特許 6366575 二重アシル化されたＧＬＰ−１誘導体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6366575

(24)【登録日】2018年7月13日

(45)【発行日】2018年8月1日

(54)【発明の名称】二重アシル化されたＧＬＰ−１誘導体

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/605 20060101AFI20180723BHJP

   A61K 38/26 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20180723BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/605ZNA

   A61K38/26

   A61P3/10

   A61P9/00

   A61P1/00

   A61P15/00

【請求項の数】9

【全頁数】94

(21)【出願番号】特願2015-510744(P2015-510744)

(86)(22)【出願日】2013年5月2日

(65)【公表番号】特表2015-517478(P2015-517478A)

(43)【公表日】2015年6月22日

(86)【国際出願番号】EP2013059113

(87)【国際公開番号】WO2013167455

(87)【国際公開日】20131114

【審査請求日】2016年4月11日

(31)【優先権主張番号】12167093.9

(32)【優先日】2012年5月8日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/646,469

(32)【優先日】2012年5月14日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509091848

【氏名又は名称】ノヴォ ノルディスク アー／エス

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100089037

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邊 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(72)【発明者】

【氏名】ヤコプ・コフォーズ

(72)【発明者】

【氏名】パトリック・ゲリベイ

【審査官】 上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０００−５００５０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５３７１４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５０５８４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５１９８０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０８０１０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００３−５３１８７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５１７４７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 KNUDSEN LOTTE B，JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY，AMERICAN CHEMICAL SOCIETY，２０００年 ５月 ４日，V43 N9，P1664-1669

【文献】 Journal of the Chemical society. Perkin Transactions 1，１９９５年，No.7，p.861-873

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／６０５

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

GLP-1ペプチドの誘導体であって、
ペプチドはGLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置において第1のK残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置において第2のK残基、およびGLP-1(7-37)と比較して最大で8個のアミノ酸の変化を含み、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、前記第1および第2のK残基に結合している2つの延長部分を含み、
前記延長部分は、Chem.2:
Chem.2:HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、
前記リンカーは、
Chem.6:-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-、または
Chem.6a:-NH-(CH₂)₄-CH(N(CH₃)₂)-CO-
を含み、
前記Chem.6a、またはChem.6は、そのCO-末端において前記GLP-1ペプチドの前記第1または前記第2のK残基のεアミノ基に結合している、
誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。

【請求項2】

yが、9、10、または11である、請求項1に記載の誘導体。

【請求項3】

前記GLP-1ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、最大で3個のアミノ酸の変化を有する、請求項1または2に記載の誘導体。

【請求項4】

前記GLP-1ペプチドが、式I
Xaa₇-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Xaa₁₂-Thr-Ser-Asp-Xaa₁₆-Ser-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Glu-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Ala-Xaa₂₅-Lys-Xaa₂₇-Phe-Ile-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Leu-Xaa₃₃-Lys-Xaa₃₅-Xaa₃₆-Xaa₃₇-Xaa₃₈
のペプチドであり、式中、
Xaa₇は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル(Imp)、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン(desH)、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、N^α-アセチル-ヒスチジン、N^α-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa₈は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa_12-は、PheまたはLeuであり、
Xaa₁₆は、ValまたはLeuであり、
Xaa₁₈は、Ser、Val、またはLeuであり、
Xaa₁₉は、TyrまたはGlnであり、
Xaa₂₀は、LeuまたはMetであり、
Xaa₂₂は、Gly、Glu、またはAibであり、
Xaa₂₃は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa₂₅は、AlaまたはValであり、
Xaa₂₇は、GluまたはLeuであり、
Xaa₃₀は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa₃₁は、TrpまたはHisであり、
Xaa₃₃は、Valであり、
Xaa₃₅は、GlyまたはAibであり、
Xaa₃₆は、ArgまたはGlyであり、
Xaa₃₇は、GlyまたはArgであり、
Xaa₃₈は、Ser、Gly、Ala、Glu、Pro、Arg、または存在しない、請求項1から3のいずれか一項に記載の誘導体。

【請求項5】

下記から選択される化合物: Chem.21：

【化1】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.22：

【化2】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.23：

【化3】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Imp⁷,Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.24：

【化4】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.25：

【化5】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.26：

【化6】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.27：

【化7】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.28：

【化8】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.29：

【化9】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸,Glu²²]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.30：

【化10】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸,Glu²²,Glu³⁰]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.31：

【化11】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.32：

【化12】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.33：

【化13】

N^ε26-[(2S)-6-[[(2S)-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-6-[[(2S)-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル]-[Imp⁷,Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.34：

【化14】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸,Glu²²,Glu³⁰]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.35：

【化15】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸,Glu²²]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.36：

【化16】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(3-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(3-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
Chem.37：

【化17】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Imp⁷,Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、および
Chem.38：

【化18】

N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-GLP-1-(7-37)-ペプチド、
;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。

【請求項6】

請求項1から4のいずれか一項に記載の誘導体、または請求項5に記載の化合物を含む、医薬品。

【請求項7】

全ての形態の糖尿病および関連する疾患の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、請求項6に記載の医薬品。

【請求項8】

医薬品の製造における、請求項1〜4のいずれか一項に記載の誘導体、または請求項5に記載の化合物の使用。

【請求項9】

全ての形態の糖尿病および関連する疾患の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、医薬品の製造における、請求項8に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)の類似体の誘導体、より特に、K²⁶およびK³⁴において二重アシル化されたGLP-1誘導体、ならびにこれらの薬学的用途に関する。

【0002】

関連出願への参照
本出願は、2012年5月8日に出願されたEP12167093.9の優先権を主張する。本出願はまた、米国特許法の元で、2012年5月14日に出願された米国特許仮出願第61/646469号、および2012年9月6日に出願された米国特許仮出願第61/741770号の利益を主張する。これらの4つの出願のそれぞれは、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている。

【0003】

配列リストの参照による組込み
「配列リスト」という表題の配列リストは、568バイトであり、2013年3月14日に作成され、参照により本明細書中に組み込まれている。

【背景技術】

【0004】

Journal of Medicinal Chemistry(2000)、第43巻、第9番、1664〜669頁は、K^26,34において二重アシル化されたGLP-1(7-37)の誘導体を開示している。

