特許 6357354 電子顕微鏡観察用染色剤および電子顕微鏡観察用試料の染色方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6357354

(24)【登録日】2018年6月22日

(45)【発行日】2018年7月11日

(54)【発明の名称】電子顕微鏡観察用染色剤および電子顕微鏡観察用試料の染色方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 1/30 20060101AFI20180702BHJP

   G01N 1/28 20060101ALI20180702BHJP

【ＦＩ】

   G01N1/30

   G01N1/28 F

【請求項の数】4

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2014-113973(P2014-113973)

(22)【出願日】2014年6月2日

(65)【公開番号】特開2015-227831(P2015-227831A)

(43)【公開日】2015年12月17日

【審査請求日】2017年2月21日

(73)【特許権者】

【識別番号】000004271

【氏名又は名称】日本電子株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100090387

【弁理士】

【氏名又は名称】布施 行夫

(74)【代理人】

【識別番号】100090398

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 美千栄

(72)【発明者】

【氏名】中越 雅道

(72)【発明者】

【氏名】細木 直樹

【審査官】 島田 保

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−２４７４１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−２２１８５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１６０８０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１１２４６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１２７６３２（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ １／００−１／３４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

三酢酸ルテチウムを含有する、電子顕微鏡観察用染色剤。

【請求項2】

請求項１において、
さらに、メタノールを含む溶媒を含有する、電子顕微鏡観察用染色剤。

【請求項3】

請求項１または２に記載の電子顕微鏡観察用染色剤に試料を接触させる工程を含む、電子顕微鏡観察用試料の染色方法。

【請求項4】

請求項３において、
前記電子顕微鏡観察用染色剤に接触した試料を、鉛化合物を含有する染色液に接触させる工程をさらに含む、電子顕微鏡観察用試料の染色方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、電子顕微鏡観察用染色剤および電子顕微鏡観察用試料の染色方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生体試料は、炭素、酸素、窒素、および水素などの軽元素から出来ており、無染色では電子顕微鏡による観察が困難であるため、重金属イオン溶液による電子染色が必要である。従来、電子染色剤、ネガティブならびにポジティブ染色剤として、酢酸ウラニルが多用されていた。

【0003】

しかしながら、近年、酢酸ウラニルは、本邦において入手困難である。また、酢酸ウラニルは、核燃料であり放射性物質のため使用に当たっては文科省に届出が必要である。その上、酢酸ウラニルは、使用済みであっても廃棄ができず永久保存が義務化されている。更に、使用認可も難しくなっている。そのため、酢酸ウラニルの代替品が要望されている。

【0004】

酢酸ウラニルに代替する電子染色剤として、例えば、特許文献１には、アリザリンが開示されている。また、特許文献２には、電子染色剤として、白金ブルー（［Ｐｔ_４（ＮＨ_３）_８（Ｃ_６Ｈ_１３Ｏ_５）_４］^＋５）が開示されている。

【0005】

また、特許文献３には、酢酸サマリウムの水溶液、または酢酸ガドリニウムの水溶液がエポキシ樹脂に包埋された生物組織試料等の電子染色剤として使用可能であり、その染色効果は酢酸ウラニルと同等であることが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００６−３８６６０号公報

【特許文献2】特開２００８−２８６７２９号公報

【特許文献3】特開２０１１−１１２４６８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

このように、近年、酢酸ウラニルの代替品として、簡便に電子染色を行うことができ、かつ高い染色効果を有する染色剤の探索が進められている。

【0008】

本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、簡便に電子染色を行うことができ、かつ高い染色効果を有する電子顕微鏡観察用染色剤および電子顕微鏡観察用試料の染色方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

（１）本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、
三酢酸ルテチウムを含有する。

【0010】

このような電子顕微鏡観察用染色剤では、高い染色効果を有することができる。さらに、このような電子顕微鏡観察用染色剤では、例えば、三酢酸ルテチウムを水やメタノール等の溶媒に溶解させることで電子染色剤として用いることができる。したがって、簡便に電子染色を行うことができる。

【0011】

（２）本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤において、
さらに、メタノールを含む溶媒を含有してもよい。

