特許 6362268 ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法及びＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6362268

(24)【登録日】2018年7月6日

(45)【発行日】2018年7月25日

(54)【発明の名称】ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法及びＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/44 20060101AFI20180712BHJP

   G01N 33/92 20060101ALI20180712BHJP

   C12M 1/34 20060101ALN20180712BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/44

   G01N33/92 B

   !C12M1/34 E

【請求項の数】3

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2014-544619(P2014-544619)

(86)(22)【出願日】2013年11月5日

(86)【国際出願番号】JP2013079814

(87)【国際公開番号】WO2014069651

(87)【国際公開日】20140508

【審査請求日】2016年9月12日

(31)【優先権主張番号】特願2012-243324(P2012-243324)

(32)【優先日】2012年11月5日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000001926

【氏名又は名称】塩野義製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100108970

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 秀晃

(74)【代理人】

【識別番号】100113789

【弁理士】

【氏名又は名称】杉田 健一

(74)【代理人】

【識別番号】100103230

【弁理士】

【氏名又は名称】高山 裕貢

(72)【発明者】

【氏名】小野 隆

(72)【発明者】

【氏名】山本 敦子

(72)【発明者】

【氏名】紫垣 修平

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第００／００７５６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５１７２１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Gematologia i trandfuzilogia，１９９０年，Vol. 35, No. 10，pp. 19-21

【文献】 Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.，２０１２年１０月２５日，Vol. 32，pp. 3033-3040

【文献】 J. Lipid Res.，２０１１年，Vol. 52，pp. 374-382

【文献】 Clin. Chem.，２０１２年１０月１５日，Vol. 58, No. 12，pp. 1656-1664

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／４４

Ｃ１２Ｍ １／３４

Ｇ０１Ｎ ３３／９２

Ｇ０１Ｎ ３３／１５

Ｇ０１Ｎ ３３／５０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

(1) ＥＬ阻害剤である被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した血清または血漿中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と、該被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した血清または血漿中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 該被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した血清または血漿中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度が、該被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した血清または血漿中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と比べて変化している場合に、該被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法。

【請求項2】

(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程、
(2) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較して上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法。

【請求項3】

(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程、
(2) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較して減少している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトールを指標とする、血管内皮リパーゼ（Endothelial Lipase。以下、ＥＬとする。）の活性測定方法に関する。具体的には、本発明は、ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法及びＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＥＬは、Triglyceride Lipase（以下、ＴＧＬとする。）ファミリーに属するPhospholipaseである（非特許文献１）。ヒトＥＬは５００残基（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００６０２４．１）のアミノ酸からなり、マウスＥＬも５００残基のアミノ酸からなる。
ＴＧＬファミリーには、Lipoprotein Lipase（以下、ＬＰＬとする。）やHepatic Lipase（以下、ＨＬとする。）が含まれる。

【0003】

ＥＬは、その強いPhospholipase活性によりＨＤＬコレステロール（以下、ＨＤＬ−ｃとする。）の代謝に関与することがそのノックアウトマウスやトランスジェニックマウスの解析から明らかとなり、血中ＨＤＬ−ｃ量を規定する因子として注目されている（非特許文献２）。冠動脈疾患(以下、ＣＡＤとする。)と血中ＨＤＬ−ｃ量に負の相関関係が成立することは古くから知られている。ＨＤＬ−ｃは抗酸化作用・抗炎症作用・コレステロール逆転送作用などを介して抗動脈硬化作用を示すとされ、低ＨＤＬ−ｃ血症はＣＡＤのリスクファクターの一つと認識されている。したがって、ＥＬ阻害剤はＨＤＬ−ｃの上昇を介してＣＡＤ治療薬となり、実際にＥＬをノックアウトした病態マウスではＨＤＬ−ｃ上昇と動脈硬化病変部位の減少が報告されている（非特許文献３）。
これらの知見は、ＥＬの選択的阻害剤は脂質代謝異常症や動脈硬化症における治療薬としての有用性を示している。

【0004】

ＥＬ阻害剤の薬効評価試験において投薬した薬剤がどの程度、血液中でＥＬを阻害しているかを把握することは、薬効のポテンシーを把握する上で重要事項である。しかしながら、血液中にはＥＬと同様の活性を有するリパーゼが存在するため、血液中のＥＬ活性を特異的に検出できるアッセイ方法を見出すことが、有望化合物の選択のための課題である。

