特許 6358610 被検出微生物を検出する検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6358610

(24)【登録日】2018年6月29日

(45)【発行日】2018年7月18日

(54)【発明の名称】被検出微生物を検出する検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/569 20060101AFI20180709BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20180709BHJP

   G01N 21/41 20060101ALI20180709BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20180709BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/569 Z

   G01N33/536 E

   G01N33/536 D

   G01N21/41 101

   G01N21/64 F

【請求項の数】10

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2013-174694(P2013-174694)

(22)【出願日】2013年8月26日

(65)【公開番号】特開2015-42958(P2015-42958A)

(43)【公開日】2015年3月5日

【審査請求日】2016年6月29日

(73)【特許権者】

【識別番号】505127721

【氏名又は名称】公立大学法人大阪府立大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】特許業務法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】椎木 弘

(72)【発明者】

【氏名】長岡 勉

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０７７７５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１２１２２９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００４−１７７３４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−３４６１７７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料に含まれる、ウイルスを除く被検出微生物を検出する検出方法であって、
前記試料に一定量の金属ナノ粒子を混合し、前記試料に含まれる前記被検出微生物に前記金属ナノ粒子を付着させる付着工程と、
前記試料に光を照射して、前記被検出微生物への前記金属ナノ粒子の付着状態に対応する光の散乱特性を評価する評価工程と、
前記評価工程における評価結果に基づいて、前記被検出微生物の濃度が高いほど前記光の散乱特性の変化が小さくなることから、前記被検出微生物を検出する検出工程と、を備え、
前記付着工程において、前記金属ナノ粒子は前記被検出微生物の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型を備えた高分子層に固定されており、前記金属ナノ粒子は前記鋳型を介して前記被検出微生物に付着する、検出方法。

【請求項2】

前記評価工程において、前記光の散乱特性は、暗視野顕微鏡像の観察、透過光の測定、および散乱光の測定の少なくともいずれか一つにより評価する、請求項１に記載の検出方法。

【請求項3】

前記評価工程において、前記光の散乱特性は、暗視野顕微鏡像の観察により評価する、請求項２に記載の検出方法。

【請求項4】

前記評価工程において、前記光の散乱特性は、前記透過光の強度に基づく消失スペクトルを測定することにより評価する、請求項２に記載の検出方法。

【請求項5】

前記評価工程において、前記光の散乱特性は、前記散乱光の強度に基づく散乱スペクトルを測定することにより評価する、請求項２に記載の検出方法。

【請求項6】

前記付着工程において、前記金属ナノ粒子は、複合体の形態で付着する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出方法。

【請求項7】

前記金属ナノ粒子は、金ナノ粒子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の検出方法。

【請求項8】

前記試料に蛍光色素を添加する添加工程をさらに備え、
前記評価工程において、前記試料に励起光を照射して、前記被検出微生物への前記金属ナノ粒子の付着状態に対応する蛍光特性を評価する、請求項１に記載の検出方法。

【請求項9】

前記付着工程において、前記金属ナノ粒子は、複合体の形態で付着する、請求項８に記載の検出方法。

【請求項10】

前記試料は溶液または分散液であり、前記光は波長が４００〜８００ｎｍである可視光を含む、請求項１に記載の検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、被検出微生物を検出する検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、医療産業、食品産業、農業、畜産、養殖、水処理施設などにおいて、微生物検出への関心が高まっている。食品，医薬品，農薬などに存在する汚染微生物は、微量であるにもかかわらず、人の健康に大きく影響しうる。また、病院、老人介護施設における微生物汚染が社会問題化している。さらに、多様な抗菌商品の流通、需要の高まりに見られるように、一般家庭における衛生管理にも関心が高まっている。たとえば、食品加工工場の場合、出荷される食品の抜き取りでの細菌検査や工場内の環境中の細菌検査を実施しているが、培養法による測定の場合、結果が得られるまでに２４〜４８時間程度要し、出荷するまでの保管コストが高くなる要因となるため、迅速な検出方法が求められている。また、農業分野においても、たとえば水耕栽培の培養液中の細菌数が増加すると発病のリスクが高まる。細菌数を早く把握することで素早く殺菌などの措置が取れるため、迅速な検出方法は有効である。

【0003】

このような状況から、微生物汚染を簡単に検出できる技術の必要性が近年急速に高まっている。また、医療現場においては、感染症の原因の病原菌を速やかに特定する必要があることから、病原菌を迅速かつ高感度で検出できる技術が求められている。微生物の検出・特定方法としては、たとえば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法などの方法が存在する。これらは、たとえば、抗体（一次抗体）と、微生物固有のタンパク質とを抗原−抗体反応させた後、さらに標識した二次抗体を抗体（一次抗体）と反応させ二次抗体の化学発光やＡＴＰの加水分解反応のモニターにより検出を行なう方法である。

【0004】

国際公開第２０１２／１２１２２９号公報（特許文献１）には、検出対象の微生物の鋳型を備えた微生物検出センサーが記載されており、微生物の補足状態に応じた重量変化を検出することが記載されている。

【0005】

Hayden, S.C. et al., J. Amer. Chem. Soc. 2012, 134, 6920-6923（非特許文献１）には、大腸菌および枯草菌の表面に金ナノ粒子が凝集する様子を電子顕微鏡像および紫外可視スペクトルで確認していることが報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２０１２／１２１２２９号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Hayden, S.C. et al., J. Amer. Chem. Soc. 2012, 134, 6920-6923

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法などの方法はいずれも微生物そのものを検出する方法ではなく、また、ＥＬＩＳＡ法などでは、微生物固有のタンパク質等に対する抗体を作製する必要があり容易ではない。