【0005】

WO99/43706A1は、いくつかのモノアシル化および二重アシル化されたGLP-1誘導体を開示している。

【0006】

WO98/08871A1は、二重アシル化されたものを含めたいくつかのGLP-1誘導体を開示している。

【0007】

WO2011/080103A1は、K^26,37において二重アシル化されたいくつかのGLP-1誘導体を開示している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】WO99/43706

【特許文献2】WO98/08871A1

【特許文献3】WO2011/080103A1

【特許文献4】WO06/097537A2

【特許文献5】WO09/030738

【特許文献6】WO2008/145728

【特許文献7】WO2009/083549A1

【特許文献8】WO2006/082204

【特許文献9】EP511600

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Journal of Medicinal Chemistry(2000年)、第43巻、第9号、1664〜669頁

【非特許文献2】Needleman, S.B.およびWunsch, C.D.、(1970年)、Journal of Molecular Biology、48:443〜453頁

【非特許文献3】MyersおよびW. Miller、「Optimal Alignments in Linear Space」、CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988年)4:11〜17頁

【非特許文献4】Chemoinformatics:A textbook、Johann GasteigerおよびThomas Engel(編)、Wiley-VCH Verlag、2003年

【非特許文献5】J. Chem. Inf. Model.、2008年、48、542〜549頁

【非特許文献6】J. Chem. Inf. Comput. Sci.、2004年、44、170〜178頁

【非特許文献7】J. Med. Chem.、2004年、47、2743〜2749頁

【非特許文献8】J. Chem. Inf. Model.、2010年、50、742〜754頁

【非特許文献9】SciTegic Pipeline Pilot Chemistry Collection:Basic Chemistry User Guide、2008年3月

【非特許文献10】SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection、2008年

【非特許文献11】http://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_111408.pdf

【非特許文献12】http://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdf

【非特許文献13】GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999年

【非特許文献14】Florencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000年

【非特許文献15】「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、編W.C. ChanおよびP.D. White、Oxford University Press、2000年

【非特許文献16】Hodgsonら:「The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids」、Chemical Society Reviews、第33巻、第7番(2004年)、422〜430頁

【非特許文献17】Remington:The Science and Practice of Pharmacy、例えば、第19版(1995年)、および任意のより最近の版

【非特許文献18】W.R. Sampson(1999年)、J. Pep. Sci.、5、403

【非特許文献19】Novobiochem2009/2010からのカタログ、もしくはより新しいバージョン

【非特許文献20】PoulsenおよびJensen、Journal of Biomolecular Screening、2007年、第12巻、240〜247頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、GLP-1ペプチドの誘導体に関する。

【0011】

リラグルチドは、2009年以降Novo Nordisk A/Sによって市販されている1日1回投与のためのモノアシル化されたGLP-1誘導体である。この化合物は、WO98/08871A1(実施例37)に開示されている。

【0012】

WO06/097537A2は、他のGLP-1誘導体の中でも、Novo Nordisk A/Sによって開発されている週1回投与のためのモノアシル化されたGLP-1誘導体であるセマグルチド(実施例4)を開示している。

【0013】

本発明の誘導体は、天然リシンにおいて26位および34位においてアシル化されている。側鎖は、脂肪酸から選択される延長部分を含むアルブミン結合部分であり、好ましくは、そのε-アミノ基において、GLP-1ペプチドのリシン残基に、任意選択でリンカーを介してアシル化されている遠位カルボキシ-フェノキシ基を有する。

【0014】

GLP-1ペプチドは、GLP-1(7-37)(配列番号1)であるか、またはGLP-1(7-37)と比較して全部で8個までのアミノ酸の変化を有するその類似体であり得る。変化は、独立に、1つもしくは複数の付加、1つもしくは複数の欠失、および/または1つもしくは複数の置換である。

【0015】

より特に、本発明は、GLP-1ペプチドの誘導体であって、ペプチドは、GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置において第1のK残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置において第2のK残基、およびGLP-1(7-37)と比較して最大で8個のアミノ酸の変化を含み、誘導体は、それぞれがリンカーを介して、それぞれ、前記第1および第2のK残基に結合している2つの延長部分を含み、延長部分は、Chem. 2:HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-^*(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、各リンカーは、Chem.3a:^*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NR₁R₂]-CO-^*を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、R₁およびR₂は、独立に、水素ラジカル(^*-H)またはメチル(^*-CH₃)を表し、wは、0〜5の範囲の整数である誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関する。

【0016】

本発明はまた、医薬として使用するため、特に、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、このような誘導体に関する。

【0017】

本発明はさらに、本発明の特定の誘導体の調製のための関連性のある新規なGLP-1類似体の形態の中間生成物に関する。

【0018】

本発明はさらに、本明細書における実施例13の化合物、ならびに同様の化合物の合成において使用し得る、新規な保護された化合物の形態の中間化合物(Chem.39、実施例19)に関する。

【0019】

本発明の誘導体は、生物活性がある。また、または代わりに、本発明の誘導体は、延長性の薬物動態プロファイルを有する。また、または代わりに、本発明の誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。これらの特性は、皮下、静脈内、および/または特に、経口投与のための次世代のGLP-1化合物の開発において重要である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下において、ギリシャ文字は、それらの記号または対応する記載された名称によって表してもよい(例えば、α=アルファ;β=ベータ;ε=イプシロン; γ=ガンマ;ω=オメガなど)。また、ギリシャ文字のμは、「u」で表してもよい(例えば、μl=ul、またはμM=uM)。

【0021】

化学式におけるアスタリスク(^*)は、i)結合点、ii)ラジカル、および/またはiii)非共有電子を示す。

【0022】

第1の態様において、本発明は、GLP-1ペプチドの誘導体であって、ペプチドは、GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置において第1のK残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置において第2のK残基、およびGLP-1(7-37)と比較して最大で8個のアミノ酸の変化を含み、誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、前記第1および第2のK残基に結合している2つの延長部分を含み、延長部分は、Chem.2、:
Chem.2:HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-^*
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、
リンカーは、
Chem.3:^*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NR₁R₂]-CO-^*
を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、R₁およびR₂は、独立に、^*-Hまたは^*-CH₃を表し、wは、0〜5の範囲の整数である誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関する。