【0005】

血液中には公知の一般的なアッセイ条件下（非特許文献４)では、ＥＬよりも高い活性を有するリパーゼが存在し、ＥＬの活性が正確に測定できないことから、投薬した阻害剤の血液中でのＥＬ活性阻害率を正確に把握することは困難である。
非臨床試験においてＥＬ活性測定に用いる血液を採取する際には、ＥＬを血管壁から遊離、回収するために大量のヘパリンを静注する必要性があるが、臨床試験において被験者にヘパリンを大量に静注することはできない。したがって、臨床試験ではＥＬ活性の指標となるマーカーが必要になるが、ＥＬ活性を反映できるマーカーの存在についての報告は現在までなされていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９９年、第２１巻第４号、４２４−４２８ページ

【非特許文献2】ＴＣＭ、２００４年、第１４巻第５号、２０２−２０６ページ

【非特許文献3】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４年、第２７９巻第４３号、４５０８５−４５０９２ページ

【非特許文献4】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２００３年、第１１１巻第３号、３４７−３５５ページ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、ＥＬ以外のリパーゼも存在する非臨床・臨床試験検体から採取した試料において、ＥＬの活性を特異的に測定することを課題とする。特に、臨床試験においては、被験者にヘパリンを大量に静注することはできないので、被験者にヘパリンを大量に静注することなくＥＬの活性を特異的に測定できるようにすることを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、ＥＬ活性測定系の精度、特異性向上およびＥＬ活性のマーカーの特定という課題を解決するためには、血液中のリポタンパク質中のリン脂質の中からＥＬに特異的な基質を見出すことが最善のストラテジーであると考えた。本発明者らは、その方針のもと、鋭意研究を重ねた結果、ホスファチジルイノシトールがＥＬ特異的な基質となることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0009】

すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１０］を提供する。
［１］ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトールを指標とする、ＥＬ活性測定方法。
［２］(1) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度よりも上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法。
［３］(1) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール濃度と、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール濃度よりも上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法。
［４］(1) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度と、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度よりも上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法。
［５］前記試料が血液、血清または血漿である［２］〜［４］いずれかに記載の方法。
［６］(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程、
(2) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較して上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法。
［７］ホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール−リポゾーム、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬ、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬ又はホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルである［６］記載の方法。
［８］(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程、
(2) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較して減少している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法。
［９］ホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール−リポゾーム、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬ、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬ又はホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルである［８］記載の方法。
［１０］前記［６］〜［９］いずれかに記載の方法に使用するためのキット。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度を指標とした、ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法が提供される。また、本発明により、ホスファチジルイノシトールを使用したＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法およびその方法に使用するためのキットが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、マウスのプレヘパリンプラズマにマウスＥＬを添加、無添加（Ｎｏｎｅ）の際のホスファチジルコリン（以下、ＰＣともいう。）量の変化を示す。横軸はホスファチジルコリンの分子種を、縦軸はホスファチジルコリンの濃度を示す。

【図2】図２は、マウスのプレヘパリンプラズマにマウスＥＬを添加、無添加（Ｎｏｎｅ）の際のホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＥともいう。）量の変化を示す。横軸はホスファチジルエタノールアミンの分子種を、縦軸はホスファチジルエタノールアミンの濃度を示す。

【図3】図３は、マウスのプレヘパリンプラズマにマウスＥＬを添加、無添加（Ｎｏｎｅ）の際のホスファチジルイノシトール（以下、ＰＩともいう。）量の変化を示す。横軸はホスファチジルイノシトールの分子種を、縦軸はホスファチジルイノシトールの濃度を示す。

【図4】図４は、ホスファチジルイノシトールをＨＤＬに導入したホスファチジルイノシトール−ＨＤＬ（以下、ＰＩ−ＨＤＬともいう。）とＨＤＬを基質とした際のマウスＥＬの活性を示す。横軸は用いた基質を、縦軸は遊離脂肪酸（以下、ＮＥＦＡともいう。）の量を示す。

【図5】図５は、ＰＩ−ＨＤＬを用いてリパーゼの既知阻害剤であるオルリスタットのマウスＥＬに対する阻害効果を示す。横軸はオルリスタットの濃度を、縦軸は阻害率を示す。

【図6】図６は、ＰＩ−ＨＤＬ又はＨＤＬを基質とした際のＥＬトランスジェニックマウスのポストヘパリンプラズマ中のＥＬ活性及びＥＬ以外のリパーゼ活性（以下、Ｎｏｎ ＥＬ活性とする。）を示す。横軸は用いた基質を、縦軸はＮＥＦＡの量を示す。