【0012】

このような電子顕微鏡観察用染色剤では、高い染色効果を有することができる。さらに、このような電子顕微鏡観察用染色剤では、三酢酸ルテチウムをメタノールを含む溶媒に溶解させることで電子染色剤として用いることができる。したがって、簡便に電子染色を行うことができる。また、このような電子顕微鏡観察用染色剤は、分散性が高く、試料粒子間に染色剤を分散させることができるため、試料が凝集している場合でも、染色剤を凝集させないことができる。

【0013】

（３）本発明に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法は、
本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤に試料を接触させる工程を含む。

【0014】

このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、試料を簡便かつ良好に電子染色することができる。

【0015】

（４）本発明に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法において、
前記電子顕微鏡観察用染色剤に接触した試料を、鉛化合物を含有する染色液に接触させる工程をさらに含んでいてもよい。

【0016】

このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法によれば、染色効果を高めることができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図2】酢酸ウラニル水溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図3】三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたβアミロイドの透過電子顕微鏡像。

【図4】酢酸ウラニル水溶液で染色されたβアミロイドの透過電子顕微鏡像。

【図5】三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたヘモシアニンの透過電子顕微鏡像。

【図6】酢酸ウラニル水溶液で染色されたヘモシアニンの透過電子顕微鏡像。

【図7】三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像。

【図8】酢酸ウラニル水溶液で染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像。

【図9】無染色のホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像。

【図10】三酢酸ルテチウム水溶液とクエン酸鉛染色液とで二重染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像。

【図11】酢酸ウラニル水溶液とクエン酸鉛染色液とで二重染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像。

【図12】各染色剤で染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像のコントラストを示すグラフ。

【図13】三酢酸ルテチウムの１００％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図14】三酢酸ルテチウムの１００％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図15】三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図16】三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図17】三酢酸ルテチウムの５０％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図18】三酢酸ルテチウムの５０％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図19】三酢酸ルテチウムの２５％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図20】三酢酸ルテチウムの２５％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図21】三酢酸ルテチウムの１０％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図22】三酢酸ルテチウムの１０％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図23】三酢酸ルテチウムの１％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【図24】三酢酸ルテチウムの１％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。

【0025】

１． 第１実施形態
１．１． 電子顕微鏡観察用染色剤
まず、第１実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤について説明する。

【0026】

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、ルテチウムを含む塩を含有する。ルテチウムを含む塩として、例えば、酢酸ルテチウム（Ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｌｕｔｅｔｉｕｍ ｓａｌｔ）が挙げられる。すなわち、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、例えば、三酢酸ルテチウムを含有する。なお、ここでは、三酢酸ルテチウムを含有するとは、三酢酸ルテチウムの水和物を含有している場合も含むものとする。三酢酸ルテチウムの水和物としては、例えば、酢酸ルテチウム四水和物(Ｌｕｔｅｔｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｔｅ， Ｌｕ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_３・４Ｈ_２Ｏ）が挙げ
られる。

【0027】

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、例えば、三酢酸ルテチウム水溶液である。本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤において、三酢酸ルテチウムの濃度は特に限定されず、例えば１質量％以上１０質量％以下である。本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤において、三酢酸ルテチウムの濃度は、例えば飽和濃度である。

【0028】

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、三酢酸ルテチウムに加えて、さらに、三酢酸ルテチウム以外の物質を含有していてもよい。

【0029】

ここで、電子顕微鏡観察用染色剤とは、電子顕微鏡観察の対象となる試料を染色するための染色剤（電子染色剤）をいう。なお、本実施形態において、染色とは、いわゆる電子染色をいい、試料の特定の部位や、試料の周囲（グリッドの支持膜と試料との間、試料の凹凸の凹部等）に電子の散乱を促す物質（重金属等）を吸着または結合させることをいう。電子顕微鏡観察用染色剤を用いて試料を染色することにより、電子顕微鏡像にコントラストをつけることができる。

【0030】

また、染色された試料の観察に用いられる電子顕微鏡としては、例えば、走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＥＭ）、走査透過電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＴＥＭ）などが挙げられる。

【0031】

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、例えば、タンパク質などの生体高分子を含んで構成される生体試料、炭素、酸素、窒素、水素などの軽元素を含んで構成される試料、ウイルス、リポソーム等の微粒子などを染色することができる。

【0032】

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤では、三酢酸ルテチウムを含有している。そのため、酢酸ウラニルと同等の高い染色効果を有することができる（後述する「１．３．
実施例」参照）。さらに、三酢酸ルテチウムは、合成等の必要がなく、例えば、水に溶解させることで電子染色剤として用いることができる。したがって、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤では、簡便に電子染色を行うことができる。

