特許 6358933 多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6358933

(24)【登録日】2018年6月29日

(45)【発行日】2018年7月18日

(54)【発明の名称】多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子

(51)【国際特許分類】

   C07K 17/00 20060101AFI20180709BHJP

   C07K 4/04 20060101ALI20180709BHJP

   C07K 17/08 20060101ALI20180709BHJP

   C07K 17/14 20060101ALI20180709BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20180709BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20180709BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180709BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20180709BHJP

   A61K 9/18 20060101ALI20180709BHJP

【ＦＩ】

   C07K17/00

   C07K4/04

   C07K17/08

   C07K17/14

   A61K38/00

   A61P37/04

   A61P43/00 111

   A61K9/14

   A61K9/18

【請求項の数】13

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2014-234585(P2014-234585)

(22)【出願日】2014年11月19日

(65)【公開番号】特開2015-129114(P2015-129114A)

(43)【公開日】2015年7月16日

【審査請求日】2017年6月20日

(31)【優先権主張番号】特願2013-250961(P2013-250961)

(32)【優先日】2013年12月4日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000006884

【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社

(73)【特許権者】

【識別番号】397022911

【氏名又は名称】学校法人甲南学園

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】辻 浩和

(72)【発明者】

【氏名】森山 薫

(72)【発明者】

【氏名】志田 寛

(72)【発明者】

【氏名】千葉 勝由

(72)【発明者】

【氏名】野本 康二

(72)【発明者】

【氏名】甲元 一也

(72)【発明者】

【氏名】長濱 宏治

(72)【発明者】

【氏名】松井 淳

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００３−７３２８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−２２６１４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−１３９６７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６３−１２６８２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１９３７３０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １７／００−１７／１４

Ｃ０７Ｋ ４／０４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

粒子状担体表面上に多糖−ペプチドグリカン複合体を担持してなる多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。

【請求項2】

多糖−ペプチドグリカン複合体が、細菌由来である請求項１記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。

【請求項3】

多糖−ペプチドグリカン複合体が、乳酸菌由来である請求項１又は２記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。

【請求項4】

多糖−ペプチドグリカン複合体が、ラクトバチルス属に属する乳酸菌由来である請求項１〜３のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。

【請求項5】

多糖−ペプチドグリカン複合体が、ラクトバチルス・カゼイ及び／又はラクトバチルス・ジョンソニー由来である請求項１〜４のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。

【請求項6】

粒子状担体が、ナノ粒子である請求項１〜５のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。

【請求項7】

粒子状担体が、ラテックスナノ粒子又はシリカナノ粒子である請求項１〜６のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。

【請求項8】

粒子状担体の平均粒子径が、２０nm〜３１００nmである請求項１〜７のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。

【請求項9】

粒子状担体の平均粒子径が、３００nm〜２０００nmである請求項１〜８のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。

【請求項10】

１個の粒子状担体への多糖−ペプチドグリカン複合体の結合量が０．１〜５０amolである請求項１〜９のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子を含有する医薬。

【請求項12】

請求項１〜１０のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子を有効成分とする免疫賦活剤。

【請求項13】

請求項１〜１０のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子を有効成分とするインターロイキン１２産生促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

多糖−ペプチドグリカン複合体（ＰＳ−ＰＧ）は、乳酸菌等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌の細胞壁に存在する成分であり、近年、炎症性腸疾患や腸炎随伴性ガンの予防効果を有することが明らかになっている（特許文献１、非特許文献１）。ＰＳ−ＰＧは、その構造及び性質の点から、グラム陰性菌の細胞壁成分であり、エンドトキシンであるリポ多糖（ＬＰＳ）とは明確に相違する。また、ＰＳ−ＰＧには、分子量の異なるＰＳ−ＰＧ１及びＰＳ−ＰＧ２の２種類あることが知られ、このうちＰＳ−ＰＧ１は、分子量約１００万kDa以上、ＰＳ−ＰＧ２は分子量約３０万kDaと推定されており、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ９０２９におけるこれらの含量の比率はＰＳ−ＰＧ１：ＰＳ−ＰＧ２＝約１：８である（非特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１１−１９３７３０号公報

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Immunology, Vol.128, 1 Suppl, e170-e180(2009)

【非特許文献2】「ラクトバチルス カゼイ シロタ株−腸内フローラおよび健康とのかかわり−」、第２６−３３頁（ヤクルト本社中央研究所、1999年1月1日発行）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかし、ＰＳ−ＰＧは、エンドトキシンであるリポ多糖とは大きく異なり、ＰＳ−ＰＧを有する生菌で発現する自然免疫賦活能が、細胞壁から分離し可溶化されたＰＳ−ＰＧでは全く生じない。従って、ＰＳ−ＰＧにおいては、生菌を用いることなくＰＳ−ＰＧの特性の変化、構造と生理活性の関係等の研究ができなかった。
従って、本発明の課題は、ＰＳ−ＰＧの生理機能を保持したモデル細胞壁系を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

そこで本発明者らは、生理活性を生じるＰＳ−ＰＧのモデル系を構築すべく種々検討した結果、粒子状担体を用いその表面にＰＳ−ＰＧを担持せしめれば、ＰＳ−ＰＧ含有粒子が得られ、当該粒子はＩＬ−１２産生促進効果を有し、免疫賦活能を有することを見出し、本発明を完成した。

