特許 6355032 新規組換え二機能性融合タンパク質、それらの調製および使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6355032

(24)【登録日】2018年6月22日

(45)【発行日】2018年7月11日

(54)【発明の名称】新規組換え二機能性融合タンパク質、それらの調製および使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20180702BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20180702BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20180702BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180702BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180702BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180702BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180702BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20180702BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20180702BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20180702BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180702BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20180702BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20180702BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20180702BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20180702BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20180702BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20180702BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 Z

   C07K19/00ZNA

   C07K14/705

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K38/18

   A61P37/08

   A61P37/06

   A61P35/00

   A61P29/00 101

   A61P1/00 171

   A61P11/06

   A61P27/02

   A61P1/16

   A61P9/00

【請求項の数】27

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2016-548031(P2016-548031)

(86)(22)【出願日】2015年3月24日

(65)【公表番号】特表2017-510249(P2017-510249A)

(43)【公表日】2017年4月13日

(86)【国際出願番号】US2015022097

(87)【国際公開番号】WO2015148416

(87)【国際公開日】20151001

【審査請求日】2016年12月6日

(31)【優先権主張番号】61/969,276

(32)【優先日】2014年3月24日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】317002227

【氏名又は名称】イミューンオンコ バイオファーマシューティカルズ （シャンハイ） カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000877

【氏名又は名称】龍華国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ジン、デチアン

【審査官】 濱田 光浩

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／０８２５６３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５２６７２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５３６４９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５１２６４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／０００２３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５３７１４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０３８０４４９５（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ａ６１Ｋ ３８／１８

Ｃ０７Ｋ １４／７０５

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ １／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

リンカーを介して、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外ドメインのＩｇ領域と連結する、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）の細胞外ドメインのＩｇ領域を含んでなる、組換え二機能性融合タンパク質であって、その中で前記タンパク質が、表面抗原分類４７（ＣＤ４７）およびＶＥＧＦに結合して、前記ＣＤ４７とマクロファージの細胞表面の前記ＳＩＲＰαとの結合をブロックし、前記マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を刺激して、前記ＶＥＧＦによって誘導される血管内皮細胞の前記増殖を阻害し得る、組換え二機能性融合タンパク質。

【請求項2】

前記シグナル調節タンパク質の前記細胞外ドメインの前記Ｉｇ領域がＳＩＲＰαＤ１である、請求項１に記載の組換え二機能性融合タンパク質。

【請求項3】

前記ＶＥＧＦＲがＶＥＧＦＲ１である、請求項１に記載の組換え二機能性融合タンパク質。

【請求項4】

ＶＥＧＦＲ１のＩｇ領域が、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの第２のＩｇ領域（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）である、請求項３に記載の組換え二機能性融合タンパク質。

【請求項5】

前記リンカーがＩｇのＦｃ断片である、請求項１に記載の組換え二機能性融合タンパク質。

【請求項6】

前記Ｆｃ断片がＩｇＧ１のＦｃ断片である、請求項５に記載の組換え二機能性融合タンパク質。

【請求項7】

ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片を介して、ＳＩＲＰαの前記細胞外ドメインの第１のＩｇ領域（ＳＩＲＰαＤ１）と連結する、ヒトＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの第２のＩｇ領域を含んでなる、請求項１に記載の組換え二機能性融合タンパク質。

【請求項8】

配列番号８と少なくとも９５％同一性のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の組換え二機能性融合タンパク質。

【請求項9】

配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる、請求項８に記載の組換え二機能性融合タンパク質。

【請求項10】

請求項８に記載の組換え二機能性融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項11】

請求項９に記載の組換え二機能性融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。

【請求項13】

請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。

【請求項14】

請求項１２に記載の発現ベクターを含んでなる、単離した宿主細胞。

【請求項15】

請求項１に記載の組換え二機能性融合タンパク質と、少なくとも１つの薬剤アジュバントとを含んでなる、医薬組成物。

【請求項16】

請求項１５に記載の医薬組成物を治療有効量含んでなる、ＣＤ４７の過剰発現によって引き起こされる疾患を治療するキット。

【請求項17】

前記疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、乳がん、膵臓がん、および腎細胞がんの群から選択される、請求項１６に記載のキット。

【請求項18】

前記疾患が、クローン病、アレルギー性喘息、および関節リウマチの群から選択される、請求項１６に記載のキット。

【請求項19】

請求項１５に記載の医薬組成物を治療有効量含んでなる、ＶＥＧＦ機能および活性の亢進によって引き起こされる疾患を治療するキット。

【請求項20】

前記疾患が、加齢黄斑変性、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、肝臓線維症、および血管肉腫から選択される、請求項１９に記載のキット。

【請求項21】

配列番号８と少なくとも９８％同一性のアミノ酸配列を含んでなる、請求項８に記載の組換え二機能性融合タンパク質。

【請求項22】

配列番号８と少なくとも９９％同一性のアミノ酸配列を含んでなる、請求項２１に記載の組換え二機能性融合タンパク質。

【請求項23】

前記単離した宿主細胞が原核細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。

【請求項24】

前記単離した宿主細胞が酵母細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。

【請求項25】

前記単離した宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。

【請求項26】

前記単離した宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。

【請求項27】

前記単離した宿主細胞がヒト細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組換え二機能性融合タンパク質、その調製および使用、特に腫瘍治療におけるその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

がん細胞は、宿主の免疫監視を逃れるために、少なくとも３つの機序を発達させた。１）どちらもＴ細胞表面のＰＤ−１に結合してＴ細胞アポトーシスを誘導する、膜タンパク質ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の高度発現による、Ｔリンパ球による免疫監視からの逃避。２）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による免疫監視からの逃避。ＮＫ細胞表面のＮＫＧ２Ｄタンパク質は、がん細胞表面のＭＩＣＡ／ＭＩＣＢタンパク質への結合に際して、ＮＫ細胞が活性化され得て、次にそれはがん細胞を殺滅し得る。しかし、がん細胞は、がん細胞からのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ離脱を促進する機序を発達させた。離脱したＭＩＣＡ／ＭＩＣＢはＮＫＧ２Ｄと結合し、そのＮＫ細胞活性化をブロックする。３）マクロファージ（Ｍφ）の免疫監視からの逃避。ほぼ全てのがん細胞は、それらの表面に高レベルのＣＤ４７を発現し^［１］、それはＭφ表面の信号調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）と結合して、それによって阻害シグナルの発生が誘導され、それはＭφの食作用機能を阻害する^［２］。効果的な抗がん剤の開発は、これらの機序を標的化する必要がある^［１］。

【0003】

さらにがん細胞の増殖は、十分な栄養供給に依存する。がん細胞は、それ自体が、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの血管増殖を促進する因子を分泌し得る。ＶＥＧＦの活性阻害は、腫瘍への血液供給を停止させ、それによってがんの増殖を阻害するであろう。例えば、ＦＤＡ認可抗体医薬であるアバスチンは、ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害することで機能して、がん（結腸がん、肺がん）を治療する。結腸がん治療のために、２０１２年８月に市販が認可された別のタンパク質薬剤であるザルトラップもまた、ＶＥＧＦを標的とする。しかしこれらの薬剤は、がん細胞増殖をある程度阻害するのみであって、がん細胞を排除し得ない。

【0004】

シグナル調節タンパク質は、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）、ＳＩＲＰγ（ＣＤ１７２ｇ）の３つの構成要素がある、膜貫通タンパク質ファミリーである。３つの構成要素は、全て同様の細胞外領域を含んでなるが、細胞内ドメインが異なる。細胞外ドメインは３つのＩｇ様領域を含んでなり、第１のＩｇ様領域がＩｇ−Ｖ領域である一方で、第２および第３の領域はＩＧ−Ｃ領域である。