【0009】

本発明は、迅速かつ簡便で、高感度に微生物を検出できる新規な微生物の検出方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、試料に含まれる被検出微生物を検出する検出方法であって、試料に含まれる被検出微生物に金属ナノ粒子を付着させる付着工程と、試料に光を照射して、被検出微生物への金属ナノ粒子の付着状態に対応する光の散乱特性を評価する評価工程と、評価工程における評価結果に基づいて、被検出微生物を検出する検出工程と、を備える。

【0011】

上記評価工程において、光の散乱特性は、好ましくは、暗視野顕微鏡像の観察、透過光の測定、および散乱光の測定の少なくともいずれか一つにより評価する。たとえば、透過光の強度に基づく消失スペクトルを測定する、または散乱光の強度に基づく散乱スペクトルを測定することにより光の散乱特性を評価することができる。

【0012】

上記付着工程において、金属ナノ粒子は、複合体の形態で付着する形態であってもよい。上記金属ナノ粒子は、金ナノ粒子が例示される。上記付着工程において、金属ナノ粒子にプローブ分子が結合されており、金属ナノ粒子はプローブ分子を介して被検出微生物に付着する形態とすることができる。上記プローブ分子は、被検出微生物の表面部位と化学的相互作用あるいは化学結合することにより前記被検出微生物に付着するものを用いることが好ましい。たとえば、ｉ）被検出微生物の表面部位と静電的相互作用または疎水的相互作用により前記被検出微生物に付着するプローブ分子、ｉｉ）タンパク質からなり被検出微生物の表面の糖鎖と結合することにより前記被検出微生物に付着する分子、あるいはｉｉｉ）抗体からなり被検出微生物の表面の抗原と抗原抗体反応することにより被検出微生物に付着するプローブ分子を用いることができる。

【0013】

上記付着工程において、金属ナノ粒子は被検出微生物の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型を備えた高分子層に固定されており、金属ナノ粒子は鋳型を介して被検出微生物に付着する形態であってもよい。

【0014】

また、本発明は、試料に含まれる被検出微生物を検出する検出方法であって、試料に含まれる被検出微生物に金属ナノ粒子を付着させる付着工程と、試料に蛍光色素を添加する添加工程と、試料に励起光を照射して、被検出微生物への金属ナノ粒子の付着状態に対応する蛍光特性を評価する評価工程と、評価工程における評価結果に基づいて、被検出微生物を検出する検出工程と、を備える。上記付着工程において、金属ナノ粒子は、複合体の形態で付着する形態であってもよい。

【発明の効果】

【0015】

本発明の方法によると、迅速かつ簡便で、高感度に微生物を検出することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】第１の実施形態の付着工程を模式的に示す図である。

【図2】金属ナノ粒子複合体の一例を模式的に示す図である。

【図3】第１の実施形態の付着工程のプローブ分子による付着方法の一例を説明する図である。

【図4】第１の実施形態の付着工程の鋳型による付着方法の一例を説明する図である。

【図5】第１の実施形態の評価工程において用いられるシステムの一例を示す模式図である。

【図6】金ナノ粒子（ａ）、酸化銅ナノ粒子（ｂ）、金ナノラズベリー（ｃ）のＴＥＭ像を示す図である。

【図7】実験例１において、第１の金属ナノ粒子（negative Au NPs）を用いた場合の電子顕微鏡像（ａ）と暗視野顕微鏡像（ｂ）を示す図である。

【図8】実験例１において、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）を用いた場合の電子顕微鏡像（ａ）と暗視野顕微鏡像（ｂ）を示す図である。

【図9】実験例１において、第３の金属ナノ粒子（positive Cu₂O NPs）を用いた場合の電子顕微鏡像（ａ）と暗視野顕微鏡像（ｂ）を示す図である。

【図10】実験例１において、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）を用いた場合の電子顕微鏡像（ａ）と暗視野顕微鏡像（ｂ）を示す図である。

【図11】実験例１において、緑膿菌のみを含み、金属ナノ粒子または金属ナノ粒子複合体を添加しない場合の暗視野顕微鏡像を示す図である。

【図12】実験例１において、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）または第３の金属ナノ粒子（positive Cu₂O NPs）を用いた場合の散乱スペクトルを示す図である。

【図13】実験例１において、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）または第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）を用いた試料と、緑膿菌のみを含む試料の散乱スペクトルを示す図である。

【図14】実験例２において、試料２〜４の電子顕微鏡像（ａ）と、暗視野顕微鏡像（ｂ）を示す図である。

【図15】実験例２において、試料１〜６の消失スペクトルを示す図である。

【図16】緑膿菌の濃度と金属ナノ粒子の付着数との関係を模式的に示す図である。

【図17】実験例３において、試料８〜１３の暗視野顕微鏡像を示す図である。

【図18】実験例３において、試料７〜１３の散乱スペクトルを示す図である。

【図19】実験例３において、金属ナノ粒子複合体の比率に対する波長６００ｎｍの散乱強度の関係を示す図である。

【図20】実験例４において、試料Ａ，Ｂ，Ｃの蛍光スペクトルを示す図である。

【図21】実験例４において、試料Ａ，１４〜２１の蛍光スペクトルを示す図である。

【図22】実験例４において、金ナノ粒子の含有量に対する波長５１２ｎｍでの蛍光強度の関係を示す図である。

【図23】実験例４において、試料Ａ２，２２〜２９の蛍光スペクトルを示す図である。

【図24】実験例４において、金ナノラズベリーの含有量に対する波長５１２ｎｍでの蛍光強度の関係を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明の実施の形態について図面を参照して詳しく説明する。
＜第１の実施形態＞
第１の実施形態は、試料に含まれる被検出微生物を検出する検出方法であって、試料に含まれる被検出微生物に金属ナノ粒子を付着させる付着工程（Ｓｔ１）と、試料に光を照射して、被検出微生物への金属ナノ粒子の付着状態に対応する光の散乱特性を評価する評価工程（Ｓｔ２）と、評価工程における評価結果に基づいて、被検出微生物を検出する検出工程（Ｓｔ３）と、を備える。

