）におけるその役割に関与することが分かっている。

【0011】

現行の治療法の欠点を考慮し、骨粗鬆症等の骨量減少の分野において改善された治療法、ならびに他の骨障害のうちで改善された骨折修復が必要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｒｉｇｇｓ，Ｗｅｓｔ Ｊ．Ｍｅｄ．１５４：６３ ７７（１９９１）

【非特許文献2】Ｋｈｏｓｌａ ａｎｄ Ｒｉｇｇｓ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７０：９７８９８２，１９９５

【非特許文献3】Ｇｌｉｎｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：３５７−６２（１９９８）

【非特許文献4】Ｆｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４（２７）：１９４６５−７２（１９９９）

【非特許文献5】Ｚｏｒｎ，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：Ｒ５９２−９５（２００１）

【非特許文献6】Ｋｒｕｐｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２３８：３０１−１３（１９９９）

【非特許文献7】Ｂａｆｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：６８３（２００１）

【非特許文献8】Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１（１７）：３２１（２００１）

【非特許文献9】Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１７：６６４（２００２）

【非特許文献10】Ｓｅｍｅｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：９５１−６１（２００１）

【非特許文献11】Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０７：５１３−２３（２００１）

【非特許文献12】Ｐａｔｅｌ，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３４６（２０）：１５７２（２００２）

【非特許文献13】Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．７０（１）：１１−１９，２００２

【非特許文献14】Ｂｏｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ．３４６（２０）：１５１３−１５２１，２００２

【非特許文献15】Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６８：５７７ ５８９，２００１、Ｂａｌｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０：５３７ ５４３，２００１

【発明の概要】

【0013】

骨形成の増加を必要とする状態、例えば、多発性骨髄腫等の病的状態と関連する骨折修復または骨量減少を治療するのに効果的な新規のＤＫＫ１阻害剤が、本明細書に提供される。さらに、ＤＫＫ１およびスクレロスチン阻害剤の組み合わせを含む骨同化を増大させる薬剤の組み合わせが、本明細書に提供される。これらの組み合わせは、例えば、骨粗鬆症の治療、骨折治癒の加速、および骨形成速度の増加を必要とする任意の数の状態の治療に使用することができる。組み合わせは、２つの別々の阻害剤、例えば、抗スクレロスチン抗体および抗ＤＫＫ１抗体であり得るか、または単一の分子的実体、例えば、二重特異性抗体を含む二重特異性分子であり得る。

【0014】

また、ＤＫＫ１と結合する様々な抗体も本明細書に提供される。抗ＤＫＫ１剤はまた、ＤＫＫ１とＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６との間の結合を遮断するか、または低下させ、それによって、Ｗｎｔシグナル伝達と関連する少なくとも１つの活性を刺激することもできる。薬剤は、抗体またはその免疫学的に機能的な断片であり得、それ故に、天然の構造を有する抗体、ならびに抗原結合ドメイン（例えば、ドメイン抗体）を有するポリペプチドが含まれる。抗体および断片は、骨量の減少に関連する状態の予防または治療を含む様々な異なる疾患を治療するために、または新しい骨の生成を刺激するために、ならびに様々な非骨関連障害に使用することができる。また、抗体の生成に有用な核酸分子、ベクター、および宿主細胞、ならびに選択的結合剤も提供される。

【0015】

提供される抗体および免疫学的に機能的な断片の一部には、以下の軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ以上を含む：（ｉ）配列番号９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、１６３、１６９、１７５、１８１、１８７、１９３、１９９、２０５、２１１、２１７、または２２３と少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１３９、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００、２０６、２１２、２１８、または２２４と少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４０、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５、２０１、２０７、２１３、２１９、または２２５と少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ ＣＤＲ３。提供される抗体および免疫学的に機能的な断片の一部には、前述のＬＣ ＣＤＲのうちの１つ以上、ならびに／または以下の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ以上が含まれる：（ｉ）配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、２０８、２１４、２２０、または２２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、または２２７と少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ ＣＤＲ２、ならびに（ｉｉｉ）配列番号１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８、２０４、２１０、２１６、２２２、または２２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ ＣＤＲ３。提供される抗体および免疫学的に機能的な断片の一部にはまた、上記の１つ以上のＬＣ ＣＤＲおよび１つ以上のＨＣ ＣＤＲも含まれる。

【0016】

そのような抗体または断片は、ＤＫＫ１ポリペプチドに特異的に結合することができる。ある抗体または断片は、前述のＣＤＲのうちの１個、２個、３個、４個、５個、または６個全てが含まれる。

【0017】

他の抗体または断片の軽鎖および重鎖は、上記に記載される通りであるが、前述の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。またその他の抗体またはその断片は、ＣＤＲ１が、配列番号９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、１６３、１６９、１７５、１８１、１８７、１９３、１９９、２０５、２１１、２１７、もしくは２２３に記載されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が、配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１３９、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００、２０６、２１２、２１８、もしくは２２４に記載されるアミノ酸配列を有する、および／またはＣＤＲ３が、配列番号９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４０、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５、２０１、２０７、２１３、２１９、もしくは２２５に記載されるアミノ酸配列を有する、軽鎖を有するものである。いくつかの抗体および断片はまた、ＣＤＲ１が、配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、２０８、２１４、２２０、もしくは２２６に記載されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が、配列番号１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、もしくは２２７に記載されるアミノ酸配列を有する、および／またはＨＣ ＣＤＲ３が、配列番号１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８、２０４、２１０、２１６、２２２、もしくは２２８に記載されるアミノ酸配列を有する、重鎖も有し得る。ある抗体または断片には、配列番号９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４０、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５、２０１、２０７、２１３、２１９、もしくは２２５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、および／または配列番号１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８、２０４、２１０、２１６、２２２、もしくは２２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３が含まれる。

【0018】

提供されるある他の抗体および免疫学的に機能的な断片には、（ａ）配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、または９４と８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、またはそれ以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、（ｂ）配列番号１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、または９６と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、あるいは（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨが含まれる。

【0019】

その他の抗体または断片は、構造が類似しているが、ＶＬが、配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、もしくは９４と少なくとも９０％、９２％、またはより好ましくは９５％の配列同一性を有し、ＶＨが、配列番号１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、もしくは９６と少なくとも９０％の配列同一性を有する。ある抗体または断片では、ＶＬが、配列番号８４、２８、または３２と少なくとも９８％の配列同一性を有し、ＶＨが、配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、または９４と少なくとも９８％の配列同一性を有する。また他の抗体または断片は、配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、もしくは９４のアミノ酸配列を有するＶＬ、および／または配列番号１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、または９６のアミノ酸配列を有するＶＨを含むものである。

【0020】

いくつかの抗体または断片は、配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、もしくは９４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる軽鎖、および／あるいは配列番号１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、もしくは９６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる重鎖を含む。

【0021】

また、配列番号１に示される配列から発現した成熟ヒトＤＫＫ１タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその免疫学的に機能的な断片も含まれ、当該抗体が、２つのループを含むエピトープに結合し、当該ループは、配列番号２のアミノ酸２２０〜２３７との間および配列番号２のシステイン残基２４５〜２６３との間のジスルフィド結合によって形成される。

【0022】

開示されている他の抗体または断片は、ＤＫＫ１ポリペプチドに対する特異的結合に関して上記のもの等の抗体と競合する。例えば、いくつかの抗体および断片は、２本の同一重鎖および２本の同一軽鎖からなる抗体と競合し、該重鎖は、配列番号４２を含み、当該軽鎖は、配列番号４４を含む。

【0023】

提供される種々の抗体および断片は、単一の軽鎖および／または重鎖あるいは単一の可変軽ドメインおよび／または単一の可変重ドメインを含んでよい。他の抗体および断片は、２本の軽鎖および／または２本の重鎖を含む。抗体または断片が、２本の軽鎖および／または重鎖を含む場合、いくつかの場合において、２本の軽鎖は互いに同一であり、同様にいくつかの場合において、２本の重鎖が同一である。提供される抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体を含んでよい。免疫学的に機能的な断片としては、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）^２、またはドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例において、抗体または断片は、５×１０^−４以下のｋ_ｄ（ｋ_ｏｆｆ）でＤＫＫ１ポリペプチドから解離する。

【0024】

また、前述の抗体および免疫学的に活性な断片のいずれかを含む薬学的組成物も提供される。そのような組成物はまた、典型的には、緩衝剤、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、または保存剤も含む。薬学的組成物または医薬品の調製における前述の抗体および免疫学的に活性な断片の使用もまた提供される。

【0025】

前述の抗体をコードする種々の核酸もまた提供される。いくつかの核酸は、例えば、（ａ）配列番号９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、および／もしくは９３に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ、ならびに／または（ｂ）配列番号１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、および／もしくは９５に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲをコードし、そのため、コードされたＣＤＲが、ＤＫＫ１ポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその免疫学的に機能的な断片をコードする。ある他の核酸は、抗体または免疫学的に活性な断片の可変軽鎖領域（ＶＬ）および／または可変重鎖領域（ＶＨ）をコードする配列を含むか、またはそれからなり、ＶＬは、配列番号９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、または９３と少なくとも８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有し、ＶＨは、配列番号１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、または９５と少なくとも８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。いくつかの核酸は、配列番号９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、もしくは９３を含むか、またはそれからなるＶＬをコードする配列、ならびに／あるいは配列番号１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、もしくは９５を含むか、またはそれからなるＶＨをコードする配列を含む。前述の核酸を含む発現ベクター、またそのような発現ベクターを含む細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）もまた、本明細書に開示されている。そのような発現ベクターを含む細胞を培養することによって抗体またはその免疫学的に活性な断片を生成する方法も記載されている。

【0026】

別の態様では、種々の疾患の治療における前述の結合剤、例えば、抗体またはその免疫学的に機能的な断片または組み合わせの使用が開示されている。ある方法は、例えば、整形外科的処置、歯科的処置、移植外科、関節置換術、骨移植術、ならびに骨折の治癒、癒着不能の治癒、遷延治癒、および顔の形成等の骨美容整形および骨の修復が挙げられるが、これらに限定されない、骨の外傷への、本明細書に記載される有効量の抗体または免疫学的に活性な断片または組み合わせを、それを必要とする患者に投与することを含む。１つ以上の組成物は、処置、置換、移植、外科手術、もしくは修復、または骨損傷と関連する他の疾患の前、その間、および／またはその後に投与され得る。

【0027】

骨量の減少を治療または予防する方法が、本明細書にさらに提供され、本方法には、それを必要とする患者に、本明細書に記載される治療有効量の抗体またはその免疫学的に機能的な断片（例えば、配列番号９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、１６３、１６９、１７５、１８１、１８７、１９３、１９９、２０５、２１１、２１７、もしくは２２３に示されるアミノ酸、または配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１３９、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００、２０６、２１２、２１８、もしくは２２４に示されるアミノ酸、および配列番号９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４０、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５、２０１、２０７、２１３、２１９、もしくは２２５に示されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ、ならびに／または配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、２０８、２１４、２２０、もしくは２２６に示されるアミノ酸、配列番号１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、もしくは２２７に示されるアミノ酸、および配列番号１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８、２０４、２１０、２１６、２２２、もしくは２２８に示されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを含む抗体または免疫学的に機能的な断片）を投与することを含む。本実施形態の一態様では、患者は骨に転移する癌を患っている患者であり、別の態様では、患者は多発性骨髄腫を患っている患者である。また別の態様では、患者は、骨粗鬆症、骨減少症、ページェット病、歯周病、リウマチ性関節炎、および固定化による骨喪失を患っている患者から選択される。また他の実施形態では、患者は、癌と関連する骨粗鬆症または溶骨性病変によって引き起こされるもの（例えば多発性骨髄腫）等の根底にある骨量の減少に起因され得るか、または起因され得ない骨の損傷を有する患者から選択される。そのような骨の損傷の例としては、整形外科的処置、歯科的処置、移植外科、関節置換術（例えば、人工股関節置換手術、膝の代替手術等）、骨移植術、ならびに骨折の治癒、癒着不能の治癒、遷延治癒、および顔の形成等の骨美容整形および骨の修復が挙げられるが、これらに限定されない。１つ以上の組成物は、処置、置換、移植、外科手術、もしくは修復の前、その間、および／またはその後に投与され得る。

【0028】

また他の実施形態では、患者は、癌と関連する骨粗鬆症、溶骨性病変によって引き起こされるもの（例えば多発性骨髄腫）等の状態に起因され得るか、または起因され得ない骨の損傷を有する患者から選択される。

【0029】

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付された図面を参照して明らかになろう。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】ヒトＤＫＫ１抗体のエピトープ部位。トリプシン部位は、実線の矢印で示され、ＡｓｐＮ部位は、点線の矢印で示される。トリプシン部位は、実線の矢印にあり、ＡｓｐＮ部位は、点線の矢印にある。Ａｂ５．２５．１の結合領域は、２つの不連続部分を含み、第１の部分は、アミノ酸９８〜１０４であり、アミノ酸１０７〜１２１および１２７〜１４０の領域である。最後の３つのジスルフィド結合が、全てのトリプシン部位がＡｂ５．２５．１によって保護され得る主要エピトープ領域を形成する。ＡＲＧ１０２はまた、トリプシン消化からも保護される。ＣＮＢｒ処置によるアミノ酸１２１〜１２５位の除去は、結合の欠失を生じない。ＡｓｐＮ消化への耐性として知られている領域は、抗体結合に対してアクセスされなくてもよい。

【図2】パネルＡのレーン１ ＬＲＰ６−Ｈｉｓのみが含まれる；レーン２ ｒｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ；レーン３ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ；レーン４ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５．８０．１；レーン５ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋６．３７．５；レーン６ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋ｒ１１Ｈ１０；レーン７ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５．２５．１；レーン８ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５．７７．１。パネルＢのレーン１ ＬＲＰ６−Ｈｉｓのみが含まれる；レーン２ ｒｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ；レーン３ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ；レーン４ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋０．５μｇ ５．８０．１；レーン５ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５μｇ ５．８０．１；レーン６ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋０．５μｇ ６．３７．５；レーン７ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５μｇ ６．３７．５；レーン８ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋０．５μｇ ｒ１１Ｈ１０；レーン９ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５μｇ ｒ１１Ｈ１０；レーン１０ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５μｇ ５．２５．１；レーン１１ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５μｇ ５．７７．１。

【図3】ビヒクル、ＰＴＨ、および異なる量の抗体２．４０．２について、３週間での脛骨の骨塩密度の変化の割合を示す。２０ｍｇ／ｋｇの用量が、ビヒクルとは有意に異なった。

【図4】５．２５．１ビンからの抗体５．３２．１および１１Ｈ１０ビンからの抗体５．８０．１が、オステオカルシンを増加させる能力についてインビボで試験された。８週齢の雄ＢＤＦ−１マウスに、精製されたモノクローナル抗体の３つの用量（３、１０、または３０ｍｇ／ｋｇ）のうちの１つを２週間にわたって皮下注入した。１群につき６匹のマウスを使用した。陰性対照マウスは、ビヒクル（ＰＢＳ）を注入した。

【図5】マウスは、１週間に２回、３週間、２５ｍｇ／ｋｇのそれぞれの抗体（６．３７．５および６．１１６．６）を皮下注入した。１群につき１０匹のマウスを使用した。対照群は、ビヒクル（１週間に２回）またはＰＴＨ（１００μｇ／ｋｇを１週間に５回）を注入した。データは、腰椎部の骨塩密度における基準からの変化の割合として表される。

【図6】さらなる研究は、閉鎖骨折治癒ラットモデルにおいてラット１１Ｈ１０ビン抗体を用いて行われた。完全ラット１１Ｈ１０ビン抗体ｒ１１Ｈ１０は、本明細書に記載される完全ヒト抗体に対するサロゲート分子として、本研究に使用された。最大負荷およびＢＭＤの改善は、骨折仮骨での抗ＤＫＫ１処置で達成され、これは骨折の治癒の加速を示した。

【図7】疾患の動物モデルから単離された血清中のＤＫＫ１が検出され、ＤＫＫ１タンパク質モデルは、薬理学的薬により腎臓損傷を誘発してから３週間で約５倍増加する。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本明細書で特に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれる。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養物、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学、タンパク質および核酸の化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用する学名は、当該技術分野で周知かつ一般的に使用されるものである。本発明の方法および技法は、一般に、特に指定しない限り、当該技術分野で周知の慣用方法に従って、本明細書全体にわたって引用および記述されている様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照。酵素反応および精製技法は、当該技術分野で一般的に行われるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、および医薬品および薬学的化学に関連して使用する術語、ならびにそれらの実験室の手順および技法は、当該技術分野で周知かつ一般的に使用されるものである。標準的な技法は、化学合成、化学分析、薬学的調製、配合、および送達、ならびに患者の処置に使用することができる。

【0032】

本開示で利用する以下の用語は、特に指定しない限り、以下の意味を有すると理解される。

【0033】

本明細書で使用される「ＤＫＫ１」には、例えば、ラット、マウス、カニクイザル、ヒトのネイティブ型のＤＫＫ１が含まれる。ヒト、マウス、ラット、およびカニクイザルＤＫＫ１タンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号１、３、５、および７に示され、対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２、４、６、および８に示される。ヒトＤＫＫ１タンパク質（配列番号２）は、配列番号２のアミノ酸１〜３１からなるリーダー配列を有する。例示的なラットＤＫＫ１タンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ２１９８０４に記載される。また、この用語には、これらのネイティブタンパク質と免疫学的に交差反応性を有する、そのようなネイティブ配列の変異体も含まれる。これらのタンパク質は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６とＷｎｔとの間の相互作用を阻害することができる。また、この用語は、抗体が特異的に結合することができるエピトープを含有する、ＤＫＫ１のネイティブまたは変異型の断片を指すこともできる。

【0034】

「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のポリマーを意味する。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形態であり得る。当該修飾には、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体等の塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボース等のリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、およびホスホロアミデート等のヌクレオチド間連結修飾が含まれる。この用語には一本鎖および二本鎖の形態の両方が含まれる。

【0035】

「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００個以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０の塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、突然変異遺伝子の構築に使用するために、一本鎖または二本鎖であり得る。

【0036】

「単離された核酸分子」とは、単離されたポリヌクレオチドが天然で見つかるポリヌクレオチドの全体または一部分と会合していない、またはそれが天然で連結していないポリヌクレオチドと連結している、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそのいくつかの組み合わせを意味する。本開示の目的のために、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」には無傷の染色体が包含されないことを理解されるべきである。特定の核酸配列「を含む」単離された核酸分子には、特定の配列に加えて、１０個まで、またはさらには２０個までの他のタンパク質またはその一部分のコード配列が含まれていてもよく、または引用した核酸配列のコード領域の発現を制御する操作によって連結させる調節配列が含まれていてもよく、および／またはベクター配列が含まれていてもよい。

【0037】

特に指定されない限り、本明細書に記述される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向を転写方向と称され、ＲＮＡ転写物の５’末端の５’側であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域を「上流配列」と称され、ＲＮＡ転写物の３’末端の３’側であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域を「下流配列」と称される。

【0038】

「制御配列」という用語は、それらが連結されているコード配列の発現およびプロセシングに影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物の制御配列には、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が含まれ得る。例えば、真核生物の制御配列には、転写因子の１つまたは複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、および転写終結配列が含まれ得る。本発明による「制御配列」には、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含むことができる。

【0039】

「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移すために使用される、任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、またはウイルス）を意味する。

【0040】

「発現ベクター」または「発現構築体」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、それに作動可能に連結した１つ以上の異種コード領域の発現を（宿主細胞と共に）指示および／または制御する核酸配列を含有するベクターを指す。発現構築体としては、転写、翻訳に影響を与えるまたはそれを制御する配列、およびイントロンが存在する場合、それに作動可能に連結したコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を与える配列が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0041】

本明細書で使用される「作動可能に連結した」とは、この用語が適用される構成成分が、それらが適切な条件下でその固有の機能を実行することを可能にする関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列と「作動可能に連結した」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性に適合する条件下で達成されるように、それに連結されている。

【0042】

「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換させた、または形質転換させることができ、それによって対象となる遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語には、対象となる遺伝子が存在する限り、子孫と元の親細胞との形態学または遺伝的構成が同一であるかどうかに関わらず、親細胞の子孫が含まれる。

【0043】

「形質導入」という用語は、１つの細菌から別の細菌への、通常はバクテリオファージによる遺伝子の移行を意味する。また、「形質導入」とは、レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得および移行も指す。

【0044】

「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来または外因性のＤＮＡの取り込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に、細胞は「トランスフェクトされている」。多くのトランスフェクション技法が当該技術分野で周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｉｄ．、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照。そのような技法は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞内に導入するために使用することができる。

【0045】

「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含有するように改変されている場合に、細胞は形質転換されている。例えば、細胞は、トランスフェクション、形質導入、または他の技法を介して新しい遺伝物質を導入することによってそのネイティブ状態から遺伝子改変されている場合に、形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入の後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体内に物理的に組み込まれることによって細胞のそれと組み換えられ得るか、または複製されずにエピソーム要素として一過的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製され得る。細胞は、形質転換ＤＮＡが細胞の分裂に伴って複製される場合に、「安定に形質転換された」と見なされる。

【0046】

「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有する巨大分子、即ち、天然に存在する非組換えの細胞によって産生される、または遺伝子操作されたもしくは組換えの細胞によって産生されるタンパク質を意味し、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、またはネイティブ配列の１つ以上のアミノ酸からの欠失、それへの付加、および／もしくはその置換を有する分子を含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、具体的には、抗ＤＫＫ１抗体、または抗ＤＫＫ１抗体の１つ以上のアミノ酸からの欠失、それへの付加、および／もしくはその置換を有する配列が包含される。「ポリペプチド断片」という用語は、完全長ネイティブタンパク質と比較してアミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失、および／または内部の欠失を有するポリペプチドを指す。また、そのような断片は、ネイティブタンパク質と比較して修飾されたアミノ酸も含有し得る。ある実施形態では、断片は、５〜５００のアミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０のアミノ酸長であり得る。本発明に有用なポリペプチド断片には、結合ドメインを含めた、抗体の免疫学的に機能的な断片が含まれる。抗ＤＫＫ１抗体の場合、有用な断片としては、ＣＤＲ領域、重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部分または２つのＣＤＲを含む単にその可変領域等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0047】

本明細書で言及される「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）それが通常一緒に見つかる、少なくともいくつかの他のタンパク質を含まない、（２）同じ供給源、例えば同じ種からの他のタンパク質を本質的に含まない、（３）異なる種からの細胞によって発現される、（４）少なくとも約５０パーセントのポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または天然で会合している他の物質から分離されている、（５）それが天然で会合していないポリペプチドと作動可能に会合している（共有または非共有的な相互作用による）、または（６）天然に存在しないことを意味する。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは合成起源の他のＲＮＡ、またはその任意の組み合わせがそのような単離されたタンパク質をコードし得る。好ましくは、単離されたタンパク質は、実質的に、その治療的、診断的、予防的、研究用、または他の使用を妨害する可能性のあるタンパク質もしくはポリペプチドまたはその天然環境中で見つかる他の汚染物質を含まない。

【0048】

ポリペプチド（例えば抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列と比較して、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列内に挿入、それから欠失、および／またはそれに置換されているアミノ酸配列を含む。本発明の変異体には、融合タンパク質が含まれる。

【0049】

ポリペプチドの「誘導体」は、挿入、欠失、または置換の変異体とは明確に異なるいくつかの様式で、例えば、別の化学部分との共役によって化学修飾されたポリペプチド（例えば抗体）である。

【0050】

「抗体」という用語は、任意のイソタイプの無傷の免疫グロブリン、またはその断片を指し、標的抗原への特異的結合について無傷の抗体と競合することができ、これはキメラ、ヒト化、完全ヒト、および二重特異性抗体を含む。無傷の抗体は、一般には、少なくとも２つの完全長重鎖および２つの完全長軽鎖を含むが、いくつかの例において、重鎖のみを含み得るラクダ科動物において天然に存在する抗体等の少数の鎖を含み得る。本発明による抗体は、専ら単一の供給源に由来し得るか、または「キメラ」であり得る、即ち、抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来し得る。例えば、ＣＤＲ領域がラットまたはネズミ源に由来し得る一方で、Ｖ領域のフレームワーク領域が、ヒト等の異なる動物源に由来する。本発明の抗体または結合断片は、ハイブリドーマ中、組換えＤＮＡ技法によって、または無傷の抗体の酵素的または化学的切断によって生成され得る。特に指定されない限り、「抗体」という用語には、２本の完全長重鎖および２本の完全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片、および突然変異タンパク質が含まれ、それらの例が以下に記載される。

【0051】

「軽鎖」という用語には、完全長軽鎖および結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有するその断片が含まれる。完全長軽鎖には、可変領域ドメインＶＬ、および定常領域ドメインＣＬが含まれる。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。本発明による軽鎖には、カッパ鎖およびラムダ鎖が含まれる。

【0052】

「重鎖」という用語には、完全長重鎖および結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有するその断片が含まれる。完全長重鎖には、可変領域ドメインＶＨ、ならびに３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３が含まれる。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ＣＨ３が−−ＣＯＯＨ末端に最も近い。本発明による重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブタイプが含まれる）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプが含まれる）、ＩｇＭ、ならびにＩｇＥを含む、任意のイソタイプのものであり得る。

