特許 6360074 マンノース受容体選択的リシニル化カチオン性両親媒性物質及びその調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6360074

(24)【登録日】2018年6月29日

(45)【発行日】2018年7月18日

(54)【発明の名称】マンノース受容体選択的リシニル化カチオン性両親媒性物質及びその調製方法

(51)【国際特許分類】

   C07C 279/14 20060101AFI20180709BHJP

   C07C 277/08 20060101ALI20180709BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20180709BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20180709BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20180709BHJP

   C07H 21/00 20060101ALI20180709BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20180709BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20180709BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20180709BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20180709BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20180709BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20180709BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20180709BHJP

【ＦＩ】

   C07C279/14CSP

   C07C277/08

   A61K47/28

   A61K47/24

   A61K45/00

   C07H21/00

   A61K31/7088

   A61K31/7105

   A61K31/711

   A61K31/713

   A61P37/02

   A61P37/04

   A61K48/00

【請求項の数】19

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2015-551256(P2015-551256)

(86)(22)【出願日】2013年12月27日

(65)【公表番号】特表2016-511228(P2016-511228A)

(43)【公表日】2016年4月14日

(86)【国際出願番号】IN2013000806

(87)【国際公開番号】WO2014106856

(87)【国際公開日】20140710

【審査請求日】2016年11月29日

(31)【優先権主張番号】0017/DEL/2013

(32)【優先日】2013年1月3日

(33)【優先権主張国】IN

(73)【特許権者】

【識別番号】596020691

【氏名又は名称】カウンスィル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ

【氏名又は名称原語表記】ＣＯＵＮＣＩＬ ＯＦ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＆ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ

(74)【代理人】

【識別番号】110002022

【氏名又は名称】特許業務法人コスモ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ガル アルプ

(72)【発明者】

【氏名】モク ゴーピクリシュナ

(72)【発明者】

【氏名】アガワン サチン バラード

(72)【発明者】

【氏名】チョウドリー アラビンダ

【審査官】 早川 裕之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５２０９６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５２９９１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０３５５５７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Biomaterials，２０１２年，３３，６２２０−６２２９

【文献】 J. Med. Chem.，２００５年，４８，８１２−８２０

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ ２７９／１４

Ｃ０７Ｃ ２７７／０８

Ａ６１Ｋ ３１／７０８８〜７１３

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ４７／２４〜２８

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ３７／０２〜０４

Ｃ０７Ｈ ２１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記化学式（１）で表されるカチオン性両親媒性化合物であって、

式中、Ｒは、下記化学式（２）で表されるシキモイル又は下記化学式（３）で表されるキノシルであり、

Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立して水素又は親油部分であり、Ｒ^１及びＲ^２は同時に水素ではなく、
Ｒ^３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５アルキルであり、
Ｘは任意で塩素又は臭素から選択され、
前記親油部分はＣ８〜２４アルキル、モノ−、ジ−及びトリ不飽和アルケニルから成る群から選択される、カチオン性両親媒性化合物。

【請求項2】

下記化学式（４）で表されるＣ_４９Ｈ_９８Ｎ_６Ｏ_５

又は、下記化学式（５）で表されるＣ_４９Ｈ_１００Ｎ_６Ｏ_６

である請求項１に記載のカチオン性両親媒性化合物。

【請求項3】

ＤＮＡワクチンのインビボ送達に使用されるものである請求項１に記載のカチオン性両親媒性化合物。

【請求項4】

下記化学式（１）で表される化合物の調製方法であって、

（式中、Ｒは、下記化学式（２）で表されるシキモイル又は下記化学式（３）で表されるキノシルであり、

Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立して水素又は親油部分であり、Ｒ^１及びＲ^２は同時に水素ではなく、
Ｒ^３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５アルキルであり、
Ｘは任意で塩素又は臭素から選択され、
前記親油部分はＣ８〜２４アルキル、モノ−、ジ−及びトリ不飽和アルケニルから成る群から選択される）
（ａ）下記化学式IIの化合物をＬ−リシン誘導体と極性非プロトン性溶媒中で結合させることで下記化学式IIIの化合物を得て、続く酸脱保護により下記化学式IVの化合物を得
るステップと、

（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた化学式IVの化合物をシキミ酸又はキナ酸と結合させることで下記化学式Ｖの化合物を得るステップと、

（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた化学式Ｖの化合物を脱保護することで下記化学式VIの化合物を得て、続く非プロトン性溶媒中での前記化学式VIの化合物をグアニジニル化して化学式VIIの化合物を得るステップと、

（ｄ）前記ステップ（ｃ）で得られた化学式VIIの化合物をヨウ化メチルで四級化する
ことで下記化学式VIIIの化合物を得て、続く極性プロトン性溶媒中での塩基媒介脱保護により下記化学式IXの化合物を得て、最後の抽出及びイオン交換により下記化学式Ｉの化合物を得るステップと、を含み、

式中、Ｒ及びＲ’が、下記化学式（２）で表されるシキモイル又は下記化学式（３）で表されるキノシルである調製方法。

【請求項5】

前記化学式IIの化合物が８〜２４個の炭素原子を有する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ステップ（ａ）及びステップ（ｃ）の前記極性非プロトン性溶媒が、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン及びトリエチルアミンから成る群から選択される、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記塩基が、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメトキシド及びカリウムメトキシドから成る群から選択される、請求項４に記載の方法。

【請求項8】

ステップ（ｄ）における塩基媒介脱保護用の前記極性プロトン性溶媒が、メタノール、エタノール及び水とメタノールとの混合物から成る群から選択される、請求項４に記載の方法。

【請求項9】

請求項１に記載のカチオン性両親媒性化合物、共脂質及びポリアニオン性化合物を生理学的に許容可能な添加剤と共に含む製剤。

【請求項10】

ヘルパー脂質をさらに含み、前記ヘルパー脂質がコレステロール、ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｉｎｅ）及びホスファチジルグリセロールから成る群から選択される、請求項９に記載の製剤。

【請求項11】

前記共脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルホスホコリン、中性ホスファチジルエタノールアミン、中性ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、コレステロール及び１，２−ｓｙｎ−ジオレオイル−グリセロールホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から成る群から選択される、請求項９に記載の製剤。

【請求項12】

前記カチオン性両親媒性化合物の前記共脂質に対するモル比が１：１〜３：１である、請求項９に記載の製剤。

【請求項13】

前記ポリアニオン性化合物が、核酸、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド及び薬剤から成る群から選択される、請求項９に記載の製剤。

【請求項14】

前記核酸が、プラスミド、リボ核酸、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡのポリヌクレオチドから成る群から選択される、請求項１３に記載の製剤。

【請求項15】

皮膚、皮下、皮内、経鼻、静脈内、筋肉内、腹腔内及び肺経路で投与される、請求項９に記載の製剤。

【請求項16】

２５〜１００マイクロリットルの範囲で細胞内投与される、請求項９に記載の製剤。

【請求項17】

５００００個の細胞に対して０．１〜０．５マイクログラムのＤＮＡの比で細胞に投与される、請求項９に記載の製剤。

【請求項18】

前記カチオン性両親媒性化合物の範囲が９．０〜０．３マイクログラムであり、脂質対ＤＮＡ比が０．３：１〜９：１である、請求項９に記載の製剤。

【請求項19】

免疫応答を方法において生じさせる方法であって、免疫原をコードするポリヌクレオチドと共に請求項９に記載の製剤を少なくとも１匹のマウスに投与することで少なくとも１匹の免疫化マウスを生み出すことを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子免疫化（ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）に有用なマンノース受容体選択的リシニル化（ｌｙｓｉｎｙｌａｔｅｄ）カチオン性両親媒性物質に関する。本発明は特には、グアニジン、そしてマンノース模倣シキモイル（ｓｈｉｋｉｍｏｙｌ）、キノイル（ｑｕｉｎｏｙｌ）及びマンノシル頭部基の両方を有する新規なリシニル化カチオン性両親媒性物質系列に関する。本発明はさらに、マンノース受容体選択的リシニル化カチオン性両親媒性物質の調製方法に関する。本発明は、遺伝子免疫化において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対してＤＮＡワクチンをターゲティング可能なカチオン性両親媒性物質のリポソーム製剤にも関する。

【背景技術】

【0002】

抗原をコードしているＤＮＡの投与であるＤＮＡワクチン接種が、がん、感染性疾患、アレルギーを含めた多くの複雑な障害を治療するための新たに登場した治療手法として関心を集めつつある（Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００８；４５１：７２５−７２９、Ｒｉｃｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．２００８；８：１０８−１２０）。ＤＮＡワクチンは、体液性及び細胞性の両方の免疫応答を誘起することができ、また同等の弱毒ウイルスより安全かもしれないと考えられている（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１８：９２７−９７４、Ｌｉｕ，Ｍ．Ａ．Ｊ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．２００３；２５３：４０２−４１０）。しかしながら、臨床試験により、ネイキッドＤＮＡの局所注射により誘起される免疫応答は不十分であると明らかになった（Ｒｏｙ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０００；１９：７６４−７７８、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３；１４：７０９−７１４）。研究から、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）のトランスフェクション及び続く活性化は遺伝子免疫化に続く免疫の獲得における重要な事象であると判明している（Ａｋｂａｒｉ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９；１８９：１６９−１７８、Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６０：５７０７−５７１８）。Ｍｏｕｎｔａｉｎ及び共同研究者は、カチオン性ペプチドと腫瘍関連抗原をコードしている遺伝子との複合体をトランスフェクトした単球由来樹状細胞でマウスの免疫化を行うと、マウスがメラノーマ細胞による致死的な攻撃から保護されることを実証した（Ｉｒｖｉｎｅ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００；１８：１２７３−１２７８）。

【0003】

樹状細胞、マクロファージ等の抗原提示細胞は、抗原タンパク質をそのプロテアソーム複合体を介して小さいペプチド断片へとプロセシングする。次に、これらの小ペプチド断片はＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子を介して免疫細胞（ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞）に提示され、その結果として細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及び体液性応答が誘起される（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１；９：２７１−２９６、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ １９９８；３９２：２４５−２５２、Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．Ｃｅｌｌ １９９４；７６：２８７−２９９、Ａｋｂａｒｉ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９；１８９：１６９−１７８、Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６０：５７０７−５７１８、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ １９９８；３９２：２４５−２５２）。しかしながら、抗原提示細胞のトランスフェクションは困難である。カチオン性マイクロパーティクル（Ｈｅｄｌｅｙ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９８；４：３６５−３６８、Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２０００；９７：８１１−８１６）、カチオン性リポソーム（Ｐｅｒｒｉｅ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２００１；１９：３３０１−３３１０）及びカチオン性ペプチド（Ｉｒｖｉｎｅ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０００；１８：１２７３−１２７８）等をエクスビボでのＡＰＣのトランスフェクションに使用することが過去に報告されている。抗原をコードしているＤＮＡをカチオン性リポソームを介して送達することでＡＰＣの直接トランスフェクションを行って免疫応答の効力を上昇させようとの試みがなされてきた（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９７；４０２：１０７−１１０、Ｋｌａｖｉｎｓｋｉｓ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ １９９７；１５：８１８−８２０，Ｐｅｒｒｉｅ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２００１；１９：３３０１−３３１０、Ｈａｔｔｏｒｉ，ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００４；３１７：９９２−９９９）。カチオン性リポソームは、その非毒性で生体適合性である性質から、他のＤＮＡ送達手段より大いに有利である。

【0004】

ＤＮＡワクチン接種の有効性を高めるのに有望なアプローチは、ＡＰＣに対する、マンノース受容体（細胞表面で発現する１８０ｋＤａでマルチドメインの独特な膜貫通受容体）を介したＤＮＡワクチンのターゲティングをベースとしている（Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９５；１８２：３８９−４００）。過去に、Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｒ．らは、マンノース模倣キナ酸及びシキミ酸頭部基を有するカチオン性両親媒性物質がＤＮＡを抗原提示細胞にマンノース受容体を介してターゲティングできることを実証した（Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０；５３：１３８７−１３９１）。同じ研究において、メラノーマ腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ１）をコードしているプラスミドＤＮＡとマンノース模倣キナ酸及びシキミ酸頭部基を有する２種の新規な両親媒性物質のリポソームとの静電複合体（リポプレックス）を事前にトランスフェクトした自家ＤＣでの免疫化により、免疫化した同系のマウスにおいて、致死的なメラノーマ腫瘍による攻撃に対する極めて高い防御免疫が得られることが実証された（Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０；５３：１３８７−１３９１）。より最近では、Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｒ．らは、樹状細胞をベースとした遺伝子免疫化で使用するための、マンノース模倣シキミ酸及びキナ酸頭部基を有するマンノース受容体特異的リシニル化カチオン性両親媒性物質を開発した（Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ。インド国特許出願第２１７０／ＤＥＬ／２０１０号明細書）。しかしながら、樹状細胞をベースとした遺伝子免疫化法では時間がかかり且つ費用効率が悪いステップを数多くたどる。自家樹状細胞（ＤＣ）をレシピエントから苦心して単離する必要がある。次に、単離したＤＣにエクスビボ（生体外）で対象となるＤＮＡワクチンをトランスフェクトする必要があり、最後にエクスビボでトランスフェクションを行ったＤＣをレシピエントの体内に再度移植し直す必要がある。言い換えると、現在行われている、エクスビボでの樹状細胞のトランスフェクションをベースとした遺伝子免疫化手順は労働集約的であり、大きい規模で行うにはおそらくコストが高くなりすぎる。そのため、ＤＮＡを送達するためにエレクトロポレーション技法を用いて、Ｓｔｅｉｎｍａｎ及び共同研究者は、インビボの環境下でＤＣに対してＤＮＡワクチンをターゲティングすることにより遺伝子免疫化の有効性を強化することに成功した。このアプローチは、ＤＣ限定抗原取り込み受容体ＤＥＣ２０５に特異的な抗原タンパク質及び単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）をコードするＤＮＡワクチンの構築をベースとしている（Ｎｃｈｉｎｄａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００８；１１８：１４２７−１４３６、Ｎｃｈｉｎｄａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１０；１０７：４２８１）。しかしながら、抗原タンパク質及びｓｃＦｖの両方をコードするそのようなＤＮＡワクチンの大規模な構築は費用効率が良いものにはなりそうにない。より最近では、Ｈａｓｈｉｄａ及び共同研究者が、遺伝子免疫化におけるＤＣのインビボでの形質導入のための、マンノース受容体選択的及び超音波応答性マンノシル化リポソームの開発を報告した（Ｕｎ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１０；３１：７８１３−７８２６、Ｕｎ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ ２０１１；８：５４３−５５４）。