【0023】

GLP-1ペプチドおよび類似体
「GLP-1ペプチド」という用語は、本明細書において使用する場合、ヒトグルカゴン様ペプチド-1(GLP-1(7-37))またはその類似体を意味し、その配列は配列番号1として配列リストに含まれている。配列番号1の配列を有するペプチドはまた、「天然」GLP-1と示し得る。

【0024】

「GLP-1類似体」または「GLP-1の類似体」という用語は、本明細書において使用する場合、GLP-1(7-37)(配列番号1)のバリアントであるペプチド、または化合物を意味する。

【0025】

配列リストにおいて、配列番号1の第1のアミノ酸残基(ヒスチジン)を、第1番と割り当てる。しかし以下において、当技術分野の慣習によると、このヒスチジン残基は、第7番と称され、それに続くアミノ酸残基は、それに応じて付番され、グリシン第37番で終わる。したがって一般に、本明細書においてアミノ酸残基番号またはGLP-1(7-37)配列の位置番号について任意に参照することは、7位におけるHisで開始し、37位におけるGlyで終了する配列について参照することである。

【0026】

本発明の誘導体のGLP-1類似体は、i)変化しているアミノ酸残基に対応する天然GLP-1(7-37)におけるアミノ酸残基の数(すなわち、天然GLP-1における対応する位置)について、およびii)実際の変化について参照することにより記載し得る。
れている天然GLP-1のアミノ酸配列を表す。

【0027】

本発明の誘導体の部分を形成するGLP-1類似体は、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したときに、最大で8個のアミノ酸の変化を含む。すなわち、これは、いくつかのアミノ酸残基が、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したときに変化している、GLP-1(7-37)ペプチドである。これらの変化は、独立に、1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を表し得る。

【0028】

下記は、適正な類似体命名法の非限定的な例である。

【0029】

例えば、類似体[Imp⁷、Aib⁸]-GLP-1-(7-37)は、GLP-1(7-37)ペプチドを示し、これは、天然GLP-1と比較したとき、下記の置換:イミダゾプロピオニル(des-アミノヒスチジン(desH)とまた示し得る)による7位におけるヒスチジンの置換、およびAib(α-アミノイソ酪酸)による8位におけるアラニンの置換を有する。この類似体はまた、GLP-1(7-37)への参照が暗示される場合、(7Imp、8Aib)と短く示し得る。

【0030】

特定の指定した変化を「含む」類似体は、配列番号1と比較したとき、さらなる変化を含み得る。

【0031】

上記の例から明らかなように、アミノ酸残基は、これらの完全な名称、これらの1文字コード、および/またはこれらの3文字コードによって同定し得る。これらの3つの方法は、完全に同等である。

【0032】

「と等しい位置」または「対応する位置」という表現を使用して、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)を参照することにより、バリアントGLP-1(7-37)配列における変化の部位を特徴付けることができる。同等または対応する位置、および変化の数は、例えば、単純な筆記および目視によって容易に推定され、かつ/またはNeedleman-Wunschアラインメントである「align」などの、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用し得る。アルゴリズムは、Needleman, S.B.およびWunsch, C.D.、(1970年)、Journal of Molecular Biology、48:443〜453頁、およびMyersおよびW. Miller、「Optimal Alignments in Linear Space」、CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988年)4:11〜17頁によるアラインプログラムに記載されている。アラインメントのために、デフォルトスコアリングマトリックスBLOSUM50およびデフォルト同一性マトリックスを使用してもよく、ギャップにおける第1の残基についてのペナルティは、-12、または好ましくは-10で設定してもよく、ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティは、-2、または好ましくは-0.5で設定してもよい。

【0033】

このようなアラインメントの一例は、本明細書において下記で挿入されており、ここで、配列第1番(SEQ_ID_NO_1)は、配列番号1であり、配列第2番(ANALOGUE)は、その類似体(8Aib、22E、30E)である。
# アラインメントされた_配列:2
# 1:SEQ_ID_NO_1
# 2:ANALOGUE
# マトリックス:EBLOSUM62
# ギャップ_ペナルティ:10.0
# 伸長_ペナルティ:0.5
# 長さ:31
# 同一性:28/31(90.3%)
# 類似性:28/31(90.3%)
# ギャップ:0/31(0.0%)
# スコア:145.0

【0034】

上記アラインメントから推測することができるように、非天然アミノ酸、例えば、Aibが配列に含まれる場合、これらは、アラインメントの目的のために、Xで置き換えてもよい。必要に応じて、Xは、後で手作業によって補正することができる。

【0035】

「ペプチド」という用語は、例えば、本発明の誘導体のGLP-1類似体の状況において使用されるように、アミド(またはペプチド)結合によって相互結合している一連のアミノ酸を含む化合物を意味する。

【0036】

本発明のペプチドは、ペプチド結合によって結合している少なくとも5個の構成アミノ酸を含む。特定の実施形態において、ペプチドは、少なくとも10個の、好ましくは、少なくとも15個の、より好ましくは、少なくとも20個の、さらにより好ましくは、少なくとも25個の、または最も好ましくは、少なくとも28個のアミノ酸を含む。

【0037】

特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも5個の構成アミノ酸から構成され、好ましくは、少なくとも10個の、少なくとも15個の、少なくとも20個の、少なくとも25個のアミノ酸から構成され、または最も好ましくは、少なくとも28個のアミノ酸から構成される。

【0038】

さらなる特定の実施形態において、ペプチドは、a)i)28個、ii)29個、iii)30個、iv)31個、v)32個、もしくはvi)33個のアミノ酸から構成され、またはb)i)28個、ii)29個、iii)30個、iv)31個、v)32個、もしくはvi)33個のアミノ酸からなる。