【0053】

本明細書で使用される、免疫グロブリン鎖の「免疫学的に機能的な断片」（または単に「断片」）という用語は、完全長鎖中に存在するアミノ酸のうち少なくとも一部を欠くが、抗原に特異的に結合することができる、抗体の軽鎖または重鎖の一部分を指す。そのような断片は、これらが標的抗原に特異的に結合し、所定のエピトープとの特異的結合について無傷の抗体と競合することができるという点で、生物活性がある。本発明の一態様では、そのような断片は完全長軽鎖または重鎖中に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持しており、いくつかの実施形態では、単一の重鎖および／もしくは軽鎖またはその一部分を含む。これらの生物活性のある断片は、組換えＤＮＡ技法によって生成させ得るか、または無傷の抗体の酵素的または化学的切断によって生成させ得る。本発明の免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体、および一本鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科動物、またはウサギが挙げられるが、これらに限定されない任意の哺乳動物源に由来し得る。さらに、本発明の抗体の機能的部分、例えば、１つ以上のＣＤＲを、第２のタンパク質または低分子と共有結合させて、身体中の特定の標的を対象とする、二機能性治療特性を保有するか、または長期的な血清半減期を有する治療剤を作製できることが企図される。

【0054】

「Ｆａｂ断片」は、１本の軽鎖および１本の重鎖のＣＨ１および可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。

【0055】

「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２本の重鎖断片を含有し、いくつかの例において、低ヒンジ領域を含む。２本の重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合（典型的には、ヒンジ領域にある）およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって一緒に結合される。

【0056】

「Ｆａｂ’断片」は、１本の軽鎖ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含有する１本の重鎖の一部分を含有し、また、２つのＦａｂ’断片の２本の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されて、Ｆ（ａｂ’）_２分子を形成することができるように、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の領域も含有する。

【0057】

「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２本の軽鎖、および２本の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されるようにＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部分を含有する２本の重鎖を含有する。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２本の重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に結合されている２つのＦａｂ’断片からなる。

【0058】

「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。

【0059】

「一本鎖抗体」は、重鎖および軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって接続されて単一のポリペプチド鎖を形成し、これが抗原結合領域を形成する、Ｆｖ分子である。一本鎖抗体は、国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９号および米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号に詳述されている。

【0060】

「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。いくつかの例において、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーによって共有結合されて、二価ドメイン抗体が作製される。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同じまたは異なる抗原を標的とし得る。

【0061】

「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの例において、２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。しかしながら、二価抗体は、二重特異性であってもよい（以下を参照）。

【0062】

「多特異性抗体」は、１つを超える抗原またはエピトープを標的とするものである。

【0063】

「二重特異性」、「デュアル二相特異的」、または「二機能性」の抗体とは、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、多特異性抗体の１種であり、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合等を含むが、これらに限定されない様々な方法によって生成され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ（１９９０），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照。二重特異性抗体の２つの結合部位は、同じまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープと結合する。

【0064】

「中和抗体」という用語は、リガンドと結合する、リガンドとその結合パートナーとの結合を防止する、およびそうでなければその結合パートナーとのリガンド結合の結果生じる生物学的応答を妨げる抗体を指す。抗体またはその免疫学的に機能的な断片の結合および特異性を評価するにあたって、抗体または断片は、過剰量の抗体が、リガンドと結合した結合パートナーの量を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれより多く（インビトロの競合的結合アッセイによって測定）低下させる場合に、リガンドとその結合パートナーとの結合を実質的に阻害する。ＤＫＫ１に対する抗体の場合、中和抗体は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６と結合するＤＫＫ１の能力を消失させ、それによって、Ｗｎｔ活性の測定可能な増加を誘導する。

【0065】

「競合する」という用語は、同一のエピトープについて競合する抗体において使用される場合は、抗体間の競合が、試験下での抗体または免疫学的に機能的な断片が参照抗体と共通抗原（例えばＤＫＫ１またはその断片）との特異的結合を防止または阻害するアッセイによって決定されることを意味する。数々の種類の競合的結合アッセイ、例えば、固相の直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２−２５３を参照）、固相の直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９を参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）、Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５を参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６−５５２を参照）、ならびに直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）を使用することができる。典型的には、そのようなアッセイは、これらのうちのいずれかを保有する固体表面または細胞と結合した精製した抗原、未標識の試験免疫グロブリン、および標識した参照免疫グロブリンの使用を含む。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞と結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験免疫グロブリンは、過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同一のエピトープと結合する抗体、および、参照抗体によって結合されるエピトープに、立体障害が起こるために十分に近位な隣接エピトープと結合する抗体が含まれる。競合結合性を判定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例に提供される。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、これは、参照抗体と共通抗原との特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％阻害する。いくつかの場合において、結合は、抗体等の選択的結合剤によって少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９７％またはそれより多く阻害され、さらにその抗原と結合することができる抗体を産生するために動物に使用することができる。抗原は、異なる抗体と相互作用することができる１つ以上のエピトープを保有し得る。

【0066】

「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意の決定基が含まれる。エピトープは、その抗原を特異的に標的とする抗体によって結合される抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合は、抗体と直接接触する特異的なアミノ酸が含まれる。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、場合によっては、核酸等の他の種類の分子上に存在し得る。エピトープ決定基には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニル基等の、化学活性のある表面の分子の群が含まれる場合があり、特異的な三次元構造的特徴および／または特異的な負荷特徴を有し得る。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複雑な混合物中で標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。

【0067】

本発明の抗体は、解離定数（Ｋ_ｄ）が１×１０^−７Ｍである場合にその標的抗原「に特異的に結合する」と言われる。抗体は、Ｋｄが１×１０^−８であるとき、「高親和性」を持つ抗原に特異的に結合し、より高い親和性は、Ｍ ５×１０^−９Ｍであり、Ｋｄが５×１０^−１０Ｍであるとき、「非常に高い親和性」を持つ。本発明の一実施形態では、抗体は、１×１０^−９ＭのＫｄおよび約１×１０^−４／秒のオフ速度を有する。本発明の一実施形態では、オフ速度は、＜１×１０^−５である。本発明の他の実施形態では、抗体は、約１×１０^−８Ｍ〜１×１０^−１０ＭのＫｄでヒトＤＫＫ１と結合し、また別の実施形態では、抗体は、２×１０^−１０のＫｄで結合する。当業者は、特異的結合が排他的結合を意味せず、むしろ、互いに親和性のある群間での生物学的反応において一般的であるような、ある程度の非特異的結合を許容することを認識されよう。

【0068】

「同一性」という用語は、配列のアラインメントおよび比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「パーセント同一性」とは、比較した分子中のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較した分子の最小のものの大きさに基づいて計算される。これらの計算には、アラインメント中のギャップ（存在する場合）を特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（即ち、「アルゴリズム」）によって対処しなければならない。アラインメントした核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されているものが含まれる。

【0069】

パーセント同一性を計算する際、比較される配列は、配列間の最大の一致を与える方法でアラインメントされる。パーセント同一性を決定するために使用されるコンピュータプログラムは、ＧＡＰが含まれるＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １２：３８７、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰを用いて、パーセント配列同一性を決定する２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアラインメントする。配列は、そのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致についてアラインメントされる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップ開きペナルティ（これは平均対角の３倍として計算され、「平均対角」とは、使用される比較マトリックスの対角の平均であり、「対角」とは、特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全なアミノ酸一致に割り当てられたスコアまたは数値である）およびギャップ伸長ペナルティ（これは、通常はギャップ開きペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２等の比較マトリックスがアルゴリズムと併せて使用される。ある実施形態では、標準の比較マトリックス（Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５−３５２ ｆｏｒ ｔｈｅ ＰＡＭ ２５０ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９ ｆｏｒ ｔｈｅ ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘを参照）もアルゴリズムによって使用される。

【0070】

ＧＡＰプログラムを用いてポリペプチドまたはヌクレオチド配列のパーセント同一性を決定するための推奨されるパラメータは、以下の通りである。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３、
比較マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｆｒｏｍ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，上記参照、
ギャップペナルティ：１２（但し、末端ギャップにはペナルティを用いない）
ギャップ長ペナルティ：４
類似度の閾値：０

【0071】

２つのアミノ酸配列をアラインメントするためのあるアラインメントスキームでは、２つの配列の短い領域のみの一致しかもたらさない場合があり、この小さなアラインメントされた領域は、２つの完全長配列間には有意な関係が存在しないにも関わらず、非常に高い配列同一性を有する場合がある。したがって、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、所望する場合は、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続的なアミノ酸にまたがるアラインメントをもたらすように調整することができる。

【0072】

本明細書で使用される「実質的に純粋な」とは、記載された分子種が存在する優勢の種である、即ち、モル濃度に基づいて、これが同じ混合物中の任意の他の個々の種よりも豊富であることを意味する。ある実施形態では、実質的に純粋な分子とは、目的の種が、存在する全ての高分子種の少なくとも５０％（モル濃度に基づいて）を構成する組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を構成する。他の実施形態では、汚染種が慣用の検出方法によって組成物中に検出され得ず、したがって、組成物は単一の検出可能な高分子種からなるように、目的の種を本質的に均質となるまで精製する。

【0073】

「骨減少症」という用語は、正常な骨塩密度（ＢＭＤ）を有すると見なされる標準の患者と比較して、少なくとも１標準偏差の骨減少を有する患者を指す。この目的のために、測定値は二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡ）によって決定され、患者のＢＭＤは、年齢および性別が一致した標準（Ｚスコア）と比較される。骨減少症を決定する際、ＢＭＤの測定値は、１つ以上の骨から採り得る。

【0074】

「治療有効量」という用語は、哺乳動物において治療反応を生じると決定された抗ＤＫＫ１抗体の量を指す。そのような治療有効量は、当業者によって容易に確認される。

【0075】

「アミノ酸」には、当該技術分野におけるその通常の意味が含まれる。２０種の天然に存在するアミノ酸およびその略記は慣用の用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，ｅｄｓ．），Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１）を参照。また、２０種の慣用のアミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、α−，α−二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の慣用でないアミノ酸も、本発明のポリペプチドの適切な構成成分であり得る。慣用でないアミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、イプシロン−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、イプシロン−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、シグマ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で使用されるポリペプチドの表記法では、標準の用法および慣習に従って、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向がカルボキシル末端方向である。

【0076】

本発明は、ＤＫＫ１（例えば、配列番号２のアミノ酸３２〜２６６からなるポリペプチド）に特異的な免疫グロブリンの抗体および抗原結合部位を含む新規の組成物を提供する。これらの抗体および抗体断片の一部は、ラット、マウス、カニクイザル、およびヒトのＤＫＫ１を含むいくつかの哺乳動物源からのＤＫＫ１と交差反応することができる。抗体および断片の一部は、１つの種からのＤＫＫ１に対して別の種よりも高い親和性を有する（例えば、ある抗体および断片は、ラットまたはマウスのＤＫＫ１と比較してヒトのＤＫＫ１に対してより高い親和性を有する、その他の抗体は、ヒトのＤＫＫ１と比較してラットまたはマウスのＤＫＫ１に対してより高い親和性を有する）。本発明はまた、キメラ、ヒト化、およびヒト抗体、ならびにヒトＤＫＫ１において立体構造エピトープと結合する抗体およびその免疫学的に機能的な断片を含む新規の中和抗体も提供する。また、抗体および断片をコードする核酸、ならびにこれらの核酸を用いて抗体を発現させるための方法も開示される。別の態様では、本発明は、抗体抗原結合部位の免疫学的結合特性を示すことができる分子（例えば免疫学的に機能的な断片およびポリペプチド）に関する。

【0077】

本明細書に開示されている抗体および免疫学的に機能的な断片は、様々な利用性を有する。例えば、抗体および断片の一部は、特異的結合アッセイ、ＤＫＫ１またはそのリガンドの親和性精製、およびＤＫＫ１活性の他のアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイに有用である。ある種の抗体を、ＤＫＫ１の活性と関連する様々な疾患を処置するために使用することができる。したがって、いくつかの抗体および断片は、骨塩密度の増加、新しい骨の合成、全身性骨減少（例えば骨侵食）の処置、骨修復、および様々な形態の関節炎の処置等の骨に関連する様々な処置に使用することができる。いくつかの抗体はまた、破骨細胞活性を増加し、骨吸収を誘発するために使用することもできる。しかしながら、開示されているある種の抗体および断片は、骨疾患に関連しない様々な多様な疾患を処置するために使用することができる。以下にさらに詳述されるように、そのような疾患の例には、幹細胞再生を促進することが望ましい疾患（例えば、糖尿病および筋肉の疾患）、炎症性疾患（例えば、クローン病および炎症性腸疾患）、神経系の疾患、眼疾患、腎疾患、および様々な皮膚疾患が含まれる。

【0078】

ＤＫＫ１の活性を調節するために有用な様々な選択的結合剤が提供される。これらの薬剤には、例えば、抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖抗体、ドメイン抗体、免疫粘着、および抗原結合領域を有するポリペプチド）を含有し、ＤＫＫ１ポリペプチド（例えば、ヒト、ラット、および／またはマウスのＤＫＫ１ポリペプチド）に特異的に結合する、抗体およびその免疫学的に機能的な断片が含まれる。薬剤の一部は、例えば、ＤＫＫ１のＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６への結合を阻害するのに有用であり、したがって、Ｗｎｔシグナル伝達と関連する１つ以上の活性を刺激するために使用することができる。

【0079】

提供される結合剤の一部は、典型的には天然に存在する抗体と関連する構造を有する。これらの抗体の構造単位は、典型的にはそれぞれが２本の同一のポリペプチド鎖のカプレットからなる１つ以上の四量体を含むが、哺乳動物の一部の種は単一の重鎖のみを有する抗体も産生する。典型的な抗体では、それぞれの対またはカプレットには１本の完全長「軽」鎖（ある実施形態では、約２５ｋＤａ）および１本の完全長「重」鎖（ある実施形態では、約５０〜７０ｋＤａ）が含まれる。それぞれの個々の免疫グロブリン鎖は、それぞれが約９０〜１１０個のアミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを発現する、いくつかの「免疫グロブリンドメイン」からなる。これらのドメインが、抗体ポリペプチドが構成される基本単位である。それぞれの鎖のアミノ末端部分には、典型的には、抗原認識を司っている可変ドメインが含まれる。カルボキシ末端部分は、鎖の他方の末端よりも進化的に保存されており、「定常領域」または「Ｃ領域」と称される。ヒト軽鎖は、一般にカッパおよびラムダ軽鎖として分類され、これらのそれぞれが１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインを含有する。重鎖は、典型的にはミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロン鎖として分類され、これらにより、抗体のイソタイプがそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義される。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が含まれるが、これらに限定されない、いくつかのサブタイプを有する。ＩｇＭサブタイプには、ＩｇＭおよびＩｇＭ２が含まれる。ＩｇＡサブタイプには、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２が含まれる。ヒトでは、ＩｇＡおよびＩｇＤイソタイプは、４本の重鎖および４本の軽鎖を含有し、ＩｇＧおよびＩｇＥイソタイプは、２本の重鎖および２本の軽鎖を含有し、ＩｇＭイソタイプは、５本の重鎖および５本の軽鎖を含有する。重鎖Ｃ領域は、典型的には、エフェクター機能を司っている可能性がある１つ以上のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数は、イソタイプに依存する。例えば、ＩｇＧ重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインをそれぞれ含有する。提供される抗体は、これらのイソタイプおよびサブタイプのうちのいずれかを有することができる。本発明のある実施形態では、抗ＤＫＫ１抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のサブタイプからなる。

【0080】

完全長軽鎖および重鎖では、可変および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖には、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含まれる。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．）１９８９，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓを参照。それぞれの軽鎖／重鎖の対の可変領域は、典型的には抗原結合部位を形成する。

【0081】

免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般に同じ全体的な構造を示し、３つの超可変領域、より頻繁には「相補性決定領域」またはＣＤＲと称される領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。上述のそれぞれの重鎖／軽鎖の対の２本の鎖からのＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によってアラインメントされて、標的タンパク質上の特異的エピトープ（例えばＤＫＫ１）に特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端に、天然に存在する軽鎖および重鎖可変領域は両方とも、これらの要素の以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４と一致する。これらのドメインのそれぞれ中の位置を占有するアミノ酸に数字を割り当てるために、付番システムが考案されている。この付番システムは、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７ ａｎｄ １９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３に定義されている。

【0082】

ヒト（配列番号１および２）、マウス（配列番号３および４）、ラット（配列番号５および６）、ならびにカニクイザル（配列番号７および８）の核酸およびタンパク質のＤＫＫ１配列が、それぞれ、表１に提供される。また、抗体の軽鎖および重鎖の特定の例、ならびにその対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列も本明細書に提供される。最も左の列に配列識別子、中央に配列（核酸またはタンパク質）、および最も右の列に配列の内部表示が提供される。さらに、それぞれのＣＤＲが提供される（配列番号９７〜２２８）。Ｖｈ＝可変重鎖、Ｖｋ＝可変カッパ軽鎖、Ｖｌ＝可変ラムダ軽鎖。

【表1】

【0083】

当業者は、定常領域をさらに含む、完全長抗体の配列と比較して重鎖および軽鎖の両方の可変領域を包含する表１に示される配列間の違いを理解されよう。可変ドメインは、当該技術分野で公知の標準技術を用いて適切な定常ドメインと組み合わせることができる。表１中に記載される軽鎖のそれぞれは、表１に示される重鎖のいずれか（例えば、配列番号２４２または２４４に示されるポリペプチド）と組み合わせて、抗体を形成することができる。いくつかの例において、抗体は、表１中に記載されるものから少なくとも１本の重鎖および１本の軽鎖を含む。他の例では、抗体は、２本の同一の軽鎖および２本の同一の重鎖を含有する。一例として、抗体または免疫学的に機能的な断片は、２本のＬ１軽鎖および２本のＨ１重鎖、または２本のＬ２軽鎖および２本のＨ３重鎖、または２本のＬ２軽鎖および２本のＨ４重鎖、または２本のＬ２および２本のＨ５重鎖、ならびに表１中に記載される軽鎖の対および重鎖の対の他の同様の組み合わせを含んでもよい。

【0084】

提供される他の抗体は、表１に示される重鎖および軽鎖の組み合わせによって形成される抗体の変異体であり、これらの鎖のアミノ酸配列に対してそれぞれ、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を有する軽鎖および／または重鎖を含む。いくつかの例において、そのような抗体は、少なくとも１本の重鎖および１本の軽鎖を含む一方で、他の例では、そのような変異型は、２本の同一の軽鎖および２本の同一の重鎖を含有する。

【0085】

ある抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸残基のみで本明細書に記載される軽鎖可変ドメインの配列とは異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、それぞれのそのような配列の違いは、独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入、または置換のいずれかである。いくつかの抗体において、軽鎖可変領域は、表１中の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。

【0086】

提供されるいくつかの抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸残基のみで表１中の重鎖可変ドメインの配列とは異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ドメインを含む重鎖可変ドメインを含み、それぞれのそのような配列の違いは、独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入、または置換のいずれかである。いくつかの抗体において、重鎖可変領域は、表１に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。また他の抗体または免疫学的に機能的な断片には、ちょうど記載されるような、変異軽鎖および変異重鎖の変異型が含まれる。

【0087】

所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔらによって、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１−３２４２，１９９１に記載されるシステムを用いて同定され得る。

【0088】

提供される抗体および免疫学的に機能的な断片は、上述のＣＤＲのうちの１個、２個、３個、４個、５個、または６個全てが含まれていてもよい。いくつかの抗体または断片には、軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３の両方が含まれる。ある抗体は、ＣＤＲの変異型を有し、ＣＤＲのうちの１個以上（即ち、２個、３個、４個、５個、または６個）が、ＣＤＲ配列に対してそれぞれ少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。例えば、抗体または断片は、軽鎖ＣＤＲ３配列および重鎖ＣＤＲ３配列に対してそれぞれ少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性をそれぞれ有する軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３の両方を含むことができる。提供される抗体の一部のＣＤＲ配列はまた、任意の所与のＣＤＲに対するアミノ酸配列が、たった１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸残基によって、表１中のＣＤＲ配列とは異なり得る。列挙された配列の違いは、通常、保存的置換である（下記参照）。

【0089】

軽鎖または重鎖ＣＤＲのうちの１つ以上を含むポリペプチドは、以下のさらに詳述される適切な宿主細胞中にポリペプチドを発現させるために好適なベクターを用いることによって産生され得る。重鎖および軽鎖可変領域ならびに表１中に開示されているＣＤＲは、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、およびｓｃＦｖが含まれるが、これらに限定されない、当該技術分野で知られている様々な種類の免疫学的に機能的な断片のいずれかを調製するために使用することができる。

【0090】

抗体が、ＤＫＫ１等の特定の残基内のエピトープと結合すると言われるとき、例えば、意味することは、抗体が特定の残基（例えば、ＤＫＫ１の特定のセグメント）からなるポリペプチドに特異的に結合することである。そのような抗体は、必ずしもＤＫＫ１内の全ての残基と接触するわけではない。ＤＫＫ１内の全ての単一のアミノ酸置換または欠失が、必ずしも結合親和性に有意な影響を及ぼすわけではない。抗体の厳密なエピトープ特異性は、様々な方法で測定され得る。例えば、１つのアプローチは、ＤＫＫ１の配列をスパニングし、少数のアミノ酸（例えば３個のアミノ酸）単位で異なる約１５個のアミノ酸の重複するペプチドの集合を試験することを含む。ペプチドは、マイクロタイター皿のウェル内で固定化される。固定化は、ペプチドの片方の末端をビオチン化することによって達成され得る。任意に、同じペプチドの異なる試料は、ＮおよびＣ末端でビオチン化され、比較のために、別々のウェル中に固定化され得る。これは、末端特異抗体を確認するために有用である。任意に、さらなるペプチドは、対象となる特定のアミノ酸で終了することが含まれ得る。このアプローチは、ＤＫＫ１の内部断片に対して末端特異抗体を確認するために有用である。抗体または免疫学的に機能的な断片は、様々なペプチドのそれぞれに対する特異的結合についてスクリーニングされる。エピトープは、抗体が特異的結合を示す全てのペプチドに共通しているアミノ酸のセグメントで生じるものとして確定される。

【0091】

ＤＫＫ１（表１を参照）のカルボキシ末端部分に位置する立体構造エピトープと結合する抗体およびその機能的な断片も提供される。ＤＫＫ１のカルボキシ末端は、いくつかのループを創製するジスルフィド結合のクラスターを形成するいくつかのシステイン残基を含有する。本発明は、これらのループのうちの２つと結合し、それによってＤＫＫ１の能力を中和し、Ｗｎｔ活性を抑制する抗体を提供する。前述の立体構造エピトープと結合することができる例示的な抗体は、モノクローナル抗体１１Ｈ１０および１Ｆ１１であり、これらのそれぞれは、軽鎖および重鎖を含む。これらの抗体は、米国特許第７，７０９，６１１号に詳述されている。

【0092】

これらの２つのループを含むエピトープは、配列番号２のシステイン残基２２０と２３７との間および配列番号２のシステイン残基２４５と２６３との間のジスルフィド結合によって形成される。したがって、エピトープを形成する２つのループの本体は、配列番号２のアミノ酸２２１〜２３６および２４６〜２６２を含む。結合に関与するこのループ内のセグメントは、配列番号２のアミノ酸２２１〜２２９および配列番号２のアミノ酸２４６〜２５３を含む。したがって、本明細書に提供されるある抗体および断片は、前述の領域に特異的に結合する。抗体および断片の一部は、例えば、配列番号２のアミノ酸２２１〜２６２を含むか、またはそれらからなるペプチドと結合する。

【0093】

本発明の一態様では、配列番号２のアミノ酸２２１〜２２９および／または２４６〜２５３を含むか、またはそれらからなるペプチドが提供される。他のペプチドは、配列番号２のアミノ酸２２１〜２３６および／または２４６〜２６２を含むか、またはそれらからなる。提供されるさらに他のペプチドは、配列番号２の２２１〜２６２の領域または配列番号２のアミノ酸２２１〜２５３の領域を含むか、またはそれらからなる。そのようなペプチドは、ネイティブＤＫＫ１の完全長タンパク質配列よりも短い（例えば、ペプチドは、前述の領域の１つ以上を含み得、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、または２００のアミノ酸長であり得る）。これらのペプチドは、免疫原性を増加させるために別のペプチドに融合させることができ、したがって、融合タンパク質の形態であり得る。

【0094】

また、ＤＫＫ１に対する特異的結合に関して例示の抗体または機能的な断片の１つと競合する抗体およびその免疫学的に機能的な断片も提供される。そのような抗体および断片はまた、例示の抗体の１つと同じエピトープと結合し得る。例示の抗体または断片と同じエピトープと競合するか、または結合する抗体および断片は、同様な機能的特性を示すと思われる。例示の抗体および断片としては、表１中に記載される重鎖および軽鎖、可変領域ドメイン、ならびにＣＤＲを有するものを含む、上記のものが挙げられる。競合抗体または免疫学的に機能的な断片には、上記の抗体およびエピトープの項に記載されるエピトープと結合するものを挙げることができる。

【0095】

特定の例として、いくつかの競合抗体または断片としては、配列番号２のアミノ酸３２〜２６６からなるＤＫＫ１タンパク質に特異的に結合し、２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖からなる抗体のヒトＤＫＫ１に対する結合を防止または減少させることができるものが挙げられる。他の競合抗体は、表１中に記載されるもの等の２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖からなる抗体のヒトＤＫＫ１に対する結合を防止または減少させる。

【0096】

提供される抗体には、ＤＫＫ１と結合するモノクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて、例えば、免疫化スケジュール完了後、形質転換動物から採取した脾臓細胞の固定化によって製造することができる。脾臓細胞は、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて、例えば、それらを骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを製造することによって不死化することができる。ハイブリドーマ製造融合法に用いられる骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、融合効率が高く、酵素が欠失しているために、ある選択培地中で増殖する能力がなく、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する。マウスの融合に用いられる好適な細胞株の例としては、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７、およびＳ１９４／５ＸＸＯ Ｂｕｌが挙げられ、ラット融合に用いられる細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、および４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、およびＵＣ７２９−６である。