【0005】

モデルＤＮＡワクチンとしてｐ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ酵素をコード）を使用して、本発明は、ｐ−ＣＭＶ−β−ｇａｌと、グアニジン及びマンノース模倣シキモイル頭部基の両方を有する本明細書に記載のマンノース受容体選択的リシニル化カチオン性両親媒性物質のリポソームとの静電複合体のマウスにおける直接インビボ投与（すなわち、自家ＤＣの単離が不要）が、β−ｇａｌ抗原に対する細胞性及び体液性の両方の免疫応答を引き出すのに極めて効率的であることを開示する。本発明は、グアニジン及びマンノース模倣シキモイル頭部基の両方を有する本明細書に記載のリシニル化カチオン性両親媒性物質の、ヒト悪性メラノーマの大部分で発現する２種のヒトメラニン形成細胞系列特異的抗原であるＧｐ１００及びチロシナーゼをコードしているＤＮＡワクチンを使用した遺伝子免疫化における応用例も開示する（Ｃｏｕｌｉｅ Ｐ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９４；１８０：３５−４２、Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４；９１：３５１５−９、Ｔｏｐａｌｉａｎ Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９４；９１：９４６１−９４６５、Ｂｒｉｃｈａｒｄ Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９３；１７８：４８９−９５）。これらの抗原は、そのマウスカウンターパートとアミノ酸配列同一性をそれぞれ７７％、８２％共有している（Ｚｈａｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ １９９７；２０：１５−２５、Ｃｏｌｅｌｌａ Ａ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０００；１９１：１２２１−１２３１）。本発明は、ＤＮＡワクチンであるｐ−ＣＭＶ−ｇｐ１００及びｐ−ＣＭＶ−チロシナーゼ（それぞれメラノーマ抗原ｇｐ−１００及びチロシナーゼをコード）とグアニジン及びマンノース模倣シキミ酸頭部基の両方を有する本明細書に記載のリシニル化カチオン性両親媒性物質のリポソームとの静電複合体（リポプレックス）での直接インビボ免疫化により、免疫化マウスにおいて、長期間にわたる（腫瘍チャレンジから１００日）抗腫瘍効果が侵襲性メラノーマ腫瘍による攻撃に対して得られることを開示する。本明細書に記載の単純で非ウイルス性のインビボＤＣターゲティング系は、遺伝子免疫化において、長期間にわたる免疫応答の誘起に将来、利用し得る。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】インド国特許出願第２１７０／ＤＥＬ／２０１０号明細書

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００８；４５１：７２５−７２９

【非特許文献2】Ｒｉｃｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．２００８；８：１０８−１２０

【非特許文献3】Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１８：９２７−９７４

【非特許文献4】Ｌｉｕ，Ｍ．Ａ．Ｊ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．２００３；２５３：４０２−４１０

【非特許文献5】Ｒｏｙ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０００；１９：７６４−７７８

【非特許文献6】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３；１４：７０９−７１４

【非特許文献7】Ａｋｂａｒｉ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９；１８９：１６９−１７８

【非特許文献8】Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６０：５７０７−５７１８

【非特許文献9】Ｉｒｖｉｎｅ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００；１８：１２７３−１２７８

【非特許文献10】Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１；９：２７１−２９６

【非特許文献11】Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ １９９８；３９２：２４５−２５２

【非特許文献12】Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．Ｃｅｌｌ １９９４；７６：２８７−２９９

【非特許文献13】Ｈｅｄｌｅｙ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９８；４：３６５−３６８

【非特許文献14】Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２０００；９７：８１１−８１６

【非特許文献15】Ｐｅｒｒｉｅ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２００１；１９：３３０１−３３１０

【非特許文献16】Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９７；４０２：１０７−１１０

【非特許文献17】Ｋｌａｖｉｎｓｋｉｓ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ １９９７；１５：８１８−８２０

【非特許文献18】Ｈａｔｔｏｒｉ，ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００４；３１７：９９２−９９９

【非特許文献19】Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９５；１８２：３８９−４００

【非特許文献20】Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０；５３：１３８７−１３９１

【非特許文献21】Ｎｃｈｉｎｄａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００８；１１８：１４２７−１４３６

【非特許文献22】Ｎｃｈｉｎｄａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１０；１０７：４２８１

【非特許文献23】Ｕｎ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１０；３１：７８１３−７８２６

【特許文献2】Ｕｎ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ ２０１１；８：５４３−５５４

【特許文献3】Ｃｏｕｌｉｅ Ｐ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９４；１８０：３５−４２

【特許文献4】Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４；９１：３５１５−９

【特許文献5】Ｔｏｐａｌｉａｎ Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９４；９１：９４６１-９４６５

【特許文献6】Ｂｒｉｃｈａｒｄ Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９３；１７８：４８９−９５

【特許文献7】Ｚｈａｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ １９９７；２０：１５−２５

【特許文献8】Ｃｏｌｅｌｌａ Ａ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０００；１９１：１２２１−１２３１

【発明の目的】

【0008】

本発明の主な目的は、遺伝子材料を抗原提示細胞に効率的に送達するための、グアニジン、そしてマンノース模倣シキミ酸及びキナ酸頭部基を有する新規なリシニル化カチオン性両親媒性物質並びにその調製方法を提供することである。

【0009】

本発明のさらに別の目的は、本明細書に記載のカチオン性両親媒性物質のリポソームとモデルＤＮＡワクチンとの複合体の細胞取り込みを抗原提示細胞のマンノース受容体が媒介することを示すことである。

【0010】

本発明のさらに別の目的は、マンノース模倣頭部基を有する本明細書に記載のカチオン性両親媒性物質から調製されたリポソームとモデルＤＮＡワクチンとの複合体が、マンノシル頭部基を有する対応するカチオン性両親媒性物質のリポソームから調製されるリポプレックスにより引き出されるものより高い細胞性及び体液性免疫応答を引き出すことを示すことである。

【0011】

本発明のさらに別の目的は、グアニジン及びマンノース模倣シキモイル頭部基を有する本明細書に記載のカチオン性両親媒性物質から調製されるリポソームと、ｇｐ１００及びチロシナーゼメラノーマ抗原をコードしているＤＮＡワクチンとの複合体でのマウスの直接インビボ免疫化が、免疫化マウスにおいて長期間にわたる抗腫瘍（メラノーマ）免疫応答を誘起できることを示すことである。

【発明の概要】

【0012】

したがって、本発明は、カチオン性両親媒性化合物に関し、
式（Ｉ）：

【0013】

【化1】

【0014】

式中、Ｒは、シキモイル、キノシル（ｑｕｉｎｏｓｙｌ）及びマンノシル基：

【0015】

【化2】

【0016】

から成る群から選択され、
Ｒ^１及びＲ^２は独立して水素又は親油部分であり、Ｒ^１及びＲ^２は同時に水素ではなく、
Ｒ^３は独立して水素、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_５ヒドロキシ及びＣ_１〜Ｃ_５アミノであり、
Ｘは任意で塩素又は臭素から選択され、
親油部分はＣ_８〜２４アルキル、モノ−、ジ−及びトリ不飽和アルケニルから成る群から選択される。

【0017】

本発明のある実施形態において、化合物は、
Ｃ_４９Ｈ_９８Ｎ_６Ｏ_５

【0018】

【化3】

【0019】

Ｃ_４９Ｈ_１００Ｎ_６Ｏ_６

【0020】

【化4】

【0021】

Ｃ_５０Ｈ_１０３Ｎ_６Ｏ_８

【0022】

【化5】

【0023】

から成る群から選択される。

【0024】

本発明のさらに別の実施形態において、化合物は、ＤＮＡワクチンのインビボ送達に使用される。

【0025】

本発明のさらに別の実施形態において、式Ｉの化合物の調製方法は、以下の：
（ａ）式ＩＩの化合物をＬ−リシン誘導体と極性非プロトン性溶媒中で結合させることで式ＩＩＩの化合物を得て、続く酸脱保護により式ＩＶの化合物を得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた式ＩＶの化合物をシキミ酸、キナ酸又はマンノースと結合させることで式Ｖの化合物を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた式Ｖの化合物を脱保護することで式ＶＩの化合物を得て、続く非プロトン性溶媒中での式ＶＩの化合物のグアニジニル化により式ＶＩＩの化合物を得るステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた式ＶＩＩの化合物をヨウ化メチルで四級化することで式ＶＩＩＩの化合物を得て、続く極性プロトン性溶媒中での塩基媒介脱保護により式ＩＸの化合物を得て、最後の抽出により式Ｉの化合物を得るステップ
とを含む。

【0026】

本発明のさらに別の実施形態において、式ＩＩの化合物は８〜２４個の炭素原子を有する。

【0027】

本発明のさらに別の実施形態において、極性非プロトン性溶媒は、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン及びトリエチルアミンから成る群から選択される。

【0028】

本発明のさらに別の実施形態において、塩基は、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメトキシド及びカリウムメトキシドから成る群から選択される。

【0029】

本発明のさらに別の実施形態において、塩基媒介脱保護用の極性プロトン性溶媒は、メタノール、エタノール及び水とメタノールとの混合物を含む群から選択される。

【0030】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤は、式Ｉのカチオン性両親媒性化合物、共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）及びポリアニオン性化合物を生理学的に許容可能な添加剤と共に含む。

【0031】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤は、ヘルパー脂質をさらに含む。

【0032】

本発明のさらに別の実施形態において、共脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルホスホコリン、中性ホスファチジルエタノールアミン又は中性ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、コレステロール、１，２−ｓｙｎ−ジオレオイル−グリセロールホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びコレステロールから成る群から選択される。

【0033】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤中で使用するカチオン性両親媒性物質の共脂質に対するモル比は１：１〜３：１の範囲である。

【0034】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤中のカチオン性両親媒性物質の共脂質に対する好ましいモル比は１：１である。

【0035】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤中で使用するポリアニオン性化合物は、核酸、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質及び薬剤から成る群から選択される。

【0036】

本発明のさらに別の実施形態において、核酸は、プラスミド、リボ核酸、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡのポリヌクレオチドから成る群から選択される。

【0037】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤は、皮膚、皮下、皮内、経鼻、静脈内、筋肉内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｉａｌ）又は肺経路で投与される。

【0038】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤は、２５〜１００マイクロリットルの範囲で細胞内投与される。

【0039】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤は、５００００個の細胞に対して０．１〜０．５マイクログラムのＤＮＡの比で細胞に投与される。

【0040】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤中のカチオン性両親媒性物質は９．０〜０．３マイクログラムであり、脂質対ＤＮＡ電荷比は０．３：１〜９：１である。

【0041】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤は、インビトロ、またインビボの両方の環境下で抗原提示細胞をトランスフェクトする。

【0042】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤は、市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００より効率的にｍｂｍＤＣをトランスフェクトする。

【0043】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤は、細胞性及び体液性の両方の免疫応答を誘起する。

【0044】

本発明のさらに別の実施形態において、製剤は、適切な公知の免疫原を使用して、ヒト又は動物の体において、任意の疾患に対する長期間にわたる保護効果を示す。

【0045】

本発明のさらに別の実施形態において、免疫応答を誘起する方法であって、この方法は、式Ｉのカチオン性両親媒性化合物、共脂質及びポリアニオン性化合物を生理学的に許容可能な添加剤と共に含む製剤を投与することを含む。

【0046】

本発明のさらに別の実施形態において、免疫応答を生じさせる方法であって、この方法は、免疫原をコードするポリヌクレオチドと共に製剤を少なくとも１匹のマウスに投与することで少なくとも１匹の免疫化マウスを生み出すことを含む。

【0047】

本発明の重要な実施形態は、抗原提示細胞への遺伝子の送達における、これらの新規なカチオン性両親媒性物質のマンノース受容体選択効率を評価することである。

【0048】

本発明の別の重要な実施形態は、本明細書で開示の製剤がマウスにおいて引き出す細胞性及び体液性の両方の免疫応答の評価である。

【0049】

本発明の最も重要な実施形態は、メラノーマ腫瘍関連抗原（ｇｐ−１００及びチロシナーゼ）をコードしているプラスミドＤＮＡと、マンノース模倣シキモイル頭部基を有する新規なリシニル化カチオン性両親媒性物質のリポソームとの静電複合体（リポプレックス）で免疫化した同系マウスにおける、侵襲性メラノーマ腫瘍に対する長期間（腫瘍チャレンジから１００日）にわたる抗腫瘍効果の評価である。

【図面の簡単な説明】

【0050】

スキーム１は、マンノース模倣シキモイル頭部基を有するカチオン性両親媒性物質の調製に用いる合成手順の概略図である。
スキーム２は、マンノース模倣キノイル頭部基を有するカチオン性両親媒性物質の調製に用いる合成手順の概略図である。
スキーム３は、マンノシル頭部基を有するカチオン性両親媒性物質３の調製に用いる合成手順の概略図である。

