特許 6366181 フラン化合物分解方法及び新規なフラン化合物分解微生物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6366181

(24)【登録日】2018年7月13日

(45)【発行日】2018年8月1日

(54)【発明の名称】フラン化合物分解方法及び新規なフラン化合物分解微生物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20180723BHJP

   B09B 3/00 20060101ALI20180723BHJP

   C12N 1/14 20060101ALI20180723BHJP

   C12P 1/02 20060101ALI20180723BHJP

   C05F 17/00 20060101ALI20180723BHJP

   C12R 1/79 20060101ALN20180723BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/00 SZAB

   B09B3/00 304Z

   C12N1/00 R

   C12N1/14 A

   C12P1/02 Z

   C05F17/00

   C12R1:79

【請求項の数】8

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2014-200765(P2014-200765)

(22)【出願日】2014年9月30日

(65)【公開番号】特開2016-67288(P2016-67288A)

(43)【公開日】2016年5月9日

【審査請求日】2017年7月11日

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01942

(73)【特許権者】

【識別番号】304021417

【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学

(73)【特許権者】

【識別番号】595134858

【氏名又は名称】豊栄物産株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100081271

【弁理士】

【氏名又は名称】吉田 芳春

(74)【代理人】

【識別番号】100162189

【弁理士】

【氏名又は名称】堀越 真弓

(72)【発明者】

【氏名】中崎 清彦

(72)【発明者】

【氏名】中下 隆史

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０２１２９３３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平６−５５１５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Beata Kluczek-Turpeinen et al.，World Journal of Microbiology & Biotechnology，２００５年，Vol.21，p.1603-1609

【文献】 B. Kluczek-Turpeinen et al.，Appl. Microbiol. Biotechnol.，２００３年，Vol.61，p.374-379

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペシロマイセスｓｐ．（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）を用いて、フラン化合物を分解することを特徴とするフラン化合物分解方法。

【請求項2】

前記フラン化合物の分解には、前記フラン化合物の存在下で前記ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）を培養する工程を有することを特徴とする請求項１に記載のフラン化合物分解方法。

【請求項3】

前記培養工程は、５０℃未満の条件下で行われることを特徴とする請求項２に記載のフラン化合物分解方法。

【請求項4】

前記培養工程は、ｐＨ４〜７の条件下で行われることを特徴とする請求項２又は３に記載のフラン化合物分解方法。

【請求項5】

前記フラン化合物は、有機性廃棄物の亜臨界水処理又はバイオマスの糖化処理により生成したものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のフラン化合物分解方法。

【請求項6】

前記フラン化合物が５−ＨＭＦ又はフルフラールであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のフラン化合物分解方法。

【請求項7】

ペシロマイセスｓｐ．（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）。

【請求項8】

有機物を亜臨界水処理する工程と、亜臨界水処理された有機物にペシロマイセスｓｐ．（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）を接種し、２０℃〜５０℃、ｐＨ４〜７の条件下で培養する工程を有することを特徴とするコンポスト製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フラン化合物を分解する方法、フラン化合物を分解することができる新規微生物及び当該微生物を用いたコンポスト製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

私たちの生活にともなって排出される廃棄物はその量が年々増加しており、廃棄物の適正な処理は大きな課題となっている。廃棄物の中でも、家庭やレストラン、食品加工工場などから廃棄される食品廃棄物は、重金属等の有害な物質を含まない有機物であることから、コンポスト（堆肥）化することにより農業利用が可能である。そのため、コンポスト化は食品廃棄物リサイクルのための重要な技術として注目を集めている。

【0003】

食品廃棄物からなるコンポストは、微生物の好気性発酵により食品廃棄物を分解することにより得られるが、微生物による有機物の分解は微生物が接触した部分でしか生じない。一般的に、家庭やレストラン、食品加工工場などから廃棄される食品廃棄物は固形物であり、サイズが大きいものが多く含まれている。そのため、有機物の分解には時間がかかり、通常の自然発酵方式での食品廃棄物のコンポスト化は３ヵ月程度を要している（特許文献１参照）。

【0004】

そのため、特許文献１では、有機物の分解速度を増加させて効率的に食品廃棄物からのコンポストを生産することを目的として、食品廃棄物に微生物を含む戻し堆肥及び水を加えて撹拌し、所定の大きさに造粒した後に１カ月発酵させる方法が記載されている。また、非特許文献１では、稲藁をコンポスト原料として用いた際に、発酵工程前の前処理として亜臨界水中で稲藁の熱水処理を行い、その後６週間発酵させる方法が記載されている。このように、コンポスト原料を亜臨界水処理することにより、その溶解度を増加させると共にコンポスト原料の固形物サイズを小さくすることができるため、有機物の比表面積が増加し、後の発酵工程において微生物による有機物の分解が促進されるものと考えられる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第４７８２５９５号明細書

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４年１月、Ｖｏｌ．１５１、ｐ．３０６〜３１３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、本発明者らは、食品廃棄物を亜臨界水処理することにより、５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）やフルフラールといったフラン化合物が生産されること、及び、これらのフラン化合物が有機物分解に関与する微生物の活性を阻害し、有機物分解のスタートアップを遅延させることを見出した。