【0033】

１．２． 電子顕微鏡観察用試料の作製方法
次に、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法について説明する。本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法は、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法を含む。

【0034】

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法は、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤に試料を接触させる工程を含む。また、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法は、さらに、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤に接触した試料を、鉛化合物を含有する染色液に接触させる工程を含む（二重染色）。

【0035】

以下、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法について、より詳細に説明する。

【0036】

１．２．１． ネガティブ染色法
まず、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤を、ネガティブ染色法に適用した例について説明する。ここで、ネガティブ染色法とは、試料の周囲を染色剤で固めてコントラストをつける手法をいう。

【0037】

例えば、カーボン支持膜等を備えたグリッド上に、ウイルス等の試料を載せ、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤を加える。これにより、染色剤の一部が、グリッドの支持膜と試料との間、試料の凹凸の凹部等に残留し、透過電子顕微鏡像にコントラストがつく。以上の工程により、試料をネガティブ染色することができる。

【0038】

１．２．２． ポジティブ染色法
次に、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤を、ポジティブ染色法に適用した例について説明する。

【0039】

例えば、まず、生体試料をエポキシ樹脂に包埋する。包埋の方法としては、例えば、まず、灌流固定または浸漬固定した生体試料を切り出す。そして、切り出された生体試料を、カコジル酸緩衝１〜４％パラホルムアルデヒドと１〜４％グルタールアルデヒドとの混合液に浸漬し、前固定する。なお、前固定は、カコジル酸緩衝１〜４％パラホルムアルデヒドだけで行ってもよいし、１〜４％グルタールアルデヒドだけで行ってもよい。次に、前固定された生体試料を、カコジル酸緩衝液で洗浄し、１〜２％四酸化オスミウムで後固定する。そして、後固定された生体試料を上昇エタノール系列で脱水した後、エポキシ樹脂に包埋する。このようにして、生体試料をエポキシ樹脂に包埋することができる。なお、生体試料を包埋するための材料はエポキシ樹脂に限定されず、例えば、メタクリル酸樹脂、ポリエステル樹脂、パラフィン等を用いてもよい。

【0040】

次に、エポキシ樹脂に包埋された生体試料を薄片化する。薄片化は、例えば、ミクロトーム（ウルトラミクロトーム）を用いて行われる。

【0041】

次に、薄片化された生体試料を染色する。染色は、本実施形態に係る染色剤を薄片化された生体試料に接触させることにより行われる。例えば、染色は、本実施形態に係る染色剤に、薄片化された生体試料を浸漬させることにより行われる。ここで、電子顕微鏡観察用染色剤の温度は、例えば、５℃以上５０℃以下である。また、浸漬時間は、例えば、１分以上１０時間以下である。その後、染色された生体試料を純水等で洗浄する。以上の工程により、試料をポジティブ染色することができる。

【0042】

１．２．３． 二重染色
次に、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤で試料を染色した後に、鉛化合物を含有する染色液に接触させる二重染色について説明する。本実施形態では、例えば、試料を、三酢酸ルテチウム水溶液と鉛化合物を含有する染色液とによって二重染色する。

【0043】

鉛化合物としては、例えば、クエン酸鉛が挙げられる。このクエン酸鉛を含有する染色液（クエン酸鉛染色液）としては、例えば、レイノルド（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）法で処方されたものが挙げられる。クエン酸鉛染色液の温度は、例えば、５℃以上５０℃以下である。

【0044】

二重染色は、例えば、上述した手順（「１．２．２． ポジティブ染色」参照）でポジティブ染色された試料を、鉛化合物を含有する染色液に浸漬させることで行われる。浸漬時間は、例えば、１分以上１０時間以下程度である。クエン酸鉛染色液に浸漬された試料は、純水等によって洗浄されてもよい。また、鉛化合物として、例えば、硝酸鉛を用いてもよい。

【0045】

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、上述したように、簡便に電子染色を行うことができ、かつ高い染色効果を有する本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤を用いて染色するため、試料を、簡便かつ良好に染色することができる。

【0046】

また、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤に接触した試料を、鉛化合物を含有する染色液に接触させる工程をさらに含むため、より染色効果を高めることができる（後述する「１．３．５． 実施例５」、「１．３．６． 実施例６」参照）。

