特許 6365863 質量分析におけるペプチドピークの同定・定量のためのデータベース作成方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6365863

(24)【登録日】2018年7月13日

(45)【発行日】2018年8月1日

(54)【発明の名称】質量分析におけるペプチドピークの同定・定量のためのデータベース作成方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20060101AFI20180723BHJP

【ＦＩ】

   G01N27/62 X

   G01N27/62 V

【請求項の数】5

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2013-147591(P2013-147591)

(22)【出願日】2013年7月16日

(65)【公開番号】特開2015-21739(P2015-21739A)

(43)【公開日】2015年2月2日

【審査請求日】2016年7月5日

(73)【特許権者】

【識別番号】504159235

【氏名又は名称】国立大学法人 熊本大学

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100102255

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤 誠次

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(72)【発明者】

【氏名】大槻 純男

【審査官】 伊藤 裕美

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−０９１３４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／００７８８４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０４４４０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０１４８５３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 中津海洋一，次世代プロテオミクスが拓く生命科学研究の新地平：ウエスタンブロッティングはもう要らない？！，生化学，２０１２年 １月，第84巻第1号，pp.53-57

【文献】 Gillet LC，Targeted Data Extraction of the MS/MS Spectra Generated by Data-independent Acquisition: A New Conce，Mol Cell Proteomics，２０１２年 １月１８日，11/6，O111.016717，DOI: 10.1074/mcp.O111.016717

【文献】 Liu,Y. et al，Quantitative measurements of N-linked glycoproteins in human plasma by SWATH-MS，Proteomics，２０１３年 ３月１１日，13/8，1247-56

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２７／６０− Ｇ０１Ｎ ２７／７０

Ｈ０１Ｊ ４９／００− Ｈ０１Ｊ ４９／４８

Ｇ０１Ｎ ３３／４８− Ｇ０１Ｎ ３３／９８

Ｇ０１Ｎ ３０／００− Ｇ０１Ｎ ３０／９６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いた解析により複数の対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを同定及び／又は定量するための、ペプチドピークの溶出時間、及び該ペプチドピークの溶出時間に対応するＭＲＭトランジション並びにピーク強度を格納したデータベースを作成する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｆ）を備えたことを特徴とする方法。
（ａ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析で得られる、対象タンパク質を構成するペプチドを含むペプチド群由来のペプチドピーク群の標準溶出時間、及び、前記ペプチドピーク群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション並びにピーク強度を取得し、データベースに格納する工程；
（ｂ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析で得られる、対象タンパク質’を構成するペプチド’を含むペプチド’群由来のペプチドピーク’群の溶出時間、及び、前記ペプチドピーク’群の溶出時間に対応するＭＲＭトランジション並びにピーク強度を取得する工程；（ｃ）前記ペプチドピーク群の中から前記ペプチドピーク’群と共通するペプチドピークを標準化用ペプチドピーク群として選択する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で選択した標準化用ペプチドピーク群の標準溶出時間を基準に、前記ペプチドピーク群の標準溶出時間と前記ペプチドピーク’群の溶出時間とのアライメントを行い、前記ペプチドピーク’群の溶出時間を前記ペプチドピーク群の標準溶出時間に標準化し、前記ペプチドピーク’群の標準溶出時間を取得する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で取得した前記ペプチドピーク’群の標準溶出時間を前記ペプチドピーク群の標準溶出時間に組み込み、新たなペプチドピーク群の標準溶出時間として前記データベースに格納する工程；
（ｆ）ペプチドピーク’群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション及びピーク強度を、前記データベースに格納する工程；

【請求項2】

工程（ｂ）〜（ｆ）の工程を、２〜２５回繰り返すことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いた解析により１又は複数の試料中の１又は複数の対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを同定する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）を備えたことを特徴とする方法。
（Ａ）試料中の対象タンパク質群をタンパク質消化酵素により断片化処理し、対象ペプチド群を調製する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で調製した対象ペプチド群を用いて、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いた解析を行い、ペプチドピークの溶出時間、質量電荷比（ｍ／ｚ）、及びＭＲＭクロマトグラム情報を含むデータを取得する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）で取得したペプチドピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）を基に対象ペプチドピーク群を同定し、該対象ペプチドピーク群の中から請求項１又は２に記載の方法を用いて作成したデータベースに格納されるペプチドピーク群と共通するペプチドピークを標準化用対象ペプチドピーク群として選択する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で選択した標準化用対象ペプチドピーク群の溶出時間を基準に、対象ペプチドピーク群の溶出時間と、請求項１又は２に記載の方法を用いて作成したデータベースに格納されるペプチドピーク群の標準溶出時間とのアライメントを行い、請求項１又は２に記載の方法を用いて作成したデータベースに格納されるペプチドピーク群の標準溶出時間を、対象ペプチドピーク群の溶出時間にシフトし、シフトした標準溶出時間と、該シフトした標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション及びピーク強度とを再構築イオンライブラリとして取得する工程；
（Ｅ）工程（Ｄ）で取得した再構築イオンライブラリを用いて、工程（Ｂ）で取得したＭＲＭクロマトグラム情報を含むデータからペプチドピークのＭＲＭクロマトグラムを抽出し、前記ＭＲＭクロマトグラムから対象ペプチドピーク群を同定する工程；

【請求項4】

さらに、複数の試料間における対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを定量するための以下の工程（Ｆ）及び（Ｇ）を備えたことを特徴とする請求項３に記載の方法。
（Ｆ）工程（Ｅ）で同定した対象ペプチドピーク群の中から、
請求項１又は２に記載の方法を用いて作成したデータベースに格納される対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションのうち、最大ピーク強度を付与するＭＲＭトランジションのクロマトグラムから得られるピーク面積と、請求項１又は２に記載の方法を用いて作成したデータベースに格納される対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションのクロマトグラムから得られるペプチドピーク面積の合計とのピーク面積の比と、
前記最大ピーク強度を付与するＭＲＭトランジションにおける最大ピーク強度と、前記ピーク面積の合計に用いたＭＲＭトランジションにおけるピーク強度の合計とのピーク強度の比と
の比を基に、対象ペプチドピーク群の定量用ペプチドピークを選択する工程；
（Ｇ）工程（Ｆ）で選択した対象ペプチドピーク群の定量用ペプチドピーク面積を複数の試料について算出し、算出したピーク面積の比から、複数の試料間における対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを定量する工程；

【請求項5】

タンパク質消化酵素による断片化処理が、トリプシンとリシルエンドペプチダーゼとの併用による断片化処理であることを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いた解析により複数の対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを同定及び／又は定量するための、ペプチドピークの溶出時間、及び該ペプチドピークの溶出時間に対応するＭＲＭトランジション並びにピーク強度を格納したデータベースを作成する方法や、かかる方法を用いて作成したデータベースや、かかるデータベースを用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析により試料中の対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを同定・定量する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

プロテオミクスは、タンパク質を網羅的に解析する手法であり、生命科学、特にバイオマーカーの研究に重要な手法である。近年、プロテオミクスは、試料中に存在するタンパク質の網羅的な同定のみならず、異なる試料間で変動するタンパク質を網羅的に同定・定量する網羅的定量比較のツール（定量プロテオミクス）としても期待が高まり、これまでに様々な手法が開発され、利用されている（非特許文献１）。定量プロテオミクスは、ショットガンプロテオミクス、すなわち、多数のタンパク質を含む試料をタンパク質分解酵素処理してペプチド断片を分離し、質量分析法を用いてペプチド断片を同定する手法を技術基盤としているため、比較解析できるタンパク質は同一解析試料において同定されたものに限られる。そのため、質量分析法や質量分析前にペプチド断片を分離する方法を改良することにより、比較解析できるタンパク質数を増加させることが行われている。

【0003】

ショットガンプロテオミクスを用いないプロテオミクスとして多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いたプロテオミクスがある。ＭＲＭを用いたプロテオミクスは、前駆（プリカーサー）イオン（Ｑ１）及びプロダクトイオン（Ｑ３）の質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づき、特定のＭＲＭトランジションを用いて標的タンパク質を定量する手法であるが（非特許文献１〜３）、かかる手法と安定同位体で標識した内部標準ペプチドを組み合わせて用いることにより、異なる試料中における標的タンパク質の量的変化を、高感度且つ高精度に定量することができる（非特許文献４〜６、特許文献１）。しかし、定量できるのは標的タンパク質に限られることや、質量分析におけるスキャン速度や標識内部標準ペプチド数により、定量できる標的タンパク質の数が限られていることが問題とされていた。

【0004】

最近、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおける新たなデータ取得法としてＳＷＡＴＨ−ＭＳ取得法が開発された（非特許文献４、７）。かかるＳＷＡＴＨ−ＭＳ取得法により、試料から全てのＭＳ／ＭＳデータを取得し、ＭＲＭトランジションを用いたＭＲＭ解析を行うことができる。ＳＷＡＴＨで取得したデータには、非常に低レベルで発現するタンパク質に関する情報も含まれるものの（非特許文献４）、ＳＷＡＴＨで取得したデータは、同一解析試料をショットガンプロテオミクス等の従来の質量分析法により解析し、同定されたタンパク質についてのＭＲＭトランジションや溶出時間（「保持時間［retention times；ＲＴ］」ともいう）等の情報に基づいて定量解析（標準的ＳＷＡＴＨ定量法）されるため、発現レベルが低い等の理由で同一解析試料において同定されなかったタンパク質については定量することができない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２００７／０５５１１６号パンフレット

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Malmstrom, L., et al. Proteomics 11, 2947-2956 (2011)

【非特許文献2】Gillette, M.A. & Carr, S.A. Nat Methods 10, 28-34 (2013)

【非特許文献3】Surinova, S., et al. J Proteome Res 10, 5-16 (2011)

【非特許文献4】Gillet, L.C., et al. Mol Cell Proteomics 11, O111 016717 (2012).

