特許 6359832 試料分注装置及び試料分注方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6359832

(24)【登録日】2018年6月29日

(45)【発行日】2018年7月18日

(54)【発明の名称】試料分注装置及び試料分注方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 35/10 20060101AFI20180709BHJP

   G01N 1/00 20060101ALI20180709BHJP

【ＦＩ】

   G01N35/10 A

   G01N1/00 101K

【請求項の数】15

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2014-18155(P2014-18155)

(22)【出願日】2014年2月3日

(65)【公開番号】特開2015-145805(P2015-145805A)

(43)【公開日】2015年8月13日

【審査請求日】2017年1月25日

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100098545

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100087745

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 善廣

(74)【代理人】

【識別番号】100106611

【弁理士】

【氏名又は名称】辻田 幸史

(72)【発明者】

【氏名】羽藤 正勝

(72)【発明者】

【氏名】橘内 徳司

(72)【発明者】

【氏名】竹田 真宏

【審査官】 島田 保

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−１４９８５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０５８３２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−１２６００９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０３３５５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２２２７００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５５−１０２４４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−１３４１８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０１６３７３０（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３５／００−３７／００

Ｇ０１Ｎ １／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

マイクロプレートに形成したそれぞれのウェルに、マイクロシリンジを用いて試料を注入する試料分注装置であって、
一方の端面に開口する第１空洞部と、他方の端面に開口する第２空洞部とを形成したフィッティングリングを設け、
前記第１空洞部と前記第２空洞部とは連通し、
前記第１空洞部に、前記マイクロシリンジのシリンジ本体に固定して又は前記シリンジ本体に着脱可能に設けられるリムーバブルニードル基部を挿入することで、
前記シリンジ本体に装着されるニードルチップ又は前記リムーバブルニードル基部に装着される前記ニードルチップを前記第２空洞部に配置し、
前記ウェルの底面から前記ニードルチップの先端までが所望の一定の距離となるように、他方の前記端面と前記ニードルチップの前記先端との距離が規定された
ことを特徴とする試料分注装置。

【請求項2】

前記フィッティングリングの他方の前記端面を、前記マイクロプレートのプレート表面に当接させる
ことを特徴とする請求項１に記載の試料分注装置。

【請求項3】

請求項１に記載の試料分注装置を用いて前記試料を注入する前記マイクロプレート及びスペーサであって、
前記スペーサを前記マイクロプレートに載置して用い、
前記スペーサには、前記ウェルに対応したスペーサ貫通孔を形成し、
前記フィッティングリングの端部を前記スペーサ貫通孔に挿入し、
前記フィッティングリングの他方の前記端面を、前記スペーサのスペーサ表面又は前記マイクロプレートのプレート表面に当接させる
ことを特徴とするマイクロプレート及びスペーサ。

【請求項4】

前記ウェルに対応したスペーサ貫通孔を形成したスペーサが、前記マイクロプレートに載置して用いられる試料分注装置であって、
他方の前記端面を、外周リング面で構成し、
内周リング面を前記外周リング面よりも突出させて端部を形成し、
前記外周リング面を、前記スペーサのスペーサ表面に当接させ、前記端部を前記スペーサ貫通孔に挿入する
ことを特徴とする請求項１に記載の試料分注装置。

【請求項5】

前記第２空洞部を、小径空洞部と大径空洞部とで構成し、
他方の前記端面は、前記大径空洞部によって形成される
ことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の試料分注装置。

【請求項6】

前記大径空洞部は、前記小径空洞部から他方の前記端面に向かって径を漸次拡大させた
ことを特徴とする請求項５に記載の試料分注装置。

【請求項7】

前記ニードルチップの前記先端を、他方の前記端面から突出させた
ことを特徴とする請求項１、請求項２、及び請求項６のいずれか１項に記載の試料分注装置。

【請求項8】

前記ニードルチップの前記先端を、他方の前記内周リング面から突出させた
ことを特徴とする請求項４に記載の試料分注装置。

【請求項9】

前記ニードルチップの前記先端を、前記第２空洞部の内部に配置した
ことを特徴とする請求項１、請求項２、及び請求項６のいずれか１項に記載の試料分注装置。

【請求項10】

他方の前記端面から、前記ニードルチップと平行なスリットを設けた
ことを特徴とする請求項９に記載の試料分注装置。

【請求項11】

他方の前記端面から前記ニードルチップの前記先端までの前記距離が異なる複数のフィッティングリングを備えた
ことを特徴とする請求項１、請求項２、請求項６、請求項７、請求項９、及び請求項１０のいずれか１項に記載の試料分注装置。

【請求項12】

前記試料が粘稠な試料であり、
一つの前記ウェルに注入する前記試料が１０〜３００ｎｌであり、
前記ウェルの前記底面から前記ニードルチップの前記先端までの距離を５０μｍ〜４００μｍとした
ことを特徴とする請求項１、請求項２、請求項４、及び請求項６から請求項１１のいずれか１項に記載の試料分注装置。

【請求項13】

請求項２に記載の試料分注装置を用いて前記試料を注入する前記マイクロプレートであって、
基板と、前記基板に貼り付けられるプラスチックシートと、前記プラスチックシートの前記基板と反対面に配置される粘着剤層保護シートとから構成され、
前記プラスチックシート及び前記粘着剤層保護シートにはシート貫通孔が形成され、前記基板に前記プラスチックシートを貼り付けることで、前記シート貫通孔によって前記ウェルが形成され、
前記プレート表面を、前記粘着剤層保護シートのシート表面とした
ことを特徴とするマイクロプレート。

【請求項14】

前記マイクロプレートには、Ｘ軸方向にａ個、前記Ｘ軸方向と直交するＹ軸方向にｂ個の前記ウェルが格子状に配列され、
前記スペーサには、Ｘ軸方向にａ個、Ｙ軸方向にｂ／ｎ個（ただし、ｎは１以上でｂの約数）の前記スペーサ貫通孔を形成した
ことを特徴とする請求項３に記載のマイクロプレート及びスペーサ。