【0007】

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１３〕を提供するものである。
〔１〕粒子状担体表面上に多糖−ペプチドグリカン複合体（ＰＳ−ＰＧ）を担持してなるＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔２〕ＰＳ−ＰＧが、細菌由来である〔１〕記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔３〕ＰＳ−ＰＧが、乳酸菌由来である〔１〕又は〔２〕記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔４〕多糖−ペプチドグリカン複合体が、ラクトバチルス属に属する乳酸菌由来である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。
〔５〕ＰＳ−ＰＧが、ラクトバチルス・カゼイ及び／又はラクトバチルス・ジョンソニー由来である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔６〕粒子状担体が、ナノ粒子である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔７〕粒子状担体が、ラテックスナノ粒子又はシリカナノ粒子である〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔８〕粒子状担体の平均粒子径が、２０nm〜３１００nmである〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔９〕粒子状担体の平均粒子径が、３００nm〜２０００nmである〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の多糖−ペプチドグリカン複合体含有粒子。
〔10〕１個の粒子状担体へのＰＳ−ＰＧの結合量が０．１〜５０amolである〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子。
〔11〕〔１〕〜〔10〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子を含有する医薬。
〔12〕〔１〕〜〔10〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子を有効成分とする免疫賦活剤。
〔13〕〔１〕〜〔10〕のいずれかに記載のＰＳ−ＰＧ含有粒子を有効成分とするインターロイキン１２産生促進剤。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、生菌の状態でなければ生理活性を示さなかったＰＳ−ＰＧの生理活性を有する人工粒子が提供できる。本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子を用いれば、生菌を用いることなく、ＰＳ−ＰＧが免疫賦活能を生じるメカニズムの研究等が可能となる。また、本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子は免疫賦活剤及びＩＬ−１２産生促進剤等の医薬、それらの作用を有する食品等としても有用である。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】ラクトバチルス・カゼイ由来ＰＳ−ＰＧ含有粒子の粒子状担体の平均粒子径とＩＬ−１２産生誘導能との関係を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子は、粒子状担体表面上にＰＳ−ＰＧを担持してなる。

【0011】

ＰＳ−ＰＧは、細菌の細胞壁由来のもの及び人工的に作製されたものが含まれる。このうち、生理活性の点で細菌の細胞壁由来のものが好ましい。ここで、細菌としては、乳酸菌、ビフィズス菌、クロストリジウム等のグラム陽性菌、大腸菌、バクテロイデス等のグラム陰性菌が挙げられるが、取り扱い性、安全性、生理活性の点から乳酸菌、ビフィズス菌が好ましく、乳酸菌がより好ましい。乳酸菌としては、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属等に属する乳酸菌が好ましく、より具体的には、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ユーグルティ、ラクトバチルス・デルブルッキー サブスピシーズ．ブルガリカス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ．ラクチス、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ．クレモリス、ロイコノストック・メセンテロイデス、ペディオコッカス・ペントサセウス等が挙げられる。このうち、ラクトバチルス属に属する乳酸菌が好ましく、ラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ジョンソニーがより好ましく、特にラクトバチルス・カゼイが好ましい。ラクトバチルス・カゼイとしては、ラクトバチルス・カゼイ YIT 9029（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）が好ましく、ラクトバチルス・ジョンソニーとしては、ラクトバチルス・ジョンソニー YIT 0219^T（ＪＣＭ ２０１２^T）が好ましい。

【0012】

これらの細菌から、ＰＳ−ＰＧを分離するには、例えば特許文献１及び非特許文献２の記載に従えばよい。
ＰＳ−ＰＧとしては、ＰＳ−ＰＧ１及び／又はＰＳ−ＰＧ２を含有するもの（細菌の細胞壁由来のもの、人工的に作製されたもの等）であれば特に限定されず、さらには、例えば各種クロマトグラフィーによる分離や密度勾配遠心法などの分離・精製処理をさらに行ったものも含まれる。

【0013】

粒子状担体としては、ナノ粒子であることが生理活性を発揮させる点から好ましい。その具体的な平均粒子径としては、１nm〜３１００nmが好ましく、２０nm〜３１００nmがより好ましく、１００nm〜３１００nmがさらに好ましく、３００nm〜２０００nmがさらに好ましく、５００nm〜２０００nmがさらに好ましく、１０００nmが特に好ましい。

【0014】

粒子状担体の形状は、特に限定されないが、球状又は略球状であることが、ＰＳ−ＰＧの結合量、担持率、生理活性の点で好ましい。

【0015】

粒子状担体としては、スチレン・ジビニルベンゼン共重合体ビーズ等のポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、デンドリマー、シリカビーズや酸化チタンビーズ、アルミナビーズのような無機ナノビーズ、カーボンナノ材料、金ナノ粒子や銀ナノ粒子のような金属ナノ粒子（ナノロッドも含む）、セレン化カドミウムのような半導体ナノ粒子、リポソームやミセルなどの自己組織化会合体粒子等が挙げられるが、粒子径の小さく安定なナノ粒子が得られる点から、ラテックスナノ粒子、シリカナノ粒子が好ましい。ラテックスナノ粒子としては、ポリスチレン系ラテックスナノ粒子が好ましい。
また、これらの粒子状担体表面は、ＰＳ−ＰＧを担持するため、アミノ基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、カルボニル基、α，β−不飽和カルボニル基、ホルミル基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、ジスルフィド基、アルキニル基等で修飾されているのが好ましい。これらの修飾基としては、脂肪族又は芳香族等の修飾基が挙げられ、例えば、脂肪族アミノ基、芳香族アミノ基等が挙げられる。また、ヒスチジンオリゴマー、ビピリジン、ジピコリルアミン、イミノ二酢酸等のような金属イオンと配位結合を形成する配位子で修飾されていてもよい。

