特許 6363590 アンピシリン耐性の質感付与性乳酸菌株

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6363590

(24)【登録日】2018年7月6日

(45)【発行日】2018年7月25日

(54)【発明の名称】アンピシリン耐性の質感付与性乳酸菌株

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20180712BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20180712BHJP

   A23C 9/127 20060101ALI20180712BHJP

   A23C 9/123 20060101ALI20180712BHJP

   C12R 1/225 20060101ALN20180712BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

   C12Q1/02

   A23C9/127

   A23C9/123

   C12R1:225

【請求項の数】10

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2015-506263(P2015-506263)

(86)(22)【出願日】2013年4月23日

(65)【公表番号】特表2015-516810(P2015-516810A)

(43)【公表日】2015年6月18日

(86)【国際出願番号】EP2013058335

(87)【国際公開番号】WO2013160270

(87)【国際公開日】20131031

【審査請求日】2016年1月20日

(31)【優先権主張番号】12165134.3

(32)【優先日】2012年4月23日

(33)【優先権主張国】EP

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM25852

(73)【特許権者】

【識別番号】503260310

【氏名又は名称】セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100196977

【弁理士】

【氏名又は名称】上原 路子

(72)【発明者】

【氏名】エリック ヨハンセン

(72)【発明者】

【氏名】キム イブ ソーレンセン

(72)【発明者】

【氏名】アネッテ キベニチ

【審査官】 上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００６−２８８２９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−３５７５２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０９２３００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００１−５２００３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−２４５５７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Applied and Environmental Microbiology，２００７年，73(3)，730-739

【文献】 International Journal of Food Microbiology，２００７年，Vol.115，p.35-42

【文献】 Journal of Antimicrobial Chemotherapy，２００７年，Vol.59，p.900-912

【文献】 Food microbiology，１９９３年，10(4)，279-285

【文献】 The Internet Journal of Microbiology，２００９年，8(1)，p.1-10

【文献】 乳業技術，２０１０年，60，66-92

【文献】 International Journal of Dairy Technology，２０１０年，Vol.63, No.2，p.149-170

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−７／００

Ａ２３Ｃ １／００−２３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに受託番号ＤＳＭ２５８５２で寄託されたラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＣＨＣＣ１５４６６株および当該寄託株を出発材料として用いて得られる変異体からなる群より選択される乳酸菌株であって、当該変異体は、当該寄託株の必須特性を保持しており、前記必須特性とは、１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの当該変異体を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間が少なくとも５０秒ということであり、かつ前記変異体は、５つ以下の突然変異誘発処理を施されてものであって、ここで、１つの処理とは、スクリーニング／選択工程前に行う１つの突然変異誘発工程である、乳酸菌株。

【請求項2】

請求項１に記載の乳酸菌株を１０⁴〜１０¹⁴ＣＦＵ／ｇで含む組成物。

【請求項3】

少なくとも１つのラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株を含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

少なくとも１つのラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株および少なくとも１つのストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株を含む、請求項２又は３に記載の組成物。

【請求項5】

凍結、凍結乾燥または液体の形態である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

請求項１に記載の乳酸菌株あるいは請求項２〜５のいずれか１項に記載の組成物を用いて乳基質を発酵することを含む、発酵乳製品を調製するための方法。

【請求項7】

請求項１に記載の乳酸菌株あるいは請求項２〜５のいずれか１項に記載の組成物を含む発酵乳製品。

【請求項8】

乳製品を調製するための請求項１に記載の乳酸菌株あるいは請求項２〜５のいずれか１項に記載の組成物の使用。

【請求項9】

乳製品は、発酵乳製品である、請求項８に記載の使用。

【請求項10】

乳酸菌株を得るための方法であって、
該方法は、
ａ）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）からなる群より選択されるアンピシリン感受性である非変異の乳酸菌株のプールから、その乳酸菌株の増殖に適した培地中で、３７℃で２０時間の培養後、ＯＤ₆₀₀測定による増殖が、アンピシリンを含まない当該培地内での増殖に比べ２０％減少するアンピシリンの量が４００ｎｇ／ｍｌより多いという定義により、抗生物質アンピシリンに耐性がある変異した乳酸菌株のプールを選択および単離すること；ならびに
ｂ）工程ａ）の抗生物質アンピシリンに耐性がある変異した乳酸菌株のプールから、少なくとも１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの当該乳酸菌株を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間が少なくとも５０秒である、乳酸菌株を選択および単離すること；を含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等の乳酸菌の変異体であって、抗生物質アンピシリンに耐性で、かつ、乳中で増殖させると親株の他の増殖特性を保持しながら質感を向上させることが発見された変異体に関する。本発明は、さらに、このような変異体を含むスターター培養物などの培養物、およびこの培養物を用いて発酵させた乳製品に関する。

【背景技術】

【0002】

食品産業では、食品の味および質感を向上させるためのみならず、これらの食品の貯蔵寿命を延ばすために、数多くの細菌、特に乳酸菌、を使用する。酪農産業では、乳酸菌を、（発酵によって）乳を酸性化するためのみならず、それらを取り入れて製品に質感を与えるために、集中して使用する。

【0003】

食品産業で使用される乳酸菌の中では、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属が挙げられる。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種の乳酸菌は、単独でまたはラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）などの他の細菌と組み合わせて、食品、特に発酵製品の製造に広く用いられる。それらは、特に、発酵乳、例えばヨーグルトの製造に使用する発酵物の調合に用いられる。それらのいくつかは、発酵製品の質感を増強させるのに大きな役割を果たしている。この特性は、多糖類の産生と密接に関連している。

