特許 6353977 ＢＡＣＥ阻害剤としてのテトラヒドロピロロ［３，４−Ｄ］［１，３］チアジン誘導体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6353977

(24)【登録日】2018年6月15日

(45)【発行日】2018年7月4日

(54)【発明の名称】ＢＡＣＥ阻害剤としてのテトラヒドロピロロ［３，４−Ｄ］［１，３］チアジン誘導体

(51)【国際特許分類】

   C07D 513/04 20060101AFI20180625BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20180625BHJP

   A61K 31/542 20060101ALI20180625BHJP

【ＦＩ】

   C07D513/04 375

   C07D513/04CSP

   A61P25/28

   A61K31/542

【請求項の数】10

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2017-514410(P2017-514410)

(86)(22)【出願日】2015年9月8日

(65)【公表番号】特表2017-530957(P2017-530957A)

(43)【公表日】2017年10月19日

(86)【国際出願番号】US2015048788

(87)【国際公開番号】WO2016043996

(87)【国際公開日】20160324

【審査請求日】2017年3月30日

(31)【優先権主張番号】14382347.4

(32)【優先日】2014年9月15日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100176094

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 満

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】コーツ，デイビッド アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】ロザーダ，パブロ ガルシア

【審査官】 早乙女 智美

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１６−５１２２５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１５１８３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０９８４６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／０９１０１６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ ５１３／０４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式：

【化1】

の化合物の結晶。

【請求項2】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、請求項１に記載の結晶。

【請求項3】

０．２度の回析角に対する公差で、１８．６°、１９．３°、及び２６．７°からなる群から選択されるピークのうち１つ以上と組み合わせて、１１．８°の回析角２シータでのＸ線回析スペクトラムにおける実質的なピークにより特徴づけられる、請求項１または２のいずれかに記載の結晶。

【請求項4】

０．２度の回析角に対する公差で、１８．１°、２７．０°、及び１９．７°からなる群から選択されるピークのうち１つ以上と組み合わせて、１５．７°の回析角２シータでのＸ線回析スペクトラムにおける実質的なピークにより特徴づけられる、請求項１に記載の結晶。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか１項に記載の結晶を含む、アルツハイマー病を治療するための医薬組成物。

【請求項6】

請求項１〜４のいずれか１項に記載の結晶を含む、軽度認知障害がアルツハイマー病へと進行することを予防するための医薬組成物。

【請求項7】

療法における使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結晶。

【請求項8】

アルツハイマー病の治療における使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結晶。

【請求項9】

軽度認知障害からアルツハイマー病への進行の予防における使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結晶。

【請求項10】

１つ以上の薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結晶を含有する、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は新規な結晶質ＢＡＣＥ阻害剤に関するものであり、当該結晶質ＢＡＣＥ阻害剤を含有する医薬組成物に関するものであり、生理的障害を治療するための結晶質ＢＡＣＥ阻害剤の使用方法に関するものであり、ならびにその合成に有用な中間体及び方法に関するものである。

【0002】

本発明は、アルツハイマー病、ならびにアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ：ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）の神経毒性があり高度に凝集性のペプチド断片であるアミロイドβ（Ａベータ）ペプチドが関与する他の疾患及び障害の治療の分野に属する。アルツハイマー病は、世界で数百万人の患者が罹患する悲惨な神経変性性疾患である。現在市販されている承認薬は一過性で対症的効果を患者にもたらすだけであることを鑑みると、アルツハイマー病の治療には、いまだ満たされていない多大なニーズが存在する。

【背景技術】

【0003】

アルツハイマー病は、脳内におけるＡベータの生成、凝集及び沈着により特徴づけられる。β−セクレターゼ（アミロイド前駆タンパク質βサイト切断酵素；ＢＡＣＥ：β−ｓｉｔｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）の完全阻害または部分阻害は、マウスモデルにおいてプラーク関連病変及びプラーク依存性病変に対し高い効果を有していることが示されており、このことからＡベータペプチド値のわずかな低下でさえも、プラーク量及びシナプス欠損の長期的で大幅な低下をもたらし得ることが示唆され、従って、特にアルツハイマー病の治療における重要な治療利益をもたらすであろう。

【0004】

米国特許第８，１５８，６２０号は、ＢＡＣＥ阻害活性を有する縮合アミノジヒドロチアジン誘導体を開示しており、さらに、たとえばアルツハイマー型認知症などのＡβペプチドにより引き起こされる神経変性性疾患の有用な治療剤として開示している。さらに、J. Neuroscience, 31(46), pages 16507-16516 (2011)は、経口投与されるＣＮＳ活性ＢＡＣＥ阻害剤である（Ｓ）−４−（２，４−ジフルオロ−５−ピリミジン−５−イル−フェニル）−４−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−［１，３］チアジン−２−イルアミンを開示している。

【0005】

医薬製剤の調製の容易さ、及び安定性が改善された医薬組成物を提供するためには、結晶型のＢＡＣＥ阻害剤が望ましい。

【発明の概要】

【0006】

従って、本発明は、結晶質である式Ｉ：

【化1】

の化合物を提供するものである。

【0007】

本発明はまた、患者において、アルツハイマー病を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、結晶質である式Ｉの化合物の有効量をかかる治療を必要としている患者に投与することを含む。本発明はさらに、患者において、軽度認知機能障害がアルツハイマー病へと進行することを予防する方法を提供するものであり、当該方法は、結晶質である式Ｉの化合物の有効量をかかる治療を必要としている患者に投与することを含む。本発明はまた、患者においてＢＡＣＥを阻害する方法を提供するものであり、当該方法は、結晶質である式Ｉの化合物の有効量をかかる治療を必要としている患者に投与することを含む。本発明はまた、アミロイド前駆タンパク質のＢＡＣＥ介在性の開裂を阻害する方法を提供するものであり、当該方法は、結晶質である式Ｉの化合物の有効量をかかる治療を必要としている患者に投与することを含む。本発明はさらに、Ａベータペプチドの生成を阻害する方法を提供するものであり、当該方法は、結晶質である式Ｉの化合物の有効量をかかる治療を必要としている患者に投与することを含む。

【0008】

さらに本発明は、療法における使用、特にアルツハイマー病の治療のための、または軽度認知機能障害がアルツハイマー病に進行することを予防するための、結晶質である式Ｉの化合物を提供するものである。さらには、本発明は、アルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、結晶質である式Ｉの化合物の使用を提供するものであり、または軽度認知機能障害がアルツハイマー病へと進行することを予防するための医薬の製造のための、結晶質である式Ｉの化合物の使用を提供するものである。

【0009】

本発明はさらに、１つ以上の薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と、結晶質である式Ｉの化合物を含有する医薬組成物を提供する。本発明はまた、結晶質である式Ｉの化合物の合成のための新規中間体及び方法を包含する。

【発明を実施するための形態】

【0010】

軽度認知機能障害は、臨床所見、及び軽度認知機能障害を示す患者が徐々にアルツハイマー型認知症へと進行することに基づいた、アルツハイマー病に関連した認知症の潜在的な前駆期として定義されている。（Morris, et al., Arch. Neurol., 58, 397-405 (2001); Petersen, et al., Arch. Neurol., 56, 303-308 (1999)）。「軽度認知機能障害のアルツハイマー病への進行の予防」という用語は、患者において、軽度認知機能障害がアルツハイマー病へと進行することを減速させること、止めること、または反転させることを含む。

【0011】

本明細書において用いられる場合、「治療すること：ｔｒｅａｔｉｎｇまたはｔｏ ｔｒｅａｔ」という用語は、既存の症状もしくは障害の進行または重篤度を抑えること、減速させること、止めること、または反転させることを含む。

【0012】

本明細書において用いられる場合、「患者」という用語は、ヒトを指す。

【0013】

「Ａベータペプチド生成の阻害」という用語は、患者において、Ａベータペプチドのｉｎ ｖｉｖｏレベルの低下を意味すると解釈される。

【0014】

本明細書において用いられる場合、「有効量」という用語は、患者に単回投与または反復投与された際に、診断を受けた患者または治療を受けている患者において所望される効果をもたらす、本発明化合物もしくはその薬学的に受容可能な塩の量または投与量を指す。

【0015】

有効量は、公知の技術を使用することにより、及び類似の環境下で得られた結果を観察することにより、当分野の当業者としての担当診断医によって容易に決定することができる。患者の有効量の決定において、限定されないが、患者の種；大きさ、年齢、及び一般健康状態；関与する具体的な疾患または障害；疾患もしくは障害の程度、または関与、または重篤度；個々の患者の反応性；投与される特定の化合物；投与方法；投与される製剤の生体利用効率の特徴；選択される用法；併用薬の使用；及び他の関連状況をはじめとする多くの因子が担当診断医により考慮される。

【0016】

本発明の化合物は、一般的に広範な用量域で有効である。たとえば、１日当たりの用量は通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／体重ｋｇの範囲内にある。一部の例において、前述の範囲の下限値を下回る用量レベルがより適切である場合もあり、一方で他の場合においては、許容可能な副作用と共にさらに多量の投与量が用いられ得、従って、上述の用量域は決して本発明の範囲を限定することを意図していない。

【0017】

本発明化合物は、好ましくは、経口、経皮、及び非経口の経路をはじめとする、化合物が生体利用可能となる任意の経路により投与される医薬組成物として製剤化される。最も好ましくは、かかる組成物は経口投与、または経皮投与用であり、経口投与が特に好ましい。かかる医薬組成物、及び同組成物の調製方法は当分野に公知である。（たとえばRemington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006を参照のこと）。

【0018】

式Ｉの結晶質化合物は、本発明の治療方法において特に有用であるが、ある形態が好ましい。以下の項目においてかかる形態を記述する。これら好ましい形態は、本発明の治療方法及び新規化合物の両方に適用可能であることを理解されたい。

【0019】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドの結晶型１；
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドの結晶型２；
０．２度の回析角の公差で、１８．６°、１９．３°、及び２６．７°からなる群から選択されるピークの１つ以上と組み合わせて、１１．８°の回析角２−シータでのＸ線回析スペクトラムの実質的なピークにより特徴づけられる、Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドの結晶型２；
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドの結晶型３；及び
０．２度の回析角の公差で、１８．１°、２７．０°、及び１９．７°からなる群から選択されるピークの１つ以上と組み合わせて、１５．７°の回析角２−シータでのＸ線回析スペクトラムの実質的なピークにより特徴づけられる、Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドの結晶型３、
が、好ましい。

