特許 6362209 抗血液凝固剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6362209

(24)【登録日】2018年7月6日

(45)【発行日】2018年7月25日

(54)【発明の名称】抗血液凝固剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20180712BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20180712BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20180712BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20180712BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 NZNA

   A61P9/10

   A61P7/02

   !C07K16/28

【請求項の数】3

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2013-273308(P2013-273308)

(22)【出願日】2013年12月27日

(65)【公開番号】特開2015-127309(P2015-127309A)

(43)【公開日】2015年7月9日

【審査請求日】2016年12月27日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ・ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｋａｋｅｎ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｄ／ｐ／２２３９００５１／２０１１／３／ｊａ．ｊａ．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐ：／／ｋａｋｅｎ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｊａ／ｈｅｌｐ／ｎｅｗｓ．ｈｔｍｌ 掲載日 平成２５年７月１０日

(73)【特許権者】

【識別番号】510094724

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立循環器病研究センター

(73)【特許権者】

【識別番号】504180239

【氏名又は名称】国立大学法人信州大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】沢村 達也

(72)【発明者】

【氏名】藤田 佳子

(72)【発明者】

【氏名】垣野 明美

【審査官】 天野 貴子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／１４７１７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００１−５０６５７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０８−０７３３６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０１３０８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−１０９４３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−３２６９５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−００６３２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 REIN D. et al，The Journal of Nutrition，２０００年，vol.130, no.8 Supplement，pp.2120S-2126S

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ７／０２

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ｃ０７Ｋ １６／２８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＬＯＸ−１と第Ｖ因子および第Ｖａ因子のうちの少なくとも一方との結合を阻害する結合阻害成分を含有し、
上記結合阻害成分は、抗ＬＯＸ−１抗体であることを特徴とする抗血液凝固剤。

【請求項2】

上記結合阻害成分は、ＬＯＸ−１と、第Ｖ因子および第Ｖａ因子のうちの少なくとも一方のＨ鎖との結合を阻害する結合阻害成分であることを特徴とする請求項１に記載の抗血液凝固剤。

【請求項3】

上記結合阻害成分は、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子および第Ｖａ因子のうちの少なくとも一方のＡ２ドメインとの結合を阻害する結合阻害成分であることを特徴とする請求項２に記載の抗血液凝固剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗血液凝固剤、および当該抗血液凝固剤を含有する薬学的組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、ワーファリンに代わる抗血液凝固剤として、トロンビン阻害剤であるアルガトロバン、ダビガトラン、補助因子にアンチトロンビンＩＩＩを要求する間接第Ｘａ因子阻害剤であるフォンダパリヌクス、直接第Ｘａ因子阻害剤であるリバーロキサバン、エドキサバン、アピキサバンが用いられるようになっている。

【0003】

ところで、低密度リポタンパク質（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（以下「ＬＤＬ」という。））の酸化によって生成する酸化ＬＤＬは、動脈硬化に対して促進的に機能することが分かっており、血中の酸化ＬＤＬ量を低減することにより、抗動脈硬化作用が奏される。

【0004】

酸化ＬＤＬによる動脈硬化促進作用は、酸化ＬＤＬがレクチン様酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１；Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）を介して血管内皮細胞に取り込まれるために生ずると考えられている。ＬＯＸ−１は、血管内皮細胞の酸化ＬＤＬ受容体として同定されたが、現在では、炎症、動脈硬化、血栓、心筋梗塞、カテーテル治療後の血管再狭窄等の循環器疾患を促進する因子として知られている。例えば、ＬＯＸ−１の発現は、正常な血管においては非常に低く、動脈硬化巣、カテーテル傷害後の血管、炎症の血管等において高くなる。また、血液中の可溶型ＬＯＸ−１は、急性冠症候群や、閉塞性動脈硬化症において、特に顕著に増加している（非特許文献１）。

【0005】

特許文献１には、哺乳類の血管内皮細胞の変性低密度リポタンパク質受容体をコードする領域から実質的になるＤＮＡ配列、および、抗ＬＯＸ−１抗体等が開示されている。

【0006】

特許文献２には、ＬＯＸ−１が血小板と結合し、細胞内に取り込まれること、またＬＯＸ−１に結合する物質によって当該結合および取り込みが阻害されることが記載されている。また、特許文献３には、ヒトＬＯＸ−１に結合するヒトモノクローナル抗体が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開平９−９８７８７号公報（１９９７年４月１５日公開）

【特許文献2】特開２０００−１０９４３５号公報（２０００年４月１８日公開）

【特許文献3】国際公開第０１／０６４８６２号（２００１年９月７日公開）

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Hayashida K et al. Circulation, 112:812-818, 2005

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかしながら、上述のような従来の抗血液凝固剤では、大出血のリスクを高めずに、病的な血液凝固反応を選択的に抑制することができないという問題がある。換言すれば、正常な止血のための凝固反応を抑制せずに、血栓症等を引き起こす病的な凝固反応を選択的に抑制することができないという問題がある。

【0010】

ワーファリンも含め、上記薬剤は血液凝固系のプロテアーゼカスケードにおける最も主要なプロテアーゼを阻害する。そのため、凝固抑制能は非常に強いが、同時に大出血を起こすリスクをはらんでいる。そして、このような副作用は、薬剤の本来の作用である血液凝固抑制作用と表裏一体であるので、防ぐことが困難である。新しく開発されたトロンビン阻害剤および第Ｘａ因子阻害剤では、ワーファリンに比べて大出血の発現率は少ないとされている（Connolly SJ, N. Engl. J. Med., 363:1875-1876, 2010; Patel MR, N. Engl. J. Med., 365:883-891, 2011; Granger CB, N. Engl. J. Med., 365:981-992, 2011）。それでもやはり、副作用を防ぐため、第Ｘａ因子阻害剤に対する阻害剤の開発が話題になるのが実情である（Lu G, Nature Med., 19:446-451, 2013）。