【0039】

またさらなる特定の実施形態において、ペプチドは、ペプチド結合によって相互結合しているアミノ酸からなる。

【0040】

アミノ酸は、アミン基およびカルボン酸基、ならびに任意選択で、側鎖と称されることが多い1種または複数のさらなる基を含有する分子である。

【0041】

「アミノ酸」という用語には、タンパク新生アミノ酸(遺伝コードによってコードされる、天然アミノ酸、および標準的アミノ酸を含める)、ならびに非タンパク新生アミノ酸(タンパク質において見出されない、および/または標準的遺伝コードにおいてコードされていない)、ならびに合成アミノ酸が含まれる。したがって、アミノ酸は、タンパク新生アミノ酸、非タンパク新生アミノ酸、および/または合成アミノ酸の群から選択し得る。

【0042】

遺伝コードによってコードされないアミノ酸の非限定的な例は、γ-カルボキシグルタメート、オルニチン、およびホスホセリンである。合成アミノ酸の非限定的な例は、アミノ酸のD-異性体、例えば、D-アラニンおよびD-ロイシン、Aib(α-アミノイソ酪酸)、β-アラニン、およびデス-アミノ-ヒスチジン(desH、代替名、イミダゾプロピオン酸、略名、Imp)である。

【0043】

以下において、光学異性体が述べられていない全ての特定のアミノ酸は、L-異性体を意味すると理解され(他に特定しない限り)、例えば、グルタミンの特定のアミノ酸に言及するとき、これは、その他に述べない限り、L-グルタミンを意味することを意図する。他方、アミノ酸がより一般の式、例えば、brutto式または構造式によって記載される場合、および立体化学が示されないとき、これらの式は、全ての立体異性体を包含することを意図する。

【0044】

本発明のGLP-1誘導体および類似体は、GLP-1活性を有する。この用語は、GLP-1受容体に結合し、シグナル伝達経路を開始させて、当技術分野において公知のようなインスリン分泌性作用または他の生理学的作用をもたらす能力を意味する。例えば、本発明の類似体および誘導体は、本明細書において実施例20および21に記載されている1つもしくは複数のアッセイを使用して、GLP-1活性について試験することができる。本明細書において実施例22に記載されているGLP-1受容体結合アッセイはまた、関連性のある場合、GLP-1活性、または、より正確に、GLP-1受容体親和性(低HSA実験)の尺度として使用し得る。

【0045】

GLP-1誘導体
「誘導体」という用語は、GLP-1ペプチドまたは類似体との関連で本明細書において使用する場合、化学修飾されたGLP-1ペプチドまたは類似体を意味し、ここで、1個または複数の置換基は、ペプチドに共有結合で結合している。置換基はまた、側鎖と称してもよい。

【0046】

特定の実施形態において、側鎖は、アルブミンと共に非共有結合性凝集物を形成することができ、それによって血流による誘導体の循環を促進し、また、GLP-1-誘導体およびアルブミンの凝集物はゆっくりとのみ崩壊して、活性医薬成分を放出するという事実によって、誘導体の作用時間を延長させる作用を有する。したがって、置換基、または側鎖は、全体として、好ましくはアルブミン結合部分と称される。

【0047】

別の特定の実施形態において、アルブミン結合部分は、特に、アルブミン結合、それによって延長に関連した一部分を含み、この一部分は従って、延長部分と称してもよい。延長部分は、ペプチドへのその結合点に対して、アルブミン結合部分の反対の末端に、または反対の末端の付近にあってよい。

【0048】

またさらなる特定の実施形態において、アルブミン結合部分は、延長部分とペプチドへの結合点との間の一部分を含み、この一部分は、リンカー、リンカー部分、スペーサーなどと称してもよい。リンカーは、任意選択でよく、したがってその場合には、アルブミン結合部分は、延長部分と同一であり得る。

【0049】

特定の実施形態では、アルブミン結合部分および/または延長部分は、生理学的pH(7.4)で、親油性であり、かつ/または負に帯電している。

【0050】

アルブミン結合部分、延長部分、またはリンカーは、アシル化によってGLP-1ペプチドのリシン残基に共有結合で結合し得る。

【0051】

好ましい実施形態において、好ましくは、延長部分およびリンカーを含む、アルブミン結合部分の活性エステルは、アミド結合の形成下で、リシン残基のアミノ基、好ましくは、そのεアミノ基に共有結合で結合している(この工程は、アシル化と称される)。

【0052】

特に明記しない限り、リシン残基のアシル化について参照するとき、そのε-アミノ基への参照と理解される。

【0053】

リンカーを介して第1および第2のK残基(すなわち、K²⁶およびK³⁴)に結合している2つの延長部分を含む誘導体は、第1および第2のリシン残基のε-アミノ基において、例えば、GLP-1ペプチドのそれぞれ、26位および34位において、2回アシル化された、二重アシル化された、または二連アシル化された誘導体と称してもよい。

【0054】

本目的のために、「アルブミン結合部分」、「延長部分」、および「リンカー」という用語は、未反応および反応した形態のこれらの分子を含み得る。1つまたは他の形態が意味されるかどうかは、用語が使用される状況から明らかである。

【0055】

一態様において、各延長部分は、Chem. 2:
Chem.2:HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-^*
から独立に選択される延長部分を含み、またはこれらからなる
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)。

【0056】

一実施形態において、^*-(CH₂)_y-^*は、直鎖状アルキレン(yは、6〜13の範囲の整数である)を意味する。

【0057】

「脂肪酸」という用語は、4〜28個の炭素原子を有する脂肪族モノカルボン酸を意味し、「脂肪酸」は好ましくは、枝分かれしておらず、かつ/または偶数鎖であり、飽和または不飽和であり得る。

【0058】

命名法は、当技術分野で通常の通りであり、例えば、上記の式において、^*-COOHおよびHOOC-^*は、カルボキシを意味し、^*-C₆H₄-^*は、フェニレンを意味し、^*-CO-^*および^*-OC-^*は、カルボニル(O=C<^**)を意味し、C₆H₅-O-^*は、フェノキシを意味する。さらに、CO-^*は、C(=O)-^*を意味する。例えば、本明細書において任意の式(R-CO-^*)(式中、Rは、各式によって定義されている通りである)において、R-CO-^*は、R-C(=O)-^*を意味する。特定の実施形態において、芳香族化合物、例えば、フェノキシ、およびフェニレンラジカルは、パラであり得る。