【0008】

また、近年、セルロース系バイオマスからのバイオエタノールの生産が注目を集めているが、バイオマスの糖化に伴って生成したフラン化合物が、発酵微生物である酵母等の増殖阻害を引き起こし、バイオエタノールの生産を阻害することが深刻な問題となっている。さらに、フラン化合物は枯草菌（Bacillus subtilis）やサルモネラ属細菌の増殖も阻害することが知られており、多くの種類の微生物にとって阻害的な作用をもたらすことが知られている。

【0009】

本発明は上述した点に鑑み案出されたもので、その目的は、フラン化合物を効果的に分解する方法及びフラン化合物を分解する新規な微生物を提供することにある。

【0010】

また、本発明の他の目的は、有機物を亜臨界水処理してコンポストを生産する際に、効率的にコンポストを短期間で生産するための方法を提供することにある。

【0011】

さらに、本発明の他の目的は、セルロース系バイオマスからバイオエタノールを生産する際に、バイオエタノールを効率的に生産するための方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

上記課題を解決するため、本発明のフラン化合物分解方法は、ペシロマイセスｓｐ．（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）を用いて、フラン化合物を分解する。

【0013】

ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）は、一般的に発酵阻害物質とされるフラン化合物の存在下であっても生育が阻害されず、フラン化合物を分解する能力を有した微生物である。そのため、他の発酵微生物はフラン化合物により生育や発酵が妨げられるが、ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株はフラン化合物存在下でも活発であり、効率よくフラン化合物を迅速に分解することができる。

【0014】

また、このフラン化合物の分解には、フラン化合物の存在下でペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）を培養する工程を有することも好ましい。このペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株は、発酵阻害物質とされるフラン化合物の存在下であっても活発に増殖することができるため、培養によってその微生物濃度を増加させ、フラン化合物を迅速に効率よく分解することができる。

【0015】

また、本発明のフラン化合物分解方法の培養工程は、５０℃未満の条件下で行われることも好ましい。これにより、常温性糸状菌であるペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）の好適な培養温度が選択される。

【0016】

さらに、本発明のフラン化合物分解方法の培養工程は、ｐＨ４〜７の条件下で行われることも好ましい。これにより、ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）の好適な培養ｐＨが選択される。

【0017】

また、本発明のフラン化合物分解方法におけるフラン化合物は、有機性廃棄物の亜臨界水処理又はバイオマスの糖化処理により生成したものであることも好ましい。ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）が適用される対象として好適なものが選択される。

【0018】

また、本発明のフラン化合物分解方法におけるフラン化合物は、５−ＨＭＦ又はフルフラールであることも好ましい。ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）が分解するフラン化合物として好適なものが選択される。

【0019】

また、本発明の微生物は、ペシロマイセスｓｐ．（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）である。

【0020】

本発明のコンポスト製造方法は、有機物を亜臨界水処理する工程と、亜臨界水処理された有機物にペシロマイセスｓｐ．（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）を接種し、２０℃〜５０℃、ｐＨ４〜７の条件下で培養する工程を有している。

【0021】

コンポスト原料の有機物を亜臨界水処理するとフラン化合物が生成し、コンポスト化を促進する微生物の生育や発酵が阻害される。しかし、この亜臨界水処理された有機物にペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）を接種し、所定の温度及びｐＨで培養することにより、ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）が優占的に増殖してフラン化合物を分解する。

【発明の効果】

【0022】

本発明によれば、以下のような優れた効果を有するフラン化合物分解方法及びコンポスト製造方法を提供することができる。
（１）フラン化合物分解能を備えた新規な微生物により、フラン化合物を効果的に分解することができる。
（２）有機物の亜臨界水処理により生産されたフラン化合物を効率的に分解除去することができ、分解除去後には有機物分解も迅速に進行するため、コンポスト化期間が短縮され、コンポスト製造を効率良く行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】実施例１における、コンポストＡをコンポスト種菌として用いたＲｕｎ Ａ及びコンポストＢをコンポスト種菌として用いたＲｕｎ Ｂの装置内温度、炭酸ガス発生速度、ｐＨ及びフラン化合物の濃度の経時変化を示すグラフである。

【図2】実施例１におけるＲｕｎ Ａ及びＲｕｎ Ｂの微生物の濃度の経時変化を示すグラフである。

【図3】実施例３におけるペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株を接種した固体培養の微生物濃度、ｐＨ及びフラン化合物の濃度の経時変化を示すグラフである。

【図4】実施例４における、ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株を接種したＲｕｎ Ｉ及びＦＡ１３株を接種しなかったＲｕｎ ＩＩの装置内温度、炭酸ガス発生速度、ｐＨ及びフラン化合物の濃度の経時変化を示すグラフである。