【図1】単離したｍｂｍＤＣにおける細胞表面ＭＨＣ ＩＩ、全ＭＨＣ ＩＩ、マンノース受容体、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、Ｈ_２Ｋｂ、ＣＤ８６及びＣＤ４０を含めたＤＣ表面マーカーの存在をフローサイトメトリにより確認している。約５ｘ１０^５個のｍｂｍＤＣを、細胞表面ＭＨＣ ＩＩ、全ＭＨＣ ＩＩ（表面及び細胞内ＭＨＣ ＩＩの全て）に特異的な非抱合型モノクローナル抗体、マンノース受容体に対するフィコエリトリン（ＰＥ）抱合型モノクローナル抗体並びにＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、Ｈ_２ｋｂ、ＣＤ８６及びＣＤ４０に対するＦＩＴＣ抱合型モノクローナル抗体で染色した。ＭＨＣ−ＩＩマーカープロファイルを測定するために、抗ＭＨＣ−ＩＩモノクローナル抗体での染色後、ｍｂｍＤＣをＦＩＴＣ抱合型二次抗体で染色した。各実験を３回繰り返し、各回で同様のマーカープロファイルが観察された。

【図2】１、２のｍｂｍ−ＤＣトランスフェクション効率がマンノース受容体により媒介され、またそのマンノシル類似体３のものより高いことを示す。脂質１〜３とα５−ＧＦＰプラスミドとのリポプレックスをトランスフェクトしたｍｂｍＤＣにおけるＧＦＰ発現の程度を、フローサイトメトリで測定した。（Ａ）ｍｂｍＤＣにおけるトランスフェクション効率。（Ｂ）マンナン（１ｍｇ／ｍＬ）で事前に飽和させたｍｂｍＤＣにおけるトランスフェクション効率。これらのトランスフェクション実験のそれぞれにおいて、約５ｘ１０^５個の細胞を使用し、細胞に、脂質：ＤＮＡ電荷比が８：１のリポプレックスをトランスフェクトした。比較のために、各ケースにおけるトランスフェクション効率を、市販のリポソームトランスフェクションキットＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ ２０００（セクションＡ、Ｂの最右のパネルに示す）のＧＦＰリポプレックスを使用しても測定した。各実験を３回繰り返し、各回で同様のトランスフェクションプロファイルが観察された。

【図3】１、２、３とモデル遺伝子ワクチンとしてのｐ−ＣＭＶ−β−ｇａｌとのリポプレックスを皮下投与した際のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける体液性及び細胞性免疫応答をまとめたものである。（Ａ）生後６〜８週間のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（それぞれ体重は２０〜２２ｇ、ｎ＝４）を、１、２、３とモデル遺伝子ワクチンとしてのｐ−ＣＭＶ−β−ｇａｌとのリポプレックス（５％グルコース溶液中１５０μｌ、１５μｇのＤＮＡ、４：１の脂質：ＤＮＡ比、７日間隔で３回）で皮下的に免疫化した。３回目の免疫化から２週間後、マウスから血清サンプルを採取し、β−ｇａｌ抗体についてＥＬＩＳＡでアッセイした。Ｙ軸は、血清を１：２００で希釈した場合に得られる吸光度を表す（カチオン性両親媒性物質１、２、３に関して^＊Ｐ＜０．００５。処置していないマウスの場合の値と比較）。（Ｂ）２回目の免疫化から２週間後、脾細胞を採取し、（インビトロで再刺激することなく）速やかにＥＬＩＳＡによるＴ細胞（細胞）応答に使用した（カチオン性両親媒性物質１、２、３に関して^＊Ｐ＜０．００５。処置していないマウスの場合の値と比較）。

【図4】ｐ−ＣＭＶ−チロシナーゼ及びｐ−ＣＭＶ−ｇｐ１００と脂質１とのリポプレックスで免疫化した同系マウスにおける長期間にわたる抗腫瘍効果を示す。（Ａ、Ｃ）生後６〜８週間のメスの同系Ｃ５７ＢＬ／６マウス（それぞれ体重は２０〜２２ｇ、ｎ＝６）を、脂質１とｐ−ＣＭＶ−チロシナーゼとのリポプレックス（Ａ）、脂質１とｐ−ＣＭＶ−ｇｐ１００とのリポプレックス（Ｃ）、脂質１とｐ−ＣＭＶ−β−ｇａｌとのリポプレックス（１５μｇのＤＮＡを含有する１５０μＬの５％グルコース溶液を使用。４：１の脂質：ＤＮＡ比、７日間隔で３回）で免疫化（皮下）した。３回目の免疫化から２週間後、約１ｘ１０^５個のＢ１６Ｆ１０細胞を皮下注射することでマウスを致死性メラノーマ腫瘍に曝露した。腫瘍の体積（Ｖ＝１／２ａｂ^２であり、ａ＝腫瘍の最大長さ、ｂ＝互いに直角で測定した腫瘍の最小長さ）を、最大２９日間にわたってノギスで測定した。結果は、ｎ＝５の腫瘍の場合の平均±ＳＤである（^＊Ｐ＜０．００５対脂質１とｐ−ＣＭＶ−β−ｇａｌとのリポプレックスの場合の腫瘍サイズ）。（Ｂ、Ｄ）脂質１とｐ−ＣＭＶ−チロシナーゼとのリポプレックス（Ｂ）、脂質１とｐ−ＣＭＶ−Ｇｐ−１００とのリポプレックス（Ｄ）、脂質１とｐ−ＣＭＶ−β−ｇａｌとのリポプレックスで免疫化（皮下）し、続いて上述したようにメラノーマ腫瘍に曝露した無腫瘍マウスの割合。

【発明を実施するための形態】

【0051】

本発明は、マンノース受容体選択的リシニル化カチオン性両親媒性物質及びその調製方法を提供する。

【0052】

本発明はさらに、グアニジン、またマンノース模倣シキモイル及びキノイル頭部基の両方を有する式Ｉの一連の新規なリシニル化カチオン性両親媒化合物、その合成方法、抗原提示細胞におけるそのマンノース受容体特異的遺伝子導入特性の評価並びに本明細書に記載のカチオン性両親媒性物質から調製したリポソームとモデルＤＮＡワクチンとの複合体の皮下投与により引き出されるマウスにおける細胞性及び体液性の両方の免疫応答の評価に関する。

【0053】

本発明はまた、マンノース模倣シキモイル頭部基を有するカチオン性両親媒性物質が、マンノシル頭部基を有する対応するカチオン性両親媒性物質、またマンノース模倣キノイル頭部基領域を有するカチオン性両親媒性物質より、マウスにおける樹状細胞をベースとした遺伝子免疫化において細胞性及び体液性の両方の免疫応答を引き出すのにより効果的であることを開示する。最も重要なことに、ここで発明者らは、メラノーマ腫瘍関連抗原（ｇｐ１００及びチロシナーゼ）をコードしているプラスミドＤＮＡとマンノース模倣シキモイル頭部基を有する新規なリシニル化カチオン性両親媒性物質のリポソームとの静電複合体（リポプレックス）でのマウスの皮下免疫化により、免疫化マウスにおいて、長期間にわたる（腫瘍チャレンジから１００日）抗腫瘍効果が侵襲性メラノーマ腫瘍に対して得られることを示す。

【0054】

マンノース受容体は、シスチンリッチアミノ末端、フィブロネクチンタイプＩＩ反復領域、８個の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの５種のドメインから成る１８０ｋＤａの膜貫通タンパク質である。マンノース受容体は、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース等の糖をその表面に担持している分子又は微生物に８個のＣＲＤドメインを介して選択的に結合する（Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００１；１：４６９−４７４）。受容体タンパク質のＤ−マンノース、カルシウムイオン、２つのアスパラギン及び２つのグルタミン酸残基における水素結合及び２つのエクアトリアル、ビシナル水酸基（３位、４位）間での配位結合の広範囲にわたるネットワークがこの結合に大きく貢献している（Ｗｅｉｓ，Ｗ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９２；３６０：１２７−１３４、Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ １９９２；３６０：１８３−１８６）。このため、マンノース受容体は、細胞壁上でマンノースを発現している抗原微生物の宿主に対する防御免疫の付与において重要な役割を果たす。樹状細胞及びマクロファージの両方（抗原提示細胞（ＡＰＣ））がその細胞表面上で主にエンドサイトーシスマンノース受容体を発現するため（Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００１；１：４６９−４７４）、カチオン性脂質：ＤＮＡ複合体（リポプレックス）のＡＰＣによる選択的な取り込みは、原則として、ＡＰＣ特異的リガンドでのリポソーム表面の共有結合性修飾により強化されるはずである。

【0055】

ＤＮＡワクチン接種の有効性を高めるのに有望なアプローチは、ＡＰＣに対する、その細胞表面で発現する１８０ｋＤａでマルチドメインの独特な膜貫通受容体であるマンノース受容体を介したＤＮＡワクチンのターゲティングをベースとしている（Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９５；１８２：３８９−４００）。モデルＤＮＡワクチンとしてｐ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ酵素をコード）を使用して、本発明は、ｐ−ＣＭＶ−β−ｇａｌと、グアニジン及びマンノース模倣シキモイル頭部基の両方を有する本明細書に記載のマンノース受容体選択的リシニル化カチオン性両親媒性物質のリポソームとの静電複合体のマウスにおける直接インビボ投与（すなわち、自家ＤＣの単離が不要）が、β−ｇａｌ抗原に対する細胞性及び体液性の両方の免疫応答を引き出すのに極めて効率的であることを開示する。本発明は、グアニジン及びマンノース模倣シキモイル頭部基の両方を有する本明細書に記載のリシニル化カチオン性両親媒性物質の、ヒト悪性メラノーマの大部分で発現する２種のヒトメラニン形成細胞系列特異的抗原であるＧｐ１００及びチロシナーゼをコードしているＤＮＡワクチンを使用した遺伝子免疫化における応用例も開示する（Ｃｏｕｌｉｅ Ｐ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９４；１８０：３５−４２、Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４；９１：３５１５−９、Ｔｏｐａｌｉａｎ Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９４；９１：９４６１−９４６５、Ｂｒｉｃｈａｒｄ Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９３；１７８：４８９−９５）。これらの抗原は、そのマウスカウンターパートとアミノ酸配列同一性をそれぞれ７７％、８２％共有している（Ｚｈａｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ １９９７；２０：１５−２５、Ｃｏｌｅｌｌａ Ａ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０００；１９１：１２２１−１２３１）。本発明は、ＤＮＡワクチンであるｐ−ＣＭＶ−ｇｐ１００及びｐ−ＣＭＶ−チロシナーゼ（それぞれメラノーマ抗原ｇｐ−１００及びチロシナーゼをコード）とグアニジン及びマンノース模倣シキミ酸頭部基の両方を有する本明細書に記載のリシニル化カチオン性両親媒性物質のリポソームとの静電複合体（リポプレックス）での直接インビボ免疫化により、免疫化マウスにおいて、長期間（腫瘍チャレンジから１００日）にわたる抗腫瘍効果が侵襲性メラノーマ腫瘍による攻撃に対して得られることを開示する。本明細書に記載の単純で非ウイルス性のインビボＤＣターゲティング系は、遺伝子免疫化において、長期間にわたる免疫応答の誘起に将来、利用し得る。本発明は、マンノース模倣頭部基を有する新規なカチオン性両親媒性物質系列の調製方法、またそのマンノシル化類似体の合成方法にも関する。加えて、本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）であるマウス骨髄由来樹状細胞（ｍｂｍＤＣ）における、本明細書で開示のカチオン性両親媒性物質のマンノース受容体媒介遺伝子導入特性も開示する。マンノース模倣シキミ酸及びキナ酸頭部基を有する新規なカチオン性両親媒性物質は、治療用抗原をコードしている遺伝子材料をマンノース受容体を過剰発現する抗原提示細胞に送達するのに潜在的に有用である。

【0056】

本発明で開示のマンノース模倣頭部基を有するカチオン性両親媒性物質に共通する、他とは異なる新規な構造的特徴には（１）正に帯電した窒素原子に直接結合している疎水性基の存在、（２）リシン官能性を通じて正に帯電した四級化窒素原子に共有結合したマンノース受容体結合極性キナ酸頭部基の存在及び（３）リシン側鎖アミノ基に直接結合したグアニジン頭部基の存在が含まれる。これらの独特な構造的特徴が、マンノース模倣頭部基を有する本明細書で開示のカチオン性両親媒性物質のマンノース受容体媒介遺伝子導入効率に大きく貢献していると考えられる。本発明の恩恵を最も享受する可能性がある科学の領域は、遺伝子免疫化又はＤＮＡワクチン接種の分野である。本発明の実践において、「カチオン性」とは、正電荷が四級化窒素又はプロトン化窒素原子上にあることを意味する。本発明の両親媒性物質のカチオン性は、両親媒性物質と生物学的に活性な分子、例えば核酸及び／又は細胞成分、例えば細胞膜糖タンパク質との相互作用の強化に貢献し得る。カチオン性両親媒性物質、治療的に活性な生体高分子及び／又は細胞膜成分間でのそのような高い相互作用が、治療用分子を細胞内に成功裡に輸送するにあたって重要な役割を果たし得る。

【0057】

マンノース模倣シキモイル及びキノイル頭部基を有する本発明の脂質は、ある共通の構造及び官能基を有する。そのため、このカチオン性両親媒性物質は、以下の式（Ｉ）：

【0058】

【化6】

【0059】

により表され、式中、Ｒは、シキモイル、キノシル及びマンノシル基から成る群から選択され、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立して水素又は親油部分であり、Ｒ^１及びＲ^２は同時に水素ではなく、
Ｒ^３は独立して水素又はＣ_１〜Ｃ_５アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_５ヒドロキシ及びＣ_１〜Ｃ_５アミノであり、
グアニジン頭部基はリシンの側鎖アミノ基に直接結合され、
Ｘは任意で塩素又は臭素から選択され、
親油部分はＣ_８〜２４アルキル、モノ−、ジ−及びトリ不飽和アルケニルから成る群から選択される。

