特許 6366503 ざ瘡についての新規ＴＨ１７分化マーカーおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6366503

(24)【登録日】2018年7月13日

(45)【発行日】2018年8月1日

(54)【発明の名称】ざ瘡についての新規ＴＨ１７分化マーカーおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6806 20180101AFI20180723BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20180723BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20180723BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20180723BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180723BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6806 Z

   G01N33/15 Z

   G01N33/50 Z

   G01N33/50 P

   G01N33/68

   C12N15/09 Z

【請求項の数】6

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2014-517636(P2014-517636)

(86)(22)【出願日】2012年6月25日

(65)【公表番号】特表2014-520512(P2014-520512A)

(43)【公表日】2014年8月25日

(86)【国際出願番号】EP2012062258

(87)【国際公開番号】WO2013000870

(87)【国際公開日】20130103

【審査請求日】2015年6月17日

(31)【優先権主張番号】61/501,365

(32)【優先日】2011年6月27日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】599045604

【氏名又は名称】ガルデルマ・リサーチ・アンド・デヴェロップメント

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100089037

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邊 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(72)【発明者】

【氏名】イザベル・カーラヴァン

【審査官】 中村 勇介

(56)【参考文献】

【文献】 Organohalogen Compounds，２０１０年，Vol.72，p.582-585

【文献】 Linchuang Pifuke Zashi，２０１０年，Vol.39, No.7，p.417-419，CAplus［オンライン］、STN［検索日２０１６．５．２３］Accession No. 2010:1353582

【文献】 Experimental Dermatology，２０１１年 ２月，Vol.20, No.2，p.169，アブストラクト番号P042

【文献】 Annu. Rev. Immunol.，２００９年，Vol.27，p.485-517

【文献】 Ann. N. Y. Acad. Sci.，２００８年，1143，p.188-211

【文献】 The Journal of Clinical Investigation，２００９年，Vol.119, No.8，p.2317-2329

【文献】 Journal of Molecular Cell Biology，２００９年，Vol.1，p.66-68

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ１／００−３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

IL-12Rβ1、CCR6をコードするDNAまたはmRNAあるいは対応するタンパク質、ならびに、IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-26、TNFαおよびCCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの、ざ瘡についてのマーカーとしての使用。

【請求項2】

a)個体からのサンプル中の、IL-12Rβ1またはCCR6をコードするDNAまたはmRNAあるいは対応するタンパク質、ならびに、IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを検出する工程、
b)健康な個体からのサンプル中の、IL-12Rβ1またはCCR6をコードするDNAまたはmRNAあるいは対応するタンパク質、ならびに、IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22およびCCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを検出する工程、
c)工程b)の健康な個体において、および、工程a）の個体において、それぞれ検出された少なくとも1つのマーカーの発現レベルを比較する工程であって、
工程a)の個体におけるマーカーのうち少なくとも1つの過剰発現がざ瘡の指標であり、これによりざ瘡を同定する、工程、
を含む、ざ瘡の同定のための方法。

【請求項3】

生物学的サンプル中の、IL-12Rβ1またはCCR6をコードするDNAまたはmRNAあるいは対応するタンパク質のうち少なくとも1つ、ならびに、IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22およびCCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを分析する工程であって、マーカーのうち少なくとも1つの発現における異なる時点におけるバリエーションが、ざ瘡の進行またはバリエーションの指標である、工程、
を含む、個体におけるざ瘡の進行またはバリエーションをモニタリングする方法。

【請求項4】

ざ瘡の1つまたは複数の症状を有すると同定された個体から得られた生物学的サンプルにおいて、IL-12Rβ1またはCCR6をコードするDNAまたはmRNAあるいは対応するタンパク質、ならびに、IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22、および、CCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを分析する工程であって、ざ瘡の処置の個体への投与の前後でのマーカーのうち少なくとも1つの発現におけるバリエーションが、ざ瘡の処置における効力の指標である、工程、
を含む、個体におけるざ瘡を処置するための処置の効力をモニタリングする方法。

【請求項5】

IL-12Rβ1またはCCR6をコードするDNAまたはmRNAあるいは対応するタンパク質の発現を阻害もしくは下方調節する、ならびに/あるいは、IL-12Rβ1またはCCR6をコードするDNAまたはmRNAあるいは対応するタンパク質の、トランス活性化活性を含めた生物学的機能を阻害する、候補の能力を決定する工程を含む、Th-17細胞分化インヒビターのin vitroスクリーニング方法。

【請求項6】

a)ざ瘡病変を模倣する少なくとも1つの生物学的サンプルまたはざ瘡病変を模倣する生物学的サンプルの混合物を、試験される1つまたは複数の薬物候補と接触させる工程;
b)a)で得られた生物学的サンプルまたは生物学的サンプルの混合物中の、IL-12Rβ1またはCCR6をコードするDNAまたはmRNAあるいは対応するタンパク質のうち少なくとも1つ、ならびに、IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22およびCCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの発現または生物学的機能を検出する工程;
c) 工程b)で検出された発現または生物学的機能と、薬物候補と接触していないざ瘡病変を模倣するサンプルで検出された発現または生物学的機能とを比較する工程、
d) 工程b)において検出されたような、工程a)の生物学的サンプルまたは混合物中のIL-12Rβ1またはCCR6をコードするDNAまたはmRNAあるいは対応するタンパク質、ならびに、IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22、および、CCL20から選択された少なくとも1つのマーカーの発現または生物学的機能を阻害する薬物候補を選択する工程であって、前記選択された候補がTh17細胞分化インヒビターとして同定される工程
を含む、Th17細胞分化インヒビターの同定のためのin vitroスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、炎症プロセスにおけるTh17細胞の関与を初めて同定することによるざ瘡の新規特徴付けプロセス、およびざ瘡におけるTh17細胞の機能を標的化する治療適用に関する。

【0002】

より具体的には、本発明は、ざ瘡についての新規マーカーとしての、Th17細胞分化における重要なアクターであるIL-12Rβ1/IL-23R、CCR6、BATF、AHR、STAT3、IRF4の使用、およびざ瘡を診断するためのその使用、Th17分化のインヒビター、特にIL-12Rβ1/IL-23R、CCR6、BATF、AHR、STAT3、IRF4の阻害におけるインヒビターをスクリーニングするためのその使用、ならびにざ瘡処置におけるこれらのスクリーニングされたインヒビターの使用、に関する。

【背景技術】

【0003】

ざ瘡は、世界中の数百万の人々に影響を与える最も一般的な皮膚状態である。重症なざ瘡を有する患者は、この疾患に関連する瘢痕に起因して、著しい心理的および情緒的問題に直面することが多い。尋常性ざ瘡の病変形成は複雑であり、完全には理解されていない。