【0005】

ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）の細胞内ドメインは、シグナルトランスダクションおよび対応する細胞機能を阻害し得る、２つの阻害シグナル伝達領域を含有する。ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）およびＳＩＲＰγ（ＣＤ１７２ｇ）の膜内ドメインは非常に短く、シグナルトランスダクション領域を含有しないが、ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）は、例えば、ＤＡＰ１２などのアダプタータンパク質を通じて、シグナルトランスダクションのために機能してもよい（図１を参照されたい）。ＳＩＲＰは、主に、マクロファージ（Ｍφ）、樹状細胞（ＤＣ）、およびニューロンで発現される。

【0006】

ＣＤ４７はまた、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通糖タンパク質であり、赤血球をはじめとする全ての細胞型の表面に発現される。ＣＤ４７のリガンドとしては、インテグリン、トロンボスポンジン−１、およびＳＩＲＰが挙げられる。ＣＤ４７は、細胞内遊走、Ｔ細胞およびＤＣ活性化、および神経発達をはじめとする、多数の生物学的機能を有する。さらにＣＤ４７は、ＳＩＲＰαとの相互作用によって、マクロファージの食作用を阻害し得る。「攻撃するな」というシグナルを発することで、ＣＤ４７は、マクロファージによる攻撃から、血液細胞などの正常細胞を保護する。

【0007】

上述したように、多数の腫瘍またはがん細胞は、ＣＤ４７を過剰発現し、それはマクロファージ細胞表面のＳＩＲＰαと結合することで、マクロファージによるがん細胞の食作用を妨げる。ＣＤ４７を過剰発現するがん細胞としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、乳がん、および膵臓がんが挙げられる。腫瘍を有するマウスへのＣＤ４７特異的抗体の注射は、生体内で腫瘍増殖を顕著に阻害し得る^{［３−４］}。ヒト白血病細胞を保有するマウス中のがん細胞は、この抗体がマウス注射されると、完全に排除された^［５］。

【0008】

ＶＥＧＦは、分子量約４０ｋＤａの分泌糖タンパク質のファミリーである。このファミリーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰＩＧＦをはじめとする、５つの構成要素を有する。そのそれぞれが、異なるリガンドと選択的に結合し得る、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３をはじめとする３つのＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）がある。例えば、ＶＥＧＦＲ１は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、およびＰＩＧＦと結合し、ＶＥＧＦＲ２は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄと結合するが、ＰＩＧＦとは結合せず；ＶＥＧＦＲ３は、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄのみと結合する。受容体は、異なる機能を有する。ＶＥＧＦＲ１は、ＶＥＧＦＲ２よりも１０倍高い、非常に高い親和性でＶＥＧＦ−Ａと結合するので、それはＶＥＧＦＲ２を負に調節するように機能する。ＶＥＧＦＲ２は、血管内皮細胞増殖を誘導して、血管増殖を促進する。他方、ＶＥＧＦＲ３は、リンパ管導管発生と増殖に関連がある。特定の病態（例えば、がんおよび加齢黄斑変性）に見られるように、全てのＶＥＧＦおよびそれらの受容体の中でも、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦＲ２が最重要であり、ＶＥＧＦＲ２と結合するＶＥＧＦ−Ａの過剰分泌は、異常な血管増殖を引き起こして、病気の発症または悪化をもたらすであろう。したがって、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦＲ２は、どちらも重要な医薬標的である。

【0009】

抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であるベバシズマブは、２００４年に市販が認可され、転移性結腸がん、肺がん、および腎臓がんに対して特効がある。これもまたＶＥＧＦを標的とする組換えタンパク質薬剤のザルトラップ（Ｚａｌｔｒａ）は、ＶＥＧＦトラップとしても知られており、２０１２年に転移性結腸がんの治療のために市販が認可された。ＶＥＧＦＲ２を標的化するラムシルマブは、第ＩＩＩ相臨床試験実施中である。抗ＣＤ４７医薬は市場に出ておらず、全て前臨床段階にある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

これまでに、ＣＤ４７およびＶＥＧＦの双方を標的とするいかなる単一分子医薬も報告されておらず、本発明はこの必要性を満たす。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、ＩｇのＦｃ断片を介して、ＶＥＧＦＲの細胞外ドメインのＩｇ領域と連結する、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外ドメインのＩｇ領域を含んでなる、組換え二機能性融合タンパク質を開示し、その中でタンパク質は、ＣＤ４７およびＶＥＧＦに同時に結合して、ＣＤ４７とマクロファージ細胞表面のＳＩＲＰとの結合をブロックして、マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を刺激して、ＶＥＧＦによって誘導される血管内皮細胞増殖を阻害し得る。本出願は、組換え二機能性融合タンパク質をコードする核酸分子、タンパク質を発現する発現ベクター、タンパク質を生成する方法、およびＣＤ４７またはＶＥＧＦを過剰発現する疾患を治療する方法もまた、提供する。

【0012】

一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質は、リンカーを介して、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外ドメインのＩｇ様領域と連結する、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外ドメインのＩｇ様領域を含んでなり、その中でタンパク質は、ＣＤ４７およびＶＥＧＦと結合し得て、ＣＤ４７とマクロファージ細胞表面のＳＩＲＰとの結合をブロックし、マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を刺激して、ＶＥＧＦによって誘導される血管内皮細胞の増殖を阻害する。

【0013】

一実施形態では、組換え二機能性融合タンパク質中のシグナル調節タンパク質はＳＩＲＰαであり、シグナル調節タンパク質の細胞外ドメインのＩｇ様領域はＳＩＲＰαＤ１である。

【0014】

一実施形態では、組換え二機能性融合タンパク質中のＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１であり、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様領域は、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの第２のＩｇ領域（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）である。

【0015】

一実施形態では、組換え二機能性融合タンパク質のリンカーは、ＩｇのＦｃ断片である。一実施形態では、Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１のＦｃ断片である。

【0016】

一実施形態では、組換え二機能性融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片を介して、ＳＩＲＰαの細胞外ドメインの第１のＩｇ領域（ＳＩＲＰαＤ１）と連結する、ヒトＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの第２のＩｇ領域（ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）を含んでなる。特定の一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質は、配列番号８に示される配列と９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる。一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質および配列番号８の間のアミノ酸配列同一性は、少なくとも９８％である。一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質および配列番号８の間のアミノ酸配列同一性は、少なくとも９９％である。一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる。

【0017】

別の実施形態では、本発明は、リンカーを介して、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）の細胞外ドメインのＩｇ様領域と連結する、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外ドメインのＩｇ様領域を含んでなる、本発明の組換え二機能性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供し、その中でタンパク質は、ＣＤ４７およびＶＥＧＦと結合し得て、ＣＤ４７とマクロファージ細胞表面のＳＩＲＰとの結合をブロックし、マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を刺激して、ＶＥＧＦによって誘導される血管内皮細胞の増殖を阻害する。

【0018】

一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド分子は、ＳＩＲＰα、好ましくはＳＩＲＰαＤ１を含んでなる組換え二機能性融合タンパク質をコードする。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド分子は、ＶＥＧＦＲ１と、好ましくはＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの第２のＩｇ領域（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）とを含んでなる、組換え二機能性融合タンパク質をコードする。