【0011】

本発明は上記従来の問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は大出血のリスクを高めずに、病的な血液凝固反応を選択的に抑制する抗血液凝固剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

上記課題を解決するために本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことにＬＯＸ−１が第Ｖ因子または第Ｖａ因子と複合体を形成し、血液凝固反応を促進するという全く新しい知見が得られた。本発明者らは、この新しい知見に基づき、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子または第Ｖａ因子との結合を阻害することで、ＬＯＸ−１が関与しない血液凝固カスケードを保ったまま、ＬＯＸ−１が関与する血液凝固反応を選択的に抑制し得るということを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下の発明を包含する。

【0013】

本発明に係る抗血液凝固剤は、上記の課題を解決するために、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子および第Ｖａ因子のうちの少なくとも一方との結合を阻害する結合阻害成分を含有することを特徴としている。

【0014】

上述のように、ＬＯＸ−１の発現は、正常な血管においては非常に低く、動脈硬化巣、カテーテル傷害後の血管、炎症の血管等において高くなることが知られている。よって、ＬＯＸ−１は主に、正常血管とは異なる上記病的血管および病的状態において、血液凝固反応を促進していると考えられる。

【0015】

本発明に係る抗血液凝固剤によれば、ＬＯＸ−１が関与しない血液凝固カスケードを保ったまま、ＬＯＸ−１が関与する血液凝固反応を選択的に抑制することができる。従って、大出血のリスクを高めずに、病的な血液凝固反応を選択的に抑制することができる。

【0016】

本発明に係る抗血液凝固剤において、上記結合阻害成分はＬＯＸ−１と第Ｖ因子および第Ｖａ因子のうちの少なくとも一方のＨ鎖との結合を阻害する結合阻害成分であってもよい。

【0017】

本発明に係る抗血液凝固剤において、上記結合阻害成分はＬＯＸ−１と第Ｖ因子および第Ｖａ因子のうちの少なくとも一方のＡ２ドメインとの結合を阻害する結合阻害成分であってもよい。

【0018】

上記結合阻害成分は抗ＬＯＸ−１抗体であってもよい。

【0019】

上記結合阻害成分はポリフェノールであってもよい。

【0020】

さらに本発明は、本発明に係る抗血液凝固剤を含有することを特徴とする薬学的組成物をも包含する。

【0021】

なお、特許文献１においては、血液凝固反応の抑制について検討されておらず、ＬＯＸ−１を利用すれば、診断に用いることができる抗ＬＯＸ−１抗体を調製できることが開示されているに過ぎない。

【0022】

特許文献２では、血小板とＬＯＸ−１との結合に対する抗ＬＯＸ−１抗体による阻害効果については確認されている。また、特許文献３では、細胞内への酸化ＬＤＬの取込みに対する抗ＬＯＸ−１抗体による阻害効果、および、動脈の血栓形成に対する抑制効果等が確認されている。特許文献２および３に記載の技術は、主に血小板とＬＯＸ−１との結合に対する阻害効果に基づくものであり、抗血小板作用を示すものであると考えられる。

【0023】

ここで、抗血小板剤は、抗血液凝固剤（抗凝固剤）とは異なるものである。具体的には、抗血小板剤は血小板の凝集を阻害し、主に動脈において白色血栓の形成を防ぐものであるのに対し、抗血液凝固剤はフィブリンの形成を阻害し、主に静脈において赤色血栓の形成を防ぐものである（フリー百科事典ウィキペディア(Wikipedia)、"抗血小板剤"、[online]、[2013年10月15日検索]、インターネット<http://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%8A%97%E8%A1%80%E5%B0%8F%E6%9D%BF%E5%89%A4>；理化学辞典第４版、第４１８頁、岩波書店）。

【0024】

従って、本発明に係る抗血液凝固剤は、特許文献１〜３に記載の技術とは全く異なるものである。

【発明の効果】

【0025】

本発明は、トロンビンまたは第Ｘａ因子を標的とする従来の抗血液凝固剤とは異なり、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子または第Ｖａ因子との結合を阻害する。そのため、ＬＯＸ−１が関与しない血液凝固カスケードを保ったまま、ＬＯＸ−１が関与する血液凝固反応を抑制することができる。よって、大出血のリスクを高めずに、病的な血液凝固反応を選択的に抑制することができるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】血液凝固系のカスケードを示す図である。

【図2】第Ｖ因子の構造を示す図である。

【図3】ＬＯＸ−１結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって展開した結果を示す図である。

【図4】表面プラズモン共鳴によるＬＯＸ−１と第Ｖ因子および第Ｖａ因子との結合の親和性の評価結果を示す図である。（ａ）は第Ｖ因子についての結果を示しており、（ｉ）は、縦軸にレスポンス、横軸に時間をとったセンサーグラムであり、（ｉｉ）は縦軸に平衡結合量Ｒｅｑ、横軸に濃度をとったグラフである。（ｂ）は第Ｖａ因子についての結果を示しており、（ｉ）は、縦軸にレスポンス、横軸に時間をとったセンサーグラムであり、（ｉｉ）は縦軸に平衡結合量Ｒｅｑ、横軸に濃度をとったグラフである。

【図5】ＬＯＸ−１固相化ＥＬＩＳＡにおける、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子および第Ｖａ因子との結合に対する抗ＬＯＸ−１抗体による阻害効果の評価結果を示す図である。

【図6】抗Ｌ鎖抗体および抗Ｈ鎖抗体を用いたＬＯＸ−１と第Ｖａ因子との結合部位の検出結果を示す図である。（ａ）は抗Ｌ鎖抗体およびＣａＣｌ_２溶液を加えた結果、（ｂ）は抗Ｌ鎖抗体およびＥＤＴＡを加えた結果、（ｃ）は抗Ｈ鎖抗体およびＣａＣｌ_２溶液を加えた結果、（ｄ）は抗Ｈ鎖抗体およびＥＤＴＡを加えた結果である。