【図7】図７は、図６のＥＬ活性／ＥＬ以外のリパーゼ活性を、ＰＩ−ＨＤＬ又はＨＤＬそれぞれについて計算した結果を示す。縦軸はＥＬ活性／Ｎｏｎ ＥＬ活性を、横軸は用いた基質を示す。

【図8】図８は、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）及びＥＬノックアウトマウスのプレヘパリンプラズマ中のホスファチジルイノシトール濃度についての測定結果を示す。横軸はホスファチジルイノシトールの分子種を、縦軸はホスファチジルイノシトールの濃度を示す。

【図9】図９は、野生型マウス及びＥＬノックアウトマウスのプレヘパリンプラズマ中のホスファチジルエタノールアミン濃度についての測定結果を示す。横軸はホスファチジルエタノールアミンの分子種を、縦軸はホスファチジルエタノールアミンの濃度を示す。

【図10】図１０は、ＥＬ中和抗体をカニクイザルに静脈内投与し、経時的に採取したプレヘパリンプラズマ中のＨＤＬコレステロール濃度の、ＥＬ中和抗体投与前の濃度に対する比率を示す。横軸はＥＬ中和抗体投与後のプレヘパリンプラズマの採取時間を、縦軸はＥＬ中和抗体投与前の濃度に対する比率を示す。

【図11】図１１は、ＥＬ中和抗体をカニクイザルに静脈内投与し、経時的に採取したプレヘパリンプラズマ中のホスファチジルイノシトール濃度の、ＥＬ中和抗体投与前の濃度に対する比率を示す。横軸はＥＬ中和抗体投与後のプレヘパリンプラズマの採取時間を、縦軸はＥＬ中和抗体投与前の濃度に対する比率を示す。

【図12】図１２は、ＥＬ中和抗体をカニクイザルに静脈内投与し、経時的に採取したプレヘパリンプラズマ中のリゾホスファチジルイノシトール（以下、ＬＰＩともいう。）濃度の、ＥＬ中和抗体投与前の濃度に対する比率を示す。横軸はＥＬ中和抗体投与後のプレヘパリンプラズマの採取時間を、縦軸はＥＬ中和抗体投与前の濃度に対する比率を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いる意味で用いられる。

【0013】

本発明は、一実施形態では、ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトールを指標とする、ＥＬ活性測定方法を提供する。かかる方法は、ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトールを指標とするＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法及び、ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトールを指標とするＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法を包含する。

【0014】

ホスファチジルイノシトールは、極性基にイノシトールをもつ酸性リン脂質の１つであり、ＰＩと略記されることもある。１位、２位の脂肪酸の組み合わせの違いによって多種類の分子種が存在する。例えば、ホスファチジルイノシトールの分子種を質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３８、２重結合の合計が４と予測された場合、３８：４という表記を行う。

【0015】

ホスファチジルコリンはレシチンとも呼ばれ、ＰＣと略記されることもある。１位、２位のアシル基の組み合わせの違いによって多種類の分子種が存在する。例えば、ホスファチジルコリンの分子種を質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３６、２重結合の合計が３と予測された場合、３６：３という表記を行う。

【0016】

ホスファチジルエタノールアミンは、ＰＥと略語されることもある。１位、２位の脂肪酸の組み合わせの違いによって多種類の分子種が存在する。例えば、ＰＥの分子種を質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１、２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が４０、２重結合の合計が６と予測された場合、４０：６という表記を行う。

【0017】

ＥＬとは、ＴＧＬファミリーに属するPhospholipaseの一種である血管内皮リパーゼを意味する。ヒト、ウサギおよびマウスＥＬのＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号は、それぞれ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００６０２４．１、ＮＰ＿００１１８２５６７．１およびＮＰ＿０３４８５０．３である。
本明細書において、ＥＬとは、前記ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質のみならず、前記ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質において１アミノ酸又は数アミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質も含まれる。ただし、これらのタンパク質は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているＥＬと同等のホスホリパーゼ活性を有するものに限定される。

【0018】

ＥＬ活性が関連する疾患とは、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満及びシンドロームＸを意味する。

【0019】

また、本発明は、一実施形態では、
(1) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と比べて変化している場合に、被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療又は予防効果を有する医薬の薬効評価方法を提供する。
ＥＬ活性が関連する疾患とは、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満及びシンドロームＸ等を意味する。