【非特許文献5】Kamiie, J., et al. Pharm Res 25, 1469-1483 (2008)

【非特許文献6】Ohtsuki, S., et al. J Pharm Sci 100, 3547-3559 (2011)

【非特許文献7】Liu, Y., et al. Proteomics 13, 1247-1256 (2013)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の課題は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析により、高感度に且つ網羅的に対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを同定・定量するためのデータベースを作成する方法や、前記データベースを用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析により、高感度に且つ網羅的に対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを同定・定量できる方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

対象タンパク質を構成するペプチドがＬＣ−ＭＳ／ＭＳの液体クロマトグラフ部から溶出され質量分析計で検出されるまでの時間、すなわち溶出時間（保持時間［retention times；ＲＴ」ともいう］は、ペプチドピークを同定するために不可欠であるものの、解析試料間で変動することが問題とされていた。本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、解析試料間で同定されたペプチドピーク群のうち、共通するペプチドピーク群の溶出時間を基準として、解析試料間のペプチドピーク群の溶出時間の標準化を図り、標準化した溶出時間が蓄積したデータベースを作成したところ、データベース中に１０万個以上のペプチドピークの溶出時間を精度の良く蓄積することができることが見いだされた。さらにかかるデータベースを用いて試料中の対象タンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析を行い、測定対象ペプチドピークを同定し、同定したペプチドピークの中からペプチドピークのバリデーションを行うことにより、標準的ＳＷＡＴＨ定量法を用いて同定できなかったペプチドピークの増減も精度よく検出できることを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。

【0009】

すなわち、本発明は、（１）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いた解析により複数の対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを同定及び／又は定量するための、ペプチドピークの溶出時間、及び該ペプチドピークの溶出時間に対応するＭＲＭトランジション並びにピーク強度を格納したデータベースを作成する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｆ）を備えたことを特徴とする方法に関する。
（ａ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析で得られる、ペプチドピーク群の標準溶出時間、及び、前記ペプチドピーク群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション並びにピーク強度を取得し、データベースに格納する工程；
（ｂ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析で得られる、ペプチドピーク’群の溶出時間、及び、前記ペプチドピーク’群の溶出時間に対応するＭＲＭトランジション並びにピーク強度を取得する工程；
（ｃ）前記ペプチドピーク群の中から前記ペプチドピーク’群と共通するペプチドピークを標準化用ペプチドピーク群として選択する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で選択した標準化用ペプチドピーク群の標準溶出時間を基準に、前記ペプチドピーク群の標準溶出時間と前記ペプチドピーク’群の溶出時間とのアライメントを行い、前記ペプチドピーク’群の溶出時間を前記ペプチドピーク群の標準溶出時間に標準化し、前記ペプチドピーク’群の標準溶出時間を取得する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で取得した前記ペプチドピーク’群の標準溶出時間を前記ペプチドピーク群の標準溶出時間に組み込み、新たなペプチドピーク群の標準溶出時間として前記データベースに格納する工程；
（ｆ）ペプチドピーク’群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション及びピーク強度を、前記データベースに格納する工程；

【0010】

また、本発明は、（２）工程（ｂ）〜（ｆ）の工程を、２〜２５回繰り返すことを特徴とする上記（１）に記載の方法に関する。

【0011】

また、本発明は、（３）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いた解析により複数の対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを同定及び／又は定量するためのデータベースであって、上記（１）又は（２）に記載の方法を用いて作成した、１０万個以上のペプチドピークの溶出時間、及び該ペプチドピークの溶出時間に対応するＭＲＭトランジション並びにピーク強度を備えたことを特徴とするデータベースに関する。

【0012】

また、本発明は、（４）液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いた解析により１又は複数の試料中の１又は複数の対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを同定する方法であって、以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）を備えたことを特徴とする方法に関する。
（Ａ）試料中の対象タンパク質群をタンパク質消化酵素により断片化処理し、対象ペプチド群を調製する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で調製した対象ペプチド群を用いて、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いた解析を行い、ペプチドピークの溶出時間、質量電荷比（ｍ／ｚ）、及びＭＲＭクロマトグラム情報を含むデータを取得する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）で取得したペプチドピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）を基に対象ペプチドピーク群を同定し、該対象ペプチドピーク群の中から上記（１）又は（２）に記載の方法を用いて作成したデータベースに格納されるペプチドピーク群と共通するペプチドピークを標準化用対象ペプチドピーク群として選択する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で選択した標準化用対象ペプチドピーク群の溶出時間を基準に、対象ペプチドピーク群の溶出時間と、上記（１）又は（２）に記載の方法を用いて作成したデータベースに格納されるペプチドピーク群の標準溶出時間とのアライメントを行い、上記（１）又は（２）に記載の方法を用いて作成したデータベースに格納されるペプチドピーク群の標準溶出時間を、対象ペプチドピーク群の溶出時間にシフトし、シフトした標準溶出時間と、該シフトした標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション及びピーク強度とを再構築イオンライブラリとして取得する工程；
（Ｅ）工程（Ｄ）で取得した再構築イオンライブラリを用いて、工程（Ｂ）で取得したＭＲＭクロマトグラム情報を含むデータからペプチドピークのＭＲＭクロマトグラムを抽出し、前記ＭＲＭクロマトグラムから対象ペプチドピーク群を同定する工程；

【0013】

また、本発明は、（５）さらに、複数の試料間における対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを定量するための以下の工程（Ｆ）及び（Ｇ）を備えたことを特徴とする上記（４）に記載の方法に関する。
（Ｆ）工程（Ｅ）で同定した対象ペプチドピーク群の中から、ピーク面積とピーク強度との比を基に、対象ペプチドピーク群の定量用ペプチドピークを選択する工程；
（Ｇ）工程（Ｆ）で選択した対象ペプチドピーク群の定量用ペプチドピーク面積を複数の試料について算出し、算出したピーク面積の比から、複数の試料間における対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを定量する工程；

【0014】

さらに本発明は、（６）タンパク質消化酵素による断片化処理が、トリプシンとリシルエンドペプチダーゼとの併用による断片化処理であることを特徴とする上記（４）又は（５）に記載の方法に関する。

【発明の効果】

【0015】

本発明によると、高感度に且つ網羅的に対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを同定・定量できるため、健常者由来の試料と、癌やアルツハイマーや心疾患などの各種疾患患者由来の試料との間で発現量が変動する対象タンパク質を高感度且つ網羅的に同定し、定量することができ、バイオマーカー探索分野やバイオマーカーを用いた疾患診断分野で有用である。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１Ａ及びＢは、本発明のデータベースの作成方法の概要を示す。図１Ｃ〜Ｅは、ヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）画分を用いて本発明のデータベースを作成した結果を示す図である。

【図2】図２Ａは、本発明のデータベースを用いたイオンライブラリの再構築法の概要を示す。図２Ｂは、本発明のデータベースを用いてイオンライブラリを再構築したときの実測値ＲＴと補正（シフト）したｎＲＴとの差異を示す。図２Ｃは、２回の実験（図中「Exp1」と「Exp2」）により、標準的ＳＷＡＴＨ定量法を用いて同定・定量したペプチドピークの面積を比較した結果を示す図である。図２Ｄは、２回の実験（図中「Exp1」と「Exp2」）により、本発明のデータベースを用いて同定・定量したペプチドピークの面積を比較した結果を示す図である。図２Ｅは、２回の実験（図中「Exp1」と「Exp2」）により、本発明のデータベースを用いて同定したペプチドピークからペプチドピークのバリデーションを行い抽出したペプチドピーク面積を比較した結果を示す図である。図２Ｆは、２回の実験（図中「Exp1」と「Exp2」）により、本発明のデータベースを用いて同定したペプチドピークからペプチドピークのバリデーションを行い抽出したペプチドピークの中からさらにＭＲＭトランジション数が３以上のペプチドピークを抽出し、その面積を比較した結果を示す図である。

【図3】図３は、モデル試料を用いて本発明のデータベースによるＳＷＡＴＨ定量解析の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明のデータベースは、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いた解析により複数の対象タンパク質を構成するペプチドの複数のペプチドピークを同定及び／又は定量するための、１０万個以上のペプチドピークの溶出時間、及び該ペプチドピークの溶出時間に対応するＭＲＭトランジション並びにピーク強度を格納したものであり、本発明のデータベースに格納される「ペプチドピーク」には、対象タンパク質を構成するペプチド由来のピークが含まれる。本発明のデータベースは、以下の工程（ａ）〜（ｆ）を備えた方法（以下、「本件データベースの作成方法」ということがある）を用いて作成することができる。

【0018】

工程（ａ）
工程（ａ）においては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析で得られる、ペプチドピーク群の標準溶出時間やかかるペプチドピーク群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジションやピーク強度を取得し、データベースに格納する。上記「ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析で得られる、ペプチドピーク群の標準溶出時間やかかるペプチドピーク群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジションやピーク強度」は、実際に、自ら対象タンパク質を含む試料（対象タンパク質試料）をタンパク質消化酵素により断片化処理し、対象タンパク質を構成するペプチドを含むペプチド群を調製した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析を行うことにより得られた、上記ペプチド群由来のピーク（ペプチドピーク群）の標準溶出時間や、かかるペプチドピーク群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジションやピーク強度であってもよいし、第三者が上記解析を行うことにより得られた、ペプチドピーク群の標準溶出時間や、かかるペプチドピーク群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジションやピーク強度（のデータ［情報］）であってもよい。