【図7】（ａ）は、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子のＨ鎖の各ドメインとの結合を評価した結果を示す図である。（ｂ）は、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子のＨ鎖の各ドメインとの結合に対する抗ＬＯＸ−１抗体による阻害効果の評価結果を示す図である。

【図8】（ａ）はＬＯＸ−１の濃度による血液凝固時間の変化を示す図である。（ｂ）は抗体とＬＯＸ−１とを添加した場合の血液凝固時間を示す図である。

【図9】第Ｖ因子欠損血漿におけるＣａ再加血液凝固試験の結果を示す図である。

【図10】ＬＯＸ−１にプロシアニジンを添加した場合の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

以下、本発明について、詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。また、本明細書中に記載された公知文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

【0028】

〔本発明の抗血液凝固剤〕
本発明の抗血液凝固剤は、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子および第Ｖａ因子のうちの少なくとも一方との結合を阻害する結合阻害成分を含有することを特徴としている。

【0029】

本発明者らは、ＬＯＸ−１が第Ｖ因子または第Ｖａ因子と複合体を形成し、凝固反応を促進することを初めて見出した。そして、本発明者らは、この全く新しい知見に基づき、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子または第Ｖａ因子との結合を阻害することで、ＬＯＸ−１が関与しない血液凝固カスケードを保ったまま、ＬＯＸ−１が関与する血液凝固反応を抑制することができる抗血液凝固剤を実現できることを見出した。

【0030】

上述のようにワーファリン、トロンビン阻害剤および第Ｘａ因子阻害剤等の従来の抗血液凝固剤では、主作用（凝固抑制）と副作用（出血）とが機能的に不可分であるため、使用にあたっては血栓症予防のメリットと出血のリスクとのバランスをとるのが困難であった。そのため、従来の抗血液凝固剤では、血栓症を予防できるが出血死を招き得るという問題が常に付きまとった。

【0031】

上記問題を防ぐためには、薬剤の用量の調節等しかなかったが、本発明によれば、従来の抗血液凝固剤とは質的に異なるアプローチが可能となり、血液凝固作用を完全には抑えずに（つまり、出血リスクを高めずに）、病的な凝固反応を抑え、血栓症を抑制することができる。

【0032】

本発明は、従来の抗血液凝固剤とは異なり、プロテアーゼまたは血液凝固因子を標的とするのではなく、これらの活性の調節分子であるＬＯＸ−１を標的としている。そのため、本発明の抗血液凝固剤によれば、凝固機能の過度の抑制は起こらず、ＬＯＸ−１が病的に機能している場合にのみ抗血液凝固作用を発揮すると考えられる。

【0033】

また、第Ｘ因子またはトロンビンのノックアウトマウスは致死性であるのに対し、ＬＯＸ−１ノックアウトマウスは正常に発生して成長する（Mehta et al. Circulation Research 100:1634-1642, 2007.）。このことからも、本発明の安全性を推測することができる。

【0034】

さらに、本発明の抗血液凝固剤はＬＯＸ−１を標的とするため、薬物動態の点においても、ワーファリンのように摂取食物の影響を受けず、低分子トロンビン阻害剤および第Ｘａ因子阻害剤のように肝機能および腎機能の影響を受けることもない。また、本発明の抗血液凝固剤は、Ｐ糖タンパク質またはチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の基質となることもないので、薬物相互作用の可能性も少ない。

【0035】

第Ｖ因子（および第Ｖ因子が活性化されたものである第Ｖａ因子）は血液凝固因子の一種である。図１は血液凝固系のカスケードを示す図である。抗血液凝固作用を得るためには、血液凝固系において内因性経路と外因性経路との合流地点より下流のカスケードを阻害する必要がある。第Ｖ因子（第Ｖａ因子）は、血液凝固系において内因性経路と外因性経路との合流地点（すなわち、第Ｘａ因子）より下流で働く補酵素である。従って、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子または第Ｖａ因子との結合を阻害することによって、血液凝固を抑制することができる。

【0036】

図２は、第Ｖ因子の構造を示す図である。第Ｖ因子はＨ鎖とＬ鎖とが一体となったタンパク質である。第Ｖ因子は、Ｎ末端側からＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１、Ｃ２のドメインに分かれており、Ａ１ドメインおよびＡ２ドメインがＨ鎖を形成し、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインがＬ鎖を形成している。第Ｖ因子が活性化されると、Ｈ鎖とＬ鎖とに分断され、第Ｖａ因子になる。なお、後述の実施例５に記載のように本発明者らはＡ２ドメインがＬＯＸ−１と結合することを明らかにした。

【0037】

本明細書においては、第Ｖ因子を「ＦＶ」と表記する場合もある。同様に、第Ｖａ因子を「ＦＶａ」と表記する場合もある。また、Ｈ鎖は重鎖とも言われ、本明細書においてはこれを「ＨＣ」と記載する場合もある。また、Ｌ鎖は軽鎖とも言われ、本明細書においては、これを「ＬＣ」と記載する場合もある。

【0038】

結合阻害成分が、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子または第Ｖａ因子との結合を阻害するかどうかについては、実施例に記載された方法によって確認することができる。具体的には、実施例３に記載された方法によって、確認することができる。例えば、実施例３に記載された方法によって、結合阻害成分の存在下におけるＬＯＸ−１と第Ｖ因子との結合が、結合阻害成分の非存在下におけるＬＯＸ−１と第Ｖ因子との結合に比べて有意に減少していれば、結合阻害成分がＬＯＸ−１と第Ｖ因子との結合を阻害すると判断できる。ＬＯＸ−１と第Ｖａ因子との結合についても同様である。