【図5】実施例４におけるＲｕｎ Ｉ及びＲｕｎ ＩＩの微生物の濃度の経時変化を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明のフラン化合物分解方法は、フラン化合物の分解能力を有するペシロマイセスｓｐ．（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）を用いて、フラン化合物を分解することにより行われる。本発明者らは後述する実施例に示すように、食品廃棄物からなるコンポスト原料を亜臨界水処理した際に、フラン化合物が生産され、コンポスト化に関与する微生物の生育が阻害されることを見出した。しかしながら、さまざまな条件下でコンポスト化試験を行ったところ、コンポスト試料中のフラン化合物濃度が迅速に低下し、その後の有機物分解も速やかに進行する試験区を発見した。この試験区のコンポスト試料からフラン化合物の分解能力を有するペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）が単離された。

【0025】

ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）の培養温度は２０℃〜５０℃が好ましく、２５℃〜４０℃がより好ましく、２７℃〜３５℃が特に好ましい。また、培養環境下のｐＨは、ｐＨ４〜７が好ましく、ｐＨ４．５〜６がより好ましい。このような培養条件でペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）を培養することにより優占的にＦＡ１３株が増殖し、効率的に培養環境中に存在するフラン化合物が分解される。

【0026】

また、フラン化合物の分解にあたっては、あらかじめ培養・増殖させた相当量のペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）の菌糸体若しくは胞子、又はそれらの破砕物等をフラン化合物を含む分解対象中に添加してもよい。ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）は糸状菌であり、ＰＤ液体培地（バレイショ浸出液２００ｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ；栄研化学株式会社製「パールコア ポテトデキストロース寒天培地」から寒天を除いたもの）やＰＤ寒天培地で好適に培養され、増殖される。なお、ＦＡ１３株はＰＤ寒天培地上で若草色の特徴的なコロニーを形成する。

【0027】

ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）が分解するフラン化合物としては特に限定されないが、一例として５−ＨＭＦ及び／又はフルフラールが挙げられる。これらのフラン化合物は、コンポスト製造時における食品廃棄物の亜臨界水処理やバイオエタノール生産時におけるバイオマスの糖化処理により生成する。そのため、ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）をコンポスト製造時やバイオエタノール生産時に生成したフラン化合物の分解に用いることができる。

【0028】

次に、ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）を用いたコンポスト製造方法について説明する。まず、コンポスト原料となる有機物の亜臨界水処理工程について説明する。亜臨界水処理とは、臨界点（水の臨界点は２２ＭＰａ、３７４℃）より温度・圧力の低い条件における亜臨界状態を利用して行う処理のことをいう。本発明の実施形態に係る亜臨界水処理は、食品廃棄物等のコンポスト原料を亜臨界状態下におき、水溶媒中で５分〜１０時間、好ましくは１０分〜２時間、より好ましくは１０分〜６０分間抽出処理することにより得られる。亜臨界条件としては圧力０．２ＭＰａ〜１５ＭＰａ、温度１５０℃〜２４０℃が好ましい。コンポスト原料として食堂、コンビニエンスストア及び食品加工工場から回収した食品廃棄物を用いた際には、亜臨界水処理によってコンポスト原料がほとんど液化してしまうため、コンポスト原料の水分を調整可能なおがくず等の水分調整材を添加することが好ましい。この亜臨界水処理によって、有機物が一定量分解されるが、その際にフラン化合物が生成する。

【0029】

次に、上述した亜臨界水処理されたコンポスト原料に対し、ペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）を接種し、培養を行う工程について説明する。培養温度は２０℃〜５０℃が好ましく、２５℃〜４０℃がより好ましく、２７℃〜３５℃が特に好ましい。また、培養環境下のｐＨは、ｐＨ４〜７が好ましく、ｐＨ４．５〜６となるように調整することがより好ましい。このような培養条件でペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）を培養することにより、ＦＡ１３株が活発に増殖し、コンポスト原料中に存在するフラン化合物が分解される。すなわち、フラン化合物がコンポスト原料中に存在する間はコンポスト化を促進させる微生物の生育は阻害されているため、接種したＦＡ株が優占種となり、フラン化合物の分解が行われる。フラン化合物の分解期間は、接種又は添加するＦＡ株の濃度によって異なるが、１日〜１０日間程度が好ましく、２日〜５日間程度がより好ましい。フラン化合物の分解状況はフラン化合物の濃度をＨＰＬＣ等で測定することにより確認することが可能である。

【0030】

最後に、有機物分解を行う工程について説明する。フラン化合物を一定程度分解した後は、培養温度を上昇させて５０℃〜６０℃とし、ｐＨは７〜８となるように調整して、有機物を分解する微生物に好適な培養環境となるように変化させる。フラン化合物が略分解された後であるため、有機物を分解する微生物の生育や増殖は阻害されない。これにより、これまで優占種であったフラン化合物分解菌、すなわちＦＡ１３株は減少し、有機物を活発に分解する好熱性細菌等が増殖し、コンポスト化が効率的に進行する。有機物の分解期間は、３日〜２０日程度が好ましく、５日〜１０日程度がより好ましい。