【0018】

評価工程（Ｓｔ２）において、光の散乱特性は、好ましくは、暗視野顕微鏡像の観察、透過光の測定および散乱光の測定の少なくともいずれか一つにより評価する。

【0019】

［付着工程］
図１は、第１の実施形態の付着工程を模式的に示す図である。金属ナノ粒子１を含む溶液と、被検出微生物２を含む溶液を混合させることにより、被検出微生物２に金属ナノ粒子１を付着させる工程である。

【0020】

（被検出微生物）
被検出微生物２は、特に限定されない。たとえば、大腸菌のEscherichia属、緑膿菌などのPseudomonas属、Acinetobacter calcoaceticusなどのAcinetobacter属を始め、Serratia属、Klebsiella属、Enterobacter属、Citrobacter属、Burkholderia属、Sphingomonadase属、Chromobacterium属、Salmonella属、Vibrio属、Legionella属、Campylobacter属、Yersinia属、Proteus属、Neisseria属、Staphylococcus属、Streptococcus属、Enterococcus属、Clostridium属、Corynebacterium属、Listeria属、Bacillus属、Mycobacterium属、Chlamydia属、Rickettsia属、Haemophilus属の細菌が例示される。また、ウィルスとしては、A型肝炎ウィルス、アデノウィルス、ロタウィルス、ノロウィルスが、真菌としてはカンジダが、原虫としてはクリプトスポリジウムが例示される。

【0021】

（金属ナノ粒子）
金属ナノ粒子１は、ナノメートルのオーダーのサイズを有する金属粒子である。ナノメートルのオーダーとは１から数百ナノメートルの範囲を含み、典型的には粒径が１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。金属ナノ粒子は、表面プラズモンが観測されるものであれば、特に限定されない。表面プラズモンが観測される金属ナノ粒子１は、被検出微生物２への付着状態に対応して、光の散乱特性が変化する。したがって、散乱特性を評価し（評価工程）、かかる評価結果に基づいて、被検出微生物２への付着状態を検出することができ、被検出微生物２を検出することができる（検出工程）。

【0022】

金属ナノ粒子１は、単体金属からなるナノ粒子であっても、金属化合物からなるナノ粒子であってもよく、たとえば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、銅ナノ粒子、酸化銅ナノ粒子が例示される。また、金属ナノ粒子１の被検出微生物２への付着形態としては、図１に示すように、各金属ナノ粒子１がそれぞれ被検出微生物２に付着する形態以外に、複数の金属ナノ粒子が集合して複合体（以下、「金属ナノ粒子複合体」ともいう）を形成し、かかる金属ナノ粒子複合体が被検出微生物に付着する形態が挙げられる。金属ナノ粒子複合体は、複数の金属ナノ粒子が集合している形態であれば特に限定されないが、例えば、複数の金属ナノ粒子が高分子層の表面に保持されている形態を挙げることができる。

【0023】

図２は、金属ナノ粒子複合体の一例を模式的に示す図である。金属ナノ粒子複合体５は、複数の金属ナノ粒子１と、金属ナノ粒子１を保持する高分子層４とを備える。たとえば、金イオンと、金イオンの還元剤であるアニリンとを混合することにより、金イオンは還元され金ナノ粒子が生成され、同時にアニリンは酸化されてアニリンオリゴマーが生成されて高分子層４となり、金ナノ粒子複合体（以下、「金ナノラズベリー」ともいう）５が形成される。金ナノラズベリーの直径は通常５０〜１５０ｎｍである。

【0024】

（付着方法）
図３は、第１の実施形態における、金属ナノ粒子１を被検出微生物２に付着させる方法の一例を説明する模式図である。まず、金属ナノ粒子１にプローブ分子３を結合させて、プローブ分子３を介して、被検出微生物２の表面に金属ナノ粒子を付着させる。プローブ分子３は、被検出微生物２の表面部位と化学的相互作用あるいは化学結合により、被検出微生物２に付着する。化学的相互作用あるいは化学結合による付着としては、たとえば、静電的相互作用による付着、疎水的相互作用による付着、被検出微生物２の表面の糖鎖とタンパク質（レクチン等）からなるプローブ分子との結合による付着、被検出微生物２の表面の抗原と抗体からなるプローブ分子との抗原抗体反応による付着等が挙げられる。

【0025】

図３において被検出微生物２の表面に存在する糖鎖や抗原と、特異的に結合するレクチンや抗体などのタンパク質を、金属ナノ粒子１に結合するプローブ分子３とする、プローブ分子３を介して金属ナノ粒子１を被検出微生物２に付着させる方法によると、試料中に複数種類の微生物が含まれる場合でも被検出微生物２を特異的に検出することができるので好ましい。

【0026】

図４は、図３に示す方法とは異なる、金属ナノ粒子１を被検出微生物２に付着させる方法を説明する模式図である。図４に示す方法においては、金属ナノ粒子１が高分子層４に保持された金属ナノ粒子複合体５ａを用いる。金属ナノ粒子複合体５ａの高分子層４の表面に被検出微生物２の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型７を形成し、鋳型７を介して金属ナノ粒子複合体５ａを被検出微生物２に付着させる方法である。被検出微生物２の立体構造とは、被検出微生物２の全体の立体構造に限定されることはなく、被検出微生物２の特異的部位の立体構造であってもよい。図４においては、被検出微生物２の細胞壁外壁９の構成成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）８の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型７が形成されている。被検出微生物２に付着した金属ナノ粒子複合体５ａに光を照射すると、散乱光１２が観察されるので、散乱特性を測定することにより被検出微生物を検出することができる。