【0004】

炎症は、ざ瘡の病変形成の重要な構成要素の1つである。グラム陽性微生物P. acnesに対する免疫学的反応は、炎症反応の開始において主要な役割を果たし得る(De Young LM、 Young JM、Ballaron SJ、Spires DA、Puhvel SM. Intradermal injection of Propionibacterium acnes: a model of inflammation relevant to acne. J Invest Dermatol.1984年11月;83巻(5号):394〜8頁、Jappe U、Ingham E、Henwood J、Holland KT. Propionibacterium acnes and inflammation in acne; P. acnes has T-cell mitogenic activity. Br J Dermatol.2002年2月;146巻(2号):202〜9頁)。最近刊行された研究は、炎症性ざ瘡におけるToll様レセプター2(TLR-2)もまた示している(Fathy A、Mohamed RW、Ismael NA、El-Akhras MA. Expression of toll-like receptor 2 on peripheral blood monocytes of patients with inflammatory and noninflammatory acne vulgaris. Egypt J Immunol. 2009年;16巻(1号):127〜34頁;Nagy I、Pivarcsi A、Koreck A、Szell M、Urban E、Kemeny L. Distinct strains of Propionibacterium acnes induce selective human beta-defensin-2 and interleukin-8 expression in human keratinocytes through toll-like receptors. J Invest Dermatol.2005年5月;124巻(5号):931〜8頁)。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】WO2009/068825

【特許文献2】WO/2008/156644

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】De Young LM、 Young JM、Ballaron SJ、Spires DA、Puhvel SM. Intradermal injection of Propionibacterium acnes: a model of inflammation relevant to acne. J Invest Dermatol.1984年11月;83巻(5号):394〜8頁

【非特許文献2】Jappe U、Ingham E、Henwood J、Holland KT. Propionibacterium acnes and inflammation in acne; P. acnes has T-cell mitogenic activity. Br J Dermatol.2002年2月;146巻(2号):202〜9頁

【非特許文献3】Fathy A、Mohamed RW、Ismael NA、El-Akhras MA. Expression of toll-like receptor 2 on peripheral blood monocytes of patients with inflammatory and noninflammatory acne vulgaris. Egypt J Immunol. 2009年;16巻(1号):127〜34頁

【非特許文献4】Nagy I、Pivarcsi A、Koreck A、Szell M、Urban E、Kemeny L. Distinct strains of Propionibacterium acnes induce selective human beta-defensin-2 and interleukin-8 expression in human keratinocytes through toll-like receptors. J Invest Dermatol.2005年5月;124巻(5号):931〜8頁

【非特許文献5】Braff MH、Bardan A、Nizet V、Gallo RL. Cutaneous defense mechanisms by antimicrobial peptides. J Invest Dermatol. 2005年7月;125巻(1号):9〜13頁

【非特許文献6】Schroder JM. Epithelial antimicrobial peptides: local innate defense effector molecules. Ann Dermatol Venereol.2004年4月;131巻(4号):411〜6頁

【非特許文献7】Selsted ME、Ouellette AJ. Mammalian defensins in the antimicrobial immune response. Nat Immunol.2005年6月;6巻(6号):551〜7頁

【非特許文献8】Shaheen B、Gonzalez M. A microbial aetiology of acne-what is the evidence? Br J Dermatol. 2011年4月18日

【非特許文献9】Peck A、Mellins ED. Precarious balance: Th17 cells in host defense. Infect Immun. 2010年1月;78巻(1号):32〜8頁

【非特許文献10】Weiら、2007年、J Biol. Chem.、9月20日

【非特許文献11】Chung Yら、Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity 2009年;30巻:576〜87頁

【非特許文献12】Veldhoen M、Hocking RJ、Atkins CJ、Locksley RM、Stockinger B. and Immunity 2006年2月;24巻(2号):179〜89頁

【非特許文献13】Zhou, L.ら、2007年. IL-6 programs T(H)-17 cell differentiation by promoting sequential engagement of the IL-21 and IL-23 pathways. Nat. Immunol. 8巻:967〜974頁

【非特許文献14】Martinez GJら、Regulation and function of proinflammatory TH17 cells. Ann N Y Acad Sci. 2008年11月;1143巻:188〜211頁

【非特許文献15】Hedrick MNら、CCR6 is required for IL-23-induced psoriasis-like inflammation in mice. J Clin Invest. 2009年8月;119巻(8号):2317〜29頁

【非特許文献16】Nakae, S.ら、2003年. Suppression of immune induction of collagen-induced arthritis in IL-17-deficient mice. J. Immunol. 171巻:6173〜6177頁

【非特許文献17】Doe Cら、Expression of the T helper 17-associated cytokines IL-17A and IL-17F in asthma and COPD. Chest. 2010年11月;138巻(5号):1140〜7頁

【非特許文献18】Liu ZJら、Potential role of Th17 cells in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 2009年12月14日;15巻(46号):5784〜8頁

【非特許文献19】Milner, J.D.ら、2008年. Impaired T (H) 17 cell differentiation in subjects with autosomal dominant hyper-IgE syndrome. Nature 452巻:773〜776頁

【非特許文献20】Yang XOら(2007年) STAT3 regulates cytokine-mediated generation of inflammatory helper T cells. J Biol Chem 282巻:9358〜63頁

【非特許文献21】BATF: bringing (in) another Th17-regulating factor. J Mol Cell Biol. 2009年12月;1巻(2号):66〜8頁

【非特許文献22】Wong Rら、「Analysis of RNA recovery and gene expression in the epidermis using non-invasive tape stripping」; J Dermatol Sci.2006年11月;44巻(2号):81〜92頁

【非特許文献23】Benson NRら、「An analysis of select pathogenic messages in lesional and non-lesional psoriatic skin using non-invasive tape harvesting」. J Invest Dermatol. 2006年10月;126巻(10号):2234〜41頁

【非特許文献24】Wong Rら、「Use of RT-PCR and DNA microarrays to characterize RNA recovered by non-invasive tape harvesting of normal and inflamed skin」. J Invest Dermatol. 2004年7月;123巻(1号):159〜67頁

【非特許文献25】Mol Pharmacol. 2010年2月;77巻(2号):228〜36頁

【非特許文献26】a second class of nuclear receptors for oxysterols: Regulation of RORalpha and RORgamma activity by 24S-hydroxycholesterol (cerebrosterol) - Wang Yら、Biochim Biophys Acta. 2010年8月;1801巻(8号):917〜23頁.電子出版2010年3月6日

【非特許文献27】Wang Yら、Modulation of retinoic acid receptor-related orphan receptor alpha and gamma activity by 7- oxygenated sterol ligands. J Biol Chem. 2010年2月12日;285巻(7号):5013〜25頁

【非特許文献28】Blaskovich MA、Sun J、Cantor Aら、Discovery of JS-124 (cucurbitacin I), a selective Janus Kinase/ Signal Transducer and Activator of Transcription 2 signaling pathway inhibitor with potent antitumor activity against human and murine cancer cells in mice Cancer Res 2003年;63巻:1270〜1279頁

【非特許文献29】Nagabhushanam V、Subbarao K、Ramachandran Mら、Inhibition of STAT3 driven gene expression in melanoma cells by SCV-07 J Clin Oncol 2008年;26巻(5月20日、補遺):14619頁

【非特許文献30】Song H、Wang R、Wang Sら、A low-molecular-weight compound discovered through virtual database screening inhibits Stat3 function in breast cancer cells PNAS 2005年;102巻:4700〜4705頁