【0039】

抗血液凝固作用は、例えば実施例７〜９に記載されたＣａ再加血液凝固試験によって確認することができる。ＬＯＸ−１および第Ｖ因子の存在下においてＣａ再加血液凝固試験を行い、結合阻害成分の存在下における血液凝固時間が、結合阻害成分の非存在下における血液凝固時間に比べて有意に増加していれば、結合阻害成分が抗血液凝固作用を示すと判断できる。さらに、ＬＯＸ−１、第Ｖ因子および結合阻害成分の存在下における血液凝固時間が、ＬＯＸ−１および結合阻害成分の非存在下における血液凝固時間と同程度であれば、結合阻害成分は出血リスクを高めないと判断できる。

【0040】

また、(i)ＬＯＸ−１の非存在下であって結合阻害成分の存在下における血液凝固時間が、ＬＯＸ−１および結合阻害成分の非存在下における血液凝固時間と同程度であり、且つ、(ii)ＬＯＸ−１および結合阻害成分の存在下における血液凝固時間が、ＬＯＸ−１の存在下であって結合阻害成分の非存在下における血液凝固時間に比べて有意に増加していれば、結合阻害成分はＬＯＸ−１が関与しない血液凝固カスケードを保ったまま、ＬＯＸ−１が関与する血液凝固反応を抑制することができると判断できる。

【0041】

なお、各データについて例えばスチューデントのｔ検定を実施して、一方のデータがもう一方のデータに比べて危険率５％未満で有意に減少または増加していれば、「有意に減少している」または「有意に増加している」と判断できる。

【0042】

結合阻害成分としては、ＬＯＸ−１に結合し、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子との結合を阻害する物質であれば、特に限定されず、例えば、抗ＬＯＸ−１抗体、および、ポリフェノールが挙げられる。

【0043】

本明細書において、「抗体」とは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。

【0044】

「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）に従えば作製することができる。

【0045】

モノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法（例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４，７２（１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５））などを参照のこと）を用いれば作製され得る。

【0046】

ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２ならびに上記抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、ＬＯＸ−１に結合するフラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。

【0047】

つまり、本発明に利用可能な抗体は、少なくとも、ＬＯＸ−１を認識し、且つその活性を阻害する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメント）を備えていればよく、個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明に利用可能である。

【0048】

結合阻害成分として利用できるポリフェノールとしては、例えばフラボノイド類が挙げられる。さらにフラボノイド類の例としては、プロシアニジンが挙げられる。なお、プロシアニジンはＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの結合を阻害することが知られている（Nishizuka et al. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci, 87:104-113, 2011.）。ただし、実施例９に示すようにプロシアニジンが抗血液凝固作用を有することは、本発明者らによって初めて見出された。

【0049】

本発明の抗血液凝固剤に含有される結合阻害成分の量は、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子または第Ｖａ因子との結合を阻害する作用が奏されるために十分な量であれば特に限定されるものではなく、結合阻害成分の精製度、剤型、または摂取方法等を考慮して適宜決定することができる。例えば、結合阻害成分の含有割合は、抗血液凝固剤の５０％（ｗ／ｗ）以上であることが好ましく、８０％（ｗ／ｗ）以上であることがより好ましく、１００％（ｗ／ｗ）であることがさらに好ましい。

【0050】

〔本発明の薬学的組成物〕
本発明の薬学的組成物は、上述の本発明の抗血液凝固剤を含有することを特徴としている。本発明の薬学的組成物によれば、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子または第Ｖａ因子との結合を阻害することで、ＬＯＸ−１が関与しない血液凝固カスケードを保ったまま、ＬＯＸ−１が関与する血液凝固反応を抑制することができるため、血栓症の防止に奏効することが期待される。

【0051】

本発明の薬学的組成物は、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子または第Ｖａ因子との結合を阻害する活性を損なわない限りにおいて、薬学的に許容される、抗血液凝固剤以外の他の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア等）をさらに含有してもよい。

【0052】

ここで、上記「薬学的に受容可能なキャリア」について以下に説明する。本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」（以下、単に「キャリア」ともいう）とは、医薬、または動物薬のような農薬を製造するときに、処方を補助することを目的として用いられる物質であって、結合阻害成分に有害な影響を与えないものをいう。さらに、本発明にかかる薬学的組成物を受容した個体において毒性が無く、且つキャリア自体は有害な抗体の産生を誘導しないものが意図される。

【0053】

上記キャリアとしては、製剤素材として使用可能な各種有機または無機のキャリア物質が用いられ、後述する薬学的組成物の投与形態および剤型に応じて適宜選択することができる。例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等；防腐剤；抗酸化剤；安定剤；矯味矯臭剤等として配合されるが、本発明はこれらに限定されない。

【0054】

上記「賦形剤」としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ-マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロース等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0055】

上記「滑沢剤」としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ワックス、タルク、コロイドシリカ等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0056】

上記「結合剤」としては、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ-マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0057】

上記「崩壊剤」としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0058】

上記「溶剤」としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリン等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0059】

上記「溶解補助剤」としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ-マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0060】

上記「懸濁剤」としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0061】

上記「等張化剤」としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ-マンニトール等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0062】

上記「緩衝剤」としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0063】

上記「無痛化剤」としては、例えば、ベンジルアルコール等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0064】

上記「防腐剤」としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0065】

上記「抗酸化剤」としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0066】

また、上記安定剤、矯味矯臭剤としては、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。

【0067】

本発明にかかる薬学的組成物の投与形態としては、経口的に投与するものであっても、非経口的に、静脈内、直腸内、腹腔内、筋肉内、または皮下に投与するものであってもよく、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与することができる。なお、本明細書中において、上記「非経口」とは、脳室内、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。