【0027】

被検出微生物２の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型７は、国際公開ＷＯ２０１２／１２１２２９号公報に記載されている方法にしたがって形成することができる。図４に示すような、被検出微生物２の立体構造に相補的な三次元構造の鋳型７を介して金属ナノ粒子１を被検出微生物２に付着させる方法によると、試料中に複数種類の微生物が含まれる場合でも被検出微生物２を特異的に検出することができるので好ましい。

【0028】

本発明の実施の形態においては、被検出微生物２に応じて、金属ナノ粒子１を被検出微生物２に付着させる方法を選択する。たとえば、被検出微生物２が全体または表面の電荷が負電荷過剰の状態にある微生物であれば、プローブ分子３と被検出微生物２との静電相互作用による付着方法を選択することができる。このような、金属ナノ粒子１とプローブ分子３の組み合わせとして金ナノ粒子とアミノエタンチオールとの組み合わせが例示される。金ナノ粒子と組み合わせて用いられるプローブ分子３としては、アミノエタンチオール以外にも、アミノ基とチオール基を有する分子が好ましく用いられる。このような分子は、チオール基が金ナノ粒子に配位結合し、またアミノ基が正電荷を有することにより全体または表面の電荷が負電荷過剰の状態にある微生物に静電相互作用により付着するからである。

【0029】

［評価工程］
評価工程においては、被検出微生物への金属ナノ粒子の付着状態に対応する光の散乱特性を評価する。表面プラズモンが観測される金属ナノ粒子が被検出微生物に付着した場合に、表面プラズモン共鳴が生じ、光を照射した場合に散乱光が生じて光の散乱特性が変化する。したがって、被検出微生物の有無、または被検出微生物の濃度に応じて金属ナノ粒子の被検出微生物への付着状態が変化し、表面プラズモン共鳴の程度が変化して、散乱光の強度が変化したり、または散乱光のピークがシフトしたりするなど、光の散乱特性が変化する。評価工程では、かかる光の散乱特性を評価する。光の散乱特性は、好ましくは、暗視野顕微鏡像の観察、透過光の強度に基づく消失スペクトルの測定および散乱光の強度に基づく散乱スペクトルの測定の少なくともいずれか一つにより評価する。消失スペクトルは、吸収スペクトルと散乱スペクトルの和であり、消失スペクトルを解析することにより散乱特性を評価することができる。

【0030】

図５は、評価工程において、消失スペクトルの測定または散乱スペクトルの測定を行うために用いられるシステムの一例を示す模式図である。システム２０において、光源１３から所望の光を検出対象の試料１６に照射し、試料１６からの散乱光９を、光の照射方向に対して９０°の方向に配置された検出器１８により検出し、散乱スペクトルを測定する。光の照射方向に配置された検出器１９では、透過光を検出することにより消失スペクトルを測定することができる。システム２０は、散乱光を測定する検出器１８、または透過光を測定する検出器１９の少なくともいずれかが配置されているものであればよい。検出器１８、１９としては、たとえばフォトダイオード、光電子増倍管（ＰＭＴ）などを用いることができる。システム２０において、光源１３としては好ましくは発光ダイオード（ＬＥＤ）が用いられ、光源１３から照射される光は、好ましくは波長が４００〜８００ｎｍの可視光である。光の散乱特性は、図５に示すようなシステムを用いて迅速かつ簡便に評価することができる。

【0031】

暗視野顕微鏡像は、散乱光により形成される像であり、かかる像の観察より被検出微生物への金属ナノ粒子の付着状態を直接的に明確に確認することができる。暗視野顕微鏡による観察は、電子顕微鏡による観察と比較して、迅速かつ簡便に観察することができるという利点がある。なお、散乱強度は、試料における各被検出微生物への金属ナノ粒子の付着量に応じて一定の付着量までは大きくなるので、観察される暗視野顕微鏡像も鮮明となる。

【0032】

［検出工程］
検出工程においては、評価工程の評価結果に基づいて、被検出微生物を検出する。被検出微生物の有無、被検出微生物の濃度に応じて散乱特性がどのように変化するかを予め確認しておくことにより、評価工程の評価結果に基づいて、被検出微生物の有無を検出したり、被検出微生物の濃度を検出したりすることができる。なお、暗視野顕微鏡像の観察によると、被検出微生物の有無および濃度を直接計測することができる。

【0033】

＜第２の実施形態＞
第２の実施形態は、試料に含まれる被検出微生物を検出する検出方法であって、試料に含まれる前記被検出微生物に金属ナノ粒子を付着させる付着工程（Ｓｔ１１）と、試料に蛍光色素を添加する添加工程（Ｓｔ１２）と、試料に励起光を照射して、被検出微生物への金属ナノ粒子の付着状態に対応する蛍光特性を評価する評価工程（Ｓｔ１３）と、評価工程における評価結果に基づいて、前記被検出微生物を検出する検出工程（Ｓｔ１４）と、を備える。

【0034】

本実施形態の付着工程（Ｓｔ１１）は、第１の実施形態の付着工程（Ｓｔ１）と同様であるので説明を省略する。添加工程（Ｓｔ１２）においては、蛍光を発する蛍光色素を添加する。試料内に存在する金属ナノ粒子に現れる表面プラズモンにより、蛍光色素の蛍光強度は増強される。金属ナノ粒子が存在する場合と存在しない場合、および金属ナノ粒子の量に応じて蛍光強度に違いが生じる。したがって、評価工程（Ｓｔ１３）において、被検出微生物に付着した金属ナノ粒子に由来する蛍光特性のみを評価するために、被検出微生物に付着していない金属ナノ粒子は事前に除去しておくことが好ましい。評価工程（Ｓｔ１３）においては、試料に励起光を照射して、蛍光特性を評価する。蛍光特性の評価としては、たとえば、蛍光スペクトルの測定、蛍光顕微鏡像の観察が例示される。検出工程（Ｓｔ１４）では、かかる蛍光特性の評価に基づいて被検出微生物を検出する。