【非特許文献31】Bruno RD、Njar VC. Targeting cytochrome P450 enzymes: a new approach in anticancer drug development. Bioorg Med Chem. 2007年8月1日;15巻(15号):5047〜60頁.電子出版2007年5月23日

【非特許文献32】O'Donnell EF、Saili KS、Koch DC、Kopparapu PR、Farrer D、Bisson WH、Mathew LK、Sengupta S、Kerkvliet NI、Tanguay RL、Kolluri SK. The anti-inflammatory drug leflunomide is an agonist of the aryl hydrocarbon receptor. PLoS One. 2010年10月1日;5巻(10号)

【非特許文献33】Wadaら: Selective abrogation of Th1 response by STA-5326, a potent IL-12/IL-23 inhibitor. Blood、2007年、109巻(3号)、1156〜1164頁

【非特許文献34】Wadaら: IL-12/IL-23 inhibitors: a promising approach to the treatment of inflammatory disorders. Drugs Fut . 2008年、33巻(1号)、49〜63頁

【非特許文献35】Wilkinら、2002年、J. Am. Acad. Dermatol. 46巻、584〜587頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

最近の報告は、皮膚が、皮膚自然免疫の一部として、病原体の増殖に応答して種々の抗菌ペプチドを発現することを実証している(Braff MH、Bardan A、Nizet V、Gallo RL. Cutaneous defense mechanisms by antimicrobial peptides. J Invest Dermatol. 2005年7月;125巻(1号):9〜13頁;Schroder JM. Epithelial antimicrobial peptides: local innate defense effector molecules. Ann Dermatol Venereol.2004年4月;131巻(4号):411〜6頁;Selsted ME、Ouellette AJ. Mammalian defensins in the antimicrobial immune response. Nat Immunol.2005年6月;6巻(6号):551〜7頁)。この群の抗菌剤のうち重要なものには、ヒトβデフェンシンファミリーのメンバーおよびグラニュライシン由来ペプチドが含まれる(Dengら、2005年;Harderら、2004年;Mclnturffら、2005年)。ヒトβデフェンシン-1および2(HBD-1およびHBD-2)は、毛嚢脂腺単位において発現され、それらの発現は、ざ瘡病変において上方調節される(Chronnellら、2001年)。最近の研究はまた、P. acnesの選択された株が、TLRを介してHBD-2を活性化できることを発見しており、炎症性ざ瘡におけるこれらのペプチドの重要性をさらに確認している(Nagyら、2005年)。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本出願は初めて、ざ瘡を処置および/または診断するために、新規炎症性プロセス、Th-17細胞分化を標的化することの実験的証拠を提案するものである。

【0009】

従って、本発明は、IL-12Rβ1/IL-23R、CCR6をコードするDNAまたはmRNAおよびまた対応するタンパク質の、ざ瘡についてのマーカーとしての使用、ならびにBATF、AHR、STAT3、IRF4から選択される転写因子のうち少なくとも1つをコードするDNAまたはmRNAおよびまた対応するタンパク質の、ざ瘡についてのマーカーとしての使用、に関する。本発明はまた、上記提案されたマーカーのうち少なくとも1つならびに/またはIL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-26、TNFα、CCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの、ざ瘡についてのマーカーとしての使用にも関する。

【0010】

本発明はまた、
a)個体から採取されたサンプル中の、提案されたマーカーのうち少なくとも1つならびに/またはIL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを検出する工程、
b)健康な個体から採取されたサンプル中の、提案されたマーカーのうち少なくとも1つならびに/またはIL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22およびCCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを検出する工程、
c)少なくとも1つのマーカーの発現レベルにおける差異を比較する工程であって、該マーカーについて、発現レベルは、健康な個体における発現レベルよりも有意に高い、工程;
d)工程c)のマーカーのうち少なくとも1つの過剰発現がざ瘡の指標であり、これによりざ瘡を診断する、工程、
を含む、ざ瘡の診断のための方法を提供する。

【0011】

本発明はまた、
a)個体から採取されたサンプル中の提案されたマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを検出する工程、
b)正常個体から採取されたサンプル中の提案されたマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを検出する工程、
c)少なくとも1つのマーカーの発現レベルにおける差異を比較する工程であって、該マーカーについて、発現レベルは、健康な個体における発現レベルよりも有意に高い、工程;
d)工程c)のマーカーのうち少なくとも1つの過剰発現がざ瘡の指標であり、これによりざ瘡を診断する、工程、
を含むこともできる、ざ瘡の診断のための方法を提供する。

【0012】

本発明は、
a)個体から生物学的サンプルを採取する工程、
b)採取されたサンプル中の、提案されたマーカーのうち少なくとも1つならびに/またはIL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを分析する工程であって、マーカーのうち少なくとも1つの発現におけるバリエーションが、ざ瘡の進行の指標である、工程、
を含む、ざ瘡の進行またはバリエーションをモニタリングする方法を提供する。ざ瘡の進行は、主に面皰性(comedonal)から、より炎症支配的な状態までであり得、例えば結節嚢胞性(nodulocystic)ざ瘡または集簇性ざ瘡などの特定のざ瘡サブタイプに向かう進行もまた意味し得る。進行は、より重症な形態からあまり重症でない形態のざ瘡まで、他の方向で生じてもよい。

【0013】

本発明はまた、
a)ざ瘡の1つまたは複数の症状を有すると同定された個体に、所望の処置を投与する工程、
b)該個体から生物学的サンプルを採取する工程、
c)提案されたマーカーのうち少なくとも1つならびに/またはIL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20から選択される他のマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを分析する工程であって、マーカーのうち少なくとも1つの発現におけるバリエーションが、ざ瘡の処置における効力の指標である、工程、
を含む、ざ瘡を処置するために意図された処置の効力をモニタリングする方法を提供する。

【0014】

本発明はまた、提案されたマーカーのうち1つの発現および/または生物学的機能を阻害または下方調節する前記候補の能力を決定する工程を含む、Th-17細胞分化インヒビターのin vitroスクリーニング方法を提供する。

【0015】

より具体的には、本発明は、
a)少なくとも2つの生物学的サンプルを収集する工程であって、1つの生物学的サンプルはざ瘡病変を模倣し、1つの生物学的サンプルは健康な状態を模倣する、工程;
b)少なくとも1つのサンプルまたはサンプルの混合物を、試験される1つまたは複数の薬物候補と接触させる工程;
c) b)で得られた生物学的サンプルまたは混合物中の、提案されたマーカーのうち少なくとも1つならびに/またはIL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22およびCCL20から選択される発現マーカーのうち少なくとも1つの発現または生物学的機能を検出する工程;
d)前記b)で得られたサンプルまたは混合物中で測定された提案されたマーカーのうち少なくとも1つの発現または生物学的機能、ならびに/あるいはIL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22およびCCL20から選択される発現マーカーのうち少なくとも1つの発現を阻害することが可能な薬物候補を選択する工程、およびそのレベルを薬物候補(複数可)と混合していないサンプルと比較する工程、
を含む、薬物候補の同定のための、Th17細胞分化インヒビターのin vitroスクリーニング方法に関する。