【0097】

いくつかの例において、ハイブリドーマ細胞株は、ＤＫＫ１免疫原によって動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有する形質転換動物）を免疫化し；免疫化した動物から脾臓細胞を採取し；採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合し、それによって、ハイブリドーマ細胞を作製し；ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を構築し、ＤＫＫ１ポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによって生産される。このようなハイブリドーマ細胞株、およびそれらによって作製された抗ＤＫＫ１モノクローナル抗体は、本発明に包含される。

【0098】

ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、当該抗体技術分野で公知の任意の技術を用いて精製することができる。ハイブリドーマまたはｍＡｂは、Ｗｎｔ誘導活性を阻止する能力等の特定の特性を有するｍＡｂを同定するために、さらにスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニングの例は、以下の実施例に提供される。

【0099】

また、前述の配列に基づいたキメラ抗体およびヒト化抗体も提供される。治療剤に用いられるモノクローナル抗体は、使用前に、様々な方法において修飾され得る。一例は、機能的な免疫グロブリンの軽鎖もしくは重鎖またはその免疫学的に機能的な部分を作製するために共有結合させた異なる抗体のタンパク質セグメントからなる抗体である「キメラ」抗体である。一般に、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属しており、一方、その鎖の残部は、別の種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるか、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属している。キメラ抗体に関する方法については、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８５）を参照のこと。ＣＤＲグラフティングは、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号、および第５，５３０，１０１号を参照のこと。

【0100】

一般に、キメラ抗体を作製する目的は、意図された親種のアミノ酸数が最大化されているキメラを創製することである。一例は、抗体が、特定の種の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属しており、一方、その抗体鎖の残部が、別の種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるか、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属している「ＣＤＲグラフト」抗体である。ヒトにおける使用では、齧歯類抗体のＶ領域または選択されたＣＤＲが、ヒト抗体にグラフトされて、ヒト抗体の天然に存在するＶ領域またはＣＤＲと置き換わることが多い。

【0101】

キメラ抗体の１つの有用なタイプは、「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、最初、非ヒト動物において増加させたモノクローナル抗体から製造される。このモノクローナル抗体の非抗原認識部分に典型的に由来する該抗体におけるあるアミノ酸残基は、対応するイソタイプのヒト抗体において対応する残基と相同であるように修飾される。ヒト化は、例えば、齧歯類の可変領域の少なくとも一部を、ヒト抗体の対応する領域と置換することにより、様々な方法を用いて実施することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−３６を参照）。ある実施形態では、ヒト以外の種の定常領域をヒト可変領域と共に使用して、ハイブリッド抗体を製造することができる。

【0102】

また、完全ヒト抗体も提供される。ヒトを抗原に曝露させることなく、所与の抗原に特異的な完全ヒト抗体（「完全ヒト抗体」）を作製するための方法が利用できる。完全ヒト抗体の産生を実施する１つの手段は、マウスの体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子を不活化したマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）座を導入することは、任意の所望の抗原によって免疫化することができる動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生する１つの手段である。完全ヒト抗体の使用により、マウスまたはマウス誘導Ｍａｂを治療薬としてヒトに投与することによって時折生じ得る免疫原性およびアレルギー性応答を最小限に抑えることができる。

【0103】

完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生の不在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生することができる形質転換動物（通常はマウス）の免疫化によって産生できる。この目的のための抗原は、典型的に、６つ以上の連続アミノ酸を有し、任意に、ハプテン等の担体に共役させる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１−２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８、およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照のこと。そのような方法の一例では、形質転換動物は、その中のマウスの重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を不能化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含有するヒトゲノムＤＮＡの大型フラグメントを、マウスゲノムに挿入することによって産生される。次いで、ヒト免疫グロブリン座の完全相補体未満を有する部分的に修飾された動物を交雑育種し、所望の免疫系修飾を全て有する動物を得る。免疫原を投与するとき、これらの形質転換動物は、その免疫原に免疫特異的ではあるが、可変領域を含む、マウスのアミノ酸配列ではなく、ヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。そのような方法のさらなる詳細に関しては、例えば、国際公開第ＷＯ９６／３３７３５号および第ＷＯ９４／０２６０２号を参照のこと。ヒト抗体を作製するためのトランスジニックマウスに関するさらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、第６，７１３，６１０号、第６，６７３，９８６号、第６，１６２，９６３号、第５，５４５，８０７号、第６，３００，１２９号、第６，２５５，４５８号、第５，８７７，３９７号、第５，８７４，２９９号、および第５，５４５，８０６号に、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１０７４１号、第ＷＯ９０／０４０３６号に、欧州特許第ＥＰ５４６０７３Ｂ１号および第ＥＰ５４６０７３Ａ１号に記載されている。

【0104】

本明細書に「ＨｕＭａｂ」マウスと称される上記の形質転換マウスは、内因性のμおよびκ鎖座を不活化する標的突然変異と共に、再配列していないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子の小型遺伝子座を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９）。

【0105】

したがって、前述のマウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現減少を示し、免疫化に応答し、導入されたヒトの重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラス転換および体細胞の突然変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧ κモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，上記参照、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３、Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：６２８７−６２９５、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９、Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、Ｈａｒｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１に詳述されている。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，７８９，６５０号、第５，８７７，３９７号、第５，６６１，０１６号、第５，８１４，３１８号、第５，８７４，２９９号、および第５，７７０，４２９号、ならびに米国特許第５，５４５，８０７号、国際公開第ＷＯ９３／１２２７号、第ＷＯ９２／２２６４６号、および第ＷＯ９２／０３９１８号を参照のこと。これらの形質転換マウスにおいてヒト抗体を産生するために利用される技術は、国際公開第ＷＯ９８／２４８９３号、およびＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６にも開示されている。例えば、ＨＣＯ７およびＨＣＯ１２形質転換マウス株を用いて、ヒト抗ＤＫＫ１抗体を作出することができる。

【0106】

ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトＭＡｂを産生し、上記のもの等の形質転換マウスから選択することができる。そのような抗体をクローン化し、好適なベクターおよび宿主細胞を用いて発現させることができるか、または培養したハイブリドーマ細胞から抗体を採取することができる。

【0107】

完全ヒト抗体はまた、ファージ表示ライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１、およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１に開示されている）に由来し得る。ファージ表示法は、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーの表示による免疫選択、および引き続いて、選択抗原に対するそれらの結合によるファージの選択を模倣している。このような方法の１つが、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１０４９４号に記載されており、これには、そのようなアプローチを用いてＭＰＬおよびｍｓｋ受容体に対する高親和性で機能的なアゴニスト抗体の単離が記載されている。

【0108】

本明細書に提供される抗ＤＫＫ１剤はまた、ＤＫＫ１とＬＲＰ５および／もしくはＬＲＰ６との間の結合を遮断するか、または低下させ、それによって、Ｗｎｔシグナル伝達と関連する少なくとも１つの活性を刺激することもできる。薬剤は、抗体またはその免疫学的に機能的な断片であり得、それ故に、天然の構造を有する抗体、ならびに抗原結合ドメイン（例えば、ドメイン抗体）を有するポリペプチドが含まれる。抗体および断片は、骨量の減少に関連する状態を予防または治療することを含む様々な異なる疾患を治療する、または新しい骨の生成を刺激する、ならびに非骨関連障害を治療するために使用することができる。また、抗体および選択的結合剤の生成に有用な核酸分子、ベクター、および宿主細胞も提供される。

【0109】

提供される抗体および免疫学的に機能的な断片の一部は、以下の軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）：（ｉ）配列番号９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、１６３、１６９、１７５、１８１、１８７、１９３、１９９、２０５、２１１、２１７、または２２３と少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１３９、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００、２０６、２１２、２１８、または２２４と少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４０、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５、２０１、２０７、２１３、２１９、または２２５と少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ ＣＤＲ３のうちの１つ以上を含む。提供される抗体および免疫学的に機能的な断片の一部は、前述のＬＣ ＣＤＲのうちの１つ以上、ならびに／または以下の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）：（ｉ）配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、２０８、２１４、２２０、または２２６と少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、または２２７と少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ ＣＤＲ２、ならびに（ｉｉｉ）配列番号１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８、２０４、２１０、２１６、２２２、または２２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ ＣＤＲ３のうちの１つ以上が含まれる。提供される抗体および免疫学的に機能的な断片の一部にはまた、上記の１つ以上のＬＣ ＣＤＲおよび１つ以上のＨＣ ＣＤＲも含まれる。

【0110】

そのような抗体または断片は、ＤＫＫ１ポリペプチドに特異的に結合することができる。ある抗体または断片は、前述のＣＤＲのうちの１個、２個、３個、４個、５個、または６個全てが含まれる。

【0111】

他の抗体または断片の軽鎖および重鎖は、上記に記載される通りであるが、前述の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。またその他の抗体またはその断片は、ＣＤＲ１が、配列番号９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、１６３、１６９、１７５、１８１、１８７、１９３、１９９、２０５、２１１、２１７、または２２３に記載されるアミノ酸配列を有するものであり、ＣＤＲ２が、配列番号９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１３９、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００、２０６、２１２、２１８、または２２４に記載されるアミノ酸配列を有する、および／またはＣＤＲ３が、配列番号９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４０、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５、２０１、２０７、２１３、２１９、または２２５に記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの抗体および断片はまた、ＣＤＲ１が、配列番号１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６、２０２、２０８、２１４、２２０、または２２６に記載されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が、配列番号１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７、２０３、２０９、２１５、２２１、または２２７に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖を有し得る、および／またはＨＣ ＣＤＲ３が、配列番号１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８、２０４、２１０、２１６、２２２、または２２８に記載されるアミノ酸配列を有する。ある抗体または断片には、配列番号９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４０、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５、２０１、２０７、２１３、２１９、または２２５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３および／または配列番号１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８、２０４、２１０、２１６、２２２、または２２８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３が含まれる。

【0112】

提供されるある他の抗体および免疫学的に機能的な断片には、（ａ）配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、または９４と８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、またはそれ以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、（ｂ）配列番号１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、または９６と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、あるいは（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨが含まれる。

【0113】

その他の抗体または断片は、構造が類似するが、ＶＬが、配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、または９４と少なくとも９０％、９２％、またはより好ましくは９５％の配列同一性を有し、ＶＨが、配列番号１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、または９６と少なくとも９０％の配列同一性を有する。ある抗体または断片では、ＶＬは、配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、または９４と少なくとも９８％の配列同一性を有し、ＶＨは、配列番号１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、または９６と少なくとも９８％の配列同一性を有する。また他の抗体または断片は、配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、または９４のアミノ酸配列を有するＶＬ、および／または配列番号１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、または９６のアミノ酸配列を有するＶＨを含むものである。

【0114】

いくつかの抗体または断片は、配列番号１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、もしくは９４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる軽鎖、および／あるいは配列番号１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、もしくは９６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる重鎖を含む。

【0115】

また、配列番号１に示される配列から発現した成熟ヒトＤＫＫ１タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその免疫学的に機能的な断片も含まれ、当該抗体が、２つのループを含むエピトープに結合し、当該ループは、配列番号２のアミノ酸２２０〜２３７との間および配列番号２のシステイン残基２４５〜２６３との間のジスルフィド結合によって形成される。

【0116】

開示されている他の抗体または断片は、ＤＫＫ１ポリペプチドに対する特異的結合に関して上記のもの等の抗体と競合する。例えば、いくつかの抗体および断片は、２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖からなる抗体と競合し、該重鎖は、配列番号４２を含み、当該軽鎖は、配列番号４４を含む。

【0117】

提供される種々の抗体および断片は、単一の軽鎖および／または重鎖あるいは単一の可変軽ドメインおよび／または単一の可変重ドメインを含んでよい。他の抗体および断片は、２本の軽鎖および／または２本の重鎖を含む。抗体または断片が、２本の軽鎖および／または重鎖を含む場合、いくつかの場合において、２本の軽鎖は互いに同一であり、同様にいくつかの場合において、２本の重鎖が同一である。提供される抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体を含んでよい。免疫学的に機能的な断片としては、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）^２、またはドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、抗体または断片は、５×１０^−４以下のｋ_ｄ（ｋ_ｏｆｆ）でＤＫＫ１ポリペプチドから解離する。

【0118】

また、前述の抗体および免疫学的に活性な断片のいずれかを含む薬学的組成物も提供される。そのような組成物はまた、典型的には、緩衝剤、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、または保存剤も含む。薬学的組成物または医薬品の調製における前述の抗体および免疫学的に活性な断片の使用もまた提供される。

【0119】

前述の抗体をコードする種々の核酸もまた提供される。いくつかの核酸は、例えば、（ａ）配列番号９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、および／もしくは９３に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ、ならびに／または（ｂ）配列番号１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、および／もしくは９５に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲをコードし、そのため、コードされたＣＤＲが、ＤＫＫ１ポリペプチドに特異的に結合することができる抗体またはその免疫学的に機能的な断片をコードする。ある他の核酸は、抗体または免疫学的に活性な断片の可変軽鎖領域（ＶＬ）および／または可変重鎖領域（ＶＨ）をコードする配列を含むか、またはそれからなり、ＶＬは、配列番号９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、または９３と少なくとも８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有し、ＶＨは、配列番号１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、または９５と少なくとも８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する。いくつかの核酸は、配列番号９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、もしくは９３を含むか、またはそれからなるＶＬをコードする配列、ならびに／あるいは配列番号１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、もしくは９５を含む、またはそれからなるＶＨをコードする配列を含む。前述の核酸を含む発現ベクター、またそのような発現ベクターを含む細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）もまた、本明細書に開示されている。そのような発現ベクターを含む細胞を培養することによって抗体またはその免疫学的に活性な断片を生成する方法も記載されている。

【0120】

骨形成の増加を必要とする状態、例えば、多発性骨髄腫等の病的状態と関連する骨折修復または骨量減少を治療するのに効果的な新規のＤＫＫ１抗体が、本明細書に提供される。さらに、ＤＫＫ１およびスクレロスチン阻害剤の組み合わせを含む骨同化を増大させる薬剤の組み合わせが、本明細書に提供される。これらの組み合わせを、例えば、骨粗鬆症の治療、骨折の治癒の加速、および骨形成速度の増加を必要とする多くの状態に使用することができる。組み合わせは、２つの別々の阻害剤、例えば、抗スクレロスチンおよび抗ＤＫＫ１抗体の形態をとり得るか、または単一の分子的実体、例えば、二重特異性抗体であり得る。

【0121】

本明細書で使用される二重特異性抗体は、その２つの結合抗体の１つの上のある抗原と結合し、その第２のアーム上の異なる抗原と結合する。したがって、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原結合アームを有し、それが結合するそれぞれの抗原に対して一価である。本明細書に提供される二重特異性および二機能性ＤＫＫ１抗体は、上述される１つ以上のＣＤＲまたは１つ以上の可変領域を含むことができる。二重特異性および二機能性抗体は、場合によっては、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。これらの二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結が挙げられるが、これらに限定されない様々な方法によって産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照のこと。

【0122】

二重特異性分子はまた、本発明に従って、融合によって作製することもできる。一例では、本発明の抗体は、１つ以上の他の結合分子に（例えば、融合タンパク質の発現、化学的連結、高親和性の非共有結合等によって）連結され得る。そのような結合分子の例としては、二重特異性分子が生じるような、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0123】

二重特異性分子はまた、スクレロスチンに対して第１の結合特異性および第２の標的に対して第２の結合特異性を含むこともできる。例えば、第２の標的は、第１のエピトープとは異なるスクレロスチンの別のエピトープであり得る。別の例は、スクレロスチンに対して少なくとも１つの第１の結合特異性およびＤＫＫ１内のエピトープに対して第２の結合特異性を含む二重特異性分子である。別の例は、スクレロスチンに対して少なくとも１つの第１の結合特異性およびＬＲＰ４内のエピトープに対して第２の結合特異性を含む二重特異性分子である。さらに、二重特異性分子が多特異性である本発明については、分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含むことができる。

【0124】

一実施形態では、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１つの抗体、またはその抗体断片を含み、これには、本明細書に提供される新規の抗ＤＫＫ１抗体配列からの、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖが含まれる。それはまた、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔａ／．米国特許第４，９４６，７７８号に記載されるように、軽鎖または重鎖の二量体、またはＦｖもしくは一本鎖構築物等の任意の最小断片であってもよい。

【0125】

二重特異性分子は、当該技術分野で公知の方法を用いて結合部分を化学的に共役させることによって調製され得る。結合部分がタンパク質またはペプチドであるとき、様々な結合剤または架橋剤は、共有結合共役のために使用することができる。例には、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が含まれる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６、Ｌｉｕ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８６４８を参照）。他の方法は、Ｐａｕｌｕｓ，１９８５ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８，１１８−１ ３２、Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１−８３、およびＧｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５に記載されるものを含む。共役剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣを含み、いずれもＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能である。結合部分が抗体であるとき、２本の重鎖のヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって共役され得る。一実施形態では、ヒンジ領域を改変して、対応する重鎖または軽鎖の対応物を用いてジスルフィド結合を形成しない遊離スルフヒドリル基があるように、奇数のスルフヒドリル残基を含む。

【0126】

二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含んでもよい。二重特異性分子を調製するための方法の限定されない例は、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，４５５，０３０号、米国特許第４，８８１，１７５号、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４７６，７８６号、米国特許第５，０１３，６５３号、米国特許第５，２５８，４９８号、米国特許第５，４８２，８５８号、米国特許出願第２０１０／００７６１７８号を含む様々な特許刊行物に記載されている。

【0127】

ＤＫＫ１阻害剤またはＤＫＫ１結合部分を含む二重もしくは多特異性分子を用いたいずれかの併用療法のためのパートナーの例は、スクレロスチンタンパク質を特異的に認識するスクレロスチン抗体または結合断片を含む。スクレロスチンは、ｗｎｔシグナル伝達経路を通って骨密度を調節することに関与するものとして前述されている（ＰＣＴ第ＷＯ０６／１１９１０７号）。

【0128】

ＤＫＫ１抗体およびスクレロスチン抗体の組み合わせが、モデル動物においていずれかの単独よりも網状骨または海綿骨の骨塩密度を増加させることができ（ＰＣＴ第ＷＯ０９／０４７３５６号）、全体の骨塩量、密度、および皮質厚の増加を改善したことを示唆している報告書がある。しかしながら、これらの例では、骨折骨ではなく、無傷骨が使用された。

【0129】

報告書は、ＤＫＫ１発現が、偽関節の骨折モデルにおいて上昇していることを示す（Ｂａｊａｄａ，ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｂｏｎｅ；４５（４）：７２６−３５）。同様に、健常な骨は、無傷骨中のＢＭＤにおけるＤＫＫ１抗体のみの限定された効果を説明するのに役立つより低いレベルのＤＫＫ１を発現する（実施例１５を参照）。したがって、骨折を処置するためのスクレロスチンおよびＤＫＫ１阻害剤の組み合わせは、比較的短期間でのピーク負荷の有意な増加を含む驚くほど強力な治癒応答を得るのに特に有用である。

【0130】

変異体

【0131】

提供される抗体または免疫学的に機能的な断片の一部は、上で開示される抗体および断片の変異型である（例えば表１中に記載される配列を有するもの）。例えば、抗体または断片の一部は、表１中に記載される重鎖または軽鎖、可変領域、またはＣＤＲのうちの１つ以上において１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するものである。

【0132】

天然のアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいたクラスに分けられ得る：［０１４９］１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；［０１５０］２）中性親和性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；［０１５１］３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；［０１５２］４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；［０１５３］５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および［０１５４］６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つのメンバーを、同じクラスの他のメンバーと交換することを含み得る。保存的アミノ酸置換は、典型的には、生物系における合成ではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらには、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分の他の逆転または反転形態が含まれる。

【0133】

非保存的置換は、上記クラスの１つのメンバーを、他のクラスのメンバーと交換することを含み得る。このような置換残基は、ヒト抗体に相同的な抗体領域、または該分子の非相同領域内に導入することができる。

【0134】

このような変更を行う場合、ある実施形態によると、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。タンパク質の疎水性親水性プロフィルは、それぞれのアミノ酸に数値（「疎水性親水性指標」）を割り当て、次いで、ペプチド鎖に沿ってこれらの値を繰り返し平均化することによって算出される。それぞれのアミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタメート（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパルテート（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。

【0135】

タンパク質における相互作用的な生物学的機能の検討における疎水性親水性プロフィルの重要性は、当該技術分野で認識されている（例えば、Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１を参照）。あるアミノ酸は、類似の疎水性親水性の指標またはスコアを有し、かつ類似の生物学的活性を保持している他のアミノ酸と置換できることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて交換を行う場合、ある実施形態では、疎水性親水性指標が±２以内のアミノ酸の置換が含まれる。本発明のいくつかの態様では、±１以内のものが含まれ、本発明の他の態様では、±０．５以内のものが含まれる。

【0136】

また、このようなアミノ酸置換は、特にそのことによって作出される生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが、この場合のように免疫学的実施形態における使用が意図されている場合、親水性に基づいて効率的に行うことができることも認識されている。ある実施形態では、隣接アミノ酸の親水性によって制御されるタンパク質の最大局所平均親和性は、その免疫原性と抗原結合性または免疫原性と相関しており、即ち、そのタンパク質の生物学的特性と相関している。

【0137】

これらのアミノ酸残基に、以下の親水性値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパルテート（＋３．０±１）、グルタメート（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて交換を行う場合、ある実施形態では、親和性値が±２以内のアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態では、±１以内のものが含まれ、さらに他の実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。いくつかの例においては、親和性に基づいて一次アミノ酸配列のエピトープを同定することもできる。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも称される。

【0138】

当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に記載されたポリペプチドの好適な変異体を判定できるであろう。当業者は、活性に重要ではないと考えられる領域を標的とすることにより、活性を消失させることなく交換し得る分子の好適な領域を確認することができる。当業者はまた、類似のポリペプチドの中で保存される分子の残基および部分を確認することもできるであろう。さらなる実施形態では、生物学的活性にとって、または構造にとって重要であり得る領域も、生物学的活性を消失させることなく、あるいは、該ポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供することができる。

【0139】

さらに、当業者は、活性または構造にとって重要である類似のポリペプチドにおける残基を同定する構造−機能試験を検討することができる。そのような比較を考慮して、類似のタンパク質における活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に対応するタンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測された重要なアミノ酸残基による化学的に類似したアミノ酸の置換を選択することができる。

【0140】

当業者はまた、類似したポリペプチドにおける構造との関連で三次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。そのような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測することができる。当業者は、タンパク質の表面上にあると予想されたアミノ酸残基に根本的な変化を生じさせることがないように、選択を行うことができる。このような残基が、他の分子との重要な相互作用に関係していることがあり得るからである。さらに、当業者は、所望のそれぞれのアミノ酸残基における単一のアミノ酸置換を含有する試験変異体を作出することができる。次いで、これらの変異体を、ＤＫＫ１中和化活性に関するアッセイ（下記実施例を参照）を用いてスクリーニングでき、このようにして、どのアミノ酸が交換でき、どのアミノ酸を交換してはいけないかということに関する知見が得られる。言い換えると、このようなルーチン実験から収集された知見に基づいて、当業者は、単独での、または他の変異体と組み合わせたさらなる置換を避けるべきアミノ酸位置を容易に判定することができる。

【0141】

多くの科学刊行物が、二次構造の予測に充てられてきた。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２−２４５、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１３：２１１−２２２、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６、およびＣｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４を参照のこと。さらに、二次構造の予測を補助するために、現在、コンピュータプログラムが利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づいている。例えば、３０％超の配列同一性、または４０％超の類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の増大により、ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の可能な折り畳み数を含む二次構造の予測性が増強されている。Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７を参照のこと。所与のポリペプチドまたはタンパク質における折り畳み数には制限があり、一旦、構造の限界数が決まれば、構造式予測は飛躍的に正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６）。

【0142】

二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７、Ｓｉｐｐｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１５−１９）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４−１７０、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８）、および「進化的連関」（Ｈｏｌｍ，１９９９、上記参照およびＢｒｅｎｎｅｒ，１９９７、上記参照）が挙げられる。

【0143】

本発明のいくつかの実施形態では、（１）タンパク質分解に対する脆弱性を減少させる、（２）酸化に対する脆弱性を減少させる、（３）タンパク質複合体の形成に関する結合親和性を変化させる、（４）リガンドまたは抗原結合親和性を変化させる、および／または（４）このようなポリペプチドに関する他の物理化学的または機能的特性を与えるかまたは改変する、アミノ酸置換が行われる。例えば、天然配列において、単一のまたは複数のアミノ酸置換（ある実施形態では保存的アミノ酸置換）を行うことができる。ドメインの外側にあって、分子間接触を形成する抗体の一部に置換を行うことができる。このような実施形態では、親配列の構造的特性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換（例えば、親抗体または天然抗体を特徴付けている二次構造を破壊しない１つ以上のアミノ酸置換）を用いることができる。当該技術分野で認知されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．），１９８４，Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、およびＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｔ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５に記載されており、これらはそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0144】

本発明はまた、グリコシル化部位の数および／またはタイプが、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変化している、本発明の抗体のグリコシル化変異体も包含する。ある実施形態では、抗体タンパク質変異体は、ネイティブ抗体よりも多いまたは少ないＮ結合グリコシル化部位の数を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられており、Ｘと表されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基である。この配列を作出するためのアミノ酸残基の置換により、Ｎ結合炭水化物鎖の付加のための潜在的な新しい部位が提供される。代替として、この配列を排除または変更する置換は、ネイティブポリペプチド中に存在するＮ結合炭水化物鎖の付加を防止する。例えば、グリコシル化は、Ａｓｎを欠失させることによって、またはＡｓｎを異なるアミノ酸で置換することによって、減らすことができる。他の実施形態では、１つ以上の新しいＮ結合部位が作出される。抗体は、典型的にはＦｃ領域中に１つのＮ結合グリコシル化部位を有する。