【0035】

本実施形態で使用し得る蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、ヨウ化プロピジウム、カルセイン、アクリジンオレンジ等が例示される。使用する蛍光色素に応じて励起光の波長を選択する。蛍光色素として、フルオレセインを用いる場合、励起光としてはたとえば波長４９０ｎｍの光を選択することができる。本実施形態において、蛍光特性は、迅速かつ簡便に評価することができる。

【実施例】

【0036】

［実験例１：金属ナノ粒子の選択］
実験例１においては、被検出微生物として緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を用いた場合に、本発明の検出方法に用いることができる、または用いるのに適した金属ナノ粒子または金属ナノ粒子複合体を、電子顕微鏡像の観察、暗視野顕微鏡像の観察、散乱スペクトルの測定により確認した。

【0037】

プローブ分子を結合させた、以下（１）〜（４）に示す金属ナノ粒子または金属ナノ粒子複合体を準備した。
（１）第１の金属ナノ粒子:クエン酸ナトリウムをプローブ分子として結合させた金ナノ粒子（negative Au NPs）、
（２）第２の金属ナノ粒子：アミノエタンチオールをプローブ分子として結合させた金ナノ粒子（positive Au NPs）、
（３）第３の金属ナノ粒子：臭化セチルトリメチルアンモニウムをプローブ分子として結合させた酸化銅ナノ粒子（positive Cu₂O NPs）、
（４）第１の金属ナノ粒子複合体：アニリンをプローブ分子として結合させた金ナノラズベリー（positive Au nanoraspberry）。

【0038】

図６（ａ）は金ナノ粒子の透過電子顕微鏡像（ＴＥＭ像）を示し、図６（ｂ）は酸化銅ナノ粒子のＴＥＭ像を示し、図６（ｃ）は金ナノラズベリーのＴＥＭ像を示す。なお、本実験例において、金ナノ粒子および金ナノラズベリーは以下のようにして調製した金ナノ分散液、金ナノラズベリー分散液として準備した。

【0039】

（第１の金属ナノ粒子分散液の調製）
超純水２５ｍＬに１％テトラクロロ金(III)酸四水和物水溶液を７５０μＬおよび２％クエン酸ナトリウム水溶液を５６３μＬ加えて、８０℃のまま３０分間撹拌して第１の金属ナノ粒子分散液を調製した。得られた分散液における第１の金属ナノ粒子の平均粒径は３０ｎｍ、ゼータ電位は−３０ｍＶであった。

【0040】

（第２の金属ナノ粒子分散液の調製）
２％クエン酸ナトリウム水溶液に代えてアミノエタンチオール溶液を用いた点以外は、上述の第１の金属ナノ粒子分散液の調製方法にしたがって第２の金属ナノ粒子分散液を調製した。得られた分散液における第２の金属ナノ粒子の平均粒径は３０ｎｍ、ゼータ電位は＋４０ｍＶであった。

【0041】

（第３の金属ナノ粒子分散液の調製）
超純水１８ｍＬに１．６％硫酸銅水溶液３２０μＬ加えて３０分間窒素バブリングした。この溶液に１０％臭化セチルトリメチルアンモニウムを１ｍＬおよび４．２％水素化ホウ素ナトリウムを５００μＬ加え１０時間攪拌した。さらに空気中で１０時間攪拌することで第３の金属ナノ粒子分散液を調製した。得られた分散液における第３の金属ナノ粒子の平均粒径は４５ｎｍ、ゼータ電位は＋３０ｍＶであった。

【0042】

（金ナノラズベリー分散液の調製）
超純水５０ｍＬに１％テトラクロロ金(III)酸四水和物水溶液を１５２μＬ加えて、８０℃で撹拌し、０．１Ｍアニリン水溶液を１ｍＬ加えて、８０℃のまま３０分間撹拌した。反応溶液５０ｍＬを８５００ｒｐｍ、５℃にて３０分間遠心分離し、沈殿をｐＨ７のリン酸バッファー３ｍＬに展開し、１０分間超音波処理することで均一に分散させた。この洗浄作業を３回繰り返して、金ナノラズベリー分散液を調製した。得られた金ナノラズベリー分散液における金ナノラズベリーの平均粒径は８０ｎｍ、ゼータ電位は＋２０ｍＶであった。

【0043】

図３に示すように、プローブ分子を結合させた金属ナノ粒子または金属ナノ粒子複合体を含む溶液と、緑膿菌を含む溶液とを混合して攪拌し、その後、室温で遠心分離（６２００ｒｐｍ）することで微生物に付着していない金属ナノ粒子を除去した。金属ナノ粒子または金属ナノ粒子複合体の緑膿菌への付着状態を電子顕微鏡像、暗視野顕微鏡像により確認した。

【0044】

図７は、粒径３０ｎｍの第１の金属ナノ粒子（negative Au NPs）を用いた場合の電子顕微鏡像（ａ）と暗視野顕微鏡像（ｂ）を示す図である。図８は、粒径３０ｎｍの第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）を用いた場合の電子顕微鏡像（ａ）と暗視野顕微鏡像（ｂ）を示す図である。図９は、粒径４５ｎｍの第３の金属ナノ粒子（positive Cu₂O NPs）を用いた場合の電子顕微鏡像（ａ）と暗視野顕微鏡像（ｂ）を示す図である。図１０は、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）を用いた場合の電子顕微鏡像（ａ）と暗視野顕微鏡像（ｂ）を示す図である。図１１は、緑膿菌のみを含み、金属ナノ粒子または金属ナノ粒子複合体を添加しない場合の暗視野顕微鏡像を示す図である。図７〜図１１に示す暗視野顕微鏡像は、露光時間（４００ｍｓ）等、全て同一の条件で撮像したものである。