【0016】

別の実施形態において、本発明は、
a)少なくとも2つの生物学的サンプルを収集する工程であって、1つの生物学的サンプルはざ瘡病変を模倣し、1つの生物学的サンプルは健康な状態を模倣する、工程;
b)少なくとも1つのサンプルまたはサンプルの混合物を、試験される1つまたは複数の薬物候補と接触させる工程;
c) 工程b)で得られた生物学的サンプルまたは混合物中の、提案されたマーカーのうち少なくとも1つの発現または生物学的機能を検出する工程;
d)前記工程b)で得られたサンプルまたは混合物中で測定された提案されたマーカーから選択される少なくとも1つのマーカーの発現または生物学的機能を阻害することが可能な薬物候補を選択する工程、およびそのレベルまたは生物学的機能を、薬物候補と混合していないサンプルと比較する工程、
を含む、薬物候補同定のためのTh17細胞インヒビターのin vitroスクリーニング方法を提供する。

【0017】

本発明はまた、ざ瘡および/またはざ瘡関連障害を処置するための組成物の調製のための、上記スクリーニング方法によって同定されたインヒビターの使用に関する。より具体的には、本発明は、N-(2,2,2-トリフルオロエチル)-N-[4-[2,2,2-トリフルオロ-1-ヒドロキシ-1-(トリフルオロメチル)エチル]フェニル]-ベンゼンスルホンアミド、2オキシステロール(酸素化ステロール)、特に24S-ヒドロキシコレステロール24(S)、25-エポキシコレステロールおよび7-酸素化ステロール、メチル 2-シアノ-3,12-ジオキソオレアナ-1,9(11)ジエン-28-オエートまたはバルドキソロンメチル、-(8S,9R,10R,13R,14S,16R,17R)-17-[(E,2R)-2,6-ジヒドロキシ-6-メチル-3-オキソヘプタ-4-エン-2-イル]-2,16-ジヒドロキシ-4,4,9,13,14-ペンタメチル-8,10,12,15,16,17-ヘキサヒドロ-7H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3,11-ジオン、5-(4-クロロフェニル)-6-エチルピリミジン-2,4-ジアミン、γ-D-グルタミル-L-トリプトファン、8-ヒドロキシ-3-メチル-3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[a]アントラセン-1,7,12-トリオン、5,7-ジヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシフェニル)-4-オキソ-4H-クロメン-3-オレート(5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4H-chromen-3-olate)、メチル-N-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-1,2-オキサゾール-4-カルボキサミドまたはレフルノミド、N-[(E)-(3-メチルフェニル)メチリデンアミノ]-6-モルホリン-4-イル-2-(2-ピリジン-2-イルエトキシ)ピリミジン-4-アミンなどの、ざ瘡またはざ瘡関連障害を処置するための組成物の調製のための、スクリーニング方法によって同定された提案されたマーカーのインヒビターの使用を包含する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ざ瘡病変:Tリンパ球免疫組織化学検出(CD3単独)を示す図である。

【図2】ざ瘡病変:Tリンパ球におけるIL-17発現(CD3/IL-17同時局在化)を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

実際、ナイーブCD4+T細胞の分化に元々由来する独特なTh系列であるTh17細胞は、細菌および真菌を含む種々の細胞外病原体に対する免疫を提供する。興味深いことに、P. acnesは、健康なヒト皮膚に存在する共生細菌であるが、尋常性ざ瘡における病原性因子の1つと考えられている。しかし、P. acnesが実際に炎症していないざ瘡病変および炎症したざ瘡病変の発達における原因因子であるか否かは、未だ明らかになっていない(Shaheen B、Gonzalez M. A microbial aetiology of acne-what is the evidence? Br J Dermatol. 2011年4月18日)。

【0020】

Th17細胞はまた、乾癬、関節リウマチおよび多発性硬化症などの種々の炎症障害および自己免疫障害に関与している(Peck A、Mellins ED. Precarious balance: Th17 cells in host defense. Infect Immun. 2010年1月;78巻(1号):32〜8頁)。

【0021】

分子レベルでは、Th17細胞は、エフェクターサイトカインIL-17A、IL-17F、IL-26、IL-22、IL-21およびTNFαの独特なプロファイルの生成を特徴とし、その発達、生存および増殖のためにIL-23に依存している。これらのサイトカインは、ケラチノサイトなどの異なる型の細胞を活性化して、それらの過剰増殖と、炎症性サイトカイン、ケモカインおよび抗菌ペプチドのさらなる産生とを導き、これは次いで、炎症した皮膚において他の免疫細胞をリクルートおよび活性化して、炎症応答の増幅を導く。さらに、IL-17AおよびIL-17Fは、Th17細胞分化を促進および持続するように機能するIL-17産生の自己分泌調節を導く(Weiら、2007年、J Biol. Chem.、9月20日)。Il17はまた、間質細胞におけるTH17細胞の特徴付けられたレセプターのリガンドであるCCL20の上方調節を担い、炎症した組織中へのさらなるTh17細胞の誘引を可能にする。

【0022】

Th17細胞へのナイーブCD4 T細胞の分化のシグナル伝達経路は、IL-21と組み合わせて、IL-1bおよびIL-23と組み合わせて、またはIL-1b、IL-23およびIL-6と組み合わせてのいずれかで、TGFb-1を必要としており、レチノイド関連オーファンレセプター(RORC)およびレチノイン酸関連オーファンレセプターα(RORA)の発現を導くが、これらは、TH17分化を促進し、IL-17AおよびIL-17Fの発現を実質的に上方調節する2つの転写因子である(Chung Yら、Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity 2009年;30巻:576〜87頁、Veldhoen M、Hocking RJ、Atkins CJ、Locksley RM、Stockinger B. and Immunity 2006年2月;24巻(2号):179〜89頁)。

【0023】

以下について、「Th-17分化プロファイル分子」とは、Th17細胞分化を特徴付ける生物学的分子、即ち、ナイーブT細胞からの分化に依存するサイトカインおよび/または因子、言い換えればIL-6、IL-26、IL-23、ならびに/あるいはTH17によって産生されるサイトカインおよび/または因子(IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-26、TNFα、CCL20)、ならびに/あるいはさらにはTH17によって発現されるレセプター(CCR6、IL-23R)をいう。

【0024】

インターロイキン-23(IL-23)は、Th17細胞へのナイーブT細胞の分化を誘導できないが、Th17細胞の増殖および生存を促進する。実際、IL-23は、ヘテロダイマーレセプターIL-23R/IL-12Rβ1に結合することによってシグナル伝達を媒介し、IL-23Rの発現は、IL-6、IL-21に依存する(Zhou, L.ら、2007年. IL-6 programs T(H)-17 cell differentiation by promoting sequential engagement of the IL-21 and IL-23 pathways. Nat. Immunol. 8巻:967〜974頁. Martinez GJら、Regulation and function of proinflammatory TH17 cells. Ann N Y Acad Sci. 2008年11月;1143巻:188〜211頁)。