【0004】

現在、ヨーグルトの流行は、マイルドな風味と高い質感である。今日、マイルドな風味と高い質感は、マイルドな風味を生みだす培養物を使用すること、および所望の濃厚さを与える増粘剤またはタンパク質を添加することによって達成されている。ヨーグルトの生産者は、増粘剤を添加せず、これらの細菌の特性によりヨーグルトを製造できるようにしたいと望んでいる。これにより、コストを削減し、成分表示の項目が減るだろう。これを達成するための非常に魅力的な方法の１つは、高レベルの質感を生みだすスターター培養物を得ることである。

【0005】

業界の要求を満たすように食品に質感を与えるためには、乳酸菌、特にラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスの新規な質感付与性（ｔｅｘｔｕｒｉｚｉｎｇ）株を設けることが必要となってきている。特にストレプトコッカス・サーモフィルスの新規質感付与性株と共に用いることができるラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの新規質感付与性株が必要である。

【0006】

本発明者らは、以前に、発酵乳製品用の乳基質を発酵するのに使用すると、高い質感をもたらすラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルス菌等の改良された乳酸菌を同定するための新規な選択方法を開発した。

【0007】

国際特許出願（ＰＣＴ）第ＷＯ２０１２／０５２５５７号に記載されている方法は、本発明者が、驚くべきことに、乳酸菌のＤ−サイクロセリンおよび機能的に同等の抗生物質に対する耐性と質感付与特性の向上との間に関連性があることを確認したことに関する。

【0008】

Ｄ−サイクロセリン（Ｄ−４−アミノイソオキサゾリジン）は、細胞溶解を引き起こすアラニンラセマーゼ、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ、Ｄ−アラニル−アラニンシンターゼおよびＤ−アラニンパーミアーゼを阻害する抗生物質である。Ｄ−アラニンラセマーゼは、細胞壁のペプチドグリカン層に不可欠な部分であるＤ−アラニンの産生に必須である。

【0009】

アンピシリンは、ベータラクタムクラスの抗生物質であり、ほとんどの乳酸菌を含む多くのグラム陽性菌に対して有効である。アンピシリンは、ＤＤ−トランスペプチターゼ型の酵素（ＥＣ３．４．１６．４）の競合的阻害剤である。アンピシリンによるＤＤ−トランスペプチターゼの阻害により、細菌細胞壁の形成に必要なペプチド結合の形成が妨げられ、最終的には細胞の溶解がもたらされる。

【0010】

数多くの様々な細菌についてアンピシリン耐性の変異体が記述されているが、本発明者らの知る限り、従来技術では、本明細書中で述べるようなアンピシリン耐性と質感付与特性の向上と間の関連性については記載も示唆もされていない。

【発明の概要】

【0011】

本発明者らは、驚くべきことに、アンピシリンに耐性である乳酸菌変異体群を乳の発酵に用いると、高い剪断応力および／またはゲル剛性が生じることを見出した。

【0012】

本発明者らは、抗生物質アンピシリンおよび／または酵素ＤＤ−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性がある質感付与性乳酸菌株を得るための方法を開発した。

【0013】

本明細書中に記載する乳酸菌株を得るための方法は、以下の２つの工程を含む：
（ｉ）最初に、アンピシリンに耐性な乳酸菌株をスクリーニングし選択する、ここで、アンピシリンに耐性とは、天然／野生型の乳酸菌におけるものよりも通常著しく高いアンピシリン耐性が存在することを意味し得る；ならびに
（ｉｉ）工程（ｉ）で同定されたアンピシリン耐性株のプールから、質感付与特性が向上した乳酸菌株をスクリーニングし選択する。

【0014】

本明細書の実施例２に示すように、本発明者らは、アンピシリン耐性乳酸菌株のプールからだと、質感付与特性が向上した乳酸菌株をスクリーニング／選択するのが比較的早いことを見出した。本質的に、この理由は、非常に多くの割合の（工程（ｉ）で選択した）アンピシリン耐性乳酸菌株は、質感付与特性も向上していることを本発明者らが確認したからである。

【0015】

従って、アンピシリン耐性についての最初のスクリーニングおよび選択は、質感付与特性が向上した乳酸菌株を迅速かつ効率的にスクリーニングおよび選択できるようにするための前工程の一種と見ることができる。

【0016】

当業者には明らかなように、本明細書に記載のスクリーニングおよび選択方法の大きな利点は、質感付与特性が向上した乳酸菌株を比較的迅速かつ効率的にスクリーニングおよび選択できることである。

【0017】

例えば、商業的に関連する特性を有する、例えば、発酵乳製品を調製するのに使用すると後酸性化が低くなるといった、乳酸菌株を既に有している場合、突然変異誘発のための出発細胞としてこの株を使用して、例えば、後酸性化が低いといったその良好な特性を維持したまま質感付与特性が向上した新規の乳酸菌株を比較的迅速に選択し得ることができる。

【0018】

本明細書の実施例２に示すように、最初に選択したアンピシリン耐性株の約２５％が、２８ｍｌの酸性化乳についてポリスチレン２５ｍｌピペットから少なくとも５０秒間という流出時間による基準において、有意に高い質感をもたらした。

【0019】

本明細書に記載の新規なスクリーニングおよび選択方法を使用することなく、このような長時間の流出時間をもたらす乳酸菌株を同定することは不可能であろう（または非常に長い時間がかかるであろう）ことを申し述べる。

【0020】

理論に制限されるものではないが、驚くべきことに本明細書で確認されたアンピシリン耐性と質感付与特性の向上と間の関連性は、アンピシリン耐性乳酸菌細胞は、いわゆる細胞外多糖（ＥＰＳ）を多く生成するという理論により説明できる可能性がある。よって、理論的には、そのようなＥＰＳが細胞の周囲に一種の保護を与えている可能性、すなわち、これらのＥＰＳは細胞に侵入しようとするアンピシリンから細胞を保護し、それによってより高いアンピシリン耐性がもたらされているという可能性が考えられる。