【0031】

上述したコンポスト製造方法により、通常、３ヵ月程度要していた有機物のコンポスト化が数週間程度に短縮することができる。また、コンポスト原料に亜臨界水処理が施されているため、コンポスト原料が滅菌され、バイオハザードを低減できるという効果を有する。そのため、コンポスト製造作業を安全に行うことができる。

【0032】

本発明のペシロマイセスｓｐ．ＦＡ１３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２）は、上述したような亜臨界水処理されたコンポスト原料をコンポスト化する際に使用されるだけでなく、あらゆる目的でのフラン化合物を分解する際に使用され得る。特に限定されないが、例えば、バイオエタノール生産時におけるバイオマスの糖化処理により生成したフラン化合物を分解する場合や、工業用原料としてフラン化合物を生産した際等に廃液等中に含まれるフラン化合物を分解するような場合にも好適に使用することが可能である。

【実施例】

【0033】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に特に限定されるものではない。

【0034】

以下の実施例で使用したコンポスト原料及びコンポスト混合原料は下記の通りである。

【0035】

（１）コンポスト原料
コンポスト原料として、食堂、コンビニエンスストア及び食品加工工場から集めた食品廃棄物を用いた。本実施例で用いたコンポスト原料（食品廃棄物）の窒素の元素分析値は５４．１％、炭素の元素分析値は３．０７％であり、Ｃ／Ｎ比は１７．６であった。

【0036】

（２）コンポスト混合原料
上述したコンポスト原料である食品廃棄物とおがくずを、乾燥重量で１０：９の割合となるように混合した。１０ｍ^３容量の亜臨界水処理機を用いて、食品廃棄物とおがくずの混合物２トンを１８０℃、３０分の条件で亜臨界水処理した。亜臨界水処理された食品廃棄物とおがくずの混合物に、コンポスト種菌を乾燥重量比で５％となるように添加し、コンポスト混合材料とした。コンポスト化開始時には、消石灰を添加してコンポスト混合原料のｐＨを５に調整した。同様にコンポスト化開始時には、蒸留水を加えてコンポスト混合原料の含水率を６０％に調製した。

【0037】

また、以下の実施例で行ったコンポスト試料のｐＨ、フラン化合物の濃度、含水率及び微生物の解析並びにコンポスト化における炭酸ガス発生速度の測定は以下のように行った。

【0038】

（１）ｐＨ
採取したコンポスト試料に蒸留水を重量比で１：９となるように添加し、ホモジナイザー（株式会社日本精機製作所製品、製品名；エースホモジナイザー）で均一な懸濁液にした。懸濁液のｐＨをｐＨメータ（株式会社堀場製作所製品、製品名：ｐＨメータＤ−５１）で測定した。

【0039】

（２）フラン化合物の濃度
コンポスト原料として用いた食品廃棄物の亜臨界水処理により、フラン化合物が生成した。高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いてフラン化合物である５−ＨＭＦ及びフルフラールの濃度を測定した。ＨＰＬＣの検出器は日本分光株式会社製品、型番；ＵＶ−２０７５を用い、カラムは昭和電工株式会社製品、型番；Ｓｕｇａｒ ＳＨ−１０１１を用いた。ＨＰＬＣの液体サンプルは、上述したｐＨ測定の際に作成した試料の懸濁液を０．２０μｍの親水性ＰＴＦＥフィルターでろ過して調整した。ＨＰＬＣの移動相としては脱気した５ｍＭの硫酸水溶液を用い、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムの温度は５０℃に維持した。

【0040】

（３）含水率
採取したコンポスト試料の重量を測定した後、定温乾燥機（ヤマト科学株式会社製品、製品名；ＤＳ６００）で２４時間、１０５℃で乾燥させ、コンポスト試料の乾燥状態の重量を測定した。乾燥後の減少重量を乾燥前の重量で除した値を含水率とした。

【0041】

（４）微生物の解析
コンポスト種菌及びコンポスト試料中の常温性糸状菌、常温性細菌及び好熱性細菌の濃度は希釈平板法で求めた。常温性糸状菌の測定にはＰＤ寒天培地（栄研化学株式会社製品）を用い、培養温度３０℃、培養期間３日間とした。なお、常温性細菌の増殖を抑制するために、１ｍＬのクロラムフェニコール溶液（クロラムフェニコール１００ｍｇをエタノール１ｍＬに溶解）を１ＬのＰＤ寒天培地に加えた。常温性細菌と好熱性細菌の計数には、ＴＳ寒天培地（トリプチケースペプトン１７ｇ／Ｌ、ファイトンペプトン３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ２．５ｇ／Ｌ、グルコース２．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．３）を用い、培養温度は常温性細菌が３０℃、好熱性細菌が６０℃、培養期間は３日間とした。なお、常温性細菌を計測するときには、糸状菌の増殖を抑制するため、１００μＬのアンホテリシンＢ溶液（アンホテリシンＢ２５ｍｇをジメチルスルホキシド１ｍＬに溶解）を１ＬのＴＳ寒天培地に加えた。