【0019】

上記対象タンパク質試料としては、対象タンパク質を含む試料であれば特に制限されず、具体的には、生体から採取された細胞、組織、血液等を、凍結融解法、フレンチプレス、グラスビーズ、ホモジナイザー、超音波破砕装置等を用いた破砕処理により得られる未分画試料や、かかる未分画試料を、分画遠心法、ショ糖密度勾配遠心法等による分画処理することにより得られる細胞膜画分試料や細胞質画分試料を挙げることができる。

【0020】

上記タンパク質消化酵素としては、タンパク質の特定のアミノ酸部位で消化（切断）され、断片したペプチドが調製できる酵素であれば特に制限されず、具体的には、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ-Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｎ−Ｃ、リシルエンドペプチダーゼ、及びクロストリパインを挙げることができる。タンパク質消化酵素により断片化処理は、１又は複数のタンパク質消化酵素による断片化処理であれば特に制限されないが、効率よく断片化処理できるという点から、複数の上記タンパク質消化酵素による断片化処理が好ましく、具体的にはトリプシンとリシルエンドペプチダーゼとの併用による断片化処理を好適に例示することができる。

【0021】

上記ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析においては、まずＬＣ−ＭＳ／ＭＳのＬＣ（液体クロマトグラフィー）により、ペプチド群が分離される。ここで液体クロマトグラフィーとしては、具体的には、ペプチドの電荷の違いを利用して分離を行なう陽イオン交換クロマトグラフィーや、ペプチドの疎水性の違いを利用して分離を行なう逆相クロマトグラフィーを挙げることができ、両者を組み合わせたものであってもよい。

【0022】

次いで、分離された各ペプチドについて、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を行う。質量分析におけるイオン化の方法はソフトイオン化法であるエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）を用いることが好ましい。質量分析では、各種イオン化法によりイオン化したペプチドはアナライザーで質量に応じて分離される。上記アナライザーとしては、例えば、磁場型質量分離装置（Ｓｅｃｔｏｒ ＭＳ）、四重極型質量分離装置（ＱＭＳ）、飛行時間型質量分離装置（ＴＯＦＭＳ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分離装置（ＦＴ−ＩＣＲＭＳ）を挙げることができ、さらにこれらを組み合わせたものでもよい。

【0023】

イオン化したペプチドの検出からＭＳ／ＭＳデータの取得までの方法としては、自動化した測定モードで行う方法が好ましく、具体的にはＩＤＡ（Information Dependent Acquisition）測定法、ＤＤＡ（Data Dependent Acquisition）測定法等を挙げることができる。得られたＭＳ／ＭＳデータは、Protein Pilot、Peak View、MASCOT等のタンパク質同定のためのソフトウエアにインポートし、UniProt、EMBL、Swiss-Prot等のタンパク質データベースを用いてペプチド群を同定する。同定したペプチド群の中には、信頼性の低いペプチドピークを有するものが含まれているため、同定したペプチド群のペプチドピーク（ペプチドピーク群）の中から、信頼性の高いペプチドピークを有するものを選択することが好ましく、信頼性の高いペプチドピークとしては、上記ソフトウエアにより同定したペプチド群のＭＳ／ＭＳデータをイオンライブラリファイル（テキストファイル）に変換し、Access（Microsoft社製）にエクスポートすることにより、ペプチド信頼性を示す指標であるペプチド信頼度スコア（peptide confidence score）（信頼性が１００％の場合の信頼度スコアは１．００として示す）を基に選択することができ、例えば、前記スコアが０．８５を超えるペプチド、０．９０を超えるペプチド、０．９２を超えるペプチド、０．９４を超えるペプチド、０．９５を超えるペプチド、０．９６を超えるペプチド、０．９７を超えるペプチド、０．９８を超えるペプチド、０．９９を超えるペプチドなどを挙げることができるが、０．９９を超えるペプチドがより好ましい。

【0024】

ペプチドピーク群について、液体クロマトグラフィーにおける溶出時間とかかる溶出時間に対応するＭＲＭトランジションやピーク強度に関する情報を取得し、データベースに格納する。本願明細書中において、「ＭＲＭトランジション」とは、特定質量を有するイオン化したペプチド（プリカーサーイオン）を通過させる質量フィルター（Ｑ１）とガス衝突誘導開裂（CID: Collision Induced Dissociation）によって生じる前記プリカーサーイオンが断片化したもの（プロダクトイオン）を通過させる質量フィルター（Ｑ３）の組み合わせ（Ｑ１とＱ３の質量電荷比［ｍ／ｚ］の組み合わせ）のことを意味する。ペプチドピーク群は、上記ソフトウエアによりペプチド由来のピークにおいて複数回同定され、結果、同じペプチドピークであっても異なる複数の溶出時間を取得することがある。その場合には、ペプチドピークの溶出時間を平均した平均溶出時間を取得し、データベースに格納する。また、上記ソフトウエアによりペプチドピークが誤同定される場合があり、誤同定されたペプチドピークの溶出時間は、正同定されたペプチドピークの溶出時間と大きく異なる。このため、誤同定されたペプチドピークのデータを除外することが好ましく、その方法としては、例えば、ペプチドピークの溶出時間や平均溶出時間の標準偏差（ＳＤ）を選択することにより除外する方法を挙げることができ、溶出時間の標準偏差としては、例えば１．０分未満、０．５分未満、０．４分未満、０．３分未満、０．２分未満を挙げることができ、０．２分未満が好ましい。

【0025】

上記データベースには、さらに、ペプチドピーク群の標準溶出時間に対応するUniProtアクセッション番号や、ペプチドの修飾に関する情報を含むペプチドのアミノ酸配列や価数等の関連情報を格納することが好ましい。これらの情報により、ペプチドピークをさらに特徴付けることができ、ペプチドピークに対応するペプチド、すなわち対象タンパク質を構成するペプチドのアミノ酸配列を特定するために用いることができる。

【0026】

工程（ｂ）
工程（ｂ）においては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析で得られる、ペプチドピーク’群の溶出時間や、かかるペプチドピーク’群の溶出時間に対応するＭＲＭトランジションやピーク強度を取得する。上記「ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析で得られる、ペプチドピーク’群の溶出時間や、かかるペプチドピーク’群の溶出時間に対応するＭＲＭトランジションやピーク強度」には、実際に、対象タンパク質’を含む試料（対象タンパク質’試料）をタンパク質消化酵素により断片化処理し、対象タンパク質’を構成するペプチド’を含むペプチド’群を調製した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析を行って得られた、上記ペプチド’群由来のピーク（ペプチドピーク’群）の標準溶出時間や、かかるペプチドピーク’群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジションやピーク強度の他、上記解析により得られたペプチドピーク’群の標準溶出時間や、かかるペプチドピーク’群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジションやピーク強度（のデータ［情報］）も含まれる。

【0027】

上記タンパク質’試料としては、タンパク質を含む試料であれば特に制限されず、具体的には、生体から採取された細胞、組織、血液等を、凍結融解法、フレンチプレス、グラスビーズ、ホモジナイザー、超音波破砕装置等を用いた破砕処理により得られる未分画試料や、かかる未分画試料を、分画遠心法、ショ糖密度勾配遠心法等による分画処理することにより得られる細胞膜画分試料や細胞質画分試料を挙げることができる。上記タンパク質’試料としては、工程（ａ）におけるタンパク質試料と同じ試料であってもよいが、より多くのペプチドピークに関する情報をデータベースに格納することができるため、異なる試料が好ましい。

【0028】

タンパク質’試料をタンパク質消化酵素により断片化処理し、ペプチド’群を調製した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析を行い、ペプチドピーク’群の溶出時間や、かかるペプチドピーク’群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジションやピーク強度を取得するまでの詳細な説明は、工程（ａ）において既述のとおりである。工程（ｂ）におけるタンパク質消化酵素による断片化処理や、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析や、ペプチドピークの同定・選択等の条件は、工程（ａ）における条件と同じであることが好ましい。

【0029】

工程（ｃ）
工程（ｃ）においては、上記ペプチドピーク群の中から上記ペプチドピーク’群と共通するペプチドピークを標準化用ペプチドピーク群として選択する。標準化用ペプチドピーク群の選択は、Accessソフトウエア（Microsoft社製）等のリレーショナルデータベースソフトウエアを用いて、上記ペプチドピーク群におけるＭＲＭトランジション（Ｑ１とＱ３の質量電荷比［ｍ／ｚ］）と上記ペプチドピーク’群におけるＭＲＭトランジションとを比較し、ＭＲＭトランジションが共通（同一）のペプチドピークを選択することにより行うことができる。