【0025】

「IL-23R/IL-12Rβ1」は、IL-23RおよびIL-12レセプターによって共有されるIL-12RB1を含むヘテロダイマーレセプターを意味する。

【0026】

Th17細胞の表面表現型分析により、IL-17A産生細胞が、IL-23R/IL-12Rβ1と同時に、ケモカインレセプターCCR6を発現することが示された。興味深いことに、CCR6は、細胞の皮膚へのホーミングを誘導し、乾癬、潰瘍性大腸炎、喘息および関節リウマチを含む、Th17細胞によって媒介されると考えられる多くの炎症疾患において病因的役割を果たす(Hedrick MNら、CCR6 is required for IL-23-induced psoriasis-like inflammation in mice. J Clin Invest. 2009年8月;119巻(8号):2317〜29頁;Nakae, S.ら、2003年. Suppression of immune induction of collagen-induced arthritis in IL-17-deficient mice. J. Immunol. 171巻:6173〜6177頁;Doe Cら、Expression of the T helper 17-associated cytokines IL-17A and IL-17F in asthma and COPD. Chest. 2010年11月;138巻(5号):1140〜7頁;Liu ZJら、Potential role of Th17 cells in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 2009年12月14日;15巻(46号):5784〜8頁)。

【0027】

異なる転写因子が、記載された経路に関与している。STAT3は、IL-17、IL-21、IL-23RおよびRORCの調節経路において、Th17分化にとって重要な因子である。特に、IL-23シグナル伝達経路において、IL-23R/IL-12Rβ1の細胞内部分のリン酸化された残基は、STAT3に対するドッキング部位として機能し、その後のリン酸化が、エフェクターサイトカインの発現を活性化する(Milner, J.D.ら、2008年. Impaired T (H) 17 cell differentiation in subjects with autosomal dominant hyper-IgE syndrome. Nature 452巻:773〜776頁;Yang XOら(2007年) STAT3 regulates cytokine-mediated generation of inflammatory helper T cells. J Biol Chem 282巻:9358〜63頁)。

【0028】

他の転写因子は、上記エフェクターサイトカインまたはRORC、例えばBATF、IRF4およびAHRの同じ発現プロセスに関与している(BATF: bringing (in) another Th17-regulating factor. J Mol Cell Biol. 2009年12月;1巻(2号):66〜8頁)。

【0029】

従って、本発明は、以下の例と共に、ざ瘡についての新規マーカーとしてのTH17分化の重要なアクターを提供する。

【0030】

言い換えれば、一方では、本発明は、IL-12Rβ1/IL-23R、CCR6から選択されるレセプターのうち少なくとも1つをコードするDNAまたはmRNA、およびまた対応するタンパク質の、ざ瘡についてのマーカーとしての使用に関する。

【0031】

他方では、本発明は、BATF、AHR、STAT3、IRF4から選択される転写因子のうち少なくとも1つをコードするDNAまたはmRNAおよびまた対応するタンパク質の、ざ瘡についてのマーカーとしての使用に関する。

【0032】

本発明の目的のために、用語「マーカー」または「生物学的マーカー」は、特定の病理学的状態の存在または非存在と関連する生物学的マーカーを指す。生物学的マーカーは、特に、タンパク質、mRNAまたはDNAである。

【0033】

より明確にするために、以下の定義が使用される:用語「提案されたマーカー」とは、IL-12Rβ1/IL-23R、CCR6ならびにそのそれぞれの発現産物、mRNAまたはタンパク質または遺伝子自体を意味する。この定義はそれぞれ、BATF、AHR、STAT3およびIRF4にも適用可能である。

【0034】

用語「発現レベル」または「発現」とは、遺伝子マーカーによってコードされるmRNAまたはタンパク質のレベルを意味する。

【0035】

発現レベルの分析または検出は、当業者に公知の任意の適切な方法、例えば、ウエスタンブロッティング、IHC、質量分析(Maldi-TOFおよびLC/MS分析)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、Elisaまたは当業者に公知の任意の他の方法によって、さもなければ当業者に慣習的に公知の方法に従ってmRNAをアッセイすることによって、実施され得る。mRNAと特異的ヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに基づく技術は、最も慣習となったものである(ノザンブロッティング、RT-PCR(逆転写ポリメラーゼ連鎖反応)、定量RT-PCR(qRT-PCR)、RNase保護)。

【0036】

本発明はまた、
a)個体から採取されたサンプル中の、提案されたマーカーのうち少なくとも1つならびに/またはIL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22およびCCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを検出する工程、
b)健康な個体から採取されたサンプル中の、提案されたマーカーのうち少なくとも1つならびに/またはIL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22およびCCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを検出する工程、
c)少なくとも1つのマーカーの発現レベルにおける差異を比較する工程であって、該マーカーについて、発現レベルは、健康な個体における発現レベルよりも有意に高い、工程;
d)工程c)のマーカーのうち少なくとも1つの過剰発現がざ瘡の指標であり、これによりざ瘡を診断する、工程、
を含む、ざ瘡の診断のための方法を提供する。

【0037】

本発明はまた、
a)個体から採取されたサンプル中の提案されたマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを検出する工程、
b)正常個体から採取されたサンプル中の提案されたマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを検出する工程、
c)少なくとも1つのマーカーの発現レベルにおける差異を比較する工程であって、該マーカーについて、発現レベルは、健康な個体における発現レベルよりも有意に高い、工程;
d)工程c)のマーカーのうち少なくとも1つの過剰発現がざ瘡の指標であり、これによりざ瘡を診断する、工程、
を含むこともできる、ざ瘡の診断のための方法を提供する。

【0038】

本発明は、
a)個体から生物学的サンプルを採取する工程、
b)採取されたサンプル中の、提案されたマーカーのうち少なくとも1つならびに/またはIL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22、CCL20から選択されるマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを分析する工程であって、マーカーのうち少なくとも1つの発現におけるバリエーションが、ざ瘡の進行の指標である、工程、
を含む、ざ瘡の進行またはバリエーションをモニタリングする方法を提供する。ざ瘡の進行は、主に面皰性から、より炎症支配的な状態までであり得、例えば結節嚢胞性ざ瘡または集簇性ざ瘡などの特定のざ瘡サブタイプに向かう進行もまた意味し得る。進行は、より重症な形態からあまり重症でない形態のざ瘡まで、他の方向で生じてもよい。

【0039】

本発明はまた、
a)ざ瘡の1つまたは複数の症状を有すると同定された個体に、所望の処置を投与する工程、
b)該個体から生物学的サンプルを採取する工程、
c)提案されたマーカーのうち少なくとも1つならびに/またはIl-6、IL-17A、IL-17F、IL-22およびCCL20から選択される他のマーカーのうち少なくとも1つの発現レベルを分析する工程であって、マーカーのうち少なくとも1つの発現におけるバリエーションが、ざ瘡の処置における効力の指標である、工程、
を含む、ざ瘡を処置するために意図された処置の効力をモニタリングする方法を提供する。