【0020】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドの結晶型２が特に好ましい。

【0021】

０．２度の回析角の公差で、１８．６°、１９．３°、及び２６．７°からなる群から選択されるピークの１つ以上と組み合わせて、１１．８°の回析角２−シータでのＸ線回析スペクトラムの実質的なピークにより特徴づけられる、Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドの結晶型２が殊に好ましい。

【0022】

当分野の当業者であれば、本発明化合物がスキームＡに表される互変異性体で存在し得ることを認識するであろう。本発明化合物の特定の互変異性体のうちの１つに本明細書において何らかの言及がなされた場合、互変異性体、及びそれらのすべての混合物の両方が包含されることを理解されたい。

【0023】

スキームＡ

【化2】

さらに、以下のスキームに記述されるある中間体は、１つ以上の窒素保護基を含有し得る。実施される特定の反応条件及び特定の変換様式に従い、各場合で様々な保護基が同じであっても、異なっていてもよい。保護及び脱保護の条件は当業者に公知であり、文献（たとえば、“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”, Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007を参照のこと）に開示されている。

【0024】

明確性を目的として、以下のスキームにおいて、ある立体化学中心は特定されないままであり、及びある置換基は省略されており、何らかの形で当該スキームの教示を限定することは意図されていない。さらに個々の異性体、鏡像異性体、及びジアステレオマーは、本発明化合物の合成における任意の都合のよいポイントで、たとえば選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィーなどの方法により、当分野の当業者により分離または分割されてもよい（たとえば、J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981、及びE.L. Eliel and S.H. Wilen,” Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994を参照のこと）。「異性体１」及び「異性体２」という記号はそれぞれ、キラルクロマトグラフィーから１番目、及び２番目に溶出された化合物を指し、キラルクロマトグラフィーが合成の早い段階で開始された場合、この同じ記号は、以下の中間体及び実施例に適用される。

【0025】

以下のように、いくつかの略語を定義する：「ＡＰＰ」とは、アミロイド前駆体タンパク質を指す；「ＣＳＦ」とは、脳脊髄液を指す；「ＤＣＭ」とは、ジクロロメタンを指す；「ＤＩＰＥＡ」とは、ジイソプロピルエチルアミン、またはＮ−エチル−Ｎ−イソプロピル−プロパン−２−アミンを指す；「ＤＭＥＭ」とは、ダルベッコ変法イーグル培地を指す；「ＤＭＦ」とは、ジメチルホルムアミドを指す；「ＤＭＳＯ」とはジメチルスルホキシドを指す；「ＥＤＣＩ」とは、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を指す；「ｅｅ」とは、鏡像体過剰率を指す；「ＥｔＯＡｃ」とは、酢酸エチルを指す；「Ｅｘ」とは、実施例を指す；「Ｆ１２」とは、ハムＦ１２培地を指す；「ＦＢＳ」とは、ウシ胎児血清を指す；「ＦＲＥＴ」とは、蛍光共鳴エネルギー移動を指す；「ＨＥＫ」とは、ヒト胎児腎細胞を指す；「ＨＯＡｃ」とは、酢酸を指す；「ＨＯＢｔ」とは、１−ヒドロキシルベンゾトリアゾール水和物を指す；「ＨＰＬＣ」とは、高速液体クロマトグラフィーを指す；「ＩＣ_５０」とは、その剤に可能な最大阻害反応の５０％を生じさせる剤の濃度を指す；「ｍｉｎ」とは、分（複数含む）を指す；「ＭＴＢＥ」とは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを指す；「ＰＤＡＰＰ」とは、血小板由来アミロイド前駆タンパク質を指す；「Ｐｒｅｐ」とは、調製を指す；「ＲＦＵ」とは、相対蛍光単位を指す；「ＳＣＸ」とは、強カチオン交換樹脂を指す；「Ｒ_ｔ」とは、保持時間を指す；及び「ＴＨＦ」とは、テトラヒドロフランを指す。

【0026】

本発明化合物は、当分野に公知の様々な手段により調製されてもよく、それらの一部は以下の調製及び実施例において解説される。記載される各経路の特定の合成工程は、別の方法で組み合わせてもよく、本発明化合物を調製するための別の調製工程と組み合わせてもよい。各工程の産物は、抽出、蒸着、沈殿、クロマトグラフィー、ろ過、粉砕、または結晶化をはじめとする当分野に公知の標準的な方法により回収することができる。試薬及び開始材料は当分野の当業者に容易に入手可能である。

【0027】

調製１
２−ブロモ−１−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）エタン−１−オン

【化3】

Ｎ−ブロモスクシンイミド（９８４ｇ、５．５３モル）を、１−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）エタン−１−オン（１０００ｇ、４．６モル）とｐ−トルエンスルホン酸（１３１５ｇ、７．６４モル）のＤＣＭ（７Ｌ）溶液に、３５℃で分割して添加する。混合物を攪拌し、４０℃まで加熱する。混合物を２４℃まで冷却し、７％ＮａＨＣＯ_３（５Ｌ）を添加する。層を分離させ、有機層を１０％Ｎａ_２ＳＯ_３（５Ｌ）と水（５Ｌ）で洗浄する。有機層を２〜３体積まで濃縮し、表題化合物を得て、さらなる精製を行うことなくそれを用いる。

【0028】

調製２
５−アリル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−１−（４−メトキシベンジル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソキサゾール

【化4】

２−ブロモ−１−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）エタン−１−オン（１３６３ｇ、４．６１モル）のトルエン（１０Ｌ）溶液に、ジアリルアミン（５３７ｇ、５．５３モル）及びｄｉｐｅａ（２３８１ｇ、１８．４２モル）を加える。混合物を４０℃で４時間攪拌し、単離されていない１−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−２−（ジアリルアミノ）エタン−１−オンを得る。Ｎ−（４−メトキシベンジル）ヒドロキシルアミン（８４７ｇ、５．５３モル）及びＴｉ（ＯｉＰｒ）_４（１９６５ｇ、６．９１モル）を、粗１−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−２−（ジアリルアミン）エタン−１−オンを含有する混合物に添加する。混合物を２時間、９０℃で攪拌する。混合物を２０℃まで冷却し、５０％クエン酸一水和物（４Ｌ）及び飽和Ｎａ_２ＣＯ_３（４Ｌ）を加える。層を分離させ、水層を、ＭＴＢＥ（５Ｌ）を用いて抽出する。有機抽出物を、水（５Ｌ）を用いて洗浄し、珪藻土を通してろ過し、乾燥するまで濃縮する。ＥｔＯＡｃ（１０Ｌ）及びシュウ酸（５８０ｇ）を残留物に加え、固形物をろ過し、１ＮのＮａＯＨ（１３Ｌ）に加える。ＭＴＢＥ（５Ｌ）を加え、混合物を、珪藻土を通してろ過する。層を分離させ、有機層を２体積まで濃縮する。ヘプタン（３Ｌ）を加え、溶液を１０℃まで冷却する。得られた固形物をろ過して表題化合物（１３３０ｇ、６４％）を得る。¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 2.51-2.49(m, 3H), 3.09-3.04(m, 3H), 3.78-3.41(m, 6H), 4.01(m, 1H), 5.24-5.01(m, 2H), 5.89-5.85(m, 1H), 6.82-6.80(m, 2H), 7.51-7.13(m, 3H), 7.63-7.62(m, 1H), 7.65-7.64(m, 1H)。

【0029】

調製３
５−アリル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソキサゾール塩酸塩

【化5】

トリフルオロ酢酸（４Ｌ、５２．９モル）を、５−アリル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−１−（４−メトキシベンジル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソキサゾール（１９９０ｇ、４．４５モル）のＤＣＭ（１２Ｌ）溶液に、３５℃未満の温度が維持される速度で滴下して加える。添加が完了した後、混合物を３３〜４３℃まで加温し、６時間攪拌する。ＮａＯＨ（２０％、１０Ｌ）を、３５℃未満の温度が維持される速度で加える。層を分離させ、有機層を、水（６Ｌ）を用いて洗浄する。溶液を濃縮し、エタノール（１６Ｌ）を加え、混合物を、珪藻土を通してろ過する。ろ過物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１０Ｌ）を加える。４Ｍ ＨＣｌのＥｔＯＡｃ溶液（８Ｌ）を加え、得られた固形物をろ過し、乾燥させ、表題化合物（１３８５ｇ、８５．６％）を得る。ＥＳｍ／ｚ３２７．１（Ｍ＋１）。

【0030】

調製４
（１−アリル−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル）メタノール

【化6】

炭酸ナトリウムの飽和水溶液を、ｐＨが＞９に達するまで、５−アリル−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソキサゾール塩酸塩（１４００ｇ、３．８５モル）のＤＣＭ（７Ｌ）溶液に加える。層を分離させ、有機抽出物を１．５体積まで濃縮する。酢酸（１．３８Ｌ）を加え、溶液を２Ｌまで濃縮する。酢酸（７Ｌ）及び亜鉛粉末（２．５ｋｇ、３８．５モル）を加え、混合物を４０〜５０℃まで加熱し、３時間攪拌する。ＥｔＯＡｃ（９．８Ｌ）を加え、混合物を、珪藻土を通してろ過する。ろ過ケークを、ＥｔＯＡｃ（４Ｌ）を用いて洗浄する。ろ過物を分離させ、水（７Ｌ）を混合有機物に加える。ｐＨ≧９に達するまで水酸化アンモニウムを加える。層を分離させ、有機層を２Ｌまで濃縮する。エタノール（２．８Ｌ）を加え、溶液を２Ｌまで濃縮する。エタノール（１９Ｌ）を加え、混合物を、珪藻土を通してろ過し、表題化合物のエタノール溶液を得、それをさらなる精製を行うことなく用いる。

【0031】

調製５
［（３Ｓ，４Ｒ）−１−アリル−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル］アンモニウム；（２Ｓ，３Ｓ）−４−ヒドロキシ−２，３−ビス［（４−メチルベンゾイル）オキシ］−４−オキソ−ブタン酸塩