【0047】

１．３． 実施例
以下、実施例を挙げて本実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって制限されるものではない。

【0048】

１．３．１． 実施例１
（１）試料作製
試料は、液体培地で培養したＴ４ファージを用いた。まず、カーボン膜を張った銅製グリットにＴ４ファージを滴下し濾紙で余剰の液を吸い取る。次に、三酢酸ルテチウム水溶液をグリットに滴下しすぐに濾紙で余剰の液を吸い取ることでネガティブ染色し、電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0049】

なお、上記の三酢酸ルテチウム水溶液は、酢酸ルテチウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を、蒸留水で溶解することによって作製した。また、三酢酸ルテチウム水溶液の濃度は、２質量％とした。

【0050】

比較例として、上記手順と同様の手順により、Ｔ４ファージを酢酸ウラニル水溶液（２質量％水溶液）でネガティブ染色して電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0051】

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製ＪＥＭ−１４００）で観察した。図１は、三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像である。図２は、酢酸ウラニル水溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像である。

【0052】

図１に示すように、三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像では、Ｔ４ファージの周囲に染色剤が存在し、Ｔ４ファージの輪郭が明瞭になった。また、図１に示す三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像では、図２に示す酢酸ウラニル水溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像と同程度の高いコントラストの像が得られた。このことから、三酢酸ルテチウム水溶液は、酢酸ウラニル水溶液と同等の高い電子染色効果が得られることがわかった。

【0053】

１．３．２． 実施例２
（１）試料作製
試料は、繊維状のタンパク質であるβアミロイドを用いた。まず、カーボン膜を張った銅製グリットにβアミロイドを滴下し濾紙で余剰の液を吸い取る。次に、三酢酸ルテチウム水溶液をグリットに滴下しすぐに濾紙で余剰の液を吸い取ることでネガティブ染色し、電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0054】

なお、上記の三酢酸ルテチウム水溶液は、酢酸ルテチウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を、蒸留水で溶解することによって作製した。また、三酢酸ルテチウム水溶液の濃度は、２質量％とした。

【0055】

比較例として、上記手順と同様の手順により、βアミロイドを酢酸ウラニル水溶液（２質量％水溶液）でネガティブ染色して電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0056】

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製ＪＥＭ−１４００）で観察した。図３は、三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたβアミロイドの透過電子顕微鏡像である。図４は、酢酸ウラニル水溶液で染色されたβアミロイドの透過電子顕微鏡像である。

【0057】

図３に示すように、三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたβアミロイドの透過電子顕微鏡像では、βアミロイドの周囲に染色剤が存在し、βアミロイドの輪郭が明瞭になった。

【0058】

また、図３に示す三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたβアミロイドの透過電子顕微鏡像では、図４に示す酢酸ウラニル水溶液で染色されたβアミロイドの透過電子顕微鏡像と同程度の高いコントラストの像が得られた。このことから、三酢酸ルテチウム水溶液は、酢酸ウラニル水溶液と同等の高い電子染色効果が得られることがわかった。このように、三酢酸ルテチウム水溶液は、繊維状の物質に対しても高い染色効果を有することがわかった。

【0059】

１．３．３． 実施例３
（１）試料作製
試料は、呼吸色素タンパク質であるヘモシアニンを用いた。まず、カーボン膜を張った銅製グリットにヘモシアニンを滴下し濾紙で余剰の液を吸い取る。次に、三酢酸ルテチウム水溶液をグリットに滴下しすぐに濾紙で余剰の液を吸い取ることでネガティブ染色し、電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0060】

なお、上記の三酢酸ルテチウム水溶液は、酢酸ルテチウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を、蒸留水で溶解することによって作製した。また、三酢酸ルテチウム水溶液の濃度は、２質量％とした。

【0061】

比較例として、上記手順と同様の手順により、ヘモシアニンを酢酸ウラニル水溶液（２質量％水溶液）でネガティブ染色して電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0062】

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製ＪＥＭ−１４００）で観察した。図５は、三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたヘモシアニンの透過電子顕微鏡像である。図６は、酢酸ウラニル水溶液で染色されたヘモシアニンの透過電子顕微鏡像である。

【0063】

図５に示すように、三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたヘモシアニンの透過電子顕微鏡像では、ヘモシアニンの周囲に染色剤が存在し、ヘモシアニンの輪郭が明瞭になった。