【0016】

粒子状担体表面上へのＰＳ−ＰＧの担持形態は、吸着、イオン結合、共有結合、金属結合、ファンデルワールス結合等のいずれでもよいが、ＰＳ−ＰＧ含有粒子の安定性、生理活性等の点から共有結合が好ましい。より好ましくは、ＰＳ−ＰＧと粒子状担体表面上に修飾されたホルミル基又はアミノ基とがシッフ塩基形成、還元アミノ化を経て共有結合している形態である。

【0017】

粒子状担体へのＰＳ−ＰＧの結合量は、特に制限されないが、１個の粒子状担体表面に結合したＰＳ−ＰＧ量（モル数）として、０．１〜２５０amolが好ましく、０．１〜５０amolがより好ましく、１〜５０amolがさらに好ましく、１０〜５０amolが特に好ましい。ここで、結合量は後記実施例に示すように、１個の粒子状担体表面に結合したＰＳ−ＰＧ重量をＸ（pg）、ＰＳ−ＰＧの重量平均分子量をＹ（ｇ／mol）として、Ｘ／Ｙ（amol）によって算出することができる。

【0018】

粒子状担体へのＰＳ−ＰＧの担持率は、特に制限されないが、粒子状担体表面のアミノ基モル数に対して０．１〜１００％が好ましく、０．１〜２０％がより好ましく、１〜２０％がさらに好ましく、１０〜２０％が特に好ましい。ここで、担持率は、後記実施例に示すように、１個の粒子状担体表面のアミノ基モル数をＺ（amol）として、（Ｘ／Ｙ）／Ｚ×１００（％）によって算出することができる。

【0019】

粒子状担体表面へのＰＳ−ＰＧの担持方法としては、前述の如く吸着、イオン結合、共有結合、金属結合、ファンデルワールス結合等の形成方法が挙げられるが、アミノ基修飾された粒子状担体表面にＰＳ−ＰＧの糖鎖を還元条件下で反応させる還元アミノ化反応を用いるのが好ましい。より具体的には、ＰＳ−ＰＧのアミノ酸に含まれるアミノ基をアセチル化等により保護し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤の存在下に、アミノ基又は脂肪族アミノ基修飾粒子状担体を反応させるのが好ましい。

【0020】

本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子は、後記実施例に示すように、マクロファージにおける強いＩＬ−１２産生作用を有し、免疫賦活剤として有用である。また、従来、ＰＳ−ＰＧは菌体から分離した状態では生理活性を示さなかったが、本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子は、人工粒子であるにもかかわらず、生理活性を示すことから、ＰＳ−ＰＧの生理活性の作用機序等の研究試薬としても有用である。
従って、本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子は、ＩＬ−１２産生促進剤、免疫賦活剤等として医薬、食品、化粧品、試薬等の分野で使用可能である。

【0021】

本発明の医薬は経口投与又は非経口投与のいずれも使用できるが、経口投与が望ましい。投与に関しては、有効成分であるＰＳ−ＰＧ含有粒子を投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。

【0022】

本発明の有効成分であるＰＳ−ＰＧ含有粒子を使用する際の投与量に厳格な制限はない。対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜投与量を設定することが望ましいが、その好適な投与量はＰＳ−ＰＧ含有粒子として１回あたり１×１０⁷個以上が好ましく、１×１０⁷個〜１×１０¹³個がより好ましく、１×１０⁹個〜１×１０¹³個がさらに好ましく、１×１０¹¹個〜１×１０¹³個が特に好ましい。

【0023】

医薬品とする場合の製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固体剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。

【0024】

また、本発明の免疫賦活剤及びＩＬ−１２産生促進剤は、上記のような医薬品製剤として用いるだけでなく、飲食品等として用いることもできる。この場合には、本発明のＰＳ−ＰＧ含有粒子をそのまま、又は種々の栄養成分を加えて、飲食品中に含有せしめればよい。この飲食品は、免疫能の改善、ＩＬ−１２の産生不足による疾患、例えば感染症、腫瘍、アレルギー等の予防・治療等に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品又はその容器には、前記の効果を有する旨の表示を付してもよい。具体的に本発明の免疫賦活剤又はＩＬ−１２産生促進剤を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵飲食品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には動物の飼料も含まれる。
これらの医薬品、食品等に使用する場合の、本発明ＰＳ−ＰＧ含有粒子の濃度は１×１０⁷個／ｇ以上が好ましく、１×１０⁷個／ｇ〜１×１０¹³個／ｇがより好ましく、１×１０⁹個／ｇ〜１×１０¹³個／ｇがさらに好ましく、１×１０¹¹個／ｇ〜１×１０¹³個／ｇが特に好ましい。

【実施例】

【0025】

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【0026】

実施例１
（１）ＰＳ−ＰＧの分離
Lactobacillus casei ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）の培養菌体を９０℃にて３０分間加熱し、凍結乾燥を行った。この加熱死菌体凍結乾燥物５００mgを５mM Tris-maleate buffer（pH６．４）３０mLに懸濁し、Mutanolysin（ＳＩＧＭＡ）を添加して３７℃、２４時間、反応させた。反応液を遠心分離して得られた上清について、１０mM リン酸buffer（pH６．０）／０．２５Ｍ ＮａＣｌを外液として、２０時間、４℃にて透析した。透析内液を凍結乾燥し、凍結乾燥物を終濃度５mg／mLとなるように注射用蒸留水（扶桑薬品）に溶解した。これをセファクリル Ｓ−２００ ＨＲ（ＧＥヘルスケア、カラムサイズ：５×６０cm）にアプライし、ゲル濾過を行った（流速：１mL／min、温度：４℃）。得られたフラクションについて、フェノール・硫酸法にてＰＳ−ＰＧ画分を検出した。ＰＳ−ＰＧ画分を回収し、注射用蒸留水を外液として、２０時間、４℃にて透析した。これを凍結乾燥し、７３mgの精製ＰＳ−ＰＧを得た。