【0042】

（５）炭酸ガス発生速度
有機物が分解されると炭酸ガスが生成することから、コンポスト化に伴って生成した炭酸ガス量を測定し、有機物の分解の指標とした。装置から排出されたガスを、硫酸水溶液を充填したアンモニアトラップを通過させてアンモニアを除いた後、赤外線ガス分析装置（型式；ＲＩ−５５５、理研計器株式会社製品）に導き、ガス中に含まれる炭酸ガス量を測定した。有機物の分解速度は、単位時間及び単位コンポスト混合原料乾燥重量あたりの炭酸ガスの排出量（発生量）のモル数で定義された炭酸ガス発生速度（ｍｏｌ／ｈ／ｇ−ｄｓ）として計算した（Ｎａｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｗａｓｔｅ Ｍａｎａｇｅ． Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１６，ｐ．４８４〜４８９）。

【0043】

［実施例１］
１．亜臨界水処理されたコンポスト混合原料のコンポスト化
本実施例では、コンポスト種菌として、市販の２種類のコンポスト（熟成堆肥、袋入り）を用いた。これら２種類のコンポスト（コンポストＡ及びコンポストＢ）中に含まれる微生物の解析結果を表１に示す。表１より、コンポストＡ及びコンポストＢには高濃度の微生物が含まれているだけでなく、様々な種類の微生物が含まれることがわかった。なお、一般的にコンポストは、生産ロットが異なる場合はもちろん、生産ロットが同じ場合であっても袋ごとに微生物叢が異なる。そのため、本実施例及び以下実施例におけるコンポストＡ及びコンポストＢは、それぞれ、同一の袋から取り出したものを使用した。

【0044】

【表1】

【0045】

コンポスト化にあたっては、研究室規模のコンポスト化装置（円筒形、直径３００ｍｍ×深さ４００ｍｍ）を用いた。コンポスト混合原料を収容する装置本体をポリ塩化ビニルで形成し、発泡スチロールからなる断熱材に埋設させた。また、断熱材と装置本体との間には、装置内温度を調節するためにリボンヒータを配置した。本実施例では、上述したコンポストＡ又はコンポストＢをコンポスト種菌として含むコンポスト混合原料３０００ｇをそれぞれ装置に投入し、コンポスト化を行った。コンポスト化期間は１０日間とした。コンポスト化が進むにつれて、微生物による有機物分解にともなって代謝熱が発生し、装置内の温度が上昇したため、本実施例では装置内温度を次のように制御した。コンポスト化開始から３日間は３０℃とした。３日間経過後、リボンヒータを加熱して昇温速度２．５℃／ｈで装置内温度を６０℃まで上昇させた。残りの７日間は微生物による発熱と通気流量の調整により、６０℃に制御した。なお、好気条件を維持するために、装置底部から最小通気量である４５Ｌ／ｈで通気した。コンポスト化後半において、通気流量が最小通気量４５Ｌ／ｈであるにもかかわらず装置内温度が６０℃を下回った場合には、リボンヒータで加熱して６０℃を維持させた。

【0046】

コンポスト化過程における均一な有機物分解のために、コンポスト化期間中は１日に１度、装置内部のコンポスト混合原料を混合攪拌する切り返しの操作をおこなった。切り返し時には、コンポストが乾き過ぎないように、適宜蒸留水を添加した。切り返し時には、物理化学的及び生物学的な分析のために装置からコンポスト試料を約１５ｇずつ採取した。また、コンポスト化開始３日後には、消石灰を用いてコンポスト混合原料のｐＨを７〜８付近に調整した。その後は必要に応じて消石灰を加えることで、ｐＨを微生物にとって好ましい弱アルカリ性の８付近に調整した。

【0047】

装置から回収したコンポスト試料を用いてｐＨ、含水率、フラン化合物である５−ＨＭＦ及びフルフラールの濃度を測定した。また、コンポスト化に伴って生成した炭酸ガス量を測定し、単位時間あたりの炭酸ガス発生速度を求めた。これらの結果を図１に示す。横軸はコンポスト化開始後のコンポスト化期間（日）を示している。Ｒｕｎ ＡはコンポストＡを種菌としたコンポスト混合原料に関する結果を示しており、Ｒｕｎ Ｂは、コンポストＢを種菌としたコンポスト混合原料に関する結果を示している。