【0021】

理論に制限されるものではないが、ＥＰＳの生成が増加することで、アンピシリン耐性乳酸菌を用いた発酵乳における質感が向上したという可能性も考えられる。

【0022】

上述したように、本明細書中で同定した乳酸菌株は、最初に、アンピシリン耐性、すなわち天然／野生型の乳酸菌が耐えうるものよりも著しく高いアンピシリン濃度に対し耐性であることにより選択される。

【0023】

上記の驚くべき知見に従って、本発明は、アンピシリンに耐性および／または酵素ＤＤ−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性があるラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルス株等の質感付与性乳酸菌株、並びにこのような菌株を得るための方法に関する。さらに、本発明は、かかる変異体を含むスターター培養物等の培養物、並びにかかる培養物を用いて発酵した発酵乳製品等の乳製品に関する。

【発明を実施するための形態】

【0024】

定義
本明細書で使用する場合、用語「乳酸菌」とは、糖を発酵し主に乳酸を生成し、そして酢酸およびプロピオン酸等を含む酸も生成する、グラム陽性の、微好気性または嫌気性細菌を指す。産業的に最も有用な乳酸菌は、「ラクトバチルス目（ｏｒｄｅｒ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）」に見られ、ラクトコッカス種Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ロイコノストック種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．）、ペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ．）、ブレビバクテリウム種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、およびプロピオニバクテリウム種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）が挙げられる。加えて、厳格な嫌気性菌群に属する乳酸産生菌であるビフィズス菌、すなわちビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）も、一般に乳酸菌群に含まれる。これらは、しばしば食用培養物として単独または他の乳酸菌と組み合わせて使用される。ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種の菌を含む乳酸菌は、通常、バルクスターター培養用の凍結または凍結乾燥させた培養物、あるいは発酵乳製品などの乳製品を製造するための発酵容器またはバットに直接植菌するためのいわゆる「ダイレクトバットセット」（Ｄｉｒｅｃｔ Ｖａｔ Ｓｅｔ）」（ＤＶＳ）培養物として酪農産業に供給される。このような培養物は、一般的に「スターター培養物」又は「スターター」と呼ばれている。

【0025】

用語「乳」は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、またはラクダなどの任意の哺乳動物を搾乳して得られる乳汁分泌物として理解されるべきである。好ましい実施形態では、乳は牛乳である。乳という用語には、植物材料からなるタンパク質／脂肪の溶液、例えば、豆乳も含む。

【0026】

用語「乳基質」は、本発明の方法に従って発酵させることができる任意の生乳および／または加工乳材料であり得る。従って、有用な乳基質として、これらに限定されないが、例えば、全乳または低脂肪乳、スキムミルク、バターミルク、再構成粉乳、練乳、粉乳、乳清、乳清透過液、乳糖、乳糖を結晶化させた母液、ホエータンパク質濃縮物、またはクリームなどのタンパク質を含む任意の乳または乳状製品の溶液／懸濁液が挙げられる。明らかに、乳基質は、任意の哺乳動物に由来するもの、例えば、実質的に純粋な哺乳動物の乳であってもよく、または再構成粉乳であってもよい。

【0027】

好ましくは、乳基質中のタンパク質の少なくとも一部は、カゼインまたは乳清タンパク質などの天然の乳中に存在するタンパク質である。しかし、タンパク質の一部は、天然の乳中に存在しないタンパク質であってもよい。

【0028】

発酵前に、乳基質を、当技術分野で既知の方法に従って均質化および低温殺菌してもよい。

【0029】

本明細書で使用する場合、「均質化（Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｉｎｇ）」とは、強力に混合することにより可溶性懸濁液またはエマルジョンを得ることを意味する。均質化を発酵前に行う場合、乳脂肪が乳から分離できないほど小さなサイズに破砕するように行ってもよい。乳を強制的に高圧で小さなオリフィスに通すことによって達成してもよい。

【0030】

本明細書中で使用する「低温殺菌（Ｐａｓｔｅｕｒｉｚｉｎｇ）」とは、微生物などの生きた生物の存在を低減または排除するために乳基質を処理することを意味する。好ましくは、低温殺菌は、指定された期間、指定された温度を維持することによって達成される。指定された温度は、通常、加熱により達成される。温度および時間は、有害細菌などの特定の細菌を殺すまたは不活性化するように選択することができる。その後、急冷工程を行ってもよい。

【0031】

本発明の方法における「発酵」とは、微生物の作用により炭水化物をアルコール又は酸に変換することを意味する。好ましくは、本発明の方法における発酵は、乳糖を乳酸に変換することを含む。

【0032】

発酵乳製品の製造に使用される発酵プロセスは周知であり、当業者は、温度、酸素、微生物の量および特性、ならびに処理時間などの適切なプロセス条件をいかに選択するかがわかるであろう。明らかに、発酵条件は、本発明が達成できるように、すなわち、固体または液体の形態としての乳製品（発酵乳製品）を得るように、選択される。

【0033】

本文脈において、ヨーグルトスターター培養物は、少なくとも１つのラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株および少なくとも１つのストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む細菌培養物である。本明細書では、「ヨーグルト」とは、乳を、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株およびストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む組成物により発酵させることにより得られる発酵乳製品を指す。

【0034】

「質感（ｔｅｘｔｕｒｅ）」または「口当たり（ｍｏｕｔｈｆｅｅｌ）」とは、口の中における製品の物理的および化学的な相互作用を意味する。

【0035】

乳の質感を決定する方法には、発酵乳の剪断応力（粘度（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ））、ゲル剛性、および粘着性（ｒｏｐｉｎｅｓｓ）を測定することを含み、これらは容易に実現可能であり、当技術分野で公知であり、そして本明細書で説明される。

【0036】

本文脈において、用語「剪断応力」、「ゲル剛性」、および「粘着性」が、粘度を決定する。

【0037】

粘度（単位はＰａ・ｓ）は、剪断応力（Ｐａ）／剪断速度（１／ｓ）として定義される。

【0038】

剪断応力の値は、剪断速度＝３００（１／ｓ）が本明細書の標準であるとする。剪断速度が３００（１／ｓ）と測定された粘度を使用すると、官能実験で、レオロジー測定値と粘度感／口当たりの濃さとの間に最高の相関が見られたことが示されている（データは示さず）。