【0027】

（２）ＰＳ−ＰＧのアミノ基の保護
１．５mLのマイクロチューブに、ＰＳ−ＰＧ３mgを加え、ミリＱ水５００μＬに溶解させた。調製したＰＳ−ＰＧ水溶液に、アミノ基の脱プロトン化が起こるよう、５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）５０μＬと無水酢酸２０μＬを加え、アセチル化反応を開始した。反応溶液は室温で静置し、１５分おきにボルテックスで攪拌した。また、すべてのアミノ基をブロックするために反応開始後１時間毎に、無水酢酸を２０μＬずつ追加した。この操作を５時間続けた。５時間後、反応溶液を透析膜（フナコシ製（スペクトロポア）、分画分子量３５００）に入れ、蒸留水で１日透析した。透析によって若干白濁した溶液を２００mLナス型フラスコに移し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後のアセチル化ＰＳ−ＰＧの収量は１．６mg（回収率５３％）であった。

【0028】

（３）反応用糖鎖ストック溶液の調製
ｉ）デキストランストック溶液の調製
０．５mLのマイクロチューブに、デキストラン５mgを加え、ミリＱ水５０μＬに溶解させた（０．１mg／μＬ）。デキストランの修飾率を変化させるために、先に調製した０．１mg／μＬを１０倍ずつ希釈したストック溶液系列（最大１０²⁵倍希釈：１×１０^-1〜１×１０^-26mg／μＬ）を調製した。調製法は、ストック溶液を１０μＬとり、０．５mLのマイクロチューブに加え、ミリＱ水９０μＬを加え、混合することで希釈溶液を調製した。

【0029】

ii）ＰＳ−ＰＧストック溶液の調製
０．５mLのマイクロチューブにアセチル化したＰＳ−ＰＧ０．８mgを加え、ミリＱ水４０μＬに溶解させた（０．０２mg／μＬ）。ＰＳ−ＰＧの修飾率を変化させるために、先に調製した０．０２mg／μＬを１０倍ずつ希釈したストック溶液系列（最大１０¹⁰倍希釈：２×１０^-2〜２×１０^-12mg／μＬ）を調製した。調製法は、ストック溶液を１０μＬとり、０．５mLのマイクロチューブに加え、ミリＱ水９０μＬを加え、混合することで希釈溶液を調製した。

【0030】

実施例１において合成した糖鎖修飾ナノビーズを表１及び表２にまとめ、これら糖鎖修飾ナノビーズの合成法を以下に詳述する。

【0031】

【表1】

【0032】

【表2】

【0033】

iii)ナノビーズへの糖鎖の修飾
ナノビーズとして、脂肪族アミノ基修飾ラテックスナノビーズ（粒径２４±３nm：Molecular Probe社）（２０ＬＡ−ＮＨ₂）、脂肪族アミノ基修飾ラテックスナノビーズ（粒径１１０±５nm：Molecular Probe社）（１００ＬＡ−ＮＨ₂）、脂肪族アミノ基修飾ラテックスビーズ（粒径３．１μｍ：Molecular Probe社）（ＮＰ₃₀₀₀）、アミノ基修飾シリカナノビーズ（粒径１００nm：Micromod Partikeltechnologie GmbH社）（１００ＳＩ−ＮＨ₂）、アミノ基修飾シリカナノビーズ（粒径５００nm：Micromod Partikeltechnologie GmbH社）（５００ＳＩ−ＮＨ₂）を用いた。デキストランは、分子量４０，０００（和光純薬社）のものを用いた。
ア．シリカナノビーズへのデキストランの修飾
０．５mLのマイクロチューブに、５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）２０μＬ、シリカナノビーズ（１００ＳＩ−ＮＨ₂、もしくは５００ＳＩ−ＮＨ₂）２０μＬ、１００mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液３０μＬを加え、デキストランストック溶液２０μＬを加えた。溶液をボルテックスで攪拌した後、４５℃で１日加熱した。反応溶液を遠心分離（９，０００rpm、５min、２５℃）し、シリカナノビーズを沈殿させた。ビーズを吸い込まないように上澄みを取り除き、ナノビーズから反応溶液を洗浄するためにマイクロチューブにミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。再度、遠心分離（９，０００rpm、５min、２５℃）した後、上澄みを取り除き、ミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。この操作を２回繰り返した。
ここで、１００ＳＩ−ＮＨ₂にデキストランを１×１０^-1〜１×１０^-26mg／μＬ用いて被覆したビーズを、１００ＳＤ−１乃至１００ＳＤ−２６とし、５００ＳＩ−ＮＨ₂にデキストランを１×１０^-1〜１×１０^-26mg／μＬ用いて被覆したビーズを、５００ＳＤ−１乃至５００ＳＤ−２６とした。
イ．シリカナノビーズへのＰＳ−ＰＧの修飾
０．５mLのマイクロチューブに、５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）２０μＬ、シリカナノビーズ（１００ＳＩ−ＮＨ₂、もしくは５００ＳＩ−ＮＨ₂）２０μＬ、１００mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液３０μＬを加え、ＰＳ−ＰＧストック溶液２０μＬを加えた。溶液をボルテックスで攪拌した後、４５℃で３日加熱した。反応溶液を遠心分離（９，０００rpm、５min、２５℃）し、シリカナノビーズを沈殿させた。ビーズを吸い込まないように上澄みを取り除き、ナノビーズから反応溶液を洗浄するためにマイクロチューブにミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。再度、遠心分離（９，０００rpm、５min、２５℃）した後、上澄みを取り除き、ミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。この操作を４回繰り返した。
ここで、１００ＳＩ−ＮＨ₂にＰＳ−ＰＧを２×１０^-2〜２×１０^-12mg／μＬ用いて被覆したビーズを、１００ＳＰ−２乃至１００ＳＰ−１２とし、５００ＳＩ−ＮＨ₂にＰＳ−ＰＧを２×１０^-2〜２×１０^-12mg／μＬ用いて被覆したビーズを、５００ＳＰ−２乃至５００ＳＰ−１２とした。