【0048】

図１に示す炭酸ガス発生速度をみると、Ｒｕｎ Ａではコンポスト化開始３日後に小さなピークを示し、そのあと一旦減少するが、４日目以降は上昇しその後は高い値を保っている。このことより、Ｒｕｎ Ａ、すなわち、コンポストＡを種菌として用いた試験区ではコンポスト化初期段階で活発な有機物分解が始まっていることが示された。一方、コンポストＢを種菌として用いたＲｕｎ Ｂでは、炭酸ガス発生が遅れ、コンポスト化後半以外では炭酸ガス発生速度がきわめて低い値となっている。これらの結果から、亜臨界水処理された食品廃棄物をコンポスト化するにあたっては、有機物分解は接種した種菌に強く依存することがわかった。また、図１に示すように、コンポスト混合原料のｐＨは、Ｒｕｎ Ａではコンポスト化開始３日後に７〜８に調整したが、その後はｐＨを調整しなくても、コンポスト化期間中、ほぼ弱アルカリ性を示した。これは有機物の分解、特にタンパク質の分解によってアンモニアが生じたためと考えられた。一方、Ｒｕｎ ＢではｐＨを弱アルカリ性に保つために、消石灰を毎日、切り返しの度に添加しなければならなかった。これはＲｕｎ Ｂでは活発な有機物分解がおこらなかったことを示している。さらに、亜臨界水処理により生成したフラン化合物、すなわち、５−ＨＭＦとフルフラールの濃度については、Ｒｕｎ ＡではＲｕｎ Ｂに比べて顕著な減少がみられた。このように、コンポストＡを種菌としたＲｕｎ Ａでは、Ｒｕｎ Ｂに比べて速やかで活発な有機物分解と亜臨界水処理により生成したフラン化合物の減少が示された。

【0049】

なお、比較試験として亜臨界水処理を行わずに、同じ食品廃棄物からなるコンポスト原料に直接コンポストＡまたはコンポストＢを種菌として添加し、実施例１と同様の方法でコンポスト化を行った際には、いずれの種菌を用いた場合にも直ちに有機物分解が始まった。また、この場合には、コンポスト原料からはフラン化合物は検出されなかった。

【0050】

これらの結果により、食品廃棄物の亜臨界水処理によりフラン化合物が生成すること、生成したフラン化合物はバイオエタノールの生成等に関わる発酵微生物の活性を阻害するのと同様、コンポスト化に関わる微生物の活性も阻害すること、及び、コンポストＡを種菌としたＲｕｎ Ａのコンポスト試料には高いフラン化合物分解能を有する微生物が含まれていることが示唆された。

【0051】

そこで、装置から２４時間毎に回収したコンポスト試料中の微生物の解析をおこなった。試料中に含まれる常温性糸状菌（Ｆｕｎｇｉ）、常温性細菌（ＭＢ）及び好熱性細菌（ＴＢ）の微生物濃度の解析結果を図２に示す。横軸はコンポスト化期間（日）、縦軸はコンポスト単位乾燥重量あたりの微生物濃度（ＣＦＵ/ｇ-ｄｓ）の対数を示している。各記号のエラーバーは９５％信頼区間を表す。Ｒｕｎ ＡはコンポストＡを種菌としたコンポスト混合原料に関する結果を示しており、Ｒｕｎ Ｂは、コンポストＢを種菌としたコンポスト混合原料に関する結果を示している。

【0052】

図２に示すように、Ｒｕｎ Ａについては、常温性糸状菌（Ｆｕｎｇｉ）が２日目〜３日目に急激に増加した。この常温性糸状菌の増加のタイミングは、図１に示すフラン化合物の急激な減少のタイミングとよく一致している。また、常温性糸状菌は４日目以降は減少したが、これは、コンポスト化開始３日間経過後に反応系の温度を６０℃に上昇させたことにより生存できなくなったものと考えられる。一方、Ｒｕｎ Ｂではコンポスト化過程を通して常温性糸状菌の増殖は観察されなかった。本コンポスト化の条件で主体的な有機物分解の役割を担う常温性細菌（ＭＢ）及び好熱性細菌（ＴＢ）については、Ｒｕｎ Ａでは装置内の温度が６０℃に達すると好熱性細菌（ＴＢ）が急激に増殖し、最終的には１０^８ＣＦＵ／ｇ−ｄｓもの高濃度に達した。また、Ｒｕｎ Ａでは高温条件でも常温性細菌（ＭＢ）がわずかに増加した。これは、増殖温度範囲が広い常温性細菌が存在したために高温条件下でも増殖できたか、あるいは通気口周辺等の温度が比較的低い場所で常温性細菌が生存したためと考えられた。Ｒｕｎ Ｂでは好熱性細菌の増殖開始がＲｕｎ Ａよりも著しく遅れ、それを反映して炭酸ガス発生速度も８日目付近まで増加しなかった。なお、Ｒｕｎ Ｂでは常温性細菌は再び増殖することはなかった。

【0053】

これらの結果より、Ｒｕｎ Ａのコンポスト試料に含まれる常温性糸状菌がフラン化合物を分解すること、フラン化合物の減少によって有機物分解を担う好熱性細菌の増殖環境が整えられ、コンポスト化が促進されることが示唆された。そこで以下実施例２において、Ｒｕｎ Ａのコンポスト試料からフラン分解能を有する糸状菌の単離を試みた。