【請求項15】

請求項１に記載の試料分注装置を用いた試料分注方法であって、
基台に前記マイクロプレートを固定し、
一対のガイドバーの間にスペーサを配置し、
前記ウェルに前記試料を注入する注入ステップと、
前記注入ステップの後に、前記スペーサを移動させるスペーサ移動ステップと、
前記スペーサ移動ステップの後に、前記注入ステップで注入した前記ウェルにカバープレートを載置するカバーステップと
を有する
ことを特徴とする試料分注方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイクロプレートに形成したそれぞれのウェルに、マイクロシリンジを用いて試料を注入する試料分注装置及び試料分注方法に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質は生体内で様々な生命活動を担っている重要な分子であり、正しい立体的な構造をとることによって正しい機能を発揮する。したがって、タンパク質の構造などの解析は生命現象の深い理解につながり、構造解析によって得られた情報は、例えば、病気の原因となるタンパク質の働きを制御する薬などの効率的な開発に威力を発揮する。しかし、タンパク質の中には、立体構造解析に必要な高品質の結晶化が困難なものがある。例えば、難解析性タンパク質と呼ばれる膜タンパク質は、細胞における各種受容体及びチャネル等、生体機能に重要な役割を果たしている。そのため、その構造情報は、学術的価値があるばかりでなく、医薬品開発等の産業的価値も高い。しかしながら膜タンパク質は、活性（機能）を維持したままでの大量調製、結晶化及び構造解析が現在の技術水準では困難である。そのため、学術的及び産業的観点から、膜タンパク質のエックス線構造解析に必須である３次元結晶を得るためのさらなる技術の進歩が望まれている。
膜タンパク質の３次元結晶を得るための有力な技術として、脂質メソフェーズ法（非特許文献１）がある。脂質メソフェーズ法は、脂質二重膜を構成ユニットとする脂質メソフェーズ（膜タンパク質の結晶化の場となる）中に、膜タンパク質を再構成し、そのまま脂質二重膜マトリクス中で結晶化を行う手法であり、β２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（非特許文献２）をはじめとするＧＰＣＲ、あるいはバクテリオロドプシン（非特許文献３）など、他の結晶化方法では長年にわたり成功しなかった膜タンパク質のエックス線結晶構造解析を可能にする等、膜タンパク質の結晶化に無くてはならない技術となっている。
蒸気拡散法などの従来の結晶化法でよく用いられている方法は、可溶化した膜タンパク質を含む溶液をスクリーニングプレートのウェル内に分注する。分注後、ここに、ウェル毎に組成の異なる、タンパク質を結晶化させるための結晶化溶液（電解質及び有機化合物等を含む緩衝液）を添加して結晶化を行い、タンパク質の結晶成長する溶液条件を探索する。
脂質メソフェーズ法で、よく用いられている方法として、まず、膜タンパク質を含む水溶液を（Ｉ）マトリクス脂質と、あるいは（ＩＩ）マトリクス脂質及び適切な水溶液を前もって混合して得た脂質メソフェーズと混合し、「膜タンパク質を含有する脂質メソフェーズの試料（タンパク質−脂質メソフェーズ試料、あるいは単に試料と呼ぶ）」を調製する。次いで、一定量（通常、５０〜１００ｎｌ）のタンパク質−脂質メソフェーズ試料を９６ウェルスクリーニングプレートの各ウェル内に分注する。タンパク質−脂質メソフェーズ試料を分注後、ここに、ウェル毎に組成の異なる結晶化溶液を添加し、次いで、全てのウェルをもう一枚のガラスプレートでカバーし、タンパク質−脂質メソフェーズ試料と結晶化溶液を二枚のガラスプレートでサンドイッチ状に保持する。その後結晶化プレートを所定の温度でインキュベートし結晶化を行い、膜タンパク質が結晶成長するに好適な溶液条件を探索する（非特許文献４）。
このように、脂質メソフェーズ法でも、蒸気拡散法などの従来の結晶化法と基本的に同じ手順で実験が進められる。しかし、タンパク質−脂質メソフェーズ試料は非常に粘稠であるため、通常の液体用の分注装置では分注が困難である。そこでガスタイト型のマイクロシリンジに充填したタンパク質−脂質メソフェーズ試料をプランジャーに加えた正圧力で、一定距離移動させ、マイクロシリンジの先端に装着したシリンジニードルを通じて、スクリーニングプレートのウェル上に所定量の試料を分注する方法が用いられている（非特許文献４）。
通常の液体の分注において、特許文献１から特許文献３では、ニードルチップ又はピペットチップの先端にできる液玉の大きさと、ニードルチップ又はピペットチップの先端からウェルの底面又は液面までの距離との関係が開示されているように、分注量Ｖに対応したシリンジニードル先端とウェルの底面間の距離Ｌを適切な値で分注することが重要であることが知られている。
非常に粘稠且つ複雑なレオロジー特性を有する試料の５０〜１００ｎｌといった少量を正確に再現性良く分注するには、シリンジニードル先端とウェルの底面間の距離Ｌの制御は特に重要である。そのため、Ｌ値、分注位置の設定等のパラメターをコンピュータ制御して分注を行う自動分注装置が開発されている（非特許文献５）。
自動分注装置は、非常に多く（数千〜数万）の結晶化条件を試行錯誤的に検索する、初期のスクリーニング段階には便利である。しかし、初期スクリーニングを経て、結晶成長に適した幾つかの結晶化溶液組成がわかった後、さらに結晶化溶液組成を微調整し、構造解析に適した高品質の結晶を得るための条件探索、いわゆる「最適化段階」では、少数の分注操作で充分である場合が多く、そのような小スケールの実験には、数千〜数万の分注操作を前提に設計されている自動分注装置よりは、ハンディーな手動分注装置を用いて機動的に実験を進める方が効率的である。そのために機械式の小型の手動分注装置が開発されている（非特許文献６）。
ここでいう手動とは、Ｌ値、分注位置の設定等を手作業で行うことを意味する。例えば、以下のような操作で分注する。まず、タンパク質−脂質メソフェーズ試料を充填したガスタイト型のマイクロシリンジを装着した手動分注装置を手で保持し、シリンジニードルの先端を目的ウェルの中央部上に移動させた後、手動分注装置のマイクロシリンジプランジャー移動ボタンを手で押し、目的のスクリーニングプレートウェルに分注を行う。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開平３−３７５６９号公報

【特許文献2】特開２００２−３４０９１５号公報

【特許文献3】特開２０１１−１４９８５３号公報

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｌａｎｄａｕ ＥＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６， ９３， １４５３２ １４５３５．

【非特許文献2】Ｃｈｅｒｅｚｏｖ Ｖ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００７， ３１８， １２５８・１２６５．

【非特許文献3】Ｐｅｂａｙ−Ｐｅｙｒｏｕｌａ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９７， ２７７， １６７６−１６８１．

【非特許文献4】Ｃａｆｆｒｅｙ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ， ２００９， ４， ７０６−７３１．

【非特許文献5】Ｃｈｅｒｅｚｏｖ Ｖ， ｅｔ ａｌ．， Ａ ｒｏｂｏｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄｉｃ ｍｅｓｏｐｈａｓｅｓ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ： Ｂｉｌｏ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ， ２００４， ６０， １７９５−１８０７．

【非特許文献6】Ｃｈｅｒｅｚｏｖ Ｖ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔ， ２００５， ３８， ３９８・４００．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、現在の手動分注装置には以下のような問題点がある。
１）図２５に、マイクロシリンジのウェルの底面からニードルチップの先端までの距離Ｌ（μｍ）と分注量Ｖ（ｎｌ）との実験結果例を示す。
図２５に示すように、一定の分注量Ｖを再現性良く分注するためには、分注量Ｖに対応した距離Ｌで分注することが必須であるが、このオーダの距離を手動で保持することはできない。
特許文献１から特許文献３では、ニードルチップ又はピペットチップの先端にできる液玉の大きさと、ニードルチップ又はピペットチップの先端からウェルの底面又は液面までの距離との関係を開示しているが、手作業で、この距離をどのようにして一定に保つかについては何ら開示されていない。
このように、既知の手動分注装置ではこのような微少距離の制御を行うことは困難であり、分注量が不正確で再現性が悪い。
２）脂質メソフェーズ法によく用いられる、９６ウェルスクリーニングプレートは、約１４０μｍ厚の両面粘着性の９６個の孔（直径５ｍｍ、９ｍｍ間隔）開きポリエステルシートを、約１ｍｍ厚のＳＢＳ（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）に準拠したガラスプレートに貼付けた構造を持っている。手動分注では分注時の手の震え等により、分注された脂質メソフェーズ試料の形態が不定形になり、分注位置も一定位置（中央）に保てず、ウェルの端に分注される等、分注位置が安定しない問題がある。試料形態の不均一性は、結晶化過程に影響を与え、結晶化過程の再現性の低下に繋がる。また、試料の分注位置がウェル中心からはずれ、ウェルの端に近づくと、分注された試料上に重層した結晶化溶液の一部がウェルのエッジに接触し、ウェルとガラスとの接着面を通じての毛管現象で隣のウェルまでしみ出すことがしばしば生じる。その場合、双方の溶液が混合し、結晶化溶液の組成や濃度が変化し、結晶化の信頼性を大きく低下させる要因となる。
手動分注は自動分注装置と併用される故、自動分注装置と同程度の、分注量選択の自由度、分注精度、再現性、安定した分注位置が保証されるものでなければならない。
しかしながら、従来の手動分注装置は、以上の様に脂質メソフェーズ法に必要な、分注精度、再現性や信頼性が保証されず、操作も煩雑である等、本来満たすべき性能が得られない。

【0006】

そこで本発明は、マイクロシリンジを用いてマイクロプレートに形成したそれぞれのウェルに試料を注入する際に、ウェルの底面からニードルチップの先端までの距離を常に一定に保つことができる試料分注装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