【0060】

本発明の好ましい実施形態において、開示のカチオン性脂質は、Ｒ^１＝Ｒ^２＝ｎ−ヘキサデシル、Ｒ^３＝メチルであり、Ｘ⁻が塩化物であり、シキモイル基がマンノース模倣頭部基であるカチオン性両親媒性物質１である。

【0061】

本発明の別の第２の好ましい実施形態において、開示のカチオン性脂質は、Ｒ^１＝Ｒ^２＝ｎ−ヘキサデシル、Ｒ^３＝メチルであり、Ｘ⁻が塩化物イオンであり、キナ酸がマンノース模倣頭部基であるカチオン性両親媒性物質２である。

【0062】

本発明の別の好ましい実施形態において、開示のカチオン性脂質は、Ｒ^１＝Ｒ^２＝ｎ−ヘキサデシル、Ｒ^３＝メチルであり、Ｘ⁻が塩化物イオンであり、マンノースがマンノース模倣頭部基であるカチオン性両親媒性物質３である。

【0063】

本発明のカチオン性両親媒性物質は、水溶液中での脂質複合体又は凝集体の形成を促進する親油性ドメインを有する。疎水性ドメインの親油性及び極性キナ酸頭部基ドメインの親水性は、カチオン性脂質が水溶液に直面した場合に脂質凝集体が第２化合物の存在又は不在下で形成されるようなものである。例示的な親油性Ｒ_１及びＲ_２基には、（１）飽和Ｃ_８−Ｃ_２４アルキル基及び（２）１、２又は３個の二重結合を有する不飽和Ｃ_８−Ｃ_２４アルケニル基が含まれる。

【0064】

マンノース模倣シキモイル頭部基を有する本明細書に記載のカチオン性両親媒性物質（Ｘ）の調製に用いる合成法を下のスキーム１において概略的に描く。シキモイル頭部基を有するカチオン性両親媒性物質（Ｘ、スキーム１）を、スキーム１に示す、開始時混合三級−一級アミン（式ＩＩの化合物）（Ｋｕｍａｒ，Ｖ．Ｖ．らがＧｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．２００３；１０：１２０６−１２１５で過去に報告しているように、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−テトラデシルアミンをＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護２−ブロモエチルアミンとエチルアセテート中、無水炭酸カリウムの存在下で反応させ、続いて脱保護及び中和することで調製）を適当に保護したリシン誘導体（保護された側鎖及び保護されたα−アミン基を有する）とペプチド結合させることで合成した。結合後の生成物（中間体ＩＩＩ、スキーム１）を脱保護し、得られたアミノ化合物（中間体ＩＶ、スキーム１）をトリ−Ｏ−アセチルシキミ酸誘導体とペプチド結合させると中間体Ｖ（スキーム１）が得られた。結合後の生成物（中間体Ｖ、スキーム１）を脱保護し、得られたアミノ化合物（中間体ＶＩ、スキーム１）をジ−Ｂｏｃ−チオウレアと塩化第二水銀の存在下で結合させると中間体ＶＩＩ（スキーム１）が得られた。中間体ＶＩＩを超過剰量のヨウ化メチルで四級化すると四級化中間体ＶＩＩＩ（スキーム１）が得られ、メタノール性ナトリウムメトキシドとの反応とそれに続くＡｍｂｅｒｌｙｓｔ Ａ−２６塩化物イオン交換樹脂での塩化物イオン交換によりターゲットであるカチオン性両親媒性物質Ｘ（スキーム１）が得られた。シキミ酸頭部基を有するカチオン性両親媒性物質Ｘの合成手順の詳細は、（代表例としての）カチオン性両親媒性物質１の合成に関する実施例１において後述する。シキミ酸頭部基を有するカチオン性両親媒性物質Ｘの合成（スキーム１）で採用したものと同じ合成法をマンノース模倣キナ酸頭部基を有するカチオン性両親媒性物質（Ｙ、スキーム２）の調製に用いた。ただし、シキミ酸のトリ−Ｏ−アセチル誘導体を使用する代わりにキナ酸のＯ−テトラアセチル誘導体を使用した。キナ酸頭部基を有するカチオン性両親媒性物質Ｙの合成手順の詳細は、（代表例としての）カチオン性両親媒性物質２の合成に関する実施例２において後述する。本明細書に記載のカチオン性両親媒性物質のマンノシル類似体（３）の調製で辿った合成経路を概略的にスキーム３に示す。また、カチオン性両親媒性物質３の調製に関する合成の詳細を実施例３において後述する。スキーム１〜３に示す全ての合成中間体及びターゲットであるカチオン性両親媒性物質の構造を^１Ｈ ＮＭＲ及びＥＳＩ質量分析により確認し、ターゲットであるカチオン性両親媒性物質全ての純度を、２つの異なる移動相を使用した逆相分析ＨＰＬＣにより確認した。

【0065】

【化7】

【0066】

【化8】

【0067】

【化9】

【0068】

製剤
本発明は、最適量の本明細書で開示のマンノース模倣頭部基を有する式Ｉのカチオン性両親媒性化合物、生体高分子及び共脂質を含む新規な製剤も提供する。１種以上の追加の生理学的に許容可能な物質を本発明の医薬製剤に含めることで貯蔵用に製剤を安定させ得る又は生物学的に活性な分子を細胞内に成功裡に送達するのを促進し得る。本発明の実践における共脂質は、糖模倣（ｇｌｙｃｏｍｉｍｉｃｋｉｎｇ）両親媒性物質の１種以上との混合において有用である。コレステロールは、本明細書に記載の両親媒性物質と組み合わせて使用することで生物学的に活性な分子全般、特にはＤＮＡワクチンをＡＰＣに成功裡に送達するのを促進する優れた共脂質である。カチオン性両親媒性物質対共脂質の好ましいモル比範囲は１：１である。そのため、この範囲を極めて広く変化させることは当該技術分野の範囲内にある。典型的には、適当なモル比にあるカチオン性両親媒性物質及び共脂質（コレステロール又はＤＯＰＥ）をガラスバイアル内のメタノールとクロロホルムとの混合物に溶解させることでリポソームを調製した。水分非含有窒素ガスを薄く流すことで溶媒を除去し、次に乾燥させた脂質膜を高真空下で８時間にわたって維持した。乾燥させた脂質膜を総体積１ｍｌの滅菌脱イオン水中、カチオン性脂質濃度１ｍＭで最低１２時間にわたって水和させた。リポソームを１〜２分間にわたってボルテックスすることで付着している脂質膜を除去し、バスソニケータ（ＵＬＴＲＡｓｏｎｉｋ ２８Ｘ）により２〜３分間にわたって室温で超音波処理することで多重膜ベシクル（ＭＬＶ）を得た。次に、ＭＬＶをＴｉプローブ（Ｂｒａｎｓｏｎ ４５０ Ｓｏｎｉｆｉｅｒをデューティサイクル１００％、出力２５Ｗで使用）で１〜２分間にわたって超音波処理することで、きれいな半透明の溶液の形成により示されるように、小さな単層膜ベシクル（ＳＵＶ）が得られた。本発明のカチオン性両親媒性物質を使用して細胞内に治療量で投与することができる生物学的に活性な分子には、治療的に重要な抗原又はタンパク質をコードするリボソームＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのポリヌクレオチドが含まれる。本明細書で開示のマンノース模倣頭部基を有するカチオン性両親媒性物質は、その代表例の１種以上を組み合わせて使用することで生物学的に活性な分子の細胞／組織への進入を促進するようにブレンドし得る。

【0069】

さらなる実施形態において、本発明で開示のカチオン性両親媒性物質は純粋な形態又は他の脂質若しくはヘルパー脂質、例えばコレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール等と組み合わせて使用し得る。この治療製剤は、生物学的に活性な治療用分子と複合体を形成するまで０〜４°で貯蔵し得る。細菌増殖を防止し、貯蔵寿命を延ばす薬剤を、調製物を安定化する試薬、例えば低濃度のグリセロールと共に含め得る。凍結／解凍サイクルは製剤の効率における損失を引き起こし得ることが特に注意喚起される。

【0070】

さらに別の実施形態において、本明細書で開示のカチオン性両親媒性物質、共脂質（コレステロール又はＤＯＰＥ）及び生物学的に活性な治療用分子の製剤は、他の経路、例えば皮下、筋肉内、腹腔内に加えて静脈内投与し得る。さらに、製剤を細胞に、インビトロの系において０．１〜０．５マイクログラムのＤＮＡ：５００００個の細胞の比で投与し得る。カチオン性両親媒性物質の量は、１つのカチオン性両親媒性物質について２の正電荷、１つのヌクレオチド塩基は１の負電荷であるとして、カチオン性両親媒性物質対ＤＮＡ電荷比０．３：１〜９：１内で変動し得る。

【0071】

本発明はさらにこの製剤の調製方法を提供し、製剤方法は、本発明で開示のカチオン性両親媒性物質の分散物を調製するステップと、この分散物を生物学的に活性な分子と接触させることでカチオン性両親媒性物質と生物学的に活性な分子との複合体を形成するステップと、細胞をこの複合体と接触させることで生物学的に活性な分子の細胞への導入を促進するステップとを含む。本発明は、生物学的に活性な分子の細胞内送達を促進する様々な製剤も提供する。

【0072】

マンノース受容体を介した樹状細胞（ＤＣ）のトランスフェクション：
各種ＡＰＣの中でも、ＤＣは最も強力な抗原提示細胞であり、ナイーブＴ細胞に対して効果的に抗原を提示可能である（Ｒｏｍｉｎｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９４；１８０：８３−９３）。ＤＮＡワクチン接種の分野において、トランスフェクトしたＤＣは、効率的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答におけるキープレーヤーである（Ｄｅｎｉｓ−Ｍｉｚｅ ＫＳ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００；２４：２１０５−１１２、Ｃｏｎｄｏｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．１９９６；１０：１１２２−１１２８、Ａｋｂａｒｉ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９９；１８９：１６９−１７８、Ｃｏｏｍｂｅｓ Ｂ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．２００１；７８：１０３−１１１、Ｐｏｒｇａｄｏｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９８；１８８：１０７５−１０８２、Ｔｉｍａｒｅｓ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７０：５４８３−５４９０、Ｓｂａｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００２；２０：３１３７−３１４７、Ｉｒｖｉｎｅ ＡＳ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００；１８：１２７３−１２７８）。ＤＮＡワクチン接種及びＤＣによる抗原提示を成功させるにあたって、ＤＮＡのインターナリゼーション又はＤＣにＤＮＡを担持させるだけでは不十分である。それぞれの抗原を発現させるためには、抗原をコードしているＤＮＡワクチンを樹状細胞の核に送達する必要がある。次に、抗原のプロセシングを行い、活性化させたＤＣのＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子上に提示させる（Ｓａｍａｎｔｈａ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００５；５７：３７７−３９０）。ＤＣへの効果的なトランスフェクションは、核へと輸送される前の、インターナリゼーション後のＤＮＡのリソソーム又はファゴソームによる分解により制限される。これがＤＣのトランスフェクションが困難である理由である。トランスフェクション率はグループ毎に大きく異なり、トランスフェクション効率は０〜１０％である（Ａｌｉｊａｇｉｃ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５；２５：３１００−３１０７、Ａｒｔｈｕｒ Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９７；１：１７−２５、Ｌｏｈｍａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００；４：６０５−１４、Ｓｔｒｏｂｅｌ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００；２３：２０２８−３５）。未熟ＤＣの表面で発現したマンノース受容体（ＭＲ）はエンドサイトーシス及びファゴサイトーシスに関与する（Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ，ＲＡＢ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９０；１７２：１７８５−１７９４）。まず、カチオン性両親媒性物質１、２、３のトランスフェクション効率を、マウス骨髄由来樹状細胞において評価した。これを目的として、未熟樹状細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの骨髄から、過去に記載のプロトコルにしたがってＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４との培養により単離した（Ｉｎａｂａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９２；１７６：１６９３−１７０２）。まず、単離したｍｂｍＤＣにおける各種ＤＣマーカーの存在を蛍光サイトメトリ分析（ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）により確認した。新たに単離したｍｂｍＤＣを、各種ＤＣマーカー用のＦＩＴＣ／ＰＥ抱合型モノクローナル抗体で処理し、ＦＡＣＳプロファイルをモニタした。フローサイトメトリにおける発見により、未熟ＤＣが高い細胞内ＭＨＣクラスＩＩ分子レベル、低いＣＤ８６、高いＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０及びマンノース受容体レベルを有する特徴が確認された（図１）。