【0030】

工程（ｄ）
工程（ｄ）においては、工程（ｃ）で選択した標準化用ペプチドピーク群の標準溶出時間を基準に、上記ペプチドピーク群の標準溶出時間と上記ペプチドピーク’群の溶出時間とのアライメントを行い、上記ペプチドピーク’群の溶出時間を上記ペプチドピーク群の標準溶出時間に標準化し、上記ペプチドピーク’群の標準溶出時間を取得する。上記ペプチドピーク’群の溶出時間を上記ペプチドピーク群の標準溶出時間に標準化する方法としては、ペプチドピーク群の中の標準化用ペプチドピーク群の標準溶出時間を基準にして、最適化するようにペプチドピーク’群の（実測値）溶出時間をシフトし、ペプチドピーク群の標準溶出時間へ標準化できる方法であればよく、例えば、Origin 9ソフトウエア（OriginLab社製）、Excel(Microsoft社製)等のソフトウエアを用い、ペプチドピーク’群のうち標準化用ペプチドピーク群については、パーセンタイルフィルター（１００ポイント、５０％）を用いたスムージングによってシフト時間を算出し、算出した時間に基づいて溶出時間をシフトするとともに、ペプチドピーク’群のうち標準化用ペプチドピーク群以外のペプチドピーク’については、近傍の標準化用ペプチドピークのシフト量に応じて（例えば、線形補正を用いてシフト時間を算出し）、算出したシフト時間に基づいて溶出時間をシフトする方法を挙げることができる。

【0031】

工程（ｅ）
工程（ｅ）においては、工程（ｄ）で取得した上記ペプチドピーク’群の標準溶出時間を上記ペプチドピーク群の標準溶出時間に組み込み、新たなペプチドピーク群の標準溶出時間として上記データベースに格納する。すなわち、工程（ｅ）では、ペプチドピーク群の標準溶出時間に、ペプチドピーク’群の標準溶出時間（ペプチドピーク’群の溶出時間がペプチドピーク群の標準溶出時間へ標準化した溶出時間）を保存し、蓄積した標準溶出時間のデータベースを作成する。

【0032】

工程（ｆ）
工程（ｆ）においては、ペプチドピーク’群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション及びピーク強度を、前記データベースに格納する。すなわち、工程（ｆ）では、ペプチドピーク群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション及びピーク強度に加え、ペプチドピーク’群の標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション及びピーク強度がデータベースに保存され、蓄積した標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション及びピーク強度を格納する。ここで、ペプチドピーク’群の標準溶出時間に対応するピーク強度のうち、標準化用ペプチドピーク群のピーク強度は、データベースに格納されている標準化用ペプチドピーク群のピーク強度との平均値や合計値の他、両者を比較して大きい値の方を選択し、データベースに格納してもよく、或いは必要に応じて合計値を算出するために両者を蓄積してデータベースに格納してもよい。

【0033】

工程（ｂ）〜（ｆ）を繰り返すことにより、蓄積した標準溶出時間の蓄積レベルを高めたデータベースを作成することができるため、工程（ｂ）〜（ｆ）の工程を、少なくとも２回繰り返すことが好ましく、少なくとも２回としては、例えば、２〜２００回、２〜１００回、２〜５０回、２〜２５回、２〜１０回、１０〜２００回、１０〜１００回、１０〜５０回、１０〜２５回、２５〜２００回、２５〜１００回、２５〜５０回、５０〜２００回、５０〜１００回などであってもよいが、２〜２５回がより好ましい。また、工程（ｂ）〜（ｆ）を繰り返す場合、工程（ｂ）で取得するペプチドピーク’群の溶出時間やかかる溶出時間に対応するＭＲＭトランジションやピーク強度を得るためのタンパク質’試料としては、蓄積した標準溶出時間の蓄積レベルを効率良く高めるために、それぞれの繰り返しで異なる試料が好ましい。

【0034】

本件データベースの作成方法を用いて作成したデータベース（以下、「本件データベース」ということがある）を用い、１又は複数の試料中の１又は複数の対象タンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析を以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）を備えた方法（以下、「本件解析方法」ということがある）にしたがって行うと、対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを同定することができる。

【0035】

工程（Ａ）
工程（Ａ）においては、試料中の対象タンパク質群をタンパク質消化酵素により断片化処理し、対象ペプチド群を調製する。

【0036】

上記試料としては、対象タンパク質を含む試料であれば特に制限されず、具体的には、生体から採取された細胞、組織、血液等を、凍結融解法、フレンチプレス、グラスビーズ、ホモジナイザー、超音波破砕装置等を用いた破砕処理により得られる未分画試料や、かかる未分画試料を、分画遠心法、ショ糖密度勾配遠心法等による分画処理することにより得られる細胞膜画分試料や細胞質画分試料を挙げることができる。

【0037】

上記タンパク質消化酵素としては、タンパク質の特定のアミノ酸部位で消化（切断）され、断片したペプチドが調製できる酵素であれば特に制限されず、具体的には、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ-Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｎ−Ｃ、リシルエンドペプチダーゼ、及びクロストリパインを挙げることができる。タンパク質消化酵素により断片化処理は、１又は複数のタンパク質消化酵素による断片化処理であれば特に制限されないが、効率よく断片化処理できるという点から、複数の上記タンパク質消化酵素による断片化処理が好ましく、具体的にはトリプシンとリシルエンドペプチダーゼとの併用による断片化処理を好適に例示することができる。タンパク質消化酵素による断片化処理条件としては、用いるタンパク質消化酵素の性質により温度や時間等の条件を適宜選択することができ、例えばトリプシンを用いる場合、３０℃〜４５℃において１〜３６時間であることが好ましく、３６〜３７℃において１６〜２４時間であることがより好ましい。また、リシルエンドペプチダーゼを用いる場合、１５〜４５℃において１〜３６時間であることが好ましく、１５〜２５℃において２〜４時間であることがさらに好ましい。また、トリプシンとリシルエンドペプチダーゼを併用する場合、１５℃〜４５℃において１〜３６時間であることが好ましく、２０〜３０℃において１０〜１４時間であることがより好ましい。

【0038】

工程（Ｂ）
工程（Ｂ）においては、工程（Ａ）で調製した対象ペプチド群を用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析を行い、ペプチドピークの液体クロマトグラフィーにおける溶出時間、質量電荷比（ｍ／ｚ）（ペプチドピークの溶出時間に対応するＭＲＭトランジション）、及びＭＲＭクロマトグラム情報を含むデータを取得する。ここで「ＭＲＭクロマトグラム情報を含むデータ」とは、ペプチドピークのＭＲＭクロマトグラムを抽出できるデータのことを意味し、具体的には、ペプチドピークの溶出時間に対応するＭＲＭトランジションにおける、ペプチドピークの溶出時間とピーク強度から構成される（２次元）クロマトグラムを抽出できるデータのことをいう。

【0039】

上記ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた解析においては、まずＬＣ−ＭＳ／ＭＳのＬＣ（液体クロマトグラフィー）により、ペプチド群が分離される。ここで液体クロマトグラフィーとしては、具体的には、ペプチドの電荷の違いを利用して分離を行なう陽イオン交換クロマトグラフィーや、ペプチドの疎水性の違いを利用して分離を行なう逆相クロマトグラフィーを挙げることができ、両者を組み合わせたものであってもよい。

【0040】

次いで、分離された各ペプチドについて、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を行う。質量分析におけるイオン化の方法はソフトイオン化法であるエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）を用いることが好ましい。質量分析では、各種イオン化法によりイオン化したペプチドはアナライザーで質量に応じて分離される。上記アナライザーとしては、例えば、磁場型質量分離装置（Ｓｅｃｔｏｒ ＭＳ）、四重極型質量分離装置（ＱＭＳ）、飛行時間型質量分離装置（ＴＯＦＭＳ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分離装置（ＦＴ−ＩＣＲＭＳ）を挙げることができ、さらにこれらを組み合わせたものでもよい。

【0041】

イオン化したペプチドの検出からＭＳ／ＭＳデータの取得までの方法としては、自動化した測定モードで行う方法が好ましく、具体的にはＩＤＡ（Information Dependent Acquisition）測定法、ＤＤＡ（Data Dependent Acquisition）測定法等を挙げることができる。また、ＭＲＭクロマトグラム情報を含むデータは、ＭＲＭ測定法やSWATH-MS測定法を用いて取得することができる。得られたＭＳ／ＭＳデータは、Protein Pilot、Peak View、MASCOT等のタンパク質同定のためのソフトウエアにインポートし、UniProt、EMBL、Swiss-Prot等のタンパク質データベースを用いてペプチド群を同定する。同定したペプチド群の中には、信頼性の低いペプチドピークを有するものが含まれているため、同定したペプチド群のペプチドピーク（ペプチドピーク群）の中から、信頼性の高いペプチドピークを有するものを選択することが好ましく、信頼性の高いペプチドピークとしては、上記ソフトウエアにより同定したペプチド群のＭＳ／ＭＳデータをイオンライブラリファイル（テキストファイル）に変換し、Access（Microsoft社製）にエクスポートすることにより、ペプチド信頼性を示す指標であるペプチド信頼度スコア（peptide confidence score）（信頼性が１００％の場合の信頼度スコアは１．００として示す）を基に選択することができ、例えば、前記スコアが０．８５を超えるペプチド、０．９０を超えるペプチド、０．９２を超えるペプチド、０．９４を超えるペプチド、０．９５を超えるペプチド、０．９６を超えるペプチド、０．９７を超えるペプチド、０．９８を超えるペプチド、０．９９を超えるペプチドなどを挙げることができるが、０．９９を超えるペプチドがより好ましい。