【0045】

図８〜１０より、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）、第３の金属ナノ粒子（positive Cu₂O NPs）および第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）は緑膿菌に付着することが確認され、緑膿菌の検出に用いることができることが確認された。これは、緑膿菌の表面がリン酸基により負電荷に帯電しており、一方これらのプローブ分子は正電荷に帯電している官能基（アミノエタンチオールのアミノ基、アニリンオリゴマーのアミノ基、イミノ基等）を有し、これが緑膿菌と静電的相互作用することにより付着していることによる。なお、これらのプローブ分子は金属ナノ粒子に配位結合する官能基（アミノエタンチオールのチオール基、臭化セチルトリメチルアンモニウムのアミノ基、アニリンオリゴマーのアミノ基、イミノ基等）を有し、これを介して金属ナノ粒子に配位結合している。

【0046】

図１２は、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）を用いた場合と、第３の金属ナノ粒子（positive Cu₂O NPs）を用いた場合の散乱スペクトルを示す。図１２からわかるように、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）を用いた場合と第３の金属ナノ粒子（positive Cu₂O NPs）を用いた場合の散乱スペクトルのピーク波長は異なり、それぞれ６５０ｎｍ付近と、５５０ｎｍ付近である。したがって、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）を用いた場合の暗視野顕微鏡像は赤色であり、第３の金属ナノ粒子（positive Cu₂O NPs）を用いた場合の暗視野顕微鏡像は青色である。したがって、散乱スペクトルのピーク波長が異なる複数の金属ナノ粒子または金属ナノ粒子複合体を用いて、それぞれが異なる種類の被検出微生物に付着するように設計して散乱特性を評価することにより、試料に含まれる複数種類の被検出微生物を特定することもできる。

【0047】

図１３は、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）を用いた場合と、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）を用いた場合と、金属ナノ粒子または金属ナノ粒子複合体を混合せずに緑膿菌のみを含む試料の散乱スペクトルを示す。図１３に示す結果から、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）を用いた場合は、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）を用いた場合と比較して散乱光の強度が格段に大きいことがわかる。なお、このことは、図８（ｂ）と図１０（ｂ）に示す暗視野顕微鏡像を比較しても明らかである。したがって、本発明の実施の形態において、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）を用いるのが、散乱光の強度が大きく検出が容易であるという点から好ましいことがわかる。

【0048】

また、図１３に示す結果より、緑膿菌のみを含む試料からは散乱光はほとんど観察されないことがわかる。したがって、緑膿菌を含む試料に緑膿菌に付着しうる金属ナノ粒子または金属ナノ粒子複合体を混合し（付着工程）、特定の波長にピークを有する散乱スペクトルが測定された場合は（評価工程）、試料中に被検出対象微生物が存在することを確認することができる（検出工程）。また、散乱スペクトルのピークの強度に基づいて、被検出対象微生物の濃度を検出することも可能である。

【0049】

［実験例２：被検出微生物と金属ナノ粒子の混合比変化、金属ナノ粒子の濃度一定］
実験例２においては、被検出微生物として緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を用い、金属ナノ粒子として実験例１で用いた第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）を用いて、緑膿菌の濃度を変化させて電子顕微鏡像の観察、暗視野顕微鏡像の観察、および消失スペクトルの測定を行なった。
以下の試料１〜６を準備した。試料２〜６における第２金属ナノ粒子（positive Au NPs）の含有量は０．１ｍｇとした。
（１）試料１：緑膿菌を３．１×１０^８CFUmL^-1の濃度で含み、金属ナノ粒子を添加しない試料、
（２）試料２：緑膿菌を４．６×１０^７CFUmL^-1の濃度で含む溶液に、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）を添加した試料、
（３）試料３：緑膿菌を９．２×１０^７CFUmL^-1の濃度で含む溶液に、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）を添加した試料、
（４）試料４：緑膿菌を１．５×１０^８CFUmL^-1の濃度で含む溶液に、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）を添加した試料、
（５）試料５：緑膿菌を３．１×１０^８CFUmL^-1の濃度で含む溶液に、第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）を添加した試料、
（６）試料６：第２の金属ナノ粒子（positive Au NPs）のみを含み被検出微生物を含まない試料。

【0050】

図１４（ａ）は試料２〜４の電子顕微鏡像を示し、図１４（ｂ）は試料２〜４の暗視野顕微鏡像を示す。また、図１５は、試料１〜６の消失スペクトルを示す。図１４（ｂ）に示す暗視野顕微鏡像から、緑膿菌の濃度が薄いほど、明るい暗視野顕微鏡像が観察されることがわかる。試料５では，試料１（緑膿菌のみ）の暗視野顕微鏡像（図１１）との比較にほとんど相違が見られなかった。これは、金属ナノ粒子の濃度を一定としているため、図１６に示すように、緑膿菌２の濃度が薄いほど、一つ当たりの緑膿菌２に付着する金属ナノ粒子１の個数が増加することによるものと解される。
図１５に示す消失スペクトルから、試料１（緑膿菌のみ）および試料６（金属ナノ粒子のみ）では波長６００〜７００ｎｍ付近での消失光がほとんど観察されないにもかかわらず、試料２〜５においては、消失光の強度が緑膿菌の濃度が高くなるほど大きくなることが観察された。これは、緑膿菌の表面に金属ナノ粒子が付着することにより、波長６００〜７００ｎｍ付近での散乱光が生じることに起因しているものと解される。以上より、消失スペクトルを測定することにより、被検出微生物の有無を検出することができ、また消失スペクトルの特定波長の強度に基づいて被検出微生物の濃度を検出することも可能であることがわかる。