【0059】

上記で説明したように、本発明のGLP-1誘導体は二重アシル化されており、すなわち、2つのアルブミン結合部分は、GLP-1ペプチドに共有結合的に結合している。

【0060】

特定の実施形態において、2つのアルブミン結合部分(すなわち、全側鎖)は、同様であり、好ましくは、実質的に同一であり、または最も好ましくは、同一である。

【0061】

別の特定の実施形態において、2つの延長部分は、同様であり、好ましくは実質的に同一であり、または最も好ましくは、同一である。

【0062】

またさらなる特定の実施形態において、2つのリンカーは、同様であり、好ましくは、実質的に同一であり、または最も好ましくは、同一である。

【0063】

「実質的に同一な」という用語は、1種もしくは複数の塩、エステル、および/またはアミドの形成;好ましくは、1種もしくは複数の塩、メチルエステル、および単純なアミドの形成;より好ましくは、2種以下の塩、メチルエステル、および/または単純なアミドの形成;さらにより好ましくは、1種以下の塩、メチルエステル、および/または単純なアミドの形成;あるいは最も好ましくは、1種以下の塩の形成による、同一であることからの差異を含む。

【0064】

化合物、例えば、アルブミン結合部分、延長部分、およびリンカーとの関連で、類似性および/または同一性は、当技術分野において公知の任意の適切なコンピュータプログラムおよび/またはアルゴリズムを使用して決定し得る。

【0065】

例えば、2つの延長部分、2つのリンカー、および/または2つの全側鎖の類似性は、分子フィンガープリントを使用して適切に決定し得る。フィンガープリントは、化学構造を表す数学的方法である(例えば、Chemoinformatics:A textbook、Johann GasteigerおよびThomas Engel(編)、Wiley-VCH Verlag、2003年を参照されたい)。

【0066】

適切なフィンガープリントの例には、これらに限定されないが、UNITYフィンガープリント、MDLフィンガープリント、および/またはECFPフィンガープリント、例えば、ECFP_6フィンガープリント(ECFPは、拡張結合性フィンガープリントの略語である)が含まれる。

【0067】

特定の実施形態では、2つの延長部分、2つのリンカー、および/または2つの全側鎖は、a)ECFP_6フィンガープリント;b)UNITYフィンガープリント;および/またはc)MDLフィンガープリントとして表される。

【0068】

2つのフィンガープリントの類似性を計算するために、a)、b)またはc)が使用されようとも、谷本係数を好ましくは使用する。

【0069】

特定の実施形態では、a)、b)またはc)を使用しようとも、それぞれ、2つの延長部分、2つのリンカー、および/または2つの全側鎖は、少なくとも0.5(50%);好ましくは、少なくとも0.6(60%);より好ましくは、少なくとも0.7(70%)、または少なくとも0.8(80%);さらにより好ましくは、少なくとも0.9(90%);または最も好ましくは、少なくとも0.99(99%)の類似性、例えば、1.0(100%)の類似性を有する。

【0070】

UNITYフィンガープリントは、プログラムSYBYL(Tripos、1699 South Hanley Road、St. Louis、MO63144-2319、USAから入手可能)を使用して計算し得る。ECFP_6およびMDLフィンガープリントは、プログラムPipeline Pilot(Accelrys Inc.、10188 Telesis Court、Suite 100、San Diego,CA92121、USAから入手可能)を使用して計算し得る。

【0071】

さらなる詳細については、例えば、J. Chem. Inf. Model.、2008年、48、542〜549頁;J. Chem. Inf. Comput. Sci.、2004年、44、170〜178頁;J. Med. Chem.、2004年、47、2743〜2749頁;J. Chem. Inf. Model.、2010年、50、742〜754頁;およびSciTegic Pipeline Pilot Chemistry Collection:Basic Chemistry User Guide、2008年3月、SciTegic Pipeline Pilot Data Modeling Collection、2008年(両方ともAccelrys Software Inc.、San Diego、USから)、ならびにガイドhttp://www.tripos.com/tripos_resources/fileroot/pdfs/Unity_111408.pdf、およびhttp://www.tripos.com/data/SYBYL/SYBYL_072505.pdfを参照されたい。

【0072】

類似性計算の一例を本明細書において下記で挿入し、そこにおいて公知のGLP-1誘導体の公知の全側鎖を、そのメチルエステルと比較した。

【0073】

【化1】

【0074】

a)ECFP_6フィンガープリントを使用して、類似性は0.798であり、b)UNITYフィンガープリントを使用して、類似性は0.957であり、MDLフィンガープリントを使用して、類似性は0.905である。

【0075】

2つの同一の側鎖(アルブミン結合部分)の場合、誘導体は、対称的と示し得る。

【0076】

特定の実施形態において、類似性係数は、少なくとも0.80、好ましくは、少なくとも0.85、より好ましくは、少なくとも0.90、さらにより好ましくは、少なくとも0.95、または最も好ましくは、少なくとも0.99である。

【0077】

本発明の誘導体の2つのリンカーのそれぞれは、下記の第1のリンカー要素(A):Chem.3a:^*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NR₁R₂]-CO-^*を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、R₁およびR₂は、独立に、^*-H(水素ラジカル)、または^*-CH₃(メチル)を表し、wは、0〜5の範囲の整数である。

【0078】

Chem.3aのこの第1のリンカー要素を含むリンカーの1つの非限定的例は、リシン、またはむしろリシンのジラジカルである。リシンは好ましくは、そのωバージョンにおけるリンカーとして使用してもよく、ωは、これが、(^*-NHに対して)ラジカル化された、アルキル置換基鎖の遠位C原子におけるアミノ基であるという事実を意味する。リシンについて、ω位は本明細書において一般に、ε位と称される(α原子は、カルボン酸官能基の隣のC原子であり、それぞれの上流のC原子は、次いで、^*-NH基が結合しているC原子に達するまで、それに続くギリシャ文字であるβ、γ、δなどを使用して示され、これは、リシンの場合、ε原子である。したがって、w=0であり、R₁およびR₂の両方が^*-Hを表し、q=4であるとき、式Chem.3aは、ε-リシンのジラジカル(eps-Lys;Chem.6)を意味する。