【0019】

一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド分子は、リンカーとしてＩｇのＦｃ断片を含んでなり、好ましくは、リンカーとしてＩｇＧ１のＦｃ断片を含んでなる、組換え二機能性融合タンパク質をコードする。

【0020】

一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド分子は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片を介して、ＳＩＲＰαの細胞外ドメインの第１のＩｇ領域（ＳＩＲＰαＤ１）と連結する、ヒトＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの第２のＩｇ領域（ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）を含んでなる組換え二機能性融合タンパク質をコードする。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド分子は、配列番号８に示される配列と９５％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、組換え二機能性融合タンパク質をコードする。一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質および配列番号８の間のアミノ酸配列同一性は、少なくとも９８％である。一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質および配列番号８の間のアミノ酸配列同一性は、少なくとも９９％である。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド分子は、配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる、組換え二機能性融合タンパク質をコードする。

【0021】

別の実施形態では、本発明は、組換え二機能性融合タンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクターを提供する。

【0022】

別の実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。

【0023】

別の実施形態では、本発明は、本発明の組換え二機能性融合タンパク質と、少なくとも１つのアジュバントとを含んでなる、医薬組成物を提供する。

【0024】

別の実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物の治療有効量を患者または対象に投与するステップを含んでなる、ＣＤ４７の過剰発現またはＶＥＧＦの過剰発現またはその双方によって引き起こされる、疾患を治療する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＣＤ４７の過剰発現またはＶＥＧＦの過剰発現またはその双方によって引き起こされる疾患を治療するための医薬組成物の製造における、組換え二機能性融合タンパク質の使用を提供する。

【0025】

一実施形態では、本発明の方法は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、乳がん、膵臓がん、および腎細胞がんからなる群から選択される疾患を治療する方法である。別の実施形態では、本発明は、クローン病、アレルギー性喘息、および関節リウマチを治療する方法を提供する。

【0026】

一実施形態では、本発明によるＶＥＧＦ機能および活性の亢進によって引き起こされる疾患を治療する方法は、加齢黄斑変性、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、肝臓線維症、および血管肉腫からなる群から選択される疾患を治療する方法である。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】ＳＩＲＰの構造の概略図である。

【図2】ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２の構造および作用機序の概略図である。

【図3】ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２の核酸配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。

【図4】ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２のタンパク質電気泳動分析を示す。

【図5】標的結合活性分析の結果を示す。

【図6】標的阻害アッセイの結果を示す。

【図7】生体内抗腫瘍アッセイの結果を示す。

【図8】Ａ５４９皮下異種移植モデルにおける、ＭＡＣ−０１の治療効果を示す。ＭＡＣ−０１で処置された群（各群ｎ＝６）が分析され、ＳＩＲＰＡＤ１−Ｆｃ、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２−Ｆｃ、およびＳＩＲＰＡＤ１−ＦｃとＶＥＧＦＲ１Ｄ２−Ｆｃの組み合わせと比較された。各分子の用量は、次のとおりである：ＭＡＣ−０１：５ｍｇ／ｋｇ；ＳＩＲＰＡＤ１−ＦｃおよびＶＥＧＦＲ１Ｄ２−Ｆｃ：単一または組み合わせのどちらかで２．５ｍｇ／ｋｇ。４週間にわたる週２回の腹腔内注射の処置は、腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ^３に達した時点で開始された。

【発明を実施するための形態】

【0028】

腫瘍増殖の２つ以上の薬理を標的化する、主に３つの異なるアプローチがある。最も一般的には、２つ以上の異なる薬剤の混合物が、患者に投与され得る。この選択肢は、可能な医薬組み合わせと、異なる用量に関して最大の融通性を可能にするが、それは、（ａ）錠剤数の負担増大および個々の薬剤の異なる投与スケジュールに起因する、患者の治療に対する潜在的な遵守不良、（ｂ）薬剤と薬剤の相互作用のための可能な不適合性、および（ｃ）薬剤副作用のリスク増大に悩まされる。これらの問題は、特にがんなどの慢性疾患の治療において、治療の有効性を低下させ、治療目的の達成を妨害し得る。

【0029】

第２のアプローチは、単回投与剤形中における薬剤の固定用量組み合わせの使用に依存する。このアプローチは、錠剤数の負担を低下させ、改善された患者の服薬遵守をもたらす。固定用量組み合わせの不都合は、主に、活性成分間の可能な用量比の選択が限られることであり、最小限の副作用で最大効力を得るために、個々の患者を適切に滴定することがより困難になる。さらに、組み合わせ中の構成成分の異なる薬物動態特性は、個々の標的において薬力学効果に複雑な時間的ミスマッチをもたらすかもしれず、その結果、全体的な効力が損なわれる。

【0030】

第３のアプローチは、単一化合物中で２つ以上の薬理を組み合わせる、多機能性薬剤の使用である。このような多機能性化合物の設計および検証は、より複雑であり、分子内の標的機能の最適な比率についてかなりの研究を要するが、一体化された薬物動態が、分子標的における調和のとれた薬力学活性をもたらすことができる。多機能性分子はまた、その他の薬剤との固定用量組み合わせに適していてもよく、それによって３つまたは４つにさえ至る薬理が単一丸薬中で組み合わされて、さらなる有効性増大をもたらす。

【0031】

本発明者は、入念な実験を通じて、１つには腫瘍組織への血液供給を中断し、もう１つにはマクロファージによる腫瘍細胞食作用を誘導する、２つの作用機序を通じて、腫瘍を攻撃し得る新規組換え二機能性融合タンパク質を発明した。

【0032】

一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質は、リンカーペプチドを介してＶＥＧＦＲの細胞外ドメインのＩｇ様領域に連結する、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の細胞外ドメインのＩｇ様領域を含んでなる。このタンパク質は、ＣＤ４７およびＶＥＧＦに同時に結合し得て、ＣＤ４７とマクロファージ細胞表面のＳＩＲＰとの結合をブロックし、それによってマクロファージによる腫瘍細胞の食作用を刺激して、ＶＥＧＦによって誘導される血管内皮細胞の増殖を阻害する。

【0033】

本発明の融合タンパク質は、２つの標的結合断片（例えば、ＳＩＲＰαＤ１およびＶＥＧＦＲ１Ｄ２）およびリンカー（例えば、Ｆｃ断片）を含んでなる。当業者は、上記の３つの構成要素のいずれかを選択するための多数の設計選択肢があることを認識するであろう。

【0034】

リンカーは、主に、ポリペプチドと、第２の異種ポリペプチドまたはその他のタイプの融合ポリペプチドとの間のスペーサーの役割を果たす。一実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって共に連結するアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって連結する１〜２０個のアミノ酸で構成され、その中でアミノ酸は、２０個の天然起源アミノ酸から選択される。当業者によって理解されるように、これらのアミノ酸の１つまたは複数は、グリコシル化されてもよい。一実施形態では、１〜２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択されてもよい。一実施形態では、リンカーは、大部分が、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のないアミノ酸で構成される。代表的リンカーは、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）_５、（Ｇｌｙ）_８）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、およびポリアラニンである。下の実施例で示されるように、１つの代表的な適切なリンカーは、（Ｇｌｙ）_４Ｓｅｒ（配列番号Ｘ）である。さらなる実施形態では、本発明の二機能性融合タンパク質は、ＩｇＧのヒンジ領域または部分的ヒンジ領域に隣接して提供されるリンカー配列である、「ヒンジリンカー」を含んでなり得る。ヒンジリンカー配列はまた、本発明の二機能性融合タンパク質の製造可能性および安定性を改善するように設計されてもよい。