【0073】

単離したＤＣ表面上に期待されるＤＣマーカーの存在を確認した後（図１）、ｍｂｍＤＣに、１〜３のリポソーム（共脂質としての等モルの１，２−ジ−オレイオル（ｏｌｅｙｏｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、ＤＯＰＥと組み合わせて調製）と複合体を形成したＧＦＰプラスミドをマンノース受容体の天然リガンドであるマンナンの存在下及び不在下の両方でトランスフェクトし、トランスフェクション効率をフローサイトメトリで評価した。１、２のリポプレックスは、ｍｂｍＤＣのトランスフェクションにおいて、コントロール用のマンノシル類似体３のリポプレックスより約４倍及び２．５倍効率がよかった（１のリポプレックスの場合は約２０％、２のリポプレックスの場合は１０〜１２％。それに対して３のリポプレックスの場合は４〜５％）（図２、上方のパネル）。ｍｂｍＤＣはトランスフェクションが困難である。広く使用されている市販のリポソームトランスフェクションキットであるＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００はｍｂｍＤＣのトランスフェクションにおいて本質的に役に立たなかった（図２）。ｍｂｍＤＣをマンノース受容体の天然リガンドであるマンナンとプレインキュベートすると、ｍｂｍＤＣのトランスフェクションにおける３種の脂質１〜３全ての効率が悪化した（図２、下方のパネル）。これらを考え合わせると、脂質１〜３のトランスフェクションプロファイル（図２）は、樹状細胞の細胞表面で発現したマンノース受容体により媒介される脂質１〜３のリポプレックスによるｍｂｍＤＣトランスフェクションと一致する。

【0074】

マウスにおける皮下遺伝子免疫化時の体液性免疫応答：
ＤＮＡワクチンキャリアとしての本明細書に記載の糖模倣カチオン性両親媒性物質の治療可能性を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１５μｇの（モデル抗原コードＤＮＡとしての）ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌと脂質：ＤＮＡ電荷比４：１で複合体化した脂質１〜３のリポプレックスで皮下免疫化（３回、７日間隔）することで評価した。ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌと脂質１〜３とのリポプレックスを事前にトランスフェクトしたｍｂｍＤＣでＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを皮下免疫化してから２週間後、ＩＮＦ−γ及び抗β−ｇａｌ抗体（それぞれ細胞性及び体液性免疫応答についてのシグネチャーサイトカイン）の両方を測定するために脾細胞及び血清を採取した。無処置のマウスをコントロールとして使用した。免疫化したマウスの脾細胞からのＩＮＦ−γの量及び血清からのβ−ｇａｌ抗体の量は、無処置のマウスで免疫化したマウスのものより有意に高いと判明した（図３）。

【0075】

マウスにおける皮下遺伝子免疫化時の同系マウスにおける長期間にわたる抗腫瘍作用：
メラノーマ抗原ｇｐ１００及びチロシナーゼをコードしているＤＮＡワクチンｐ−ＣＭＶ−Ｇｐ−１００及びｐ−ＣＭＶ−チロシナーゼの本明細書に記載のリポプレックスの直接皮下投与後の免疫応答を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ同系マウスを、脂質１のリポプレックスで免疫化した（５％グルコース溶液中１５０μｌ、１５μｇのＤＮＡ、４：１の脂質：ＤＮＡ比、３回、７日間隔）。免疫化したマウス（ｎ＝５）を続いて致死量のメラノーマ腫瘍（〜１ｘ１０^５個のＢ１６Ｆ１０細胞）に曝露した。腫瘍の増殖を２９日間にわたってモニタしたが、これは脂質１で免疫化したコントロールのマウス群を研究のその時点で屠殺しなくてはならなかったからである（腫瘍サイズは極めて大きくなった。図４Ａ、Ｃ）。脂質１とｐ−ＣＭＶ−Ｇｐ−１００とのリポプレックス及び脂質１とｐ−ＣＭＶ−チロシナーゼとのリポプレックスで免疫化したマウス全てが、２９日間にわたる腫瘍増殖阻害研究中、腫瘍チャレンジ後も腫瘍を発生させることなく生存した（図４Ａ、Ｃ）。重要なことに、著しく長期間にわたる（腫瘍チャレンジから１００日）抗メラノーマ防御免疫が、腫瘍チャレンジから１００日間、脂質１とｐ−ＣＭＶ−Ｇｐ−１００とのリポプレックス及び脂質１とｐ−ＣＭＶ−チロシナーゼとのリポプレックスで免疫化したマウスの全て（ｎ＝５）において観察された（図４Ｂ、Ｄ）。このため、図４Ａ〜Ｄにまとめた発見は、インビボ環境下での遺伝子免疫化におけるマンノース模倣シキモイル末端基を有するカチオン性両親媒性物質の全身に対する高い潜在能力を説得力高く実証した。重要なことに、マウスを脂質１とｐ−ＣＭＶ−β−ｇａｌとのリポプレックス、酵素β−ガラクトシダーゼをコードしている無関係のコントロール用プラスミドで免疫化した場合、全てのマウスが３０日以内に死亡した（図４Ａ、Ｃ）。これらの発見は、今回観察された遺伝子免疫化における著しく長い防御免疫応答が抗原特異的であることを実証した。

【0076】

以下の実施例は本発明を説明する目的で挙げたものであるため、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。

【実施例1】

【0077】

実施例１：
カチオン性両親媒性物質１の合成（スキーム１、Ｘ、ｎ＝１３）
ステップ（ｉ）：固形ＨＯＢｔ（０．２８ｇ、２ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（０．４ｇ、２ｍｍｏｌ）を連続的に、５ｍＬのドライＤＣＭ／ドライＤＭＦ（９：１、ｖ／ｖ）中のＮ^α−Ｚ−Ｎ^ε−ＢＯＣ−Ｌ−リシン（０．７６ｇ、２ｍｍｏｌ）の氷冷撹拌溶液に窒素雰囲気下で添加した。３０分後、ドライＤＣＭに溶解させたＮ−２アミノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシルアミン（０．８ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で一晩撹拌し、過剰量のＤＣＭで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（約２ｘ５０ｍＬ）及び水（約２ｘ５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を回転蒸発で除去した。残留物をカラムクロマトグラフィで精製すると（６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液としてジクロロメタン中の１〜１．５％メタノール（ｖ／ｖ）を使用）、１．１ｇ（収率８０％）の純粋な中間体ＩＩＩが得られた（Ｒ_ｆ＝０．５、ジクロロメタン中の５％メタノール、ｖ／ｖ）。

【0078】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−］；１．２−１．９［ｍ，５４Ｈ，−ＣＨ_２（ＣＨ_２）_１３−；９Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ_３）_３；６Ｈ，ＬｙｓＣ^γＨ_２，ＬｙｓＣ^δＨ_２，ＬｙｓＣ^βＨ_２］；２．４−２．７［ｍ，４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］３．０−３．１［ｍ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２］；３．３−３．４［ｍ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；４．０［ｍ，１Ｈ，ＢＯＣ−ＮＨ］；４．５［ｍ，１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］；５．０［ｄ，２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_５］；５．５［ｍ，１Ｈ，−ＮＨ−Ｚ］；７．２−７．５［ｍ，５Ｈ，Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_５］

【0079】

ステップ（ｉｉ）：上のステップで調製した中間体ＩＩＩ（１．１ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を８ｍＬのメタノール及び２滴の２Ｎ塩酸に溶解させた。Ｐｄ（ＯＨ）_２／Ｃ（０．３ｇ）を反応混合物に添加し、空気を除去した。得られた反応混合物を室温で１４時間にわたって水素雰囲気下（２気圧）で撹拌した。反応混合物をセライトを使用して濾過し、濾液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾液の溶媒を回転蒸発により除去すると０．９ｇ（収率９０％）の純粋な中間体ＩＶが得られた（Ｒ_ｆ＝約０．４、１０％メタノール−クロロホルム、ｖ／ｖ）。

【0080】

ステップ（ｉｉｉ）：固形ＨＯＢｔ（０．１ｇ、１．４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（０．１５ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を連続的に、５ｍＬのドライＤＣＭ／ドライＤＭＦ（９：１、ｖ／ｖ）中の３，４，５−トリアセトキシシクロヘキシ−１−エンカルボン酸（０．２３ｇ、１．４ｍｍｏｌ）の氷冷撹拌溶液に添加した。３０分後、上のステップで調製した中間体ＩＶ（０．４ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を４ｍＬのドライＤＣＭ（０．４ｍＬのトリエチレンアミンで中和）に溶解させ、反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で一晩撹拌し、過剰量のＤＣＭで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（約２ｘ４０ｍＬ）及び水（約２ｘ４０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を回転蒸発で除去した。残留物をカラムクロマトグラフィで精製すると（６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液としてジクロロメタン中の１．５〜２％メタノール（ｖ／ｖ）を使用）、０．４ｇ（収率７２％）の純粋な中間体Ｖが得られた（Ｒ_ｆ＝０．５、ジクロロメタン中の５％メタノール、ｖ／ｖ）。

【0081】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−］；１．２−１．５［ｍ，５４Ｈ，２ｘ−ＣＨ_２（ＣＨ_２）_１３−；９Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ_３）_３］；１．６−１．９［ｍ，６Ｈ，ＬｙｓＣ^γＨ_２，ＬｙｓＣ^δＨ_２，ＬｙｓＣ^βＨ_２］；２．０−２．１［３ｓ，９Ｈ，３ｘ−ＣＯＣＨ_３］；２．２−２．４［ｄｄ，２Ｈ，ｓｈｉｋ６−Ｈ，Ｈ'］；２．７−３．２［ｍ，４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ；２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２］；３．４−３．５［ｍ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；４．３−４．４［ｍ，１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］；４．７［ｍ，１Ｈ，ＢＯＣ−ＮＨ］；５．１−５．３［ｍ，２Ｈ，ｓｈｉｋ−４−Ｈ，ｓｈｉｋ−５−Ｈ］；５．６−５．７［ｍ，１Ｈ，ｓｈｉｋ−３−Ｈ］；６．４［ｄ，１Ｈ，ｓｈｉｋ−２−Ｈ］；７．１［ｍ，１Ｈ，ＣＯ−ＮＨ］
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝Ｃ_５８Ｈ_１０６Ｎ_４Ｏ_１０の場合、１０２０［Ｍ＋１］^＋

【0082】

ステップ（ＩＶ）：上のステップで調製した中間体Ｖ（０．５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をドライＤＣＭ（４ｍＬ）に溶解させ、ＴＦＡ（２ｍＬ）を０℃で添加した。得られた溶液を０℃で３時間にわたって撹拌することで完全に脱保護した。過剰量のＴＦＡを窒素フラッシングにより除去した。得られた化合物をクロロホルム（８０ｍＬ）に溶解させ、水性飽和ＮａＨＣＯ_３（３ｘ９０ｍＬ）、ブライン（１ｘ７０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を回転蒸発により除去すると、０．４１ｇ（収率９１％）の遊離アミンが中間体ＶＩとして得られた。

【0083】

ステップ（Ｖ）：塩化第二水銀（０．２８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を、ドライＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２ｍＬ）、トリエチルアミン（１ｍＬ）及びドライジクロロメタン（ＤＣＭ、５ｍＬ）に溶解させた中間体ＶＩ（ステップＩＶで調製。０．４ｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ビス−Ｎ−Ｂｏｃ−チオウレア（０．２ｇ、０．７ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で、継続的に撹拌しながら添加した。得られた混合物を０℃、窒素下で４０分間にわたって撹拌し、エチルアセテート（２０ｍＬ）で希釈し、セライトのパッドで濾過した。濾液を水（２ｘ５０ｍＬ）及びブライン溶液（２ｘ５０ｍＬ）で連続的に洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を回転蒸発により除去した。残留物をカラムクロマトグラフィで精製すると（６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液として２〜２．５％のメタノール／ジクロロメタン（ｖ／ｖ）を使用）、０．４１ｇの純粋な中間体ＶＩＩが得られた（７１％、Ｒｆ−０．５、５％メタノール／ジクロロメタン、ｖ／ｖ）。

【0084】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−］；１．２−１．５［ｍ，５４Ｈ，２ｘ−ＣＨ_２（ＣＨ_２）_１３−；１８Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ_３）_３］；１．６−１．９［ｍ，６Ｈ，ＬｙｓＣ^γＨ_２，ＬｙｓＣ^δＨ_２，ＬｙｓＣ^βＨ_２］；２．０−２．１［３ｓ，９Ｈ，３ｘ−ＣＯＣＨ_３］；２．２−２．４［ｄｄ，２Ｈ，ｓｈｉｋ６−Ｈ，Ｈ'］；２．７−３．２［ｍ，４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ；２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２］；３．４−３．５［ｍ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；４．３−４．４［ｍ，１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］；４．７［ｍ，１Ｈ，ＢＯＣ−ＮＨ］；５．１−５．３［ｍ，２Ｈ，ｓｈｉｋ−４−Ｈ，ｓｈｉｋ−５−Ｈ］；５．６−５．７［ｍ，１Ｈ，ｓｈｉｋ−３−Ｈ］；６．４［ｄ，１Ｈ，ｓｈｉｋ−２−Ｈ］；７．１［ｍ，１Ｈ，ＣＯ−ＮＨ］
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝Ｃ_６４Ｈ_１１７Ｎ_６Ｏ_１２の場合、１１６２［Ｍ＋１］^＋

【0085】

ステップ（ｖｉ）：上のステップで調製した中間体ＶＩＩ（０．４ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を２ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５ｍＬのヨウ化メチルを溶液に添加した。反応混合物を室温で６時間にわたって撹拌し、溶媒をロータリーエバポレータで除去した。残留物をカラムクロマトグラフィで精製すると（シリカゲル、６０〜１２０メッシュサイズ、溶離液としてジクロロメタン中の２〜２．５％メタノール（ｖ／ｖ）を使用）、０．３５ｇ（収率８２％）の純粋な中間体ＶＩＩＩが得られた（Ｒ_ｆ＝０．４５、ジクロロメタン中の５％メタノール、ｖ／ｖ）。