【0020】

上記方法の工程（１）では、被験物質は、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等を例示することができる。

【0021】

上記方法の工程（１）では、試料中のホスファチジルイノシトール濃度の定量は、例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００６年、第３９巻、９５７−９７２ページを参照して質量分析により行うことができる。
一方、試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度の定量は、特開２０１０−６３４７０などを参照してＴＬＣ展開することにより、またはＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ、２０１０年、第７２巻第７/８号、６５９−６６４ページを参照して質量分析をすることにより、測定することができる。

【0022】

上記方法の工程（１）では、被験体である哺乳動物は哺乳動物であれば種類は問わない。また、哺乳動物より採取する試料は、哺乳動物由来のサンプルであれば何でもいいが、血液、血清又は血漿が好ましい。

【0023】

上記方法の工程（２）では、被験物質投与後のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質投与前のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較される。
ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質投与前のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度は、被験物質投与後の測定に対し、事前に測定したホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度であっても、同時に測定したホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度であることが好ましい。

【0024】

上記方法の工程（１）及び（２）では、血液中等にＥＬを遊離させる必要は一切ない。そのため、被験者から試料を採取する際には、ヘパリンを静注することは不要であるので、臨床試験における被験者にも本評価方法を使用することができるのが利点である。

【0025】

また、本発明は、一実施形態では、
(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程
(2) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較して上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法を提供する。

【0026】

上記方法の工程（１）で用いられるホスファチジルイノシトールは、ホスファチジルイノシトール−リポゾーム、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬ、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬおよびホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルのいずれの形態であっても、ホスファチジルイノシトールを含む形態である限り、いかなる形態であっても許容される。

【0027】

ホスファチジルイノシトール−リポゾームとは、超音波処理等の機械的操作も含めてホスファチジルイノシトール又はホスファチジルイノシトールと脂質との混合体として溶液中に分散させた状態を意味する。ホスファチジルイノシトールとの混合成分として使用される脂質としては、例えば、血中に含有される脂質などをあげることができる。
ホスファチジルイノシトール−リポゾームは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７６年、第１７巻第３号、２３９−２４７ページを参照して、適宜作製することができる。

【0028】

ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬとは、ホスファチジルイノシトールとＨＤＬを混合することにより、人為的にホスファチジルイノシトールの導入されたＨＤＬを意味する。ホスファチジルイノシトールとの混合成分として使用されるＨＤＬとしては、例えば、ＨＤＬ、もしくはその構成物のＨＤＬ２、ＨＤＬ３などを挙げることができる。

【0029】

ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬとは、ホスファチジルイノシトール又はホスファチジルイノシトールと脂質の混合物をアポ蛋白と混合することにより再構成されたＨＤＬを意味する。ホスファチジルイノシトールとの混合成分として使用される脂質としては、例えば、血中に含有される脂質などをあげることができる。ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬ作製に使用されるアポ蛋白としては、例えば、血中に含有されるアポ蛋白などをあげることができる。
ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８２年、第２５７巻第８号、４５３５−４５４０ページを参照して、適宜作製することができる。

【0030】

ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルとは、界面活性剤によりホスファチジルイノシトール又はホスファチジルイノシトールと脂質との混合体として溶解させることにより形成された混合ミセルを意味する。ホスファチジルイノシトールとの混合成分として使用される脂質としては、例えば、血中に含有される脂質などをあげることができる。ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルの作製に使用される界面活性剤としては、例えば、イオン性、非イオン性界面活性剤などをあげることができる。
ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８年、第２６３巻第１２号、５７２４−５７３１ページを参照して、適宜作製することができる。

【0031】

スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が例示される。

【0032】

上記方法の工程（２）では、ホスファチジルイノシトール濃度の測定は、例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００６年、第３９巻、９５７−９７２ページを参照して質量分析を行い直接ホスファチジルイノシトール濃度を測定するか、基質であるホスファチジルイノシトールから生成されるＮＥＦＡの量を測定すること等により行う。

【0033】

上記方法の工程（３）では、被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較される。
ホスファチジルイノシトール濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させないホスファチジルイノシトール濃度は、被験物質を接触させたホスファチジルイノシトール濃度の測定に対し、事前に測定したホスファチジルイノシトール濃度であっても、同時に測定したホスファチジルイノシトール濃度であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したホスファチジルイノシトール濃度であることが好ましい。