【0145】

さらなる好ましい抗体変異体には、親またはネイティブアミノ酸配列中の１つ以上のシステイン残基が欠失しているか、または別のアミノ酸（例えばセリン）で置換されている、システイン変異体が含まれる。システイン変異体は、とりわけ、抗体が生物活性のあるコンホメーションへと再折り畳みされなければならない場合に有用である。システイン変異体は、ネイティブ抗体よりも少ない数のシステイン残基を有する場合があり、典型的には、対合していないシステインから生じる相互作用を最小限にするために、偶数を有する。

【0146】

開示されている重鎖および軽鎖、可変領域ドメイン、ならびにＣＤＲを用いて、ＤＫＫ１ポリペプチドに特異的に結合することができる抗原結合領域を含有するポリペプチドを調製することができる。例えば、表１中に記載されるＣＤＲのうちの１つ以上を、分子（例えば、ポリペプチド）内に共有的または非共有的に組み込ませて、免疫粘着を作製することができる。免疫粘着は、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを組み込み得るか、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖と共有結合し得るか、またはＣＤＲを非共有的に組み込み得る。ＣＤＲは、免疫粘着が特定の対象となる抗原（例えば、ＤＫＫ１ポリペプチドまたはそのエピトープ）に特異的に結合することを可能にする。

【0147】

また、本明細書に記載される可変領域ドメインおよびＣＤＲに基づく模倣体（例えば、「ペプチド模倣体」（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓまたはｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）も提供される。これらの類似体は、ペプチド、非ペプチド、またはペプチドと非ペプチド領域の組み合わせであり得る。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９、Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ ｐ．３９２、およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９であり、これらは任意の目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。治療上有用なペプチドに構造的に類似のペプチド模倣体を用いて、類似の治療的または予防的効果を生じ得る。そのような化合物は、コンピュータ化分子モデリングの補助によって開発されることが多い。一般に、本発明のペプチド模倣体は、本明細書ではＤＫＫ１に特異的に結合する能力等の所望の生物活性を示す抗体に構造的に類似しているが、当該技術分野で公知の方法により、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ．２−−、−−ＣＨ−−ＣＨ−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−ＣＨ２ＳＯ−−から選択される連結によって任意に置換された１つ以上のペプチド連結を有するタンパク質である。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の、同じタイプのＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）による系統的な置換を本発明の一定の実施形態で用いて、より安定なタンパク質を作出し得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む拘束ペプチドを、当該技術分野で公知の方法により、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することのできる内部システイン残基の付加によって、作出し得る（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）、参照によって本明細書に組み込まれる）。

【0148】

また、本明細書に記載される抗体および免疫学的に機能的な断片の誘導体も提供される。誘導体化した抗体または断片は、抗体または断片に特定の使用における増加した半減期等の所望の特性を与える任意の分子または物質を含み得る。誘導体化した抗体は、例えば、検出可能な（または標識）部分（例えば、放射性、比色、抗原性、または酵素的分子、検出可能なビーズ（磁気または高電子密度（例えば金）ビーズ等）、または別の分子（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン）と結合する分子）、治療的または診断的部分（例えば、放射性、細胞毒性、または薬学的に活性な部分）、または特定の使用（例えば、ヒト対象等の対象への投与、または他のインビボもしくはインビトロの使用）における抗体の適切性を増加させる分子を含むことができる。抗体を誘導体化するために使用することができる分子の例には、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。抗体のアルブミン結合誘導体およびＰＥＧ化誘導体は、当該技術分野で公知の技法を用いて調製することができる。一実施形態では、抗体は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体と共役されるか、または連結される。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体は、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群から選択される化学物質で化学修飾することができる。

【0149】

他の誘導体としては、抗ＤＫＫ１抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端と融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現等による、抗ＤＫＫ１抗体またはその断片と、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有複合体または凝集複合体が挙げられる。例えば、共役ペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母アルファ因子リーダー、またはエピトープタグ等のペプチドであり得る。抗ＤＫＫ１抗体含有融合タンパク質は、抗ＤＫＫ１抗体の精製または同定を容易にするために付加するペプチド（例えばポリ−Ｈｉｓ）を含むことができる。また、抗ＤＫＫ１抗体ポリペプチドは、Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されているように、ＦＬＡＧペプチドと連結させることもできる。ＦＬＡＧペプチドは、抗原性が高く、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的にされたエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所定のポリペプチドと融合した融合タンパク質の調製に有用な試薬が市販されている（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）。

【0150】

１つ以上の抗ＤＫＫ１抗体ポリペプチドを含有するオリゴマーを、ＤＫＫ１アンタゴニストとして使用することができる。オリゴマーは、共有結合または非共有結合した二量体、三量体、またはより高量体の形態であり得る。２つ以上の抗ＤＫＫ１抗体ポリペプチドを含むオリゴマーが使用に企図され、その一例はホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体等が含まれる。

【0151】

一実施形態は、抗ＤＫＫ１抗体ポリペプチドと融合したペプチド部分間の共有または非共有結合性相互作用によって結合された複数の抗ＤＫＫ１抗体ポリペプチドを含むオリゴマーを対象とする。そのようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであり得る。以下により詳細に記載されるように、ペプチドの中でも、それに付着した抗ＤＫＫ１抗体ポリペプチドのオリゴマー化を促進することができる、抗体に由来するロイシンジッパーおよびある種のポリペプチドである。

【0152】

特定の実施形態では、オリゴマーは、２〜４個の抗ＤＫＫ１抗体ポリペプチドを含む。オリゴマーの抗ＤＫＫ１抗体部分は、上記の任意の形態、例えば変異体または断片であり得る。好ましくは、オリゴマーは、ＤＫＫ１結合活性を有する抗ＤＫＫ１抗体ポリペプチドを含む。

【0153】

一実施形態では、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いて調製される。抗体由来のポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインが含まれる）と融合したある異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５、Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７、およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２ “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ１０．１９．１−１０．１９．１１に記載されている。

【0154】

本発明の一実施形態は、抗ＤＫＫ１抗体のＤＫＫ１結合断片を抗体のＦｃ領域と融合させることによって作製された２つの融合タンパク質を含む二量体を対象とする。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードしている遺伝子融合体を適切な発現ベクター内に挿入し、遺伝子融合体を、組換え発現ベクターで形質転換させた宿主細胞中で発現させ、発現された融合タンパク質を抗体分子と同様にアセンブルさせ、それにより鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間で形成させて二量体を得ることによって、作製することができる。

【0155】

本明細書で使用される「Ｆｃポリペプチド」という用語は、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドのネイティブおよび突然変異体の形態が含まれる。二量化を促進するヒンジ領域を含有するそのようなポリペプチドの切断された形態も含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそこから形成されるオリゴマー）は、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇカラム上での親和性クロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提供する。

【0156】

ＰＣＴ出願第ＷＯ９３／１０１５１号および米国特許第５，４２６，０４８号および第５，２６２，５２２号（これらのそれぞれは、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域からネイティブＣ末端まで延在している一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２−４００１に記載されるＦｃ突然変異体タンパク質である。この突然変異体タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化しており、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化しており、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していること以外は、第ＷＯ９３／１０１５１号に示されているネイティブＦｃ配列と同一である。突然変異体タンパク質は、Ｆｃ受容体に対して低下した親和性を示す。

【0157】

他の実施形態では、本明細書に開示されるような抗ＤＫＫ１抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分を、ある抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分で置換することができる。

【0158】

代替として、オリゴマーは、複数の抗ＤＫＫ１抗体ポリペプチドを含み、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を有する、または有さない融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーの中では、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されているものがある。

【0159】

オリゴマー抗ＤＫＫ１抗体誘導体を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それが見つかるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、もともといくつかのＤＮＡ結合タンパク質において確認され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、以来、様々な異なるタンパク質において見出されている。既知のロイシンジッパーには、二量体化または三量体化する天然に存在するペプチドおよびその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を産生するために適切なロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／１０３０８号、およびＨｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１（参照により本明細書に組み込まれている）に記載されている肺界面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。それと融合した異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする、改変されたロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載されている。あるアプローチでは、ロイシンジッパーペプチドと融合した抗ＤＫＫ１抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を、適切な宿主細胞中で発現させ、形成される可溶性オリゴマー抗ＤＫＫ１抗体断片または誘導体を培養上清から回収する。

【0160】

提供されるいくつかの抗体は、例えば、以下の実施形態に記載されるように、測定された少なくとも１０^４または１０^５／Ｍ×秒のＤＫＫ１に対する結合親和性（Ｋ_ａ）を有する。他の抗体は、少なくとも１０^６、１０^７、１０^８、または１０^９／Ｍ×秒のｋ_ａを有する。提供されるある種の抗体は、低い解離速度を有する。いくつかの抗体は、例えば、１×１０^−４ｓ^−１、１×１０^−５ｓ^−１またはより低いＫ_ｏｆｆを有する。

【0161】

別の態様では、本発明は、インビトロまたはインビボで（例えばヒト対象に投与したとき）、少なくとも１日の半減期を有する抗ＤＫＫ１抗体を提供する。一実施形態では、この抗体は、少なくとも３日の半減期を有する。別の実施形態では、この抗体またはその部分は、４日以上の半減期を有する。別の実施形態では、この抗体またはその部分は、８日以上の半減期を有する。別の実施形態では、この抗体またはその抗原結合部分は、誘導体化されていない、または修飾されていない抗体と比較して、より長い半減期を有するように、誘導体化または修飾される。別の実施形態では、この抗体は、第ＷＯ００／０９５６０号に記載されるように、血清半減期を増大させるために、点変異を含有する。

【0162】

また、本発明の抗体の一方または両方の鎖、その断片、誘導体、突然変異体タンパク質、または変異体をコードする核酸、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、分析、突然変異、または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、または配列決定プライマーとして使用するために十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前述のものの相補的配列も提供される。核酸は、任意の長さとすることができる。それらは、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００またはそれより多いヌクレオチド長とすることができ、ならびに／または１つ以上の付加配列、例えば、調節配列を含む、および／もしくはより大きな核酸、例えば、ベクターの一部とすることができる。核酸は、一本鎖または二本鎖とすることができ、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、ならびにその人工変異体（例えばペプチド核酸）を含むことができる。

【0163】

また、本明細書に提供されるある種の抗体が結合するエピトープをコードする核酸も提供される。したがって、配列番号２のアミノ酸２２１〜２２９および／または２４６〜２５３をコードするいくつかの核酸が含まれ、また、配列番号２のアミノ酸２２１〜２３６および／または２４６〜２６２をコードする核酸、および配列番号２のアミノ酸２２１〜２６２または配列番号２のアミノ酸２２１〜２５３をコードする核酸が含まれる。これらのペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸もまた提供される。

【0164】

抗体ポリペプチド（例えば、重鎖または軽鎖、可変ドメインのみ、または完全長）をコードするＤＮＡは、ＤＫＫ１またはその免疫原性断片で免疫化されたマウスのＢ細胞から単離され得る。ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の従来の手順により単離され得る。ファージ表示は、抗体の誘導体が調製され得る公知の技法の別例である。あるアプローチでは、対象となる抗体の成分であるポリペプチドを、任意の好適な組換え発現系において発現させ、発現したポリペプチドをアセンブルさせて抗体分子を形成する。

【0165】

提供された抗体および免疫学的に機能的な断片の軽鎖および重鎖、可変領域、ならびにＣＤＲをコードする例示的な核酸が、上の表１に記載される。遺伝コードの縮重により、表１に記載されたポリペプチド配列のそれぞれは、表１に記載されたもの以外の多数の他の核酸配列によってもコードされる。本発明は、本発明のそれぞれの抗体をコードするそれぞれの縮重ヌクレオチド配列を提供する。

【0166】

本発明は、さらに、特定のハイブリダイゼーション条件下で、他の核酸（例えば、表１〜３に記載されるヌクレオチド配列を含む核酸）とハイブリダイズする核酸を提供する。核酸をハイブリダイズする方法は当該技術分野で公知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６を参照のこと。本明細書に定義されているように、中等度ストリンジェントハイブリダイゼーション条件では、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約５０％ホルムアルデヒドのハイブリダイゼーション緩衝液、６×ＳＳＣを含有する予備洗浄溶液、および５５℃ハイブリダイゼーション温度（または４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いて、約５０％のホルムアミドを含有するもの等の他の同様なハイブリダイゼーション溶液）、および０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃の洗浄条件を用いる。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件では、４５℃で、６×ＳＳＣ中、ハイブリダイズし、続いて、６８℃で、０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で１回以上洗浄する。さらに、当業者は、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、または９９％同一性であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には互いにハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加または減少させるために、ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件を操作することができる。

【0167】

ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的パラメータおよび好適な条件を考察するための指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３−６．４）に記載されており、例えば、ＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、当業者によって容易に決定することができる。

【0168】

変化は、核酸への突然変異によって導入され、それによって、核酸がコードするポリペプチド（例えば、本発明の抗体または抗体誘導体）のアミノ酸配列の変化をもたらすことができる。突然変異は、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて導入することができる。一実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基を、例えば、部位特異的変異誘発プロトコルを用いて変化させる。別の実施形態では、１つ以上のランダムに選択された残基を、例えば、ランダム変異誘発プロトコルを用いて変化させる。どんな方法で作製されても、突然変異ポリペプチドは、所望の特性に関して、発現させ、スクリーニングすることができる。

【0169】

突然変異は、核酸がコードするポリペプチドの生物活性を有意に変化させることなく、核酸に導入され得る。例えば、ヌクレオチド置換を行って、非本質的なアミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすことができる。あるいは、核酸がコードするポリペプチドの生物活性を選択的に変化させる１つ以上の突然変異が、核酸にされ得る。例えば、突然変異は、生物活性を量的にまたは質的に変化させることができる。量的変化の例としては、活性の増大、減少、または除去が挙げられる。質的変化の例としては、抗体の抗原特異性の変化が挙げられる。

【0170】

別の態様では、本発明は、本発明の核酸配列を検出するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとしての使用に好適な核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみ、例えば、プローブまたはプライマーとして使用することができるフラグメント、または本発明のポリペプチドの活性部分（例えば、ＤＫＫ１結合部分）をコードするフラグメントのみを含むことができる。

【0171】

本発明の核酸の配列に基づいたプローブは、本発明のポリペプチドをコードする核酸または類似の核酸、例えば転写体を検出するために使用することができる。プローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含むことができる。そのようなプローブは、発現する細胞を同定するために使用することができる。

【0172】

別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその一部（例えば、１つ以上のＣＤＲまたは１つ以上の可変領域ドメインを含有するフラグメント）をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例としては、プラスミド、ウィルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、および発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含むことができる。組換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された、発現させる核酸配列に作動可能に連結した１つ以上の調節配列を含む。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現に関するもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ニワトリ肉腫ウィルスプロモーター、およびサイトメガロウィルスプロモーター）、ある宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現に関するもの（例えば、組織特異的調節配列、Ｖｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７を参照されたく、これらは参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれている）、および特定の処置または条件に応答したヌクレオチド配列の誘導発現に関するもの（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオニンプロモーターならびに原核系および真核系の両方におけるｔｅｔ応答および／またはストレプトマイシン応答プロモーター（上記参照）が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換させる宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の因子に依存し得ることは、当業者には理解されよう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載される核酸によってコードされた融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生することができる。

【0173】

別の態様では、本発明は、本発明の組換え発現ベクターを導入した宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物の細胞（例えばＣＨＯ細胞））であり得る。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換法またはトランスフェクション法によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに関しては、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション法により、それらのゲノムに外来ＤＮＡを組み込むのは、細胞の少フラクションのみでよいことが知られている。これらの組み込み体を同定および選択するために、一般的には、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性に関する）をコードする遺伝子を、対象となる遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート等の薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。他の方法の中で、導入された核酸を安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞が生存し、他の細胞は死滅する）。

【0174】

提供される非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長類（サル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）等）または類人猿（例えばチンパンジー））等の任意の抗体産生動物に由来し得る。非ヒト抗体は、例えば、インビトロ細胞培養および細胞培養に基づく適用、または抗体に対する免疫応答が生じないか、有意ではないか、防止することができるか、重要でないか、または所望されている任意の他の適用において使用することができる。本発明のある実施形態では、抗体は、完全長ＤＫＫ１またはＤＫＫ１のカルボキシ末端側によって免疫化することによって産生することができる。あるいは、本明細書に提供されるある抗体が結合するエピトープの一部（例えば、１１Ｈ１０、図１を参照）を形成するヒトＤＫＫ１のセグメントである、配列番号２のアミノ酸２２１〜２３６および／またはアミノ酸２４６〜２６２によって免疫化することによって、ある種の非ヒト抗体を増加させることができる。抗体は、ポリクローナル、またはモノクローナルであり得るか、または組換えＤＮＡの発現によって宿主細胞内で合成することができる。

【0175】

完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有する形質転換動物を免疫化することによって、またはヒト抗体のレパートリーを発現しているファージ表示ライブラリーを選択することによって、上記のように調製され得る。

【0176】

本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の標準的体細胞ハイブリダイゼーション法等の様々な技法によって産生することができる。あるいは、モノクローナル抗体を産生する他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性の形質転換を使用することができる。ハイブリドーマを調製するためのある好適な動物系は、十分に確立された方法であるマウス系である。融合のために免疫化脾臓細胞を単離するための免疫化プロトコルおよび技法は、当該技術分野で知られている。そのような手順では、免疫化したマウスからのＢ細胞を、マウス骨髄腫細胞系等の好適な不死化融合パートナーと融合させる。所望する場合、マウスの代わりにラットまたはそれ以外の他の動物を免疫化し、そのような動物のＢ細胞をマウス骨髄腫細胞系と融合させて、ハイブリドーマを形成することができる。あるいは、マウス以外の源の骨髄腫細胞系を使用してもよい。ハイブリドーマを作製するための融合手順もまた十分に知られている。

【0177】

提供される一本鎖抗体は、アミノ酸架橋（短ペプチドリンカー）を介して重鎖および軽鎖の可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片（例えば表１を参照）を連結させ、単一のポリペプチド鎖を生じさせることによって形成し得る。そのような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合することによって調製され得る。得られたポリペプチドは、それ自体で折り畳まれて抗原結合モノマーを形成することができるか、または、これらは、２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３、Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。異なるＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。一本鎖抗体の産生のために開発された技法としては、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４、ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７に記載されるものが挙げられる。

【0178】

あるサブクラスのものである本明細書に提供される抗体を、サブクラス切り替え法を用いて異なるサブクラスからの抗体へと変化させることができる。例えば、表１に示される可変ドメインは、任意の所望のＩｇサブタイプの定常ドメインに付着させることができる。そのような技法により、所与の抗体（親抗体）の抗原結合性を保有するが、親抗体のイソタイプまたはサブクラスとは異なる抗体イソタイプまたはサブクラスと関連した生物学的特性も示す新規抗体の調製が可能となる。組換えＤＮＡ技法を使用することができる。そのような手順には、特定の抗体ポリペプチドをコードするクローン化したＤＮＡ、例えば、所望のイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡが使用され得る。例えば、Ｌａｎｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６を参照のこと。

【0179】

したがって、提供される抗体としては、所望のイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）、ならびにそのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。さらに、ＩｇＧ４が所望される場合、ＩｇＧ４抗体における異種性をもたらし得るＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向性を減少させるために、Ｂｌｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：４０７）に記載されているヒンジ領域における点変異を導入することもまた望まれ得る。

【0180】

さらに、異なる特性（即ち、結合する抗原に対して親和性を変化させる）を有する抗体を誘導する技法も知られている。チェーンシャッフリングと称されるそのような技法の１つは、しばしばファージ表示とも称される、線維状バクテリオファージ表面上での免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子のレパートリー表示を含む。チェーンシャッフリングは、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９に記載されるように、ハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高親和性抗体を調製するために使用されている。

【0181】

機能的および生化学的特徴を有する抗ＤＫＫ１抗体を産生するために、表１に記載される重鎖および軽鎖に対する保存的修飾（ならびにコードする核酸への対応する修飾）を行うことができる。そのような修飾を達成する方法は上述されている。

【0182】

本発明による抗体およびその機能的な断片は、様々な方法でさらに修飾し得る。例えば、これらを治療目的で使用する場合、これらをポリエチレングリコールと共役させて（ペグ化）、血清半減期を延長させる、またはタンパク質の送達を増強し得る。代替として、対象抗体またはその断片のＶ領域を異なる抗体分子のＦｃ領域と融合させ得る。この目的のために使用するＦｃ領域は、相補体と結合しないように、したがって、融合タンパク質を治療剤として使用するときに患者において細胞溶解が誘導される可能性が低下されるように、修飾され得る。さらに、対象抗体またはその機能的な断片は、抗体またはその断片の血清半減期を増大させるためにヒト血清アルブミンと共役させ得る。本発明の抗体またはその断片の別の有用な融合パートナーはトランスサイレチン（ＴＴＲ）である。ＴＴＲは四量体を形成する能力を有しており、したがって、抗体−ＴＴＲの融合タンパク質は、結合力を増加させ得る多価抗体を形成することができる。

【0183】

代替として、本明細書に記載される抗体および断片の機能的および／または生化学的特徴の実質的な改変は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列中に、（ａ）置換の領域中の、例えばシートまたはヘリカル構造としての分子主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の負荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さの維持におけるその効果が顕著に異なる置換を生じさせることによって達成され得る。「保存的アミノ酸置換」は、ネイティブアミノ酸残基を、その位置でのアミノ酸残基の極性または負荷に与える効果がわずかまたは存在しない、非ネイティブ残基で置換することを含み得る。さらに、アラニン走査突然変異誘発によって以前に記載されているように、ポリペプチド中の任意のネイティブ残基をアラニンで置換してもよい。

【0184】

対象抗体のアミノ酸置換（保存的または非保存的に関わらず）は、当業者によってルーチン的な技法を適用して実施することができる。本明細書に提供される抗体の重要な残基を同定するために、あるいはヒトＤＫＫ１に対するこれらの抗体の親和性を増加または減少させるために、あるいは本明細書に記載される他の抗ＤＫＫ１抗体の結合親和性を改変するために、アミノ酸置換を用いることができる。

【0185】

抗ＤＫＫ１抗体および免疫学的に機能的な断片は、任意の多数の慣用技術により調製することができる。例えば、抗ＤＫＫ１抗体は、当該技術分野で公知の任意の技法を用いて組替え発現系により産生することができる。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照のこと。

【0186】

本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞系中またはハイブリドーマ以外の細胞系で発現させることができる。抗体をコードする発現構築体を用いて、哺乳動物、昆虫、または微生物の宿主細胞を形質転換させることができる。形質転換は、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号によって例示されているように、例えば、ポリヌクレオチドをウイルスまたはバクテリオファージ中にパッケージングし、当該技術分野で公知の形質移入手順によって、構築体を用いて宿主細胞を形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための任意の既知の方法を用いて行うことができる。使用される最適な形質転換手順は、形質転換させる宿主細胞型に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入する方法は、当該技術分野で公知であり、デキストラン媒介性形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル封入、核酸と正負荷脂質との混合、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が含まれるが、これらに限定されない。

【0187】

本発明の組換え発現構築体は、典型的には、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３）、重鎖可変領域、軽鎖定常領域、軽鎖可変領域、抗ＤＫＫ１抗体の軽鎖または重鎖の１つ以上のＣＤＲのうちの１つ以上を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。これらの核酸配列を、標準的なライゲーション技法を用いて適切な発現ベクター内に挿入する。一実施形態では、１１Ｈ１０の重鎖または軽鎖定常領域を、ＤＫＫ１に特異的な重鎖または軽鎖可変領域のＣ末端に付加させて、発現ベクターに連結する。ベクターは、典型的には、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（即ち、ベクターは、宿主細胞の機構と適合性があり、遺伝子の増幅および／または発現を生じさせ得る）。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸還元酵素等のタンパク質レポーターを用いてタンパク質フラグメント相補性アッセイを使用するベクターが用いられる（例えば、米国特許第６，２７０，９６４号を参照）。好適な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（旧名「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」）から購入することができる。本発明の抗体および断片をクローニングおよび発現するのに他の有用なベクターとしては、Ｂｉａｎｃｈｉ ａｎｄ ＭｃＧｒｅｗ，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８４（４）：４３９−４４（２００３）に記載されているものが挙げられる。さらなる好適な発現ベクターは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．），１９９０，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに考察されており、これは参照によって本明細書に組み込まれる。

【0188】

典型的には、宿主細胞のいずれかで使用される発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスを維持するため、ならびに外因性ヌクレオチド配列をクローニングおよび発現させるための配列を含有する。「フランキング配列」と総称されるそのような配列には、典型的には、以下の作動可能に連結したヌクレオチド配列のうちの１つ以上が含まれる：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプターのスプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能なマーカー要素。

【0189】

任意に、ベクターは、「タグ」コード配列、即ち、コード配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓ等）をコードするオリゴヌクレオチド配列、または、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（インフルエンザウイルスからの赤血球凝集素）、もしくはｍｙｃ等の、市販の抗体が存在する別の「タグ」を含有し得る。タグは、典型的には、発現の際に抗体タンパク質と融合され、抗体を宿主細胞から親和性精製する手段として役割を果たすことができる。親和性精製は、例えば、タグに対する抗体をアフィニティーマトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィーによって達成することができる。任意に、タグは、続いて開裂用のあるペプチダーゼを用いること等の様々な手段によって、精製した抗体ポリペプチドから除去することができる。