【0068】

本発明にかかる薬学的組成物を経口的に投与する場合、かかる薬学的組成物（以下、「経口剤」ともいう）の剤型としては、例えば、粉剤、顆粒剤、錠剤、リポソーム、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤等の固形製剤や、シロップ剤等の液状製剤とすることができる。

【0069】

上記「液状製剤」は、上記キャリアとして、例えば、水；グリセロール、グリコール、ポリエチレングリコール等の有機溶媒；これらの有機溶媒と水との混合物等を用いて、製薬分野において通常用いられる方法で製造することができる。また、上記液状製剤は、さらに、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定剤等を含んでいてもよい。

【0070】

上記「固形製剤」は、上記キャリアとして、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤等を用いて、製薬分野において通常用いられる方法で製造することができる。

【0071】

かかる経口剤を調製する際には、目的に応じて、潤滑剤、流動性促進剤、着色剤、香料等をさらに配合してもよい。

【0072】

また、本発明にかかる薬学的組成物を非経口的に投与する場合、かかる薬学的組成物（以下、「非経口剤」ともいう）の剤型としては、例えば、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤等とすることができる。かかる非経口剤は、製薬分野において公知の方法に従って、本発明にかかる薬学的組成物を、希釈剤（例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）に溶解または懸濁させ、目的に応じて、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等をさらに加えることにより調製することができる。

【0073】

また、本発明にかかる薬学的組成物の一実施形態として、製薬分野において通常用いられる技術により、徐放性製剤とすることもできる。

【0074】

本発明にかかる薬学的組成物は、単独で投与されてもよいし、他の薬剤と併用して投与されてもよい。併用して投与される方法としては、例えば、他の薬剤との混合物として同時に投与されてもよいし、他の薬剤とは別の薬剤として同時にもしくは並行して投与されてもよいし、あるいは経時的に投与されてもよいが、本発明はこれに限定されない。

【0075】

また、本発明にかかる薬学的組成物が１日あたりに投与される回数は特に限定されるものではない。本発明の抗血液凝固剤の投与量が、１日あたりの所要の投与量範囲内であれば、１日あたり１回の投与であってもよいし、複数回に分けて投与を行ってもよい。

【0076】

なお、本発明の薬学的組成物は、ヒトのみならず、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、およびサル等）に対しても適用可能であることは、当業者であれば容易に理解する。

【0077】

本発明の薬学的組成物中の抗血液凝固剤（または結合阻害成分）の量は、ＬＯＸ−１と第Ｖ因子との結合を阻害する作用が奏されるために十分な量であれば特に限定されるものではなく、結合阻害成分の精製度、剤型、又は摂取方法や、摂取対象者の性別、年齢、体重、健康状況等を考慮して適宜決定することができる。

【0078】

ＬＯＸ−１と第Ｖ因子または第Ｖａ因子との結合を阻害する活性による効果を得るために、本発明の薬学的組成物に、結合阻害成分を、例えば、摂取量が乾燥重量として成人１日当たり、１回につき１０μｇ〜１０００ｍｇ（または１０μｇ〜５００ｍｇ）となるように含有させることができる。

【0079】

とりわけ、注射剤の場合は、例えば生理食塩水または市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に０．１μｇ抗体／ｍＬ担体〜１０ｍｇ抗体／ｍＬ担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。

【0080】

このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μｇ〜１００ｍｇの割合で、好ましくは５０μｇ〜５０ｍｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。

【0081】

本発明の抗血液凝固剤および薬学的組成物は、例えば、血栓症の防止が必要な患者に対して抗血液凝固療法のために使用することができる。血栓症の防止が必要な患者とは、例えば、脳梗塞急性期患者、脳梗塞ハイリスク者、ＰＣＩ術後患者、心筋梗塞ハイリスク者、閉塞性動脈硬化症患者、全身性炎症反応症候群患者、播種性血管内凝固症候群患者、整形外科手術後患者が挙げられる。

【0082】

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

【実施例】

【0083】

以下、実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。なお、以下の実施例において、「有意に」とは、スチューデントのｔ検定による危険率５％未満の有意差があることを示しており、図中では有意差が存在する場合、「＊」を付して示している。

【0084】

〔実施例１：血漿中のＬＯＸ−１結合タンパク質の同定〕
血漿中に含まれる、ＬＯＸ−１に結合するタンパク質を同定した。

【0085】

エピトープタグ付組換えＬＯＸ−１タンパク質を、以下の方法によって調製した。まず、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞に、ＬＯＸ−１プラスミド[内部にＮＭ００２５４３（６１−２７３，ａａ）とｐＤｉｓｐｌａｙとＦｌａｇとを含んでいる]をトランスフェクトした。そして、培養にてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞が分泌したＬＯＸ−１タンパク質を回収し、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて精製し、ＦＬＡＧ Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にて溶出して用いた。

【0086】

さらに、ＥＤＴＡを用いた採血によってヒト血漿を得た。エピトープタグ付組換えＬＯＸ−１タンパク質とヒト血漿とを混合し、タグ認識抗体により免疫沈降を行った。精製したＬＯＸ−１結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって展開し、銀染色を行った。その後、ＭＳ／ＭＳ解析によってアミノ酸配列を解析し、ＬＯＸ−１結合タンパク質を同定した。

【0087】

図３に、ＬＯＸ−１結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した結果を示す。ＭＳ／ＭＳ解析の結果、表１に示す配列番号１〜８のアミノ酸配列が得られた。その結果、ＬＯＸ−１結合タンパク質として、血液凝固因子である第Ｖ因子が含まれていることがわかった。なお、表１のＰ１〜８は、図２のＰ１〜８に対応している。