【0034】

スクリーニングによって見出されたＥＬ活性阻害物質は、ＥＬ活性が関連する疾患、すなわち、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満及びシンドロームＸ等の疾患の治療または予防効果を有する。

【0035】

更に、本発明の一実施形態では、
(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程
(2) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較して減少している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法を提供する。

【0036】

上記方法の工程（２）では、ホスファチジルイノシトールの分解産物であるリゾホスファチジルイノシトール濃度が測定される。リゾホスファチジルイノシトール濃度の定量は、特開２０１０−６３４７０などを参照してＴＬＣ展開することにより、またはＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ、２０１０年、第７２巻第７/８号、６５９−６６４ページを参照して質量分析をすることにより、測定することができる。

【0037】

以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。

【実施例1】

【0038】

マウス血漿中リポタンパク質のリン脂質に対するＥＬの基質特異性の検証
マウスＥＬをコードするＤＮＡをクローニングしたｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０ (インビトロジェン社製) をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、８%ＣＯ_２で２日間培養した。培養液を遠心分離し、細胞を回収して、２０Ｕ／ｍｌのヘパリンを含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、遠心分離により細胞を除去して得た上清をマウスＥＬ酵素溶液とした。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのプレヘパリンプラズマとマウスＥＬ酵素溶液からなる反応溶液（９：１、ｖ/ｖ）を３７℃で２時間インキュベーションした後、ＥＤＴＡ（終濃度１０ｍＭ）を添加し反応を停止した。その後、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００６年、第３９巻、９５７−９７２ページを参照して質量分析法により、反応溶液中の各種リン脂質を定量した。反応溶液にＥＬ酵素溶液を入れずにインキュベーションした際の各種リン脂質の変動のプロファイルと、ＥＬ酵素溶液添加時でのプロファイルとの比較より、ＥＬ添加で特異的に変動するリン脂質を検索した（図１〜３）。その結果、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンにはＥＬ以外のリパーゼの作用が認められたが、ホスファチジルイノシトールにはＥＬのみが活性を示すことが明らかとなった。

【実施例2】

【0039】

ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とした、マウスＥＬ活性測定とＥＬ活性阻害剤の評価
クロロホルム溶媒中のホスファチジルイノシトール（Ａｖaｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を必要量採取し、窒素存在下で溶媒を完全に蒸発乾固した。ＰＢＳを添加後、氷上で超音波処理して調製したホスファチジルイノシトールベシクルを、ヒトＨＤＬ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と混合、４℃で２４時間インキュベーションすることにより、ホスファチジルイノシトール（２．５ｍｇ／ｍｌ）をＨＤＬ（５ｍｇ/ｍｌ）に導入したホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを作製した。マウスＥＬをコードするＤＮＡをクローニングしたｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０(インビトロジェン社製) をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、８% ＣＯ_２で２日間培養した。培養液を遠心分離し、細胞を回収して、２０Ｕ/ｍｌのヘパリンを含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、遠心分離により細胞を除去して得た上清をマウスＥＬ酵素溶液とした。２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 (ｐＨ７．５)、０．５％ ウシ血清アルブミン、４ｍＭ 塩化カルシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで構成される反応溶液に基質としてホスファチジルイノシトール−ＨＤＬあるいはＨＤＬを終濃度２ｍｇ／ｍｌになるように加え、最後にマウスＥＬ酵素溶液を添加した（全量で１０μｌ）。３７℃で２時間反応後、ＥＬによって基質から生成されるＮＥＦＡをＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー (和光純薬工業社製) で測定し、そのＮＥＦＡ量（吸光度）を酵素活性指標とした。マウスＥＬ酵素溶液を添加しないときのＮＥＦＡ量をバックグラウンド値とし、実測値よりバックグラウンド値を差し引いた値をＥＬ活性とした（図４）。その結果、マウスＥＬは、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とした方が、ＨＤＬを基質とした時よりも約２倍高い活性を示し、ＨＤＬよりも高感度の基質であることが示唆された。また、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とし、既知のリパーゼ阻害剤であるオルリスタットのマウスＥＬに対する阻害活性を評価したところ、用量依存的な阻害が認められ、阻害剤評価への適用が可能であることが示された（図５）。