【0190】

発現ベクターにおけるフランキング配列は、同種（即ち、宿主細胞と同じ種および／または株に由来）でも、異種（即ち、宿主細胞種または株以外の種に由来）でも、ハイブリッド（即ち、１種を超える起源のフランキング配列の組み合わせ）でも、合成でも、または天然でもよい。したがって、フランキング配列の起源は、フランキング配列が、宿主細胞の機構において機能的であり、それによって活性化できる限りは、任意の原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎生物もしくは無脊椎生物、また任意の植物であり得る。

【0191】

本発明のベクター中で有用なフランキング配列は、当該技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって得られ得る。典型的には、本明細書で有用なフランキング配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されているはずであり、したがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織起源から単離することができる。いくつかの例において、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が既知であり得る。ここでは、フランキング配列は、核酸を合成またはクローニングするための本明細書に記載される方法を用いて合成され得る。

【0192】

フランキング配列の全体または一部分のみが知られている場合は、これは、ＰＣＲを用いて、および／またはゲノムライブラリーを、同じまたは別の種からの適切なオリゴヌクレオチドおよび／またフランキング配列断片を用いてスクリーニングすることによって得られ得る。フランキング配列が知られていない場合は、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片を、例えば、コード配列またはさらには別の遺伝子を含有し得る、より大きなＤＮＡ片から単離し得る。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡ断片を生じさせ、次いで、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．）、または当業者に知られている他の方法を用いて単離することで達成され得る。この目的を達成するための好適な酵素の選択は、当業者に容易に明らかであろう。

【0193】

複製起点とは、典型的には、原核発現ベクター、特に購入したものの一部であり、起点は、宿主細胞中でのベクターの増幅を補助する。選択したベクターが複製起点部位を含有しない場合、既知の配列に基づいてそれを化学的に合成し、ベクター内に連結させ得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）からの複製起点がほとんどのグラム陰性細菌には好適であり、様々な起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶ等のパピローマウイルス）が哺乳動物細胞中にベクターをクローニングするために有用である。一般に、哺乳動物複製起点は、哺乳動物発現ベクターには必要ない（例えば、ＳＶ４０起点は、多くの場合、これが初期プロモーターを含有することのみが理由で使用する）。

【0194】

本発明の発現およびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、かつ抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片をコードする核酸と作動可能に連結しているプロモーターを含有する。プロモーターとは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（即ち５’側）に位置する（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）転写されない配列である。プロモーターは、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの２つのクラスのうちの１つへと慣習的に分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の存在もしくは非存在または温度の変化等の、培養条件の何らかの変化に応答して、その制御下にあるＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始させる。その一方で、構成的プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する、即ち、遺伝子発現の実験的制御はわずかしか存在しない、または存在しない。様々な潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが公知である。好適なプロモーターは、制限酵素消化によってプロモーターを供給源ＤＮＡから除去することによって、またはプロモーターをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、所望のプロモーター配列をベクター内に挿入することによって、抗ＤＫＫ１抗体をコードするＤＮＡと作動可能に連結させる。

【0195】

また、酵母宿主で使用するための好適なプロモーターも当該技術分野で公知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞での使用に好適なプロモーターは公知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られたものが含まれるが、これらに限定されない。他の好適な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。

【0196】

本発明の組換え発現ベクターの実施に有用な特定のプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｍｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０）、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列中に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）、ベータ−ラクタマーゼプロモーター等の原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が含まれるが、これらに限定されない。また、組織特異性を示し、形質転換動物で利用されている、以下の動物転写制御領域も、使用が利用可能である：膵臓腺房細胞中で活性のあるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９４６、Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９４０９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）、膵臓ベータ細胞中で活性のあるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−２２）、精巣、乳房、リンパ系、および肥満細胞中で活性のあるマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）、肝臓中で活性のあるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）、肝臓中で活性のあるアルファ−胎児タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−４８、Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）、肝臓中で活性のあるアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）、骨髄性細胞中で活性のあるベータ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−４０、Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）、脳中のオリゴデンドロサイト細胞中で活性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−１２）、骨格筋中で活性のあるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）、視床下部中で活性のある性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８）、ならびに最も具体的にはリンパ球細胞中で活性のある免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８、Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）。

【0197】

高等真核生物における、本発明の抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片をコードする核酸の転写を増加させるために、エンハンサー配列をベクター内に挿入し得る。エンハンサーとは、ＤＮＡのシス作用性要素であり、通常約１０〜３００ｂｐの長さであり、プロモーターに作用して転写を増加させる。エンハンサーは、比較的、配向および位置から独立している。これらは、転写単位の５’および３’側に見られる。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−胎児タンパク質、およびインスリン）。また、ウイルスからのエンハンサー配列も使用することができる。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが、真核プロモーターを活性化させるための例示的なエンハンサー要素である。エンハンサーは、核酸分子に対して５’または３’位でベクター内にスプライシングされ得るが、これは典型的にはプロモーターに対して５’側部位に配置される。

【0198】

発現ベクターにおいて、転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード領域の３’末端に位置し、転写を終結させる役割を果たす。原核生物細胞の発現に用いられる転写終結配列は、典型的にはポリ−Ｔ配列へと続くＧ−Ｃ豊富な断片である。配列は、ライブラリーから容易にクローン化されるか、またはさらにベクターの一部として商品として購入されるが、本明細書に記載されるもの等の核酸合成のための方法を用いて容易に合成することもできる。

【0199】

選択可能なマーカー遺伝子要素は、選択的培養培地中で増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。発現ベクターに用いられる典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞では、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を付与する、（ｂ）細胞の栄養要求欠乏性を補完する、または（ｃ）複合培地から利用可能でない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。選択可能なマーカーの例としては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。細菌ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物および真核生物宿主細胞の両方における選択のために使用することができる。

【0200】

他の選択遺伝子を使用して、発現される遺伝子を増幅させることができる。増幅とは、単一のコピーでは、ある選択条件下で細胞の生存および増殖させるのに十分な高レベルで発現できない遺伝子を、組換え細胞の連続世代の染色体内で、タンデムに反復させるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な増幅可能な選択可能なマーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびプロモーターのないチミジンキナーゼが含まれる。これらのマーカーの使用において、哺乳動物細胞形質転換体を、形質転換体のみがベクター中に存在する選択遺伝子のおかげで生存するように唯一適応している選択圧下に置く。培地中の選択剤の濃度を次々に増加させる条件下で形質転換細胞を培養し、それによって、選択遺伝子が増幅された細胞のみの生存を可能にすることによって、選択圧が課される。これらの状況下で、本発明の抗体をコードするＤＮＡ等の選択遺伝子に隣接するＤＮＡが選択遺伝子と共に同時増幅される。その結果、増加した量の抗ＤＫＫ１ポリペプチドが増幅したＤＮＡから合成される。

【0201】

リボソーム結合部位がｍＲＮＡの翻訳開始に通常必要であり、これはシャイン−ダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。この要素は、典型的にはプロモーターの３’側および発現させるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。

【0202】

いくつかの例において、例えば、グリコシル化が真核宿主細胞発現系中に所望される場合は、グリコシル化または収率を向上させるために様々なプレ配列を操作することができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更するか、または、やはりグリコシル化に影響を与え得るプロ配列を付加することができる。最終タンパク質産物は、発現から起こる１つ以上の付加アミノ酸を１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）に有し得、これらは完全に除去されていない場合がある。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に付着した、ペプチダーゼ切断部位中に見られる１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用により、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断する場合は、わずかに切断されているが、それでも活性な形態の所望のポリペプチドが生じ得る。

【0203】

市販の発現ベクターが上述の所望のフランキング配列の一部を欠く場合は、これらの配列をベクター内に個々に連結させることによってベクターを改変することができる。ベクターが選択され、所望に応じて改変された後、抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片をコードする核酸分子をベクターの適切な部位内に挿入する。

【0204】

本発明の抗体またはその免疫学的に機能的な断片をコードする配列を含有する完成したベクターを、増幅および／またはポリペプチド発現のために好適な宿主細胞内に挿入する。抗ＤＫＫ１抗体、その免疫学的に機能的な断片のための発現ベクターを選択された宿主細胞内に形質転換させることは、形質移入、感染症、塩化カルシウム、電気穿孔、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン方法、または他の知られている技法等の方法を含む、公知の方法によって達成され得る。選択された方法は、使用される宿主細胞の種類と部分的に相関関係にある。これらの方法および他の好適な方法は当業者に公知である。

【0205】

形質転換させた宿主細胞は、適切な条件下で培養した際に、抗ＤＫＫ１抗体またはその機能的な断片を合成し、続いて、これを培養培地から収集するか（宿主細胞がそれを培地内に分泌する場合）、またはそれを産生する宿主細胞から直接収集することができる（それが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化等）、および生物活性のある分子への折り畳みの容易さ等の、様々な要因に依存する。

【0206】

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当該技術分野で公知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ Ｇ２）、および多くの他の細胞系等の、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、特定のＤＮＡ構築体を発現させるための最良の細胞系は、様々な細胞系を試験して、どれが最高レベルの発現レベルを有し、構成的なＤＫＫ１結合特性を有する抗体を産生するかを決定することによって選択し得る。

【0207】

ある実施形態では、本発明はまた、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、および／またはアジュバントのうちの１つ以上と共に対象の抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含む組成物を提供する。そのような組成物は、有効量の抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含有してもよい。したがって、薬学的組成物または医薬品の調製における本明細書に提供される抗体および免疫学的に活性な断片の使用も含まれる。そのような組成物は、下記の代表的な有用性の項に記載されたような種々の疾患の治療に使用することができる。

【0208】

薬学的調製物のために許容される製剤成分は、使用される投与量および濃度において、受容者に対して非毒性である。提供される抗体および免疫学的に機能的な断片に加えて、本発明による組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、解離または放出の速度、吸着または透過性、を改変、維持、または保存するための成分を含有することができる。薬学的組成物を製剤化するための好適な材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン等）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム等）；緩衝剤（酢酸塩、ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸類等）；増量剤（マンニトールまたはグリシン等）；キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン等）；充填剤；単糖類、二糖類；および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン類等）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等）；着色剤、風味剤、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー類（ポリビニルピロリドン等）；低分子量ポリペプチド類；塩形成対イオン類（ナトリウム等）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素等）；溶媒類（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール等）；糖アルコール類（マンニトールまたはソルビトール等）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル類、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０等のポリソルベート類、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール）；安定性増強剤（ショ糖またはソルビトール等）；等張性増強剤（ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール ソルビトール等）；送達媒体；希釈剤；賦形剤、および／または薬学的用アジュバント類が挙げられるが、これらに限定されない（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたく）、これは参照によって本明細書に組み込まれる。

【0209】

薬学的組成物における主要媒体または担体は、本来は、水性でも非水性でもよい。そのような組成物に好適な媒体または担体としては、注射用水、生理的食塩水、または人工脳脊髄液が挙げられ、場合によっては、非経口投与用組成物に一般的な他の材料が添加される。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンを混合した生理食塩水は、さらなる代表的媒体である。抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含む組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケークまたは水溶液形態の任意の製剤化剤と混合することにより、保存用に調製され得る。さらに、抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片は、ショ糖等の適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化され得る。

【0210】

製剤成分は、許容される濃度で投与部位に存在する。緩衝剤は、生理的ｐＨあるいはわずかにより低いｐＨで、典型的には約４．０から約８．５、あるいは約５．０から８．０の間でのｐＨ範囲内に組成物を維持するために使用することが有利である。薬学的組成物は、約ｐＨ６．５〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含むことができ、さらにソルビトールまたはその好適な代替物を含んでよい。

【0211】

薬学的組成物は、錠剤の製造に好適である非毒性賦形剤と混合した、有効量の抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含んでよい。錠剤を滅菌水または別の適切な媒体に溶解することにより、液剤は、単位用量形態で調製され得る。好適な賦形剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム、乳糖、またはリン酸カルシウム等の不活性材料；またはデンプン、ゼラチン、またはアラビアゴム等の結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク等の潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0212】

さらなる薬学的組成物は、持続型または制御送達製剤の形態である。リポソーム担体、生体侵食性ミクロ粒子、または多孔性ビーズおよび蓄積注射等の種々の他の持続型または制御送達手段を製剤化する技法を用いることができる（例えば、薬学的組成物の送達用多孔性ポリマーミクロ粒子の制御放出を記載している、国際出願ＰＣＴ／米国第９３／００８２９号を参照）。持続型放出製剤としては、造形品の形態での半透過性マトリックス、例えば、薄膜、またはミクロカプセル、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ １５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ １２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）を挙げることができる。持続型放出組成物としてはまた、当該技術分野で公知の任意のいくつかの方法により調製することができるリポソーム類を挙げることもできる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２、欧州特許第０３６，６７６号、欧州特許第０８８，０４６号、および欧州特許第１４３，９４９号を参照。

【0213】

インビボ投与に用いられる薬学的組成物は、一般的に滅菌である。滅菌は、滅菌ろ過膜を通すろ過により達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、滅菌は、凍結乾燥および再構成の前か後に実施され得る。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液において保存され得る。ある実施形態では、非経口用組成物は、滅菌アクセス口を有する容器、例えば、皮下注射針により貫通可能な密栓を有する静脈溶液用バッグまたはバイアル、または注入用に即時使用できる前充填滅菌シリンジに入れる。

【0214】

一旦本発明の薬学的組成物が製剤化されると、この薬学的組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体として、または乾燥または凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保存され得る。そのような製剤は、即時使用できる形態または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥された）で保存され得る。

【0215】

薬学的組成物を製剤化するために使用される成分は、高純度であることが好ましく、有害となる可能性のある汚染物質が実質的にないことが好ましい（例えば、少なくとも米国食品（ＮＦ）グレード、一般に少なくとも分析グレード、またより典型的には少なくとも薬学的グレード）。さらに、インビボ使用に意図された組成物は、通常は滅菌されている。所与の化合物を使用前に合成する必要がある限りは、生じた産物は典型的に、合成または精製工程時に存在し得る毒性となる可能性のある薬剤、特にエンドトキシン類のいずれもが実質的に無い。非経口用組成物はまた、滅菌で、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で製造される。

【0216】

本発明は、複数回用量または単回用量投与単位を生成するためのキットを提供する。例えば、本発明によるキットはそれぞれ、例えば、単一および複数チャンバの前充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジ、リオシリンジ、または針なしシリンジ）等の、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性希釈剤を有する第２の容器の両方を含み得る。

【0217】

本発明の薬学的組成物は、典型的には注入により非経口的に送達することができる。注入は、眼内、腹腔内、門脈内、筋肉内、静脈内、くも膜下腔内、大脳内（実質内）、脳室内、動脈内、病巣周囲、または皮下であり得る。点眼剤は、眼内投与のために使用することができる。いくつかの場合において、注入は、処置が標的とする特定の１本または複数本の骨の近傍に局在化させてよい。非経口投与のために、抗体は、薬学的に許容される媒体中、所望の抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含む、発熱物質のない非経口的に許容される水溶液中で投与され得る。特に非経口注射に好適な媒体は、抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片が、適切に保存された滅菌等張性液として製剤化されている滅菌蒸留水である。

【0218】

対象の抗ＤＫＫ１抗体およびその機能的な断片を含む薬学的組成物は、ボーラス注射によって投与されても、もしくは注入によって連続的に投与されても、埋め込みデバイス、持続型放出システム、または放出持続を達成するための他の手段によって投与されてもよい。薬学的組成物はまた、所望の分子が吸収されているか、またはカプセル化されている膜、スポンジ、または別の適切な材料を介して局所的に投与することができる。埋め込みデバイスが用いられる場合、デバイスは、任意の好適な組織または臓器に埋め込まれ得、所望の分子の送達は、拡散、持続放出型ボーラス、または連続放出を介し得る。この調製物は、その後蓄積注射によって送達され得る産物の制御放出または持続放出を提供し得る、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸、もしくはコポリ（乳／グリコール）酸（ＰＬＧＡ）等）、ビーズまたはリポソーム等の薬剤によって製剤化され得る。ヒアルロン酸による製剤化は、循環中における持続時間を助長する効果を有する。

【0219】

抗ＤＫＫ１抗体またはその機能的な断片を含む対象組成物は、吸入用に製剤化され得る。これらの実施形態では、抗ＤＫＫ１抗体は、吸入用の乾燥粉末として製剤化されるか、または抗ＤＫＫ１抗体の吸入溶液もまた、噴霧化等により、エーロゾル送達用噴射剤と共に製剤化され得る。肺投与は、化学的修飾タンパク質の肺送達が記載される、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載されており、これは参照によって本明細書に組み込まれる。

【0220】

本発明のある薬学的組成物は、経口等、消化管を介して送達することができる。この様式で投与される対象の抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片は、錠剤およびカプセル剤等の固形剤形の配合に慣例的に使用される担体と共に、または担体なしで製剤化され得る。カプセル剤は、生物学的利用能が最大であり、全身前分解が最小である時に胃腸管内の箇所で製剤の活性部分を放出するように設計され得る。抗ＤＫＫ１抗体またはその機能的な断片の吸収を促進させるために、追加の試剤を含ませることができる。経口投与では、消化酵素に対する耐性を付与するために、修飾アミノ酸を使用してもよい。また、希釈剤、風味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も使用してもよい。

【0221】

抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含む対象組成物はまた、エキソビボで使用してもよい。このような場合において、患者から取り出された細胞、組織、または臓器は、抗ＤＫＫ１抗体に暴露されるか、またはそれと共に培養される。次いで、この培養細胞は、その患者または異なる患者に戻して移植しても、または他の目的のために使用してもよい。

【0222】

ある実施形態では、抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片は、ポリペプチドを発現し、分泌させるために、本明細書に記載されるもの等の方法を用いて、遺伝子操作されたある細胞を移植することによって送達することができる。このような細胞は、動物細胞でもヒト細胞でもよく、また、自己種でも、異種でも、異種間でもよく、また不死化のものであってもよい。免疫応答の機会を減少させるために、細胞はカプセル化して周囲組織の侵入を避け得る。カプセル化材料は、典型的には、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲組織からの他の有害な因子による細胞破壊を防ぐ、生体適合性のある、半透過性ポリマー封入物または膜である。

【0223】

投与量

【0224】

提供される薬学的組成物は、予防処置および／または治療処置のために投与することができる。「有効量」とは、一般に、症状の重症度および／または頻度の軽減または除去および／または損傷の改善または修復である所望の効果を達成するために、活性成分（即ち、抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片）の十分な量であるが、非毒性である量を指す。「治療的有効量」とは、疾患状態または症状を治療するために十分な量、あるいは、疾患または任意の他の望ましくない症状の進行を防ぐか、妨げるか、遅らせるか、または逆転させるのに十分な量を指す。「予防的有効量」とは、疾患状態または症状の発生を防ぐか、妨げるか、または遅らせるのに有効な量を指す。

【0225】

一般に、抗体または断片の毒性および治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が致死する量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的有効な用量）の測定等、細胞培養および／または実験動物における標準的薬学的手順に従って判定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。

【0226】

細胞培養および／または動物実験から得られたデータは、ヒトへの投与量範囲を製剤化するのに使用することができる。活性成分の投与量は、典型的に、毒性がほとんど無いか、全く無いＥＤ５０を含む濃度を循環させる範囲内にある。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路によってこの範囲内で変わり得る。

【0227】

治療的または予防的に使用される、抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含む薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の背景および目的によって異なる。したがって、ある実施形態による治療のための適切な投与量レベルは、部分的に、送達される分子、抗ＤＫＫ１抗体が用いられる適応症、投与経路、および患者のサイズ（体重、体表面、または臓器サイズ）および／または状態（年齢および全体的な健康）によって異なり得ることを当業者は認識するであろう。臨床医は、投与量の力価を測定するため、および最適の治療効果を得るために投与経路を変更してもよい。典型的な投与量は、上記の因子によって、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれ以上の範囲である。ある実施形態では、投与量は、０．１μｇ／ｋｇから約１５０ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。

【0228】

投与回数は、製剤中の抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片の薬物動態パラメータによって異なる。例えば、臨床医は、ある投与量が所望の効果達成に到達するまで、この組成物を投与するであろう。したがって、この組成物は、単回用量、または経時的に２回以上の用量（所望の分子の同一量を含有しても、しなくてもよい）、または埋め込みデバイスまたはカテーテルを介した連続輸液として投与してもよい。治療は、経時的に連続的であっても、または断続的であってもよい。適切な投与量のさらなる精緻化は、当業者により日常的に行われ、彼らにより日常的に行われる業務の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量応答データの使用により確認され得る。

【0229】

ＤＫＫ１を標的とすることによって内科的疾患を治療するために、対象の抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含む組成物は、疾患の重症度を反映する少なくとも１つの指標において持続した改善を誘導するのに十分な量および時間で、患者に投与され得る。患者が、少なくとも１日から７日、またはいくつかの場合においては１週間から６週間離れた少なくとも２つの機会に改善を示す場合に、改善が「持続されている」と考えられる。適切な間隔は、ある程度、治療されている病態に依存し、改善が持続されているかどうかを判定するための適切な間隔を決定するのは、主治医の権限内にある。改善の程度は、兆候または症状に基づいて判定され、また生活の質のアンケート等、患者に渡されるアンケートも使用され得る。

【0230】

患者の病気の程度を反映する種々の指標は、治療の量および時間が十分であるかどうかを判定するために評価され得る。選択された１つまたは複数の指標に関するベースライン値は、抗体の最初の用量投与前の患者の検査により確立される。ベースライン検査は、最初の用量の投与から約６０日以内に行われることが好ましい。例えば、骨折の治療等の急性症状を治療するために抗体が投与される場合、傷害が生じてから実際にはできるだけ早く最初の用量が投与される。

【0231】

改善は、患者が選択された１つまたは複数の指標に関するベースラインを超えた改善が明示されるまで、抗ＤＫＫ１抗体またはその免疫学的に機能的な断片を投与することにより誘導される。慢性状態の治療において、この改善度は、少なくとも１ヵ月以上の期間、例えば、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月以上、または無期限にわたってこの医薬品を反復投与することにより得られる。１週間から６週間の期間、または単回用量でも、急性病態の治療に十分であることが多い。傷害または急性状態に関しては、単回用量でも十分であり得る。

【0232】

治療後の患者の病気の程度が１つ以上の指標に従って改善したように見え得る場合でも、治療は、同じレベルでまたは用量もしくは回数を減じて無期限に継続してもよい。一旦治療を減少または中断しても、後で症状が再出現した場合は元のレベルで再開してもよい。

【0233】

対象の抗ＤＫＫ１抗体およびその免疫学的に機能的な断片は、生体試料においてＤＫＫ１を検出するために使用することができる。このような使用は、このタンパク質を産生する細胞または組織の同定を可能にするか、あるいはＤＫＫ１が過剰産生、または過少産生される病態を検出するための診断として役立つ。提供される抗体および断片はまた、ＤＫＫ１に結合する分子をスクリーニングするための方法に使用することもできる。例えば、種々の競合的スクリーニング法を使用することができる。いくつかの方法において、抗ＤＫＫ１抗体が結合するＤＫＫ１分子またはその断片は、別の分子（即ち、候補分子）と共に、本明細書に開示される抗体または断片と接触される。抗体または断片とＤＫＫ１との間の結合の減少は、分子がＤＫＫ１に結合する指標である。抗体または断片の結合は、種々の方法、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて検出することができる。抗ＤＫＫ１抗体または断片とＤＫＫ１との間の結合の検出は、抗体を検出可能に標識することによって簡便化することができる。いくつかの方法において、最初のスクリーニングで結合を示す分子は、それがＤＫＫ１活性を阻害するかどうか（例えば、分子がＷｎｔシグナル伝達を活性化するかどうか）を判定するためにさらに分析される。

【0234】

ＤＫＫ１阻害剤またはスクレロスチン阻害剤または組み合わせ（例えば、それぞれの結合剤）の活性は、種々の方法で測定され得る。骨塩量または骨密度の結合剤の媒介による増加は、単一エネルギーおよび二重エネルギーＸ線吸収測定法、超音波、コンピュータ断層撮影法、Ｘ線撮影法、および磁気共鳴映像法を用いて測定され得る。骨量はまた、体重から、または他の方法を用いても計算され得る（Ｇｕｉｎｎｅｓｓ−Ｈｅｙ，Ｍｅｔａｂ．Ｂｏｎｅ Ｄｉｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．，５：１７７−１８１（１９８４）を参照）。例えば、骨量減少、骨吸収、骨形成、骨強度、または骨石灰化のパラメータにおける薬学的組成物および方法の効果を試験するために、骨粗鬆症および骨減少症等のヒト疾患の状態を模倣する動物および特定の動物モデルが、当該技術分野で使用される。そのようなモデルの例には、卵巣切除されたラットモデルが含まれる（Ｋａｌｕ，Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ，１５：１７５−１９２（１９９１）、Ｆｒｏｓｔ ａｎｄ Ｊｅｅ，Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ，１８：２２７−２３６（１９９２）、およびＪｅｅ ａｎｄ Ｙａｏ，Ｊ．Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ．Ｎｅｕｒｏｎ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１：１９３−２０７（２００１））。また、本明細書に記載される結合剤の活性を測定するための方法を使用して、他の阻害剤の有効性を決定してもよい。