【0042】

工程（Ｃ）
工程（Ｃ）においては、工程（Ｂ）で取得したペプチドピークの質量電荷比（ｍ／ｚ）を基に対象ペプチドピーク群を同定し、該対象ペプチドピーク群の中から本件データベースに格納されるペプチドピーク群と共通するペプチドピークを標準化用対象ペプチドピーク群として選択する。標準化用対象ペプチドピーク群の選択は、Accessソフトウエア（Microsoft社製）等のソフトウエアを用いて、本発明のデータベースに格納されるペプチドピーク群におけるＭＲＭトランジション（Ｑ１とＱ３の質量電荷比［ｍ／ｚ］）と対象ペプチドピーク群におけるＭＲＭトランジションとを比較し、ＭＲＭトランジションが共通（同一）のペプチドピークを選択することにより行うことができる。

【0043】

工程（Ｄ）
工程（Ｄ）においては、工程（Ｃ）で選択した標準化用対象ペプチドピーク群の溶出時間を基準に、対象ペプチドピーク群の溶出時間と、本件データベースに格納されるペプチドピーク群の標準溶出時間とのアライメントを行い、本件データベースに格納されるペプチドピーク群の標準溶出時間を、対象ペプチドピーク群の溶出時間にシフトし、シフトした標準溶出時間と、該シフトした標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション及びピーク強度とを再構築イオンライブラリとして取得する。本件データベースに格納されるペプチドピーク群の標準溶出時間を、対象ペプチドピーク群の溶出時間にシフトする方法としては、対象ペプチドピーク群の中の標準化用対象ペプチドピーク群の溶出時間を基準にして、最適化するように本件データベースのペプチドピーク群の標準溶出時間をシフトし、対象ペプチドピーク群の溶出時間へ実測値化できる方法であればよく、例えば、Origin 9ソフトウエア（OriginLab社製）、Excel(Microsoft社製)等のソフトウエアを用い、本件データベースのペプチドピーク群のうち標準化用対象ペプチドピーク群については、パーセンタイルフィルター（１００ポイント、５０％）を用いたスムージングによってシフト時間を算出し、算出した時間に基づいて標準溶出時間をシフトするとともに、本件データベースのペプチドピーク群のうち標準化用対象ペプチドピーク群以外のペプチドピークについては、近傍の標準化用対象ペプチドピークのシフト量に応じて（例えば、線形補正を用いてシフト時間を算出し）、算出したシフト時間に基づいて溶出時間をシフトする方法を挙げることができる。シフトした標準溶出時間は、Access（Microsoft社製）にインポートし、さらに該シフトした標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション及びピーク強度と統合することにより再構築イオンライブラリ（シフトした標準溶出時間と、該シフトした標準溶出時間に対応するＭＲＭトランジション及びピーク強度を含むデータ）とを取得する。

【0044】

工程（Ｅ）
工程（Ｅ）においては、工程（Ｄ）で取得した再構築イオンライブラリを用いて、工程（Ｂ）で取得したＭＲＭクロマトグラム情報を含むデータからペプチドピークのＭＲＭクロマトグラムを抽出し、前記ＭＲＭクロマトグラムから対象ペプチドピーク群を同定する。

【0045】

上記ペプチドピークのＭＲＭクロマトグラムから対象ペプチドピーク群を同定するために、まずＭＲＭクロマトグラム情報を含むデータから、対象ペプチド由来のペプチドピークの各ＭＲＭトランジションにおいて、ペプチドピークの溶出時間とピーク強度から構成される（２次元）クロマトグラムを作成する。次に、かかるクロマトグラムの中から、再構築イオンライブラリにおけるシフトした標準溶出時間（対象ペプチドピーク群の溶出時間が基準となるように変換された標準溶出時間）と共通する溶出時間を有するペプチドピークを抽出し、シフトした標準溶出時間と共通する溶出時間を有するペプチドピークを対象ペプチドピークとして同定する。ここで、「共通する溶出時間」には、シフトした標準溶出時間と同一の溶出時間の他、シフトした標準溶出時間を含む範囲の溶出時間、例えば、シフトした標準溶出時間±２．０分、シフトした標準溶出時間±１．５分、シフトした標準溶出時間±１．０分、シフトした標準溶出時間±０．５分、シフトした標準溶出時間±０．３分、シフトした標準溶出時間±０．２分、シフトした標準溶出時間±０．１分なども含まれる。本件データベースに、ペプチドピーク群の標準溶出時間に対応するUniProtアクセッション番号や、ペプチドの修飾に関する情報を含むペプチドのアミノ酸配列や価数等の関連情報が格納されると、これらの関連情報を基に、対象ペプチドピークに対応するペプチド、すなわち対象タンパク質を構成するペプチドのアミノ酸配列を特定することができる。

【0046】

本件解析方法は、複数の試料間における対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを定量するために、さらに、工程（Ｅ）で同定した対象ペプチドピーク群の中から、ピーク面積とピーク強度との比を基に、対象ペプチドピーク群の定量用ペプチドピークを選択する工程（Ｆ）、及び、工程（Ｆ）で選択した対象ペプチドピーク群の定量用ペプチドピーク面積を複数の試料について算出し、算出したピーク面積の比から、複数の試料間における対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを定量する工程（Ｇ）を備えたものが好ましい。

【0047】

工程（Ｆ）
工程（Ｆ）においては、対象ペプチドピーク群の定量用ペプチドピークを選択する。対象ペプチドピーク群の定量用ペプチドピークの選択は、工程（Ｅ）で同定した対象ペプチドピーク群の中から、ピーク面積とピーク強度との比を指標にして行うことができ、具体的には、工程（Ｅ）で同定した対象ペプチドピークについて、「（ｄ）本件データベースに格納される対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションのうち、最大ピーク強度を付与するＭＲＭトランジションのクロマトグラムから得られるピーク面積」と、「（ｃ）本件データベースに格納される対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションのクロマトグラムから得られるペプチドピーク面積の合計」と、「（ａ）前記最大ピーク強度を付与するＭＲＭトランジションにおける最大ピーク強度」と、「（ｂ）前記ピーク面積の合計に用いたＭＲＭトランジションにおけるピーク強度の合計」とを、式［（ｄ）本件データベースに格納される対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションのうち、最大ピーク強度を付与するＭＲＭトランジションのクロマトグラムから得られるピーク面積／（ｃ）本件データベースに格納される対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションのクロマトグラムから得られるペプチドピーク面積の合計］／［（ａ）前記最大ピーク強度を付与するＭＲＭトランジションにおける最大ピーク強度／（ｂ）前記ピーク面積の合計に用いたＭＲＭトランジションにおけるピーク強度の合計］に入力することにより値（指標値）を算出し、算出した指標値が０．２５〜４．０の範囲、好ましくは０．３３〜３．０の範囲、より好ましくは０．５〜２．０の範囲を示す対象ペプチドピークを定量用ペプチドピークとして選択する。上記ペプチドピーク面積の合計（ｃ）やピーク強度の合計（ｂ）に用いる本件データベースに格納される対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションとしては、すべての対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションであってもよいが、最大ピーク強度に対してある割合を超えるピーク強度を付与するＭＲＭトランジションを選択してもよく、その場合の「最大ピーク強度に対してある割合を超える」としては、例えば最大ピーク強度に対して５％を超える、１０％を超える、１５％を超える、２０％を超える、２５％を超える、３０％を超える等を挙げることができるが、最大ピーク強度に対して２０％を超えるが好ましい。また、定量用ペプチドピークは、さらにＭＲＭトランジション数に基づいて選択することが好ましく、例えば、ＭＲＭトランジション数が２以上、３以上、４以上、５以上のペプチドピークを定量用ペプチドピークとして選択することを挙げることができるが、ＭＲＭトランジション数が３以上のペプチドピークを定量用ペプチドピークとして選択することがより好ましい。

【0048】

工程（Ｇ）
工程（Ｇ）において、算出したピーク面積の比から、複数の試料間における対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークを定量する方法としては、特定の試料における対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークのピーク面積と、前記特定の試料とは異なる試料における対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークのピーク面積との変化を相対的に定量する方法の他、^１５Ｎ，^１３Ｃ，^１８Ｏ，及び^２Ｈのいずれか１以上の安定同位体標識元素で対象タンパク質を構成するペプチド標識された、濃度既知の安定同位体標識標的ペプチドを用意し、かかる安定同位体標識標的ペプチドを内部標準として、特定の試料における対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークのピーク面積と、前記特定の試料とは異なる試料における対象タンパク質を構成するペプチドのペプチドピークのピーク面積との変化を絶対的に定量する方法が含まれる。