【0088】

【表1】

【0089】

〔実施例２：表面プラズモン共鳴によるＬＯＸ−１とＦＶおよびＦＶａとの結合の親和性の評価〕
表面プラズモン共鳴によって、ＬＯＸ−１タンパク質とＦＶおよびＦＶａとの結合の親和性を評価した。ＬＯＸ−１タンパク質は、以下の方法によって調製した。まず、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞に、ＬＯＸ−１プラスミド[内部にＮＭ００２５４３（６１−２７３，ａａ）とｐｃＤＮＡ４と６×ＨｉｓとＩｇκ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌとを含んでいる]をトランスフェクトした。なお、Ｉｇκ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌはｐＳｅｃＴａｇ／ＦＲＴ／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）より得られた。そして、培養にてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞が分泌したＬＯＸ−１タンパク質を回収し、ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（ＴＡＫＡＲＡ）によるＨｉｓ−ｔａｇ精製を用いてエピトープタグ付組換えＬＯＸ−１タンパク質を調製した。ＦＶおよびＦＶａはＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．より購入した（ＦＶとしてはＨｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｖ：ＨＣＶ−０１００、ＦＶａとしてはＨｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｖａ：ＨＣＶＡ−０１１０を用いた）。表面プラズモン共鳴はＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて行った。センサーチップにＦＶおよびＦＶａそれぞれを固相化したものを作製し、０〜４００ｎＭのＬＯＸ−１タンパク質を流速１０μＬ／ｍｉｎにて流した。

【0090】

図４に得られた結果を示す。図４（ａ）はＦＶについての結果を示しており、（ｉ）は、縦軸にレスポンス、横軸に時間をとったセンサーグラムであり、（ｉｉ）は縦軸に平衡結合量Ｒｅｑ、横軸に濃度をとったグラフである。これらの結果から算出した解離定数Ｋ_Ｄは１５．２５±１．２８ｎＭであった。また、図４（ｂ）はＦＶａについての結果を示しており、（ｉ）は、縦軸にレスポンス、横軸に時間をとったセンサーグラムであり、（ｉｉ）は縦軸に平衡結合量Ｒｅｑ、横軸に濃度をとったグラフである。これらの結果から算出した解離定数Ｋ_Ｄは２２．１４±０．１２ｎＭであった。

【0091】

この結果から、ＬＯＸ−１タンパク質とＦＶおよびＦＶａとは非常に強く結合することが明らかになった。

【0092】

〔実施例３：ＬＯＸ−１とＦＶおよびＦＶａとの結合に対する抗ＬＯＸ−１抗体による阻害効果の評価（ＬＯＸ−１固相化ＥＬＩＳＡ）〕
ＬＯＸ−１とＦＶおよびＦＶａとの結合活性をＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay: 酵素免疫測定法）によって評価した。ＥＬＩＳＡは以下のようにして行った。３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５μｇ／ｍＬ／ウェルのＬＯＸ−１を４℃、ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔの条件で固相化した。３％ＢＳＡ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４でブロッキングを行った後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。上記プレートに抗ＬＯＸ−１抗体、またはＩｇＧを加えプレインキュベートを行い、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＦＶまたはＦＶａを加えて室温で、１時間反応させた。コントロールとして、ＬＯＸ−１を固相化していないウェル、並びに、抗ＬＯＸ−１抗体およびＩｇＧのいずれも加えないウェルも作製した。なお、抗ＬＯＸ−１抗体としては、ＨＵＣ３４８（抗体１）、ＨＵＣ５２（抗体２）およびＨＵＣ５２ヒト化抗体（抗体３）を用いた。

【0093】

ＬＯＸ−１とＦＶおよびＦＶａとの結合活性の検出には、抗ＦＶＬ鎖抗体、ビオチン標識抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、および、ＴＭＢ試薬を用いた。そして、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。ＦＶａについても同様にＥＬＩＳＡを行った。

【0094】

図５に結果を示す。ＬＯＸ−１固相プレートにおいては、ＦＶのみ、またはＦＶおよびＩｇＧを加えた場合に比べて、抗ＬＯＸ−１抗体を加えた場合はＬＯＸ−１とＦＶとの結合が有意に阻害された（危険率５％未満の有意差あり）。同様に、ＬＯＸ−１とＦＶａとの結合も、抗ＬＯＸ−１抗体によって有意に阻害された。

【0095】

〔実施例４：抗Ｌ鎖抗体および抗Ｈ鎖抗体を用いたＬＯＸ−１とＦＶａとの結合部位の特定〕
ＦＶａのどの部位がＬＯＸ−１と結合しているのかをＥＬＩＳＡによって特定した。ＥＬＩＳＡは以下のようにして行った。３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５μｇ／ｍＬ／ウェルのＬＯＸ−１を４℃、ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔの条件で固相化した。３％ＢＳＡ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４でブロッキングを行った後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。プレートにＦＶまたはＦＶａを加え、室温で、１時間反応させた。その後、抗Ｌ鎖抗体を加え、さらに２ｍＭのＣａＣｌ_２溶液または２ｍＭのＥＤＴＡを加え、室温、１時間インキュベートした。そして、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。ＦＶａは０μｇ／ｍＬ、０．０３μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬまたは３μｇ／ｍＬの濃度で加えられた。また、ＬＯＸ−１の代わりにコントロールとしてＢＳＡを用いて同様の測定を行った。さらに、抗Ｌ鎖抗体の代わりに抗Ｈ鎖抗体を用いて同様の測定を行った。なお、抗Ｌ鎖抗体としてはＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．より購入したＡｎｔｉ-Ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｖ：ＡＨＶ−５１０１、抗Ｈ鎖抗体としてはＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．より購入したＡｎｔｉ-Ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｖ：ＡＨＶ−５１４６を用いた。

【0096】

図６にＥＬＩＳＡによる結果を示す。図６（ａ）は抗Ｌ鎖抗体およびＣａＣｌ_２溶液を加えた結果であり、図６（ｂ）は抗Ｌ鎖抗体およびＥＤＴＡを加えた結果である。図６（ｃ）は抗Ｈ鎖抗体およびＣａＣｌ_２溶液を加えた結果であり、図６（ｄ）は抗Ｈ鎖抗体およびＥＤＴＡを加えた結果である。