【0040】

本発明はまた、提案されたマーカーのうち1つの発現および/または生物学的機能を阻害または下方調節する前記候補の能力を決定する工程を含む、ざ瘡を処置するためのTh-17細胞分化インヒビターのin vitroスクリーニング方法を提供する。

【0041】

より具体的には、本発明は、
a)少なくとも2つの生物学的サンプルを収集する工程であって、1つの生物学的サンプルはざ瘡病変を模倣し、1つの生物学的サンプルは健康な状態を模倣する、工程;
b)少なくとも1つのサンプルまたはサンプルの混合物を、試験される1つまたは複数の薬物候補と接触させる工程;
c) b)で得られた生物学的サンプルまたは混合物中の、提案されたマーカーのうち少なくとも1つならびに/またはIL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22およびCCL20から選択される発現マーカーのうち少なくとも1つの発現または生物学的機能を検出する工程;
d)前記b)で得られたサンプルまたは混合物中で測定された提案されたマーカーのうち少なくとも1つの発現または生物学的機能、ならびに/あるいはIL-6、IL-17A、IL-17F、IL-22およびCCL20から選択される発現マーカーのうち少なくとも1つの発現を阻害することが可能な薬物候補を選択する工程、およびそのレベルを薬物候補(複数可)と混合していないサンプルと比較する工程、
を含む、薬物候補の同定のための、Th17細胞分化インヒビターのin vitroスクリーニング方法に関する。

【0042】

表現「因子またはマーカーのうち1つの過剰発現」は、少なくとも50%、好ましくは少なくとも100%、なおより好ましくは少なくとも200%増加した発現レベルを意味する意図であり、または等価な意味で、正常な個体におけるレベルの少なくとも2倍(a factor of 2)もしくは少なくとも2倍(twice)の高さの増加として異なって表される;これは、上述のケモカイン、サイトカインおよびレセプターの全体的な過剰発現を実証し、従って、ざ瘡に特徴的なマーカーを提示する。

【0043】

本発明の文脈において、生物学的サンプルは、個体から採取された任意の型のサンプルに対応し、組織サンプルまたは流体サンプル、例えば、血液、リンパ液もしくは間質液であり得る。

【0044】

1つの特定の好ましい実施形態によれば、サンプルは、サイズが変動する(好ましくは、直径1〜6mm)の生検、またはWong Rら、「Analysis of RNA recovery and gene expression in the epidermis using non-invasive tape stripping」; J Dermatol Sci.2006年11月;44巻(2号):81〜92頁;またはBenson NRら、「An analysis of select pathogenic messages in lesional and non-lesional psoriatic skin using non-invasive tape harvesting」. J Invest Dermatol. 2006年10月;126巻(10号):2234〜41頁;もしくはさもなくばWong Rら、「Use of RT-PCR and DNA microarrays to characterize RNA recovered by non-invasive tape harvesting of normal and inflamed skin」. J Invest Dermatol. 2004年7月;123巻(1号):159〜67頁に記載された方法に従う、D-Squamesなどのテープストリッピング(tape stripping)によって採取された皮膚サンプルである。テープストリッピングの原理によれば、使用される製品は、可撓性半透明ポリマー支持体および接着剤を含む。製品は、患者の皮膚に、好ましくは接着がなくなるまで、繰り返し貼り付けられる。得られたサンプルは、表皮の最外側層の内容物にのみ関する。特定の皮膚状態に特異的なマーカーをモニタリングするためおよび診断を方向付けるために、特にこのサンプリング方法に従って得られたタンパク質内容物を分析する方法は、特許出願WO2009/068825(Galderma R&D)に記載されている。この方法は、特定のプロテオミクスマーカーの存在、その非存在または特定のプロテオミクスマーカーにおけるバリエーションを検出するために、迅速で非侵襲性かつ比較的安価であるので、特に好ましい。この方法は、特に、質量分析検出、ELISAまたはタンパク質定量の分野の当業者に公知の任意の他の方法を特徴とする。定量は、少なくとも1つのタンパク質を検出するために、可撓性かつ接着性の支持体上の得られた皮膚サンプルにおいて実施され、このタンパク質の存在、非存在、または標準値と比較した、量もしくは濃度におけるバリエーションは、特定の病理学的皮膚状態の存在、進行または非存在と関連する。

【0045】

本発明の別の実施形態は、提案された本発明のマーカーのうち少なくとも1つの発現または生物学的活性またはトランス活性化特性を含めた生物学的機能を阻害および/または下方調節する前記候補の能力を決定する工程を含む、ざ瘡を処置するためのTh17細胞分化候補インヒビターのin vitroスクリーニング方法である。

【0046】

同定された候補は、所与のマーカーの生物学的機能またはこのマーカーによってモジュレートされる生物学的プロセスに影響を与える。例えば、候補によるRORγtおよび/またはRORαの阻害は、Th17細胞分化の誘導ならびにTh17細胞の機能を含めた、RORγtの生物学的機能に影響を与え得る。スクリーニング目的のために、この生物学的サンプルは、上述の遺伝子の発現を(完全にまたは部分的に)制御するプロモーターの制御下で作動するレポーター遺伝子を含む、トランスフェクトされた細胞からなる。あるいは、プロモーターは、少なくとも一部、合成によりアセンブルされ得、ROR応答性エレメントを含み得る。化合物が提案されたマーカーの機能をモジュレートする能力は、レポーター遺伝子の発現を分析することによって評価される。

【0047】

トランスフェクトされた細胞は、提案されたマーカーのうち少なくとも1つを発現するように、さらに操作され得る。

【0048】

このレポーター遺伝子は、その対応する基質と共に、着色産物(複数可)を提供する酵素、例えば、CAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)、GAL(βガラクトシダーゼ)またはGUS(βグルクロニダーゼ)をコードし得る。レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼまたはGFP(緑色蛍光タンパク質)のいずれかであり得る。

【0049】

レポーター遺伝子タンパク質の投薬量またはその活性は、典型的には、比色定量法、蛍光定量法または化学発光法によって評価される。

【0050】

本発明のさらなる実施形態によれば、生物学的サンプルは、目的の遺伝子を発現する細胞であり、上記工程c)は、遺伝子産物の活性を測定することからなる。

【0051】

別の実施形態において、本発明は、ざ瘡および/またはざ瘡関連障害を処置するための組成物の調製のための、記載されたスクリーニング方法により同定されたインヒビター/アンタゴニスト/インバースアゴニストの使用に関する。