【0079】

Chem.3aのこの第1のリンカー要素を含むリンカーの別の非限定的例は、N^α,N^α-ジメチルリシン、またはむしろこの残基のジラジカル(6-アミノ-(S)-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル)である。また、N^α,N^α-ジメチルリシンは好ましくは、そのωバージョンにおけるリンカーとして使用してもよく、ωは、これが、(^*-NHに対して)ラジカル化された、アルキル置換基鎖の遠位C原子におけるアミノ基であるという事実を意味する。また、N^α,N^α-ジメチルリシンについて、ω位は本明細書において一般に、ε位と称される(α原子は、カルボン酸官能基の隣のC原子であり、それぞれの上流のC原子は、次いで、^*-NH基が結合しているC原子に達するまで、それに続くギリシャ文字であるβ、γ、δなどを使用して示され、これは、N,N-ジメチルリシンの場合、ε原子である。したがって、w=0であり、R₁およびR₂の両方が、^*-CH₃を表し、q=4であるとき、式Chem.3aは、N^α,N^α-ジメチルεリシンのジラジカル(手短に言えば、「N,N-ジメチル-eps-Lys」;Chem.6a)を意味する。

【0080】

好ましい実施形態において、この第1のリンカー要素は、そのL-形態である。

【0081】

リンカーは、1回または2回のChem.3aを含み得る。zが2であるとき、Chem.3a要素は、好ましくはアミド結合を介して相互結合している。例えば、リンカーは、2回のε-Lys(2×eps-Lys;2×Chem.6)を含み得る。

【0082】

リンカー(第1および第2のリンカーのそれぞれ)は、例えば、下記に定義するような第2(B)、および/または第3(C)のリンカー要素から独立に選択されるリンカー要素のような1つまたは複数のさらなるリンカー要素をさらに(すなわち、1回または2回の第1のリンカー要素(A)に加えて)含み得る。
第2のリンカー要素(B):
Chem.12:

【0083】

【化2】

【0084】

(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数である)。

【0085】

特定の実施形態において、k=1およびn=1であるとき、このリンカー要素は、OEG、または8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸と示してもよく、かつ/またはこのリンカー要素は、下記の式:
Chem.12a:^*-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-^*
によって表してもよい。

【0086】

第3のリンカー要素(C)、γ-グルタミン酸(gGlu):
Chem.14:

【0087】

【化3】

【0088】

γ-Glu(gGlu)においては、これは別のリンカー要素への、またはリシンのε-アミノ基への結合のためにここで使用される、アミノ酸であるグルタミン酸のγカルボキシ基である。

【0089】

1つの非限定的な特定の実施形態において、各リンカーは、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列にあり、その^*-NH末端において延長部分のCO-^*末端に結合しており、そのCO-^*末端においてGLP-1類似体の第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、Chem.14および2回のChem.6(Chem.14-2×Chem.6)からなる。

【0090】

例えば、第1のリンカーは、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列にあり、その^*-NH末端において第1の延長部分のCO-^*末端に結合しており、そのCO-^*末端においてGLP-1類似体の第1のK残基のεアミノ基に結合している、(Chem.14-2×Chem.6)からなり;第2のリンカーは、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列にあり、その^*-NH末端において第2の延長部分のCO-^*末端に結合しており、そのCO-^*末端においてGLP-1類似体の第2のK残基のεアミノ基に結合している、(Chem.14-2×Chem.6)からなる。

【0091】

言うまでもなく、良好な秩序のためだけに、ここでおよび下記において、「示した配列において」という語句は、最初に言及したリンカー要素(ここで、Chem.14)の^*-NH末端が、延長部のCO-^*末端に結合しており、最後に言及したリンカー要素(ここで、2回のChem.6の最後の1つ)のCO-^*末端が、GLP-1類似体の当該のK残基のεアミノ基に結合していることを意味する。

【0092】

本発明の誘導体は、同じ分子式および結合した原子の配列を有する異なる立体異性体の形態で存在し得るが、空間中のこれらの原子の三次元の配向のみが異なる。本発明の例示的な誘導体の立体異性は、実験セクションにおいて、標準的な命名法を使用して名称および構造で示される。特に明記しない限り、本発明は、特許請求した誘導体の全ての立体異性体の形態に関する。

【0093】

本発明のGLP-1誘導体の血漿中濃度は、任意の適切な方法を使用して決定し得る。例えば、LC-MS(液体クロマトグラフィー質量分析)、または免疫アッセイ、例えば、RIA(放射線免疫アッセイ)、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、およびLOCI(発光酸素チャネリング免疫アッセイ)を使用し得る。適切なRIAおよびELISAアッセイのための一般のプロトコルは、例えば、WO09/030738、116〜118頁に見出される。好ましいアッセイは、例えば本明細書において実施例24に記載されているLOCIアッセイである。

【0094】

中間生成物
本発明はまた、GLP-1(7-37)(配列番号1)の下記の類似体から選択されるGLP-1類似体の形態の中間生成物
(i)8Aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または(iv)8Aib、22E、30E;または(i)、(ii)、(iii)、もしくは(iv)の類似体のいずれかの薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関する。

【0095】

本発明はさらに、本明細書における実施例13の化合物、ならびに同様の化合物、すなわち、Chem.39の構造を有する化合物(S)-2-ジメチルアミノ-6-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸:

【0096】

【化4】

【0097】

またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルの合成において使用し得る新規な保護されたリンカー化合物の形態の中間生成物に関する。

【0098】

薬学的に許容される塩、アミド、またはエステル
本発明の中間生成物、類似体および誘導体は、薬学的に許容される塩、アミド、またはエステルの形態でよい。

【0099】

塩は、例えば、塩基および酸の間の化学反応、例えば:2NH₃+H₂SO₄→(NH₄)₂SO₄によって形成される。

【0100】

塩は、塩基性塩、酸性塩でよく、または塩は、どちらでなくてもよい(すなわち、中性塩)。塩基性塩は、水中で、水酸化イオンを生成し、酸性塩は、ヒドロニウムイオンを生成する。

【0101】

本発明の誘導体の塩は、それぞれ、アニオン基またはカチオン基と反応する、加えたカチオンまたはアニオンによって形成し得る。これらの基は、本発明の誘導体のペプチド部分において、および/または側鎖において位置し得る。