請求項１記載の本発明の試料分注装置は、マイクロプレートに形成したそれぞれのウェルに、マイクロシリンジを用いて試料を注入する試料分注装置であって、一方の端面に開口する第１空洞部と、他方の端面に開口する第２空洞部とを形成したフィッティングリングを設け、前記第１空洞部と前記第２空洞部とは連通し、前記第１空洞部に、前記マイクロシリンジのシリンジ本体に固定して又は前記シリンジ本体に着脱可能に設けられるリムーバブルニードル基部を挿入することで、前記シリンジ本体に装着されるニードルチップ又は前記リムーバブルニードル基部に装着される前記ニードルチップを前記第２空洞部に配置し、前記ウェルの底面から前記ニードルチップの先端までが所望の一定の距離となるように、他方の前記端面と前記ニードルチップの前記先端との距離が規定されたことを特徴とする。
請求項２記載の本発明は、請求項１に記載の試料分注装置において、前記フィッティングリングの他方の前記端面を、前記マイクロプレートのプレート表面に当接させることを特徴とする。
請求項３記載の本発明のマイクロプレート及びスペーサは、請求項１に記載の試料分注装置を用いて前記試料を注入する前記マイクロプレート及びスペーサであって、前記スペーサを前記マイクロプレートに載置して用い、前記スペーサには、前記ウェルに対応したスペーサ貫通孔を形成し、前記フィッティングリングの端部を前記スペーサ貫通孔に挿入し、前記フィッティングリングの他方の前記端面を、前記スペーサのスペーサ表面又は前記マイクロプレートのプレート表面に当接させることを特徴とする。
請求項４記載の本発明は、請求項１に記載の試料分注装置において、前記ウェルに対応したスペーサ貫通孔を形成したスペーサが、前記マイクロプレートに載置して用いられる試料分注装置であって、他方の前記端面を、外周リング面で構成し、内周リング面を前記外周リング面よりも突出させて端部を形成し、前記外周リング面を、前記スペーサのスペーサ表面に当接させ、前記端部を前記スペーサ貫通孔に挿入することを特徴とする。
請求項５記載の本発明は、請求項１又は請求項２に記載の試料分注装置において、前記第２空洞部を、小径空洞部と大径空洞部とで構成し、他方の前記端面は、前記大径空洞部によって形成されることを特徴とする。
請求項６記載の本発明は、請求項５に記載の試料分注装置において、前記大径空洞部は、前記小径空洞部から他方の前記端面に向かって径を漸次拡大させたことを特徴とする。
請求項７記載の本発明は、請求項１、請求項２、及び請求項６のいずれか１項に記載の試料分注装置において、前記ニードルチップの前記先端を、他方の前記端面から突出させたことを特徴とする。
請求項８記載の本発明は、請求項４に記載の試料分注装置において、前記ニードルチップの前記先端を、他方の前記内周リング面から突出させたことを特徴とする。
請求項９記載の本発明は、請求項１、請求項２、及び請求項６のいずれか１項に記載の試料分注装置において、前記ニードルチップの前記先端を、前記第２空洞部の内部に配置したことを特徴とする。
請求項１０記載の本発明は、請求項８に記載の試料分注装置において、他方の前記端面から、前記ニードルチップと平行なスリットを設けたことを特徴とする。
請求項１１記載の本発明は、請求項１、請求項２、請求項６、請求項７、請求項９、及び請求項１０のいずれか１項に記載の試料分注装置において、他方の前記端面から前記ニードルチップの前記先端までの前記距離が異なる複数のフィッティングリングを備えたことを特徴とする。
請求項１２記載の本発明は、請求項１、請求項２、請求項４、及び請求項６から請求項１１のいずれか１項に記載の試料分注装置において、前記試料が粘稠な試料であり、一つの前記ウェルに注入する前記試料が１０〜３００ｎｌであり、前記ウェルの前記底面から前記ニードルチップの前記先端までの距離を５０μｍ〜４００μｍとしたことを特徴とする。
請求項１３記載の本発明のマイクロプレートは、請求項２に記載の試料分注装置を用いて前記試料を注入する前記マイクロプレートであって、基板と、前記基板に貼り付けられるプラスチックシートと、前記プラスチックシートの前記基板と反対面に配置される粘着剤層保護シートとから構成され、前記プラスチックシート及び前記粘着剤層保護シートにはシート貫通孔が形成され、前記基板に前記プラスチックシートを貼り付けることで、前記シート貫通孔によって前記ウェルが形成され、前記プレート表面を、前記粘着剤層保護シートのシート表面としたことを特徴とする。
請求項１４記載の本発明は、請求項３に記載のマイクロプレート及びスペーサにおいて、前記マイクロプレートには、Ｘ軸方向にａ個、前記Ｘ軸方向と直交するＹ軸方向にｂ個の前記ウェルが格子状に配列され、前記スペーサには、Ｘ軸方向にａ個、Ｙ軸方向にｂ／ｎ個（ただし、ｎは１以上でｂの約数）の前記スペーサ貫通孔を形成したことを特徴とする。
請求項１５記載の本発明の試料分注方法は、請求項１に記載の試料分注装置を用いた試料分注方法であって、基台に前記マイクロプレートを固定し、一対のガイドバーの間にスペーサを配置し、前記ウェルに前記試料を注入する注入ステップと、前記注入ステップの後に、前記スペーサを移動させるスペーサ移動ステップと、前記スペーサ移動ステップの後に、前記注入ステップで注入した前記ウェルにカバープレートを載置するカバーステップとを有することを特徴とする。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、マイクロシリンジを用いて行う分注作業において、ウェルの底面からニードルチップの先端までの距離を常に一定に保つことができるため、ウェル毎の分注量のばらつきを少なくでき、また、ウェルの底面からニードルチップの先端までの距離を変更することで分注量を任意に変更できる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】本発明の第１の実施例による試料分注装置の要部断面図

【図2】同試料分注装置のフィッティングリングを示す写真

【図3】同試料分注装置を用いるマイクロプレートを示す図

【図4】同試料分注装置を構成するスペーサを示す図

【図5】本発明の第２の実施例による試料分注装置を構成する基台とガイドバーを示す図

【図6】図５（ａ）及び（ｂ）に示す基台に図３に示すマイクロプレートを装着した状態の平面図

【図7】図６に示す状態に更に図５（ｃ）及び（ｄ）に示すガイドバーを装着した状態を示す平面図

【図8】図７に示す状態に更に図４に示すスペーサを装着した状態を示す平面図

【図9】第１のスペーサ移動ステップを行った状態を示す図

【図10】第１のカバーステップを行った状態を示す図

【図11】第２のスペーサ移動ステップを行った状態を示す図

【図12】第２のカバーステップを行った状態を示す図

【図13】第３のスペーサ移動ステップを行った状態を示す図

【図14】第３のカバーステップを行った状態を示す図

【図15】第４のスペーサ移動ステップを行った状態を示す図

【図16】第４のカバーステップを行った状態を示す図

【図17】本発明の第３の実施例による試料分注装置を構成するフィッティングリングの要部断面図

【図18】同試料分注装置の使用状態を示す要部断面図

【図19】本発明の第４の実施例による試料分注装置を構成するフィッティングリングの要部断面図

【図20】本発明の第５の実施例による試料分注装置を構成するフィッティングリングの要部断面図及び同試料分注装置の使用状態を示す要部断面図

【図21】本発明の第６の実施例による試料分注装置を構成するフィッティングリングの要部断面図及び同試料分注装置の使用状態を示す要部断面図

【図22】本発明の第７の実施例による試料分注装置を構成するフィッティングリングの要部断面図及び同試料分注装置の使用状態を示す要部断面図

【図23】第１の実施例による試料分注装置を用いた場合の実験結果と比較例を示す図

【図24】（ａ）第１の実施例による試料分注装置を用いてウェルに注入された試料を撮影した写真、（ｂ）図２４（ａ）で撮影した写真からウェル内での試料の位置及び大きさを模式的に現した説明図、（ｃ）分注位置の実験結果を示すデータ