【0049】

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

【実施例1】

【0050】

［結果１：ＭＲＭアレイデータベース（本発明のデータベース）作成方法の概要］
本発明のデータベースの作成方法の概要を図１Ａ及びＢに示す。まず、第１タンパク質試料（図１Ａの「Sample #1」）から質量分析用試料を調製し（詳細は、後述の［方法１：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析する試料の調製法］参照）、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、ＩＤＡ（Information Dependent Acquisition）測定により第１タンパク質試料を構成する第１試料ペプチドピーク（群）のＭＳ／ＭＳデータを取得する（詳細は、後述の［方法２：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ］参照）。続いて、ＭＳ／ＭＳデータを基にProtein PilotやPeak Viewソフトウエア等を用いて第１試料ペプチド群を同定し、前記ＭＳ／ＭＳデータをイオンライブラリファイルに変換する。次に、信頼性の高いペプチドピーク群（例えば、本実施例においては、信頼度スコア＞０．９９を選択規準とした）を選択し、さらに信頼性の高い平均溶出時間（本実施例においては、同一ペプチドの溶出時間の標準偏差［ＳＤ］＜０．２分を選択基準とした）を有するペプチドピーク群を選択し、かかるペプチドピーク群の溶出時間を標準溶出時間（標準ＲＴ、ｎＲＴ）としてデータベースに保存（格納）する。次いで第２タンパク質試料（図１Ａの「Sample #2」）も第１タンパク質試料と同様の方法で解析し、第２試料ペプチドピーク群を同定・選択し、かかる第２試料ペプチドピーク群の実測ＲＴ２を取得する。その後、データベースに格納した第１試料ペプチドピーク群の中から、第２試料ペプチドピーク群と共通するペプチドピークを、標準化用ペプチドピーク群として選択する。かかる標準化用ペプチドピーク群のｎＲＴを基準にして、アラインメントを最適化するように第２試料ペプチドピーク群内の標準化用ペプチドピークの実測ＲＴ２をシフトさせる（たとえば、本実施例においてはパーセンタイルフィルターを用いたスムージングによってシフト時間を算出）。第２試料ペプチドピーク群内の標準化用ペプチドピーク以外のペプチドピークは近傍の標準化用ペプチドピークのシフト量に応じてシフトさせる（たとえば、本実施例においては線形補正を用いてシフト時間を算出）。以上のシフトによりすべての第２試料ペプチドピーク群に対して実測ＲＴ２をｎＲＴ２としてｎＲＴに標準化（変換）する。第２試料ペプチドピーク群のｎＲＴ２をデータベースに保存することにより、蓄積したｎＲＴ（ｎＲＴ＋ｎＲＴ２）のデータベースを作成する。ｎＲＴの蓄積と同時にＭＲＭトランジション、ピーク強度及び関連情報（価数、UniProtアクセッション番号、ペプチドの修飾に関する情報を含むペプチドのアミノ酸配列）も格納する（図１Ｂ）。さらに、第３タンパク質試料（図１Ａの「Sample #3」）についても第１タンパク質試料や第２タンパク質試料と同様の方法で解析を行い、第３試料ペプチドピーク群を同定・選択し、かかる第３試料ペプチドピーク群の実測ＲＴ３を取得し、ｎＲＴ３に標準化し、データベースに保存することにより、蓄積したｎＲＴ（ｎＲＴ＋ｎＲＴ２＋ｎＲＴ３）の蓄積レベルを高める。なお、第４タンパク質試料以降は、各ペプチドピークについてアラインメントの際にデータベースから信頼性の高い平均ｎＲＴを選択し、実測ＲＴと比較を行う（たとえば、本実施例においてはＲＴの標準偏差［ＳＤ］＜０．２分を選択基準とした）。

【0051】

［結果２：本発明のデータベースの作成法］
ヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）（XTreme 200、XenoTech社製）を用いて、本発明のデータベースを作成した結果を図１Ｃ〜Ｅに示す。ＨＬＭのトリプシン消化ペプチドをアルカリ条件下の逆相カラムで分画した３種類の画分のＲＴ（図１Ｃの「赤（画分１）、青（画分２）、及び緑（画分３）」）と、対照としての未分画のＨＬＭのＲＴとの差異を調べたところ、連続測定にもかかわらず３種類の画分で同定されたペプチドピークのＲＴは、未分画のＨＬＭとはずれており、その時間差は画分毎に異なっていた（図１Ｃ）。上記１種類の画分のＲＴ（赤［画分１］）についてｎＲＴの変換過程を示す。あらかじめ構築した本発明のデータベース（後述する２３種類の試料のデータを蓄積したデータベース）内の６８５８個の共通ペプチドピーク（標準化用ペプチドピーク）のｎＲＴと画分１の標準化用ペプチドピークの実測ＲＴの時間差をプロットし（図１Ｄ、赤点）、平滑化によりシフト時間量を算出した（図１Ｄ、緑線）。画分１の標準化用ペプチドピークの実測ＲＴから変換したｎＲＴとデータベース内の標準化用ペプチドピークのｎＲＴとの差は、９８．３％の標準化用ペプチドピークで０．２分以内であることが示された（図１Ｅ）この結果は、誤差が０．２分以内でｎＲＴに変換できることを示している。また、ＬＣ溶媒を新しく交換した場合や培養細胞の細胞内画分試料を解析した場合にも同様の結果が得られた。

【0052】

さらに、２３種類の試料（未分画のＨＬＭのデータセット５組［XTreme 200、XenoTech社製］、ＨＬＭ画分データセット１０組［XTreme 200、XenoTech社製］、細胞株［ＨＥＫ２９３、Ｃａｃｏ２及びＢｅＷｏ］の細胞内画分試料のデータセット８組）と、２種類の合成ペプチドのデータセット［Ohtsuki, S., et al. J Pharm Sci 100, 3547-3559 (2011)、Shawahna, R., et al. Mol Pharm 8, 1332-1341 (2011)、Uchida, Y., et al. J Neurochem 117, 333-345 (2011)参照］のデータセット２組）を基にデータを取得し、本発明のデータベースを作成した（詳細は、後述の［方法３：本発明のデータベースにおけるｎＲＴデータの蓄積］参照）。その結果、１０７,７１５個のペプチドピークのｎＲＴとＭＲＭトランジション情報を含むデータベースを作成することができた。かかるペプチドピークは、UniProtアクセッション番号と、前駆ペプチドの修飾に関する情報を含むペプチド配列及び価数によって特徴付けられている。また、２回以上の実験のデータが蓄積されたペプチドピークは５４,９８０個であり、その９７．０％は、標準偏差（ＳＤ）が０．２分以内であることが示された。ＲＴがＳＤ＜０．２分のペプチドピーク、及びＲＴを１回の実験で検出したペプチドピークを選択し（合計１０６,０７４個のペプチドピーク）、これらペプチドピークのｎＲＴとＭＲＭトランジションとピーク強度の他、関連情報（価数、UniProtアクセッション番号、ペプチドの修飾に関する情報を含むペプチドのアミノ酸配列）を含むデータベースを以降の解析に用いた。

【0053】

［結果３：本発明のデータベースを用いたイオンライブラリの再構築法の概要］
本発明のデータベースを用いたイオンライブラリの再構築法の概要を図２Ａに示す。まず、対象タンパク質を含む測定用試料を用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いたＩＤＡ解析を行い、イオンライブラリファイルを取得する。次に、信頼性の高い対象ペプチドピーク群（例えば、本実施例においては、信頼度スコア＞０．９９を選択基準とした）を選択し、対象ペプチドピーク群と本発明のデータベースに格納されている標準ペプチドピーク群とを比較し、共通のペプチドピークであり且つ両者のＲＴを基にＲＴ値の信頼性が高いペプチドピーク（例えば、本実施例においては、標準偏差［ＳＤ］＜０．２分を選択基準とした）を標準化用対象ペプチドピーク群として選択する。標準化用対象ペプチドピーク群のＲＴを基準に、データベースに格納される標準ペプチドピーク群のｎＲＴをシフト・補正することにより、前記ｎＲＴを実測値に基づいたＲＴに変換し、再構築イオンライブラリを作成し、ＳＷＡＴＨ定量解析に用いる。

【0054】

［結果４：本発明のデータベースを用いたイオンライブラリの再構築］
ＨＬＭを用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いたＩＤＡ解析を行い、イオンライブラリファイルを取得後、本発明のデータベースを用いて再構築イオンライブラリを作成し（詳細は、［方法４：本発明のデータベースを基にしたイオンライブラリファイルの再構築］参照）、実測値のＲＴとシフトしたｎＲＴとの差異を測定した（図２Ｂ）。再構築用溶出時間として用いなかった０．９０〜０．９９の信頼度スコアを有する対象ペプチド群（１５８５個のペプチド）のピークについて、実測値ＲＴとシフトしたｎＲＴとを比較して両者の差異幅を検証した。その結果、両者の差異幅が０．２分以内の対象ペプチドピークは、９５．４％（１５１２個）あることが示された（図２Ｂ）。また、再構築用溶出時間として用いた信頼度スコア＞０．９９を有する対象ペプチドピーク群（１２８６３個のペプチド）については、１２７８４個のペプチドピーク（９９．４％）のＲＴが０．２分以内の差異幅であることが示された。これらの結果は、シフトしたｎＲＴに対応する実測値ＲＴを十分特定できるため、シフトしたｎＲＴを用いてクロマトグラム上の対象ペプチドピークを同定できることを示している。

【0055】

［結果５：本発明のデータベースを用いたＳＷＡＴＨ定量解析１］
次に、本発明のデータベースを用いて同定したペプチドピークのピーク面積を再現的に定量できるかどうかを検討した。測定対象試料の一部をＩＤＡ解析し、対象ペプチドを同定し、本発明のデータベースを用いて対象ペプチドとの共通ペプチドピーク（標準化用ペプチドピーク）の溶出時間を利用しイオンライブラリを再構築した。さらに、測定対象試料をＳＷＡＴＨ解析し、ＳＷＡＴＨで取得したデータを再構築したイオンライブリーを用いて解析し対象ペプチドピークのピーク面積を定量した。１．５カ月後に同様の試料を用いて同様に解析を行い、両者のピーク面積を比較した。なお、ピーク面積は、全対象ペプチドピーク群のピーク面積の総計で標準化した。その結果、図２Ｄに示すように、両測定対象試料間で２倍以内の差異幅で再現性良く定量できる対象ペプチドピークは、６１．１％（５９５５３／９７５１２）にとどまることが示された。特に、低ピーク面積を示す対象ペプチドピークの多くが２倍を超える差異で定量され、再現性に問題があることが示された。再現性を低下させる原因として、本発明のデータベースを用いて同定した対象ペプチドピークのうち、検出限界以下の対象ペプチドピークも定量してしまうことが考えられた。このため、定量できる対象ペプチドピークをバリデーション（validation）する必要があると考えた。