【0035】

リンカーはまた、非ペプチドリンカーであってもよい。例えば、−ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｓ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｓ＝２〜２０である）などのアルキルリンカーが、利用され得る。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ_１〜６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ_２、フェニルなどの任意の立体障害のない基によってさらに置換されてもよい。

【0036】

本発明の二機能性融合タンパク質はまた、分解を低下させるおよび／または半減期を増大させる、毒性を低下させる、免疫原性を低下させる、および／または生物学的活性を増大させるなどの所望の性質を与える目的で、非ポリペプチド分子に付着され得る。代表的分子としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリジン、デキストランなどの直鎖ポリマー；脂質；コレステロール基（ステロイドなど）；炭水化物、またはオリゴ糖分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0037】

例えば、連結順序に関する設計を選択する際には、それらの双方の構成要素がそれぞれの標的に対する高い結合親和性を保つように、１つの構成要素の他の構成要素の空間配置に対する影響を最小化させることが好ましい。連結順序は、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２、またはＳＩＲＰαＤ１−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２−Ｆｃ、またはＶＥＧＦＲ１Ｄ２−ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃであってもよい。また当業者は、標的結合親和性が損なわれない限り、組換え二機能性融合タンパク質の分子量を最小化させて、融合タンパク質の生成を促進させるべきであることを認識するであろう。

【0038】

例えば、リンカータンパク質断片は、Ｆｃ断片、またはその他の適切なリンカータンパク質であってもよい。Ｆｃ断片は、サイズが２３２アミノ酸であってもよく、ヒンジ領域にシスチン、ＣＨ２領域に２つのシスチン、およびＣＨ３領域に２つのシスチンを含んでなる。ヒンジ領域のシスチンが、２つの単量体間のジスルフィド結合形成に寄与し、それによってホモ二量体を生成する一方で、ＣＨ２およびＣＨ３領域のシスチンは、鎖内ジスルフィド結合を形成して、タンパク質を安定化させ得る。

【0039】

免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＡが挙げられ、その中では、ＩｇＧが最も豊富で比較的安定している。ＩｇＧは、そのＦｃ断片がスタフィロコッカスプロテインＡとの最大結合活性を示し、したがって容易に精製され得ることから、本発明において好適である。

【0040】

例えば、ＣＤ４７と結合できる、ＳＩＰＲの細胞外領域のＩｇ領域（ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰγ）は、全て融合タンパク質で使用されてもよい。これは、ＶＥＧＦＲの細胞外領域Ｉｇ様領域についてもあてはまる。ＶＥＧＦＲ１のＤ２は、最大活性でＶＥＧＦに結合することが知られており、したがって本発明において好適である。

【0041】

非ヒト動物からのタンパク質またはペプチドの強力な免疫原性が、アレルギーおよびその他の悪影響をもたらすこともあるために、好ましくは、ヒトがん治療ではヒト由来配列が使用される。しかし、本発明では、異なる適用目的に基づいて、その他の動物タンパク質またはペプチドもまた使用されてもよい。

【0042】

一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質中のシグナル調節タンパク質は、ＳＩＲＰαである。前記シグナル調節タンパク質の細胞外ドメインのＩｇ様領域は、ＳＩＲＰαＤ１である。

【0043】

一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質中のＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１であり、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様領域は、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの第２のＩｇ様領域（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）である。

【0044】

一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質中のＦｃ断片は、ＩｇＧ１のＦｃ断片である。

【0045】

一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片を介して、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの第２のＩｇ様領域（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）に連結し、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２を生じる、ヒトＳＩＲＰαの細胞外ドメインの第１のＩｇ様領域を含んでなる。

【0046】

一実施形態では、本発明の組換え二機能性融合タンパク質のアミノ酸配列は、図３のＢに示される（配列番号８）。一実施形態では、二機能性組換え融合タンパク質は、配列番号８に記載される配列を有する、ポリペプチドを含んでなる。別の実施形態では、ポリペプチドは、上記ポリペプチドと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性があるアミノ酸配列を有し、その中でポリペプチドはＣＤ４７およびＶＥＧＦの双方に結合でき、腫瘍細胞増殖を阻害できる。

【0047】

別の態様では本発明は、配列番号８に記載される配列を有するポリペプチドを含んでなる二機能性組換え融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ポリペプチドは、上記ポリペプチドと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性があるアミノ酸配列を有し、その中でポリペプチドはＣＤ４７およびＶＥＧＦの双方に結合でき、腫瘍細胞増殖を阻害できる。

【0048】

本発明は、前述の組換え二機能性融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物もまた開示する。必要ならば、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体または賦形剤もまた、医薬組成物に包含されてもよい。担体としては、薬剤学では普通である、希釈剤、ビヒクル、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、収着担体、潤滑剤などが挙げられる。

【0049】

このような組成物は、薬学的に許容される材料と生理学的に許容される製剤材料との混和材中に、治療的または予防的有効量のポリペプチドまたはタンパク質を含んでなる。医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解または遊離速度、吸着または透過を改変、維持または保存するための製剤材料を含有してもよい。適切な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（ホウ酸、炭酸水素、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、その他の有機酸など）；増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；複合化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；増量剤；単糖類；二糖類およびその他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色料；着香料および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存料（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０やポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）；安定性促進剤（スクロースまたはソルビトール）；浸透圧促進剤（アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または医薬品添加物が挙げられるが、これに限定されるものではない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）。

【0050】

最適医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形態、および所望の用量次第で、当業者によって判定されるであろう。例えば、前出のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照されたい。このような組成物は、ポリペプチドの物理的状態、安定性、生体内遊離速度、および生体内クリアランス速度に影響を与えてもよい。例えば、適切な組成物は、注射用水、非経口投与のための生理学的食塩水であってもよい。

【0051】

医薬組成物中の主要ビヒクルまたは担体は、水性または非水性のどちらであってもよい。例えば、適切なビヒクルまたは担体は、場合により非経口投与のための組成物で一般的なその他の物質が添加された、注射用水、生理学的食塩水または人工脳脊髄液であってもよい。血清アルブミンと混合された中性緩衝食塩水または生理食塩水は、さらなる代表的ビヒクルである。その他の代表的医薬組成物は、Ｔｒｉｓ緩衝液、または酢酸緩衝液を含んでなり、それらはソルビトールまたはその適切な代替物をさらに含んでもよい。本発明の一実施形態では、組成物は、所望の純度を有する選択された組成物と、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態の任意選択の配合物因子（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）とを混合することで、貯蔵のために調合されてもよい。さらに、治療用組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として調合されてもよい。

【0052】

製剤は、例えば、吸入療法、経口、または注射などの多様な方法によって送達され得る。非経口投与が検討される場合、本発明で使用される治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に、所望のポリペプチドを含んでなる、発熱性物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態であってもよい。非経口注射に特に適するビヒクルは、その中でポリペプチドが無菌等張溶液として調合される、適切に保存された無菌蒸留水である。さらに別の調製は、製品の制御放出または持続放出を提供する、注射用微小球、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームなどの所望の分子と、薬剤との調合を伴い得て、次に製品は蓄積注射を通じて送達されてもよい。ヒアルロン酸もまた使用されてもよく、これは、循環中の持続期間を促進する効果を有してもよい。所望の分子を導入するためのその他の適切な手段としては、植込み型薬物送達デバイスが挙げられる