【0235】

ヒトでは、例えば、臀部および脊椎の二重Ｘ線吸光光度法（ＤＸＡ）を用いて骨塩密度を臨床的に測定することができる。他の技術には、定量的コンピュータ断層撮影法（ＱＣＴ）、超音波検査、単一エネルギーＸ線吸光光度法（ＳＸＡ）、およびＸ線撮影吸光光度法（ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）が含まれる。測定のための一般的な中枢骨格部位には、脊椎および臀部が含まれ、末梢部位には、前腕、手指、手関節、および踵が含まれる。超音波検査を除き、米国医師会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、ＢＭＤ技術が、典型的に、Ｘ線の使用を含み、かつ、放射線の減衰が放射線経路中の組織の厚みおよび組成に依存するという原理に基づくことを指摘している。全ての技術は、結果と基準データベースとの比較を含む。

【0236】

あるいは、１つ以上のスクレロスチン結合剤に対する生理反応は、骨マーカーレベルをモニタリングすることによって計測することができる。骨マーカーは骨リモデリングプロセス中に生成される産物であり、骨、骨芽細胞、および／または破骨細胞によって放出される。骨吸収および／または骨形成「マーカー」レベルの変動は、骨リモデリング／モデリングの変化を意味する。国際骨粗鬆症財団（ＩＯＦ）は、骨マーカーを用いて骨密度治療をモニタリングすることを推奨している（例えば、Ｄｅｌｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ Ｉｎｔ．，Ｓｕｐｐｌ．６：Ｓ２−１７（２０００）を参照されたく、参照によって本明細書に組み込まれる）。骨吸収（または破骨細胞活性）を示すマーカーには、例えば、Ｃ−テロペプチド（例えば１型コラーゲンのＣ末端テロペプチド（ＣＴＸ）または血清中の架橋型Ｃ−テロペプチド）、Ｎ−テロペプチド（１型コラーゲンのＮ末端テロペプチド（ＮＴＸ））、デオキシピリジノリン（ＤＰＤ）、ピリジノリン、尿ヒドロキシプロリン、ガラクトシルヒドロキシリシン、および酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（例えば、血清中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼアイソフォーム５ｂ）が含まれる。骨形成／鉱化マーカーとしては、骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＳＡＰ）、Ｉ型プロコラーゲンのＮおよびＣ末端伸長部分から放出されるペプチド（Ｐ１ＮＰ，ＰＩＣＰ）、およびオステオカルシン（ＯｓｔＣａ）が挙げられるが、これらに限定されない。臨床試料、例えば尿および血液中のマーカーを検出および定量するためのいくつかのキットが市販されている。

【0237】

投与時に、治療剤は、好ましくは、１つ以上の骨吸収マーカーのレベル、例えばＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド（ＣＴＸ）の血清レベルを減少させる。したがって、本発明は、療法をモニタリングする方法、即ち、スクレロスチン結合剤または他のスクレロスチン阻害剤に対する生理反応をモニタリングする方法をさらに提供する。本方法は、治療剤を投与すること、次いで１つ以上の骨吸収マーカーのレベルを測定することを含む。さらに、本方法は、投与前に１種以上の骨形成マーカーのレベルを測定することを含むことができる。治療中および／または治療後の骨吸収マーカーのレベルを治療前レベルと比較するか、あるいはその患者集団に典型的な標準範囲と比較してもよい。当業者は、類似の年齢、性別、疾患レベル、および／または患者集団の他の特性の代表的な数の患者を試験することによって、好適な標準範囲を容易に決定することができる。一回量の治療剤によって骨吸収マーカーのレベルを少なくとも約５％（例えば、約１０％、約２０％、または約３０％）減少させることができる。いくつかの実施形態では、治療剤の投与は、投与前の骨吸収マーカーのレベルと比較して、骨吸収マーカーのレベルを少なくとも約４０％（例えば、約５０％、約６０％、または約７０％）減少させる。さらに、骨吸収マーカーレベルは、一回量の投与後、少なくとも約３日間（例えば、約７日間、約２週間、約３週間、約１か月、約５週間、約６週間、約７週間、約２か月、約９週間、約１０週間、約１１週間、または約３か月）減少し得る。

【0238】

骨吸収マーカーのレベルを減少させることに加えて、患者に投与される治療剤の量はまた、１つ以上の骨形成マーカーのレベル、例えばＢＳＡＰの血清レベル、Ｐ１ＮＰの血清レベル、および／またはＯｓｔＣａの血清レベルを増加させることもできる。一回量の治療剤は、骨形成マーカーのレベルを、例えば、少なくとも約５％（例えば約１０％、約２０％、または約３０％）増加させることができる。いくつかの実施形態では、治療剤の投与は、骨形成マーカーのレベルを少なくとも約４０％（例えば約５０％、約６０％、または約７０％）上昇させる。他の実施形態では、治療剤の投与は、１つ以上の骨形成マーカーのレベルを少なくとも約７５％（例えば約８０％、約９０％、約１００％、または約１１０％）増加させる。また他の実施形態では、治療剤の投与は、骨形成マーカーのレベルを少なくとも約１２０％（例えば約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、または約１７０％）増加させる。代替の実施形態では、治療剤は、骨形成マーカーのレベルを少なくとも約１８０％（例えば約１９０％または約２００％）増加させる。骨形成マーカーレベルは、一回量の治療剤の投与後、少なくとも約３日間（例えば約７日間、約２週間、約３週間、約１ヶ月間、約５週間、約６週間、約７週間、約２ヶ月間、約９週間、約１０週間、約１１週間、または約３ヶ月間）（治療前の骨形成マーカーレベルまたはその患者集団に典型的な標準範囲と比較して）上昇したままである。

【0239】

典型的には、ＢＭＤは、「全身」（例えば、頭部、体幹、腕、および脚）または臀部（例えば臀部全体および／または大腿骨頸部）、脊椎（例えば腰椎）、手関節、手指、脛骨、および／または踵において測定することができる。骨粗鬆症の診断では、患者のＢＭＤを３０歳の成人健常者（即ち「若年成人」）のピーク密度と比較して、いわゆる「Ｔ−スコア」を作成する。また、患者のＢＭＤを「年齢適合」骨密度と比較してもよい（例えば、骨粗鬆症の予防および管理に関する世界保健機構科学グループ（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ），“Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ ＷＨＯ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｇｒｏｕｐ ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ；９２１，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（２０００）を参照のこと）。患者のＢＭＤと若年成人健常者のＢＭＤとの差異は、通常、様々な「標準偏差」の観点から言及され、それは典型的に骨密度の約１０％〜約１２％減少に等しい。世界保健機構は、ＢＭＤ Ｔ−スコアに基づく４つの診断カテゴリーを提唱した。若年成人の参照平均の１標準偏差以内のＢＭＤ値（Ｔ−スコア≧−１）は「正常」である。低い骨量（骨減少症）は、１標準偏差を超えて若年成人平均を下回るが２標準偏差未満のＢＭＤ値（Ｔ−スコア＜−１および＞−２．５）によって示される。２．５標準偏差を超えて標準を下回るＴ−スコアは骨粗鬆症の診断を裏付ける。患者が１以上の脆弱性骨折にさらに罹患しているならば、その患者は重症骨粗鬆症を有すると見なされる。

【0240】

治療剤は、患者のＴ−スコアにかかわらず、骨密度を改善するために、患者に投与してよい。治療剤は、患者のＢＭＤを少なくとも約１％（約２％、約３％、約４％、約５％、または約６％）増加させるために有効な用量でかつ期間で投与してよい。いくつかの実施形態では、ＢＭＤは、少なくとも約８％（例えば少なくとも約１０％、約１２％、約１５％、または約１８％）増加する。他の実施形態では、治療剤によって、臀部、脊椎、手関節、手指、脛骨、および／または踵でのＢＭＤが、少なくとも約２０％（例えば少なくとも約２２％、約２５％、または約２８％）増加する。また他の実施形態では、ＢＭＤは、少なくとも約３０％（例えば少なくとも約３２％、約３５％、約３８％、または約４０％）増加する。換言すれば、ＢＭＤは、若年成人健常者の正常ＢＭＤを下回る約１〜約２．５標準偏差の範囲（好ましくは約０〜約１標準偏差の範囲）まで増加させ得る。

【0241】

骨リモデリングまたはモデリングの変化は、身体全体の塩濃度の変動を引き起こし得る。骨は血流中のカルシウムレベルの主要な調節器の１つである。破骨細胞によって媒介される骨吸収は、貯蔵されたカルシウムを体循環に放出し、一方、骨芽細胞によって媒介される骨形成は、循環からカルシウムを取り出して骨組織に取り込む。正常な骨モデリング／リモデリングでは、これらのプロセスが循環して健康かつ強い骨を維持し、約８．５ｍｇ／ｄＬ〜約１０．５ｍｇ／ｄＬの遊離カルシウムレベルを維持する（例えば約２．２ｍｍｏｌ／Ｌ〜約２．６ｍｍｏｌ／Ｌ）。骨障害、他の疾病、およびある種の治療でさえ、全身カルシウムレベルを崩壊させ、恐ろしい結果を有し得る。高カルシウム血症は、血液中の高レベルの（例えば１２ｍｇ／ｄＬまたは３ｍｍｏｌ／Ｌを超える）カルシウムと関連する。異常に高いカルシウムレベルは、例えば、疲労、錯乱、便秘、食欲低下、頻尿、心臓障害、および骨痛を引き起こす。低カルシウム血症は、血液中の異常に低レベル（例えば約９ｍｇ／ｄＬまたは２．２ｍｍｏｌ／Ｌ未満）なカルシウムによって示される電解質平衡障害である。７．５ｍｇ／ｄＬ未満（１．８７ｍｍｏｌ／Ｌ未満）のカルシウムレベルは、重症低カルシウム血症と考えられ、臨床症状を伴うことがある。

【0242】

治療方法および使用方法
本発明の方法は、骨関連障害、例えば、異常な骨芽細胞または破骨細胞活性と関連する骨関連障害の治療または予防に有用である。実際、本発明の治療剤は、軟骨形成不全、鎖骨頭蓋異骨症、内軟骨腫症、繊維性骨異形成症、ゴーシェ病、低リン血症、Ｘ連鎖低リン血症性くる病、マルファン症候群、多発性遺伝性外骨腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｅｘｏｔｏｓｅｓ）、神経線維腫症、骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、硬化性病変、偽関節、化膿性骨髄炎、歯周病、抗てんかん薬誘発性骨量減少、原発性および続発性副甲状腺機能亢進症、家族性副甲状腺機能亢進症候群、無重力誘発性骨量減少、男性の骨粗鬆症、閉経後骨量減少、脊椎固定術、骨関節炎、腎性骨ジストロフィー、骨の浸潤性障害、口腔骨量減少、顎の骨壊死、若年性パジェット病、メロレオストーシス、代謝性骨疾患、肥満細胞症、鎌状細胞貧血／疾患、臓器移植関連骨量減少、腎臓移植関連骨量減少、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、てんかん、若年性関節炎症、地中海貧血症、ムコ多糖症、ファブリー病、ターナー症候群、ダウン症候群、クラインフェルター症候群、ハンセン病、ペルテス病（Ｐｅｒｔｈｅ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、青年期特発性脊柱側弯症、乳児性発症多系統炎症性疾患（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｏｎｓｅｔ ｍｕｌｔｉ−ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、ウィンチェスター症候群、メンケス病、ウィルソン病、虚血性骨疾患（例えばレッグ・カルベ・ペルテス病および局所遊走性骨粗鬆症）、貧血状態、ステロイドに起因する症状、糖質コルチコイド誘発性骨量減少、ヘパリン誘発性骨量減少、骨髄障害、壊血病、栄養不良、カルシウム欠乏症、骨粗鬆症、骨減少症、アルコール依存症、慢性肝疾患、閉経後状態、慢性炎症性症状、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、炎症性大腸炎、クローン病、希発月経、無月経、妊娠、真性糖尿病、甲状腺機能亢進症、甲状腺障害、副甲状腺障害、クッシング病、末端肥大症、性腺機能低下症、運動不足または廃用、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、局所骨粗鬆症、骨軟化症、関節置換に関連する骨量減少、ＨＩＶ関連骨量減少、成長ホルモンの損失に関連する骨量減少、嚢胞性線維症に関連する骨量減少、化学療法関連骨量減少、腫瘍誘発性骨量減少、癌関連骨量減少、ホルモン切除の骨量減少（ｈｏｒｍｏｎｅ ａｂｌａｔｉｖｅ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ）、多発性骨髄腫、薬物誘発性骨量減少、神経性無食欲症、疾患関連顔面骨量減少、疾患関連頭蓋（ｃｒａｎｉａｌ）骨量減少、顎の疾患関連骨量減少、頭蓋（ｓｋｕｌｌ）の疾患関連骨量減少、加齢に伴う骨量減少、加齢に伴う顔面骨量減少、加齢に伴う頭蓋（ｃｒａｎｉａｌ）骨量減少、加齢に伴う顎骨量減少、加齢に伴う頭蓋（ｓｋｕｌｌ）骨量減少、および宇宙旅行に関連する骨量減少からなる群から選択される骨関連障害に罹患しているヒトに投与することができる。

【0243】

本発明の方法は、有益な生物学的応答を達成するために、骨関連障害の患者を治癒させなくてもよく、または骨関連障害の発症を完全に防がなくてもよい。本方法を予防的に使用してよく、それは骨関連障害またはその症状を完全にまたは部分的に防ぐことを意味する。また、本方法を治療的に使用して、骨関連障害またはその症状を完全にまたは部分的に軽減するか、または、骨関連障害またはその症状のさらなる進行を完全にまたは部分的に防ぎ得る。実際、本発明の材料および方法は、骨塩密度を増加させかつ増加したＢＭＤを一定期間にわたって維持するために特に有用である。この関連で、本発明は、骨関連障害の治療方法であって、（ａ）全身（例えば、頭部、体幹、腕、および脚）に関して、または臀部（例えば臀部全体および／または大腿骨頸部）、脊椎（例えば腰椎）、手関節、手指、脛骨、および／または踵で測定されるＢＭＤを、約１％、約２％、約３％、約６％、約８％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２５％、または３０％またはそれ以上、増加させるために有効な、１つ以上の量のスクレロスチン結合剤を投与することを含む方法を提供する。スクレロスチン結合剤を含む薬学的組成物の１回以上の投与は、例えば、約１か月〜約１８か月（例えば、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、約７か月、約８か月、約９か月、約１０か月、または約１１か月）の治療期間にわたって実施してよい。本方法はさらに、（ｂ）それに続く、骨塩密度を維持するために有効な１つ以上の量のスクレロスチン結合剤を投与することを含む。「骨塩密度を維持する」とは、ステップ（ａ）で得られる増加したＢＭＤがステップ（ｂ）の過程にわたって（例えば、約６か月、約９か月 約１年、約１８か月、約２年、または患者の一生の過程にわたって）、約１％〜約５％を超えて低下しないことを意味する。患者は骨密度の増加および骨密度の維持のための交互の治療段階を必要とし得ることが理解されよう。

【0244】

本明細書に記載されるように、単独で、または別の同化剤、例えば、中和抗体等のスクレロスチン阻害剤と組み合わせたＤＫＫ１阻害剤の治療上の使用は、根底にある骨量減少状態によって悪化していても、悪化していなくても骨修復を必要とするいかなる状態に有益である。必ずしも骨量減少と関連するとは限らない骨修復の特定の例には、遅延治癒または偽関節の治癒等の骨折修復が含まれる。したがって、当業者は、本明細書に記載されるある兆候が、例えば、骨粗鬆症と関連する骨量減少、または本明細書に記載される任意の他の骨量減少状態によって悪化したり、悪化しない場合があることを理解する。したがって、さらなる実施形態では、本発明の組成物は、整形外科的処置、歯周病、口腔骨量減少、歯科的処置、歯科インプラント、インプラント外科、関節置換術、骨移植術、骨美容整形、ならびに骨折治癒、脊椎固定術、インプラントの固定（例えば、臀部または膝等の関節置換術）、癒着不能の治癒、遅延した癒合の治癒、および顔の形成等の骨修復の結果を改善するのにも有用である。１つ以上の組成物は、処置、置換、移植、外科手術、もしくは修復の前、その間、および／またはその後に投与され得る。

【0245】

別の態様では、種々の疾患の治療における抗体または免疫学的に機能的な断片を含む前述の治療様式の使用が開示されている。例えば、ある方法は、関節炎、幹細胞の再生に応答する疾患、炎症性疾患、神経系疾患、眼疾患、腎疾患、肺疾患、および皮膚疾患を治療するために、本明細書に記載される有効量の抗体または免疫学的に活性な断片を、それを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの治療方法は、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、または骨関節炎を治療することを含む。ある種の抗体および断片は、（ａ）幹細胞の再生に応答し、糖尿病、慢性心不全、および筋肉の疾患からなる群から選択される疾患、（ｂ）クローン病、大腸炎、および炎症性腸疾患からなる群から選択される炎症性疾患、（ｃ）アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病からなる群から選択される神経系疾患、（ｄ）黄斑変性症および網膜症からなる群から選択される眼疾患、（ｅ）末期腎不全、慢性腎不全、糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎、およびＩｇＡネフロパシーからなる群から選択される腎疾患、（ｆ）慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、および嚢胞性線維症からなる群から選択される肺疾患、または（ｇ）腸上皮への化学療法で誘発される損傷から生じる皮膚疾患を治療するために使用される。

【0246】

スクレロスチン阻害剤、例えばスクレロスチン結合剤は、全身カルシウムレベルの最小限の変動しか伴わずに（例えば、カルシウムレベルはベースライン血清カルシウムレベルから１０％以下しか変動しない）、骨形成を促進し、かつ骨吸収を阻害する（または遅らせる）ことが示されている。したがって、本明細書に示されるＤＫＫ１阻害剤を用いて治療する可能性のあるパートナーとしてそれ自体示し、治療応答性を増加させる。

【0247】

いくつかの病気および薬物療法は、系カルシウムレベルを変化させ、それによって消極的に骨密度に影響を及ぼし、それらの組み合わせを含む本発明のそのような治療法は、これらの状態における骨量減少を治療するために有用である。高カルシウム血症および低カルシウム血症は、例えば、慢性腎疾患、腎疾患、腎不全、原発性または二次性副甲状腺機能亢進症、偽性副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、偽性副甲状腺機能低下症、マグネシウム枯渇、アルコール依存症、ビスホスホネート治療、重症高マグネシウム血症、ビタミンＤ欠乏、高リン酸血症、急性膵炎、飢餓骨症候群、キレート化、骨芽細胞転移、敗血症、外科手術、化学療法、新生物症候群、家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症（ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｏｃａｌｃｉｕｒｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉａ）、サルコイドーシス、結核、ベリリウム症、ヒストプラスマ症、カンジダ症、コクシジオイデス症、組織球症Ｘ、ホジキンもしくは非ホジキンリンパ腫、クローン病、ウェゲナー肉芽腫症、白血病、肺炎、シリコーン誘発性肉芽腫、運動不足、または薬物療法、例えばチアジド系利尿薬、リチウム、エストロゲン、フッ化物、グルコース、およびインスリン等の投与に起因し得る。さらに、血清カルシウムの変動は多数の従来の骨関連治療、例えばビスホスホネートおよび副甲状腺ホルモン治療の副作用である。カルシウム不均衡の、潜在的に生命を危うくする影響のため、低カルシウム血症または高カルシウム血症に感受性の患者は、ある種の治療選択肢を差し控える（ｆｏｒｅｇｏ）必要がある。

【0248】

したがって、本発明の材料および方法、特に組み合わせは、不安定なカルシウムレベルに感受性であるかまたはその影響を受けやすい患者の治療に有益である。本発明のこの態様の関連でヒトに投与されるスクレロスチン結合剤の量は、低カルシウム血症または高カルシウム血症（例えば臨床的に有意な低カルシウム血症または高カルシウム血症）を生じさせない量である。さらに、本発明は、低カルシウム血症または高カルシウム血症に罹患しているかまたはそのリスクに曝されているヒト、またはビスホスホネート、副甲状腺ホルモン、もしくは副甲状腺ホルモン類似体での治療が禁忌であるヒトの骨関連障害を治療する方法を提供する。本方法は、骨形成のマーカーのレベル、例えばＢＳＡＰ、Ｐ１ＮＰ、および／またはＯｓｔＣａの血清レベルを増加させ、かつ／または骨吸収のマーカー、例えばＣＴＸのレベルを減少させるために有効な量のスクレロスチン結合剤をヒトに投与することを含む。

【0249】

治療有効量の、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、および９６から選択される可変領域を含む本明細書に記載される抗体またはその免疫学的に機能的な断片（例えば、配列番号９７〜２２７および２２８からなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む抗体または免疫学的に機能的な断片）を、それを必要とする患者に投与することを含む、骨量の減少を治療または予防するための方法が、本明細書にさらに提供される。本実施形態の一態様では、患者は骨に転移する癌を患っている患者であり、別の態様では、患者は多発性骨髄腫を患っている患者である。当業者は、これらの組成物が、単独でまたは１つ以上の他の治療剤と組み合わせて、医薬品の製剤に有用であり得ることを認識するであろう。本発明の抗体は、骨関連障害の治療に好適である。骨折の治療で用いる配列番号４２および４４で示される抗体。間隙の癒合不全の治療で用いる配列番号４２および４４で示される抗体。骨折の治療で用いる阻害性スクレロスチン抗体と組み合わせる、配列番号４２および４４で示される抗体。間隙の癒合不全の治療で用いる阻害性スクレロスチン抗体と組み合わせる、配列番号４２および４４で示される抗体。「骨折」という用語は、治療を必要とする患者における１つ以上の骨折を含むことを意味することを理解される。

【0250】

本発明の組成物によって治療され得る特定の状態には、骨の成長または発達が異常である異形成が含まれる。そのような状態の代表的な例には、軟骨形成不全症、鎖骨頭蓋骨形成不全症、内軟骨腫症、線維性骨異形成症、ゴーシェ病、マルファン症候群、多発性遺伝性外骨症、神経線維腫症、骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、硬化性病変、偽関節、および化膿性骨髄炎が含まれる。

【0251】

治療または予防され得る他の状態には、骨減少症、骨粗鬆症、および骨量減少の多種多様な原因が含まれる。そのような状態の代表的な例には、歯周病、抗てんかん薬誘発性骨量減少、原発性および二次性副甲状腺機能亢進症、家族性副甲状腺機能亢進症候群、無重力誘発性骨量減少、男性の骨粗鬆症、閉経後骨量減少、骨関節炎、腎性骨異栄養症、骨の浸潤性障害、口腔骨量減少、顎の骨壊死、若年性パジェット病、メロレオストーシス、代謝性骨疾患、肥満細胞症、鎌状細胞疾患、虚血性骨疾患（レッグ・カルベ・ペルテス病、局所性移動性骨粗鬆症等）、貧血状態、ステロイドに起因する症状、糖質コルチコイド誘発性骨量減少、ヘパリン誘発性骨量減少、骨髄障害、壊血病、栄養不良、カルシウム欠乏症、突発性骨粗鬆症または骨粗鬆症、先天性骨減少症または骨減少症、アルコール依存症、慢性肝疾患、閉経後状態、慢性炎症性症状、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、炎症性大腸炎、クローン病、希発月経、無月経、妊娠、真性糖尿病、甲状腺機能亢進症、甲状腺障害、副甲状腺障害、クッシング病、先端肥大症、性腺機能低下症、運動不足または廃用、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、局所骨粗鬆症、骨軟化症、関節置換に関連する骨量減少、ＨＩＶ関連骨量減少、成長ホルモンの損失に関連する骨量減少、嚢胞性線維症に関連する骨量減少、線維性異形成、化学療法関連骨量減少、腫瘍誘発性骨量減少、癌関連骨量減少、ホルモン切除の骨量減少、多発性骨髄腫、薬物誘発性骨量減少、神経性無食欲症、疾患関連顔面骨量減少、疾患関連頭蓋骨量減少、顎の疾患関連骨量減少、頭蓋（ｓｋｕｌｌ）の疾患関連骨量減少、および宇宙旅行に関連する骨量減少が含まれる。さらなる状態は、加齢に伴う顔面骨量減少、加齢に伴う頭蓋骨量減少、加齢に伴う顎骨量減少、および加齢に伴う頭骨量減少を含む、加齢に伴う骨量減少に関する。

【0252】

ある国家管轄権に許可されるように、本明細書に開示される参考文献は、それぞれが、本発明の権限を付与し、説明することを含むあらゆる目的のために個別に組み込まれたように、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。以下の実施例は、本明細書に提供される抗体、断片、および組成物のある態様を単に説明するために提供されており、したがって請求された本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。

【実施例】

【0253】

実施例１
ヒトＤＫＫ１（ｈｕＤＫＫ１）免疫原の調製
ヒトＤＫＫ１のクローニングは、以下の修飾を用い、米国特許第６，３４４，５４１号に記載される通りに行った。ヒトＤＫＫ１の２つの異なるエピトープ標識された変形が、免疫原として使用され、１つはＦＬＡＧエピトープを含み、他方は、ｆｃ−融合分子であった。両方のエピトープタグは、当業者には明らかである標準の分子生物学技術を用いてヒトＤＫＫ１のカルボキシ末端に付加された。

【0254】

ヒトＤＫＫ１のエピトープ標識した変形を、ＣＨＯ細胞中の発現のための発現ベクターにクローン化した。ＦＬＡＧまたはＦｃエピトープのいずれかを含有するヒトＤＫＫ１変異体を、抗原として使用するために馴化培地から精製し、抗ｈｕＤＫＫ１抗体を生成した。エピトープ標識したｈｕＤＫＫ１は、濃縮馴化培地（ＣＭ）から精製した。また、当業者に公知の他のタンパク質産物および精製手順も使用することができる。