【0086】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−］；１．２−１．６［ｍ，５２Ｈ，２ｘ−（ＣＨ_２）_１３−，４Ｈ，ＬｙｓＣ^γＨ_２，１８Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ_３）_３］．］；１．６５−２．０［ｍ，４Ｈ，−Ｎ^＋（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２，４Ｈ，Ｌｙｓ^δＣＨ_２，ＬｙｓＣ^βＨ_２］；２．０−２．１５［３ｓ，９Ｈ，３ｘ−ＣＯＣＨ_３］；２．３−２．５［ｄｄ，１Ｈ，ｓｈｉｋ６−Ｈ，Ｈ'］；３．０−３．１［ｍ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２］；３．３［ｓ，３Ｈ，−Ｎ^＋ＣＨ_３］；３．４−３．５［ｍ，４Ｈ，−Ｎ^＋（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２］；３．７−３．８［ｍ，４Ｈ，−Ｎ^＋−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；４．４［ｍ，１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］；４．８［ｍ，１Ｈ，ＢＯＣ−ＮＨ］５．１−５．３［ｍ，２Ｈ，ｓｈｉｋ−４−Ｈ，ｓｈｉｋ−５−Ｈ］；５．７［ｔ，１Ｈ，ｓｈｉｋ−３−Ｈ］；６．５−６．６［ｄ，１Ｈ，ｓｈｉｋ−２−Ｈ］
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝Ｃ_６５Ｈ_１２０Ｎ_６Ｏ_１２の場合、１１７７Ｍ^＋

【0087】

ステップ（ｖｉｉ）：上のステップで調製した中間体ＶＩＩＩ（０．３５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）を２ｍＬのメタノールに溶解させ、Ｋ_２ＣＯ_３（０．２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加することでｐＨを約９に上昇させた。反応混合物を室温で３０分間にわたって撹拌し、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０（Ｈ^＋）で中和し、濾過し、濾液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレータ上で濃縮すると０．２５ｇ（収率８０％）の中間体ＩＸが得られた（Ｒ_ｆ＝約０．６、２０％メタノール−クロロホルム、ｖ／ｖ）。

【0088】

ステップ（ｖｉｉｉ）：上のステップで調製した中間体ＩＸ（０．２５ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を２ｍＬのドライＤＣＭに溶解させた氷冷溶液に、０．６ｍｌのＴＦＡを添加し、混合物を３〜４時間にわたって撹拌した。ＴＦＡを窒素の適用により除去し、続いて塩化物イオン交換クロマトグラフィ（ａｍｂｅｒｌｙｓｔ Ａ−２６塩化物イオン交換樹脂を使用）を行った。最終的な化合物をＭｅＯＨ及びアセトンを使用して再結晶化すると０．１５ｇ（収率６７％）の純粋なターゲット化合物Ｘ（脂質１）が白色の固形物として得られた（Ｒ_ｆ＝約０．３、１０％メタノール−クロロホルム、ｖ／ｖ）。

【0089】

^１Ｈ ＮＭＲ：（６００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ＋ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，２ｘＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−］；１．２−１．５［ｍ，５２Ｈ，２ｘ−ＣＨ_２（ＣＨ_２）_１３−］；１．６−２．０［ｍ，６Ｈ，ＬｙｓＣ^γＨ_２，ＬｙｓＣ^δＨ_２，ＬｙｓＣ^βＨ_２，４Ｈ，−Ｎ^＋（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２，２Ｈ，］；２．２［ｄｄ，１Ｈ，ｓｈｉｋ６−Ｈ］；２．８［ｄｄ，１Ｈ，ｓｈｉｋ−６−Ｈ'］；２．９−３．２［ｍ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２，４Ｈ，−Ｎ^＋（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２］；３．３−３．５［ｍ，３Ｈ，−Ｎ^＋ＣＨ_３；２Ｈ，−Ｎ^＋−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；３．５−３．７［ｍ，１Ｈ，ｓｈｉｋ４−Ｈ，２Ｈ，−Ｎ^＋−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；４．０−４．１［ｍ，１Ｈ，ｓｈｉｋ−５−Ｈ］；４．３−４．５［ｍ，１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ，１Ｈ，ｓｈｉｋ３−Ｈ］；６．５［ｓ，１Ｈ，ｓｈｉｋ２−Ｈ］
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝Ｃ_４９Ｈ_９８Ｎ_６Ｏ_５の場合、８５０［Ｍ］^＋及び４２５［Ｍ／２］^＋．

【0090】

実施例２：
カチオン性両親媒性物質２の合成（スキーム２、Ｙ、ｎ＝１３）
ステップ（ｉ）：固形ＨＯＢｔ（０．０９ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（０．１３ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を、５ｍＬのドライＤＣＭ／ドライＤＭＦ（９：１、ｖ／ｖ）中の１，３，４，５−テトラアセトキシシクロヘキサンカルボン酸（０．２４ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）の氷冷撹拌溶液に窒素雰囲気下、連続的に添加した。３０分後、スキーム１通りに調製した中間体ＩＶ（０．３８ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）をドライＤＣＭに溶解させ、反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で一晩撹拌し、過剰量のＤＣＭで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（約３ｘ５０ｍＬ）及び水（約３ｘ５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を回転蒸発により除去した。残留物をカラムクロマトグラフィで精製すると（６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液としてジクロロメタン中の１．５〜２％メタノール（ｖ／ｖ）を使用）、０．３１ｇ（収率５６％）の純粋な中間体Ｖが得られた（Ｒ_ｆ＝０．５、ジクロロメタン中の５％メタノール、ｖ／ｖ）。

【0091】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，２ｘＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−］；１．２−１．７［ｍ，５６Ｈ，２ｘ−ＣＨ_２（ＣＨ_２）_１３−；９Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ_３）_３；４Ｈ，ＬｙｓＣ^γＨ_２，ＬｙｓＣ^δＨ_２］；１．８−２．２［ｍ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^βＨ_２；１２Ｈ，４ｘＣＨ_３］；２．３−２．８［ｍ，４Ｈ，ｑｕｉ６−Ｈ，Ｈ'，ｑｕｉ２−Ｈ，Ｈ'，４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）２，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣＯ］；３．０−３．３［ｍ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；４．４［ｍ，１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］；４．７［ｍ，１Ｈ，ＢＯＣ−ＮＨ］］；４．９−５．１［ｄｄ，１Ｈ，ｑｕｉ４−Ｈ］；５．３−５．４５［ｄｄｄ，１Ｈ，ｑｕｉ５−Ｈ］；５．５−５．６［ｍ，１Ｈ，ｑｕｉ３−Ｈ］
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ_６０Ｈ_１１０Ｎ_４Ｏ_１２の場合、１０８０［Ｍ＋１］^＋

【0092】

ステップ（ＩＩ）：上のステップで調製した中間体Ｖ（０．５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）をドライＤＣＭ（４ｍＬ）に溶解させ、ＴＦＡ（２ｍＬ）を０℃で添加した。得られた溶液を０℃で３時間にわたって撹拌することで完全に脱保護した。過剰量のＴＦＡを窒素フラッシングにより除去した。得られた化合物をクロロホルム（８０ｍＬ）に溶解させ、水性飽和ＮａＨＣＯ_３（３ｘ９０ｍＬ）、ブライン（１ｘ７０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を回転蒸発により除去すると、０．４１ｇ（収率９１％）の遊離アミンが中間体ＶＩとして得られた。

【0093】

ステップ（ＩＩＩ）：塩化第二水銀（０．２８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を、ドライＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２ｍＬ）、トリエチルアミン（１ｍＬ）及びドライジクロロメタン（ＤＣＭ、５ｍＬ）に溶解させた中間体ＶＩ（ステップＩＩで調製。０．４ｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ビス−Ｎ−Ｂｏｃ−チオウレア（０．２ｇ、０．７ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で継続的に撹拌しながら添加した。得られた混合物を０℃、窒素下で４０分間にわたって撹拌し、エチルアセテート（２０ｍＬ）で希釈し、セライトのパッドで濾過した。濾液を水（２ｘ５０ｍＬ）及びブライン溶液（２ｘ５０ｍＬ）で連続的に洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を回転蒸発により除去した。残留物をカラムクロマトグラフィで精製すると（６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液として２〜２．５％メタノール／ジクロロメタン（ｖ／ｖ）を使用）、０．４１ｇの純粋な中間体ＶＩＩが得られた（７１％、Ｒｆ−０．５、５％メタノール／ジクロロメタン、ｖ／ｖ）。

【0094】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，２ｘＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−］；１．２−１．７［ｍ，５６Ｈ，２ｘ−ＣＨ_２（ＣＨ_２）_１３−；１８Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ_３）_３；４Ｈ，ＬｙｓＣ^γＨ_２，ＬｙｓＣ^δＨ_２］；１．８−２．２［ｍ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^βＨ_２；１２Ｈ，４ｘＣＨ_３］；２．３−２．８［ｍ，４Ｈ，ｑｕｉ６−Ｈ，Ｈ'，ｑｕｉ２−Ｈ，Ｈ'，４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣＯ］；３．０−３．３［ｍ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；４．４［ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ^αＣＨ］；４．７［ｍ，１Ｈ，ＢＯＣ−ＮＨ］］；４．９−５．１［ｄｄ，１Ｈ，ｑｕｉ４−Ｈ］；５．３−５．４５［ｄｄｄ，１Ｈ，ｑｕｉ５−Ｈ］；５．５−５．６［ｍ，１Ｈ，ｑｕｉ３−Ｈ］
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝Ｃ_６６Ｈ_１２１Ｎ_６Ｏ_１３の場合、１２２１［Ｍ＋１］^＋

【0095】

ステップ（ｉｖ）：上のステップで調製した中間体ＶＩＩ（０．３ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を２ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５ｍＬのヨウ化メチルを溶液に添加した。反応混合物を室温で６時間にわたって撹拌し、溶媒をロータリーエバポレータで除去した。残留物をカラムクロマトグラフィで精製すると（シリカゲル、６０〜１２０メッシュサイズ、溶離液としてジクロロメタン中の２〜２．５％メタノール（ｖ／ｖ）を使用）、０．１８ｇ（収率５８％）の純粋な中間体ＶＩＩＩが得られた（Ｒ_ｆ＝０．４５、ジクロロメタン中の５％メタノール、ｖ／ｖ）。

【0096】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，２ｘＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−］；１．２−１．５［ｍ，５２Ｈ，２ｘ−ＣＨ_２（ＣＨ_２）_１３−；１８Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ_３）_３］；１．６−１．９［４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；６Ｈ，ＬｙｓＣ^γＨ_２，ＬｙｓＣ^δＨ_２，ＬｙｓＣ^βＨ_２］；２．０−２．３［４ｓ，１２Ｈ，４ｘＣＨ_３］；２．４−２．７［ｄｄ，２Ｈ，ｑｕｉ６−Ｈ，Ｈ'；ｄｄ，２Ｈ，ｑｕｉ２−Ｈ，Ｈ'］；３．１［ｄ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２］；３．２［ｓ，３Ｈ，Ｎ^＋ＣＨ_３］；３．３−３．４［ｍ，４Ｈ，−Ｎ^＋（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２］；３．６−３．８［ｍ，４Ｈ，−Ｎ^＋−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣＯ］；４．３−４．４［ｍ，１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］；４．９−５．１［ｍ，１Ｈ，ＢＯＣ−ＮＨ；１Ｈ，ｑｕｉ４−Ｈ］；５．３−５．４５［ｄｄｄ，１Ｈ，ｑｕｉ５−Ｈ］；５．５−５．６［ｄ，１Ｈ，ｑｕｉ３−Ｈ］
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ_６７Ｈ_１２４Ｎ_６Ｏ_１３の場合、１２３６［Ｍ］^＋

【0097】

ステップ（ｖ）：上のステップで調製した中間体ＶＩＩＩ（０．１８ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を２ｍＬのメタノールに溶解させ、Ｋ_２ＣＯ_３（０．１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加することでｐＨを約９に上昇させた。反応混合物を室温で３０分間にわたって撹拌し、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０（Ｈ^＋）で中和し、濾過し、濾液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒をロータリーエバポレータで除去すると、０．１１ｇ（収率７２％）の中間体ＩＸが得られた（Ｒ_ｆ＝約０．６、２０％メタノール−クロロホルム、ｖ／ｖ）。

【0098】

ステップ（ｖｉ）、（ｖｉｉ）：２ｍＬのドライＤＣＭに溶解させた上のステップで調製した中間体ＩＸ（０．１ｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、０．６ｍｌのＴＦＡを添加し、混合物を３〜４時間にわたって撹拌した。ＴＦＡを窒素の適用により除去し、続いて塩化物イオン交換クロマトグラフィを行った（ａｍｂｅｒｌｙｓｔ Ａ−２６塩化物イオン交換樹脂を使用）。最終的な化合物をＭｅＯＨ及びアセトンを使用して再結晶化すると０．０８ｇ（収率７５％）の純粋なターゲット化合物Ｙが白色の固形物として得られた（Ｒ_ｆ＝約０．３、１０％メタノール−クロロホルム、ｖ／ｖ）。

【0099】

^１Ｈ ＮＭＲ：（６００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ＋ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−］；１．２−１．５［ｍ，５２Ｈ，｛−ＣＨ_２（ＣＨ_２）_１３−｝_２；２Ｈ，ＬｙｓＣ^δＨ_２］；１．６５−２．２［ｍ，４Ｈ，−Ｎ^＋（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；２Ｈ，ＬｙｓＣ^βＨ_２，ＬｙｓＣ^γＨ_２；２Ｈ，ｑｕｉ６−Ｈ，Ｈ'；２Ｈ，ｑｕｉ２−Ｈ，Ｈ'］；２．９−３．７［ｍ，４Ｈ，−Ｎ^＋（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；３Ｈ，−Ｎ^＋ＣＨ_３；２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２；４Ｈ，−Ｎ^＋−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ；１Ｈ，ｑｕｉ４−Ｈ］；４．０−４．２［ｍ，２Ｈ，ｑｕｉ−３Ｈ，ｑｕｉ−５Ｈ］；４．４［ｍ，１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ_４９Ｈ_１００Ｎ_６Ｏ_６の場合、８６８［Ｍ］^＋ ４３４［Ｍ／２］^＋