【0053】

別の態様では、注射投与に適する医薬製剤は、水溶液中で、好ましくは、ハンク溶液、リンゲル液、または生理学的緩衝食塩水などの生理学的適合性緩衝液中で、調合されてもよい。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増大させる物質を含有してもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、妥当な油性注射懸濁液として調合されてもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油または合成脂肪酸エステルなどの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームなどが挙げられる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーもまた、送達のために使用されてもよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤または化合物の溶解度を増大させる薬剤もまた含有して、高度に濃縮された洗剤溶液の調製ができるようにされてもよい。別の実施形態では、医薬組成物は、吸入のために調合されてもよい。吸入溶液はまた、エアロゾル送達のために噴霧剤と共に調合されてもよい。さらに別の実施形態では、溶液は噴霧されてもよい。肺投与は、化学修飾タンパク質の肺送達を記載する、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号明細書でさらに説明される。

【0054】

特定の製剤が経口投与されてもよいこともまた、検討される。本発明の一実施形態では、この様式で投与される分子は、錠剤およびカプセルなどの固体剤形の調剤で習慣的に使用される担体の存在下または不在下で、調合され得る。例えば、カプセルは、生物学的利用能が最大化され体循環前の分解が最小化された場合に、胃腸管内のある点で製剤の活性部分を遊離するように設計されてもよい。治療的分子の吸収を促進させるために、追加的な薬剤が含まれ得る。希釈剤、着香料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、およびバインダーもまた、用いられてもよい。経口投与のための医薬組成物はまた、経口投与に適する使用量で、当該技術分野で周知の薬学的に許容可能な担体を使用して、調合され得る。このような担体は、医薬組成物が、患者による摂取のために、錠剤、丸薬、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして、調合できるようにする。

【0055】

経口使用のための医薬品は、活性化合物を固体賦形剤と合わせて、結果として得られる顆粒混合物を（任意選択的に粉砕後に）処理し、錠剤または糖衣丸コアを得ることで、得られ得る。所望ならば、適切な助剤もまた添加され得る。適切な賦形剤としては、乳糖、スクロース、マンニトール、およびソルビトールをはじめとする糖などの炭水化物、またはタンパク質増量剤；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、またはその他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース；アラビアおよびトラガカントをはじめとするガム；およびゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質が挙げられる。所望ならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、およびアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。

【0056】

糖衣丸コアは、アラビアガム、滑石、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物もまた含有してもよい、濃縮砂糖溶液などの適切なコーティングと併せて使用されてもよい。製品識別のために、または活性化合物の量すなわち、用量を特徴付けるために、染料または色素が、錠剤または糖衣丸コーティングに添加されてもよい。

【0057】

経口的に使用し得る医薬品としては、ゼラチンからできたプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの被覆とからできた軟質密封カプセルもまた挙げられる。プッシュフィットカプセルは、乳糖またはデンプンなどの増量剤またはバインダー、滑石またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意選択的に安定剤と混合された、活性成分を含有し得る。軟質カプセル内では、活性化合物は、安定剤の存在下または不在下で、脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解されまたは懸濁されていてもよい。

【0058】

持続送達または制御送達製剤中のポリペプチドを含む製剤をはじめとする、追加的な医薬組成物は、当業者には明白であろう。リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔性ビーズ、および蓄積注射などの多様なその他の持続送達または制御送達手段を調合するための技術もまた、当業者に知られている．例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の制御放出を記載する、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号明細書を参照されたい。持続放出製剤の追加的な例としては、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許第５８，４８１号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７，（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、酢酸ビニルエチレン（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）を含んでもよい。持続放出組成物としてはまた、いくつかの当該技術分野で公知の方法のいずれかによって調製され得る、リポソームも挙げられる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８２：３６８８（１９８５）；欧州特許第３６，６７６号明細書；欧州特許第８８，０４６号明細書；欧州特許第１４３，９４９号明細書を参照されたい。

【0059】

生体内投与のために使用される医薬組成物は、典型的に、無菌でなくてはならない。それは、滅菌濾過膜を通過させる濾過によって、達成されてもよい。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用した滅菌が、凍結乾燥および水戻しの前または後のどちらかで実施されてもよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態でまたは溶液で貯蔵されてもよい。さらに、非経口組成物は、通常、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する、静脈注射用溶液バッグまたはバイアルなどの無菌アクセスポートを有する容器に入れられる。

【0060】

ひとたび医薬組成物が調合されたら、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体、または脱水または凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル内に貯蔵されてもよい。このような製剤は、すぐ使用できる形態、または投与に先だって水戻しを要する形態（例えば、凍結乾燥形態）のどちらかで、貯蔵されてもよい。

【0061】

特定の実施形態では、本発明は、単回投与単位を作成するためのキットを対象とする。キットは、それぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器、および水性製剤を有する第２の容器の双方を含有してもよい。単一および複数チャンバーがあるプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよび溶解シリンジ）を含有するキットもまた、本発明の範囲内に含まれる。

【0062】

治療的に用いられる医薬組成物の有効量は、例えば、治療状況および目的に左右される。したがって当業者は、治療のための適切な用量レベルが、一つには、送達される分子、ポリペプチドがそれに対して使用される適応症、投与経路、および患者のサイズ（体重、身体表面積または臓器サイズ）と状態（年齢および総体的な健康）次第で、変動することを理解するであろう。したがって、臨床医は、最適治療効果を得るために、用量を滴定して投与経路を変更してもよい。典型的な用量は、上述の要因次第で、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってもよい。ポリペプチド組成物は、好ましくは、静脈内に注射または投与されてもよい。長時間作用型医薬組成物は、特定製剤の半減期およびクリアランス速度次第で、３〜４日間毎、毎週、または隔週で投与されてもよい。投与の頻度は、使用される製剤中のポリペプチドの薬物動態パラメータに左右される。典型的に、組成物は、所望の効果を達成する用量になるまで投与される。したがって組成物は、単回用量として、または経時的に複数用量として（同一であるかまたは異なる濃度／用量で）、または持続注入として、投与されてもよい。適切な用量のさらなる精密化は、日常的に行われる。適切な用量は、適切な用量応答データの使用を通じて確認されてもよい。

【0063】

医薬組成物の投与経路は、例えば、経口的；静脈内、腹腔内、大脳内（脳実質内）、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、門脈内、病巣内経路、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、または腹腔内注射を通じて；ならびに持続放出システムによるまたは移植装置による、鼻腔内、腸内、局所、舌下、尿道、膣内、または直腸内手段などの公知の方法に従う。所望であれば、組成物は、ボーラス注入によって投与され、または点滴によって連続的に、または移植装置によって、投与されてもよい。代案としてはまたはそれに加えて、組成物は、その上に所望の分子が吸収されまたはカプセル化されている、メンブレン、スポンジ、または別の適切な材料の移植を通じて、局所的に投与されてもよい。移植装置が使用される場合、装置は、任意の適切な組織または臓器に埋め込まれてもよく、所望の分子の送達は、拡散、時期設定放出ボーラス、または連続投与を通じた送達であってもよい。

【0064】

症例によっては、本発明の二機能性融合タンパク質は、本明細書に記載されるような方法を使用して、ポリペプチドを発現および分泌するように遺伝子操作されている、特定細胞の移植によって送達され得る。このような細胞は、動物またはヒト細胞であってもよく、自己由来、異種性、または異種であってもよい。任意選択的に、細胞は、不死化されていてもよい。免疫学的反応の確率を低下させるために、細胞をカプセル化して、周囲組織の浸潤を回避してもよい。カプセル化材料は、典型的に、ポリペプチド生成物を放出させるが、患者の免疫系による、または周囲の組織からのその他の有害な要素による、細胞破壊を防止する、生体適合性の半透性ポリマーエンクロージャまたはメンブレンである。