【図25】分注量Ｖ（ｎｌ）とマイクロシリンジのウェルの底面からニードルチップの先端までの最適距離Ｌ（μｍ）との相関を示す実験結果を示す図

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明の第１の実施の形態による試料分注装置は、一方の端面に開口する第１空洞部と、他方の端面に開口する第２空洞部とを形成したフィッティングリングを設け、第１空洞部と第２空洞部とは連通し、第１空洞部に、マイクロシリンジのシリンジ本体に固定して又はシリンジ本体に着脱可能に設けられるリムーバブルニードル基部を挿入することで、シリンジ本体に装着されるニードルチップ又はリムーバブルニードル基部に装着されるニードルチップを第２空洞部に配置し、ウェルの底面から前記ニードルチップの先端までが所望の一定の距離となるように、他方の端面とニードルチップの先端との距離が規定されたものである。本実施の形態によれば、マイクロシリンジを用いて行う分注作業において、ウェルの底面からニードルチップの先端までの距離を常に一定に保つことができるため、ウェル毎の分注量のばらつきを少なくでき、また、ウェルの底面からニードルチップの先端までの距離を変更することで分注量を任意に変更できる。

【0011】

本発明の第２の実施の形態は、第１の実施の形態における試料分注装置において、フィッティングリングの他方の端面を、マイクロプレートのプレート表面に当接させるものである。本実施の形態によれば、ウェルの底面からニードルチップの先端までの距離を常に一定に保つことができる。

【0012】

本発明の第３の実施の形態によるマイクロプレート及びスペーサは、第１の実施の形態における試料分注装置を用いて試料を注入するマイクロプレート及びスペーサであって、スペーサをマイクロプレートに載置して用い、スペーサには、ウェルに対応したスペーサ貫通孔を形成し、フィッティングリングの端部をスペーサ貫通孔に挿入し、フィッティングリングの他方の端面を、スペーサのスペーサ表面又はマイクロプレートのプレート表面に当接させるものである。本実施の形態によれば、ウェルの底面からニードルチップの先端までの距離を常に一定に保つことができるとともに分注位置をウェルの中央に維持できるため、試料がウェルのエッジに触れることで、試料がウェルからしみ出すことによる液量減少や、隣接ウェル内の溶液同士の混合による溶液組成変化を防止することができる。

【0013】

本発明の第４の実施の形態は、第１の実施の形態における試料分注装置において、ウェルに対応したスペーサ貫通孔を形成したスペーサが、マイクロプレートに載置して用いられる試料分注装置であって、他方の端面を、外周リング面で構成し、内周リング面を外周リング面よりも突出させて端部を形成し、外周リング面を、スペーサのスペーサ表面に当接させ、端部をスペーサ貫通孔に挿入するものである。本実施の形態によれば、端部によって分注位置をウェルの中央に維持できるとともに、外周リング面によってウェルの底面からニードルチップの先端までの距離を常に一定に保つことができる。

【0014】

本発明の第５の実施の形態は、第１又は第２の実施の形態における試料分注装置において、第２空洞部を、小径空洞部と大径空洞部とで構成し、他方の端面は、大径空洞部によって形成されるものである。本実施の形態によれば、ウェル内に注入した試料がフィッティングリングに触れることを防止でき、ウェル内に注入した試料の減少とコンタミを防止できる。

【0015】

本発明の第６の実施の形態は、第５の実施の形態における試料分注装置において、大径空洞部は、小径空洞部から他方の端面に向かって径を漸次拡大させたものである。本実施の形態によれば、加工を容易にでき、他方の端面の面積を小さくできる。

【0016】

本発明の第７の実施の形態は、第１、第２、及び第６のいずれかの実施の形態における試料分注装置において、ニードルチップの先端を、他方の端面から突出させたものである。本実施の形態によれば、フィッティングリングをウェルに近づけることなく、ニードルチップの先端をウェルの底面に近づけることができる。

【0017】

本発明の第８の実施の形態は、第４の実施の形態における試料分注装置において、ニードルチップの先端を、他方の内周リング面から突出させたものである。本実施の形態によれば、フィッティングリングをウェルに近づけることなく、ニードルチップの先端をウェルの底面に近づけることができる。

【0018】

本発明の第９の実施の形態は、第１、第２、及び第６のいずれかの実施の形態における試料分注装置において、ニードルチップの先端を、第２空洞部の内部に配置したものである。本実施の形態によれば、ニードルチップの先端が第２空洞部の内部に隠れているため、ニードルチップにものが触れることがなく、ニードルチップを保護することができる。

【0019】

本発明の第１０の実施の形態は、第９の実施の形態における試料分注装置において、他方の端面から、ニードルチップと平行なスリットを設けたものである。本実施の形態によれば、ニードルチップの状態をスリットから計測して確認できる。

【0020】

本発明の第１１の実施の形態は、第１、第２、第６、第７、第９、及び第１０のいずれかの実施の形態における試料分注装置において、他方の端面からニードルチップの先端までの距離が異なる複数のフィッティングリングを備えたものである。本実施の形態によれば、他方の端面からニードルチップの先端までの距離が異なるフィッティングリングを使い分けることで、分注量を任意に変更できる。

【0021】

本発明の第１２の実施の形態は、第１、第２、第４、及び第６から第１１のいずれかの実施の形態における試料分注装置において、試料が粘稠な試料であり、一つのウェルに注入する試料が１０〜３００ｎｌであり、ウェルの底面からニードルチップの先端までの距離を５０μｍ〜４００μｍとしたものである。本実施の形態によれば、粘稠な試料であっても、ウェルの底面からニードルチップの先端までの距離を５０μｍ〜４００μｍとすることができ、一定の分注量を再現できる。

【0022】

本発明の第１３の実施の形態によるマイクロプレートは、第２の実施の形態の試料分注装置を用いて試料を注入するマイクロプレートであって、基板と、基板に貼り付けられるプラスチックシートと、プラスチックシートの基板と反対面に配置される粘着剤層保護シートとから構成され、プラスチックシート及び粘着剤層保護シートにはシート貫通孔が形成され、基板にプラスチックシートを貼り付けることで、シート貫通孔によってウェルが形成され、プレート表面を、粘着剤層保護シートのシート表面としたものである。本実施の形態によれば、基板にプラスチックシートを貼り付けたマイクロプレートに対して、分注量を常に一定に保つことができるとともに分注位置をウェルの中央に維持できる。

【0023】

本発明の第１４の実施の形態は、第３の実施の形態のマイクロプレート及びスペーサにおいて、マイクロプレートには、Ｘ軸方向にａ個、Ｘ軸方向と直交するＹ軸方向にｂ個のウェルが格子状に配列され、スペーサには、Ｘ軸方向にａ個、Ｙ軸方向にｂ／ｎ個（ただし、ｎは１以上でｂの約数）のスペーサ貫通孔を形成したものである。本実施の形態によれば、一つのマイクロプレートに対して、ウェルへの分注作業を分けて行え、未作業の他のウェルをスペーサで閉塞できるので、未作業の他のウェル内をクリーンな状態に維持できる。

【0024】

本発明の第１５の実施の形態による試料分注方法は、第１の実施の形態における試料分注装置を用いた試料分注方法であって、基台にマイクロプレートを固定し、一対のガイドバーの間にスペーサを配置し、ウェルに試料を注入する注入ステップと、注入ステップの後に、スペーサを移動させるスペーサ移動ステップと、スペーサ移動ステップの後に、注入ステップで注入したウェルにカバープレートを載置するカバーステップとを有するものである。本実施の形態によれば、一つのマイクロプレートに対して、ウェルへの分注作業を分けて行え、ウェル内に注入した試料の乾燥を防止できる。