【0054】

［実施例２］
２．フラン化合物分解微生物の単離
実施例１において、コンポストＡを種菌としたコンポスト混合原料のコンポスト化を行った際に、コンポスト化開始３日後に現れた糸状菌の単離を行った。コンポスト化開始３日後に採取したコンポスト試料について、ＰＤ寒天培地（栄研化学株式会社製品）を用い、培養温度３０℃、培養期間３日間で培養した。なお、常温性細菌の増殖を抑制するために、１ｍＬのクロラムフェニコール溶液（クロラムフェニコール１００ｍｇをエタノール１ｍＬに溶解）を１ＬのＰＤ寒天培地に加えた。培養後のＰＤ寒天培地上には、主に若草色のコロニーが形成されていた。これらのコロニーを回収し、５−ＨＭＦが８．０９ｍｇ／ｇ−ｄｓ、フルフラールが０．４８ｍｇ／ｇ−ｄｓ含まれ、ｐＨが５．８に調整されたＰＤ液体培地にそれぞれ接種した。培養にともなうフラン化合物の濃度変化をＨＰＬＣで測定し、フラン化合物の分解能が最も高かった微生物を選択した。この微生物を「ＦＡ１３」と名付けた。ＦＡ１３株について２６Ｓ ｒＲＮＡ系統解析を行ったところ、新規なペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属の微生物であることがわかった。この「ＦＡ１３」は、特許微生物寄託センターにＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２として寄託された。

【0055】

［実施例３］
３．単離したフラン化合物分解微生物の固体培養
実施例２で単離したＦＡ１３株のフラン化合物分解能を確認するため、コンポスト種菌を添加していないコンポスト混合原料にガンマ線を１０ｋＧｙ／ｈで３時間照射して滅菌したものにＦＡ１３株を接種して固体培養を行った。周囲の環境からの雑菌の汚染を抑止して、再現性のあるデータを得ることができるようにするため、培養装置は次のような構成とした。パイレックス（登録商標）ガラス製の円筒（直径４５ｍｍ×深さ１００ｍｍ）をリアクタとして用い、円筒の上部と下部には、通気のためのガラス管を挿入したシリコンゴム栓を取り付けた。通気する空気は、最初に孔径０．４５μｍのメンブレンフィルタを通過させた後、ＮａＯＨ水溶液を含んだ炭酸ガストラップに導き、リアクタに導入する前にバブラーを通過させて水蒸気で飽和させた。通気速度はリアクタ内部を好気条件に維持するために十分な５．５ｍＬ／ｍｉｎを維持した。温度はインキュベータの中で３日間３０℃に維持した。ここでは結果を示していないが、対照試験として、ＦＡ１３株の接種を行わずに上述と同様の条件で培養する試験も行った。培養期間中、リアクタから固体試料を採取し、試料中のＦＡ１３株の濃度（ＣＦＵ/ｇ-ｄｓ）、ｐＨ及びフラン化合物の濃度を測定した。結果を図３に示す。横軸は培養期間（日）を示している。

【0056】

図３に示すように、培養期間中のｐＨは略一定であり、ｐＨ５に維持された。また、ＦＡ１３株の濃度は培養期間の経過とともに増加し、最終的には１０^８ＣＦＵ／ｇ−ｄｓに達した。他方、フラン化合物である５−ＨＭＦとフルフラールの濃度は培養期間の経過にともなって減少し、特にＦＡ１３株が急激に増加した培養開始１日〜２日後に大きく減少した。これらの結果より、ＦＡ１３株がコンポスト混合原料中のフラン化合物を分解したことがわかった。なお、本実施例における培養開始時点の５−ＨＭＦとフルフラールの濃度は、実施例１におけるコンポスト化開始時点の５−ＨＭＦとフルフラールの濃度と比べるとやや低い値となっているが（図１参照）、これは亜臨界水処理されたコンポスト原料をガンマ線照射によって滅菌する過程で、フラン化合物の一部が分解されたためと考えられる。

【0057】

［実施例４］
４．フラン化合物分解微生物（ＦＡ１３）を接種したコンポスト化
実施例１のコンポストＢをコンポスト種菌として用いたコンポスト混合原料を準備した。このコンポスト混合原料について、実施例２で単離したＦＡ１３株を接種した試験区（Ｒｕｎ Ｉ）とＦＡ１３株の接種を行わない対照区（Ｒｕｎ ＩＩ）のコンポスト化を行った。コンポスト化期間は１０日間とした。Ｒｕｎ ＩにおけるＦＡ１３株の接種濃度は、コンポスト混合原料の乾燥重量当たり、１０^５ＣＦＵ／ｇ−ｄｓとした。いずれの試験も、その開始時には、コンポスト混合原料のｐＨは５．０に調整し、蒸留水を加えることでコンポスト混合原料の含水率を５０％とした。また、コンポスト化開始３日後には、消石灰を用いてコンポスト混合原料のｐＨを７〜８付近に調整した。