【0065】

本発明の二機能性融合タンパク質、またはその誘導体をコードする核酸分子が対象に直接導入される、生体内遺伝子治療もまた想定される。例えば、本発明の二機能性融合タンパク質をコードする核酸配列が、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適切な送達ベクターの存在下または不在下で、核酸コンストラクトの局所注射を通じて標的細胞内に導入される。代案のウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、および乳頭腫ウイルスベクターが挙げられるが、これに限定されるものではない。ウイルスベクターの物理的移動は、所望の核酸コンストラクトまたは所望の核酸配列を含有するその他の適切な送達ベクターの局所注射、リポソーム媒介移入、直接注射（裸のＤＮＡ）、または微粒子衝撃（遺伝子銃）によって、生体内で達成されてもよい。

【0066】

本開示の組成物は、単独でまたはその他の治療薬との組み合わせで使用されて、それらの治療効果を促進し、または可能な副作用を低減させてもよい。

【0067】

本発明の別の目的は、上記組換え二機能性融合タンパク質と、それを含んでなる医薬組成物とを調製する方法を提供することである。一実施形態では、調製方法は、（１）コード化をするポリヌクレオチド分子を提供するステップと；（２）（１）のポリヌクレオチド分子を含んでなる発現ベクターを構築するステップと；（３）（２）の発現ベクターで、適切な宿主細胞を形質移入または形質転換して培養し、宿主細胞内でタンパク質を発現させるステップと；（４）タンパク質を精製するステップとを含んでなる。調製は、当業者によって実証され良く知られている技術によって、実施されてもよい。

【0068】

本発明の別の目的は、前述の医薬組成物の有効量をそれを必要とする患者または対象に投与するステップを含んでなる、本発明の医薬組成物を使用して、がんを治療する方法を提供することである。一実施形態では、医薬組成物が使用されて、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、乳がん、膵臓がんおよび腎臓がんをはじめとするが、これに限定されるものではない、ＣＤ４７過剰発現腫瘍またはがんが治療される。

【0069】

一実施形態では、医薬組成物を使用して、クローン病、アレルギー性喘息、関節リウマチをはじめとするが、これに限定されるものではない、ＣＤ４７を過剰発現するその他の関連病状が治療され得る。

【0070】

一実施形態では、医薬組成物は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、肝臓線維症、血管肉腫などをはじめとするが、これに限定されるものではない、ＶＥＧＦの機能または活性を阻害することが所望される疾患で使用され得る。

【0071】

また、本発明は、組換え二機能性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子と、組換え二機能性融合タンパク質を発現する発現ベクターとを提供する。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、形質転換能を有する人工染色体（ＴＡＣ）、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）、およびヒト人工エピソーム染色体（ＨＡＥＣ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0072】

本発明は、上記発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。宿主細胞は、発現ベクターで形質転換または形質移入されてもよい。適切な宿主細胞としては、原核細胞、酵母、およびその他の真核生物が挙げられる。好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、酵母または哺乳類細胞株（ＣＯＳまたはＣＨＯなど）が使用される。

【0073】

本発明の組換え二機能性融合タンパク質（ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）は、ヒトシグナル調節タンパク質ドメインの細胞外の第１のＩｇ様領域（ＳＩＲＰαＤ１）、ヒトＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインの第２のＩｇ様領域（ＶＥＧＦＲ１Ｄ２）と、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片とを含んでなる。タンパク質は、１００ｋＤａの分子量のホモ二量体である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の安定発現細胞株がスクリーニングによって得られ、１００ミリグラムの融合タンパク質が得られた。生体外では、タンパク質は、ＣＤ４７およびＶＥＧＦに同時に結合して、ＣＤ４７とマクロファージ表面のＳＩＲＰとの結合を妨げ、マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を促進して、ＶＥＧＦによって誘導される血管内皮細胞増殖を阻害し得ることが確認された。ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、生体内試験でＣＤ４７陽性腫瘍細胞ＨＬ６０に対する強力な効力を示し、腫瘍を完全に排除してもよい。これは、腫瘍組織内の血管新生を阻害し、マクロファージによる食作用を刺激することで達成される。

【0074】

本発明は、２つの重要ながん標的、ＳＩＲＰαおよびＶＥＧＦを対象とする。ＳＩＲＰαのブロックは、マクロファージ（Ｍφ）による腫瘍細胞の食作用を促進してもよいが、大型腫瘍は、豊富な血液供給のために効果的に貪食（ｐｈａｇｏｃｙｔｅｄ）されない。ＶＥＧＦのみのブロックもまた、腫瘍を排除し得ない。ＳＩＲＰαおよびＶＥＧＦが同時にブロックされると、腫瘍は、マクロファージによる食作用（Ｍφ）の影響をより受け易くなり、増殖が阻害されて完全に排除され得る。

【0075】

ここで本発明を下の非限定的実施例によって詳述する。

【実施例】

【0076】

実施例１：ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２はＣＤ４７およびＶＥＧＦと結合してＨＬ６０腫瘍増殖を阻害する。
１．ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２発現ベクターの構築
Ｐｌｇ−Ｔａｉｌ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）が用いられた。クローニング前に、プライマー１および２によってＦｃコード配列を増幅させて、Ｆｃのカルボキシル末端の停止コドンを欠失させ、ＰＣＲ産物をＰｌｇ−Ｔａｉｌ中のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングすることで、ｐｌｇ−Ｔａｉｌが改変された。ＳＩＲＰαＤ１のコード配列は、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−２０２（商標））細胞からのプライマー３および４によって増幅され、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２のコード配列は、ＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ−１００−０１０（商標））細胞からのプライマー５および６によって増幅された。２つのＰＣＲ産物は、改変ｐｌｇ−Ｔａｉｌベクター中のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ／ＸｂａＩ部位にそれぞれクローン化され、このようにしてベクターｐＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２が作成された。

【0077】

【表1】

【0078】

２．タンパク質発現および精製
ＣＨＯ細胞を含有する完全細胞培養液ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）が、ウェルあたり０．５ｍｌで２４ウェルプレートに添加され、プレートはインキュベーター内で２４時間保たれた。形質移入のために、０．５μｇのプラスミドＤＮＡおよび２μｌのリポフェクタミン２０００（カタログ番号１１６６８−０２７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が５０μｌの無血清培養液に別々に溶解され、次に室温で２０分間混合されて、ウェルに緩慢に添加され、インキュベーター内に２４時間戻された。翌日、１００μｌの血清が採取されて、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるタンパク質発現試験のために使用された。

【0079】

３．タンパク質発現試験
タンパク質発現試験は、以下の工程によってＥＬＩＳＡによって実施された：抗ヒトＩｇＧヤギ抗体Ｆ（ａｂ'）２フラグメント（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ）がＰＢＳリン酸緩衝液に溶解されて、次にウェルあたり２０ｎｇで、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート内に添加された。ＥＬＩＳＡプレートは、４℃の冷蔵庫に一晩入れられた。試験では、プレートがブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０、３％脱脂乳）で１時間ブロックされ、次に希釈血清が添加されて室温で１時間インキュベートされた。洗浄溶液（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０）で５回の洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）が添加され、プレートが室温で１時間インキュベートされた。５回の洗浄後、ＨＲＰの基質が添加されて、２分後に停止液（１ＮＨ_２ＳＯ_４）を使用して、発色反応が停止された。光学濃度は、４５０ｎｍで測定された。