【0102】

本発明の誘導体のアニオン基の非限定的な例には、側鎖における、もしあれば、ペプチド部分における遊離カルボキシル基が含まれる。ペプチド部分は、C末端において遊離カルボン酸基を含むことが多く、ペプチド部分はまた、内部の酸アミノ酸残基、例えば、AspおよびGluにおいて遊離カルボキシル基を含み得る。

【0103】

ペプチド部分におけるカチオン基の非限定的な例には、N末端における遊離アミノ基、および存在する場合、内部の塩基性アミノ酸残基、例えば、His、Arg、およびLysの任意の遊離アミノ基が含まれる。

【0104】

本発明の誘導体のエステルは、例えば、遊離カルボン酸基とアルコールまたはフェノールとの反応によって形成されてもよく、これによって、アルコキシまたはアリールオキシ基による少なくとも1つのヒドロキシル基の置換えがもたらされる。

【0105】

エステル形成は、ペプチドのC末端における遊離カルボキシル基、および/または側鎖中の任意の遊離カルボキシル基が関与し得る。

【0106】

本発明の誘導体のアミドは、例えば、遊離カルボン酸基の活性型とアミンもしくは置換アミンとの反応によって、または遊離もしくは置換アミノ基とカルボン酸の活性型との反応によって形成し得る。

【0107】

アミド形成は、ペプチドおよび/または側鎖における、ペプチドのC末端における遊離カルボキシル基、側鎖中の任意の遊離カルボキシル基、ペプチドのN末端における遊離アミノ基、および/またはペプチドの任意の遊離もしくは置換アミノ基が関与し得る。

【0108】

特定の実施形態において、ペプチドまたは誘導体は、薬学的に許容される塩の形態である。他の特定の実施形態において、誘導体は、薬学的に許容されるアミドの形態であり、好ましくは、ペプチドのC末端におけるアミド基を有する。またさらなる特定の実施形態において、ペプチドまたは誘導体は、薬学的に許容されるエステルの形態である。

【0109】

機能特性
第1の態様において、本発明の誘導体は、良好な効力を有する。また、または代わりに、第2の態様において、本発明の誘導体は、延長性の薬物動態プロファイルを有する。また、または代わりに、第3の態様において、本発明の誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。また、または代わりに、GLP-1ペプチド(GLP-1類似体)における変異の数は、低い。

【0110】

生物活性(効力)
第1の態様によると、本発明の誘導体、および構成物GLP-1ペプチドそれ自体は、生物活性があり、または強力である。実際は、本発明の誘導体は、驚いたことに、良好な効力を有する。

【0111】

より特に、Chem.3aリンカー要素は、このように得られた最終生成物であるGLP-1誘導体の生物活性または効力に関して言えば、驚いたことに予想外に、公知のリンカー要素と比較して優位であることが証明された。

【0112】

例えば、(Chem.14-2×Chem.6)、または(Chem.14-2×Chem.6a)からなるリンカーが、当技術分野で確立しており、非常に高い評価を得ている「gGlu-2×OEG」(Chem.14-2×Chem.13)リンカーの代わりに使用されるとき、本発明で得られたGLP-1誘導体は、驚いたことに予想外に、これらのクラス最高の現況技術のGLP-1誘導体と比較して、非常により強力である。

【0113】

これは、延長性の部分がChem.2タイプのものであるとき、他の現況技術であり確立した延長性の部分、例えば、α-ωジカルボン酸と比較して、驚いたことに予想外に、さらにより明白であるであるように思われる。

【0114】

特定の実施形態において、効力および/または活性とは、インビトロの効力、すなわち、機能的GLP-1受容体アッセイにおける能力を意味し、さらに特にヒトGLP-1受容体を活性化する能力を意味する。

【0115】

インビトロの効力は、例えば、ヒトGLP-1受容体を発現している膜を含有する培地において、および/またはヒトGLP-1受容体を発現している全細胞を伴うアッセイにおいて決定し得る。

【0116】

例えば、ヒトGLP-1受容体を発現している安定的なトランスフェクトされた細胞系からの精製した形質膜を、GLP-1類似体または問題の誘導体で刺激し、cAMPの産生の効力を、例えば、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づいて測定し得、cAMPは、例えば、実施例44に記載されているように特異抗体を使用して捕捉し得る。

【0117】

また、または代わりに、ヒトGLP-1受容体の応答は、レポーター遺伝子アッセイにおいて、例えば、ヒトGLP-1受容体を発現しており、かつプロモーターにカップリングしたcAMP応答配列(CRE)のためのDNA、およびホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)のための遺伝子を含有する、安定的にトランスフェクトされたBHK細胞系において測定し得る。GLP-1受容体の活性化の結果としてcAMPが産生されるとき、これによって、ルシフェラーゼの発現をもたらす。ルシフェラーゼは、ルシフェリンを加えることによって決定し得、ルシフェリンは酵素によってオキシルシフェリンに変換され、生物発光を生じさせ、これを測定し、インビトロの効力の尺度とする。このようなアッセイの1つの非限定的例は、実施例21に記載されている。

【0118】

最大半減有効濃度(EC₅₀)という用語は一般に、用量反応曲線を参照することにより、ベースラインと最大との中間の反応を誘発する濃度を意味する。EC₅₀は、化合物の効力の尺度として使用され、その最大作用の50%が観察される濃度を表す。

【0119】

本発明の誘導体のインビトロの効力は、上記のように決定してもよく、当該の誘導体のEC₅₀が決定される。EC₅₀値が低いほど、効力は良好である。

【0120】

さらなる特定の実施形態において、本発明の誘導体は、10000pM以下、より好ましくは、5000pM未満、さらにより好ましくは、1000pM未満、または最も好ましくは、500pM未満のEC₅₀に対応するインビトロの効力を有する。(例えば、実施例20に記載されているように決定される)。またさらなる特定の実施形態において、本発明の誘導体は、0%HSAで、400pM未満、好ましくは、300pM未満、より好ましくは、200pM未満、さらにより好ましくは、150pM未満、または最も好ましくは、100pM未満のEC₅₀に対応する効力(例えば、実施例21に記載されているように決定される)を有する。