【0255】

実施例２
免疫化および力価決定
組換えＦＬＡＧ標識したヒトＤＫＫ１（ＦＬＡＧ−ＤＫＫ１）および組換えＦｃ標識したヒトＤＫＫ１（ＤＫＫ１−ｆｃ）を、抗原として使用した。ＤＫＫ１に対するモノクローナル抗体は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を連続的に免疫化することによって開発した（例えば米国特許第７，４３５，８７１号およびその中の説明を参照）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物は、全ての注射について足蹠経路によって免疫を行った。免疫化ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスからの血清中の抗ＤＫＫ抗体力価はＥＬＩＳＡにより決定した。

【0256】

実施例３
リンパ球回収、Ｂ細胞単離、融合、およびハイブリドーマの生成
リンパ節を採取し、それぞれのコホートからプールした。総流出物をＣＤ９０陰性分画（これらの細胞の大部分は、Ｂ細胞であることが期待された）として収集した。上記の洗浄された濃縮Ｂ細胞と、ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ１５８０から購入した非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１９７９，１５４８−１５５０）とを１：１に比率で混合することによって融合を行った。電気細胞融合（ＥＣＦ）は、融合発生器、モデルＥＣＭ２００１，Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを用いて実施した。使用された融合チャンバの大きさは２．０ｍＬであった。

【0257】

ＥＣＦ後、細胞懸濁液を滅菌条件下で融合チャンバから慎重に取り出して、同じ体積のハイブリドーマ培養培地（ＤＭＥＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を含む滅菌チューブに移した。細胞をインキュベートし、次いで、遠心分離した。細胞を小体積のハイブリドーマ選択培地（０．５×ＨＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９６６６）を補充したハイブリドーマ培養培地）中で再懸濁し、その体積をより多くのハイブリドーマ選択培地で適切に調整した。細胞を穏やかに混合し、９６ウェルプレートに分注し、成長させた。

【0258】

実施例４
十分に培養した後、ハイブリドーマの上清をＤＫＫ１に特異的なモノクローナル抗体についてスクリーニングした。一次スクリーニングにおいて、ＥＬＩＳＡプレートを、５０μＬ／ウェルのＦｌａｇ標識したｒｈＤＫＫ１（２μｇ／ｍＬ）で被覆し、次いで、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで、２００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、プレートを室温でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。ハイブリドーマの上清および陽性と陰性の対照のアリコート（５０μＬ／ウェル）を添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。

【0259】

インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄した。５０μＬ／ウェルの検出抗体を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで、５０μＬ／ウェルのＴＭＢを添加し、（陰性対照ウェルがやっと色を示し始めるまで）プレートを約１０分間発達させた。次いで、５０μＬ／ウェルの停止溶液を添加し、プレートを６５０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡプレートリーダー上で読んだ。カットオフ値ＯＤは、陰性対照の２倍を超えるＯＤで設定された。

【0260】

一次スクリーニングに基づいて陽性ハイブリドーマ細胞増殖ウェルからの古い培養懸濁液を完全に除去し、ＤＫＫ１陽性ハイブリドーマ細胞を新鮮なハイブリドーマ培養培地で懸濁し、２４ウェルプレートに移した。２日後、一次スクリーニングの陽性ハイブリドーマを（上記のように）Ｆｌａｇ標識したｒｈＤＫＫ１を被覆ＥＬＩＳＡおよびＦｌａｇ標識した無関連抗原を被覆ＥＬＩＳＡで確認した二次確認スクリーニングを行った。ＩｇＧおよびＩｇカッパまたはＩｇＧおよびＩｇラムダまたはＩｇＧおよびＩｇカッパに加えてラムダの両方に関して完全にヒト組成であることを示すために、抗原を被覆ＥＬＩＳＡのための三組の検出系（一組がｈＩｇＧ検出のため、一組がヒトＩｇカッパ軽鎖検出のため、もう一組がヒトラムダ軽鎖検出のため）。ｈＩｇＧ検出のみが、無関連抗原を被覆ＥＬＩＳＡのために使用された。三組の抗原を被覆ＥＬＩＳＡの手順は、３つの異なる検出抗体を別々に使用した以外は、上記載と同じである。最終選択は、抗原における陽性シグナルおよび無関連抗原における陰性シグナルに基づいた。

【0261】

生成したヒトＩｇＧ／カッパまたはＩｇＧ／ラムダＤＫＫ１特異的モノクローナル抗体を表２に詳述する。

【表2】

【0262】

機能的関心の対象であると見なされる抗体を分泌するハイブリドーマは、限界希釈法によって単細胞クローン化された。ＤＫＫ１抗体に対する単細胞クローン化したハイブリドーマのスクリーニングが上記のようにＥＬＩＳＡによって実施された。ハイブリドーマクローンを、ハイブリドーマ培養培地中で培養し、分泌したモノクローナル抗体を含有する消耗した培養上清を生成するために標準的な組織培養技術を用いて拡大した。また、ハイブリドーマクローンの冷凍ストックも生成した。

【0263】

実施例５
生物活性によるヒトＤＫＫ１への中和抗体を生成するハイブリドーマの選択
実施例２に記載されるように得られたハイブリドーマを、ルシフェラーゼ発現が標準Ｗｎｔ経路の制御下にあるＴＣＦ／ｌｅｆルシフェラーゼレポーター構築体を利用して試験した。この構築体により形質移入された細胞が、生物学的に活性なＷｎｔに曝露された場合、ルシフェラーゼ活性が誘導される。Ｗｎｔ誘導ルシフェラーゼ活性は、この構築体を含有する細胞に組換えＤＫＫ１タンパク質を添加することによって抑制することができる。本実験に関して、Ｗｎｔ３ａおよびＤＫＫ１の両方を最初に、Ｗｎｔ依存ルシフェラーゼ発現の約８０％を抑制する最適化量で細胞に添加した。中和活性のある抗ＤＫＫ１抗体のこれらの同じ細胞へのさらなる添加は、Ｗｎｔ活性を再生させ、したがって、ルシフェラーゼ発現を増加させることが予想される。Ｗｎｔ／ルシフェラーゼ構築体でトランスフェクトされた細胞中のルシフェラーゼ発現を再生することが可能であるかどうかを判定するために、ハイブリドーマの上清を試験した。ルシフェラーゼ活性は、下記のように定量化した。

【0264】

０日目に、新鮮にトリプシン化した２９３Ｔ細胞を、フィブロネクチンを被覆９６ウェルプレート上に平板培養した。次いで、細胞を、ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡおよびウミシイタケルシフェラーゼをコードするＤＮＡで同時トランスフェクトした。１日目のそれぞれのウェルで、３０μＬのＤＭＥＭ中のＴＣＦ／ｌｅｆルシフェラーゼＤＮＡおよび１ｎｇのウミシイタケルシフェラーゼＤＮＡを、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ ３０１１０７）と混合し、ＰｏｌｙＦｅｃｔ−ＤＮＡ複合体を形成させるために室温で１０分間インキュベートした。このインキュベーション後、１００μＬの増殖培地をこの複合体に添加した。次いで、培養培地をそれぞれウェルから取り出し、増殖培地中の複合体をウェルに添加した。ウェル中の増殖培地を３時間後に取り出し、Ｗｎｔ３ａを含有する馴化培地、組換えヒトＤＫＫ１および抗ＤＫＫ１ハイブリドーマの馴化培地と置き換えた。

【0265】

３日後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、それぞれのウェルに受動溶解用緩衝液を添加した。プレートを室温で２０分間振とうして、細胞溶解を生じさせた。１アッセイ当たり１０μＬの溶解液を用いて、製造元のプロトコルに従って９６ウェル白色プレート中でアッセイを実施した。ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼからの発光シグナルを両方とも記録し、これらのシグナルの比率を用いて、ＥＣ５０を決定し、用量応答曲線をプロットした。最初に、ホタルルシフェラーゼの基質を細胞溶解液の入ったウェルに注入し、発光シグナルを記録し、次いで、ウミシイタケルシフェラーゼの基質を同じウェルに注入し、得られた第２の発光シグナルを記録した。

【0266】

中和活性を有する抗ＤＫＫ１抗体を単離するためにさらなるスクリーニングとして、マウス骨髄由来のストロマ細胞株ＳＴ２を使用した。Ｗｎｔ３ａシグナル伝達に応答して、ＳＴ２細胞は、骨芽細胞マーカータンパク質アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を発現する骨芽細胞に分化する。これらの細胞中のＷｎｔ３ａによるＡＬＰの誘導は、Ｗｎｔ阻害剤ＤＫＫ１を培養培地に添加することによって阻止することができる。ＡＬＰ発現は、中和抗ＤＫＫ１抗体等のＤＫＫ１活性を中和することが可能な薬剤に細胞を曝露することによってこれらの条件下で再生することができる。

【0267】

簡潔に言えば、のハイブリドーマをＥＬＩＳＡアッセイにおいてスクリーニングし、ＥＬＩＳＡアッセイにおける３４４の結合ＤＫＫ１、および中和化アッセイ（ＴＣＲ／ｌｅｆレポーターアッセイまたはＳＴ２細胞アッセイ）のうちの１つまたは両方において２５が陽性であった。３つの運動のそれぞれから最良の活性を示すハイブリドーマを表３に示す。これらの抗体の細胞活動から見ることができるように、第２（５．Ｘ．ｘ）および第３（６．Ｘ．ｘ）の活動から由来するもの、即ち、ＫＬマウスにおいて生じるものは、一般に、Ｘｅｎｏマウスを用いた第１の（２．Ｘ．ｘ）運動において生じるものよりも低いＥＣ５０から明白であるように、より良好な細胞ベースの活動を示した。

【表3】

【0268】

実施例６
抗体のクローニングおよび配列分析
総ＲＮＡは、抗ＤＫＫ１ハイブリドーマ細胞株から調製された。ＤＮＡ配列は、Ａｂｇｅｎｉｘによって提供されたか、またはクローン化したＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）ＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）産物の配列決定によって得られた。

【0269】

実施例７
ＣＨＯ細胞中のヒト抗ｈｕＤＫＫ１抗体の発現および精製
抗ＤＫＫ１細胞株を、標準的な電気穿孔法の手順を用いて、発現プラスミドｐＤＣ３２３−抗ＤＫＫ１カッパ、ならびに２．４０．３、６．３５．５、６．１１６．６のＨＣ−ＩｇＧ２およびＬＣ−カッパのｐＤＣ３２４［抗ＤＫＫ１−ＩｇＧ２］と共にＣＨＯ宿主細胞をトランスフェクトすることによって創出した。発現プラスミドと共に宿主細胞株をトランスフェクトした後、プラスミドの選択および細胞の回収を可能するために、細胞を、４％ 透析したウシ胎仔血清（ｄｓまたはｄｆＦＢＳ）を含有する−ＧＨＴ選択培地中で２〜３週間生育させた。次いで、血清を培地から除去し、細胞をＧＨＴ選択培地中で、＞８５％生存率に達するまで生育させた。次いで、このトランスフェクトされた細胞プールを、高度発現細胞に対して選択するために、［１５０−３００］ｎＭ ＭＴＸを含有する培地中で培養し、続いて、５００−１０００ｎＭ ＭＴＸを含有する培地中で培養した。

【0270】

細胞株を発現する抗ｈｕＤＫＫ１−１抗体を、無菌細胞培養技術を用いて拡大した。拡大時、細胞を生物反応器に接種し、必要に応じて培養液を供給した。回収時、細胞を遠心分離し、馴化培地を濾過した。ヒト抗ｈｕＤＫＫ１抗体を、プロテインＡセファロース上の馴化培地から精製した。精製したＤＫＫ１抗体は、最適な緩衝液に緩衝液交換した。

【0271】

実施例８
ＥＬＩＳＡベースの交差遮断アッセイ
本実施例において使用される液体体積は、９６ウェルプレート ＥＬＩＳＡ（例えば、５０〜２００ｕＬ／ウェル）において一般的に使用されるものであった。本実施例では、Ａｂ−ＸおよびＡｂ−Ｙは、約１４５Ｋｄの分子量を有し、１抗体分子当たり２つのＤＫＫ１結合部位を有することが想定された。抗ＤＫＫ１抗体（Ａｂ−Ｘ）を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に少なくとも１時間被覆した（例えば、５０ｕＬの１ｕｇ／ｍＬ）。このコーティングステップ後、抗体溶液を除去し、プレートを洗浄溶液で洗浄し、次いで、当該技術分野で公知の適切なブロッキング溶液および手順を用いて遮断した。ブロッキング溶液をＥＬＩＳＡプレートから除去し、被覆抗体を交差遮断する能力について試験した第２の抗ＤＫＫ１抗体（Ａｂ−Ｙ）を、ＥＬＩＳＡプレートの適切なウェルにブロッキング溶液中で過剰に添加した（例えば、５０ｕＬの１０ｕｇ／ｍＬ）。

【0272】

この後、ブロッキング溶液中の制限された量（例えば、５０ｕＬの１０ｕｇ／ｍＬ）のｈｕＤＫＫ１を、適切なウェルに添加し、プレートを攪拌しながら室温で少なくとも１時間インキュベートし、次いで、プレートを洗浄した。ブロッキング溶液中の適切な量のＤＫＫ１検出試薬をＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で少なくとも１時間インキュベートした。

【0273】

次いで、プレートを洗浄溶液で洗浄し、適切な試薬で発達させた。このアッセイのバックグラウンドシグナルは、被覆抗体（この場合はＡｂ−Ｘ）、第２の溶液相抗体（この場合はＡｂ−Ｙ）、ＤＫＫ１緩衝液のみ（即ち、ＤＫＫ１なし）、およびＤＫＫ１検出試薬を有するウェルにおいて得られるシグナルとして定義された。このアッセイの陽性対照シグナルは、被覆抗体（この場合はＡｂ−Ｘ）、第２の溶液相抗体緩衝液のみ（即ち、第２の溶液相抗体なし）、ＤＫＫ１、およびＤＫＫ１検出試薬を有するウェルにおいて得られるシグナルとして定義された。ＥＬＩＳＡアッセイは、バックグラウンドシグナルの少なくとも６倍である陽性対照シグナルを有するためにそのような様式で実行する必要がある。

【0274】

Ａｂ−ＸおよびＡｂ−Ｙは、形式１または形式２のいずれかで、溶液相抗ＤＫＫ１抗体が、溶液相抗ＤＫＫ１抗体（即ち、陽性対照ウェル）の不在下で得られたＤＫＫ１検出シグナルと比較して、ＤＫＫ１検出シグナル（即ち、被覆抗体によって結合されるＤＫＫ１の量）の、６０％〜１００％、具体的には、７０％〜１００％、より具体的には、８０％〜１００％の減少を生じることができる場合、交差遮断すると定義される。「交差遮断する（ｃｒｏｓｓ ｂｌｏｃｋ）」という用語は、試験分子の結合の完全な阻害を包含することを意図するのではなく、むしろ、本明細書に記載される、１００％未満の一連の結合の減少を含み得ることが当業者によって理解されよう。一例では、単離された抗体またはその断片は、配列番号４２および４４に示される抗体の結合を交差遮断する、および／または配列番号４２および４４に示される抗体によるヒトＤＫＫ１への結合から交差遮断される。配列番号４２および４４に示される抗体の結合によってヒトＤＫＫ１への結合が交差遮断される抗体には、ヒトＤＫＫ１への結合の６０％減少、ヒトＤＫＫ１への結合の７０％減少、ヒトＤＫＫ１への結合の８０％減少、ヒトＤＫＫ１への結合の９０％減少、またはヒトＤＫＫ１への結合の９５％減少を有するものが含まれる。配列番号４２および４４に示される抗体の結合によってヒトＤＫＫ１への結合を交差遮断する抗体には、ヒトＤＫＫ１への結合の６０％でその結合を減少、ヒトＤＫＫ１への結合の７０％減少、ヒトＤＫＫ１への結合の８０％減少、ヒトＤＫＫ１への結合の９０％減少、またはヒトＤＫＫ１への結合の９５％減少させるものが含まれる。互いに交差遮断することができた抗体は、本明細書では同じビンにあると称される。

【0275】

Ｎ末端Ｈｉｓ標識したＤＫＫ１（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ；２００５ カタログ番号１４０６−ＳＴ−０２５）等のＤＫＫ１の標識した変形がＥＬＩＳＡにおいて使用されるという場合には、適切なタイプのＤＫＫ１検出試薬がＨＲＰ標識した抗Ｈｉｓ抗体を含む。Ｎ末端Ｈｉｓ標識したＤＫＫ１の使用に加えて、Ｃ末端Ｈｉｓ標識したＤＫＫ１を使用してもよい。さらに、当該技術分野で公知の様々な他の標識および標識結合タンパク質の組み合わせを、このＥＬＩＳＡベースの交差遮断アッセイに使用してもよい（例えば、抗ＨＡ抗体によるＨＡ標識；抗ＦＬＡＧ抗体によるＦＬＡＧ標識；ストレプトアビジンによるビオチン標識）。

【0276】

本明細書に記載されるヒト抗ｈｕＤＫＫ１中和抗体は、抗体が互いに交差遮断することができないことにより明らかであるように、２つの異なるエピトープを認識する。第１のエピトープは、前述される１１Ｈ１０と称される（米国特許第７，７０９，６１１号）。第２のエピトープは、以下に記載され、５．２５．１（配列番号４２および４４）と称される。

【0277】

実施例９
５．２５．１抗体に結合するヒトＤＫＫ１エピトープの特徴付け
ヒトＤＫＫ１は、Ｎ末端近傍およびＣ末端の端部に位置する２つのジスルフィドリッチドメインを含有し、本明細書では、Ｎ末端およびＣ末端ジスルフィドドメインと称される。Ｎ末端ジスルフィドドメイン（以後、「ジスルフィドドメイン１」または「Ｄ１」）は、５５のアミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸８５〜１３９）を含有し、１０個のシステインを有して、５つの分子内ジスルフィド結合を形成する。Ｃ末端ジスルフィドドメイン（以後、「ジスルフィドドメイン２」または「Ｄ２」）は、７５のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸１８９〜２６３）を含有し、１０個のシステインを含有して、５つの分子内ジスルフィド結合も形成する。これらの２つのジスルフィドドメインは、約５０のアミノ酸の伸長によって分離される。ＤＫＫ１のジスルフィドドメイン２（Ｄ２）は、カノニカル補リパーゼ折り畳み体と同様の分子構造を有することが提案されており、その結晶構造は、ブタ補リパーゼを用いて決定されている（Ａｒａｖｉｎｄ，Ａ．ａｎｄ Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：Ｒ４７７−４７９（１９９８））。ＤＫＫ分子のＮ末端Ｄ１ドメイン中の１０個のシステイン残基間で分子内ジスルフィド結合は、最近、決定されている。

【0278】

還元剤を用いた処置が５．２５．１に結合するＤＫＫ１の能力を無効にし、したがって、この抗体によって標的とされたエピトープが高次構造的（または不連続）であり、Ｄ１およびＤ２ドメイン中の無傷ジスルフィド結合の維持を必要とすることが示された。この高次構造的エピトープを特徴付けるために、臭化シアン（ＣＮＢｒ）および数種の異なるプロテアーゼによるヒトＤＫＫ１の断片化を含んだ戦略が適用され、次いで、断片を分析し、抗体に結合する能力について試験した。また、抗体結合によるタンパク質分解から保護されるこれらのアミノ酸残基または配列領域を検出するために、５．２５．１の存在下で消化も実施された。得られたデータは、エピトープの位置が決定されることを可能にした。要するに、抗体５．２５．１の不在または存在下で、ＤＫＫ１タンパク質分解消化を行い、次いで、ＨＰＬＣペプチドマッピングに供した。抗体に曝露させた試料中のＨＰＬＣピークの高さの部分的もしくは完全な減少および／または新しく生成したピークの検出が観察され得る。

【0279】

それぞれのペプチド消化後、反応産物をＨＰＬＣによって分離し、個々のピークを採取し、ペプチドを同定し、Ｎ末端配列決定によってマップ化した。ペプチドが５．２５．１に結合するかどうかを判定するために、結合のためのバイオセンサーとしてＨｕＤＫＫ１により共有結合したセンサーグラム表面を用いてＢｉａＣｏｒｅワークステーションによるリアルタイムの生体特異的相互作用アッセイに供した。ＨＰＬＣペプチドマッピングは、標準条件下で実施された。

【0280】

ＣＮＢｒ消化
ｈＤＫＫ１のＣＮＢｒ開裂により、２つの大型断片が生成した。これらは、ＣＮＢｒ１およびＣＮＢｒ２であり、これらはそれぞれ、Ｄ２およびＤ１ジスルフィドドメインを表した。ＣＮＢｒ１は、５つのジスルフィド結合により一緒に保持された２つのペプチド（配列番号２のアミノ酸１７９〜２０６および配列番号２のアミノ酸２０７〜２６６［または２７４（さらなるＣ末端ｆｌａｇペプチドを含む場合）］）からなった。同様に、ＣＮＢｒ２は、２つのペプチド（配列番号２のアミノ酸３２〜１２２および配列番号２のアミノ酸１２７〜１７８）からなり、５つのジスルフィド結合により一緒に保持された（表４）。ＢｉａＣｏｒｅ分析の結果は、５．２５．１がＣＮＢｒ２には有意に結合することができたが、ＣＮＢｒ１には全く結合しないことが示された。したがって、５．２５．１は、ＨｕＤＫＫ１のＤ１ジスルフィドドメインに位置したエピトープ領域に結合することが結論付けられた。

【0281】

トリプシン消化
次に、ヒトＤＫＫ１を、ＡＲＧおよびＬＹＳ残基の後で開裂するトリプシンで消化した。０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬで約２００μｇのＤＫＫ１を、８μｇのこれらのプロテアーゼの１つまたは他のものと共に３７℃で２０時間ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中でインキュベートし、ＤＫＫ１の完全消化を達成した。

【0282】

トリプシン消化物のＨＰＬＣクロマトグラフィーにより、複数のピークが生じ、これらを回収し、乾燥させ、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２に再構成した。表４は、ＣＮＢｒ開裂およびタンパク質分解に由来するＮ末端ジスルフィドドメインＤ１を含有するＤＫＫ１のペプチド断片を示す。

【表4】

【0283】

配列分析は、トリプシン消化後のＨＰＬＣから回収されたペプチドピークにおいて行われた。ジスルフィド結合のないペプチド配列を含有するペプチドピークはまた、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によっても確認された。複数のジスルフィド結合したペプチドを含有する断片の分子量は、マトリックス支援レーザー脱離質量分光分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって確認された。２つのピーク、Ｔ２（内径１ｍｍのカラムを用いて保持時間４０．７分、または２．１ｍｍのカラムを用いて４３．５分）およびＴ３（内径１ｍｍのカラムを用いて保持時間４１．９分、または２．１ｍｍのカラムを用いて４４．７分）が、ジスルフィドドメイン１にマッピングされる配列を含有することが確認され、一方、Ｔ１ペプチド（１ｍｍのＣ１８カラムにおいて保持時間３５分または２．１のＣ４カラムにおいて３６．５分）は、ジスルフィドドメインＤ２にマッピングされた。ＢｉａＣｏｒｅ結合実験によって試験されたとき、Ｔ１、Ｔ２、およびＴ３のいずれも５．２５．１に結合しなかった。Ｔ２およびＴ３は、配列番号２のアミノ酸７４〜１０２、１０３〜１１５、１２１〜１２３、１２４〜１３４、１３５〜１４７を有するＤ１ドメイン中の５つのジスルフィド結合によって一緒に保持された５つの小型ペプチド（３から１３アミノ酸長）からなる大型ペプチド断片である（表４）。ジスルフィドドメイン１で配列の１つの小型セグメントが、Ｔ２およびＴ３から欠落していた。全てのＬｙｓおよびＡｒｇを含有するこの欠落配列は、配列番号２のアミノ酸１１６〜１２０（ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＡＲＧの配列）であった。

【0284】

ヒトＤＫＫ１はまた、ＰＢＳ緩衝液中の１：１〜１：３のモル比で５．２５．１を用いて室温で１時間インキュベートした。次いで、ＤＫＫ１／抗体複合体のアリコートは、上記のような条件下で、トリプシンによって消化された。トリプシン消化のＨＰＬＣペプチドマッピングプロファイルは、Ｔ２およびＴ３のピークが消失し、新しいピークＴ４（１ｍｍのカラムを用いて保持時間４１．３分または内径２．１ｍｍのカラムを用いて４４．３分）が検出可能であったことを除いては、抗体５．２５．１の不在下でＤＫＫ１消化から得られたものと完全に同一であった。Ｔ４はまた、Ｎ末端ドメインＤ１ペプチドであるだけでなく、配列番号２のアミノ酸７４〜１４７を有する単一アミノ酸配列も含有する（表４）。Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイでは、Ｔ４は、５．２５．１に結合し、センサーチップ表面に結合したＤＫＫ１を用いた５．２５．１結合のために競争させることができる。

【0285】

ＡｓｐＮ消化
５．２５．１結合エピトープをさらに描写するために、ＨｕＤＫＫ１は、プロテアーゼＡｓｐＮで消化し、得られた断片を上述のように分析した。ＡｓｐＮ消化により生成した主要なＨＰＬＣピークのうち、抗体５．２５．１に結合したピークは、ＡｓｐＮ１、ＡｓｐＮ２、およびＡｓｐＮ３であった。配列分析により、ＡｓｐＮ１およびＡｓｐＮ２がジスルフィドドメインＤ１に由来することが示された。ＡｓｐＮ１およびＡｓｐＮ２は、アミノ酸配列が同一であり、それらのそれぞれが、ジスルフィドドメインＤ１における５つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのペプチドからなった。これらの２つのペプチドは、配列番号２のアミノ酸７８〜１０４および１０５〜１４１からなった（表４を参照）。ＡｓｐＮ３は、配列がドメインＤ１およびＤ２配列の両方を含有する部分的消化産物である。２つの他のピーク、ＡｓｐＮ４およびＡｓｐＮ５はまた、単離され、ドメインＤ２においてジスルフィド結合したペプチドであることが確認され、ＡｓｐＮ４またはＡｓｐＮ５は、５．２５．１結合のためにはＤＫＫ１と競合しない。