【0064】

また、図５に示す三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたヘモシアニンの透過電子顕微鏡像では、図６に示す酢酸ウラニル水溶液で染色されたヘモシアニンの透過電子顕微鏡像と同程度の高いコントラストの像が得られた。このことから、三酢酸ルテチウム水溶液は、酢酸ウラニル水溶液と同等の高い電子染色効果が得られることがわかった。このように、三酢酸ルテチウム水溶液は、円筒状の物質に対しても高い染色効果を有することがわかった。

【0065】

１．３．４． 実施例４
（１）試料作製
本実施例では、三酢酸ルテチウムで染色された生体試料の電子顕微鏡観察用試料を作製
した。生体試料としては、ホウレンソウの葉を用いた。具体的には、まず、灌流固定したホウレンソウの葉を切り出し、カコジル酸緩衝２％パラホルムアルデヒドと２％グルタールアルデヒドとの混合液に浸漬し、前固定した。次に、前固定されたホウレンソウの葉を、カコジル酸緩衝液で洗浄し、２％四酸化オスミウムで後固定した。そして、上昇エタノール系列で脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。

【0066】

次に、エポキシ樹脂に包埋されたホウレンソウの葉を薄片化した。薄片化は、ウルトラミクロトームを用いて行った。次に、薄片化されたホウレンソウの葉を、三酢酸ルテチウム水溶液に室温で２０分間浸漬した。なお、三酢酸ルテチウム水溶液は、酢酸ルテチウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を、蒸留水で溶解することによって作製した。また、三酢酸ルテチウム水溶液の濃度は、２質量％とした。その後、染色された生体試料を純水で洗浄した。このようにして、三酢酸ルテチウムで染色されたホウレンソウの葉の電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0067】

比較例として、上記手順と同様の手順により、ホウレンソウの葉を酢酸ウラニル水溶液（２質量％水溶液）で染色して電子顕微鏡観察用試料を作製した。また、上記手順と同様の手順により、染色を行わなかったホウレンソウの葉の電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0068】

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製ＪＥＭ−１４００）で観察した。図７は、三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像である。図８は、酢酸ウラニル水溶液で染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像である。図９は、無染色のホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像である。なお、図７、図８、および図９に示すスケールバーは、２μｍに相当する。

【0069】

図７に示すように、三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像では、図９に示す無染色のホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像では明瞭に観察することができなかった、クロマチンが黒く染まって明瞭になった。また、図７に示す三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像では、図８に示す酢酸ウラニル水溶液で染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像と同程度の高いコントラストの像が得られた。このことから、三酢酸ルテチウム水溶液は、酢酸ウラニル水溶液と同等の高い電子染色効果が得られることがわかった。このように、三酢酸ルテチウム水溶液は、生体試料に対しても高い染色効果を有することがわかった。

【0070】

１．３．５． 実施例５
（１）試料作製
本実施例では、三酢酸ルテチウムとクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の電子顕微鏡観察用試料を作製した。生体試料としては、ホウレンソウの葉を用いた。具体的には、上記の実施例４と同様の手順でホウレンソウの葉を三酢酸ルテチウム水溶液（２質量％水溶液）で染色し、この三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたホウレンソウの葉をレイノルドのクエン酸鉛染色液に室温で５分間浸漬し、その後、純水で洗浄した。

【0071】

比較例として、上記手順と同様の手順により、ホウレンソウの葉を酢酸ウラニル水溶液（２質量％水溶液）とレイノルドのクエン酸鉛染色液とで二重染色して電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0072】

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会
社製ＪＥＭ−１４００）で観察した。図１０は、三酢酸ルテチウム水溶液とクエン酸鉛染色液とで二重染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像である。図１１は、酢酸ウラニル水溶液とクエン酸鉛染色液とで二重染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像である。なお、図１０および図１１に示すスケールバーは、２μｍに相当する。

【0073】

図１０に示すように、三酢酸ルテチウム水溶液とクエン酸鉛染色液とで二重染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像では、図１１に示す酢酸ウラニル水溶液とクエン酸鉛染色液とで二重染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像と同程度の高いコントラストの像が得られた。このことから、三酢酸ルテチウム水溶液とクエン酸鉛染色液とによる二重染色では、酢酸ウラニル水溶液とクエン酸鉛染色液とによる二重染色と同等の高い電子染色効果が得られることがわかった。