【0056】

本発明者らは、ピークのバリデーション用の簡便な指標を開発した（詳細は、後述の［方法５：ペプチドピークのバリデーション］参照）。すなわち、本発明のデータベースに対して、式［（ｄ）本件データベースに格納される対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションのうち、最大ピーク強度を付与するＭＲＭトランジションのクロマトグラムから得られるピーク面積／（ｃ）本件データベースに格納される対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションのクロマトグラムから得られるペプチドピーク面積の合計］／［（ａ）前記最大ピーク強度を付与するＭＲＭトランジションにおける最大ピーク強度／（ｂ）前記ピーク面積の合計に用いたＭＲＭトランジションにおけるピーク強度の合計］の値を、各ＭＲＭトランジションについて算出し、０．５〜２の範囲内にある対象ペプチドピークを有効なピークとして抽出した。なお、本実施例においては、上記ペプチドピーク面積の合計（ｃ）やピーク強度の合計（ｂ）に用いる本件データベースに格納される対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションは、最大ピーク強度に対して２０％を超えるピーク強度を付与するＭＲＭトランジションを選択した（後述の［方法４：本発明のデータベースを基にしたイオンライブラリファイルの再構築］参照）。バリデーション指標を用いてピークを抽出すると、ピーク面積の差異幅が２倍以内のペプチドピークの割合は６１．１％から８７．４％（３７７０７／４３１２９）へ増加するとともに、ピーク面積の差異幅が１．５倍以内のペプチドピークの割合は４７．５％から７４．１％へ増加することが示された（図２Ｅ）。この結果は、上記ペプチドピークのバリデーションが有効であることを示している。さらに定量性良く定量できる対象ペプチドの割合を高めるため、ＭＲＭトランジション数が３以上のペプチドピークを抽出すると、ピーク面積の差異幅が２倍以内のペプチドの割合は８７．４％から９０．３％（３２２３５／３５６９２）へ増加することが示された（図２Ｆ）。かかるペプチドピークのバリデーションでピークを限定した後においても、定量できるペプチドの数は、標準的ＳＷＡＴＨ定量法を用いた場合よりも４．２３倍（３２２３５／７６１５：図２ＣとＦとの比較）多かった。また、定量できる対象ペプチドのピーク面積の下限に着目したところ、標準的ＳＷＡＴＨ定量法を用いた場合よりも１／１０低いレベルのものも定量できることが示された（図２Ｆの１０^３カウントと図２Ｃの１０^４カウントの比較）。これらの結果は、本発明のデータベースを用いて測定対象ペプチドピークを同定し、同定したペプチドピークの中から上記ペプチドピークのバリデーションを行うことにより、定量できるペプチドピークを効率良く抽出できることを示している。

【0057】

［結果６：本発明のデータベースを用いたＳＷＡＴＨ定量解析２］
次に、バリデーションを行って抽出したペプチドピークの面積の増減を十分検出できるかどうかについて、合成ペプチドをスパイクしたモデル試料（詳細は、後述の［方法６：本発明のデータベースを用いたペプチドピークの定量の検証］参照）を用いて検討した。０．１ｆｍｏｌの合成ペプチドをスパイクした試料と、２５ｆｍｏｌの合成ペプチドをスパイクした試料とを比較して増加の有無を検証したところ、標準的ＳＷＡＴＨ定量を用いた場合、増加を検出できた合成ペプチドピーク数は１７１（総登録ピーク数［３１２］の５４．８％）であったのに対して、本発明のデータベースから再構築したイオンライブラリを用いて定量を行いバリデーションにより抽出（以下、「本発明のデータベースを用いたＳＷＡＴＨ定量」ということがある）した場合、増加を検出できた合成ペプチドピーク数は２６３（総登録ピーク数［３１２］の８４．３％）と増加していた（図３Ａ）。また、合成ペプチドの量比を変えた他の組合せを用いて解析した場合でも同様の結果が得られており、例えば、０．５ｆｍｏｌの合成ペプチドをスパイクした試料と、２５ｆｍｏｌの合成ペプチドをスパイクした試料との間では、標準的ＳＷＡＴＨ定量を用いた場合、増加を検出できた合成ペプチドピーク数は１７１（総登録ピーク数［３１２］の５４．８％）であったのに対して、本発明のデータベースを用いたＳＷＡＴＨ定量を用いた場合、増加を検出できた合成ペプチドピーク数は２６４（総登録ピーク数［３１２］の８４．６％）と増加しており、また、５ｆｍｏｌの合成ペプチドをスパイクした試料と、２５ｆｍｏｌの合成ペプチドをスパイクした試料との間では、標準的ＳＷＡＴＨ定量を用いた場合、増加を検出できた合成ペプチドピーク数は１６６（総登録ピーク数［３１２］の５３．２％）であったのに対して、本発明のデータベースを用いたＳＷＡＴＨ定量を用いた場合、増加を検出できた合成ペプチドピーク数は２３８（総登録ピーク数［３１２］の７６．２％）と増加していた（図３Ａ）。これらの結果は、本発明のデータベースを用いて合成ペプチドを同定し、同定した合成ペプチドのピークについて、バリデーションにより抽出したペプチドピークは、そのピーク面積の増減を感度良く検出できることを示している。

【0058】

次に、上記バリデーションにより抽出したペプチドピークは、そのピーク面積の増減を精度よく定量できるかどうかについて検討した。０．５ｆｍｏｌの合成ペプチドでスパイクした試料と、５ｆｍｏｌの合成ペプチドでスパイクした試料との間でペプチドピークの面積比（詳細は、後述の［方法６：本発明のデータベースを用いたペプチドピークの定量の検証］参照）を比較すると、１０．４倍の差があることが示された（図３Ｃ）。すなわち、合成ペプチドの量比に相当するピーク面積比で検出することができた。この結果は、本発明のデータベースを用いて合成ペプチドを同定し、同定した合成ペプチドのピークについて、バリデーションにより抽出したペプチドピークは、そのピーク面積の増減を十分な精度で検出できることを示している。なお、標準的ＳＷＡＴＨ定量法を用いた場合にも、０．５ｆｍｏｌの合成ペプチドでスパイクした試料と、５ｆｍｏｌの合成ペプチドでスパイクした試料との間でペプチドピークの面積比が９．９倍の差で検出できたものの（図３Ｂ）、本発明のデータベースを用いたＳＷＡＴＨ定量法は、標準的ＳＷＡＴＨ定量法を用いて同定できなかったペプチドピークの増減も精度よく検出できる点で優れている。

【0059】

［方法１：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析する試料の調製法］
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより解析する試料は、文献（Ohtsuki, S., et al. Drug Metab Dispos 40, 83-92 (2012)、Ohtsuki, S., et al. J Pharm Sci 100, 3547-3559 (2011)、Yoneyama, T., et al. J Proteome Res 12, 753-762 (2013)）に記載の方法を修正した方法を用いて調製した。以下にその調製方法を示す。まず、７Ｍ塩酸グアニジン及び１０ｍＭＥＤＴＡを含有する懸濁液に、タンパク質試料（５０μｇ）を懸濁した。窒素存在下、室温で６０分間、ＤＴＴ（dithiothreitol）で試料を還元し、次いで、室温で６０分間、ヨードアセトアミデでＳ−カルバモイルメチル化した。アルキル化されたタンパク質を、メタノールとクロロホルムの混合物で沈殿させた。この沈殿物を６Ｍ尿素に溶解し、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で希釈した。試料を１Ｍ尿素まで希釈した後、リシルエンドペプチダーゼを酵素／基質が１：１００の割合で用い、２５℃で３時間消化し、次にトシルフェニルアラニルクロロメチルケトンで処理したトリプシンを酵素／基質が１：１００の割合で用い、３７℃で１６時間消化した。ＧＬ−ＳＤＢチップ及びＧＬ−ＧＣチップ（ジーエルサイエンス社製）を用いて試料を脱塩し、蒸発させ、０．１％のギ酸に溶解し、試料を調製した。

【0060】

［方法２：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ］
ｎａｎｏＬＣシステム（Ultimate 3000 RSLCnano；DIONEX社製）を、正イオン化モードで作動させたナノ−エレクトロスプレーイオン化質量分析計（TripleTOF 5600；ABSCIEX社製）に接続して用い、対象タンパク質を含む試料を分析した。イオン源ガス、カーテンガス、イオンスプレー電圧、インターフェースヒーター温度、及びデクラスタリング電位のパラメータ値は、それぞれ２０、２０、２３００、１５０、及び８０であった。累積時間５０マイクロ秒、衝突エネルギー分散係数５、イオン放出遅延３０及びイオン放出幅１５にて、ローリング衝突エネルギーを利用し、前駆イオン（Ｑ１）を３００〜１００８、プロダクトイオン（Ｑ３）を１００〜１６００スキャンし、ＩＤＡ法を行った。プロダクトイオンを観察するための候補前駆イオンの最大数は、２０イオン／サイクルだった。分析したイオンは１０秒間除外した。蓄積時間を５０マイクロ秒とし、前駆イオンのＳＷＡＴＨウインドウを３００〜１００８の１３Ｄａ（１Ｄａの重複を含む）の質量電荷比に設定し、ＳＷＡＴＨ−ＭＳ取得法を行った。プロダクトイオンは、ＩＤＡ測定と同じ設定で、ローリング衝突エネルギーを用い、１００〜１６００スキャンした。サイクル時間は３．０５秒であった。Ｃ１８カラム（Acclaim PepMap RSLC C18、２μｍ、１００Å、内径７５μｍ×２５ｃｍ、 DIONEX社製）及びトラップカラム（内径１００μｍ×２ｃｍ、 Acclaim PepMap100 C18を充填、５μｍ、１００Å、DIONEX社製）を用い、４０℃にてＮａｎｏＬＣを行った。０．１％ギ酸に１〜２５％及び２５〜５０％のアセトニトリルを含有する直線勾配を適用し、流速３００ｎＬ／分にて、６０分間及び１５分間（図１及び２）又は４０分間及び１０分間（図３）、対象ペプチドを溶出した。