【実施例3】

【0040】

ＥＬトランスジェニックマウスの血漿中の内因性ＥＬの活性測定
クロロホルム溶媒中のホスファチジルイノシトール（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を必要量採取し、窒素存在下で溶媒を完全に蒸発乾固した。ＰＢＳを添加し、氷上で超音波処理して調製したホスファチジルイノシトールベシクルを、ヒトＨＤＬ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と混合、４℃で２４時間インキュベーションすることにより、ホスファチジルイノシトール（２．５ｍｇ／ｍｌ）をＨＤＬ（５ｍｇ/ｍｌ）に導入したホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを作製した。ＥＬトランスジェニックマウスにヘパリン（シグマアルドリッチ社製）を含む生理食塩水（大塚製薬社製）を５０ＫＵ／ｋｇ尾静脈より投与し、３０分後に腹部大静脈より採血して得られた血液を遠心分離後、上清を回収して内因性ＥＬを含むプラズマを得た。１００ｍＭトリス塩酸緩衝液 (ｐＨ７．５)、５ｍＭ 塩化カルシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで構成される反応溶液にホスファチジルイノシトール−ＨＤＬあるいはＨＤＬを基質として終濃度１．５ｍｇ／ｍｌになるように加え、最後に過剰量のマウスＥＬ中和抗体又はノーマル抗体処理後のプラズマを添加した（全量で10μｌ）。３７℃で１時間反応後、酵素反応によって生成されたＮＥＦＡをＮＥＦＡ Ｃ―テストワコー (和光純薬工業社製)で測定し、そのＮＥＦＡ量（吸光度）を酵素活性指標とした。血中にあらかじめ内在するＮＥＦＡ量をバックグランドとして、酵素反応時の測定値から差し引いてそれぞれの酵素活性値とした。マウスＥＬ中和抗体存在下での酵素活性値をＮｏｎ ＥＬ活性、ノーマル抗体存在下での酵素活性値からマウスＥＬ中和抗体存在下での酵素活性値を引いた差をＥＬ活性とした（図６）。その結果、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とした方がＥＬ活性が顕在化し、ＥＬとＮｏｎ ＥＬの活性比（ＥＬ活性／Ｎｏｎ ＥＬ活性）は、ＨＤＬに比較してホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とした時の方が約３．５倍高いことが明らかとなった（図６、７）。

【実施例4】

【0041】

野生型マウス及びＥＬノックアウトマウスの血漿中ホスファチジルイノシトール及びホスファチジルエタノールアミン濃度の比較
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の野生型マウス及びＥＬノックアウトマウスから採取したプレヘパリンプラズマ中のホスファチジルイノシトールの定量を、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００６年、第３９巻、９５７−９７２ページを参照して質量分析により実施した（図８及び図９）。その結果、ＥＬノックアウトマウスのプラズマ中のホスファチジルイノシトール濃度は、野生型マウスのそれよりも約１．８倍の上昇が認められたのに対し、ホスファチジルエタノールアミンの濃度は約１．１倍のみの上昇であったことから、ホスファチジルイノシトール濃度が内在性のＥＬ活性を高感度に反映していることが示唆された。

【実施例5】

【0042】

カニクイザルにＥＬ中和抗体を投与した際の血中ＨＤＬコレステロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトール濃度の推移
カニクイザルにＥＬ中和抗体を静脈内投与し経時的に採血したプレヘパリンプラズマ中のＨＤＬコレステロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定した。ＨＤＬコレステロールの定量は自動分析装置で実施した（図１０）。ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトールの定量は、質量分析により実施し、各分子種のトータル量として算出した（図１１、１２）。その結果、ＨＤＬコレステロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトールともにＥＬ中和抗体投与後、経時的に増加し、個々のＥＬ中和抗体投与前の初期値に比較して、ＥＬ中和抗体投与７時間後で、ＨＤＬコレステロールで１.６倍、ホスファチジルイノシトールで２.４倍、リゾホスファチジルイノシトールで２.６倍になっていた。

【実施例6】

【0043】

ホスファチジルイノシトール−リポゾーム、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬ及びホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルを基質とした、ＥＬ活性測定
ホスファチジルイノシトール−リポゾームは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７６年、第１７巻第３号、２３９−２４７ページを、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８２年、第２５７巻第８号、４５３５−４５４０ページを参照して、適宜作製する。
一方、ホスファチジルイノシトール−リポゾーム又はホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬを基質としたＥＬ活性測定は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第４２巻第４６号、１３７７８−１３７８５ページ等を参照して行う。
一方、ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８年、第２６３巻第１２号、５７２４−５７３１ページを参照して、適宜作製する。また、同文献を参照して、ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルを基質として、ＥＬ活性を測定する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】