【0051】

［実験例３：被検出微生物と金属ナノ粒子複合体の混合比変化］
実験例３においては、被検出微生物として緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を、金属ナノ粒子として実験例１で用いた第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）を用いて、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）の濃度を変化させて暗視野顕微鏡像の観察および散乱スペクトルの測定を行なった。

【0052】

図３に示すように、金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）を含む溶液と、緑膿菌を含む溶液とを混合して攪拌し、その後、室温で遠心分離（６２００ｒｐｍ）することで微生物に付着していない金属ナノ粒子を除去した。金属ナノ粒子または金属ナノ粒子複合体の緑膿菌への付着状態を電子顕微鏡像、暗視野顕微鏡像により確認した。

【0053】

以下の試料７〜試料１３を準備した。試料７〜１３においては、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を１．５×１０^８CFUmL^-1の濃度で含み、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）の濃度が７６μgである場合を緑膿菌に対して１．０の比率で含まれるとして、かかる比率に換算して記載する。
（１）試料７：緑膿菌を７．５×１０^８CFUmL^-1の濃度で含み、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）が０．２の比率で含まれる試料、
（２）試料８：緑膿菌を３．８×１０^８CFUmL^-1の濃度で含み、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）が０．４の比率で含まれる試料、
（３）試料９：緑膿菌を１．５×１０^８CFUmL^-1の濃度で含み、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）が１．０の比率で含まれる試料、
（４）試料１０：緑膿菌を６．０×１０^８CFUmL^-1の濃度で含み、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）が１．２５の比率で含まれる試料、
（５）試料１１：緑膿菌を３．８×１０^８CFUmL^-1の濃度で含み、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）が２．０の比率で含まれる試料、
（６）試料１２：緑膿菌を３．０×１０^８CFUmL^-1の濃度で含み、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）が２．５の比率で含まれる試料、
（７）試料１３：緑膿菌を１．５×１０^８CFUmL^-1の濃度で含み、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）が５．０の比率で含まれる試料。

【0054】

図１７は試料８〜１３の暗視野顕微鏡像を示し、図１８は試料７〜１３の散乱スペクトルを示し、図１９は図１８の散乱スペクトルに基づいて作成した、金属ナノ粒子複合体の比率に対する波長６００ｎｍの散乱強度の関係を示す図である。図１７に示す暗視野顕微鏡像は、露光時間を１００ｍｓとし、他の撮像条件についても全て同一とした。図１７に示す暗視野顕微鏡像から、金属ナノ粒子複合体の比率が２．０までの試料（試料８〜１１）においては、金属ナノ粒子複合体濃度が濃いほど、明るい暗視野顕微鏡像が観察されることがわかった。これは、緑膿菌に対して、金属ナノ粒子複合体の濃度が濃いほど、一つ当たりの緑膿菌に付着する金属ナノ粒子複合体の個数が増加することによるものと解される。

【0055】

図１８に示す散乱スペクトルから、試料７（緑膿菌のみ）の場合は散乱光が測定されず、また試料８〜１３においては、金属ナノ粒子複合体の濃度が大きいほど、散乱スペクトルのピーク強度が大きくなることが観察されたが、試料１２，１３については、ピーク強度はほぼ同じであった。また、図１９に示す結果から、金属ナノ粒子複合体の比率を３．０以上としても散乱光の強度は大きくならないことがわかった。したがって、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）を用いて検出を行う場合、予測される被検出微生物の濃度に対して、第１の金属ナノ粒子複合体（positive Au nanoraspberry）を、その比率が１．２５〜２．５となるような範囲で添加して散乱特性を評価することが好ましいことがわかった。

【0056】

［実験例４］
実験例４においては、金ナノ粒子および金ナノラズベリーによる蛍光増強効果を確認する測定を行った。まず、１μＭのフルオレセイン水溶液について、励起波長４９０ｎｍで蛍光測定を行なった。次に、１μＭのフルオレセイン水溶液に、以下のように調製した金ナノ粒子分散液を滴下して、励起波長４９０ｎｍで蛍光測定を行なった。さらに、１μＭのフルオレセイン水溶液に、実験例１で調製した金ナノラズベリー分散液を滴下して、励起波長４９０ｎｍで蛍光測定を行なった。

【0057】

（金ナノ粒子分散液の調製）
超純水２５ｍＬに１％テトラクロロ金(III)酸四水和物水溶液を７５０μＬおよび０．１Ｍ炭酸カリウム水溶液（０．５ｍＬ）を加え、４℃で撹拌した。その後、１３ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム水溶液０．５ｍＬを５回（全量２．５ｍＬ）加えて２０分攪拌して金ナノ粒子分散液を調製した。得られた金ナノ粒子分散液における金ナノ粒子の平均粒径は５ｎｍ、ゼータ電位は−１５ｍＶであった。

【0058】

図２０は、１μＭのフルオレセイン水溶液（試料Ａ）の蛍光スペクトルと、１μＭのフルオレセイン水溶液に金ナノ粒子分散液が滴下されて金ナノ粒子を０．９７０μｇ含む水溶液（試料Ｂ）の蛍光スペクトルと、１μＭのフルオレセイン水溶液に金ナノラズベリー水溶液が滴下されて金ナノラズベリーを０．７２７μｇ含む水溶液（試料Ｃ）の蛍光スペクトルとを示す。

【0059】

図２０に示されるように、１μＭのフルオレセイン水溶液（試料Ａ）は、５１２ｎｍに極大値を持つスペクトルを示した。この蛍光ピークの強度は９５であった。金ナノ粒子を０．９７０μｇ含む水溶液（試料Ｂ）のピーク強度は１５４であり、試料Ａのピーク強度と比較して１．５倍増強された。金ナノラズベリーを０．７２７μｇ含む水溶液（試料Ｃ）のピーク強度は１０００以上であり、試料Ａのピーク強度と比較して１０倍以上増強された。