【0034】

ウ．ラテックスナノビーズへのデキストランの修飾
０．５mLのマイクロチューブに、５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）２０μＬ、ラテックスナノビーズ２０μＬ、１００mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液３０μＬを加え、デキストランストック溶液２０μＬを加えた。溶液をボルテックスで攪拌した後、４５℃で１日加熱した。反応溶液を遠心分離（１０，０００rpm、１５min、２５℃）し、ラテックスナノビーズを沈殿させた。ビーズを吸い込まないように上澄みを取り除き、ナノビーズから反応溶液を洗浄するためにマイクロチューブにミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。再度、遠心分離（１０，０００rpm、１５min、２５℃）した後、上澄みを取り除き、ミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。この操作を２回繰り返した。
ここで、２０ＬＡ−ＮＨ₂にデキストランを１×１０^-1〜１×１０^-26mg／μＬ用いて被覆したビーズを、２０ＬＤ−１乃至２０ＬＤ−２６とし、１００ＬＡ−ＮＨ₂にデキストランを１×１０^-1〜１×１０^-26mg／μＬ用いて被覆したビーズを、１００ＬＤ−１乃至１００ＬＤ−２６とした。

【0035】

エ．ラテックスナノビーズへのＰＳ−ＰＧの修飾
０．５mLのマイクロチューブに、５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）２０μＬ、ラテックスナノビーズ２０μＬ、１００mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液３０μＬを加え、ＰＳ−ＰＧストック溶液２０μＬを加えた。溶液をボルテックスで攪拌した後、４５℃で３日加熱した。反応溶液を遠心分離（１０，０００rpm、１５min、２５℃）し、ラテックスナノビーズを沈殿させた。ビーズを吸い込まないように上澄みを取り除き、ナノビーズから反応溶液を洗浄するためにマイクロチューブにミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。再度、遠心分離（１０，０００rpm、１５min、２５℃）した後、上澄みを取り除き、ミリＱ水７０μＬを加え、ボルテックスで攪拌した。この操作を４回繰り返した。
ここで、２０ＬＡ−ＮＨ₂にＰＳ−ＰＧを２×１０^-2〜２×１０^-12mg／μＬ用いて被覆したビーズを、２０ＬＰ−２乃至２０ＬＰ−１２とし、１００ＬＡ−ＮＨ₂にＰＳ−ＰＧを２×１０^-2〜２×１０^-12mg／μＬ用いて被覆したビーズを、１００ＬＰ−２乃至１００ＬＰ−１２とした。
オ．ナノビーズ表面へのＰＳ−ＰＧ結合量の定量
ｉ）材料
ＮＰ₃₀₀₀について
脂肪族アミノ基修飾ラテックスナノビーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）
粒子直径＝３．１μｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社公表データ）
粒子表面のアミノ基占有面積＝２１Ų＝０．２１×１０^-6μｍ²（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社公表データ）
粒子の表面積＝４×(×（３.１／２）²＝３０．２μｍ²
粒子表面のアミノ基数＝３０．２μｍ²／０．２１×１０^-6μｍ²＝１４３，６９２，３８０
粒子表面のアミノ基モル数＝１４３，６９２，３８０／６．０２×１０²³mol^-1＝２４．３×１０^-17mol＝２４３amol

【0036】

ii）ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧの合成
マイクロチューブに１５０μＬのＰＢＳ（５０mM，pH８．５）、７５μＬのアセチル化ＰＳ−ＰＧ水溶液（２．０mg／７５μＬ：ビーズ表面のアミノ基に対して８等量のアセチル化ＰＳ−ＰＧ（モル数））、２５μＬのＮＰ₃₀₀₀水溶液（３．７５×１０⁷個，０．２３０mg）、７５μＬのシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１００mM）を加えた。マイクロチューブを室温にて静置し、３０分ごとにボルテックスにより撹拌した。これを８回繰り返した後，２５０rpmで撹拌しながら４５℃にて７２時間インキュベートした。
反応溶液を遠心分離し（１１，０００rpm，１５min，４℃）、ＮＰ₃₀₀₀成分を沈殿させ、上清を除去した。２００μＬの超純水を用いた洗浄操作を７回繰り返し、ペレットとしてＰＳ−ＰＧ結合ＮＰ₃₀₀₀（ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧ）を得た。ビーズ表面のアミノ基に対して添加するアセチル化ＰＳ−ＰＧのモル数（１等量，２等量，４等量，６等量）を変化させたこと以外は、上記と同じ方法により、ＮＰ₃₀₀₀−ＰＳＰＧ、ＮＰ₃₀₀₀−２ＰＳＰＧ、ＮＰ₃₀₀₀−４ＰＳＰＧ、ＮＰ₃₀₀₀−６ＰＳＰＧを得た。