【0100】

実施例３：
コントロール用マンノシル化脂質３の合成（スキーム３）：
ステップ（ｉ）：固形ＨＯＢｔ（０．３６ｇ、２．３ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（０．４５ｇ、２．３ｍｍｏｌ）を、５ｍＬのドライＤＣＭ／ドライＤＭＦ（９：１、ｖ／ｖ）中の２−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）酢酸（０．７４ｇ、２．３ｍｍｏｌ）の氷冷撹拌溶液に窒素雰囲気下、連続的に添加した。３０分後、中間体Ｎ−２−［（Ｎ^ε−Ｚ−Ｌ−リシル）］アミノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサデシルアミン（１．２ｇ、１．５ｍｍｏｌ。Ｐｒａｍａｎｉｋ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００８；５１：７２９８−７３０２に記載される通りに調製）をドライＤＣＭに溶解させ、反応混合物に添加した。得られた溶液を室温で一晩撹拌し、過剰量のクロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（約３ｘ５０ｍＬ）及び水（約３ｘ５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を回転蒸発により除去した。残留物をカラムクロマトグラフィで精製すると（６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液としてクロロホルム中の１〜１．５％メタノール（ｖ／ｖ）を使用）、１．６ｇ（収率７３％）の純粋な中間体ＩＩＩが得られた（Ｒ_ｆ＝０．５、ジクロロメタン中の５％メタノール、ｖ／ｖ）。

【0101】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，２ｘＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−］；１．０−１．１［ｍ，９Ｈ，−Ｃ（ＣＨ_３）_３］；１．２−１．５［ｍ，５２Ｈ，２ｘ−（ＣＨ_２）_１３；４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；４Ｈ，ＬｙｓＣ^γＨ_２，ＬｙｓＣ^δＨ_２］；１．８−１．９［ｍ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^βＨ_２］；２．４−２．５［ｔ，４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２］；２．５−２．６［ｔ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；３．０−３．２［ｍ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２］；３．２５−３．４［ｍ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；４．０−４．１［ｓ，２Ｈ，−ＣＨ_２−Ｏ−Ｓｉ−］；４．３−４．４［ｍ，１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］；４．９−５．０［ｍ，−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_５；−ＣＨ_２−Ｏ−Ｓｉ−］；７．２−７．７［ｍ，１５Ｈ，−（Ｃ_６Ｈ_５）_３
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ_６６Ｈ_１１０Ｎ_４Ｏ_５Ｓｉの場合、１０６９［Ｍ＋２］^＋

【0102】

ステップ（ｉｉ）：上のステップで調製した中間体ＩＩＩ（１．２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をドライＴＨＦに溶解させ、三級ブチルアンモニウムフルオリド（０．６ｇ、２．３ｍｍｏｌ）をゆっくりと０℃で添加した。得られた溶液を室温で２時間にわたって撹拌し、過剰量のクロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（約３ｘ５０ｍＬ）及び水（約３ｘ５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を回転蒸発により除去した。残留物をカラムクロマトグラフィで精製すると（６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液としてクロロホルム中の１．５〜２％メタノール（ｖ／ｖ）を使用）、１ｇ（収率８０％）の純粋な中間体ＩＶが得られた（Ｒ_ｆ＝０．３、クロロホルム中の５％メタノール、ｖ／ｖ）。

【0103】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１１−］；１．０−２．０［ｍ，５２Ｈ，−（ＣＨ_２）_１３；４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；６Ｈ，ＬｙｓＣ^γＨ_２，ＬｙｓＣ^δＨ_２，ＬｙｓＣ^βＨ_２］；２．９−３．１［ｍ，４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２；２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；３．４−３．６［ｍ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；３．９−４．３［ｍ，２Ｈ，−ＣＨ_２−Ｏ−Ｓｉ−；１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］；５．０−５．２［ｍ，−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_５；−ＮＨＺ］；７．２−７．７［ｍ，１５Ｈ，−（Ｃ_６Ｈ_５）_３］
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ_５０Ｈ_９２Ｎ_４Ｏ_５の場合、８３０［Ｍ＋１］^＋

【0104】

ステップ（ｉｉｉ）：上のステップで調製した中間体ＩＶ（０．９ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）及びマンノースから調製した中間体（０．７ｇ、１．４ｍｍｏｌ。Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０；３１７：９９２−９９９の通りに調製）をドライＤＣＭに窒素雰囲気下で溶解させ、ホウ素トリフルオリドエチルエーテラート（０．２ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を−２０℃で添加した。得られた溶液を−２０℃で２時間にわたって撹拌し、過剰量のクロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（約３ｘ５０ｍＬ）及び水（約３ｘ５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を回転蒸発により除去した。残留物をカラムクロマトグラフィで精製すると（１００〜２００メッシュシリカゲル、溶離液としてクロロホルム中の１〜１．５％メタノール（ｖ／ｖ）を使用）、０．５ｇ（収率５１％）の純粋な中間体Ｖが得られた（Ｒ_ｆ＝０．５、クロロホルム中の５％メタノール、ｖ／ｖ）。

【0105】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，（ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−）_２］；１．２−１．９［ｍ，５２Ｈ，−（ＣＨ_２）_１３；４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；６Ｈ，ＬｙｓＣ^δＨ_２，ＬｙｓＣ^βＨ_２，ＬｙｓＣ^γＨ_２］；２．０−２．２［４ｓ，１２Ｈ，４ｘ−ＣＯ−ＣＨ_３］；２．５−２．８［ｍ，４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；３．１−３．４［ｍ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２；２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ；３Ｈ，５−Ｈ］；４．０−４．４［ｍ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−Ｏ−；２Ｈ，−ＣＨ_２−ＯＣＯＣＨ_３，１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］；４．８［ｓ，１Ｈ，１−Ｈ］；５．０［ｓ，−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_５］；５．２−５．４［ｍ，３Ｈ，２−Ｈ，３−Ｈ，４−Ｈ］；７．２−７．７［ｍ，５Ｈ，−（Ｃ_６Ｈ_５）］
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ_６４Ｈ_１１０Ｎ_４Ｏ_１４の場合、１１６０［Ｍ＋１］^＋

【0106】

ステップ（ｉｖ）：上のステップで調製した中間体Ｖ（０．５ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を８ｍＬのメタノール及び２滴の２Ｎ塩酸に溶解させた。Ｐｄ（ＯＨ）_２／Ｃ（０．２ｇ）を反応混合物に添加し、空気を除去した。得られた反応混合物を室温で１４時間にわたって水素雰囲気（２気圧）下で撹拌した。反応混合物をセライトを使用して濾過し、濾液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾液の溶媒を回転蒸発により除去すると０．４ｇ（収率９０％）の純粋な中間体ＶＩが得られた（Ｒ_ｆ＝約０．４、１０％メタノール−クロロホルム、ｖ／ｖ）。

【0107】

ステップ（Ｖ）：塩化第二水銀（０．２８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を、ドライＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２ｍＬ）、トリエチルアミン（１ｍＬ）及びドライジクロロメタン（ＤＣＭ、５ｍＬ）に溶解させた中間体ＶＩ（ステップＩＶで調製。０．４ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、ビス−Ｎ−Ｂｏｃ−チオウレア（０．２ｇ、０．７ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で継続的に撹拌しながら添加した。得られた混合物を０℃、窒素下で４０分間にわたって撹拌し、エチルアセテート（２０ｍＬ）で希釈し、セライトのパッドで濾過した。濾液を水（２ｘ５０ｍＬ）及びブライン溶液（２ｘ５０ｍＬ）で連続的に洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濾液の溶媒を回転蒸発により除去した。残留物をカラムクロマトグラフィで精製すると（６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液として２〜２．５％のメタノール／ジクロロメタン（ｖ／ｖ）を使用）、０．４１ｇの純粋な中間体ＶＩＩ（７１％、Ｒｆ＝０．５、５％メタノール／ジクロロメタン、ｖ／ｖ）が得られた。

【0108】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，（ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−）_２］；１．２−１．９［ｍ，５２Ｈ，−（ＣＨ_２）_１３；４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；６Ｈ，ＬｙｓＣ^δＨ^２，ＬｙｓＣ^βＨ_２，ＬｙｓＣ^γＨ_２；１８Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ_３）_３］；２．０−２．２［４ｓ，１２Ｈ，４ｘ−ＣＯ−ＣＨ_３］；２．５−２．８［ｍ，４Ｈ，−Ｎ（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ］；３．１−３．４［ｍ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２；２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ；３Ｈ，５−Ｈ］；４．０−４．４［ｍ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−Ｏ−；２Ｈ，−ＣＨ_２−ＯＣＯＣＨ_３，１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］；４．８［ｓ，１Ｈ，１−Ｈ］；５．２−５．４［ｍ，３Ｈ，２−Ｈ，３−Ｈ，４−Ｈ］
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ_６７Ｈ_１２３Ｎ_６Ｏ_１６の場合、１２６７［Ｍ＋１］^＋

【0109】

ステップ（ｖｉ）：上のステップで調製した中間体ＶＩＩ（０．２ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を３ｍＬのクロロホルムに溶解させ、１０ｍＬのヨウ化メチルを溶液に添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、溶媒をロータリーエバポレータで除去した。残留物をカラムクロマトグラフィで精製すると（シリカゲル、６０〜１２０メッシュサイズ、溶離液としてクロロホルム中の２〜２．５％メタノール（ｖ／ｖ）を使用）、０．１５ｇ（収率８２％）の純粋な中間体ＶＩＩＩが得られた（Ｒ_ｆ＝０．４、クロロホルム中の５％メタノール、ｖ／ｖ）。

【0110】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，２ｘＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−］；１．２−１．５［ｍ，５２Ｈ，２ｘ−（ＣＨ_２）_１３；２Ｈ，ＬｙｓＣ^γＨ_２］；１．７−１．９［ｍ，４Ｈ，−Ｎ^＋（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；２Ｈ，ＬｙｓＣ^βＨ_２，２Ｈ，ＬｙｓＣ^δＨ_２；１８Ｈ，ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ_３）_３］；２．０−２．２［４ｓ，１２Ｈ，４ｘ−ＣＯ−ＣＨ_３］；３．１−３．５［ｍ，３Ｈ，−Ｎ^＋−ＣＨ_３；２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２；４Ｈ−Ｎ^＋（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；１Ｈ，５−Ｈ］；３．６−３．８［ｍ，４Ｈ，−Ｎ^＋−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−］；４．０−４．４［ｍ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−Ｏ−；２Ｈ，−ＣＨ_２−ＯＣＯＣＨ_３］；４．５［ｄｄ，１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］；４．８［ｓ，１Ｈ，１−Ｈ］；５．２−５．４［ｍ，３Ｈ，２−Ｈ，３−Ｈ，４−Ｈ］
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ_６８Ｈ_１２６Ｎ_６Ｏ_１６の場合、１２８２［Ｍ］^＋

【0111】

ステップ（ｖｉｉ）：上のステップで調製した中間体ＶＩＩＩ（０．１５ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を２ｍＬのメタノールに溶解させ、Ｋ_２ＣＯ_３（０．１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加することでｐＨを約９まで上昇させた。反応混合物を室温で３０分間にわたって撹拌し、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０（Ｈ^＋）で中和し、濾過し、濾液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒をロータリーエバポレータで除去すると０．１ｇ（収率７５％）の中間体ＩＸが得られた（Ｒ_ｆ＝約０．６、２０％メタノール−クロロホルム、ｖ／ｖ）。

【0112】

ステップ（ｖｉｉｉ）：２ｍＬのドライＤＣＭに溶解させた上のステップで調製した中間体ＩＸ（０．１ｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に０．６ｍｌのＴＦＡを添加し、混合物を３〜４時間にわたって撹拌した。ＴＦＡを窒素の適用により除去し、続いて塩化物イオン交換クロマトグラフィを行った（ａｍｂｅｒｌｙｓｔ Ａ−２６塩化物イオン交換樹脂を使用）。最終的な化合物をＭｅＯＨ及びアセトンを使用して再結晶化すると０．０８ｇ（収率７５％）の純粋なターゲット化合物３が白色の固形物として得られた（Ｒ_ｆ＝約０．２、２０％メタノール−クロロホルム、ｖ／ｖ）。

【0113】

^１Ｈ ＮＭＲ：（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３＋ＣＤ_３ＯＤ）：δ／ｐｐｍ＝０．９［ｔ，６Ｈ，２ｘＣＨ_３−（ＣＨ_２）_１３−］；１．２−１．５［ｍ，５２Ｈ，２ｘ−（ＣＨ_２）_１３］；１．５−１．９［４Ｈ，−Ｎ^＋（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；６Ｈ，ＬｙｓＣ^βＨ_２，ＬｙｓＣ^γＨ_２，ＬｙｓＣ^δＨ_２］；２．９−３．１［ｍ，２Ｈ，ＬｙｓＣ^ωＨ_２；３Ｈ，−Ｎ^＋−ＣＨ_３；４Ｈ−Ｎ^＋（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）_２；２Ｈ，−Ｎ^＋−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−］；３．５−４．０［４Ｈ，２−Ｈ，３−Ｈ，４−Ｈ，５−Ｈ；２Ｈ，−ＣＨ_２−ＯＨ；２Ｈ，−Ｎ^＋−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−］；４．０−４．４［ｍ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−Ｏ−；１Ｈ，ＬｙｓＣ^αＨ］；４．９［ｓ，１Ｈ，１−Ｈ］
ＥＳ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ_５０Ｈ_１０３Ｎ_６Ｏ_８の場合、９５４［Ｍ］^＋ ４５７［Ｍ／２］^＋