【実施例】

【0025】

図１を用いて本発明の第１の実施例による試料分注装置を説明する。
図１（ａ）は同試料分注装置の要部断面図、図１（ｂ）は同試料分注装置の使用状態を示す要部断面図、図１（ｃ）は図１（ｂ）中、四角でかこった要部の拡大断面図である。
本発明の第１の実施例による試料分注装置は、フィッティングリング１０とスペーサ２０とで構成される。
フィッティングリング１０は、一方の端面１１に開口する第１空洞部１２と、他方の端面１３に開口する第２空洞部１４とを形成している。第１空洞部１２と第２空洞部１４とは連通している。
フィッティングリング１０の他方の端面１３は、内周リング面１３ａと外周リング面１３ｂとで構成し、内周リング面１３ａを外周リング面１３ｂよりも突出させて突出部１３ｃを形成している。
スペーサ２０は、マイクロプレート３０に載置して用いられる。
スペーサ２０には、ウェル３１に対応したスペーサ貫通孔２１を形成している。
マイクロプレート３０は、基板３２と、基板３２に貼り付けられるプラスチックシート３３から構成される。プラスチックシート３３の両面には粘着剤が塗布されており、粘着剤は粘着剤層保護シート３４で保護されている。図１（ｃ）に示すように、基板３２にプラスチックシート３３を貼り付けた状態では、プラスチックシート３３の基板３２と反対面には粘着剤層保護シート３４が配置されている。プラスチックシート３３及び粘着剤層保護シート３４にはシート貫通孔３５が形成されている。
基板３２にプラスチックシート３３を貼り付けることで、シート貫通孔３５によってマイクロプレート３０にはウェル３１が形成される。

【0026】

図１（ａ）及び図１（ｂ）では、マイクロシリンジ４０のシリンジ本体４１と、シリンジ本体４１に着脱可能に設けられるリムーバブルニードル基部４２と、リムーバブルニードル基部４２に装着されるニードルチップ４３を示している。
リムーバブルニードル基部４２は第１空洞部１２に挿入され、ニードルチップ４３は第２空洞部１４に配置される。
なお、フィッティングリング１０は、第１空洞部１２にリムーバブルニードル基部４２があらかじめ挿入固着されたものでもよいし、リムーバブルニードル基部４２が一体に形成されたものでもよい。
あらかじめリムーバブルニードル基部４２が固定されたフィッティングリング１０とすることで、他方の端面１３からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌ１を製造時に一定に保つことができる。
図１（ｂ）に示すように、フィッティングリング１０の端部である突出部１３ｃをスペーサ貫通孔２１に挿入し、フィッティングリング１０の他方の端面１３である外周リング面１３ｂを、スペーサ２０のスペーサ表面２２に当接させる。

【0027】

図１（ｃ）に示すように、ニードルチップ４３の先端４３ａからウェル３１の底面までの距離をＬ、フィッティングリング１０の他方の端面１３である外周リング面１３ｂからニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離をＬ１、ウェル３１の深さをＬ３、スペーサ２０の厚さをＬ２とすると、Ｌ＝Ｌ３＋Ｌ２−Ｌ１となる。
すなわち、ウェル３１の深さＬ３、スペーサ２０の厚さＬ２が一定のもとで、他方の端面１３である外周リング面１３ｂからニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌ１によって、ウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌを一定に保つことができる。また、他方の端面１３である外周リング面１３ｂからニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌ１を変更することで、ウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌを変更でき、分注量を変更できる。
以上のように、本実施例によれば、外周リング面１３ｂによってウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌを常に一定に保つことができるとともに、突出部１３ｃによってニードルチップ４３からの分注位置をウェル３１の中央に維持できる。
図２は、同試料分注装置のフィッティングリングを示す写真である。

【0028】

図３は、図１で説明したマイクロプレートを示している。
図３（ａ）は同マイクロプレートの平面図、図３（ｂ）は同マイクロプレートを示す写真である。
マイクロプレート３０は、１ｍｍ厚の基板３２に、ＳＢＳ（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）標準仕様サイズの９６個のシート貫通孔３５を設けた両面粘着性の厚さ約１４０μｍのプラスチックシート３３と粘着剤層保護シート３４を貼り付けている。
プラスチックシート３３の一方向であるＸ軸方向の幅は、基板３２のＸ軸方向の幅よりも広く、プラスチックシート３３には、基板３２よりも外方の位置にプレート固定孔３３ａを形成している。プレート固定孔３３ａを形成している基板３２よりも外方の部分は、分注作業終了後、プラスチックシート３３に施されたY軸方向のミシン目から切り離す事で、ＳＢＳ標準仕様サイズとなる。
基板３２にプラスチックシート３３を貼り付けることで、シート貫通孔３５によってウェル３１が形成される。
マイクロプレート３０には、Ｘ軸方向に８個、Ｘ軸方向と直交するＹ軸方向に１２個のウェル３１が格子状に配列される。

【0029】

図４は、図１で説明したスペーサを示している。
図４（ａ）は同スペーサの平面図、図４（ｂ）は同スペーサの側面断面図である。
スペーサ２０の一端には、Ｘ軸方向に８個、Ｙ軸方向に３個のスペーサ貫通孔２１を形成し、スペーサ２０の他端には、スペーサ固定用ねじ孔２３を形成している。
スペーサ貫通孔２１の周囲領域がスペーサ表面２２を構成している。
なお、Ｘ軸方向にａ個、Ｘ軸方向と直交するＹ軸方向にｂ個のウェル３１が格子状に配列されたマイクロプレート３０に対応して、スペーサ２０には、Ｘ軸方向にａ個、Ｙ軸方向にｂ／ｎ個（ただし、ｎは１以上でｂの約数）のスペーサ貫通孔２１を形成する。

【0030】

図５から図１６を用いて第２の実施例による試料分注装置と、この試料分注装置を用いた試料分注方法について説明する。
図５は同試料分注装置を構成する基台とガイドバーを示している。
図５（ａ）は同基台の側面断面図、図５（ｂ）は同基台の平面図、図５（ｃ）は同ガイドバーの平面図、図５（ｄ）は同ガイドバーの側面図である。
図５（ａ）及び図５（ｂ）に示すように、基台５０には、基板３２を載置する載置部５１、プレート固定孔３３ａとともにプラスチックシート３３を固定する固定ピン５２、及びスペーサ固定用ねじ孔２３とともにスペーサ２０を固定する固定用ねじ孔５３を形成している。
載置部５１は、凹部又は開口によって形成される。載置部５１のＸ軸方向の幅は、基板３２のＸ軸方向の幅よりも若干広く、載置部５１のＹ軸方向の幅は、基板３２のＹ軸方向の幅よりも若干広く形成している。
載置部５１のＹ軸方向の両端には、基板３２の装脱着時に用いる拡大部５１ａが形成されている。
固定ピン５２は、載置部５１より外方で、載置部５１のＸ軸方向の両端に形成されている。
固定用ねじ孔５３は、載置部５１より外方で、載置部５１のＹ軸方向の一端に形成されている。
載置部５１は、基台５０のＹ軸方向の一端に、固定用ねじ孔５３は、基台５０のＹ軸方向の他端に配置している。
固定用ねじ孔５３は、Ｙ軸方向に複数段形成し、それぞれの段の間隔は、スペーサ２０のＹ軸方向に形成したスペーサ貫通孔２１の個数に対応している。図５では、載置部５１に近い方から順に、固定用ねじ孔５３ａ、５３ｂ、５３ｃ、５３ｄを４段形成している。
図５（ｃ）及び図５（ｄ）に示すように、ガイドバー６０には、ガイド固定孔６１を形成している。ガイド固定孔６１は、基台５０の固定ピン５２に対応して形成している。

【0031】

図６は図５（ａ）及び（ｂ）に示す基台に図３に示すマイクロプレートを装着した状態の平面図、図７は図６に示す状態に更に図５（ｃ）及び（ｄ）に示すガイドバーを装着した状態を示す平面図、図８は図７に示す状態に更に図４に示すスペーサを装着した状態を示す平面図である。
図６では、基台５０にマイクロプレート３０を装着した状態を示している。
図６に示すように、基板３２を載置部５１に載置する。プラスチックシート３３に形成されたプレート固定孔３３ａに、基台５０に形成された固定ピン５２を挿入する。固定ピン５２によりプラスチックシート３３は基台５０に固定される。

【0032】

図７では、更に、基台５０にガイドバー６０を装着した状態を示している。
図７に示すように、一対のガイドバー６０を基板３２の両側に載置する。一対のガイドバー６０に形成されたガイド固定孔６１は、基台５０に形成された固定ピン５２の位置に配置される。なお、一部のガイド固定孔６１は、プレート固定孔３３ａに対応している。