【0037】

iii)１個のＮＰ₃₀₀₀に結合したＰＳ−ＰＧ量の算出方法
ペレットとして得られた各ＰＳ−ＰＧ結合ＮＰ₃₀₀₀を凍結乾燥し、精密電子天秤により各ＰＳ−ＰＧ結合ＮＰ₃₀₀₀の重量を測定した。各反応前後で増加した重量はナノビーズに結合したＰＳ−ＰＧによるものとし，１個のＮＰ₃₀₀₀に結合したＰＳ−ＰＧ量を算出した。以下はその一例として、ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧの算出過程を示す。
反応前のＮＰ₃₀₀₀（３．７５×１０⁷個）の重量は０．２３０mgであった。ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧの場合、反応、精製後の重量は０．２８４mgであった。これより、３．７５×１０⁷個のＮＰ₃₀₀₀に５４μｇのＰＳ−ＰＧが結合したことが分かった。また、１個のＮＰ₃₀₀₀に結合したＰＳ−ＰＧ重量は１．４４pgと算出され（５４μｇ／３．７５×１０⁷個）、ＰＳ−ＰＧの重量平均分子量３０，０００（ｇ／mol）を用いると、１個のＮＰ₃₀₀₀に結合したＰＳ−ＰＧのモル数は４８amolと算出された（１．４４pg／３０，０００ｇ・mol^-1）。ＮＰ₃₀₀₀表面のアミノ基モル数は２４３amolであることより、ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧの場合、ＮＰ₃₀₀₀表面に提示されたアミノ基の１９．８％がＰＳ−ＰＧとの結合に用いられたことが分かった。

【0038】

iv）ＮＰ₃₀₀₀へのＰＳ−ＰＧ結合量の定量
１個のナノビーズ表面に結合したＰＳ−ＰＧ量（モル数）を表３にまとめる。ＰＳ−ＰＧ添加量の増加に伴い，ナノビーズ１個に結合したＰＳ−ＰＧ量は増加した。ＰＳ−ＰＧ添加量とＰＳ−ＰＧ結合量とは正比例の関係にはなく、ＰＳ−ＰＧ１モル等量と２モル等量で結合量は同程度であった。４モル等量では２モル等量の約２倍の結合量が得られた。６モル等量では２モル等量の約１４倍の結合量，８モル等量では２モル等量の約４３倍の結合量が得られた。

【0039】

【表3】

【0040】

試験例１
（マウス由来マクロファージ細胞を用いたサイトカイン産生評価）
（１）細胞の培養、継代
１０cmディッシュで培養したＪ７７４．１細胞（マウスマクロファージ様株化細胞）は、ピペッティングおよびトリプシン処理によりディッシュ底面からはがし、その細胞懸濁液を遠心分離（１０００rpm、３min）することにより、遠沈チューブ内に回収した。上清を吸引除去した後、そこに新鮮培地（１０％非働化ウシ胎児血清、１００Ｕ／mLペニシリン、１００μｇ／mLストレプトマイシン、０．０５mM ２−メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ−１６４０培地）を加え、ピペッティングによりＪ７７４．１細胞を培地中に懸濁させた。得られたＪ７７４．１細胞懸濁液を新しい１０cmディッシュ内に注ぎ（２．０×１０⁵cells／mL、８mL）、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で培養した。これらの操作を３日毎に繰り返し、継代を行った。

【0041】

（２）細胞毒性試験
Ｊ７７４．１細胞懸濁液を細胞培養用９６wellプレートに１００μＬ／wellずつ分注し（１．０×１０⁵cells／well）、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で２時間インキュベートした。その後、使用培地に懸濁した各種ＰＳ−ＰＧ結合ナノビーズおよびコントロール（２０ＬＤ−１、１００ＬＤ−１、５００ＳＤ−１、２０ＬＡ−ＮＨ₂、１００ＬＡ−ＮＨ₂、５００ＳＩ−ＮＨ₂）を１００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で２４時間培養した。その後、各wellにＷＳＴ−１アッセイ溶液（ＷＳＴ−１／１−ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳの９／１混合水溶液）を１０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で２時間呈色反応させた。その後、マイクロプレートリーダーで４５０nmおよび６２０nmの吸光度を測定した。

【0042】

（３）ＩＬ−１２産生誘導実験
Ｊ７７４．１細胞懸濁液を細胞培養用９６wellプレートに１００μＬ／wellずつ分注し（１．０×１０⁵cells／well）、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で２時間インキュベートした。その後、使用培地にて懸濁した各種ＰＳ−ＰＧ結合ナノビーズおよびコントロール（２０ＬＤ−１、１００ＬＤ−１、５００ＳＤ−１、２０ＬＡ−ＮＨ₂、１００ＬＡ−ＮＨ₂、５００ＳＩ−ＮＨ₂）を１００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で２４時間培養した。その後、培養上清を０．２２μｍフィルターでろ過し、得られたろ液を−３０℃で保存した。Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１２ ｐ４０／ｐ７０をＮａ₂ＣＯ₃緩衝液（pH９．６）で希釈し、ＥＬＩＳＡ用９６wellプレートに５０μＬずつ添加し、４℃で一晩インキュベートした。各wellを０．０５％Tween２０を含むＰＢＳ（pH７．４）で洗浄後、１％ＢＳＡを含むＮａ₂ＣＯ₃緩衝液を１００μＬずつ添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。各wellをＰＢＳで洗浄後、サンプルおよび０．０３％ＮａＮ₃を含むＰＢＳで所定の濃度になるよう希釈したｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１２ ｐ７０を５０μＬずつ添加し、室温で９０分間反応させた。各wellをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈したｂｉｏｔｉｎ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１２ ｐ４０／ｐ７０を５０μＬずつ添加し、室温で９０分間反応させた。各wellをＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２００００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを５０μＬずつ添加し、暗中室温で３０分間反応させた。各wellをＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ（３,３’,５,５’-テトラメチルベンジジン）基質溶液を５０μＬずつ添加し、暗中室温で２０分間反応させた。各wellに１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を５０μＬずつ添加して発色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０nmおよび６２０nmの吸光度を測定した。