【0097】

Ｃａ^２＋が存在する場合、Ｈ鎖とＬ鎖とは図２に示したように一体となっている。ＥＤＴＡで処理した場合は、Ｈ鎖とＬ鎖との結合は消失する。抗Ｌ鎖抗体によって図６（ａ）で検出されていたＬＯＸ−１とＦＶａとの結合が、ＥＤＴＡ処理を行った図６（ｂ）ではほとんど検出されなかった。一方、抗Ｈ鎖抗体によって図６（ｃ）で検出されていたＬＯＸ−１とＦＶａとの結合は、ＥＤＴＡ処理を行った図６（ｄ）でもほとんど変化することなく検出された。従って、ＬＯＸ−１はＦＶａのＨ鎖に結合することがわかった。

【0098】

〔実施例５：ＬＯＸ−１とＦＶのＨ鎖の各ドメインとの結合〕
さらにＦＶのＨ鎖のどの部位がＬＯＸ−１と結合しているのかをＥＬＩＳＡによって特定した。ＦＶとしては以下の方法によって調製した組換えＦＶを用いた。まず、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞に、ＦＶ Ｈ鎖プラスミド[内部にＮＭ０００１３０．４（１−７０９，ａａ）とｐｃＤＮＡ３．３とＶ５−６×ＨｉｓとＩｇκ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌとを含んでいる]、ＦＶ Ａ１タンパク質プラスミド[内部にＮＭ０００１３０．４（１−３０３，ａａ）とｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓとＩｇκ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌとを含んでいる]、またはＦＶ Ａ２タンパク質プラスミド[内部にＮＭ０００１３０．４（３１７−６５６，ａａ）とｐｃＤＮＡ３．３とＶ５−６×ＨｉｓとＩｇκ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌとを含んでいる]をトランスフェクトした。なお、Ｉｇκ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌはｐＳｅｃＴａｇ／ＦＲＴ／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）より得られた。そして、培養にてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞が分泌したＦＶのＨ鎖、Ａ１またはＡ２を回収し、ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（ＴＡＫＡＲＡ）でＨｉｓ−ｔａｇ精製を用いて調製した。

【0099】

ＥＬＩＳＡは以下のようにして行った。３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５μｇ／ｍＬのＬＯＸ−１を４℃、ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔの条件で固相化した。３％ＢＳＡ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４でブロッキングを行った後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。プレートにＦＶのＨ鎖、ＦＶのＨ鎖のＡ１ドメインまたはＦＶのＨ鎖のＡ２ドメインを０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬ加え、室温、１時間反応させた。検出にはＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ標識抗Ｖ５抗体、ＴＭＢ試薬を用いた。そして、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。コントロールとしてＬＯＸ−１の代わりにＤｅｃｔｉｎ−１を用いた場合についても同様に測定を行った。

【0100】

図７（ａ）に結果を示す。ＬＯＸ−１と、ＦＶのＨ鎖およびＦＶのＨ鎖のＡ２ドメインとの結合が検出された。ＬＯＸ−１とＡ１ドメインとの結合は検出されなかった。従って、ＬＯＸ−１はＦＶのＨ鎖のＡ２ドメインに結合することがわかった。

【0101】

〔実施例６：ＬＯＸ−１とＦＶのＨ鎖のＡ２ドメインとの結合に対する抗ＬＯＸ−１抗体による阻害効果〕
さらにＬＯＸ−１とＦＶのＨ鎖のＡ２ドメインとの結合が抗ＬＯＸ−１抗体によって抑制されることをＥＬＩＳＡによって確認した。ＦＶとしては実施例５と同様に組換えＦＶを用いた。抗ＬＯＸ−１抗体としては、実施例３と同様にＨＵＣ３４８（抗体１）、ＨＵＣ５２（抗体２）およびＨＵＣ５２ヒト化抗体（抗体３）を用いた。

【0102】

ＥＬＩＳＡは以下のようにして行った。３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５μｇ／ｍＬのＬＯＸ−１を４℃、ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔの条件で固相化した。３％ＢＳＡ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４でブロッキングを行った後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。上記プレートに抗ＬＯＸ−１抗体、またはＩｇＧを１０μｇ／ｍＬ加えプレインキュベートを行い、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、プレートにＦＶのＨ鎖を３μｇ／ｍＬ、ＦＶのＨ鎖のＡ１ドメインまたはＦＶのＨ鎖のＡ２ドメインを１０μｇ／ｍＬ加え、室温、１時間反応させた。検出には抗Ｖ５抗体、ビオチン標識抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＴＭＢ試薬を用いた。そして、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。それぞれコントロールとして、ＬＯＸ−１を固相化していない場合、および、ＩｇＧおよび抗ＬＯＸ−１抗体を加えない場合についても同様に測定を行った。

【0103】

図７（ｂ）に結果を示す。ＩｇＧおよび抗ＬＯＸ−１抗体を加えなかった場合、Ｈ鎖およびＡ２ドメインではＦＶの結合が検出された。また、ＩｇＧを加えた場合も同様にＦＶの結合が検出された。これに対し、抗ＬＯＸ−１抗体を加えた場合、ＦＶ（Ｈ鎖およびＡ２ドメイン）の結合は有意に阻害された（危険率５％未満の有意差あり）。