【0033】

図８では、更に、基台５０にスペーサ２０を装着した状態を示している。
図８に示すように、一対のガイドバー６０の間に、スペーサ２０を載置する。スペーサ２０に形成されたスペーサ固定用ねじ孔２３は、基台５０に形成された固定用ねじ孔５３ａの位置に配置される。
マイクロプレート３０に載置したスペーサ２０は、一対のガイドバー６０によって、Ｘ軸方向の移動を規制され、Ｙ軸方向に摺動可能となる。
この状態で、スペーサ固定用ねじ孔２３及び固定用ねじ孔５３ａをねじ止めすることで、スペーサ２０を基台５０に装着する。
図８に示す状態でマイクロプレート３０に形成したそれぞれのウェル３１に、マイクロシリンジ４０を用いて試料を注入することができる。

【0034】

図８に示す状態で第１の注入ステップを行う。
注入ステップでは、スペーサ貫通孔２１によって開口したＸ軸方向にａ個、Ｙ軸方向にｂ／ｎ個のウェル３１に試料を注入する。
本実施例では、ａ＝８、ｂ＝１２、ｎ＝４である。
図８に示す第１の注入ステップでは、スペーサ貫通孔２１によって開口したＸ軸方向に８個、Ｙ軸方向に３個のウェル３１に試料を注入する。
すなわち、マイクロプレート３０の一端を１列目のウェル３１とした場合に、Ｙ軸方向に３列目までのウェル３１に試料を注入する。なお、脂質メソフェーズ法による結晶化に利用する場合には、試料としてタンパク質−脂質メソフェーズ試料が用いられ、この試料の注入の後に、結晶化溶液が注入される。以下の注入ステップにおいても同様である。

【0035】

図８に示す第１の注入ステップの後に、第１のスペーサ移動ステップを行う。
図９は、第１のスペーサ移動ステップを行った状態を示している。
スペーサ移動ステップでは、スペーサ固定用ねじ孔２３及び固定用ねじ孔５３ａからねじを取り外し、スペーサ２０をＹ軸方向にｂ／ｎ個のウェル３１の距離だけ、すなわち３列分のウェル３１だけ移動させる。
第１のスペーサ移動ステップによってスペーサ２０を移動した後に、スペーサ固定用ねじ孔２３及び固定用ねじ孔５３ｂをねじ止めすることで、スペーサ２０を基台５０に装着する。
図９に示すように、第１のスペーサ移動ステップによって、スペーサ２０は、Ｙ軸方向に３列分のウェル３１の距離だけ移動する。従って、スペーサ２０は、試料が注入された１列目から３列目までのウェル３１上から除かれる。なお、脂質メソフェーズ法による結晶化に利用する場合には、注入ステップに代えてこの段階で結晶化溶液を分注することもできる。以下のステップにおいても同様である。

【0036】

図９に示す第１のスペーサ移動ステップの後に、図１０に示す第１のカバーステップを行う。
図１０に示すように、試料が注入された１列目から３列目までのウェル３１上の粘着剤層保護シート３４を取り去り、１列目から３列目までのウェル３１に、カバープレート７１を載置する。
第１のカバーステップの後に、第２の注入ステップを行う。
図１０に示すように、スペーサ貫通孔２１は、マイクロプレート３０の４列目から６列目までのウェル３１に位置している。
従って、第２の注入ステップでは、マイクロプレート３０の４列目から６列目までのウェル３１に試料を注入する。

【0037】

図１０に示す第２の注入ステップの後に、第２のスペーサ移動ステップを行う。
図１１は、第２のスペーサ移動ステップを行った状態を示している。
第２のスペーサ移動ステップでは、スペーサ固定用ねじ孔２３及び固定用ねじ孔５３ｂからねじを取り外し、スペーサ２０をＹ軸方向に更にｂ／ｎ個のウェル３１の距離だけ、すなわち更に３列分のウェル３１だけ移動させる。
第２のスペーサ移動ステップによってスペーサ２０を移動した後に、スペーサ固定用ねじ孔２３及び固定用ねじ孔５３ｃをねじ止めすることで、スペーサ２０を基台５０に装着する。
図１１に示すように、第２のスペーサ移動ステップによって、スペーサ２０は、Ｙ軸方向に更に３列分のウェル３１の距離だけ移動する。従って、スペーサ２０は、試料が注入された４列目から６列目までのウェル３１上から除かれる。

【0038】

図１１に示す第２のスペーサ移動ステップの後に、図１２に示す第２のカバーステップを行う。
図１２に示すように、試料が注入された４列目から６列目までのウェル３１上の粘着剤層保護シート３４を取り去り、４列目から６列目までのウェル３１に、カバープレート７２を載置する。
第２のカバーステップの後に、第３の注入ステップを行う。
図１２に示すように、スペーサ貫通孔２１は、マイクロプレート３０の７列目から９列目までのウェル３１に位置している。
従って、第３の注入ステップでは、マイクロプレート３０の７列目から９列目までのウェル３１に試料を注入する。

【0039】

図１２に示す第３の注入ステップの後に、第３のスペーサ移動ステップを行う。
図１３は、第３のスペーサ移動ステップを行った状態を示している。
第３のスペーサ移動ステップでは、スペーサ固定用ねじ孔２３及び固定用ねじ孔５３ｃからねじを取り外し、スペーサ２０をＹ軸方向に更にｂ／ｎ個のウェル３１の距離だけ、すなわち更に３列分のウェル３１だけ移動させる。
第３のスペーサ移動ステップによってスペーサ２０を移動した後に、スペーサ固定用ねじ孔２３及び固定用ねじ孔５３ｄをねじ止めすることで、スペーサ２０を基台５０に装着する。
図１３に示すように、第３のスペーサ移動ステップによって、スペーサ２０は、Ｙ軸方向に更に３列分のウェル３１の距離だけ移動する。従って、スペーサ２０は、試料が注入された７列目から９列目までのウェル３１上から除かれる。

【0040】

図１３に示す第３のスペーサ移動ステップの後に、図１４に示す第３のカバーステップを行う。
図１４に示すように、試料が注入された７列目から９列目までのウェル３１上の粘着剤層保護シート３４を取り去り、７列目から９列目までのウェル３１に、カバープレート７３を載置する。
第３のカバーステップの後に、第４の注入ステップを行う。
図１４に示すように、スペーサ貫通孔２１は、マイクロプレート３０の１０列目から１２列目までのウェル３１に位置している。
従って、第４の注入ステップでは、マイクロプレート３０の１０列目から１２列目までのウェル３１に試料を注入する。

【0041】

図１４に示す第４の注入ステップの後に、第４のスペーサ移動ステップを行う。
図１５は、第４のスペーサ移動ステップを行った状態を示している。
第４のスペーサ移動ステップでは、スペーサ固定用ねじ孔２３及び固定用ねじ孔５３ｄからねじを取り外し、スペーサ２０をＹ軸方向に更にｂ／ｎ個のウェル３１の距離だけ、すなわち更に３列分のウェル３１だけ移動させる。
図１５に示すように、第４のスペーサ移動ステップによって、スペーサ２０は、Ｙ軸方向に更に３列分のウェル３１の距離だけ移動する。従って、スペーサ２０は、試料が注入された１０列目から１２列目までのウェル３１上から除かれる。

【0042】

図１５に示す第４のスペーサ移動ステップの後に、図１６に示す第４のカバーステップを行う。
図１６に示すように、試料が注入された１０列目から１２列目までのウェル３１上の粘着剤層保護シート３４を取り去り、１０列目から１２列目までのウェル３１に、カバープレート７４を載置する。

【0043】

以上のように、注入ステップからカバーステップをｎ回繰り返すことで、一つのマイクロプレート３０に対して、ウェル３１への分注作業を分けて行え、ウェル３１内に注入した試料の乾燥を防止できる。