【0060】

図２１は、１μＭのフルオレセイン水溶液（試料Ａ）の蛍光スペクトルと、１μＭのフルオレセイン水溶液に金ナノ粒子分散液が滴下されて金ナノ粒子を以下の量含む試料１４〜２１の蛍光スペクトルを示す。
（１）試料１４：金ナノ粒子の含有量０．１９４μｇ、
（２）試料１５：金ナノ粒子の含有量０．５８２μｇ、
（３）試料１６：金ナノ粒子の含有量０．９７０μｇ、
（４）試料１７：金ナノ粒子の含有量１．９４μｇ、
（５）試料１８：金ナノ粒子の含有量５．８２μｇ、
（６）試料１９：金ナノ粒子の含有量９．７０μｇ、
（７）試料２０：金ナノ粒子の含有量１９．４μｇ、
（８）試料２１：金ナノ粒子の含有量３２．２μｇ。

【0061】

図２２は、図２１の蛍光スペクトルに基づいて作成した、金ナノ粒子の含有量に対する波長５１２ｎｍでの蛍光強度の関係を示す図である。図２１、２２によると、金ナノ粒子の含有量が９．７０μｇ（試料１９）となるまでは金ナノ粒子の含有量の増大に対応して波長５１２ｎｍの蛍光強度が増大したが、さらに含有量を増大（９．７０〜３２．２μｇ）させると、ピーク強度は急激に減少し、試料２１においては、フルオレセインのみと比べて小さくなった。これは、金ナノ粒子表面の増強電場による蛍光増強の一方、金ナノ粒子に近接した蛍光色素の電子移動がクエンチされることによるものと解される。したがって、本実験例にしたがって被検出微生物の検出を行なう場合には、予想される被検出微生物の濃度に応じて、金ナノ粒子の濃度および蛍光色素の濃度を選択することが好ましい。

【0062】

次に、図２０において金ナノラズベリーを添加した場合に蛍光強度が装置の限界を超えたため（強度１０００以上）、試料Ａよりフルオレセインの濃度を１０倍希釈した０．１μＭのフルオレセイン水溶液（試料Ａ２）を準備し、これに実験例１で調製した金ナノラズベリー分散液を滴下して、励起波長４９０ｎｍで蛍光測定を行なった。図２３は、試料Ａ２の蛍光スペクトルと、０．１μＭのフルオレセイン水溶液に金ナノラズベリー分散液が滴下されて金ナノラズベリーを以下の量含む試料２２〜２９の蛍光スペクトルを示す。
（１）試料２２：金ナノラズベリーの含有量０．０７２７μｇ、
（２）試料２３：金ナノラズベリーの含有量０．２１８μｇ、
（３）試料２４：金ナノラズベリーの含有量０．３６４μｇ、
（４）試料２５：金ナノラズベリーの含有量０．７２７μｇ、
（５）試料２６：金ナノラズベリーの含有量２．１８μｇ、
（６）試料２７：金ナノラズベリーの含有量３．６４μｇ、
（７）試料２８：金ナノラズベリーの含有量７．２７μｇ、
（８）試料２９：金ナノラズベリーの含有量１２．１μｇ。

【0063】

図２４は、図２３の蛍光スペクトルに基づいて作成した、金ナノラズベリーの含有量に対する波長５１２ｎｍでの蛍光強度の関係を示す図である。図２３、２４によると、金ナノラズベリーの含有量が３．６４μｇ（試料２７）となるまでは金ナノラズベリーの含有量の増大に対応して波長５１２ｎｍの蛍光強度が増大したが、さらに含有量を増大（３．６４〜１２．１μｇ）させても、ピーク強度はほぼ一定の強度を示した。これは、金ナノラズベリー中において金ナノ粒子がアニリンオリゴマーをリンカーとして集合化された構造を持つことに基づくものと解される。すなわち、アニリンオリゴマーにフルオレセインが補足され、金ナノ粒子に直接接することがないため、クエンチが抑制するものと解される。本実験例にしたがって被検出微生物の検出を行なう場合には、予想される被検出微生物の濃度に応じて、金ナノラズベリーの濃度および蛍光色素の濃度を選択することが好ましい。

【0064】

以上の結果を考察すると、試料Ｂにおいてピーク強度が増強されたのは、金ナノ粒子が表面に持つ増強電場（表面プラズモン）が、近傍の蛍光色素の蛍光を増強することによるものと解される。また、試料Ｃにおいてピーク強度が増強されたのは、金ナノ粒子が集合した構造を持つ金ナノラズベリーでは、隣接する金ナノ粒子において表面の増強電場がカップリングすることでホットスポットを形成し、このホットスポットではさらに増強効果が向上することによるものと解される。

【0065】

実験例４の結果から、まず付着工程で試料に含まれる被検出微生物に金属ナノ粒子または金属ナノ粒子複合体を付着させて、その後被検出微生物に付着していない金属ナノ粒子または金属ナノ粒子複合体を除去し、ここで蛍光色素を添加して、かかる試料について評価工程において蛍光特性を評価することにより、評価結果に基づいて被検出微生物を検出することができることがわかった。あるいは、あらかじめ蛍光色素を保持させた金属ナノ粒子複合体を、試料に含まれる被検出微生物に付着させて、かかる試料について評価工程において蛍光特性を評価することにより、評価結果に基づいて被検出微生物を検出することができることがわかった。被検出微生物に付着した金属ナノ粒子複合体が存在する場合には、蛍光スペクトルのピーク強度が増強することになるからである。

【符号の説明】

【0066】

１ 金属ナノ粒子、２ 被検出微生物、３ プローブ分子、４ 高分子層、５ 金属ナノ粒子複合体（金ナノラズベリー）、７ 鋳型、８ リポ多糖、９ 細胞壁外壁、１２ 散乱光、１３ 光源、１６ 試料、１８，１９ 検出器。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】