【0043】

（４）細胞毒性
ナノビーズ表面をＰＳ−ＰＧで修飾すると、ナノビーズのＪ７７４．１細胞に対するサイズ依存的な毒性は軽減されることが分かった。

【0044】

（５）ＩＬ−１２産生誘導効果
ｉ）ＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスナノビーズ（２０ＬＰ−２）について
２０ＬＰ−２を用いてＩＬ−１２産生誘導実験を行ったところ、粒子濃度１．０×１０¹³個／mLで、ＩＬ−１２発現量は２８，８７８pg／mLに達した。

【0045】

ii）ＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスナノビーズ（１００ＬＰ−２）について
１００ＬＰ−２を用いてＩＬ−１２産生誘導実験を行ったところ、粒子濃度が１．０×１０¹〜１．０×１０⁹個／mLでは、ＩＬ−１２発現量は濃度上昇に伴い２５１pg／mL〜５１２pg／mLの濃度範囲で変化していた。しかし、粒子濃度が１．０×１０¹¹個／mLに達するとＩＬ−１２の生産量が５，０２６pg／mLまで急激に上昇した。

【0046】

iii)ＰＳ−ＰＧ修飾シリカナノビーズ（５００ＳＰ−２）について
５００ＳＰ−２を用いてＩＬ−１２産生誘導実験を行ったところ、粒子濃度が１．０×１０¹〜１．０×１０⁷個／mLでは、ＩＬ−１２発現量は濃度上昇に伴い２５７pg／mL〜７５１pg／mLの濃度範囲で変化していたが、粒子濃度が１．０×１０⁹個／mLに達するとＩＬ−１２の産生量が８９２pg／mLまで急激に上昇した。

【0047】

iv)ＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスナノビーズ（ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧ）について
ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧを用いてＩＬ−１２産生誘導実験を行ったところ、粒子濃度が１．０×１０⁷個／mLで、ＩＬ−１２産生量が９２１pg／mLまで急激に上昇した。約２０nmのナノビーズでは１．０×１０¹³個／mL、約１００nmのナノビーズでは１．０×１０¹¹個／mL、約５００nmのナノビーズでは１．０×１０⁹個／mLという粒子濃度に閾値（ＩＬ−１２産生量が急激に上昇する粒子濃度）があったことから考えると、粒子径が大きくなるほど閾値となる粒子濃度が低下することが明らかとなった。
なお、前記ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧに相当する量の可溶化ＰＳ−ＰＧ（細胞壁から分離し可溶化されたＰＳ−ＰＧをビーズに被覆しない状態で添加）を用いてＩＬ−１２産生誘導実験を行ったところ、前記ＮＰ₃₀₀₀−８ＰＳＰＧの粒子濃度に相当する濃度域においてＩＬ−１２の産生は誘導されず、ＩＬ−１２の発現量に顕著な差はなかった。

【0048】

v）デキストラン修飾ラテックスナノビーズ（２０ＬＤ−１）について
２０ＬＤ−１を用いたものに関しては、粒子濃度が１．０×１０¹〜１．０×１０¹³個／mLの範囲でＩＬ−１２の産生は誘導されず、ＩＬ−１２の発現量に顕著な差はなかった。

【0049】

実施例２
（ＰＳ−ＰＧ修飾ナノビーズの粒径とIL-12産生量の相関）
（ｉ）ＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスナノビーズの合成
０．５μＬのマイクロチューブに５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）２０．０μＬ、各サイズ（直径：２００、３００、１０００、２０００、３０００nm）のＮＰ（ラテックスナノビーズ）懸濁液２０μＬ、１００mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液３０．０μＬ、各サイズのＮＰ表面に存在するアミノ基に対して８モル当量になるようにミリＱ水で濃度調整したラクトバチルス・カゼイ由来ＰＳ−ＰＧ溶液を２０μＬ加えた。その後、溶液をボルテックスにて撹拌し、４５℃で７２時間加熱した。その後、反応溶液を遠心し（１１，０００rpm、１５min、４℃）ナノビーズを沈殿させた。ナノビーズ反応溶液の上清を取り除き、ミリＱ水を加えボルテックスで撹拌した。再度、遠心分離（１１，０００rpm １５min ４℃）した後に上清を取り除き、ナノビーズにミリＱ水を加えボルテックスで撹拌した。この操作を７回繰り返した。

【0050】

（ii）ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１２濃度の定量
Ｊ７７４．１細胞（マウスマクロファージ様株化細胞）を９６wellプレートに１×１０^５ｃｅｌｌｓ／wellで分注し（１００μＬ）、３７℃５％ＣＯ_２で２時間インキュベートした。その後、濃度調整した（１．０×１０^９個／mL）各サイズのＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスビーズ溶液を各wellに１００μＬずつ添加し、３７℃５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。２４時間後、培養上清を０．４５μｍフィルターにて濾過回収後、ＥＬＩＳＡ用サンプルとして−２０℃で保存した。ＥＬＩＳＡ用９６wellプレートにｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１２ ｐ４０／ｐ７０（pH９．６のＮａ_２ＣＯ_３緩衝液で１０μｇ／mLに希釈）を５０μＬ添加し、４℃で一晩インキュベートしプレートへ固層化した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて５回洗浄し、１％ＢＳＡ−Ｎａ_２ＣＯ_３緩衝液を１００μＬ添加し４℃下で２４時間インキュベートした。各wellをＰＢＳにて４回洗浄し、サンプルおよび１％ＢＳＡ−ＰＢＳで（４０００pg／mL、２０００pg／mL、１０００pg／mL、５００pg／mL、２５０pg／mL、１２５pg／mL、６２．５pg／mL、０pg／mL）となるよう希釈したｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１２ ｐ７０を５０μＬ添加し、室温で９０分間反応した。各wellをＰＢＳにて４回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したｂｉｏｔｉｎ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＬ１２ ｐ４０／ｐ７０（１．０μｇ／mL）を５０μＬ添加し室温で９０分間反応した。ＰＢＳにて４回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２００００倍希釈したペルオキシターゼ標識ストレプトアビジン溶液５０μＬを添加し、暗中室温下で３０分間反応させた。ＰＢＳにて４回洗浄し、ＴＭＢ（３,３’,５,５’-テトラメチルベンジジン）基質溶液５０μＬを添加し、暗中室温下で２０分反応させマイクロプレートリーダーにて６２０nmの吸光度を測定した。その後、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を５０μＬ添加し反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて４５０nmおよび６２０nmの吸光度を測定した。