【0044】

図１７及び図１８を用いて本発明の第３の実施例による試料分注装置を説明する。
図１７（ａ）は同試料分注装置を構成するフィッティングリングの断面図、図１７（ｂ）は同フィッティングリングの底面図である。なお、第１の実施例と同一部材には同一符号を付して説明を省略し、第１の実施例と異なる点を説明する。
本実施例によるフィッティングリング１０では、第２空洞部１４を、小径空洞部１４ａと大径空洞部１４ｂとで構成し、他方の端面１３は、大径空洞部１４ｂによって形成される。
また、大径空洞部１４ｂは、小径空洞部１４ａから他方の端面１３に向かって径を漸次拡大させている。
また、ニードルチップ４３の先端４３ａは、他方の端面１３から突出させている。
また、フィッティングリング１０には、他方の端面１３から、ニードルチップ４３と平行な一対のスリット１３ｄを設けている。

【0045】

図１８は同試料分注装置の使用状態を示す要部断面図である。
図１８に示すように、フィッティングリング１０の端部をスペーサ貫通孔２１に挿入し、フィッティングリング１０の他方の端面１３を、マイクロプレート３０のプレート表面３６に当接させる。
ニードルチップ４３の先端４３ａからウェル３１の底面までの距離をＬ、フィッティングリング１０の他方の端面１３からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離をＬ１、ウェル３１の深さをＬ３とすると、Ｌ＝Ｌ３−Ｌ１となる。
すなわち、ウェル３１の深さＬ３が一定のもとで、他方の端面１３からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌ１によって、ウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌを一定に保つことができる。また、他方の端面１３からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌ１を変更することで、ウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌを変更でき、分注量を変更できる。また、ウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌを分注量に対応した値に設定できる。

【0046】

以上のように、本実施例によれば、他方の端面１３によってウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌを常に一定に保つことができるとともに、フィッティングリング１０の端部をスペーサ貫通孔２１に挿入することによってニードルチップ４３からの分注位置をウェル３１の中央に維持できる。
また、本実施例によれば、大径空洞部１４ｂによって他方の端面１３を構成することで、ウェル３１内に注入した試料がフィッティングリング１０に触れることを防止でき、ウェル３１内に注入した試料の減少とコンタミを防止できる。
また、本実施例によれば、大径空洞部１４ｂを、小径空洞部１４ａから他方の端面１３に向かって径を漸次拡大させることで、加工を容易にでき、他方の端面１３の面積を小さくできる。
また、本実施例によれば、ニードルチップ４３の先端４３ａを、他方の端面１３から突出させることで、フィッティングリング１０をウェル３１に近づけることなく、ニードルチップ４３の先端４３ａをウェル３１の底面に近づけることができる。
また、本実施例によれば、他方の端面１３に一対のスリット１３ｄを設けているので、このスリット１３ｄによりニードルチップ４３の状態観察、ニードルチップ４３の汚染のクリーニング、フィッティングリング１０の他方の端面（底面）１３からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌの計測を可能としている。また、治具に一対のスリット１３ｄをはめ込むことで、フィッティングリング１０の回転を阻止できるため、フィッティングリング１０に触れることなく、シリンジ本体４１又はリムーバブルニードル基部４２を第１空洞部１２に挿入でき、又はリムーバブルニードル基部４２を装着したフィッティングリング１０をシリンジ本体４１に取り付けることができる。
なお、第３の実施例で説明したフィッティングリング１０は、第２の実施例による試料分注装置に適用することができる。

【0047】

図１９を用いて本発明の第４の実施例による試料分注装置を説明する。
図１９（ａ）は同試料分注装置を構成するフィッティングリングの断面図、図１９（ｂ）は同フィッティングリングの底面図である。なお、第３の実施例と同一部材には同一符号を付して説明を省略し、第３の実施例と異なる点を説明する。
本実施例によるフィッティングリング１０では、ニードルチップ４３の先端４３ａを、第２空洞部１４の内部に配置している。なお、ニードルチップ４３の先端４３ａは、大径空洞部１４ｂに配置することが好ましい。
本実施例によれば、ニードルチップ４３の先端４３ａが第２空洞部１４の内部に隠れているため、ニードルチップ４３にものが触れることがなく、ニードルチップ４３を保護することができる。
また、本実施例によれば、ニードルチップ４３の先端４３ａを大径空洞部１４ｂに配置することで、ウェル３１内に注入した試料がフィッティングリング１０に触れることを防止でき、ウェル３１内に注入した試料の減少とコンタミを防止できる。
なお、第４の実施例で説明したフィッティングリング１０は、第２の実施例による試料分注装置に適用することができる。

【0048】

図２０を用いて本発明の第５の実施例による試料分注装置を説明する。
図２０（ａ）は同試料分注装置を構成するフィッティングリングの断面図、図２０（ｂ）は同試料分注装置の使用状態を示す要部断面図である。なお、第１の実施例と同一部材には同一符号を付して説明を省略し、第１の実施例と異なる点を説明する。
本実施例によるフィッティングリング１０では、第２空洞部１４を、小径空洞部１４ａと大径空洞部１４ｂとで構成し、他方の端面１３は、大径空洞部１４ｂによって形成される。
また、大径空洞部１４ｂは、小径空洞部１４ａから他方の端面１３に向かって径を漸次拡大させている。
また、ニードルチップ４３の先端４３ａは、第２空洞部１４の内部、すなわち、小径空洞部１４ａに配置している。
また、フィッティングリング１０には、他方の端面１３から、ニードルチップ４３と平行な一対のスリット１３ｄを設けている。
図２０（ｂ）に示すように、本実施例ではスペーサ２０を用いない。
フィッティングリング１０の端部をウェル３１に挿入し、フィッティングリング１０の他方の端面１３を、ウェル３１の底面の外周部に当接させる。
ニードルチップ４３の先端４３ａからウェル３１の底面までの距離をＬ、フィッティングリング１０の他方の端面１３からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離をＬ１とすると、Ｌ＝Ｌ１となる。
すなわち、他方の端面１３からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌ１によって、ウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌを一定に保つことができる。また、他方の端面１３からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌ１を変更することで、ウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌを変更でき、分注量を変更できる。

【0049】

以上のように、本実施例によれば、他方の端面１３によってウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌを常に一定に保つことができるとともに、フィッティングリング１０の端部をウェル３１に挿入することによってニードルチップ４３からの分注位置をウェル３１の中央に維持できる。
また、本実施例によれば、大径空洞部１４ｂによって他方の端面１３を構成することで、ウェル３１内に注入した試料がフィッティングリング１０に触れることを防止でき、ウェル３１内に注入した試料の減少とコンタミを防止できる。
また、本実施例によれば、大径空洞部１４ｂを、小径空洞部１４ａから他方の端面１３に向かって径を漸次拡大させることで、加工を容易にでき、他方の端面１３の面積を小さくできる。
また、本実施例によれば、他方の端面１３に一対のスリット１３ｄを設けているので、このスリット１３ｄによりニードルチップ４３の状態観察、ニードルチップ４３の汚染のクリーニング、フィッティングリング１０の他方の端面（底面）１３からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌの計測を可能としている。また、治具に一対のスリット１３ｄをはめ込むことで、フィッティングリング１０の回転を阻止できるため、フィッティングリング１０に触れることなく、シリンジ本体４１又はリムーバブルニードル基部４２を第１空洞部１２に挿入でき、又はリムーバブルニードル基部４２を装着したフィッティングリング１０をシリンジ本体４１に取り付けることができる。
なお、第５の実施例で説明したフィッティングリング１０は、第２の実施例による試料分注装置に適用することができる。
なお、第５の実施例において、スリット１３ｄを省略することもできる。

【0050】

図２１を用いて本発明の第６の実施例による試料分注装置を説明する。
図２１（ａ）は同試料分注装置を構成するフィッティングリングの断面図、図２１（ｂ）は同試料分注装置の使用状態を示す要部断面図である。なお、第５の実施例と同一部材には同一符号を付して説明を省略し、第５の実施例と異なる点を説明する。
本実施例によるフィッティングリング１０では、大径空洞部１４ｂを円柱状に形成している。
また、本実施例によれば、円柱状に大径空洞部１４ｂを形成することで、第５の実施例と比較して、大径空洞部１４ｂの空間を大きくでき、ウェル３１内に注入した試料がフィッティングリング１０に触れることを防止でき、ウェル３１内に注入した試料の減少とコンタミを防止できる。