【0039】

用語「ゲル剛性」または「ゲル硬度」とは、発酵乳製品が圧力を受けたときにその構造が保持される時間の長さの尺度であり、１ＨＺで測定される。

【0040】

本明細書で使用する場合、用語「粘着性（ｒｏｐｉｎｅｓｓ）」とは、発酵乳製品における糸（ｓｔｒｉｎｇｓおよびｔｈｒｅａｄｓ）の形成ならびに凝集性（ｃｏｈｅｓｉｖｅｎｅｓｓ）を意味する。粘着性は、Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ Ｊ．１６（２）；１１１−１１８（Ｆｏｌｋｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２００６）に記載のように定義および測定される。

【0041】

本明細書の「アンピシリン耐性」という用語は、特定の変異体細菌株が、当該抗生物質を含む培養培地中で死滅しない、または当該変異体細菌株が由来する対応非変異株と比較してより死滅速度が有意に遅いことを意味する。耐性は、培養培地中の抗生物質化合物の濃度に依存した変異株および非変異株間の増殖特性の違いを反映し得る。例えば、培養培地中の抗生物質の濃度が低いと、非変異株の増殖が停止または大幅に減少する一方、変異株の増殖には影響しないということがある。好ましくは、耐性の評価における感受性標準株として使用できる非変異株として、ＣＨＣＣ１３９９５株が挙げられる。

【0042】

抗生物質アンピシリンに対し耐性である乳酸菌株とは、本明細書では、乳酸菌株の増殖に適した培地（例えば、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスにはＭＲＳ培地、ストレプトコッカス・サーモフィルスには、２％（ｗ／ｖ）乳糖を含有するＭ１７）中で３７℃で２０時間の培養後、ＯＤ₆₀₀測定による増殖が、抗生物質アンピシリンを含まない当該培地内でのＯＤ₆₀₀測定による増殖に比べ２０％減少する抗生物質アンピシリンの量が４００ｎｇ／ｍｌより多い乳酸菌株として定義される。

【0043】

アンピシリンに耐性である変異乳酸菌株は、本明細書ではさらに、Ｅ−テストで読み取る変異乳酸菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値が、当該変異株が由来する母株の場合よりも少なくとも１インクリメント（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ）高いことによっても定義される。

【0044】

本文脈において、用語「変異体」は、本発明の株（または母株）を、例えば、遺伝子操作、放射線照射、および／または化学処理をすることにより得られる由来株または由来可能な株として理解されるべきである。また、変異体は、自然発生する変異体であってもよい。変異体は、機能的に同等な変異体、例えば、母株と実質的に同一または改善した特性（例えば、粘度、ゲル剛性、および粘着性に関する特性）を有する変異体であることが好ましい。このような変異体は、本発明の一部である。特に、用語「変異体」は、本発明の菌株に、エタンメタンスルホネート（ＥＭＳ）又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＮＴＧ）のような化学的突然変異原やＵＶ光を用いた処理を含む従来から用いられている任意の突然変異誘発処理を施して得られる株、または本発明の菌株から自然発生する変異体を意味する。変異体には、複数の突然変異誘発処理（１つの処理とは、スクリーニング／選択工程前に行う１つの突然変異誘発工程であると理解すべきである）を施してもよいが、現在、２０以下、または１０以下、または５以下の処理（またはスクリーニング／選択工程）を実施することが好ましい。現在好ましい変異体は、母株と比較して、細菌ゲノムにおけるヌクレオチドの１％未満、０．１未満、０．０１未満、０．００１％未満、またはさらに低い０．０００１％未満が削除または別のヌクレオチドに置換されている。

【0045】

本文脈において、用語「多様体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、本発明の株と機能的に同等な株、例えば、実質的に同一または改善した特性（例えば、粘度、ゲル剛性、および粘着性に関する特性）を有する株として理解されるべきである。適切なスクリーニング技術を用いて同定できる多様体は、本発明の一部である。

【0046】

本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特に示さない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含するものとして解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、特に断りのない限り、オープンエンドの用語（すなわち「含むが、これらに限定されない」という意味）として解釈すべきである。本明細書において値の範囲を列挙するのは、本明細書中に特に示さない限り、その範囲内の各個別の値をそれぞれ言及するための簡便な方法を単に提供するという意図であり、各個別の値はそれぞれ本明細書に列挙したかのように、明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書で特に示さない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書に示す、任意の及び全ての例、または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより明確にする意図であり、特に断らない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明細書中の言葉は、請求されていない要素が本発明の実施に必須であるという意味に解釈すべきではない。

【0047】

本発明の実施および態様
本明細書で論じるように、高い割合の抗生物質アンピシリン耐性乳酸菌は、乳中で増殖させると、商業的に関連する質感付与性株と比べ質感を向上させることが見出された。

【0048】

当業者は、アンピシリンと効果態様を同じくするかまたは標的を同じくする他の抗生物質も、本明細書に記載の種類の変異体を単離するために単独で又はアンピシリンと組み合わせて使用可能であることを認識するであろう。従って、本発明は、ＤＤ−トランスペプチターゼに対する他の阻害剤といった機能的に等価な他の抗生物質の使用をも包含する。このような抗生物質として、アモキシシリン、ペニシリンＧ、プロカインペニシリン、ベンザチンペニシリン、およびペニシリンＶが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0049】