【0074】

１．３．６． 実施例６
（１）試料作製
上記の実施例４と同様の手順で、ホウレンソウの葉を三酢酸ルテチウム水溶液（２質量％水溶液）で染色して試料を作製した。また、上記の実施例５と同様の手順で、ホウレンソウの葉を三酢酸ルテチウム水溶液（２質量％水溶液）とレイノルドのクエン酸鉛染色液とで二重染色して試料を作製した。

【0075】

比較例として、上記の実施例４と同様の手順でホウレンソウの葉を酢酸ウラニル水溶液（２質量％水溶液）で染色して電子顕微鏡観察用試料を作製した。また、上記の実施例５と同様の手順でホウレンソウの葉を酢酸ウラニル水溶液（２質量％水溶液）とレイノルドのクエン酸鉛染色液とで二重染色して電子顕微鏡観察用試料を作製した。また、比較例として、ホウレンソウの葉を染色せずに電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0076】

（２）コントラストの定量的な比較
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製ＪＥＭ−１４００）で観察し、得られた透過電子顕微鏡像のコントラストを定量的に比較した。

【0077】

コントラストの比較は、倍率、照射条件を一定にして各染色剤で染色された試料を撮影し、撮影した画像のコントラストを、真空部分（試料や支持膜がない箇所）で撮影した画像のコントラストを基準として規格化することで行った。規格化は、下記式（１）を用いて行った。

【0078】

コントラスト（％）＝（Ｉ_ｖａｃ−Ｉ）／Ｉ_ｖａｃ×１００

【0079】

ただし、Ｉ_ｖａｃは真空部分の電子線透過量であり、真空部分を撮影した画像全体の強度の平均値から算出した。Ｉは試料部分の電子線透過量であり、染色された試料を撮影した画像全体の強度の平均値から算出した。

【0080】

（３）結果
図１２は、各染色剤で染色されたホウレンソウの葉の透過電子顕微鏡像のコントラストを示すグラフである。図１２に示す各染色剤におけるコントラストの値は、異なる視野で撮影された５枚の画像の平均値である。

【0081】

図１２に示すグラフから、三酢酸ルテチウム水溶液で染色された試料の透過電子顕微鏡像は、酢酸ウラニルで染色された試料の透過電子顕微鏡像と、同程度の高いコントラストが得られることがわかった。また、三酢酸ルテチウム水溶液とレイノルドのクエン酸鉛染色液とで二重染色された試料の透過電子顕微鏡像は、酢酸ウラニル水溶液（２質量％水溶
液）とレイノルドのクエン酸鉛染色液とで二重染色された試料の透過電子顕微鏡像と、同程度の高いコントラストが得られることがわかった。また、三酢酸ルテチウム水溶液とレイノルドのクエン酸鉛染色液とで二重染色された試料の透過電子顕微鏡像は、三酢酸ルテチウム水溶液で染色された試料の透過電子顕微鏡像よりも高いコントラストが得られた。

【0082】

２． 第２実施形態
２．１． 電子顕微鏡観察用染色剤
次に、第２実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤について説明する。なお、上述した第１実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤の例と異なる点について説明し、同様の点については説明を省略する。

【0083】

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、三酢酸ルテチウムと、メタノールを含む溶媒と、を含有する。

【0084】

また、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤の溶媒は、例えば、メタノールである。なお、該溶媒は、メタノールと、水と、を含んでいてもよい。このとき、該溶媒のメタノールの濃度は特に限定されない（後述する「２．３． 実施例」参照）。

【0085】

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤において、三酢酸ルテチウムの濃度は特に限定されず、例えば１質量％以上１０質量％以下である。本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤において、三酢酸ルテチウムの濃度は、例えば飽和濃度である。

【0086】

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、三酢酸ルテチウムに加えて、さらに、三酢酸ルテチウム以外の物質を含有していてもよい。

【0087】

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤では、三酢酸ルテチウムと、メタノールを含む溶媒と、を含有している。そのため、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、酢酸ウラニルと同等の高い染色効果を有することができる（後述する「２．３． 実施例」参照）。さらに、三酢酸ルテチウムは、合成等の必要がなく、例えば、メタノールに溶解させることで電子染色剤として用いることができる。したがって、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤では、簡便に電子染色を行うことができる。さらに、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、分散性が高く、試料粒子間に染色剤を分散させることができるため、試料が凝集している場合でも、染色剤を凝集させないことができる（後述する「２．３． 実施例」参照）。