【0052】

特に、RORγtまたはRORαのインヒビター/アンタゴニスト/インバースアゴニストは、以下のリストから選択され得る:
-N-(2,2,2-トリフルオロエチル)-N-[4-[2,2,2-トリフルオロ-1-ヒドロキシ-1-(トリフルオロメチル)エチル]フェニル]-ベンゼンスルホンアミド;この化合物は、新規レチノイン酸レセプター関連オーファンレセプター-α/γインバースアゴニストである(Mol Pharmacol. 2010年2月;77巻(2号):228〜36頁))。
-2オキシステロール(酸素化ステロール)、特に24S-ヒドロキシコレステロール24(S)、25-エポキシコレステロールおよび7-酸素化ステロール[a second class of nuclear receptors for oxysterols: Regulation of RORalpha and RORgamma activity by 24S-hydroxycholesterol (cerebrosterol) - Wang Yら、Biochim Biophys Acta. 2010年8月;1801巻(8号):917〜23頁.電子出版2010年3月6日]; Wang Yら、Modulation of retinoic acid receptor-related orphan receptor alpha and gamma activity by 7- oxygenated sterol ligands. J Biol Chem. 2010年2月12日;285巻(7号):5013〜25頁))
-メチル2-シアノ-3,12-ジオキソオレアナ-1,9(11)ジエン-28-オエートまたはバルドキソロンメチル(「RTA402」および「CDDO-メチルエステル」としても公知)。
-(8S,9R,10R,13R,14S,16R,17R)-17-[(E,2R)-2,6-ジヒドロキシ-6-メチル-3-オキソヘプタ-4-エン-2-イル]-2,16-ジヒドロキシ-4,4,9,13,14-ペンタメチル-8,10,12,15,16,17-ヘキサヒドロ-7H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3,11-ジオンまたはSI-124(Blaskovich MA、Sun J、Cantor Aら、Discovery of JS-124 (cucurbitacin I), a selective Janus Kinase/ Signal Transducer and Activator of Transcription 2 signaling pathway inhibitor with potent antitumor activity against human and murine cancer cells in mice Cancer Res 2003年;63巻:1270〜1279頁)
-ピリメタミン:-5-(4-クロロフェニル)-6-エチルピリミジン-2,4-ジアミンまたはピリメタミン(Dariprim)(WO/2008/156644)
-γ-D-グルタミル-L-トリプトファンまたはSCV-07(SciClone Pharmaceuticals)(Nagabhushanam V、Subbarao K、Ramachandran Mら、Inhibition of STAT3 driven gene expression in melanoma cells by SCV-07 J Clin Oncol 2008年;26巻(5月20日、補遺):14619頁)
-8-ヒドロキシ-3-メチル-3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[a]アントラセン-1,7,12-トリオンまたはSTA-21(Song H、Wang R、Wang Sら、A low-molecular-weight compound discovered through virtual database screening inhibits Stat3 function in breast cancer cells PNAS 2005年;102巻:4700〜4705頁
-天然フラボノール:例えば、5,7-ジヒドロキシ-2-(4-ヒドロキシフェニル)-4-オキソ-4H-クロメン-3-オレートまたはケンフェロール(Bruno RD、Njar VC. Targeting cytochrome P450 enzymes: a new approach in anticancer drug development. Bioorg Med Chem. 2007年8月1日;15巻(15号):5047〜60頁.電子出版2007年5月23日)。
-メチル-N-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-1,2-オキサゾール-4-カルボキサミドまたはレフルノミド(O'Donnell EF、Saili KS、Koch DC、Kopparapu PR、Farrer D、Bisson WH、Mathew LK、Sengupta S、Kerkvliet NI、Tanguay RL、Kolluri SK. The anti-inflammatory drug leflunomide is an agonist of the aryl hydrocarbon receptor. PLoS One. 2010年10月1日;5巻(10号)。
-N-[(E)-(3-メチルフェニル)メチリデンアミノ]-6-モルホリン-4-イル-2-(2-ピリジン-2-イルエトキシ)ピリミジン-4-アミンまたはSTA 5326(Apilimod Synta pharmaceuticals) Wadaら: Selective abrogation of Th1 response by STA-5326, a potent IL-12/IL-23 inhibitor. Blood、2007年、109巻(3号)、1156〜1164頁;Wadaら: IL-12/IL-23 inhibitors: a promising approach to the treatment of inflammatory disorders. Drugs Fut . 2008年、33巻(1号)、49〜63頁
-[(3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S)-3-[(2S,4S,5R,6R)-5-[(2S,4S,5R,6R)-5-[(2S,4S,5R,6R)-4,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オキサン-2-イル]オキシ-4-ヒドロキシ-6-メチル-オキサン-2-イル]オキシ-4-ヒドロキシ-6-メチル-オキサン-2-イル]オキシ-12,14-ジヒドロキシ-10,13-ジメチル-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-テトラデカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル]-5H-フラン-2-オンまたはジゴキシンおよびその誘導体。

【0053】

別の態様において、インヒビターは、ポリペプチド、DNAまたはアンチセンスRNA、si-RNAまたはPNA(「ペプチド核酸」、即ち、プリン塩基およびピリミジン塩基によって置換されたポリペプチド鎖を有し、この後者にハイブリダイズするためのDNA様構造を有する)のいずれかであり得る。

【0054】

モジュレーターは、抗体であり得、好ましくはモノクローナル抗体であり得る。有利には、モノクローナル抗体は、血漿(plasmatic)濃度の測定が、約0.01μg/ml〜約100μg/ml、好ましくは約1μg/ml〜約5μg/mlになるのに十分な量で患者に投与される。

【0055】

本発明は、ざ瘡を処置するために意図される。ざ瘡とは、全てのざ瘡形態、特に単純性(simple)ざ瘡、面皰性(comedonic)ざ瘡、丘疹膿疱性(papulopustular)ざ瘡、丘疹面皰性(papulocomedonic)ざ瘡、結節嚢胞性ざ瘡、集簇性ざ瘡、首の項部のケロイド性(cheloid)ざ瘡、再発性粟粒性(recurrent miliary)ざ瘡、壊死性(necrotic)ざ瘡、新生児(neonatal)ざ瘡、職業性(occupational)ざ瘡、酒さ性ざ瘡、老人性(senile)ざ瘡、太陽光線性(solar)ざ瘡および薬剤関連(medication-related)ざ瘡、ならびにまたより広くは、ざ瘡関連障害(例えば過剰脂漏症(hyperseborrhoea))であると理解される。

【0056】

以下の実施例は、その範囲を限定することなく本発明を例示する。

【0057】

Table 1[表1]:Affymetrix技術によって測定されたmRNA発現。Th17分化プロファイル分子IL-17A、IL-17F、IL-26、IL-6、CCL20および提案されたざ瘡についてのマーカーIL-12Rβ1/IL-23R、CCR6、BATF、AHR、STAT3、IRF4、ならびに典型的にTh2サイトカインとみなされるIL-5、IL-4、IL-13の分析。

【0058】

Table 2[表2]:Th17分化プロファイル分子:IL-17A、IL-22、IL-23A、CCL20、IL-6および提案されたマーカーのうち3つ:IL-23R、CCR6、STAT3およびまた典型的にTh2サイトカインとみなされるIL-5、IL-4、IL-13ならびにIL-5、IL-4、IL-13の発現の、qRT-PCR(TaqManns低密度アレイ技術)により測定されたmRNA発現:

【0059】

Table 3[表3]:Th17分化プロファイル分子:IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23A、CCL20、TNFαならびに典型的にTh2サイトカインとみなされるIL-5、IL-4、IL-13のLuminexアッセイによるタンパク質発現:

【0060】

図１：ざ瘡病変:Tリンパ球免疫組織化学検出(CD3単独)を示す図である。

【0061】

図２：ざ瘡病変:Tリンパ球におけるIL-17発現(CD3/IL-17同時局在化)を示す図である。

【実施例】

【0062】

実施例１
ざ瘡に罹患している患者の非病変皮膚と比較した、これらの患者の病変皮膚におけるTH17分子プロファイルのモジュレーション:IL17A、IL17F、IL26およびCCL20ならびに提案されたマーカーIL-12Rβ1/IL-23R、CCR6、BATF、AHR、STAT3およびIRF4の発現の分析。

【0063】

患者の選択および組織生検:
ざ瘡患者の皮膚生検を、有効な臨床実務に従って、12人のざ瘡を有する患者において、炎症性丘疹からおよび非病変皮膚から得た(ざ瘡サブタイプの臨床的記述は、Wilkinら、2002年、J. Am. Acad. Dermatol. 46巻、584〜587頁の分類に従って実施した)。

【0064】

遺伝子の発現レベルにおける変化を評価するために、病変皮膚における発現レベルを、同じ被験体(n=12)の非病変皮膚における発現レベルと比較する。

【0065】

mRNA抽出、標識化およびプローブアレイへのハイブリダイゼーション:
RNeasy抽出キット(Quigen Inc.、Valencia、CA)を使用してmRNAを皮膚から単離し、Agilentの2100 Bioanalyserを使用して質を評価した。T7-オリゴプライマーおよびAffymetrixの1サイクルcDNA合成キットを使用した二本鎖cDNAの生成(即ち、in vitro転写プロセス)の後に、Gene Chip IVT標識化キットによって、mRNA発現を評価した。RNAをエタノール沈澱してサンプルを濃縮し、次いで、分光光度計を使用して定量した。各サンプル由来の、およそ200ngの良好な品質の総RNA[RNA指標数(RNA indication number)(RIN)≧7]を使用し、T7-オリゴ(dt)プライマー(1サイクルcDNA合成キット、Affymetrix)を使用して二本鎖ｃDNAを生成した。in vitro転写(Gene Chip IVT標識化キット、Affymetrix)によって生成されたビオチン化cRNAを、断片化し、AffymetrixヒトU133A 2.0 plusマイクロアレイにハイブリダイズさせた。これらのアレイを、Gene Chip Fluidics Station 450で処理し、Affymetrix Gene Chip Scanner(Santa Clara、CA)でスキャンした。

【0066】

Affymetrix遺伝子チップに基づくmRNA発現の統計分析:
Affymetrix Gene Chipからの発現データを、RMA(Robust Multi-array Analysis)法を用いて標準化する。生の強度値を、バックグラウンド補正し、log2変換し、次いで分位数標準化(quantile normalize)する。次に、線形モデルを、標準化したデータにフィッティングして、各アレイ上の各プローブセットについて発現測定を得る。異なるざ瘡サブタイプのサンプルにおいて有意にモジュレートされた遺伝子を同定するために、JMP 7.0.1(SAS Institute)およびirMF 3.5(National Institute of Statistical Sciences、NISS)ソフトウェアを使用して、Benjamini-Hochberg多重補正と共に一元配置ANOVAを実施した。

【0067】

mRNA発現のqRT-PCR測定:
Th17分化プロファイルの発現もまた、qRT-PCRによって測定した。

【0068】

以下の表において、発現レベルは、ざ瘡患者の非病変皮膚および病変皮膚における個々の遺伝子の平均Ct(サイクル閾値)を使用して報告されている。Ct値は、所与の遺伝子のmRNAの量と反比例する。

【0069】

サイトカインの抽出およびアッセイ:
タンパク質を、12人のざ瘡を有する患者における炎症性丘疹および非病変皮膚から抽出した。Luminexアッセイ(Millipore & Procartaサイトカイン投薬キット)を使用して、サイトカインを、タンパク質抽出物中に投与した。サイトカイン量を、タンパク質の総濃度に対して標準化した。ペアードP値(paired P-value)を、各サイトカインについて計算した。

【0070】

Th17分化プロファイル分子:IL-17A、IL-17F、IL-26、CCL20および提案されたマーカーIL12Rβ1/IL23R、CCR6、BATF、AHR、STAT3およびIRF4のmRNA発現を、Affymetrix技術(Table 1[表1])およびqRT-PCR(Table 2[表2])を使用して測定した。

【0071】

Table 1[表1]およびTable 2[表2]によれば、Affymetrix技術(Table 1[表1])またはqRT-PCR(Table 2[表2])技術によって測定されたTh17細胞分化を特徴付ける特定のサイトカインIL-17A、IL-17F、IL-22、IL-26のmRNAは、ざ瘡を有する患者において有意に上方調節される。さらに、これらの表において、IL-5、IL-4およびIL-13のmRNA発現は検出されることも変化することもなく、このことは、ざ瘡における炎症応答が、Th2細胞によって駆動されないことを示唆している。

【0072】

Table 3[表3]は、非病変皮膚と比較して病変皮膚において、IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22およびTNFαのタンパク質発現レベルの上方調節を実証している。

【0073】

驚くべきことに、IL-12Rβ1/IL-23R、CCR6、BATF、AHR、STAT3およびIRF4を含む転写因子のmRNAレベルは、ざ瘡においてモジュレートされないが、ヒト皮膚におけるその発現が明らかに実証された。従って、これらは、それら単独でまたはそれらの組み合わせでもしくは上述のTh17細胞分化プロファイル分子のうち少なくとも1つとの組み合わせで使用する際に、ざ瘡を診断するためおよび/またはTh-17細胞分化のインヒビターをスクリーニングするためのマーカーとして、興味深いものである。特に、CCR6リガンドCCL20のmRNAおよびタンパク質の発現、ならびにIL-23AのmRNA発現は、ざ瘡を有する患者において上方調節され、従って、化合物を介して、それらのレセプターCCR6およびIL-23Rβ/IL-23Rとのその結合を阻害すること、ならびにざ瘡についてのマーカーとしてのこれらのレセプターの使用の潜在的な興味を確認する。

【0074】

実施例２
免疫組織化学分析:
正常な皮膚において、本発明者らは、リンパ球が浸潤することは殆どないが、病変領域由来の生検では、より多い数でリンパ球が見出されることを観察した。この文脈において、免疫組織化学技術を使用したIL-17検出を、病変領域由来のこれらの浸潤物において実施した。

【0075】

Tリンパ球を検出するために、第1の一次抗体(抗CD3)を使用し、次いでIL-17に特異的な第2の抗体を使用した。

【0076】

これらの抗体をそれぞれ、赤色フルオロフォア(TRITC)または緑色フルオロフォア(FITC)と組み合わせた第2の抗体によって明らかにした。

【0077】

CD3発現についての結果を図1中に示す。黒色の陽性細胞により、浸潤物がほぼTリンパ球から構成されたことが確認された。

【0078】

図2は、CD3陽性Tリンパ球の下位集団がIL-17を同時発現したことを実証している。この陽性IL-17染色は、ざ瘡病変におけるTh17細胞の存在を示唆する。

【0079】

【表1】

【0080】

【表2】

【0081】

【表3】

【図1】

【図2】