第１の態様において、本発明は、以下を特徴とする乳酸菌株に関する：
（ｉ）当該乳酸菌株は、その乳酸菌株の増殖に適した培地中で、３７℃で２０時間の培養後、ＯＤ₆₀₀測定による増殖が、抗生物質を含まない当該培地内でのＯＤ₆₀₀測定による増殖に比べ２０％減少する抗生物質の量が４００ｎｇ／ｍｌより多いという定義によると、抗生物質アンピシリンおよび／または酵素ＤＤ−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に対して耐性である；ならびに、
（ｉｉ）少なくとも１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの当該乳酸菌株を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間が少なくとも５０秒である。
好ましくは、工程（ｉ）の抗生物質は、アンピシリンである。

【0050】

（ｉ）の点のＯＤ₆₀₀測定による増殖が２０％減少する抗生物質の量を決定するためのアッセイ、および（ｉｉ）の点の２８ｍｌの酸性化乳についてポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間を決定するためのアッセイの両方とも、既知で市販の標準的な要素に基づくものである。

【0051】

当業者は、本明細書中で説明したようにラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株の成長に適したＭＲＳ培地およびストレプトコッカス・サーモフィルス株の成長に適したＭ１７培地＋２％（ｗ／ｖ）乳糖を含む乳酸菌株の増殖に適した標準培地が分かるであろう。

【0052】

従って、当業者は、本明細書中におけるアッセイの詳細な説明（例えば、実施例２参照）に基づき日常的にこれらのアッセイを繰り返して、ある対象の乳酸菌株がアンピシリンおよび／またはＤＤ−トランスペプチターゼ阻害する他の抗生物質に耐性である要件（（ｉ）の点）および質感付与特性が向上するという要件（（ｉｉ）の点）に適合するか否かを客観的に決定することができる。

【0053】

好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群より選択される。より好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株である。

【0054】

好ましい実施形態では、（ｉ）の点のＯＤ₆₀₀測定による増殖が２０％減少する抗生物質の量は、５００ｎｇ／ｍｌより多い、例えば、６００ｎｇ／ｍｌより多い、例えば、７００ｎｇ／ｍｌより多い。

【0055】

別の好ましい実施形態では、（ｉｉ）の点の流出時間は、少なくとも６０秒、例えば少なくとも７０秒、例えば少なくとも８０秒、例えば少なくとも９０秒、例えば少なくとも１００秒、例えば少なくとも１１０秒である。

【0056】

第二の態様において、本発明は、以下を特徴とする乳酸菌株に関する：
（ｉ）当該乳酸菌株は、Ｅ−テストにおける変異乳酸菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値が、当該乳酸菌株が由来する母株のＭＩＣよりも少なくとも１インクリメント高いという定義によると、抗生物質アンピシリンおよび／または酵素ＤＤ−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に対して耐性である；ならびに、
（ｉｉ）少なくとも１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの当該変異乳酸菌株を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間が、少なくとも１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの当該母株を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間の少なくとも２倍である。
好ましくは、工程（ｉ）の抗生物質は、アンピシリンである。

【0057】

（ｉ）の点のＥ−テスト、および（ｉｉ）の点の２８ｍｌの酸性化乳についてポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間を決定するためのアッセイの両方とも、既知で市販の標準的な要素に基づくものである。

【0058】

従って、当業者は、本明細書中におけるアッセイの詳細な説明（例えば、実施例１および実施例２参照）に基づき日常的にこれらのアッセイを繰り返して、ある対象の乳酸菌株がアンピシリンおよび／またはＤＤ−トランスペプチターゼ阻害する他の抗生物質に耐性である要件（（ｉ）の点）および質感付与特性が向上するという要件（（ｉｉ）の点）に適合するか否かを客観的に決定することができる。

【0059】

好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群より選択される。より好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株である。

【0060】

好ましい実施形態では、（ｉ）の点のＥ−テストにおける変異乳酸菌株のＭＩＣが、母株のＭＩＣよりも少なくとも２インクリメント、例えば少なくとも３インクリメント、例えば少なくとも４インクリメント、例えば少なくとも５インクリメント高い。

【0061】

別の好ましい実施形態では、（ｉｉ）の点の流出時間は、少なくとも５０秒、例えば少なくとも６０秒、例えば少なくとも７０秒、例えば少なくとも８０秒、例えば少なくとも９０秒、例えば少なくとも１００秒、例えば少なくとも１１０秒である。

【0062】

本発明の第３の態様は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに受託番号ＤＳＭ２５８５２で寄託されたラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスＣＨＣＣ１５４６６株およびそれらの変異体および多様体からなる群より選択された乳酸菌株に関する。

【0063】

当業者は、出発材料として当該寄託株を使用することにより、従来の突然変異誘発又は再分離技術により、日常的に、本明細書に記載の関連する特徴および利点を保持するそれらのさらなる変異体または誘導体を得ることができることは、当業者にとって明らかである。従って、用語「それらの変異体」とは、出発材料として当該寄託株を使用することにより得られる変異株であって、少なくとも１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの乳酸菌株を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間が少なくとも５０秒であるという当該寄託株の必須特性を保持している変異体に関する。

【0064】

本発明の第４の態様は、請求項１〜６のいずれか１項に記載の乳酸菌株を１０⁴〜１０¹⁴ＣＦＵ／ｇで含む組成物に関する。

【0065】

好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも１つのラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株を含む。好ましくは、組成物は、少なくとも１つのラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株および少なくとも１つのストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む。

【0066】

別の好ましい実施形態では、組成物は、スターター培養物として使用可能である。

【0067】

さらに別の好ましい実施形態では、組成物は、凍結、凍結乾燥または液体の形態である。

【0068】

本発明に係る乳酸菌株（アンピシリンおよび／またはＤＤ−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性があり、質感付与特性が向上した乳酸菌株）は、好ましくは、発酵乳製品を調製するために使用できる。用量および投与は、当該技術分野に従って実施できる。

【0069】

さらに、発酵乳製品を製造するための本明細書に記載の他の関連工程は、全て当該技術分野に従って実施できる。発酵乳製品を調製するための他の関連工程は、当業者に公知で日常的な工程である。