【0114】

実施例４：
樹状細胞におけるカチオン性両親媒性物質１〜３のマンノース受容体特異的遺伝子導入有効性の評価
プラスミドＤＮＡの調製。ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌ、ｐ−ＣＭＶ−チロシナーゼ及びｐ−ＣＭＶ−ｇｐ１００をＲＡＳ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ハイデラバード、インド）から購入した。プラスミドを、過去に記載されたように、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＤＨ５α株で増幅し、アルカリ溶解法で単離し、最後にＰＥＧ−８０００沈殿により精製した（Ｋａｒｍａｌｉ ＰＰ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００４；４７：２１２３−２１３２）。プラスミドの純度をＡ_２６０／Ａ_２８０比（約１．９）及び１％アガロースゲル電気泳動によりチェックした。

【0115】

リポソームの調製。リポソームを慣用の方法により調製した。簡単に説明すると、適当なモル比の脂質及び共脂質（コレステロール、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ）をクロロホルムに溶解させた。次に、溶媒を薄い窒素ガス流下で蒸発させ、８時間にわたって真空乾燥させ、脱イオン水中で一晩水和させると、インビトロ実験用の１ｍＭ又はインビボ実験用の５ｍＭの最終脂質濃度が得られた。水和させた脂質膜をまず３０秒間にわたってボルテックスし、次に清澄になるまでＢｒａｎｓｏｎ ４５０ ｓｏｎｉｆｉｅｒをデューティサイクル１００％、出力２５Ｗで使用して超音波処理した。得られた清澄なリポソーム水溶液をリポプレックスの調製に使用した。

【0116】

樹状細胞の単離。初代ｍｂｍＤＣを過去に記載の手順を用いて単離した（Ｉｎａｂａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９２；１７６：１６９３−１７０２）。簡単に説明すると、オスのＣ５７ＢＬ／６マウスの脛骨及び腓骨から採取した骨髄をナイロンメッシュに通して骨及びデブリを除去し、完全ＤＣ培地（１０％のＦＢＳ、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、２ｍＭのグルタミン、１％のＮＥＡＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４、１％の抗生物質溶液を含有するＲＰＭＩ−１６４０）に再懸濁させた。２日毎に細胞に新鮮なＤＣ培地を補充した。６日後、凝集した細胞を、ＲＰＭＩを接着性ストローマ細胞上にやさしくピペッティングすることで移動させた。移動させた細胞をまとめて取りだし、２８０ｇで１０分間にわたって室温で遠心分離した。上清を廃棄した。まずペレットを完全ＤＣ培地に１ｘ１０^６細胞／ｍＬで再懸濁させ、最後に１００ｍｍ細胞培養ペトリ皿に１ｘ１０^７細胞／皿で置いた（１皿あたり培地は１０ｍＬ）。２４時間後、ペトリ皿をやさしく回し揺らすことで非接着性細胞を回収し、トランスフェクション及びフローサイトメトリ実験に使用した。培養物を、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃で維持した。

【0117】

ＤＣ−トランスフェクション。まず、脂質１、２、３のトランスフェクション効率をマウス骨髄由来樹状細胞において評価した。これを目的として、上記のプロトコルにしたがって、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４と共に培養することで、未熟樹状細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの骨髄から単離した。未熟樹状細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０及びマンノース受容体を含めた標準的なＤＣマーカーに関して、ＤＣを、これらのＤＣマーカー用のＦＩＴＣ／ＰＥ抱合型モノクローナル抗体で処理することで特徴付けした。ＤＣマーカーのプロファイルをフローサイトメトリでモニタした。フローサイトメトリでの発見は、高細胞内レベルのＭＨＣクラスＩＩ分子、低ＣＤ８６、高レベルのＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０及びマンノース受容体を有する未熟ＤＣの特徴を裏付けた（図１）。単離したＤＣの表面上でこれらの期待されるＤＣマーカーの存在を確認した後、カチオン性両親媒性物質１，２、３のトランスフェクション効率をｍｂｍＤＣで評価した。単離したＤＣを６ウェルプレートに１ｘ１０^６細胞／ウェルで播種した。緑色蛍光タンパク質をコードしている３μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐα５ＧＦＰ）及び８ｎｍｏｌのカチオン性両親媒性物質１、２、３を含有するリポプレックスを細胞に添加し、５％ＣＯ_２の無血清培地において４時間にわたって３７℃でインキュベートした。４時間のインキュベーション後、培地を完全ＤＣ培地と交換し、１８時間にわたって３７℃、５％ＣＯ_２の存在下でインキュベートした。カチオン性両親媒性物質１、２、３のトランスフェクション効率をフローサイトメトリ分析により測定した。図２にまとめた発見は、遺伝子の樹状細胞への送達におけるカチオン性両親媒性物質１、２の有効性がそのマンノシル類似体３のものより優れていることをはっきりと実証している。

【0118】

実施例６：
樹状細胞をベースとした遺伝子免疫化における体液性及び細胞性免疫応答の誘起
マウスの免疫化：生後６〜８週間のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（それぞれ体重２０〜２２ｇ、ｎ＝５）を、脂質１〜３とｐ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ又は脂質１とｐ−ＣＭＶ−Ｇｐ−１００、１とｐ−ＣＭＶ−チロシナーゼ（５％グルコース溶液中１５０μｌ、１５μｇのＤＮＡ、４：１の脂質：ＤＮＡ比）のリポプレックスだけを３回、７日間隔で皮下投与することで免疫化した。３回目の免疫化から２週間後、マウスを屠殺し、血清及び脾臓を免疫応答アッセイのために回収した又はＢ１６Ｆ１メラノーマ細胞に曝露した。

【0119】

実施例７：
ＥＬＩＳＡアッセイによる抗β−ｇａｌ抗体の測定（体液性応答）。抗β−ｇａｌ抗体を、過去に記載されている通りに、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）アッセイを用いて測定した（ＭｃＫｅｅｖｅｒ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２００２；２０：１５２４−１５３１）。簡単に説明すると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにβ−ｇａｌタンパク質（０．３μｇ／ウェル）をＰＢＳで調製した５μｇ／ｍＬの原液を使用してコーティングした。プレートをＰＢＳ（３ｘ２００μＬ）で洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで室温で２時間にわたってブロックした。次に、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（３ｘ２００μＬ）を含有するＰＢＳで洗浄し、マウスの血清（１００μＬ）と共に室温で２時間にわたってインキュベートした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで再度洗浄し（３ｘ２００μＬ）、１００μＬの希釈（１：１０００）ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合型抗マウス抗体を各ウェルに添加した。プレートを室温で２時間にわたってインキュベートし、結合していない抗体−ＨＲＰ抱合体を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳでプレートを洗浄することで除去した（３ｘ２００μＬ）。次に、プレートを暗所にて各ウェルあたり１００μＬのＡＢＴＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＵＳＡ）と共に室温で１０分間にわたってインキュベートし、吸光度を４０５ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、ＵＫ）により測定した。図１０のパートＡにまとめた発見は、カチオン性両親媒性物質１、２のリポソームを事前にトランスフェクトしたＤＣの投与が、マンノシル類似体３のリポソームを事前にトランスフェクトしたＤＣを投与する場合より高い抗β−ｇａｌ抗体応答を引き出したことを実証している。言い換えると、図１０のパートＡにまとめた発見は、モデルＤＮＡワクチンと本明細書で開示のカチオン性両親媒性物質のリポソームとの複合体を事前にトランスフェクトしたＤＣでマウスを免疫化すると、モデルＤＮＡワクチンにコードされた抗原に対する効率的な抗原特異的体液性免疫応答を誘発可能であることを説得力高く実証している。

【0120】

実施例８：
ＥＬＩＳＡアッセイによるインシチュＩＦＮ−γ（細胞性免疫応答）及びＩＬ−４（体液性免疫応答）。ＣＤ４^＋Ｔｈ細胞は、そのヘルパー機能を分泌サイトカインを介して示す。２つのＴｈ細胞サブセット（Ｔｈ１及びＴｈ２）間でのサイトカイン分泌パターンの差が、特定の抗原による攻撃に対して開始される免疫応答のタイプを決定する。Ｔｈ１サブセットは、細胞媒介免疫応答、例えばＴｃ細胞の活性化の開始に関与し、Ｔｈ２サブセットは体液性応答、例えば抗体産生Ｂ細胞の活性化を刺激する。Ｔｈ１及びＴｈ２細胞が分泌する２種の決定サイトカインはそれぞれインターフェロンガンマ（ＩＮＦ−γ）及びインターロイキン−４（ＩＬ−４）である（Ｒｅｎｇａｒａｊａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２０００；２１：４７９−４８３）。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４ ＥＬＩＳＡアッセイを、過去に記述された通りに行った（ＭｃＫｉｎｎｅｙ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０００；２３７：１０５）。最後の免疫化から２週間後、マウスを屠殺し、その脾臓を回収した。脾臓をシリンジプランジャで細かく刻むことで脾細胞を単離し、赤血球を１ｍＬの溶解バッファで溶解した（０．０２ＭトリスＨＣｌ中の０．１４Ｍ塩化アンモニウム、ｐＨ７．２）。生存細胞を血球計数器で数え、（インビトロで再刺激することなく）速やかにインターフェロン−γ及びＩＬ−４ ＥＬＩＳＡアッセイに使用した。アッセイを、製造業者のプロトコルにしたがって行った（Ｅｎｄｏｇｅｎ Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ Ｅｌｉｓａキット、マウスＩＬ−４ Ｅｌｉｓａキット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）。簡単に説明すると、脾細胞を、抗マウスＩＦＮ−γ又は抗マウスＩＬ−４抗体を事前にコーティングした９６ウェルプレートで、１ｘ１０^６細胞／ウェル、５０μＬの完全培地でインキュベートした。プレートをカバーし、１２時間にわたって３７℃、５％ＣＯ_２の存在下でインキュベートした。次に、細胞を洗浄バッファ（３ｘ２００μＬ）で洗い流し、５０μＬのビオチニル化二次抗体を各ウェルに加え、１時間にわたって室温でインキュベートした。プレートを洗浄バッファ（３ｘ２００μＬ）で洗浄し、１００μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液と共に３０分間にわたってインキュベートした。プレートを洗浄バッファ（３ｘ２００μＬ）で再度洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質溶液で処理し、３０分間にわたって暗所でインキュベートした。１００μＬの停止液を添加することで反応を停止させ、吸光度をマイクロプレートリーダにより４５０ｎｍで測定した。

【0121】

実施例９：
腫瘍チャレンジ実験。Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞をＴ２５培養フラスコから１ｍＬの細胞剥離溶液（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を使用して収穫し、ＰＢＳで洗浄し（２ｘ５００μＬ）、５ｘ１０^５細胞／ｍＬでＨＢＳＳに再懸濁させた。最後の免疫化から２週間後、２００μＬのＨＢＳＳ中の１ｘ１０^５個のＢ１６Ｆ１細胞を生後６〜８週間のメスのＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス（ｎ＝５）に注射した（皮下）。２週間後、目視検査及び触診を行うことで腫瘍の検出を行い、腫瘍があった場合は、直角方向の腫瘍直径の測定を毎日行った。測定値が１４を超えているならば、マウスを安楽死させた。

【0122】

本発明の利点
本発明の方法は、マンノース模倣カチオン性両親媒性物質を有するカチオン性両親媒性物質の調製方法、また遺伝子免疫化において生物学的に活性な化合物、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等を抗原提示細胞に送達するのに利用することができる。本発明は、ポリアニオン、ポリペプチド又はヌクレオポリマーを抗原提示細胞にマンノース受容体特異的に送達するのに特に有用である。本発明は、本明細書に記載のカチオン性両親媒性物質から調製するリポソームと抗原決定因子をコードしているポリヌクレオチドとの複合体の投与を通じて動物において免疫応答を引き出す方法を対象とする。さらに、本発明は、本明細書に記載のカチオン性両親媒性物質と感染性疾患を引き起こすタンパク質をコードしているポリヌクレオチドとの複合体の投与を通じて動物において感染性疾患に対する能動免疫を引き出す方法も対象とする。本発明は、ポリヌクレオチドが感染性疾患を引き起こす免疫原の抗原決定因子をコードしているＤＮＡ配列を含む発現ベクターであり且つＤＮＡの転写がプロモータの制御下にある遺伝子免疫化方法にも関する。本発明はさらに、ポリヌクレオチドが感染性免疫原をコードしているＲＮＡ分子である遺伝子免疫化を対象とする。特には、マンノース模倣シキミ酸及びキナ酸頭部基を有する本明細書で開示の新規なカチオン性両親媒性物質は、遺伝子免疫化において、感染性免疫原をコードしているＤＮＡ又はＲＮＡの送達に将来的に利用できる可能性を秘めている。本発明の別の際立った特徴は、本明細書で開示の新規なカチオン性両親媒性物質の樹状細胞（最もプロフェッショナルな抗原提示細胞）トランスフェクション効率が、Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０；５３：１３８７−１３９１で最近開示されたシキミ酸及びキナ酸頭部基を有する第１世代カチオン性両親媒性物質のものより約４〜５倍優れていることである。本発明の最も重要な実施形態は、免疫化マウスを致死量の侵襲性メラノーマ腫瘍に曝露した後の長期間にわたる抗腫瘍効果を引き出すことである。本発明で開示の発見は、（ａ）骨が折れ且つコストが高くつく自家樹状細胞の単離、（ｂ）単離したＤＣへのＤＮＡワクチンのエクスビボでのトランスフェクション及び（ｃ）レシピエントの体内へのトランスフェクション後のＤＣの再移植の必要性を回避するものである。これらをまとめると、本発明により、遺伝子免疫化は単純且つ費用効率が高いものとなる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】