【化7】

ジ−ｐ−トルオイル−Ｌ−酒石酸一水和物（１．０４ｋｇ、２．６９モル）を、（１−アリル−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル）メタノール（１２６４ｇ、３．８５ミリモル）のエタノール（２１Ｌ）溶液に加える。混合物を６５〜７５℃まで加熱し、３時間攪拌する。混合物を５〜１０℃まで冷却し、［（３Ｓ，４Ｒ）−１−アリル−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル］アンモニウム；（２Ｓ，３Ｓ）−４−ヒドロキシ−２，３−ビス［（４−メチルベンゾイル）オキシ］−４−オキソ−ブタン酸塩（１．０ｇ）の種晶を加え、混合物を３時間攪拌する。固形物をろ過し、ろ過ケークを冷たいエタノール（１．４Ｌ）を用いて洗浄する。ろ過ケークを乾燥させ、白色固形物として表題化合物を得る。第二の溶離異性体のキラル解析：カラム：ＩＣ Ｃｈｉｒａｌｐａｋ、４．６ｍｍ＊２５０ｍｍ＊５μｍ；溶離剤：９０％ヘキサン（０．３％ジエチルアミン）：１０％エタノール（０．３％ジエチルアミン）；１．０ｍＬ／分の流速、ＵＶ２７０ｎｍで、Ｒ_ｔ＝７．４分で鏡像異性的に富化された（９９％ｅｅ）鏡像異性体が確認される（１０５０ｇ、３８％）。¹H NMR(400 MHz, CD₃OD) δ 2.40(s, 6H), 3.05-3.04(m, 1H), 3.57-3.31(m, 3H), 3.66-3.58(m, 4H), 3.75-3.74(m, 2H), 5.38-5.36(m, 1H), 5.50-5.46(m, 1H), 5.88(s, 2H), 5.97-5.91(m, 1H), 7.10-7.05(m, 1H), 7.29(d, J=8.0 Hz, 4H), 7.53-7.51(m, 1H), 7.80-7.78(m, 1H), 8.01(d, J=8.0 Hz, 4H)。

【0032】

調製６
（（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル）メタノール

【化8】

１Ｎ ＨＣｌ（５００ｍＬ、５００ミリモル）を、［（３Ｓ，４Ｒ）−１−アリル−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル］アンモニウム；（２Ｓ，３Ｓ）−４−ヒドロキシ−２，３−ビス［（４−メチルベンゾイル）オキシ］−４−オキソ−ブタン酸塩（１００ｇ、１３９．４ミリモル）の０℃のＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）溶液に加える。混合物を１時間攪拌する。水層を分離させ、１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ８に調節する。水層を、ＥｔＯＡｃ（３５０ｍＬ×２）を用いて抽出する。有機層をひとつにまとめ、水（５００ｍＬ）で洗浄し、濃縮させ、表題化合物を得る（４０ｇ、８７％）。第二の溶離異性体のキラル解析：カラム：ＩＣ Ｃｈｉｒａｌｐａｋ、４．６ｍｍ＊２５０ｍｍ＊５μｍ；溶離剤：９０％ヘキサン（０．３％ジエチルアミン）：１０％エタノール（０．３％ジエチルアミン）；１．０ｍＬ／分の流速、ＵＶ２７０ｎｍで、Ｒ_ｔ＝７．４分で鏡像異性的に富化された（９９．７％ｅｅ）鏡像異性体が確認される。¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 2.78-2.70(m, 5H), 3.16-3.00(m, 3H), 3.87-3.75(m, 1H), 3.90-3.84(m, 1H), 5.24-5.11(m, 2H), 5.91-5.87(m, 1H), 6.95-6.91(m, 1H), 7.35-7.32(m, 1H), 7.67- 7.65 (m, 1H)。

【0033】

調製７
Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−１−アリル−３−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル）カルバモチオイル）ベンズアミド

【化9】

（（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル）メタノール（３０ｇ、９１．１ミリモル）の０℃のＴＨＦ（４００ｍＬ）溶液に、イソチオシアン酸ベンゾイル（１５．０ｇ、９１．９ミリモル）を加える。溶液を２５℃まで加温し、１時間攪拌して、表題化合物のＴＨＦ溶液を得て、それをさらなる精製を行うことなく使用する。

【0034】

調製８
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド、二塩酸塩

【化10】

トリフェニルホスフィン（３６．８ｇ、１４０．３ミリモル）を、Ｎ−（（（３Ｓ，４Ｒ）−１−アリル−３−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル）カルバモチオイル）ベンズアミド（９１．１ミリモル）のＴＨＦ（４００ｍＬ）溶液に加える。アゾジカルボン酸ジ−ｔ−ブチル（３１．６ｇ、１３７．２ミリモル）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液を加える。混合物を２時間、２０〜３０℃で攪拌する。混合物を濃縮し、ＭＴＢＥ（４００ｍＬ）を加える。溶液を、珪藻土を通してろ過し、ケークを、ＭＴＢＥ（１３０ｍＬ）を用いて洗浄する。ろ過物を１つにまとめ、
１Ｎ ＨＣｌのＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）溶液を加える。混合物を２時間攪拌し、次いで、５００ｍＬまで濃縮する。ＭＴＢＥ（３２０ｍＬ）を加え、溶液をろ過し、ヘプタン（１３０ｍＬ）を用いて洗浄する。固形物をＥｔＯＡｃ（６５０ｍＬ）中でスラリー化させ、２時間、５０〜６０℃で攪拌する。熱いスラリーをろ過し、固形物を、ＥｔＯＡｃ（１３０ｍＬ）とヘプタン（１３０ｍＬ）を用いて洗浄する。固形物をＥｔＯＡｃ（６５０ｍＬ）中で再度スラリー化させ、２時間、５０〜６０℃で攪拌する。熱いスラリーをろ過し、ＥｔＯＡｃ（１３０ｍＬ）とヘプタン（１３０ｍＬ）を用いて洗浄する。固形物を乾燥させ、ジ−ＨＣｌ塩として表題化合物を得る（４０ｇ、８０％、９９．５％ｅｅ）。第一の溶離異性体のキラル解析：カラム：ＩＣ Ｃｈｉｒａｌｐａｋ、４．６ｍｍ＊２５０ｍｍ＊５μｍ；溶離剤：８５％ヘキサン（０．１％ジエチルアミン）：１５％イソプロピルアルコール（０．１％ジエチルアミン）；１．０ｍＬ／分の流速、ＵＶ２８２で、Ｒ_ｔ＝１２．５分で鏡像異性的に富化された（９９．５％ｅｅ）鏡像異性体が確認される。

【0035】

調製９
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（２−フルオロ−５−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）フェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド

【化11】

１５％炭酸ナトリウム（４４０ｍＬ）を、Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド二塩酸塩（４９５ｇ、７１７．８８ミリモル）のＥｔＯＡｃ（３Ｌ）と水（７８４ｍＬ）の溶液に加える。混合物を１〜２時間攪拌する。層を分離させ、有機層を、シリカゲル（４０ｇ）を通してろ過し、ＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）を用いて洗浄する。ろ過物を濃縮し、乾燥させ、Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミドを得る。トリフルオロアセトアミド（１３６．７ｇ、１．２１モル）、ＮａＩ（１８２．５ｇ、１．２２モル）、４Ａ分子篩（３４２ｇ）、及びＫ_２ＣＯ_３（１７０．９ｇ、１．２４モル）を、Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド（３４１ｇ、４９４．５４ミリモル）のＤＭＳＯ（５２５ｍＬ）と１，４−ジオキサン（１．０２５Ｌ）の溶液に加える。トランス−Ｎ，Ｎ’−ジメチルシクロヘキサン（８１．６ｇ、５７３．６６ミリモル）及びヨウ化銅（２７．３ｇ、１４３．３４ミリモル）のＤＭＳＯ（５００ｍＬ）溶液を反応混合物に加える。混合物を５分間攪拌する。混合物を１００℃まで加温し、８時間攪拌し、２４℃まで冷却する。水（５．９Ｌ）及びＤＣＭ（５．９ｌ）を加え、混合物をろ過し、層を分離させる。有機層を水（５．９Ｌ）で洗浄し、ＤＣＭ溶液中で表題化合物を得て、それをさらなる精製を行うことなく使用する。

【0036】

調製１０
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド、塩酸塩

【化12】

水酸化ナトリウム（２８．７ｇ）及び水（２．７Ｌ）を、Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（２−フルオロ−５−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）フェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド（２５０ｇ、４９４．４ミリモル）のＤＣＭ溶液に加え、混合物を６８時間、２４℃で攪拌する。ｐＨ１〜３を得るために、１Ｎ ＨＣｌ（３．５Ｌ）を加える。層を分離させ、水層をＤＣＭ（６８０ｍＬ）で洗浄する。ＤＣＭ（４Ｌ）を水層に加え、次いで、２１％水酸化アンモニウムを加え、ｐＨ８〜１０とする。層を分離させ、有機抽出物を１つにまとめ、シリカゲル（１７０ｇ）を通してろ過し、ＤＣＭ（１．４Ｌ）で洗浄する。溶媒を濃縮して乾燥させ、ＥｔＯＡｃ（４Ｌ）で希釈する。１Ｎ ＨＣｌのＥｔＯＡｃ（７００ｍＬ）溶液を、２５℃未満の温度で加え、混合物を１時間攪拌する。混合物を約７〜８体積まで濃縮し、ＥｔＯＡｃ（２．８Ｌ）を加える。得られた沈殿物をろ過し、ＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）で洗浄する。固形物を乾燥させ、表題化合物を得る（２４６ｇ、５２％）。

【0037】

調製１１
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アセトアミド−２−フルオロフェニル）−６−アリル−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド

【化13】

無水酢酸（２３．５ｇ、０．２３モル）を、Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド塩酸塩（１００ｇ、０．１５３モル）及びトリエチルアミン（５４．３ｇ、０．５３５モル）のＤＣＭ（８００ｍＬ）溶液に加える。１時間、２０〜２５℃で攪拌した後、飽和ＮａＨＣＯ_３（７００ｍＬ）と水（６００ｍＬ）を加える。層を分離させ、表題化合物を得て、それをさらに精製することなく、ＤＣＭ溶液として用いる。

【0038】

調製１２
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アセトアミド−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド

【化14】

トリフェニルホスフィン（４．０ｇ、０．０１５モル）及び１，３−ジメチルバルビツール酸（１５．２ｇ、０．０９７モル）を、Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アセトアミド−２−フルオロフェニル）−６−アリル−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド（０．１５３モル）のＤＣＭ溶液に加える。酢酸パラジウム（１．７ｇ、７．７ミリモル）を加え、混合物を１時間、２０〜３０℃で攪拌する。２５％水酸化アンモニウムを加え、層を分離させる。有機層をＨＯＡｃ（５００ｍＬの水中、３．０等量）で洗浄し、ｐＨを、２５％水酸化アンモニウムを用いて８〜９に調節する。水層を、ＤＣＭ（２ｘ５００ｍＬ）を用いて抽出する。有機抽出物を１つにまとめ、３〜４体積に濃縮する。ＭＴＢＥ（１Ｌ）を加え、混合物をろ過する。混合物を濃縮し、ヘプタン（１Ｌ）を加える。得られた固形物をろ過し、回収し、乾燥させて、表題化合物を得る（４８ｇ、７６％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 2.15 (s, 3H), 2.87-2.83(m, 1H), 3.43-3.23(m, 5H), 3.70-3.67(m, 1H), 7.12-7.07 (m, 1H), 7.28-7.27 (m, 1H), 7.52-7.41(m, 4H), 7.79(m, 1H), 8.18-8.16(m, 2H)。ES m/z 413.1 (M+1)。

【0039】

調製１３
Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アセトアミド−２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド

【化15】

２−クロロ−５−フルオロピリミジン（２８．９ｇ、２１８ミリモル）及び炭酸カリウム（３３．４６ｇ、２４２．１ミリモル）を、Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アセトアミド−２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド（５０ｇ、１２１．２２ミリモル）のＤＭＦ（１００ｍＬ）溶液に加える。混合物を８時間、８０〜８５℃まで加熱する。混合物を２４℃まで冷却し、ろ過し、ＤＭＦ（１００ｍＬ）で洗浄する。固形物を水中（２Ｌ）でスラリー化させ、ろ過し、表題化合物を得る（６８．５ｇ、９８％）。ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝５０９．２（Ｍ＋１）＋、¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δppm 1.22 (t, J = 7.28 Hz, 2 H) 1.92 - 2.07 (m, 6 H) 2.89 - 3.20 (m, 2 H) 3.36 - 3.44 (m, 1 H) 3.67 (t, J=9.54 Hz, 1 H) 3.84 (br. s., 1 H) 4.16 (br. s., 2 H) 7.23 (br. s., 2 H) 7.35 - 7.61 (m, 8 H) 7.77 (br. s., 2 H) 7.85 - 8.18 (m, 4 H) 8.48 (s, 4 H) 10.15 (br. s., 1 H) 10.46 - 10.59 (m, 1 H)。

【0040】

調製１４
（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン

【化16】

水酸化リチウム（８．６ｇ、２０４．９ミリモル）を、Ｎ−（（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アセトアミド−２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，６，７，７ａ−ヘキサヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル）ベンズアミド（８０ｇ、１５７．３ミリモル）のメタノール（４００ｍＬ）溶液に加える。混合物を４時間、６０〜７０℃に加熱する。濃縮ＨＣｌ（１３２ｇ）を加え、混合物を１８時間、５５℃で攪拌する。混合物を３０℃まで冷却し、濃縮してメタノールを除去する。水を加え、水層をＤＣＭ（３ｘ）で抽出し、９２０ｇの水溶液として表題化合物を得て、全質量の５．６％の表題化合物を、さらなる精製を行うことなく用いる。

【0041】

調製１５
Ｎ−アリル−Ｎ−（２，２−ジメトキシエチル）カルバミン酸ベンジル

【化17】

Ｎ−（２，２−ジメトキシエチル）カルバミン酸ベンジル（５０ｇ、２０８．９ミリモル）のトルエン（１８０ｍＬ）溶液を、窒素雰囲気下、固形水酸化カリウム（５１．６ｇ、９１９．６９ミリモル）で処置する。１０分後、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム（０．８ｇ、３．１ミリモル）を加える。さらに１０分後、臭化アリル（３３ｇ、２７２．８ミリモル）のトルエン（５０ｍＬ）溶液を、１０分かけて滴下して加える。得られた混合物を５０℃で４８時間攪拌する。混合物を室温まで冷却し、水でクエンチする。有機層を分離させ、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、乾燥するまで濃縮し、表題化合物を得る（４４ｇ、７５％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２８０（Ｍ＋Ｈ）。

【0042】

調製１６
Ｎ−アリル−Ｎ−（２−オキソエチル）カルバミン酸ベンジル

【化18】

Ｎ−アリル−Ｎ−（２，２−ジメトキシエチル）カルバミン酸ベンジル（３０ｇ、１０７ミリモル）のギ酸（３６．８ｍＬ、８６０ミリモル）及び水（４．８４ｍＬ）の溶液を、室温で一晩攪拌する。混合物を濃縮し、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１：２）及び水で希釈する。有機層を分離させ、ブライン溶液でｐＨ＝６まで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒を蒸発させ、表題化合物を得る（２５ｇ、９９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２３４（Ｍ＋Ｈ）。

【0043】

調製１７
Ｎ−アリル−Ｎ−[２−ヒドロキシイミノエチル]カルバミン酸ベンジル

【化19】

Ｎ−アリル−Ｎ−（２−オキソエチル）カルバミン酸ベンジル（２５ｇ、１０７ミリモル）のアセトニトリル（１５０ｍＬ）溶液を、ヒドロキシラミン塩酸塩（９．６８ｇ、１３９ミリモル）、及び酢酸ナトリウム三水和物（１６ｇ、１１７．９ミリモル）の水溶液（７５ｍＬ）を用いて処置する。混合物を一晩、室温で攪拌する。アセトニトリルを蒸発させ、水溶液を、ＥｔＯＡｃを用いて抽出する。有機層を分離させ、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空下で濃縮し、表題化合物（２４ｇ、９０％）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２４９（Ｍ＋Ｈ）。

【0044】

調製１８
３，３ａ，４，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−５−カルボン酸ベンジル

【化20】

Ｎ−アリル−Ｎ−[２−ヒドロキシイミノエチル]カルバミン酸ベンジル（２４ｇ、９６．６ミリモル）のＤＣＭ（３３８ｍＬ）溶液を、５％ｗ／ｗ次亜塩素酸ナトリウム水溶液（１０６．０８ミリモル、１４３．０６ｍＬ）を用いて、１０分かけ滴下して処置する。得られた混合物を室温で一晩攪拌する。反応を、重亜硫酸ナトリウム（７ｇ）の４０％水溶液を用いてクエンチする。有機層を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空下で濃縮する。粗生成物を、ヘキサン中、５％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る（１８ｇ、７５％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２４７（Ｍ＋Ｈ）。

【0045】

調製１９
６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−５−カルボン酸ベンジル

【化21】

ｎ−ブチルリチウムの１．６Ｍヘキサン溶液（２５．４ｍＬ、４０．６ミリモル）を、−７８℃の４−ブロモ−１−フルオロ−２−ヨードベンゼン（１２．２２ｇ、４０．６ミリモル）のＴＨＦ（６０ｍＬ）溶液に滴下して加え、黄色溶液を得て、それを１５分間、−７８℃で攪拌する。

【0046】

三フッ化ホウ素エーテラート（５．１４ｍＬ、４０．６ミリモル）を加え、−７８℃の３，３ａ，４，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−５−カルボン酸ベンジル（５ｇ、２０．３ミリモル）のＴＨＦ（６０ｍＬ）溶液を分離させ、混合物を５分間、−７８℃で攪拌する。この溶液を、カニューレを介して、従前に調製された−７８℃のオルガノリチウム混合物に加える。まとめられた混合物を、−７８℃で３０分間攪拌する。混合物を、飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチして、室温まで加温する。混合物を、ＥｔＯＡｃ（３ｘ）を用いて抽出し、有機抽出物を１つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、真空下で溶媒を除去する。粗生成物を、ヘキサン勾配中、３５分の５％〜１００％ＥｔＯＡｃを用いてシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る（２．２７ｇ、２７％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）４２１／４２３（Ｍ＋Ｈ）。

【0047】

調製２０
１−（ベンゾイルカルバモチオイル）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−５−カルボン酸ベンジル

【化22】

イソチオシアン酸ベンゾイル（２．８７ｍＬ、２１．２８ミリモル）を、６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−５−カルボン酸ベンジル（５．９７７ｇ、１４．２ミリモル）のＴＨＦ（９５ｍＬ）溶液に滴下して加え、一晩、窒素雰囲気下で攪拌する。溶媒を真空下で除去する。粗生成物を、ヘキサン勾配中、３０分の５％〜１００％ＥｔＯＡｃを用いてシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る（６．０５ｇ、７３％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）５８４／５８６（Ｍ＋Ｈ）。

【0048】

調製２１
３−（ベンゾイルカルバモチオイルアミノ）−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボン酸ベンジル

【化23】

１−（ベンゾイルカルバモチオイル）−６ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］イソキサゾール−５−カルボン酸ベンジル（６．０５ｇ、１０．４ミリモル）と亜鉛（粉末、１０ミクロン未満）（６．７７ｇ、１０３．５ミリモル）の混合物を
、室温、窒素雰囲気下で一晩、酢酸（５２ｍＬ）中で攪拌する。反応物を、ＥｔＯＡｃを用いて希釈し、珪藻土を通してろ過する。溶媒を真空下で除去し、残留物をＥｔＯＡｃ、水、及び飽和重炭酸ナトリウム水溶液を用いて希釈する。混合物を、ＥｔＯＡｃ（３ｘ）を用いて抽出し、混合有機層を１つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を真空下で除去する。粗生成物を、ヘキサン勾配中、３０分の５％〜１００％ＥｔＯＡｃを用いてシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る（５．２２２ｇ、８６％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）５８６／５８８（Ｍ＋Ｈ）。

【0049】

調製２２
２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボン酸ベンジル

【化24】

１，１’−カルボニルジイミダゾール（２．８７ｇ、１７．７ミリモル）を、３−（ベンゾイルカルバモチオイルアミノ）−３−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボン酸ベンジル（５．１９８ｇ、８．８６ミリモル）のＴＨＦ（５２ｍＬ）溶液に加える。混合物を室温で１．５時間攪拌し、次いで、反応物を、窒素雰囲気下で一晩、還流で加熱する。反応物を冷却し、水で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３ｘ）を用いて抽出する。有機層を１つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を真空下で除去する。粗生成物を、ヘキサン勾配中、３０分の５％〜１００％ＥｔＯＡｃを用いてシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る（２．９３ｇ、５８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）．５６８／５７０（Ｍ＋Ｈ）。