【0051】

（iii）結果
ＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスナノビーズの担体の粒子径（２００nm〜３０００nm）とＩＬ−１２産生作用との関係を図１に示す。
図１から明らかなように、粒子状担体の平均粒子径が３００nm〜２０００nmであるＰＳ−ＰＧ含有粒子のＩＬ−１２産生誘導能が特に優れていることがわかる。

【0052】

実施例３
（ラクトバチルス・ジョンソニー由来ＰＳ−ＰＧ含有粒子のＩＬ−１２産生誘導能）
（ｉ）ラクトバチルス・ジョンソニー由来ＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスナノビーズの合成
ラクトバチルス・ジョンソニー ＹＩＴ ０２１９^T（ＪＣＭ ２０１２^T）由来ＰＳ−ＰＧ溶液の調製は、実施例１のラクトバチルス・カゼイ由来由来ＰＳ−ＰＧ溶液の調製方法と同様の方法により行った。
０．５μＬのマイクロチューブに５０mMリン酸緩衝液（pH８．５）２０．０μＬ、直径：１μｍのＮＰ（ラテックスナノビーズ）懸濁液２０μＬ、１００mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液３０．０μＬ、ＮＰ表面に存在するアミノ基に対して８モル当量になるようにミリＱ水で濃度調整したラクトバチルス・ジョンソニー由来ＰＳ−ＰＧ溶液を２０μＬ加えた。その後、溶液をボルテックスにて撹拌し、４５℃で７２時間加熱した。その後、反応溶液を遠心し（１１，０００rpm、１５min、４℃）ナノビーズを沈殿させた。ナノビーズ反応溶液の上清を取り除き、ミリＱ水を加えボルテックスで撹拌した。再度、遠心分離（１１，０００rpm、１５min、４℃）した後に上清を取り除き、ナノビーズにミリＱ水を加えボルテックスで撹拌した。この操作を７回繰り返した。
（ii）ＥＬＩＳＡによるＩＬ−１２濃度の定量
Ｊ７７４．１細胞を９６wellプレートに１×１０^５ｃｅｌｌｓ／wellで分注し（１００μＬ）、３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベートした。その後、濃度調整した各サイズのＰＳ−ＰＧ修飾ラテックスビーズ溶液を各wellに１００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。２４時間後、培養上清を０．４５μｍフィルターにて濾過回収後、ＥＬＩＳＡ用サンプルとして−２０℃で保存した。ＥＬＩＳＡ用９６wellプレートにｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１２ ｐ４０／ｐ７０（pH９．６のＮａ_２ＣＯ_３緩衝液で１０μｇ／mLに希釈）を５０μＬ添加し、４℃で一晩インキュベートしプレートへ固層化した。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて５回洗浄し、１％ＢＳＡ−Ｎａ_２ＣＯ_３緩衝液を１００μＬ添加し４℃下で２４時間インキュベートした。各wellをＰＢＳにて４回洗浄し、サンプルおよび１％ＢＳＡ−ＰＢＳで（４０００pg／mL、２０００pg／mL、１０００pg／mL、５００pg／mL、２５０pg／mL、１２５pg／mL、６２．５pg／mL、０pg／mL）となるよう希釈したｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１２ ｐ７０を５０μＬ添加し、室温で９０分間反応した。各wellをＰＢＳにて４回洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したｂｉｏｔｉｎ ｒａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＬ１２ ｐ４０／ｐ７０（１．０μｇ／mL）を５０μＬ添加し室温で９０分間反応した。ＰＢＳにて４回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２００００倍希釈したペルオキシターゼ標識ストレプトアビジン溶液５０μＬを添加し、暗中室温下で３０分間反応させた。ＰＢＳにて４回洗浄し、ＴＭＢ（３,３’,５,５’-テトラメチルベンジジン）基質溶液５０μＬを添加し、暗中室温下で２０分反応させマイクロプレートリーダーにて６２０nmの吸光度を測定した。その後、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を５０μＬ添加し反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて４５０nmおよび６２０nmの吸光度を測定した。

【0053】

（iii）結果
ラクトバチルス・ジョンソニー由来ＰＳ−ＰＧ修飾ナノ粒子のＪ７７４．１細胞に対するＩＬ−１２産生誘導能は、粒子濃度１×１０⁸粒子／mLで８７０，０００pq／mLに達した。Ｌ．Ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来ＰＳ−ＰＧは菌体レベルでＩＬ−１２産生誘導能を示さないことが知られていることから、この実験結果は、ＩＬ−１２産生誘導を示さない乳酸菌由来のＰＳ−ＰＧでも、本発明のように粒子化（粒子状担体表面上に担持）することにより、ＩＬ−１２産生誘導能を示すようになることを示唆している。

【図1】