【0070】

従って、本発明の第５の態様は、本発明の第１、第２、または第３の態様に係る乳酸菌株あるいは本発明の第４の態様に係る組成物を用いて乳基質を発酵することを含む、発酵乳製品を調製するための方法に関する。

【0071】

第６の態様は、本発明の第４の態様に係る方法によって得られる発酵乳製品に関する。

【0072】

第７の態様は、本発明の第１、第２、または第３の態様に係る乳酸菌株あるいは本発明の第４の態様に係る組成物を含む発酵乳製品に関する。

【0073】

本発明の第８の態様は、乳製品を調製するための本発明の第１、第２、または第３の態様に係る乳酸菌株あるいは本発明の第４の態様に係る組成物の使用に関する。

【0074】

好ましい実施形態では、乳製品は、発酵乳製品である。好ましくは、発酵乳製品は、ヨーグルトである。

【0075】

本発明の第９の態様は、乳酸菌株を得るための方法であって、
ａ）乳酸菌株のプールから、その乳酸菌株の増殖に適した培地中で、３７℃で２０時間の培養後、ＯＤ₆₀₀測定による増殖が、抗生物質を含まない当該培地内での増殖に比べ２０％減少する抗生物質の量が４００ｎｇ／ｍｌより多いという定義により、抗生物質アンピシリンおよび／または酵素ＤＤ−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性がある乳酸菌株のプールを選択および単離すること；ならびに
ｂ）工程ａ）のアンピシリンおよび／または酵素ＤＤ−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性がある乳酸菌株のプールから、少なくとも１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの当該乳酸菌株を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間が少なくとも５０秒である、乳酸菌株を選択および単離すること；
を含む方法に関する。

【0076】

好ましくは、当該方法は、
ａ）乳酸菌株のプールから、その乳酸菌株の増殖に適した培地中で、３７℃で２０時間の培養後、ＯＤ₆₀₀測定による増殖が、アンピシリンを含まない当該培地内での増殖に比べ２０％減少するアンピシリンの量が４００ｎｇ／ｍｌより多いという定義により、抗生物質アンピシリンに耐性がある乳酸菌株のプールを選択および単離すること；ならびに
ｂ）工程ａ）の抗生物質アンピシリンに耐性がある乳酸菌株のプールから、少なくとも１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの当該乳酸菌株を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間が少なくとも５０秒である、乳酸菌株を選択および単離すること；
を含む。

【0077】

好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群より選択される。より好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株である。

【0078】

好ましい実施形態では、（ｉ）の点のＯＤ₆₀₀測定による増殖が２０％減少する抗生物質の量は、５００ｎｇ／ｍｌより多い、例えば、６００ｎｇ／ｍｌより多い、例えば、７００ｎｇ／ｍｌより多い。

【0079】

別の好ましい実施形態では、（ｉｉ）の点の流出時間は、少なくとも６０秒、例えば少なくとも７０秒、例えば少なくとも８０秒、例えば少なくとも９０秒、例えば少なくとも１００秒、例えば少なくとも１１０秒である。

【0080】

第１０の態様は、乳酸菌株を得るための方法であって、
ａ）乳酸菌母株を設けること；
ｂ）Ｅ−テストにおける変異乳酸菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値が、当該変異乳酸菌株が由来する母株のＭＩＣよりも少なくとも１インクリメント高いという定義により、抗生物質アンピシリンおよび／または酵素ＤＤ−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性がある変異乳酸菌株のプールを選択および単離すること；ならびに
ｃ）工程ｂ）のアンピシリンおよび／または酵素ＤＤ−トランスペプチターゼを阻害する他の抗生物質に耐性がある変異乳酸菌株のプールから、少なくとも１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの当該変異乳酸菌株を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間が、少なくとも１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの当該母株を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間の少なくとも２倍である、変異乳酸菌株を選択および単離すること；
を含む方法に関する。

【0081】

好ましくは、当該方法は、
ａ）乳酸菌母株を設けること；
ｂ）Ｅ−テストにおける変異乳酸菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値が、当該変異乳酸菌株が由来する母株のＭＩＣよりも少なくとも１インクリメント高いという定義により、抗生物質アンピシリンに耐性がある変異乳酸菌株のプールを選択および単離すること；ならびに
ｃ）工程ｂ）のアンピシリンに耐性がある変異乳酸菌株のプールから、少なくとも１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの当該変異乳酸菌株を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間が、少なくとも１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの当該母株を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間の少なくとも２倍である、変異乳酸菌株を選択および単離すること；
を含む。

【0082】

好ましい実施形態では、乳酸菌母株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスおよびストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群より選択される。より好ましい実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株である。

【0083】

本発明のさらにより好ましい実施形態では、母株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに受託番号ＤＳＭ２４０２１で寄託されたラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスＣＨＣＣ１３９９５株である。

【0084】

好ましい実施形態では、（ｉ）の点のＥ−テストにおける変異乳酸菌株のＭＩＣが、母株のＭＩＣよりも少なくとも２インクリメント、例えば少なくとも３インクリメント、例えば少なくとも４インクリメント、例えば少なくとも５インクリメント高い。

【0085】

別の好ましい実施形態では、（ｉｉ）の点の、少なくとも１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの当該変異乳酸菌株を接種し３７℃で２０時間酸性化した、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有する２８ｍｌの全脂肪牛乳についてのポリスチレン２５ｍｌピペットからの流出時間は、少なくとも５０秒、例えば少なくとも６０秒、例えば少なくとも７０秒、例えば少なくとも８０秒、例えば少なくとも９０秒、例えば少なくとも１００秒、例えば少なくとも１１０秒である。