【0080】

４．安定発現細胞株のスクリーニング
形質移入細胞は、濃度増大圧縮抗生物質スクリーニング（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、カタログ番号１０１３１０３５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を受けた。不安定細胞は徐々に死滅して、生存した細胞は、ウェルあたり０．５〜１個の細胞に希釈にして、５枚の９６ウェルプレートに添加された。プレートは、インキュベーターに１０〜１５日間入れられた。単一クローンを含有するウェルがＥＬＩＳＡで試験され、次に陽性細胞が増殖され、無血清Ｅｘ−細胞ＣＤＣＨＯ培養液（カタログ番号１４３６１Ｃ−１０００ＭＬ、ＳＩＧＭＡ）を用いて習慣的に培養された。さらなるスクリーニング後、最大発現レベルに相当する細胞が選択されて、使用のために冷凍された。

【0081】

５．タンパク質生成および精製
安定発現細胞株（３×１０^５／ｍｌ）が、３００ｍｌ無血清培養液を含有する２Ｌ振盪フラスコに接種され、振盪フラスコは培養のために振盪床に入れられた。細胞密度が５×１０^６／ｍｌに達した後、本発明者らは上清を得た。上清は、プロテインＡカラムによって精製された。精製タンパク質は、透析（ｐＨ７．０）によってＰＢＳで置換された。タンパク質電気泳動分析を用いて、少なくとも９８％の純度が確証された。

【0082】

６．標的結合親和性
標的ＣＤ４７およびＶＥＧＦに対するＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２の結合親和性は、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ法を使用して試験された。

【0083】

ＳＥＭ−Ｋ２細胞およびＨＬ６０細胞が、結合親和性試験で使用された（前者は急性リンパ芽球性白血病細胞であり、後者は前骨髄球性白血病細胞である）。ＰＢＳでの洗浄後、細胞は、１×１０^６／ｍｌの濃度でＰＢＳに懸濁された。ｈｌｇＧ（１μｇ／ｍｌ）が細胞懸濁液に添加されて、懸濁液は４℃の冷蔵庫内で１時間インキュベートされた。細胞は、ＰＢＳで洗浄した後に、９６ウェルＵ形細胞培養プレート（カタログ番号１６３３２０、Ｎｕｎｃ（商標））に移された（ウェルあたり１００μｌ）。次に、異なる濃度のＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２が添加されて、細胞は、４℃の冷蔵庫内で１時間インキュベートされた。細胞は、ＰＢＳで洗浄した後に懸濁されて、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（カタログ番号Ｆ９５１２、Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートされた。後１時間、細胞は、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙ Ｃｙｔｅ６ＨＴ−２Ｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって試験された。

【0084】

ＶＥＧＦ−Ａの結合親和性は、以下の工程でＥＬＩＳＡによって試験された：
ＶＥＧＦ−１６５をコーティング緩衝液ＣＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，製品コード：１００１３２９２８８ Ｃ３０４１−１００ＣＡＰ）で１０００ｎｇ／ｍｌに希釈する；１００μｌの溶液をＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号４４２４０４、Ｎｕｎｃ（商標））に添加する（ウェルあたり１００ｎｇ）；被覆プレートを４℃の冷蔵庫に一晩入れる；試験中に、被覆プレートを０．０５％のＰＢＳ−Ｔで１回洗浄し、次に被覆プレートを３％の脱脂乳で１時間封止する；希釈ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２（２０、１０、５、…０．０１ｎＭ）を被覆プレートに添加する（ウェルあたり１００μｌ）；室温で１時間インキュベートした後、サンプルを廃棄し、溶液を０．０５％のＰＢＳ−Ｔで５回洗浄する；１００μｌの希釈ＨＲＰ−ウサギ抗ヒトＩｇＧＦｃを添加する（１：２００００）（カタログ番号：３０９−０３６−００８、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）；溶液を室温で１時間インキュベートする；プレートを洗浄溶液で５回洗浄する；ＨＲＰ基質を添加する；暗所で発色反応を１０〜２０分間実施し、１ＮＨ_２ＳＯ_４を使用して反応を停止させる；マイクロプレートリーダー上でＯＤ４５０値を得る。

【0085】

７．標的活性ブロックアッセイ
ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２が、ＣＤ４７−ＳＩＲＰαの結合によって誘導される食作用阻害活性をブロックし得るかどうかを試験するために、ＦＩＴＣＣＦＳＥ標識ＳＥＭ−Ｋ２細胞およびＲＡＷ２６４．７細胞を２：１のＲＡＷ２６４．７：ＳＥＭ−Ｋ２比で混合する；次に混合物を６枚の新しい細胞培養プレート内で、異なる濃度を有するＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ、およびヒトＩｇＧ−Ｆｃと共にインキュベートする；４時間後にプレートを注意深く振盪して、懸濁ＳＥＭ−Ｋ２細胞を吸引し、プレートをＰＢＳで２回洗浄して全ての懸濁細胞を除去する；プレート壁上のＲＡＷ２６４．７細胞をトリプシン−ＥＤＴＡにより消化して、プレートをＰＢＳで２回洗浄する；ＲＡＷ２６４．７細胞によるＳＥＭ−Ｋ２細胞の食作用比率をフローサイトメトリーを通じて定量的に分析する。

【0086】

８．抗腫瘍アッセイ
ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２の生体内抗腫瘍活性が、ＨＬ−６０皮下腫瘍モデルにおいて試験された。ＨＬ−６０細胞株は、急性前骨髄球性白血病がある１人の患者に由来する、特徴がよく分かっている生体外ヒト白血病モデルであり^［６］、薬物の治療効果のための異種移植片マウスモデルで幅広く使用されている^{［７−９］}。２０匹のＢａｌｂ／ｃヌードマウスに、白血病（ＨＬ６０）細胞（マウスあたり４×１０^６個の細胞）が皮下注射された。腫瘍が１００〜１５０ｍｍ^３にまで増殖したら、マウスは４群に分割された：第１群には、ＰＢＳが腹腔内注射され；第２群には、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２−Ｆｃが腹腔内注射され；第３群には、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃが腹腔内注射され；第４群には、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２が腹腔内注射された。各グループの用量は３ｍｇ／ｋｇであり、週２回で連続的に６回投与された。腫瘍の体積および重量は、週２回測定された。

【0087】

実験結果
１．ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２発現ベクターの構築
ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片によって連結する、ＳＩＲＰαの第１の細胞外ドメイン（Ｄ１）およびＶＥＧＦＲ１の第２の細胞外ドメイン（Ｄ２）からなる組換えＦｃ融合タンパク質であり、ＭＡＣ−０１と命名される。それは、図２のＡに示されるような構造を有する。ＳＩＲＰαＤ１およびＶＥＧＦＲ１Ｄ２は、分子クローニングによって、それぞれＮ末端およびＣ末端に連結される。ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２の配列は、１５０３ヌクレオチドを含有し（図３のＡ）、その中でシグナルペプチドコード配列は６３ヌクレオチド（赤色）を有し、ＳＩＲＰαＤ１は４２６ヌクレオチド（青色）を有し、ＩｇＧ１−Ｆｃは６９６ヌクレオチド（黒色）を有し、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２は３０６ヌクレオチド（緑色）を有し、ＥｃｏＲＩ配列は６ヌクレオチドを有し、ＸｈｏＩ配列は６ヌクレオチドを有する。図３のＢは、対応するアミノ酸配列を示す。