【0050】

調製２３
Ｎ−［７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化25】

ヨードトリメチルシラン（２．２１ｍＬ、１５．４６ミリモル）を、室温の２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボン酸ベンジル（２．９３ｇ、５．１５ミリモル）のアセトニトリル（４４ｍＬ）溶液に滴下して加える。反応物を２時間、室温で攪拌し、溶媒を真空下で除去する。粗生成物を、３：１のＤＣＭ：メタノール、次いで２：１のＤＣＭ：７Ｎアンモニアのメタノール溶液を用いて、ＳＣＸカラムで精製し、表題化合物を得る（２．０９８ｇ、９４％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）４３４／４３６（Ｍ＋Ｈ）。

【0051】

調製２４
２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル

【化26】

ジ−ｔ−ブチルジカルボネート（１．１６ｇ、５．３１ミリモル）及びトリエチルアミン（１．０１ｍＬ、７．２５ミリモル）を、Ｎ−［７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（２．０９８ｇ、４．８３ミリモル）のＤＣＭ（４８ｍＬ）溶液に加える。反応物を窒素雰囲気下で１時間、室温で攪拌する。溶媒を真空下で除去し、粗生成物を、ヘキサン勾配中、３０分の５％〜１００％ＥｔＯＡｃを用いてシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る（２．５５６ｇ、９９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：（^７９Ｂｒ／^８１Ｂｒ）５３４／５３６（Ｍ＋Ｈ）。

【0052】

調製２５
７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−２−ベンズアミド−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル

【化27】

２−ベンズアミド−７ａ−（５−ブロモ−２−フルオロ−フェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２．５５６ｇ、４．８ミリモル）とトランス−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，２−シクロヘキサンジアミン（１５０ｍｇ、１．１ミリモル）のエタノール（５０ｍＬ）溶液を、アジ化ナトリウム（９３３ｍｇ、１４．３ミリモル）で処置する。Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム塩の水溶液（０．６６Ｍ、３．２ｍＬ、２．１ミリモル）及び水（１ｍＬ）を加え、フラスコの蓋を窒素で洗浄する。混合物を、硫酸銅（ＩＩ）五水和物の水溶液（０．３３Ｍ、３．２ｍＬ、１．１ミリモル）で処置し、前もって加熱しておいたホットプレート上で混合物をただちに８０℃で１．５時間、窒素雰囲気下で加熱する。均一な混合物を加熱で得る。反応物を冷却し、氷水で希釈し、混合物をＥｔＯＡｃ（３ｘ）で抽出する。有機抽出物を１つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を真空下で除去して粗アジ化産物を得る。粗アジ化産物を、冷エタノール（１５０ｍＬ）中で、１０％パラジウム炭素（１ｇ）と混合し、混合物を、真空／窒素を用いて洗浄し、次いで、真空／水素を用いて洗浄する。混合物を、室温で３０ｐｓｉの水素下、５時間攪拌する。反応物をベントし、珪藻土を通してろ過し、ろ過ケークをＤＣＭでリンスする。溶媒を真空下でろ過物から除去し、粗生成物を、ＤＣＭ中、５０％ＥｔＯＡｃを用いてシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る（２．０１４ｇ、８９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４７１（Ｍ＋Ｈ）。

【0053】

調製２６
Ｎ−［７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化28】

トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を、７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−２−ベンズアミド−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−６−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２．０１３ｇ、４．２８ミリモル）のＤＣＭ（３０ｍＬ）溶液に加え、混合物を４時間、窒素雰囲気下、室温で攪拌する。溶媒を真空下で除去し、粗生成物を、３：１のＤＣＭ：メタノール、次いで２：１のＤＣＭ：７Ｎアンモニアのメタノール溶液を用いて、ＳＣＸカラムで精製し、表題化合物を得る（１．５５５ｇ、９８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３７１（Ｍ＋Ｈ）。

【0054】

調製２７
Ｎ−［７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化29】

Ｎ−［７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（７０５ｍｇ、１．９０ミリモル）、５−フルオロ−２−クロロピリミジン（１．０１ｇ、７．６１ミリモル）、及びＤＩＰＥＡ（１．６６ｍＬ、９．５２ミリモル）の溶液を、１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）中で加熱し、窒素雰囲気下で４時間、還流する。反応物を冷却し、水で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×）を用いて抽出する。有機層を１つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を真空下で除去し、粗生成物を得る。粗生成物を、ヘキサン勾配中、２５分の５％〜１００％ＥｔＯＡｃを用いてシリカゲル上で精製し、表題化合物を得る（５９０ｍｇ、６６％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４６７（Ｍ＋Ｈ）。

【0055】

調製２８
Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド、（異性体１）

【化30】

ラセミ化合物のＮ−［７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（１．６９４ｇ、３．６３ミリモル）を、キラルＨＰＬＣ（カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ、８ｘ３５ｃｍ；溶離剤：９０％メタノール（０．２％ジメチルエチルアミン）及び１０％アセトニトリル；流速４００ｍＬ／分、ＵＶ ２８０ｎｍ）により精製する。第一の溶離異性体（カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ−Ｈ ０．４６ｘ１５ｃｍ；溶離剤：１０：９０アセトニトリル：メタノール（０．２％ジメチルエチルアミンを含む）；流速０．６ｍＬ／分、ＵＶ ２８０ｎｍ）の解析により、Ｒ_ｔ＝６．７０分で鏡像異性的に富化された（９９％ｅｅ）鏡像異性体が確認される（７２３ｍｇ、４３％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４６７（Ｍ＋Ｈ）。

【0056】

調製２９
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド、（異性体１）

【化31】

Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロ−フェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド、異性体１（０．３６１ｇ、０．７７ミリモル）は、ＤＣＭ（４ｍＬ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）の混合物中に溶解される。５−メトキシピラジン−２−カルボン酸（２４０ｍｇ、１．５５ミリモル）、ＨＯＢＴ（２１０ｍｇ、１．５５ミリモル）及びＥＤＣＩ（３００ｍｇ、１．５５ミリモル）を混合物に加え、混合物を、一晩、室温で攪拌する。反応溶液を直接、１２ｇのシリカゲルローディングカラム上に加え、４０ｇのシリカゲルカラムを用いて精製し、０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で溶出する。生成物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に溶解し、１Ｎ ＮａＯＨ（２×５０ｍＬ）、及びブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄する。シリカゲル精製を上述のように繰り返し、表題化合物を得る（３５０ｍｇ、７４％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：６０３（Ｍ＋Ｈ）。

【0057】

調製３０
５−アリル−６ａ−（２−フルオロフェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソキサゾール

【化32】

フローケミストリー反応工程：３４３ｍｌのシームレスのステンレススチール管型反応装置（Ｏ．Ｄ＝１／８インチ）を、ＧＣオーブンの内側に置き、２０分間、２０ｍＬ／分で、トルエンを用いてフラッシュする。窒素の背圧（７２０ｐｓｉｇ）を適用し、ＧＣの温度を２１０℃に設定する。温度が２１０℃に達した後、２−（ジアリルアミノ）−１−（２−フルオロフェニル）エタノンオキシム（４８０．５１ｇ、１．７４モル）のトルエン（５．８１Ｌ）溶液を、連続モードで作動している高圧シリンジポンプの対を用いて、２２．８６６ｍＬ／分で、反応装置にポンプで通し、１５分の滞留時間を得る。すべてのストック溶液が消費された後、反応装置を、３０分間、２２．８６６ｍＬ／分でトルエンを用いてフラッシュする。ＧＣオーブンの温度を２５℃に設定し、完了溶液を回収し、真空下で濃縮する。溶媒を蒸発させ、残留物を塩化メチレン（２．５Ｌ）及び水（５Ｌ）に溶解する。塩酸を用いてｐＨを１に調節し、水層を分離させ、水酸化ナトリウムを用いて中和し、ｐＨを１０に調節する。水層を、ＭＴＢＥ（３ｘ２．５Ｌ）を用いて抽出する。有機抽出物を１つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、乾燥するまで蒸着させ、粗表題化合物を得て（２４８ｇ、４７％）、さらなる精製を行うことなく使用する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２４９（Ｍ＋１）。

【0058】

調製３１
１−アリル−４−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール

【化33】

亜鉛末（５９０ｇ、９モル）を、５−アリル−６ａ−（２−フルオロフェニル）−３，３ａ，４，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソキサゾール（３５５９ｇ、１．２９モル）の、メタノール（２．８５Ｌ）及び塩化アンモニウム飽和水溶液（３．５６Ｌ）の混合溶液に添加し、混合物を１６時間、７０℃で加熱する。反応物を６０℃まで冷却し、ＴＨＦ（２．８５Ｌ）で希釈し、珪藻土上で熱したままろ過する。有機溶媒を除去するためにろ過物を蒸着させ、水性混合物をクエン酸１０％ｗ／ｗ水溶液（４Ｌ）及びＥｔＯＡｃ（３．５Ｌ）を用いて希釈する。有機層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃ（２ｘ２Ｌ）で洗浄する。水層を水酸化ナトリウム５０％ｗ／ｗで中和し、ｐＨを１０に調節し、次いでＥｔＯＡｃ（２×１．５Ｌ）を用いて抽出する。有機抽出物を１つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、乾燥するまで蒸着させ、粗表題化合物を得る（２９９ｇ、９２％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２５１（Ｍ＋１）

【0059】

調製３２
［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール；２，３−ビス［（４−メチルベンゾイル）オキシ］ブタン二酸

【化34】

ジ−ｐ−トルオイル−Ｌ−酒石酸（３４８．６ｇ、８８４ミリモル）の１−メトキシ−２−プロパノール（１．１３Ｌ）溶液を、従前に４０℃まで加熱しておいた［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール（２２５．９ｇ、９０２ミリモル）の１−メトキシ−２−プロパノール（１．１３Ｌ）溶液に加える。反応物を、２２℃まで冷却し、１８時間攪拌する。白色固形物をろ過により集め、１−メトキシ−２−プロパノール（６００ｍｌ）を用いて洗浄する。回収した固形物を乾燥させ、表題化合物を得る（１８３．０１ｇ、３１．８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２５１（Ｍ＋１）。