【0086】

本発明の第１１の態様は、本発明の第８または第９の態様に係る方法によって得られる乳酸菌株に関する。

【0087】

本発明はさらに、以下の非限定的な実施例によって説明される。

【実施例】

【0088】

材料：
培地：ストレプトコッカス・サーモフィルスに適切な培地として、次の培地が挙げられる。
以下の組成を有する既知のＭ１７寒天培地：
寒天、１２．７５ｇ／Ｌ
アスコルビン酸、０．５ｇ／Ｌ
カゼインペプトン（トリプシン分解）、２．５ｇ／Ｌ
β−グリセロリン酸二ナトリウム五水和物、１９ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム水和物、０．２５ｇ／Ｌ
肉エキス、５ｇ／Ｌ
肉ペプトン（ペプシン分解）、２．５ｇ／Ｌ
ソヤペプトン（パパイン分解）、５ｇ／Ｌ
酵母エキス、２．５ｇ／Ｌ。

そして、以下の組成を有するＭ１７ブロス培地：
アスコルビン酸、０．５ｇ／Ｌ
乳糖、５ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム、０．２５ｇ／Ｌ
肉エキス、５ｇ／Ｌ
肉ペプトン（ペプシン分解）、２．５ｇ／Ｌ
グリセロリン酸ナトリウム、１９ｇ／Ｌ
ソヤペプトン（パパイン分解）、５ｇ／Ｌ
トリプトン、２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス、２．５ｇ／Ｌ
最終ｐＨ７．０±０．２（２５℃）。

【0089】

これらの培地は、通常、２０ｇ／ｌの乳糖（２％ｗ／ｖ）を添加して使用される。

【0090】

ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスに適切な培地として、次の培地が挙げられる。
以下の組成を有する既知のＭＲＳ寒天培地：
バクトプロテオースペプトンＮｏ．３、１０ｇ／ｌ
バクト牛肉エキス、１０ｇ／ｌ
バクト酵母エキス、５ｇ／ｌ
デキストロース、２０ｇ／ｌ
ソルビタンモノオレート複合体、１ｇ／ｌ
クエン酸アンモニウム、２ｇ／ｌ
酢酸ナトリウム、５ｇ／ｌ
硫酸マグネシウム、０．１ｇ／ｌ
硫酸マンガン、０．０５ｇ／ｌ
第二リン酸カリウム、２ｇ／ｌ
バクト寒天、１５ｇ／ｌ。

そして、以下の組成を有するＭＲＳブロス培地：
バクトプロテオースペプトンＮｏ．３、１０ｇ／ｌ
バクト牛肉エキス、１０ｇ／ｌ
バクト酵母エキス、５ｇ／ｌ
デキストロース、２０ｇ／ｌ
ソルビタンモノオレート複合体１ｇ／ｌ
クエン酸アンモニウム、２ｇ／ｌ
酢酸ナトリウム、５ｇ／ｌ
硫酸マグネシウム、０．１ｇ／ｌ
硫酸マンガン、０．０５ｇ／ｌ
第二リン酸カリウム、２ｇ／ｌ
最終ｐＨ６．５±０．２（２５℃）。

【0091】

当業者に知られているように、Ｍ１７培地は、ストレプトコッカス・サーモフィルスの増殖に適していると考えられる培地であり、ＭＲＳ培地は、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの増殖に適していると考えられる培地である。

【0092】

当業者によって理解されるように、本文脈において、特定のＭ１７およびＭＲＳ培地濃縮物は、異なる業者から得てもよく、また、特定の業者が、独立して、本明細書に関連する対象株のアンピシリン耐性について（標準的な測定不確実性の範囲内で）本明細書に関連する結果を得てもよい。

【0093】

実施例１：アンピシリン耐性選択アッセイ
当該方法を、ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの株を用いて示す。ストレプトコッカス・サーモフィルスを用いたアンピシリン耐性選択アッセイを実施するために、ＭＲＳ培地ではなく、Ｍ１７培地に２％ｗ／ｖ乳糖を加えたものを使用すべきである。

【0094】

対象のラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス株を１０ｍｌのＭＲＳブロス培地に接種して、嫌気条件下、３７℃で少なくとも２０時間培養する。培養物に浸漬した綿棒を使用し、ＭＲＳ寒天プレート（直径９０ｍｍ）の表面全体に塗布する。抗生物質感受性試験（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，ｃａｔ．＃５０１５５８））用のアンピシリンＥ−テストスティック（０．０１６〜２５６μｇ／ｍｌ）を寒天上に置き、プレートを嫌気条件下、３７℃で２４時間以内インキュベートする。アンピシリンの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）とは、播種した株について目視できるほど増殖が阻害される最低濃度のことであり、これは楕円形の阻害領域がＥ−テストストリップと交わる点において読み取る。

【0095】

本明細書で説明するようなアンピシリンに対する耐性が増加したラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス細胞は、本明細書ではＥ−テストで読み取られるＭＩＣ値が、母株よりも少なくとも１インクリメント高いラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス細胞として定義する。

【0096】

アンピシリンに対する耐性の増加についてこの基準を満たすことができる細胞は、本明細書では、本実施例１のアンピシリン耐性アッセイにおけるアンピシリン耐性細胞として定義する。

【0097】

結論：
特定の対象株（例えば、関連する市販品から得た株）について本実施例１のアンピシリン耐性選択アッセイに基づき、当業者は、この特定の対象株が本明細書における関連アンピシリン耐性を有するか否かを日常的にテストすることができる。

【0098】

実施例２：レオロジー特性が向上したラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス変異体を単離するためのアンピシリンの使用
株：
ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスＣＨＣＣ１３９９５
ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスＣＨＣＣ１５４６６（ＣＨＣＣ１３９９５のアンピシリン耐性変異体）

【0099】

変異体の単離：
ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスＣＨＣＣ１３９９５株のアンピシリン耐性変異体を単離するために、０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌまたは７００ｎｇ／ｍｌの量のアンピシリンを含有する１０ｍｌのＭＲＳブロス中に単一コロニー由来の増殖細胞を嫌気的に接種し３７℃で少なくとも２０時間増殖させた。