【0104】

〔実施例７：抗ＬＯＸ−１抗体による抗血液凝固作用〕
抗ＬＯＸ−１抗体による抗血液凝固作用をＣａ再加血液凝固試験によって確認した。ガラス試験管に組換えＬＯＸ−１タンパク質を０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬの濃度で加えた。組換えＬＯＸ−１タンパク質は実施例２と同様の方法によって得られた。さらに、上記試験管にクエン酸を用いて得られたヒト血漿を加えた。その後、試験管にＣａ^２＋を終濃度１２．５ｍＭで加えた。試験管を３７℃の湯浴中でゆっくり振盪しながら、流動性を確認した。試験管を転倒しても凝固塊が落ちない状態になるまでの時間を凝固時間として測定した。また、組換えＬＯＸ−１タンパク質１μｇ／ｍＬとともに、ＩｇＧまたは抗ＬＯＸ−１抗体を１０μｇ／ｍＬ加えた場合についても同様に凝固時間を測定した。さらに組換えＬＯＸ−１タンパク質を添加しなかった場合についても同様に凝固時間を測定した。抗ＬＯＸ−１抗体としては、実施例３と同様にＨＵＣ３４８（抗体１）、ＨＵＣ５２（抗体２）およびＨＵＣ５２ヒト化抗体（抗体３）を用いた。

【0105】

図８（ａ）は、ＩｇＧおよび抗ＬＯＸ−１抗体を加えなかった場合の結果であり、ＬＯＸ−１の濃度による凝固時間の変化を示している。添加された組換えＬＯＸ−１タンパク質の濃度依存的に凝固時間は短縮された。特に組換えＬＯＸ−１タンパク質を１０μｇ／ｍＬ添加した場合には、０μｇ／ｍＬの場合に比べて２／３の時間まで短縮された。従って、ＬＯＸ−１の添加により、血液の凝固時間は有意に短縮されることがわかった（危険率５％未満の有意差あり）。

【0106】

図８（ｂ）は、ＩｇＧまたは抗ＬＯＸ−１抗体を加えた場合の結果を示している。まずＩｇＧは、血漿単独への添加では凝固時間に影響を与えなかった。ＬＯＸ−１を血漿に添加した場合は、凝固時間の短縮が見られた。ＬＯＸ−１を添加した血漿に対してＩｇＧを添加した場合は、ＬＯＸ−１のみを血漿に添加した場合に比べて凝固時間の変化が見られなかった。一方、ＬＯＸ−１を添加した血漿に対して抗ＬＯＸ−１抗体を添加した場合は、ＬＯＸ−１を添加しない場合と同等の時間まで凝固時間が戻ることが観察された。なお、ＬＯＸ−１のみを血漿に添加した場合に比べて抗ＬＯＸ−１抗体を添加した場合は、凝固時間が有意に増加した（危険率５％未満の有意差あり）。すなわち、抗ＬＯＸ−１抗体はＬＯＸ−１に依存しない凝固反応には影響を与えないが、ＬＯＸ−１によって促進される凝固反応のみを抑制することが明らかとなった。

【0107】

〔実施例８：ＦＶ欠損血漿における凝固反応〕
ＦＶ欠損血漿における凝固反応をＣａ再加血液凝固試験によって確認した。プラスチック試験管に組換えＬＯＸ−１タンパク質を１０μｇ／ｍＬの濃度で加え、固相化した。上記試験管にＦＶまたはＦＶａを１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。ＬＯＸ−１タンパク質に結合していないＦＶおよびＦＶａは洗浄して除去した。さらに、上記試験管にＦＶ欠損血漿を加えた。その後、試験管にＣａ^２＋を終濃度１２．５ｍＭで加え、実施例７と同様に凝固時間を測定した。また、ＬＯＸ−１の代わりにＤｅｃｔｉｎ−１を加えた場合、および、ＬＯＸ−１もＤｅｃｔｉｎ−１も加えなかった場合についても同様に凝固時間を測定した。

【0108】

図９（ａ）および（ｂ）は、ＦＶ欠損血漿における凝固反応の結果を示す図である。図９（ａ）に示すように、ＬＯＸ−１にＦＶまたはＦＶａを結合させた場合のみ凝固時間の短縮が見られた（危険率５％未満の有意差あり）。図９（ｂ）において、ＡはＬＯＸ−１もＤｅｃｔｉｎ−１も加えなかった場合、ＢはＤｅｃｔｉｎ−１を加えた場合、ＣはＬＯＸ−１を加えた場合に、それぞれＦＶを添加した結果を示している。図９（ｂ）からもＬＯＸ−１にＦＶを結合させた場合のみ凝固していることがわかる。従って、ＬＯＸ−１とＦＶまたはＦＶａとの結合によって凝固反応が生じていることが明らかになった。

【0109】

〔実施例９：プロシアニジンによる抗血液凝固作用〕
プロシアニジンによる抗血液凝固作用をＣａ再加血液凝固試験によって確認した。ガラス試験管に組換えＬＯＸ−１タンパク質１μｇ／ｍＬおよびプロシアニジン１μｇ／ｍＬを加えた。その後、実施例８と同様にヒト血漿およびＣａ^２＋を加え、凝固時間を測定した。また、プロシアニジンを加えなかった場合についても同様に凝固時間を測定した。さらに組換えＬＯＸ−１タンパク質を添加しなかった場合についても同様に凝固時間を測定した。

【0110】

図１０に結果を示す。プロシアニジンは血漿単独への添加では凝固時間に影響を与えなかった。ＬＯＸ−１を血漿に添加した場合は、凝固時間の短縮が見られた。ＬＯＸ−１を添加した血漿に対してプロシアニジンを添加した場合は、凝固時間の短縮が抑制されることが観察された（危険率５％未満の有意差あり）。すなわち、プロシアニジンはＬＯＸ−１に依存しない凝固反応には影響を与えないが、ＬＯＸ−１によって促進される凝固反応のみを抑制することが明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0111】

上記説示したように、本発明によれば、大出血のリスクを高めずに、病的な血液凝固反応を選択的に抑制する抗血液凝固剤を提供する。このため、本発明に係る抗血液凝固剤は、ＬＯＸ−１が関与する血栓症等の有効な治療または予防手段となる。

【0112】

従って、本発明は、例えば、医療および医薬品に関わる産業において利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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