【0058】

コンポスト化には実施例３で用いたリアクタを使用し、通気方法も実施例３と同様とした。コンポスト混合原料をリアクタに入れ、リアクタ本体を温度制御のためにインキュベータ中に設置した。コンポスト化の温度は最初の３日間は３０℃、その後、昇温速度２．５℃／ｈで６０℃まで上昇させ、残りの７日間は６０℃に維持した。リアクタからの排出ガスは５Ｌのポリビニルフルオライド製テドラーバッグ（近江オドエアーサービス株式会社）に回収した。テドラーバッグは２４時間ごとに交換して、収集されたガスの体積を測定するとともに、炭酸ガス濃度を北川式ガス検知管（光明理化学工業株式会社）で定量し、２４時間毎の炭酸ガス発生量を計算した。コンポスト化過程における有機物の均一な分解のために、コンポスト化期間中は２４時間毎に滅菌されたスパチュラでコンポスト混合原料を混合攪拌する切り返しを行った。切り返し後、コンポスト試料を採取し、ｐＨ及びフラン化合物の濃度の測定、並びにコンポスト試料中に含まれる微生物の解析を行った。これらの結果を図４及び図５に示す。横軸はコンポスト化期間（日）を示している。

【0059】

図４では、Ｒｕｎ Ｉ（ＦＡ１３株接種あり）、Ｒｕｎ ＩＩ（ＦＡ１３株接種なし）のコンポスト化における、温度と炭酸ガス発生速度、ｐＨ、フラン化合物の濃度の経時変化を示している。ＦＡ１３株を接種したＲｕｎ Ｉについての結果をみると、フラン化合物は迅速に分解され、炭酸ガス発生速度はコンポスト化の初期段階から大きくなり、ｐＨは消石灰を添加して調整しなくても弱アルカリ性を示した。他方、ＦＡ１３株を接種しなかったＲｕｎ ＩＩについての結果をみると、フラン化合物の濃度については、時間の経過と共にゆるやかな濃度の低下はみられたが、Ｒｕｎ Ｉのような迅速な分解はみられなかった。また、炭酸ガス発生速度はＲｕｎ Ｉに比べて極めて小さく、ｐＨについては毎日消石灰を加えてｐＨを調整したため、ｐＨの値はジグザグに変化した。このように、ＦＡ１３株を接種したＲｕｎ Ｉと接種しないＲｕｎ ＩＩの間で明らかな違いが観察された。以上の結果、ＦＡ１３株の接種は亜臨界水処理によって生じた阻害物質、つまりフラン化合物の分解とコンポスト化の促進に効果的であることが確かめられた。

【0060】

図５では、Ｒｕｎ ＩとＲｕｎ ＩＩのコンポスト試料中の経時的な微生物の濃度の変化を示している。横軸はコンポスト化期間（日）、縦軸はコンポスト単位乾燥重量あたりの微生物濃度（ＣＦＵ/ｇ-ｄｓ）の対数を示している。ＦＡ１３株を接種したＲｕｎ ＩではＦＡ１３がコンポスト化の初期段階で増加し、１０^７ＣＦＵ／ｇ−ｄｓの高濃度に達した。なお、本実施例のＲｕｎ Ｉでは、常温性糸状菌の中でもＦＡ１３が圧倒的に優勢であることが寒天培地上のコロニーの観察から確認されたため、常温性糸状菌濃度をＦＡ１３濃度として示した。ＦＡ１３株のコロニーは若草色をしており、きわめて特徴的であるため、寒天培地上での識別が可能である。ＦＡ１３は反応系の温度が６０℃に上昇すると減少したが、代わりに好熱性細菌（ＴＢ）は１０^８ＣＦＵ／ｇ−ｄｓをこえる非常に高い濃度にまで増殖した。また、常温性細菌（ＭＢ）はコンポスト化期間全般を通して一定値に保たれたことから、この常温性細菌は芽胞として存在することで、高い熱耐性を獲得していた可能性が考えられた。他方、ＦＡ１３を接種しなかったＲｕｎ ＩＩではＦＡ１３やその他の常温性糸状菌は観測されなかった。また、常温性細菌と好熱性細菌は温度が６０℃に上昇する４日後まで一定濃度に保たれていたが、４日以降は両方の細菌が減少してしまっていた。

【0061】

このように、単離された新規なＦＡ１３株を亜臨界水処理されたコンポスト混合原料に接種することにより、亜臨界水処理によって生じたフラン化合物がすみやかに分解され、コンポスト化を促進させる微生物が活発に増殖した結果、迅速なコンポスト化が可能となったことが示された。一般的に、単離した微生物をコンポスト等に接種しても、接種する前からそこに存在していた微生物との競合が困難であるため、接種された菌による効果は得られ難いとされている。しかしながら、亜臨界水処理されたコンポスト混合原料中には、他の微生物の活動を阻害するような物質、すなわち、亜臨界水処理によって生じたフラン化合物が含まれていた。それゆえ、他の微生物はフラン化合物が存在するうちは増殖することができない。他方、ＦＡ１３株はフラン化合物の存在下でも活発に増殖することができ、フラン化合物を分解できるという特徴がある。それゆえ、ＦＡ１３株はフラン化合物が存在するうちは他の微生物と競合することがなく、コンポスト混合原料中で他の微生物に打ち勝って増殖し優勢となった結果、フラン化合物を有効に分解するという効果を示すことができたものと考えられた。

【0062】

本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含まれるものである。

【受託番号】

【0063】

ＮＩＴＥ Ｐ−０１９４２

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】