【0100】

２０時間の増殖後、全てのサンプルについてのＯＤ₆₀₀を測定した。

【0101】

通常、ＯＤ₆₀₀測定によるラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの嫌気的な増殖が、アンピシリンを含まないＭＲＳ培地（すなわち、０ｎｇ／ｍｌのアンピシリン）に比べ２０％減少するアンピシリンの濃度は、３００ｎｇ／ｍｌより多かった。アンピシリンの濃度が５００ｎｇ／ｍｌであった培養物を希釈して、アンピシリンを添加していないＭＲＳ寒天プレート上に播種し、その後、３７℃で少なくとも２０時間嫌気的にインキュベートした。その後、５００ｎｇ／ｍｌのアンピシリンが存在するマイクロタイタープレート内で３７℃で嫌気的な増殖をしたコロニーをピックアップしてスクリーニングした。通常、得られたコロニーの２５％は、アンピシリンの存在下で高速に増殖するものとして同定された。これらを、さらなる研究用に選択した。選択したアンピシリン耐性変異体をさらに精製し、それらの乳中で増殖できる能力について試験した。この作業中、変異体のいくつかは以下の条件で親株よりもかなり優れた質感をもたらすことが観察された。

【0102】

粘性スクリーニング：
レオロジースクリーニング分析は、単純なピペット粘度試験により行った。この試験では、アンピシリン耐性変異株の粘度を、２８ｍｌの酸性化乳を充填したポリスチレン２５ｍｌピペット（ＣＥＬＬＳＴＡＲ（登録商標））からの流出時間を測定することによって、前もって（実際のレオロジー試験前に）試験した。
各サンプルは、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を添加した全脂肪牛乳に、アンピシリン耐性変異体を乳１ｍｌにつき少なくとも１０⁴個の細胞の量で接種し３７℃で２０時間おいて酸性化させた。

【0103】

ピペッティング試験の前に、酸性化した乳を静かに攪拌することにより均質化し、その後ポリスチレン２５ｍｌピペットの上部まで（２８ｍｌ）充填し、各サンプルについてピペットからの流出時間を３回測定した。表１は、２１株のアンピシリン耐性変異体を用いて３７℃で２０時間発酵した乳についてのピペット粘度試験の結果を示す。結果は、これらの変異体のほとんどは、母株より高い粘度をもたらすことを示している。２１株のアンピシリン耐性変異体のうち６株については流出時間が母株のものに比べ２倍になり、アンピシリン耐性変異体の約２５％は少なくとも５０秒の流出時間となった。

【0104】

特に、変異体１８（アンピシリン変異体Ｎｏ．１８）は、流出時間が長かった。この変異由来株をＣＨＣＣ１５４６６として指定し、実施例３に記載したレオロジー試験に使用した。

【0105】

【表1】

【0106】

結論
本明細書中に記載のラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスアンピシリン耐性変異体は、望ましい高レベルの質感を生みだすスターター培養物として、培養物に取り入れることができる。

【0107】

実施例３：発酵乳製品の調製のためのストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスアンピシリン耐性変異体の使用
レオロジー：
２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を添加した全脂肪牛乳における増殖に続き、レオロジー分析をＲｅｏＬｏｇｉｃａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＢ，ＳｗｅｄｅｎのＳｔｒｅｓｓＴｅｃｈレオメータを用いて行った。

【0108】

上述の実施例は、選択したアンピシリン耐性変異体を単一の培養物として用い発酵した発酵乳は質感が向上したことを示す。本実施例では、ヨーグルトとして製造した発酵乳、すなわちストレプトコッカス・サーモフィルスおよびラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの株を組み合わせて用いた発酵乳の質感を分析する。いくつかの変異体により向上する質感付与効果を実証するために、ヨーグルトは、１つの野生型ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ４８９５株を固定し、これにそれぞれラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカス野生型ＣＨＣＣ１３９９５株またはアンピシリン耐性ＣＨＣＣ１５４６６株のいずれかを混合した組み合わせを用いて製造した。ヨーグルト培養物は、ストレプトコッカス・サーモフィルス：ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスが９：１の比率の混合物を、２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を添加した全脂肪牛乳に接種し、最終ｐＨが４．５０になるまで４０℃で発酵した。以下の混合物を、４℃で５日間保存した後にＳｔｒｅｓｓｔｅｃｈレオメータを用いて分析した。粘着性は、Ｆｏｌｋｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００６．Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ Ｊ．１６（２）；１１１−１１８）に記載の通りに測定する。結果を表２に示す。

【0109】

【表2】

【0110】

結果は、アンピシリン耐性変異体ＣＨＣＣ１５４６６の単一の培養物を用いて観察された向上した質感付与特性は、ストレプトコッカス・サーモフィルス株の存在下でも維持されることを明らかに示すものである。

【0111】

この変異体をラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスの野生型株の代わりにヨーグルト発酵に用いると、剪断応力への影響はわずかだが、ゲル剛性および粘着性は顕著に向上した。

【0112】

結論
本明細書に記載のラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスのアンピシリン耐性変異体は、ヨーグルト等の発酵乳製品に望ましい高レベルの質感を生みだすスターター培養物として、培養物に取り入れることができる。

【0113】

寄託および専門家の取決
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ４８９５の株は、２００７年３月２９日、ドイツ国Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ），Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに受託番号ＤＳＭ１９２４２で寄託された。

【0114】

ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスＣＨＣＣ１３９９５の株は、２０１０年９月２２日、ドイツ国Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに受託番号ＤＳＭ２４０２１で寄託された。

【0115】

ラクトバチルス・デルブリッキー亜種ブルガリカスＣＨＣＣ１５４６６の株は、２０１２年４月３日、ドイツ国Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに受託番号ＤＳＭ２５８５２で寄託された。

【0116】

寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件の下で行われた。

【0117】

出願人は、寄託微生物のサンプルは、出願人により承認された専門家のみが利用可能とすべきことを要求する。