【0286】

消化結果の分析
上記の結果により、５．２５．１は、ジスルフィドドメインＤ１に位置しているヒトＤＫＫ１の非線形エピトープに結合することを示す。図１に示されるように、エピトープ領域は、以下に記載される観察により推定される。

【0287】

トリプシン開裂（図１中の１０２位でＲおよび１１５位〜１２０位でＲＫＲＲＫＲおよび１３４位でＫ）は、ジスルフィドによって結合される５つのペプチドを生成する。このＤ１ドメインのトリプシンペプチドの分画は、５．２５．１結合活性を失う。

【0288】

抗体５．２５．１は、ＤＫＫ１に結合し、トリプシンタンパク質分解からＤ１ドメインにおける全ての開裂部位（９９位でＲおよび１１５位〜１２０位でＲＫＲＲＫＲおよび１３４位でＫ）を保護することができる。異なる保持時間で回収して得られたＤ１のトリプシン断片は、単一のポリペプチド鎖であり、Ｄ１中の全てのＡｒｇおよびＬｙｓの部位でタンパク質分解から保護され、したがって、エピトープ領域で近傍に位置するか、またはエピトープ結合に含まれる。結合活性は、ＡｓｐＮまたはＣＮＢｒ開裂を生じたＤ１断片中で維持される。結合活性を維持するために、Ｄ１ドメインにおける観察された最小の断片サイズは、Ａｓｐ−Ｎが１０５位でＧｌｙ１０５からＡｓｐの間のペプチド結合を切り取り、一緒に接続しないようにこの大型ジスルフィドループ（Ｃｙｓ９７からＣｙｓ１１１の間で形成された）を離すことを除いては、アミノ酸７８〜１４１である。

【0289】

アミノ酸１２３〜１２６（ＡＲＧ−ＨＩＳ−ＡＬＡ−ＭＥＴの配列）の除去のためのＣＮＢｒ開裂およびＧｌｙ１１４−Ａｓｐ１１５ペプチド結合のＡｓｐＮ開裂は、５．２５．１結合からのＣＮＢｒ２およびＡｓｐＮ１（またはＡｓｐＮ２）断片に影響を及ぼさず、したがって、これらの領域における配列は、エピトープ中にはない。Ｄ１中の高度に負荷電した領域（アミノ酸８３〜９１）は、Ａｂの不在下でＧｌｕＣおよびＡｓｐＮ消化に対して耐性があり、この領域がタンパク質分解に利用しにくく（立体障害によるものであり得）、５．２５．１にも利用できないことを示す。

【0290】

要約すると、５．２５．１結合のためにＨｕＤＫＫ１に存在するエピトープは、Ｎ末端ジスルフィドドメインＤ１：配列番号２のアミノ酸９８〜１０４、１０７〜１２１、および１２９〜１４０で不連続な配列を含む。そして、Ｄ１ドメインのジスルフィド結合は、５．２５．１が結合するために正確な配座および三次元構造を保有するように、元の状態のままでなければならない。

【0291】

実施例１０
ＤＫＫ１に対するモノクローナル抗体の結合親和性
ＢｉａＣｏｒｅ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてヒト抗ｈｕＤＫＫ１抗体のＤＫＫ１への結合を試験するために分析が実施された。ＢｉａＣｏｒｅにより、選択した抗体のｋｄの測定が可能であった。より低いｋｄを有する抗体は、より高いｋｄを有するものよりも長くｈＤＫＫ１と結合するためより望ましく、したがって、より大きな応答を生じさせる可能性が高い。結合のセンサーグラムを分析し、データを以下に要約する。

【表5】

【0292】

オフ速度に加えて、ｋａ（オン速度）、ＫＤ（親和性）、細胞系およびインビボ活性等の他のパラメータはまた、治療薬の全体の選択に影響を及ぼす要因である。表５中のデータはまた、ＫＬマウスの後の免疫化に由来するこれらの抗体が、より望ましいＫｄを有する抗体を産出したことも示した。ｈｕＤｋｋ４への結合はまた、特異性を決定するために、いくつかの抗体について試験され、ヒト抗ｈｕＤＫＫ１抗体が、Ｄｋｋ４に対してよりもＤＫＫ１に対して少なくとも５０倍の特異性の増加を有したと判断し、これは５．２５．１および５．３２．１がＤｋｋ４への検出可能な結合がないことを示した。

【0293】

興味深いことに、１１Ｈ１０および５．２５．１ビンの両方で抗体を含んだ第２の活動抗体のＢｉａＣｏｒｅ分析から生じたセンサーグラムが分析されたとき、ビン間で差異が存在することは明らかであった。所与の抗体濃度で１１Ｈ１０ビンからの抗体は、５．２５．１ビンからの抗体で得たものよりも高い結合シグナルを得た。増加した最大シグナルは、１１Ｈ１０ビン抗体（２．４０．２および５．８０．２および５．８０．３）から観察される。

【0294】

ヒト抗ｈｕＤＫＫ１抗体が、ＤＫＫ１に対する親和性において変化し、ヒトＤＫＫ１に対するこれらのいくつかの親和性がＢｉａＣｏｒｅアッセイの感度限界を超えたことが、ＢｉａＣｏｒｅの結果から明らかであった。したがって、ＤＫＫ１に対するこれらの抗体のいくつかの親和性を、より高感度のＫｉｎＥｘＡ（商標）３０００を用いて平衡結合分析によってさらに評価した。これらの測定では、Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ ６×ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、ヒト、カニクイザル、またはマウスＤＫＫ１で予め被覆し、ＢＳＡにより遮断した。１００ｐＭ、３００ｐＭ、または１０００ｐＭの抗体を、ヒト、マウス、またはサルＤＫＫ１の１ｐＭから５０ｎＭまでの濃度範囲の種々の濃度で混合し、室温で８時間平衡化した。次いで、この混合物を、ＤＫＫ１被覆ビーズ上に通過させた。ビーズ結合抗ＤＫＫ１抗体量を、蛍光タグで標識されたヤギ抗ヒト−ＩｇＧ抗体（Ｃｙ５；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いて定量化した。測定された蛍光シグナル量は、平衡でのそれぞれの反応混合物中の遊離抗ＤＫＫ１抗体の濃度に比例した。解離平衡定数（Ｋｄ）は、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを用いてデュアル曲線ワンサイト相同モデルを用いて競合曲線の非線形回帰式から得られた。選択した抗体に対するＫｉｎＥｘＡアッセイの結果を表６に示す。

【表6】

【0295】

実施例１１
１１Ｈ１０ビン抗体のみが、ｈｕＤＫＫ１のＬＲＰ６およびＫｒｅｍｉｎ２への結合を遮断する
ＤＫＫ１のＷｎｔ共受容体ＬＲＰ６またはＫｒｅｍｉｎ２への結合を遮断するための１１Ｈ１０ビンおよび５．２５．１ビン抗体の能力を、共免疫沈降法を用いて調べた。組換えマウスＬＲＰ６−ＨｉｓおよびｒｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇまたは組換えヒトクレメン２−ｈｉｓおよびｈＤＫＫ１−ｆｌａｇは、一晩振とうしながら、ハンクス平衡塩類溶液中の抗ＤＫＫ１抗体を用いて、または用いないで予めインキュベートし、複合体形成を可能にした。

【0296】

図２Ａでは、ｒｈＤＫＫ１−ｆｌａｇを、ＬＲＰ６−Ｈｉｓおよび５μｇの、１１Ｈ１０ビン（５．８０．１、６．３７．５、もしくはｒ１１Ｈ１０）または５．２５．１ビン（５．２５．１、５．７７．１）のいずれかからの中和ＤＫＫ１抗体のうちの１つでインキュベートした。この混合物を、ｈｉｓ標識ＬＲＰ６と結合し、関連したＤＫＫ１を破壊する抗ｈｉｓ抗体で免疫沈降した。次いで、免疫沈降物を、ｒｈＤＫＫ１を認識した抗ｆｌａｇ抗体を用いてウエスタンブロット分析に供した。このようにして、溶液中のＬＲＰ６と関連したＤＫＫ１およびＤＫＫ１のＬＲＰ６への結合と競合する中和ＤＫＫ１抗体の能力、およびＬＲＰ５に対する推測によって、測定され得た。レーン１のみにＬＲＰ６−Ｈｉｓが含まれる；レーン２ ｒｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ；レーン３ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ；レーン４ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５．８０．１；レーン５ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋６．３７．５；レーン６ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋ｒ１１Ｈ１０；レーン７ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５．２５．１；レーン８ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５．７７．１。このデータは、５．２５．１ビン抗体以外の全て３つの１１Ｈ１０ビン抗体が、ＤＫＫ１のＬＲＰ６への相互作用を遮断することができることを示した。

【0297】

同様の方法では、ＤＫＫ１のＫｒｅｍｉｎ２への結合を遮断する同じ前述の抗体の能力、およびＫｒｅｍｉｎ１に対する推測により決定された（図２Ｂ）。レーン１のみにＬＲＰ６−Ｈｉｓが含まれる；レーン２ ｒｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ；レーン３ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ；レーン４ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋０．５μｇ ５．８０．１；レーン５ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５μｇ ５．８０．１；レーン６ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋０．５μｇ ６．３７．５；レーン７ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５μｇ ６．３７．５；レーン８ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋０．５μｇ ｒ１１Ｈ１０；レーン９ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５μｇ ｒ１１Ｈ１０；レーン１０ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５μｇ ５．２５．１；レーン１１ ｈＬＲＰ６−Ｈｉｓ＋ｈＤＫＫ１−Ｆｌａｇ＋５μｇ ５．７７．１。

【0298】

このデータは、５．２５．１ビン抗体以外の全て３つの１１Ｈ１０ビン抗体が、ＤＫＫ１のＫｒｅｍｉｎ２への相互作用を遮断することができることを示した。本実験で示されたデータは、２つの異なる抗体ビンがＷｎｔシグナル伝達におけるＤＫＫ１活性を中和する能力において異なる作用機構を示すことを示唆している。

【0299】

実施例１２
選択した抗体のインビボ活性
マウス動物モデルにおけるＤＫＫ１の中和が、骨塩密度（ＢＭＤ）および骨形成マーカー血清オステオカルシンの増加をもたらすかどうかを判定するために、実験を行った。試験した抗体は、２．４０．２、５．３２．５、５．８０、６．３７．５、６．１１６．６であり、上述のように精製した。

【0300】

第１の実験では、４週齢の雄ＢＤＦ−１マウス（ＡＰＲ ２３３７５７，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、精製された２．４０．２モノクローナル抗体の３つの用量（５、１０、または２０ｍｇ／ｋｇ）のうちの１つを用いて週間にわたって皮下注入した。１群につき５匹のマウスを使用した。陰性対照マウスは、ビヒクル（ＰＢＳ）を注入し、陽性対照マウスは、これらのマウスにおける骨密度の増加を刺激することが知られている（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １４（６）：６９０−７０９（１９９３））副甲状腺ホルモン（アミノ酸１〜３４）を注入した。１注入につき１００μｇ／ｋｇのＰＴＨ（１−３４）を使用した。３週間での脛骨の骨塩密度の変化の割合に対する結果を図３に示す。

【0301】

２つの異なる抗体ビンのインビボ有効性を比較するために、代表的な抗体をそれぞれのビンから選択した。選択した抗体は、５．２５．１ビンから５．３２．１であり、１１Ｈ１０ビンから５．８０．１であった。これらの抗体の両方が、類似の親和性を有するマウスＤＫＫ１に結合した。８週齢の雄ＢＤＦ−１マウス（ＡＰＲ ２３３７５７，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、精製されたモノクローナル抗体の３つの用量（３、１０、または３０ｍｇ／ｋｇ）のうちの１つを用いて２週間にわたって皮下注入した。１群につき６匹のマウスを使用した。陰性対照マウスは、ビヒクル（ＰＢＳ）を注入した。このデータは、腰椎部の骨塩密度における基準からの変化の割合として図４に表され、１１Ｈ１０ビン抗体（５．８０．１）が５．２５．１ビン抗体（５．３２．１）よりも優れた骨形成活性を示すことを示す。

【0302】

別の実験では、１１Ｈ１０ビンからの２つのさらなる抗体を、８週齢の雄ＢＤＦ−１マウスに注入した。これらのマウスは、１週間に２回、３週間、２５ｍｇ／ｋｇのそれぞれの抗体（６．３７．５および６．１１６．６）を皮下注入した。１群につき１０匹のマウスを使用した。対照群は、ビヒクル（１週間に２回）またはＰＴＨ（１００μｇ／ｋｇを１週間に５回）を注入した。このデータは、腰椎部の骨塩密度における基準からの変化の割合として図５に表され、これらの抗体がＰＴＨと同様の程度での骨密度を増加したことを示した。

【0303】

さらなる研究は、閉鎖骨折治癒ラットモデルにおいてラット１１Ｈ１０ビン抗体を用いて行われた。完全ラット１１Ｈ１０ビン抗体ｒ１１Ｈ１０は、本明細書に記載される完全ヒト抗体に対するサロゲート分子として、本研究に使用された。本研究の長さは、ヒト抗体に対する齧歯類の免疫応答により完全ヒトＤＫＫ１抗体の使用を除外した。簡潔に述べると、閉鎖骨折は、７〜７．５月齢の雄ラットの大腿骨に生じた（実施例１４の手法を参照）。大腿骨を、骨折前の大腿骨の骨髄空間に微細針（１８Ｇ）の挿入によって安定化した。次いで、動物をビヒクルまたはｒ１１Ｈ１０（１週間に２回、２５ｍｇ／ｋｇ）により処置した。骨折は７週間で治癒された。本研究の完了後、骨折した大腿骨は、骨塩密度、生体力学的強度、およびブリッジについて分析した。抗ＤＫＫ１で処置した動物は、全てのこれらのパラメータの有意な改善を示し、これは抗ＤＫＫ１療法が骨折および骨再生を必要とする他の兆候の治癒の処置に有用であることを示す。図６は、最大負荷およびＢＭＤの改善が、骨折仮骨での抗ＤＫＫ１処置で達成され、これは骨折の治癒の加速を示す。

【0304】

実施例１３
ヒトおよび動物モデルの血清および組織試料中のＤＫＫ１の検出
本明細書に記載される抗体を用いて、血清が含まれるが、これに限定されないヒト試料中のＤＫＫ１レベルを検出する。このタイプのアッセイを開発するために、本明細書に記載される２つの異なるエピトープ等の同じエピトープを認識しなかった２つの抗体を選択することは重要であった。ヒト血清または他の組織中のＤＫＫ１に対してアッセイするために、標準曲線が、最初に、組換えｈｕＤＫＫ１を用いて構築された。この標準曲線は、ｈｕＤＫＫ１を欠いている、または低レベルのｈｕＤＫＫ１を含むヒト血清中で構築されることが好ましかった。一般には、血清のために使用される標準曲線の範囲は、この範囲が分析される試料中に得られるｈｕＤＫＫ１の最小値および最大値に応じて調整する必要があり得るが、２５ｐｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのｈｕＤＫＫ１である。使用したプロトコルの一例は、以下の通りであるが、当業者には明らかである修正は、利用される特定の抗体および試料に応じて行われ得る。

【0305】

最初に、分析されるべきヒト血清を、非結合の半領域プレートに充填した。所定量のエピトープＸからのビオチン化抗体（１１Ｈ１０等）および所定量のエピトープＹ（５．２５．１等）からの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体を、６０μＬの血清を含むウェル中の全体積に達するように、Ｉブロック緩衝液中５０ｍｇ／ｍＬのウサギＩｇＧと共にウェルに添加した。この混合物を振とう器上に３０分間置き、次いで、４℃で一晩インキュベートした。

【0306】

一晩インキュベーション後、５０μＬの溶液を３９６ウェルプレートに移した。次いで、このプレートを混合しながら室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、検出溶液を添加した。次いで、このプレートを適切なリーダー上で分析した。このアッセイは二重で行われ、血清中のＤＫＫ１濃度は、標準曲線との比較によって判定された。このデータは、患者が分析されるべき組織または血清試料中の変化したＤＫＫ１レベルを有するかどうかを判定するのに有用である。

【0307】

ヒト血清中のヒトＤＫＫ１の検出のために本明細書に記載される抗体の使用に加えて、抗体はまた、疾患の動物モデルから単離された血清中のＤＫＫ１を検出するために使用することもできる。包括されない例として、上述されるプロトコルを用いて、ラット慢性腎疾患（ＣＫＤ）モデルにおいてＤＫＫ１レベルを検出した。罹患した腎臓および対照腎臓の抽出物を調製し、ラットＤＫＫ１タンパク質レベルを判定した。このデータを図７に示し、ＤＫＫ１タンパク質レベルが薬理学的薬剤により腎臓損傷を誘発してから３週間でほぼ５倍上昇することを示す。これらの結果は、ＤＫＫ１が腎疾患の進行に関与することを示し、ＤＫＫ１の薬理学的調節が腎疾患において治療的有用性があることを示唆している。同様に、本実施例に記載される方法を用いて、ＤＫＫ１調節が治療的有用性を有し得る他の疾患状態を同定することができる。

【0308】

実施例１４
スクレロスチンおよびＤＫＫ１は、骨形成の負の調節因子である。スクレロスチンモノクローナル抗体（Ｓｃｌ−Ａｂ）による全身療法によるスクレロスチンの阻害は、骨粗鬆症の動物モデルにおいて骨形成、骨量、および骨強度を有意に増加させた（Ｌｉ ＸＤ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２００９；２４：５７８）。さらに、Ｓｃｌ−Ａｂによる処置が、骨修復の動物モデルにおいて骨折治癒を強化した（Ｋｅ ＨＺ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓ ＯＲＳ ２００９；３４：２２、Ｏｍｉｎｓｋｙ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＡＳＢＭＲ ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｅｐｔ ２００９；Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）。同様に、モノクローナル抗体ｒ１１Ｈ１０（ＤＫＫ１−Ａｂ）の全身投与によるＤＫＫ１の中和化は、マウス（Ｋｏｍａｔｓｕ ＤＥ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ ２０１０、ＤＯＩ １０．１００２／ＪＯＲ．２１０７８）およびラット骨折モデルの骨折部位での骨塩密度（ＢＭＤ）および強度を増加した。Ｓｃｌ−ＡｂおよびＤＫＫ１−Ａｂの組み合わせが、成熟ラットモデルにおいて、骨形成を刺激し、骨折したおよび骨折していない骨における骨強度を増加させる上で相乗効果を有し得ると仮説を立てた。

【0309】

研究設計：７〜７．５月齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（平均体重５８０ｇ）を、前述に報告されるように、片側の閉鎖した大腿骨の中骨幹骨折を施した（Ｂｏｎｎａｒｅｎｓ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ １９８４；２：９７−１０１）。簡潔に言えば、１８ゲージのシリンジ針を、大腿顆を通って髄管に挿入し、これが内固定としての役割を果たした。次いで、大腿骨を、大腿前面（側面）での鈍的衝撃負荷により横骨折させた。骨折から１日後、動物（ｎ＝１４〜１８／群）は、食塩水ビヒクルもしくはＳｃｌ−Ａｂ、またはＤＫＫ１−Ａｂ（ｒ１１Ｈ１０）、またはＳｃｌ−ＡｂおよびＤＫＫ１−Ａｂの組み合わせ（組み合わせ）のいずれかで皮下注入した。Ｓｃｌ−ＡｂおよびＤＫＫ１−Ａｂの両方は、１週間に２回、２５ｍｇ／ｋｇで皮下注入した。骨折から７週間後、動物を殺処分し、骨折したおよび無傷の対側（ＣＬ）の大腿骨をデンシトメトリーおよび生体力学のために回収した。本研究は、Ａｍｇｅｎ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。

【0310】

デンシトメトリー：大腿骨は、ＣＬ大腿骨中の骨折領域（骨折した大腿骨の中央３０％）または対応する領域でＤＸＡ（ＧＥ Ｌｕｎａｒ ＰＩＸＩｍｕｓ ＩＩ）によりエクスビボで走査されて、面骨塩密度（ＢＭＤ）を決定した。両方の大腿骨はまた、デスクトップマイクロＣＴシステム（ｅＸｐｌｏｒｅ Ｌｏｃｕｓ ＳＰ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて走査し、３０μｍの解像度まで再構成した。骨折仮骨の中央１ｍｍの骨塩量（ＢＭＣ、８００ｍｇ／ｃｃの閾値）が、前述のように、元の皮質を差し引いた後に評価された（Ｔａｙｌｏｒ ＤＫ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２００９；２４：１０４３−１０５４）。全体積の割合としての仮骨体積（ＢＶ／ＴＶ）は、可変閾値（ビヒクル、Ｓｃｌ−Ａｂ、およびＤＫＫ１−Ａｂには５７０ｍｇ／ｃｃ、併用には６１５ｍｇ／ｃｃ）を用いて定量化した。無傷のＣＬ大腿骨については、皮質骨の中央骨幹の大腿骨の高さの１０％に広がる領域（閾値８００ｍｇ／ｃｃ）ならびに遠位の大腿骨骨梁（ビヒクルおよびＤＫＫ１−Ａｂには閾値４５０ｍｇ／ｃｃ、Ｓｃｌ−Ａｂでは５５０ｍｇ／ｃｃ、および併用には６００ｍｇ／ｃｃ）を調べた。平均皮質骨面積および海綿骨密度（ＢＶ／ＴＶ）はそれぞれ、これらの部位で評価された。

【0311】

生体力学：骨折仮骨の中央部または対側の大腿骨の中央骨幹での３点屈曲障害において大腿骨を試験し、骨強度のパラメータを評価した（ＭＴＳ ８５８ Ｍｉｎｉ Ｂｉｏｎｉｘ ＩＩ、径間長＝２０ｍｍ、置換速度＝０．１ｍｍ／秒）。

【0312】

統計的分析：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ．５．０１）を用いて、統計的分析を行った。群変動は、Ｆ検定によって比較された。群変動が、有意に不均一（ｐ≦０．０５）であった場合、データは、対数変換され、分散の再度検定を行った。群変動間の差が有意でなかったとき、不対ｔ検定を用いて、ビヒクルとＳｃｌ−ＡｂまたはＤＫＫ１−Ａｂの間の群平均比較を実施した。群変動が不均一（ｐ≦０．０５）のままであったとき、この比較は、マンホイットニー検定を用いて行われた。データは、平均＋標準偏差として報告され、ｐ＜０．０５は有意であると見なされた。

【0313】

結果：骨折した大腿骨：Ｓｃｌ−ＡｂおよびＤＫＫ１−Ａｂの両方がそれぞれ、ビヒクルと比較して、骨折した仮骨の中央部１ｍｍで、ＤＸＡによる骨幹ＢＭＤでの１１％増加、およびμＣＴによるＢＭＣでの２４〜２６％増加、およびμＣＴによるＢＶ／ＴＶの４０〜６０％増加、ならびに骨折した骨のピーク負荷７６〜１２２％増加によって示されるように、骨折した仮骨での骨量および骨強度の同様の改善を示した。Ｓｃｌ−ＡｂおよびＤＫＫ１−Ａｂの併用療法は、いずれか１つの単独での療法よりも著しく高いレベルまで骨折した仮骨での骨量および骨強度を大いに増大させた。併用群において、ビヒクルと比較すると、それぞれ、骨折仮骨の中央１ｍｍでの骨幹ＢＭＤ、ＢＭＣ、およびＢＶ／ＴＶの３９％、６０％、および９３％増加があった。これらの変化は、ビヒクルと比較して併用群でのピーク負荷の２３０％増加をもたらした。加えて、ＢＭＤ、ＢＭＣ、およびＢＶ／ＴＶ、ならびにピーク負荷は、Ｓｃｌ−Ａｂ単独またはＤＫＫ１−Ａｂ単独群と比較して併用群で著しく高かった。

【0314】

無傷の対側の大腿骨：

【0315】

ＤＫＫ１−Ａｂは、無傷の対側の大腿骨において、骨幹のＢＭＤ、皮質骨面積および海綿骨のＢＶ／ＴＶ、ならびに骨強度に重大な影響を及ぼさなかった。しかしながら、ビヒクルと比較して、Ｓｃｌ−Ａｂはそれぞれ、中央骨幹皮質骨のＢＭＤで６％、皮質骨面積で１０％、および遠位大腿海綿骨のＢＶ／ＴＶで４３％著しく増加した。ビヒクルと比較して、Ｓｃｌ−Ａｂ処置下の皮質骨および海綿骨の両方の部位での骨量のこれらの増加は、ピーク負荷の１７％増加と関連した。

【0316】

骨折した骨と同様に、Ｓｃｌ−ＡｂおよびＤＫＫ１−Ａｂの併用は、ビヒクルと比較して、対側の大腿骨中央骨幹のＢＭＤで１２％、皮質骨面積で１７％、遠位大腿海綿骨のＢＶ／ＴＶで１０７％、およびピーク負荷で２７％著しく増加した。併用群における骨幹のＢＭＤおよび遠位大腿海綿骨のＢＶ／ＴＶの平均値は、Ｓｃｌ−ＡｂおよびＤＫＫ１−Ａｂの単独群で観察されたものよりも著しく高く、一方、併用群における皮質骨面積およびピーク負荷はそれぞれ、ＤＫＫ１−Ａｂ単独群よりも１５％および２１％著しく高かった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]