【0088】

２．タンパク質発現解析
タンパク質電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用することで、本発明者らは、タンパク質分子量が、非還元条件下で１７０ｋＤａよりも大きいことを見出し（図４）、これは理論的な値（１００ｋＤａ）とかなり異なる。これは、タンパク質のグリコシル化に起因するかもしれない。

【0089】

３．ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２の標的結合親和性
フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡを使用することで、本発明者らは、ＶＥＧＦ−Ａに対する、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２の結合親和性を解析した。結果は、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２が、ＣＤ４７（図５のＡ）およびＶＥＧＦ−Ａ（図５のＢ）のどちらでも優れており、それぞれ０．１〜１．０ｎＭ（ＣＤ４７）および０．０８〜０．１５ｎＭ（ＶＥＧＦ−Ａ）のＥＣ５０を有することを示した。

【0090】

４．ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２はマクロファージによる腫瘍細胞の食作用を促進する
標識急性リンパ芽球性白血病細胞ＳＥＭ−Ｋ２、およびマウスのマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を使用することで、本発明者らは、腫瘍細胞の食作用に対する、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２の効果を解析した。結果は、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２が、腫瘍細胞のマクロファージによる食作用を有意に強化したことを示した（図６）。効果は用量依存的であった。

【0091】

５．ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２タンパク質の抗腫瘍活性
ＨＬ６０皮下腫瘍モデルを使用することで、本発明者らは、生体内ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２タンパク質の抗腫瘍活性を試験した。図７に示されるように、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２−Ｆｃ処置群は、腫瘍増殖に対する非常に限定的な阻害効果を示し、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ処置群は、腫瘍増殖に対する明白な阻害効果を示したが、腫瘍を排除するには十分でなかった。対照的に、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２による処置後、マウスは、治療開始時の１００ｍｍ^３からの腫瘍サイズの低下を示しながら、治療の終わりには、腫瘍はほとんど消滅していた。陰性対照群では、マウスの腫瘍体積は経時的に徐々に増大し、最終的に１０００ｍｍ^３に達した。実験結果は、ＶＥＧＦの活性阻害だけでは、ＨＬ６０腫瘍に対して有意な治療効果をもたらさないことを示し、ＨＬ６０腫瘍の増殖が、ＶＥＧＦにほとんど依存しないことが示唆された。腫瘍によって誘導されるマクロファージによる食作用阻害のブロックは、マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を強化し、それによって腫瘍細胞の増殖が有意に阻害された。しかし、ＶＥＧＦおよびＣＤ４７−ＳＩＲＰαの双方の機能が阻害されれば、腫瘍は、完全に除外されるであろう。

【0092】

上記データは、組換え二機能性融合タンパク質ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２が、優れた二重標的結合親和性がある新規組換えタンパク質であることを示唆する。生体内実験は、ＳＩＲＰαＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２タンパク質が、有意な抗腫瘍活性を有することを示す。ＨＬ６０モデルでは、腫瘍が完全に排除され得る。タンパク質は、腫瘍を排除する主に２つの機序を有する：腫瘍増殖に必要な栄養供給を停止させる、腫瘍中の血管増殖阻害；マクロファージによる腫瘍細胞の強力な食作用を誘導するように、腫瘍によって誘導される自己防御機序を破壊する、腫瘍細胞表面のＣＤ４７と貪食細胞表面のＳＩＲＰαとの結合。これらの２つの機序は相乗的であり、すなわち、腫瘍体積は栄養欠如のために低下し、したがって腫瘍はマクロファージによってより容易に貪食されて、腫瘍排除がもたらされる。

【0093】

実施例２ ＭＡＣ−０１は肺がん（Ａ５４９）増殖を阻害する。
上記組換えＦｃ融合タンパク質ＳＩＲＰＡＤ１−Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ１Ｄ２（ＭＡＣ−０１）が、Ａ５４９肺がん異種移植モデル上で試験された。Ａ５４９細胞株は、５８才の白人男性のがん性肺組織の除去と外植腫瘍中での培養を通じて、Ｄ．Ｊ．Ｇｉａｒｄ，ｅｔ ａｌ．によって１９７２年に最初に開発された^{［１０］［１１］}。Ａ５４９異種移植マウスモデルは、多数の薬剤候補の有効性評価のために広範に利用されている^{［１２−１５］}。実験データは、ＭＡＣ−０１が、ＶＥＧＦおよびＣＤ４７の双方に同時に結合し得て、したがってそれぞれの分子媒介シグナルをブロックし得ること示した。生体内肺がん異種移植モデルで検討された場合、ＭＡＣ−０１は強力な抗腫瘍活性を示し、それは単一分子の組み合わせの活性よりも明確により良い。

【0094】

Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに、２００μＬの無血清培地／マトリゲル（５０：５０ｖ／ｖ）中の５×１０^６のＡ５４９細胞が皮下注射された。平均腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ^３に達したら、適切なサイズの腫瘍を有する３０匹のマウスが、腫瘍体積に従って５群（群あたり６匹）に無作為化された。マウスは、５ｍｇ／ｋｇのＭＡＣ−０１、または２．５ｍｇ／ｋｇのＳＩＲＰＡＤ１−Ｆｃ、または２．５ｍｇ／ｋｇのＶＥＧＦＲ１Ｄ２−Ｆｃ、または２．５ｍｇ／ｋｇのＳＩＲＰＡＤ１−Ｆｃと２．５ｍｇ／ｋｇのＶＥＧＦＲ１Ｄ２−Ｆｃとの組み合わせのいずれかで、週２回の腹腔内注射によって、４週間にわたり処置された。陰性対照として、ＰＢＳ処置が使用された。抗腫瘍効果は、処置群からの腫瘍体積を対照群で除して１００を乗じた、％Ｔ／Ｃ（処置群対対照群）として表される。

【0095】

図８で示されるように、ＳＩＲＰＡＤ１−Ｆｃのみによる処置は、極小の腫瘍増殖阻害をもたらし、腫瘍増殖阻害比はわずか９３％Ｔ／Ｃであった。ＶＥＧＦＲ１Ｄ２−Ｆｃによる処置が、劇的な腫瘍増殖阻害（３２％Ｔ／Ｃ）を引き起した一方で、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２−Ｆｃ処置へのＳＩＲＰＡＤ１−Ｆｃの添加は、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２−Ｆｃ−媒介（ｍｅｄａｉｔｅｄ）腫瘍増殖阻害をさらに向上させなかった（３３％Ｔ／Ｃ）。しかし有望なことに、組換え二機能性タンパク質ＭＡＣ−０１による処置は、劇的な腫瘍増殖阻害（２５％Ｔ／Ｃ）をもたらし、それは、ＶＥＧＦＲ１Ｄ２−Ｆｃのみ、または単一分子（Ｐ＝０．０５）組み合わせのどちらの処置群と比較しても、大幅により顕著であった。統計学分析の結果は、表２に示される。

【0096】

【表2】

【0097】

上記結果は、組換え二機能性タンパク質ＭＡＣ−０１が、劇的な生体内抗腫瘍活性を有することを示し、これはＶＥＧＦおよびＳＩＲＰαを同時にブロックするためである可能性が高い。

【0098】

本発明を１つまたは複数の実施形態に関連して上で説明したが、本発明は、これらの実施形態に限定されず、説明は、添付の特許請求の精神および範囲内に含まれてもよい、全ての代案、修正、および同等物をカバーすることが意図されるものと理解すべきである。本明細書で引用される全ての参考文献（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）は、その内容全体が、参照によりさらに援用される。

【0099】

参考文献
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【0100】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]