【0061】

［方法３：本発明のデータベースにおけるｎＲＴデータの蓄積］
上記２３種類の試料と２種類の合成ペプチドのデータセットを用いてＩＤＡ測定により得られたＭＳ／ＭＳデータはProtein Pilot（ABSCIEX社製）にインポートし、UniProtヒトタンパク質データベースを検索して対象ペプチドを同定した。結果ファイル（図１の［group file］に相当）をSWATH MicroApp（ABSCIEX社製）を用いてPeak Viewにインポートし、イオンライブラリファイル（テキストファイル）をAccess（Microsoft社製）にエクスポートした。ペプチド信頼度スコア（peptide confidence score）が０．９９を超えるトランジションデータを抽出し、抽出した各トランジションデータを固有のトランジション名及び固有のペプチドピーク名とリンクさせ、Microsoft SQL Server Expressにトランジションデータベースとして格納した。データベースサイズを縮小するため、トランジションデータを、相対強度を合計することで固有のトランジション名で統合した。各ペプチドピークのＲＴの平均及び標準偏差（ＳＤ）をAccess内で計算し、ＳＤ＜０．２分であるＲＴ平均値をＲＴアラインメントに使用した。全てのＲＴ及びｎＲＴをAccessで一覧化し、ＲＴによってソーティングした全てのＲＴと標準化用ペプチドピークのＲＴ−ｎＲＴのリストをOrigin 9ソフトウエア（OriginLab社製）にエクスポートし、補正（平滑化及び補間）を行った。平滑化は、パーセンタイルフィルター（１００ポイント、５０％）を用いて行い、直線補間は平滑化したデータを用いて行った。補間したデータをAccess内のｎＲＴデータベースに格納した。各種試料から取得したｎＲＴをｎＲＴデータベースに格納した。なお、ＩＤＡデータのＲＴと比較するため、各ペプチドピークのｎＲＴの平均及びＳＤをAccessで計算し、ＳＤ＜０．２分であるＲＴの平均、又は１回の実験で検出されたペプチドのＲＴを用いた（合計１０６,０７４個のペプチドのＲＴ）。

【0062】

［方法４：本発明のデータベースを基にしたイオンライブラリファイルの再構築］
ＨＬＭを用いて、連続ＳＷＡＴＨ取得法の過程でＩＤＡ法により分析した。ＩＤＡ法で取得したデータファイルからイオンライブラリファイルを作成し、Accessにインポートした。イオンライブラリのＲＴ、及びｎＲＴデータベースのｎＲＴの平均及びＳＤを計算し、ＳＤが０．２分以内である重複ペプチドピークの全てのＲＴ及びｎＲＴをAccessで一覧化した。ｎＲＴに基づいてソーティングした全ｎＲＴと標準化用ペプチドピークのＲＴ―ｎＲＴのリストをOrigin 9ソフトウエアにエクスポートし、平滑化及び補間を行った。平滑化は、パーセンタイルフィルター（１００ポイント、５０％）を用いて行い、直線補間は平滑化したデータを用いて行った。シフトしたｎＲＴをAccessにインポートし、再構築イオンライブラリファイルを、トランジションデータベースのデータと統合することにより作成した。各ペプチドピークにおいて最大強度が２０％を超えるトランジションを再構築イオンライブラリファイル用に選択した。再構築イオンライブラリファイルをSWATH MicroAppを備えたPeak Viewにインポートし、ＳＷＡＴＨの取得データを使用してＳＷＡＴＨ定量を行った。全てのペプチドピークについてピーク面積を得るため、ペプチド数、修飾の排除、共有配列選択の排除、ＸＩＣ抽出ウインドウ、及びＸＩＣ幅を、それぞれ、「９９９」、「ｏｆｆ」、「ｏｆｆ」、「１．０分」及び「０．０４０Ｄａ」に設定した。勾配条件の違いにより、実測ＲＴとシフトしたｎＲＴとの差異が図３では図２よりも大きかったため、該図３ではＸＩＣ抽出ウインドウを１．５分に設定した。標準的ＳＷＡＴＨ定量では、ピーク面積の計算に５個のトランジションを使用した。本発明のデータベースを用いた定量では、選択した全てのトランジションを再構築イオンライブラリで使用するため、トランジション数を「９９９」に設定した。

【0063】

［方法５：ペプチドピークのバリデーション］
ピークのバリデーションには、トランジションデータベース中の「相対ピーク強度」と、Peak Viewソフトウエアからエクスポートした結果ファイル中の各トランジション（イオン）の「ピーク面積」を使用した。Accessを使用して以下の手順を行った。各ペプチドピークについて、ＭＲＭトランジションデータベースにおける最大ピーク強度（ａ）、ピーク強度の合計（ｂ）、及び最大ピーク強度を付与するトランジションを各ペプチドピークについてリスト化した。次に、Peak Viewからエクスポートした試料の結果ファイルにおいて、ピーク面積の合計（ｃ）と、トランジションデータベースにおいて最大強度を付与するトランジションのピーク面積（ｄ）を各ペプチドピークについて一覧化した。各ペプチドピークについて、式［（ｄ）本件データベースに格納される対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションのうち、最大ピーク強度を付与するＭＲＭトランジションのクロマトグラムから得られるピーク面積／（ｃ）本件データベースに格納される対象ペプチドピークのＭＲＭトランジションのクロマトグラムから得られるペプチドピーク面積の合計］／［（ａ）前記最大ピーク強度を付与するＭＲＭトランジションにおける最大ピーク強度／（ｂ）前記ピーク面積の合計に用いたＭＲＭトランジションにおけるピーク強度の合計］によってバリデーションの指標を計算した。指標値が０．５〜２の範囲にあるペプチドピークを比較に用いた。

【0064】

［方法６：本発明のデータベースを用いたペプチドピークの定量の検証］
トリプシンで消化した未分画のＨＬＭに２９６種の合成ペプチド（Ohtsuki, S., et al. J Pharm Sci 100, 3547-3559 (2011)、Shawahna, R., et al. Mol Pharm 8, 1332-1341 (2011)、Uchida, Y., et al. J Neurochem 117, 333-345 (2011)）をそれぞれ４種類の量（０．１、０．５、５及び２５ｆｍｏｌ／注入）となるように添加し、モデル試料を作製した。これらのペプチドにより本発明のデータベース中の２４０種のペプチドから３１２個のペプチドピークがモデル試料において検出された。試料は、ＳＷＡＴＨ−ＭＳ取得法で繰り返し分析した（４回）。合成ペプチドを２５ｆｍｏｌスパイクしたモデル試料を、第１試料の前、かつ、２回目と３回目のリピートの間にＩＤＡ法で分析した。Peak Viewからエクスポートしたイオンライブラリファイルから合成ペプチドのトランジション情報を削除し、合成ペプチドの情報を用いずに再構築ピークファイルを作成した。勾配条件が異なるため、ＲＴの差異は図２Ｂより大きく、検出されたピークの時間ウインドウを１．０分ではなく、１．５分に設定した。ピーク面積データをMarker Viewソフトウエア（ABSCIEX社製）にインポートして統計分析を行い、顕著に増加した（ｐ＜０．０１倍及び＞１．５倍）ペプチドピークを抽出した。これら顕著に増加したペプチドピークについてピークのバリデーションを行った。合成ペプチドの一部はＨＬＭ中のタンパク質の測定に用いることができるため、ピーク面積は、内在性ペプチドと添加ペプチドの合計面積となっている。内在性ペプチドの量を除外するため、０．５又は５ｆｍｏｌのピーク面積比を以下のとおり計算した。
ピーク面積比＝（０．５又は５ｆｍｏｌの合成ペプチドのピーク面積−０．１ｆｍｏｌの合成ペプチドのピーク面積）／（２５ｆｍｏｌの合成ペプチドのピーク面積−０．１ｆｍｏｌの合成ペプチドのピーク面積）

【産業上の利用可能性】

【0065】

本発明は、バイオマーカー探索に有効な技術であるため、医療・製薬・バイオ分野に活用できる。また、ＳＷＡＴＨのデータ取得は、現在までのところABSCIEX社（質量分析機器世界シェア一位）の機械でしかできないため、ABSCIEX社の解析ソフトウエアに本発明のデータベース作成方法のアルゴリズムを入れることが有用である。また、バイオソフトウェア企業に本発明のデータベース作成方法のアルゴリズムをライセンシングし、解析用ソフトの開発に貢献することも期待される。

【図1】

【図2】

【図3】