【0060】

調製３３
［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール

【化35】

［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール；２，３−ビス［（４−メチルベンゾイル）オキシ］ブタン二酸（２１１ｇ、３３１ミリモル）を水（２．１Ｌ）及びＥｔＯＡｃ（２．３Ｌ）に溶解する。塩酸３５％ｗ／ｗを加えてｐＨを１に調節する。水層を分離させ、水酸化ナトリウム５０％ｗ／ｗを用いてｐＨを１０に調節し、ＥｔＯＡｃ（２×）で抽出する。水層のｐＨを、ＮａＯＨ水溶液を用いて１０に調節し、ｐＨ＝１０に水溶液のｐＨを維持したままＭＴＢＥ（３×）を用いて抽出する。有機抽出物を１つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、乾燥するまで濃縮し、粗表題化合物を得る（７３ｇ、８８％、９４．８％ｅｅ）。生成物をキラルクロマトグラフィーにより解析する：Ｃｏｌｕｍｎ ＡＳ−Ｈ、溶離剤１０％イソプロピルアルコール、２％イソプロピルアミン；流速３ｍＬ／分、ＵＶは２２０；３５℃、１００バールの圧力で、第二の溶離異性体として表題化合物を得る、Ｒ_ｆ＝２．２６分。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：２５１（Ｍ＋１）。

【0061】

調製３４
Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化36】

［（３Ｒ，４Ｓ）−１−アリル−４−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）ピロリジン−３−イル］メタノール（１２９．７ｇ、４１４ミリモル）のＴＨＦ（２，３Ｌ）溶液を窒素雰囲気下で０℃に冷却する。５℃未満の温度に維持しながらイソチオシアン酸ベンゾイル（６１．５ｍＬ、４５６ミリモル）を加える。反応物を３時間かけて室温まで加温し、１，１’−カルボニルジイミダゾール（８７．４ｇ、５３８．９ミリモル）を加え、反応物を２２℃で１時間攪拌し、次いで、７０℃で１６時間加熱する。反応混合物を２２℃まで冷却し、溶媒を蒸発させる。残留物をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）と水（１Ｌ）の中で分割させる。有機層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃ（２×４００ｍＬ）で抽出する。有機層を１つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、乾燥するまで蒸着させ、粗表題化合物を得る。粗生成物を、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ ０〜４０％ＤＣＭの勾配を用いて溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、残留溶媒を含有する淡黄色固形物として表題化合物を得る（１７０ｇ、９９％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３９６（Ｍ＋１）。

【0062】

調製３５
Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（２−フルオロフェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化37】

２−メルカプト−安息香酸（１２２ｇ、７９３ミリモル）、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（４．１５ｇ、７．２１ミリモル）、及び１，４−ビス（ジフェニルホスフィノ）ブタン（３．１４ｇ、７．２１ミリモル）を、Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−６−アリル−７ａ−（２−フルオロフェニル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（１７８．２１ｇ、３６０ミリモル）の無水２−メチルテトラヒドロフラン（１．９６Ｌ）溶液に、窒素雰囲気下で加える。溶液を真空／窒素サイクルを３回行って脱ガスし、次いで１５分間、窒素を反応物に通気する。反応物に窒素を通気しながら、反応混合物を４０℃まで加熱する。反応物が４０℃に達したとき、通気を止め、反応混合物を窒素雰囲気下で３時間、４０℃で攪拌する。反応物を２２℃まで冷却し、水（２Ｌ）で希釈する。ＨＣｌ（５Ｍ）溶液を加えてｐＨを１に調節する。水層を分離させ、追加のＥｔＯＡｃ（２×８００ｍＬ）で洗浄する。水層のｐＨを、水酸化ナトリウム５０％ｗ／ｗを用いて１０に調節し、次いでＥｔＯＡｃ（１０Ｌ）を用いて抽出する。水層を追加のＥｔＯＡｃ（２×７５０ｍＬ）を用いて洗浄する。有機抽出物を１つにまとめ、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、乾燥するまで蒸着させ、淡黄色固形物として粗表題化合物を得る（１２４．７ｇ、９７％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３５６（Ｍ＋１）。

【0063】

調製３６
Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド

【化38】

Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（２−フルオロフェニル）−４ａ，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（１２４．７ｇ、２５６ミリモル）、ＤＩＰＥＡ（６７ｍＬ）、５−フルオロ−２−クロロピリミジン（２９．３ｍｌ、３０７ミリモル）のＮ−メチルピロリドン（９９７ｍＬ）溶液を１６時間、１００℃に加熱する。反応物を２２℃に冷却し、１５℃未満の温度を維持しながら、１０℃の冷水（１０Ｌ）へと注ぐ。淡いクリーム状の固形物をろ過により回収し、追加の水で洗浄する。湿性固形物をＥｔＯＡｃ（２Ｌ）中に溶解し、分離漏斗に移す。塩化ナトリウム水溶液５％ｗ／ｗ（１Ｌ）を加え、有機層を分離させ、硫酸ナトリウム上で脱水し、ろ過し、ろ過物を減圧下で濃縮させる。生成物を、０〜４０％のＥｔＯＡｃ／イソヘキサンの勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、淡黄色の固形物として表題化合物を得る（１１６ｇ、７０％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４５２（Ｍ＋１）。

【0064】

調製３７
（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン

【化39】

水酸化リチウム（９．２６ｇ、３８６ミリモル）を、Ｎ−［（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−イル］ベンズアミド（１５８．６ｇ、３５１．６ミリモル）の混合物に、メタノール（１．６Ｌ）中で加える。混合物を４時間、７０℃に加熱し、次いで２２℃に冷却する。反応混合物を真空下で蒸着させ、黄色残留物を得る。残留物を水（１Ｌ）及びＥｔＯＡｃ（７５０ｍＬ）中で分割させる。ＨＣｌ（５Ｍ水溶液）を加えてｐＨを１に調節する。水層を分離させ、有機層をＥｔＯＡｃ（２×２００ｍＬ）で洗浄する。水層のｐＨを水酸化ナトリウム５０％ｗ／ｗ水溶液を用いてｐＨ＝１０に調節し、ＥｔＯＡｃ（３×１Ｌ）を用いて抽出する。有機抽出物を１つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮し、淡黄色固形物として粗表題化合物を得る（１３３．３ｇ、９９％、１２％残留ＥｔＯＡｃを含有する）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３４８（Ｍ＋１）。

【0065】

調製３８
（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン

【化40】

硫酸（３３．４ｍｌ、６２６．６ミリモル）を、（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン（４５．８ｇ、１２５，３ミリモル）のトリフルオロ酢酸（６２６ｍＬ）溶液に加える。混合物を０℃に冷却し、２０分間攪拌する。発煙硝酸（６．２ｍＬ、１４４．１ミリモル）を加え、反応混合物を２２℃に加温し、３時間攪拌する。反応混合物を蒸着させ、ＭＴＢＥ（２５０ｍＬ）を加え、２回蒸着させる。残留物を真空下で恒量まで乾燥させ、次いで水（１４７ｍＬ）及びエタノール（８８５ｍＬ）に溶解させ、１５分間、窒素を通気させながら脱ガスする。溶液を耐圧反応装置へと移し、１０％Ｐｄ／Ｃ 糊状 ８７Ｌ（６．６ｇ、６．２７ミリモル）を加える。混合物を追加のエタノール（７００ｍＬ）を用いて希釈し、１６時間、８０ｐｓｉで水素を用いて与圧する。反応混合物をろ過し、次いで１０％Ｐｄ／Ｃ 糊状 ８７Ｌ（６．６ｇ、６．２７ミリモル）の第二のキャタリストチャージを加え、混合物を８０ｐｓｉに与圧し、耐圧反応装置中で３日間攪拌する。反応混合物を窒素で洗浄し、珪藻土上でろ過する。ろ過物を蒸着させ、残留物を水（２００ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）の間で分割させる。水層を分離させ、５℃に冷却し、水酸化アンモニウム１５％ｗ／ｗを用いて中和する。水層を、ＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）を用いて抽出する。有機層を１つにまとめ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で蒸着させ、淡褐色固形物として表題化合物を得る（４７．７ｇ、９９％、残留ＥｔＯＡｃを含有する）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：３６３（Ｍ＋１）。

【実施例】

【0066】

実施例１
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド塩酸塩

【化41】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−ベンズアミド−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド、異性体１（０．３５０ｇ、０．５８ミリモル）をＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解し、次いで、メタノール（４ｍＬ）及びエタノール（４ｍＬ）を加える。Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（４９５ｍｇ、５．８１ミリモル）及びピリジン（４７０μＬ、５．８１ミリモル）を混合物に加え、反応物を５０℃に加温し、一晩攪拌する。シリカゲル（約１０ｇ）を反応物に加え、混合物を濃縮する。シリカゲル上で乾燥させた試料を空のカートリッジ上にロードし、ＤＣＭ中、７Ｎアンモニアメタノールの０〜１０％勾配を用いて溶出し精製する。生成物を、３：１のＤＣＭ：メタノール、次いで２：１のＤＣＭ：７Ｎアンモニアのメタノール溶液を用いたＳＣＸカラム上で２回目の精製を行う。生成物を、ＤＣＭ中、７Ｎアンモニアメタノールの０％〜１０％の勾配を用いてシリカゲル上で最後に精製し、表題化合物の遊離塩基を得る。この物質をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解し、１Ｍ塩化水素のジエチルエーテル溶液（０．２０ｍＬ、６６０μモル）を加える。溶媒を真空下で除去し、表題化合物を得る（７１ｍｇ、２３％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４９８（Ｍ＋Ｈ）。