【0051】

図２２を用いて本発明の第７の実施例による試料分注装置を説明する。
図２２（ａ）は同試料分注装置を構成するフィッティングリングの断面図、図２２（ｂ）は同試料分注装置の使用状態を示す要部断面図である。なお、第６の実施例と同一部材には同一符号を付して説明を省略し、第６の実施例と異なる点を説明する。
本実施例によるフィッティングリング１０では、第１空洞部１２に、マイクロシリンジ４０のシリンジ本体４１を挿入することで、シリンジ本体４１に装着されるニードルチップ４３を第２空洞部１４に配置している。
本実施例によれば、ニードルチップ４３を交換しない固定針型のマイクロシリンジ４０に用いることができる。
なお、フィッティングリング１０は、第１空洞部１２にシリンジ本体４１があらかじめ挿入固着されたものでもよいし、シリンジ本体４１が一体に形成されたものでもよい。

【0052】

第１の実施例から第７の実施例による試料分注装置において、他方の端面１３からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌ１が異なる複数種類のフィッティングリング１０をセットとして備えることが好ましい。このように、他方の端面１３からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌ１が異なる複数種類のフィッティングリング１０を使い分けることで、分注量を任意に変更することができる。
また、第１の実施例から第４の実施例による試料分注装置では、厚さの異なる複数種類のスペーサ２０をセットとして備えることもできる。このように厚さの異なるスペーサ２０を使い分けることで、分注量を任意に変更することができる。

【0053】

上記実施例で用いる試料は、粘稠な試料の場合に特に効果が高い。粘稠な試料としては、例えば膜タンパク質を含有する脂質メソフェーズがある。この試料は、膜タンパク質を含む水溶液を、マトリクス脂質、又はマトリクス脂質及び適切な水溶液を前もって混合して得た脂質メソフェーズに混合して調製される。本実施例では、脂質メソフェーズは、脂質／水溶液混合系に現れる固体と液体との中間的な性質を持つ物質あるいは状態を意味する。脂質メソフェーズは、具体的には、脂質二重膜が三次元連続構造を持つ「キュービック液晶」、ならびに脂質二重膜が一方向にスタックした構造を持つ「ラメラ液晶」および「キュービック液晶」の長距離秩序が失われた「スポンジ相」等の脂質二重膜を構成単位とする。
また、一つのウェル３１に注入する試料のボリュームは、３００ｎｌ以下において効果があり、２０〜１００ｎｌでは特に効果が顕著である。
一つのウェル３１に注入する試料のボリュームに対応した、ウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの最適距離があるので、ウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離は、５０μｍ〜４００μｍ、好ましくは１００μｍ〜２００μｍとすることによって、一つのウェル３１に注入する試料のボリュームを１０〜３００ｎｌ好ましくは、２０〜１００ｎｌの範囲で変更することができる。
本実施例によれば、粘稠な試料であっても、ウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離を５０μｍ〜４００μｍ、好ましくは１００μｍ〜２００μｍとすることができ、一定の分注量を再現できる。
なお、本実施例では、基板３２にプラスチックシート３３を貼り付けたマイクロプレート３０を用いて説明したが、これに限られるものではなく、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどの材質でウェル３１が成形された一般的なマイクロプレート３０でも適用できる。

【0054】

図２３（ａ）は第１の実施例による試料分注装置を用いて、５０ｎｌを２０回分注した場合の実際に分注されたボリュームを示すデータ、図２３（ｂ）は比較例としての自動分注装置を用いて５０ｎｌの分注を行った場合のデータ、図２３（ｃ）は第１の実施例によるウェル内の状態を示す写真である。
マイクロシリンジ４０として、イトーシリンジ（伊藤製作所製 型式ＭＳ−ＧＦＮ５０）を用い、ニードルチップ４３の先端４３ａを９０度にカットした２４ゲージのリムーバブルニードル基部４２を用いた。
ウェル３１の底面からニードルチップ４３の先端４３ａまでの距離Ｌを１３５μｍとして分注を行った。
図２３（ａ）に示すように、２０回分注の平均ボリュームＶは５０．４ｎｌ、標準偏差σは４．８ｎｌとなった。
図２３（ｂ）に、自動分注装置を用いた場合のデータを比較例として示すが、自動分注装置を用いた場合でも、平均ボリュームＶは４７．８ｎｌ、標準偏差σは４．５ｎｌであり、本実施例による試料分注装置でも遜色無い結果となっている。
また、図２３（ｃ）に示すように、常に一定の形（円柱形）で分注される。

【0055】

図２４（ａ）は第１の実施例による試料分注装置を用いてウェルに注入された試料を撮影した写真、図２４（ｂ）は図２４（ａ）で撮影した写真からウェル内での試料の位置及び大きさを模式的に現した説明図、図２４（ｃ）は分注位置の実験結果を示すデータである。
図２４（ａ）に示すように、脂質メソフェーズ円筒の外形線Ｃａを基に脂質メソフェーズの中心Ｃｂの位置を特定し、ウェル３１の外形線Ｃｃから求めたウェル３１の中心Ｃｄから脂質メソフェーズの中心Ｃｂまでの距離（ずれ）ｒを計測した（図２４（ｂ））。これらの計測は、写真の画像解析によって行った。ただしウェル３１は半径２５００μｍ、脂質メソフェーズの平均ボリュームＶは５０．４ｎｌとしている。
図２４（ｃ）では、２０回連続分注した脂質メソフェーズ円筒の中心Ｃｂとウェル３１の中心Ｃｄとのずれｒを示している。
脂質メソフェーズ円筒の中心Ｃｂとウェル３１の中心Ｃｄとのずれｒの平均値は８４μｍ、標準偏差は３２μｍであった。また、２０回分注中でのｒの最大値は１４０μｍであった。
この実験結果から、試料の分注位置のウェル中心Ｃｄからのずれｒは、ウェル３１の半径２５００μｍに対し、平均で３％、最大でも５．６％であり、脂質メソフェーズ法において十分な分注位置精度であった。
このように分注位置をウェル３１の中心から一定の範囲に維持でき、試料がウェル３１のエッジに触れることがほんどない。
図２３及び図２４で示すように、本実施例による手動分注装置及び方法は、特に脂質メソフェーズ法による結晶化に適している。

【産業上の利用可能性】

【0056】

本発明は、特に膜タンパク質の結晶化に利用される試料分注装置及びその方法に適しており、本発明によれば、膜タンパク質を含有する脂質メソフェーズのような粘稠な試料を、２００ｎｌ以下、特に１００ｎｌ以下のボリュームでも、定量で同一形態で再現性良く、ウェルに分注することができる。

【符号の説明】

【0057】

１０ フィッティングリング
１１ 一方の端面
１２ 第１空洞部
１３ 他方の端面
１３ａ 内周リング面
１３ｂ 外周リング面
１３ｃ 突出部
１３ｄ スリット
１４ 第２空洞部
２０ スペーサ
２１ スペーサ貫通孔
２２ スペーサ表面
２３ スペーサ固定用ねじ孔
３０ マイクロプレート
３１ ウェル
３２ 基板
３３ プラスチックシート
３３ａ プレート固定孔
３４ 粘着剤層保護シート
３５ シート貫通孔
４０ マイクロシリンジ
４１ シリンジ本体
４２ リムーバブルニードル基部
４３ ニードルチップ
４３ａ 先端
５０ 基台
５１ 載置部
５１ａ 拡大部
５２ 固定ピン
５３ 固定用ねじ孔
５３ａ 固定用ねじ孔
５３ｂ 固定用ねじ孔
５３ｃ 固定用ねじ孔
５３ｄ 固定用ねじ孔
６０ ガイドバー
６１ ガイド固定孔

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】