【0088】

２．２． 電子顕微鏡観察用試料の作製方法
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法は、上述した第１実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法と、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤（三酢酸ルテチウムとメタノールを含む溶媒とを含有する染色剤）を用いる点を除いて同様であり、その説明を省略する。

【0089】

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、上述したように、簡便に電子染色を行うことができ、かつ高い染色効果を有する本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤を用いて染色するため、試料を、簡便かつ良好に染色することができる。さらに、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、試料が凝集している場合でも、染色剤を凝集させないことができる。

【0090】

２．３． 実施例
以下、実施例を挙げて本実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって制限されるものではない。

【0091】

２．３．１． 実施例１
試料は、液体培地で培養したＴ４ファージおよび大腸菌を用いた。まず、カーボンおよびフォルムバール支持膜を張った銅製グリットに試料を滴下し濾紙で余剰の液を吸い取る。次に、三酢酸ルテチウムの１００％メタノール溶液をグリットに滴下しすぐに濾紙で余剰の液を吸い取ることでネガティブ染色し、電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0092】

なお、上記の三酢酸ルテチウムの１００％メタノール溶液は、酢酸ルテチウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を、メタノール−ｄ４，１００％（和光純薬工業株式会社製）に溶かすことによって作製した。三酢酸ルテチウムの１００％メタノール溶液の濃度は、１質量％とした。

【0093】

比較例として、上記手順と同様の手順により、上記試料を三酢酸ルテチウム水溶液でネガティブ染色した。三酢酸ルテチウム水溶液は、三酢酸ルテチウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を、蒸留水で溶解させることによって作製した。三酢酸ルテチウム水溶液の濃度は、１質量％とした。

【0094】

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製ＪＥＭ−１４００）で観察した。図１３および図１４は、三酢酸ルテチウムの１００％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像である。図１５および図１６は、三酢酸ルテチウム水溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像である。なお、図１３、図１４、図１５、および図１６に示すスケールバーは、２００ｎｍに相当する。

【0095】

図１５に示すように、三酢酸ルテチウム水溶液を用いてネガティブ染色を行うと、染色剤が試料周囲に存在し、試料の輪郭がはっきりと見て取れた。しかしながら、図１６に示すように、試料が凝集している場合、染色剤も凝集し、試料の微細な構造を確認することができなかった。

【0096】

これに対して、図１３および図１４に示すように、三酢酸ルテチウムの１００％メタノール溶液を用いてネガティブ染色を行うと、試料が凝集している場合でも、染色剤が凝集することなく、１つ１つのＴ４ファージやその他の構造物を明瞭に見て取れた。これは、三酢酸ルテチウムをメタノールに溶解することで、三酢酸ルテチウムを水に溶解した場合と比べて、分散性が増し、試料粒子間により染色剤が分散するためであると考えられる。

【0097】

２．３．２． 実施例２
試料は、液体培地で培養したＴ４ファージおよび大腸菌を用いた。まず、カーボンおよびフォルムバール支持膜を張った銅製グリットに試料を滴下し濾紙で余剰の液を吸い取る。次に、三酢酸ルテチウムの５０％メタノール溶液をグリットに滴下しすぐに濾紙で余剰の液を吸い取ることで染色し、電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0098】

なお、上記の三酢酸ルテチウムの５０％メタノール溶液は、酢酸ルテチウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を、５０％メタノール溶液（ｖ／ｖ％）に溶かすことによって作製した。三酢酸ルテチウムの５０％メタノール溶液の濃度は、１質量％とした。

【0099】

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製ＪＥＭ−１４００）で観察した。図１７および図１８は、三酢酸ルテチウムの５０％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像である。なお、図１７に示
すスケールバーは、５００ｎｍに相当し、図１８に示すスケールバーは、２００ｎｍに相当する。

【0100】

図１７および図１８に示すように、三酢酸ルテチウムの５０％メタノール溶液を用いてネガティブ染色を行うと、上記の「２．３．１． 実施例１」の三酢酸ルテチウムの１００％メタノール溶液を用いて染色した場合と同様に、試料が凝集している場合でも、染色剤が凝集することなく、１つ１つのＴ４ファージやその他の構造物を明瞭に見て取れた。