【0067】

粉末Ｘ線回析（ＸＲＤ）
結晶質固形物のＸＲＤパターンは、３５ｋＶ及び５０ｍＡで操作する、ＣｕＫａ線λ＝１．５４０６０Åを備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ４ Ｅｎｄｅａｖｏｒ粉末Ｘ線回析装置及びＶａｎｔｅｃ検出器で得る。試料は、工程サイズが２θの０．００９°、及びスキャン速度が０．５秒／工程で、２θで４〜４０°の間で、ならびに０．６ｍｍの発散（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）、５．２８の固定アンチスキャッター（ａｎｔｉ−ｓｃａｔｔｅｒ）、及び９．５ｍｍの検出スリットで、スキャンされる。乾燥粉末は石英の試料容器上にパックされ、ガラススライドを用いて滑面を得る。結晶形の回析パターンは大気温度及び相対湿度で集められる。結晶学の分野において、任意の所与の結晶形に関し、回析ピークの相対強度は、たとえば結晶形態及び傾向などの因子に起因する優先される方向性によって変化しうることが良く知られている。優先される方向性の効果が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特徴的なピーク位置は変化しない。たとえば、The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995を参照のこと。さらに、結晶学分野において、任意の所与の結晶形に関し、角度のピーク位置は若干変化し得ることが良く知られている。たとえば、ピーク位置は、試料が分析される温度もしくは湿度、試料の移動、または内部標準の有無によって変わり得る。本発明の場合、指定された結晶形の明確な特定を阻害することなく、２θで±０．２のピーク位置の変動性により、これらの潜在的な変化が考慮されている。結晶形の確認は、特徴的なピーク（°２θの単位）、典型的にはより突出したピークの任意の固有の組み合わせに基づき行われ得る。大気温度及び相対湿度で集められた結晶形回析パターンは、８．８５３及び２６．７７４度２シータでのＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づき調節される。

【0068】

実施例１ａ
結晶形１のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド

【化42】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド（２０１ｍｇ、４０３．２０μモル）を、４ｍＬの酢酸ブチルと混合し、１２０℃の攪拌プレート（ｓｔｉｒｐｌａｔｅ）上で攪拌する。固形物は約５分後に溶解し、透明無色の溶液となる。次いで試料を室温まで冷却し、白色固形物が溶液から分離して沈殿する。次いで試料を室温で１０分間、スラリー化させ、白色固形物の厚いスラリーが形成される。白色固形物を真空ろ過により単離し、５分間、エアースチーム下で乾燥させる。得られた白色固形物のケークを、６０℃の真空オーブン中で風袋計量したバイアル中に週末にかけて置き表題化合物を得る（１１０ｍｇ）。結晶形１のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドは室温、及び約１５％未満の相対湿度で安定な結晶形である。

【0069】

実施例１ｂ
結晶形２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド（水和物）
塩化オキサリル（８８８μＬ、１０．２ミリモル）を、５−メトキシピラジン−２−カルボン酸（１．６ｇ、１０．２ミリモル）のアセトニトリル（５３ｍＬ）及びＤＭＦ（８４８μＬ）の溶液に加える。１５分後、新たに調製した溶液を、あらかじめ５０℃に加熱した、（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン（２．６５ｇ、７．３ミリモル）の、水（５３ｍＬ）及びエタノール（５３ｍＬ）の混合溶液に加える。反応混合物を１時間、５０℃で攪拌し、２２℃に冷却し、次いでこの温度で一晩攪拌する。有機溶媒を真空下で蒸発させ、水性混合物を水酸化ナトリウム５０％ｗ／ｗ水溶液で処置してｐＨ＝１０に調節する。淡いクリーム状の固形物を単離し、追加の水で洗浄する。固形物をイソプロピルアルコール（２ｘ）で希釈し、溶媒を蒸発させる。粗物質を、アンモニア処理したメタノール（２Ｎ）／塩化メチレンの勾配を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。所望される生成物を含有する分画を１つにまとめ、溶媒を蒸発させ、オフホワイトの固形物として表題化合物を得る（１．９ｇ，５２％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）：４９９（Ｍ＋１）。

【0070】

結晶形２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド（水和物）の他の調製法
アセトニトリル（５００ｍＬ）をＤＭＦ（１９．２ｍＬ、２４８．９ミリモル）に加える。塩化オキサリル（３９．３ｇ、３０９．６３ミリモル）、次いで５−メトキシピラジン−２−カルボン酸（４６．０ｇ、２９８．４ミリモル）を、ＤＭＦ／アセトニトリル溶液に加える。分離フラスコにおいて、（４ａＲ，７ａＳ）−７ａ−（５−アミノ−２−フルオロフェニル）−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−２−アミン（５６．８ｇ、１５６．７５ミリモル）の水溶液をアセトニトリル（５００ｍＬ）に加え、水酸化アンモニウム（９５ｍＬ）を用いてｐＨを９に調節する。次いで、この混合物を５０〜５５℃に加熱する。塩化オキサリル溶液を滴下して加え、混合物を３時間攪拌する。水酸化アンモニウムを用いてｐＨを８〜９に調節する。得られた沈殿物をろ過し、水で洗浄し、乾燥させて表題化合物を得る（１２３ｇ）。固形物を１．５時間、アセトン（２５０ｍＬ）中でスラリー化させ、ろ過する。湿性ケークをアセトンで洗浄し、表題化合物を得る（１１０ｇ、ＨＰＬＣにより９０．５％の純度）。ＴＨＦ（１Ｌ）及び活性炭（９ｇ）を当該固形物に加え、混合物を一晩加熱して還流する。混合物を、珪藻土を通してろ過し、ＴＨＦ（１５０ｍＬ）で洗浄する。有機溶液を１０体積まで濃縮し、６０℃に加熱する。水（４３０ｍＬ）を加え、混合物を８時間、６０℃で攪拌する。混合物を室温に冷却し、１０時間攪拌する。得られた固形物をろ過し、ＴＨＦ／水（７：６）で洗浄し、乾燥させ、表題化合物を得る（６９ｇ、８８％）。ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４９９（Ｍ＋１）、純度：９８．３％。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δppm 2.99 - 3.07 (m, 2 H) 3.07 - 3.14 (m, 1 H) 3.58 - 3.67 (m, 1 H) 3.68 - 3.76 (m, 1 H) 3.76 - 3.84 (m, 1 H) 4.02 (s, 3 H) 4.07 (d, J=10.92 Hz, 1 H) 6.08 (s, 2 H) 7.19 (dd, J=11.98, 8.72 Hz, 1 H) 7.78 - 7.89 (m, 2 H) 8.41 (s, 1 H) 8.44 (s, 2 H) 8.88 (s, 1 H) 10.60 (s, 1 H)。

【0071】

結晶形２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド（水和物）の調製に関する一般的手順
Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドをＴＨＦ中、約２３℃、約７１ｍｇ／ｍＬ溶媒の濃度でスラリー化する。約６０℃〜約６３℃で溶解が発生するまで攪拌しながらスラリーを加熱する。約９５：５のＴＨＦ：水溶媒の比率を得るまで熱い溶液に水を加える。結晶形２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドの種晶を加える（約３重量％ロード）。得られた薄いスラリーを約２０分間、約６０℃〜約６３℃に維持し、次いで、約２〜約４時間をかけて、約５．３〜約５．５体積の水を加え、約６９：３１のＴＨＦ：水溶媒の比率を得る。次いでスラリーを約３０分間、約６０℃〜約６３℃に維持し、次いで約１時間をかけて約２３℃に冷却し、次いで約８〜１２時間、攪拌する。次いでスラリーをろ過し、ＴＨＦ：水（３５：６５）を用いて軽くリンスし、低真空下、約４０℃で約８〜１２時間、乾燥させ、水和された所望の結晶形２ Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドを得る。

【0072】

結晶形２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドの調製試料は、以下の表１に記載されるように、回析ピーク（２シータ値）を有するとして、ＣｕＫａ線を用いたＸＲＤパターンにより特徴解析される。具体的には、当該パターンは、０．２度の回析角に対する公差で、１８．６°、１９．３°、及び２６．７°からなる群から選択されるピークのうち１つ以上と組み合わせて、１１．８°でピークを有する。
表１：実施例１ｂの結晶形２の粉末Ｘ線回析ピーク

【表1】

【0073】

結晶形２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドは、室温及び約１５％超の相対湿度で安定な結晶形である。

【0074】

実施例１ｃ
結晶形３のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド

【0075】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドを熱重量分析のパンにロードし、約１７０℃に加熱し、約５分間、１７０℃で維持する。室温に冷却し、表題化合物を得る。

【0076】

結晶形３のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドの他の調製法。

【0077】

Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミド（１２１ｍｇ）とアセトニトリル（５ｍＬ）をバイアル中で混合し、９０℃の攪拌プレート上で加熱する。約３０分後、固形物のほとんどが溶解し、濁った溶液を得る。結晶形３の種晶を加え、試料を約９０℃で約１時間、攪拌する。加熱器を取り除き、混合物を攪拌して、明白色の固形物を得る。固形物を真空ろ過により単離し、約１０分間、エアースチーム下で乾燥させ、次いで約８〜１２時間、約８０℃、低真空下で乾燥させ、表題化合物を得る。

【0078】

結晶形３のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドの調製試料は、以下の表２に記載されるように、回析ピーク（２シータ値）を有するとして、ＣｕＫａ線を用いたＸＲＤパターンにより特徴解析される。具体的には、当該パターンは、０．２度の回析角に対する公差で、１８．１°、２７．０°、及び１９．７°からなる群から選択されるピークのうち１つ以上と組み合わせて、１５．７°でピークを有する。
表２：実施例１ｃの結晶形３の粉末Ｘ線回析ピーク

【表2】

【0079】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの手順
ｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素分析及び細胞分析に関し、被験化合物をＤＭＳＯ中で調製し、１０ｍＭのストック溶液を作成する。ｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素分析及び全細胞分析を行う前に、１０ｍＭ〜０．０５ｎＭの範囲の最終化合物濃度での１０点希釈曲線を作成するために、９６ウェルの丸底プレート中でストック溶液はＤＭＳＯ中で連続希釈される。

【0080】

ｉｎ ｖｉｔｒｏプロテアーゼ阻害分析
ヒトＢＡＣＥ１の発現
ヒトＢＡＣＥ１（アクセッション番号：ＡＦ１９０７２５）は、全脳ｃＤＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローニングされる。アミノ酸配列番号１〜４６０に対応するヌクレオチド配列を、ヒトＩｇＧ_１（Ｆｃ）ポリペプチドをコードするｃＤＮＡへと挿入する（Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)）。このＢＡＣＥ１（１〜４６０）とヒトＦｃの融合タンパク質を、ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃと名付け、ｐＪＢ０２ベクター中に構築させる。ヒトＢＡＣＥ１（１〜４６０）：Ｆｃ（ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃ）を、ＨＥＫ２９３細胞中で一過性発現させる。各構築物の２５０μｇのｃＤＮＡをＦｕｇｅｎｅ６と混合し、１リットルのＨＥＫ２９３細胞に添加する。トランスフェクションの４日後、馴化培地を精製のために回収する。