【0101】

２．３．３． 実施例３
試料は、液体培地で培養したＴ４ファージおよび大腸菌を用いた。まず、カーボンおよびフォルムバール支持膜を張った銅製グリットに試料を滴下し濾紙で余剰の液を吸い取る。次に、三酢酸ルテチウムの２５％メタノール溶液をグリットに滴下しすぐに濾紙で余剰の液を吸い取ることで染色し、電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0102】

なお、上記の三酢酸ルテチウムの２５％メタノール溶液は、酢酸ルテチウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を、２５％メタノール溶液（ｖ／ｖ％）に溶かすことによって作製した。三酢酸ルテチウムの２５％メタノール溶液の濃度は、１質量％とした。

【0103】

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製ＪＥＭ−１４００）で観察した。図１９および図２０は、三酢酸ルテチウムの２５％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像である。なお、図１９および図２０に示すスケールバーは、２００ｎｍに相当する。

【0104】

図１９および図２０に示すように、三酢酸ルテチウムの２５％メタノール溶液を用いてネガティブ染色を行うと、上記の「２．３．１． 実施例１」の三酢酸ルテチウムの１００％メタノール溶液を用いて染色した場合と同様に、試料が凝集している場合でも、染色剤が凝集することなく、１つ１つのＴ４ファージやその他の構造物を明瞭に見て取れた。

【0105】

２．３．４． 実施例４
試料は、液体培地で培養したＴ４ファージおよび大腸菌を用いた。まず、カーボンおよびフォルムバール支持膜を張った銅製グリットに試料を滴下し濾紙で余剰の液を吸い取る。次に、三酢酸ルテチウムの１０％メタノール溶液をグリットに滴下しすぐに濾紙で余剰の液を吸い取ることで染色し、電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0106】

なお、上記の三酢酸ルテチウムの１０％メタノール溶液は、酢酸ルテチウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を、１０％メタノール溶液（ｖ／ｖ％）に溶かすことによって作製した。三酢酸ルテチウムの１０％メタノール溶液の濃度は、１質量％とした。

【0107】

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製ＪＥＭ−１４００）で観察した。図２１および図２２は、三酢酸ルテチウムの１０％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像である。なお、図２１および図２２に示すスケールバーは、２００ｎｍに相当する。

【0108】

図２１および図２２に示すように、三酢酸ルテチウムの１０％メタノール溶液を用いてネガティブ染色を行うと、上記の「２．３．１． 実施例１」の三酢酸ルテチウムの１００％メタノール溶液を用いて染色した場合と同様に、試料が凝集している場合でも、染色剤が凝集することなく、１つ１つのＴ４ファージやその他の構造物を明瞭に見て取れた。

【0109】

２．３．５． 実施例５
試料は、液体培地で培養したＴ４ファージおよび大腸菌を用いた。まず、カーボンおよびフォルムバール支持膜を張った銅製グリットに試料を滴下し濾紙で余剰の液を吸い取る。次に、三酢酸ルテチウムの１％メタノール溶液をグリットに滴下しすぐに濾紙で余剰の液を吸い取ることで染色し、電子顕微鏡観察用試料を作製した。

【0110】

なお、上記の三酢酸ルテチウムの１％メタノール溶液は、酢酸ルテチウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を、１％メタノール溶液（ｖ／ｖ％）に溶かすことによって作製した。三酢酸ルテチウムの１％メタノール溶液の濃度は、１質量％とした。

【0111】

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製ＪＥＭ−１４００）で観察した。図２３および図２４は、三酢酸ルテチウムの１％メタノール溶液で染色されたＴ４ファージの透過電子顕微鏡像である。なお、図２３に示すスケールバーは、２００ｎｍに相当し、図２４に示すスケールバーは、１００ｎｍに相当する。

【0112】

図２３および図２４に示すように、三酢酸ルテチウムの１％メタノール溶液を用いてネガティブ染色を行うと、上記の「２．３．１． 実施例１」の三酢酸ルテチウムの１００％メタノール溶液を用いて染色した場合と同様に、試料が凝集している場合でも、染色剤が凝集することなく、１つ１つのＴ４ファージやその他の構造物を明瞭に見て取れた。

【0113】

本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】