【0081】

ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃの精製
ｈｕＢＡＣＥ１：Ｆｃは、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製される。酵素は、小さなアリコート中、−８０℃で保存される。

【0082】

ＢＡＣＥ１ ＦＲＥＴ分析
被験化合物の連続希釈は上述のように調製される。ＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液中で化合物はさらに２０ｘ希釈される。各希釈の１０μＬを、反応混合液（２５μＬの５０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ４．６、１ｍＭ ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、及び１５μＭのＦＲＥＴ基質）を含有する、対応するタンパク質低結合黒色プレートのＡ列〜Ｈ列の各ウェルに加える（Yang, et. al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)を参照のこと）。内容物を１０分間、プレート振とう器上で良く混合する。ＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液中の２００ｐＭ ヒトＢＡＣＥ（１〜４６０）：Ｆｃ（Vasser, et al., Science, 286, 735-741 (1999)を参照のこと）の１５μＬを、基質と被験化合物を含有するプレートに加え、反応を開始させる。０時点での混合物のＲＦＵを、プレート振とう器上で軽く混合した後、励起波長３５５ｎｍ、及び発光波長４６０ｎｍで記録する。反応プレートをアルミニウムホイルで覆い、１６〜２４時間、室温で、加湿された暗いオーブン内で維持される。インキュベーション終了時のＲＦＵを、０時点で用いられたものと同じ励起及び発光の設定で記録する。０時点と、インキュベーション終了時のＲＦＵの差は、化合物処置を行った下でのＢＡＣＥ１活性を表す。ＲＦＵの差は、阻害剤濃度に対してプロットされ、曲線は、４パラメーターロジスティック方程式に適合され、ＥＣ_５０値及びＩＣ_５０値を得る（Sinha, et al., Nature, 402, 537-540 (2000)を参照のこと）。

【0083】

実施例１の化合物は、原則的に上述のように検証され、０．６１５ｎＭのＢＡＣＥ１ ＩＣ_５０（±０．１０１、ｎ＝５）［平均±ＳＥＭ；ＳＥＭ＝平均標準誤差］を示した。このデータは、実施例１の化合物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで精製組み換えＢＡＣＥ１酵素活性を阻害したことを示す。

【0084】

ＰＤＡＰＰ初代神経細胞分析
また、確認的全細胞分析を、ＰＤＡＰＰトランスジェニック胎児マウスから作製された初代神経細胞培養中で行う。初代皮質神経細胞は、胎児１６日目のＰＤＡＰＰ胎芽から調製され、９６ウェルプレート中で培養される（１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）中、１５ｘ１０^４細胞／ウェル）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで２日後、培養培地を、Ｂ２７サプリメント及び２μＭ（最終）のＡｒａ−Ｃ（Ｓｉｇｍａ社、Ｃ１７６８）を含有する血清フリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）と置き換える。ｉｎ ｖｉｔｒｏで５日目、神経細胞を３７℃で２４時間、所望される濃度の阻害剤（ＤＭＳＯ希釈されている）の存在下／非存在下でインキュベートする。インキュベーション終了時、馴化培地を、たとえばＡベータペプチドの分析により、ベータ−セクレターゼ活性の兆候に関して分析する。総Ａベータペプチド（Ａベータ １−ｘ）を、捕捉抗体としてモノクローナル抗体２６６を、及び報告抗体としてビオチニル化３Ｄ６を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより計測する。あるいは、Ａベータ１〜４０ペプチド及びＡベータ１〜４２ペプチドを、Ａベータ１〜４０に対する捕捉抗体としてモノクローナル抗体２Ｇ３を、Ａベータ１〜４２に対する捕捉抗体としてモノクローナル抗体２１Ｆ１２を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより計測する。Ａベータ１〜４０及びＡベータ１〜４２の両方のＥＬＩＳＡとも、報告抗体としてビオチニル化３Ｄ６を使用する。化合物処置後の馴化培地中に放出されたＡベータの濃度は、かかる条件下でのＢＡＣＥ１活性に相当する。１０点阻害曲線をプロットし、及び４パラメーターロジスティック方程式に適合することにより、Ａベータ低減効果に関するＥＣ_５０値及びＩＣ_５０値が得られる。実施例１の化合物は原則的に上述のように検証され、Ａベータ低減効果に関し以下の活性を示す。
表３

【表3】

平均±ＳＥＭ；ＳＥＭ＝平均の標準誤差。

【0085】

これらのデータから、実施例１の化合物は全細胞において、Ａベータ産生を阻害することが示される。

【0086】

ベータ−セクレターゼのＩｎ ｖｉｖｏ阻害
マウス、モルモット、イヌ、及びサルをはじめとする数種類の動物モデルを用いて、化合物処置後のベータ−セクレターゼ活性のｉｎ ｖｉｖｏでの阻害に関しスクリーニングを行ってもよい。本発明に用いられる動物は、野生型動物であっても、トランスジェニック動物であっても、または遺伝子ノックアウト動物であってもよい。たとえば、ＰＤＡＰＰマウスモデルは、Games et al., Nature 373, 523-527 (1995)に記載されるように作製され、他の非トランスジェニック動物または遺伝子ノックアウト動物は、阻害化合物の存在下での、Ａベータ及びｓＡＰＰベータ産生のｉｎ ｖｉｖｏ阻害の解析に有用である。一般的に、２〜１２か月齢のＰＤＡＰＰマウス、遺伝子ノックアウトマウス、または非トランスジェニック動物に、たとえばトウモロコシ油、シクロデキストラン、リン酸緩衝液、ＰＨＡＲＭＡＳＯＬＶＥ（登録商標）、または他の適切なビヒクルなどのビヒクル内に製剤化された化合物が投与される。化合物投与の１〜２４時間後、動物は殺処分され、脳ならびに脳脊髄液及び血漿が、Ａベータ、Ｃ９９、及びｓＡＰＰ断片の解析のために回収される（May, et al., Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516 (2011)を参照のこと）。

【0087】

標準的なｉｎ ｖｉｖｏ薬理学的実験に対し、動物は、様々な濃度の化合物を用いて投与され、同時に投与されたビヒクル処置対照群と比較される。基準値を確立するための０時点から始まり、実験経過の間に、脳組織、血漿、または脳脊髄液が選択された動物から採取される。化合物または適切なビヒクルが、他の群に投与され、投与後、様々な時点で殺処分される。脳組織、血漿、または脳脊髄液は選択された動物から採取され、Ａベータペプチド、ｓＡＰＰベータ、及び他のＡＰＰ断片をはじめとするＡＰＰ開裂産物の存在に関し、たとえば特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ分析などにより解析される。検証期間の終了時に動物は殺処分され、必要に応じて、脳組織、血漿または脳脊髄液がＡベータペプチド、Ｃ９９、及びｓＡＰＰベータの存在に関し解析される。ＡＰＰトランスジェニック動物の脳組織もまた、化合物処置後のベータ−アミロイドプラークの量に関し解析されてもよい。本明細書において用いられる場合、「Ａベータ １−ｘペプチド」とは、１残基から始まり、２８残基超のＣ末端で終わるＡベータ種の総和を指す。これによりＡベータ種の大部分が検出され、しばしば、「総Ａベータ」とも呼称される。

【0088】

阻害化合物を投与される動物（ＰＤＡＰＰまたは他のＡＰＰトランスジェニックマウスまたは非トランスジェニックマウス）は、ビヒクル処置対照またはゼロ時対照と比較し、脳組織、血漿、または脳脊髄液中で、ＡベータまたはｓＡＰＰベータの低下を示すことができ、及び脳組織におけるベータアミロイドプラークの減少を示すことができる。実施例１に関し、０．３、１、または３ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与の３時間後、Ａベータ １−ｘペプチド値は、ビヒクル処置マウスと比較し、それぞれ脳の海馬においておよそ３１％、３９％、及び６１％低下し、大脳皮質においておよそ２８％、４２％、及び６４％低下する。

【0089】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＢＡＣＥ酵素に対する実施例１の活性を考慮すると、これらＡベータ低減効果はｉｎ ｖｉｖｏでのＢＡＣＥ阻害と一致しており、さらには、Ｎ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドのＣＮＳへの浸透が示唆される。

【0090】

これら実験から、本発明化合物はＢＡＣＥを阻害し、従って、Ａベータ値の低減に有用であることが示される。

本発明は以下の態様を含む。
［１］
結晶質である、以下の式：

【化43】

の化合物。
［２］
結晶形２のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、［１］に記載の結晶質化合物。
［３］
０．２度の回析角に対する公差で、１８．６°、１９．３°、及び２６．７°からなる群から選択されるピークのうち１つ以上と組み合わせて、１１．８°の回析角２シータでのＸ線回析スペクトラムにおける実質的なピークにより特徴づけられる、［１］または［２］のいずれかに記載の結晶質化合物。
［４］
結晶形１のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、［１］に記載の結晶質化合物。
［５］
結晶形３のＮ−［３−［（４ａＲ，７ａＳ）−２−アミノ−６−（５−フルオロピリミジン−２−イル）−４，４ａ，５，７−テトラヒドロピロロ［３，４−ｄ］［１，３］チアジン−７ａ−イル］−４−フルオロ−フェニル］−５−メトキシ−ピラジン−２−カルボキサミドである、［１］に記載の結晶質化合物。
［６］
０．２度の回析角に対する公差で、１８．１°、２７．０°、及び１９．７°からなる群から選択されるピークのうち１つ以上と組み合わせて、１５．７°の回析角２シータでのＸ線回析スペクトラムにおける実質的なピークにより特徴づけられる、［１］または［５］に記載の結晶質化合物。
［７］
［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物の有効量を、かかる治療を必要としている患者に投与することを含む、患者において、アルツハイマー病を治療する方法。
［８］
［１］〜［６］のいずれか１項に記載の化合物の有効量を、かかる治療を必要としている患者に投与することを含む、患者において、軽度認知障害がアルツハイマー病へと進行することを予防する方法。
［９］
療法における使用のための、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１０］
アルツハイマー病の治療における使用のための、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１１］
軽度認知障害からアルツハイマー病への進行の予防における使用のための、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物。
［１２］
１つ以上の薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と、［１］〜［６］のいずれかに記載の化合物を含有する、医薬組成物。