【0121】

また、または代わりに、GLP-1受容体に結合する本発明の誘導体の能力(受容体親和性)を測定して、関連性のある場合、GLP-1活性の尺度として使用し得る。例えば、ヒトGLP-1受容体を発現している安定的なトランスフェクトされた細胞系からの精製した形質膜を、GLP-1類似体または問題の誘導体で刺激し、受容体から¹²⁵I-GLP-1を移動させるこれらの能力を測定し得る。これは、例えば、実施例22に記載されているように決定し得る。一般に、低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への結合は、低いIC₅₀値に対応して、できる限り良好であるべきである。特定の実施形態では、本発明の誘導体のIC₅₀値は、0.001%HSA(低アルブミン)の存在下で、セマグルチドについての対応するIC₅₀値未満、好ましくはその90%未満、より好ましくはその80%未満、さらにより好ましくはその70%未満、または最も好ましくはその50%未満である。

【0122】

別の特定の実施形態において、本発明の誘導体は、インビボで強力であり、これは任意の適切な動物モデルにおいて、および臨床試験において、当技術分野において公知のように決定してもよい。

【0123】

糖尿病性db/dbマウスは、適切な動物モデルの一例であり、血中グルコース低下効果、および/または体重低下効果は、このようなマウスにおいてインビボで決定し得、体重低下効果については、好ましくは、1回の急性投与後である。

【0124】

LYDブタは、適切な動物モデルの別の例であり、食物摂取量の低減は、例えば、実施例25に記載されているように、このようなブタにおいてインビボでPD研究において決定し得る。本発明の誘導体は、インビボで非常に強力であり、これはブタにおけるこのPD研究における食物摂取量の満足のいく低減によって証明される。

【0125】

延長-受容体結合/低アルブミンおよび高アルブミン
第2の態様によると、本発明の誘導体は、延長性である。

【0126】

それぞれ、低濃度および高濃度のアルブミンの存在下で、本発明の誘導体がGLP-1受容体に結合する能力は、実施例22に記載されているように決定し得る。

【0127】

一般に、低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への結合は、低いIC₅₀値に対応して、できる限り良好であるべきである。

【0128】

高アルブミン濃度でのIC₅₀値は、GLP-1受容体への誘導体の結合に対するアルブミンの影響の尺度である。公知のように、GLP-1誘導体はまた、アルブミンに結合する。これは一般に、血漿中のGLP-1誘導体の寿命を延長させる望ましい作用である。したがって、高アルブミンでのIC₅₀値は一般に、GLP-1受容体への結合と競合するアルブミン結合に起因する、GLP-1受容体への結合の減少に対応して、低アルブミンでのIC₅₀値より高い。

【0129】

また、または代わりに、アルブミンへの誘導体の結合は、血清アルブミンの非存在下で、および血清アルブミンの存在下で行い得る実施例21のアッセイを使用して測定し得る。血清アルブミンの存在下でのインビトロの効力であるEC₅₀値の増加は、血清アルブミンへの親和性を示し、動物モデルにおける試験物質の延長性薬物動態プロファイルを予測する方法を表す。

【0130】

延長-インビボでの半減期
第2の態様によると、本発明の誘導体は、延長性である。

【0131】

延長は、実施例24に記載されているように、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの末端半減期(T_1/2)として決定し得る。特定の実施形態において、ラットにおける半減期は、少なくとも10時間、好ましくは、少なくとも12時間、または最も好ましくは、少なくとも15時間である。

【0132】

あるいは、延長は、実施例23に記載されているように、別の動物種において、例えば、i.v.投与後にミニブタにおいてインビボでの末端半減期(T_1/2)として決定し得る。特定の実施形態において、ミニブタにおける末端半減期は、少なくとも8時間、好ましくは、少なくとも24時間、またより好ましくは、少なくとも40時間、さらにより好ましくは、少なくとも60時間、または最も好ましくは、少なくとも80時間である。

【0133】

驚いたことに、本発明者らは、高い効力、および同時に好ましくは、長い半減期を有する、本発明の目的である新規なクラスのGLP-1誘導体を同定した。

【0134】

経口バイオアベイラビリティー
第3の態様によると、本発明の誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。

【0135】

市販のGLP-1誘導体の経口バイオアベイラビリティーは、非常に低い。i.v.またはs.c.投与のために開発中のGLP-1誘導体の経口バイオアベイラビリティーはまた低い。

【0136】

したがって、当技術分野で改善された経口バイオアベイラビリティーのGLP-1誘導体が求められている。このような誘導体は、主にこれらの効力が一般に満足できる限り、および/またはこれらの半減期がまた一般に満足できる限り、経口投与のための適切な候補であり得る。

【0137】

一般に、バイオアベイラビリティーという用語は、未変化で体循環に達する、活性医薬成分(API)、例えば、本発明の誘導体の投与した用量の画分を意味する。定義によると、APIを静脈内に投与するとき、そのバイオアベイラビリティーは、100%である。しかし、APIを他の経路(経口的など)によって投与するとき、そのバイオアベイラビリティーは減少する(分解および/または不完全な吸収および初回通過代謝によって)。バイオアベイラビリティーについての知識は、非静脈内投与経路についての投与量を計算するときに重要である。

【0138】

絶対的経口バイオアベイラビリティーは、経口投与の後の体循環におけるAPIのバイオアベイラビリティー(曲線下面積、またはAUCとして推定する)と、静脈内投与の後の同じAPIのバイオアベイラビリティーとを比較する。絶対的経口バイオアベイラビリティーは、同じAPIの対応する静脈内投与と比較した、非静脈内投与によって吸収されるAPIの画分である。異なる用量が使用される場合、比較は用量標準化しなくてはならない。結果的に、各AUCは、投与された対応する用量で割ることによって補正される。

【0139】

血漿API濃度対時間のプロットを、経口および静脈内投与の両方の後に作製する。絶対的バイオアベイラビリティー(F)は、用量補正AUC-経口をAUC-静脈内で割った商である。

【0140】

特定の実施形態において、本発明の誘導体は、セマグルチドの絶対的経口バイオアベイラビリティーより、好ましくは、少なくとも10%高い、より好ましくは、少なくとも20%高い、さらにより好ましくは、少なくとも30%高い、または最も好ましくは、少なくとも40%高い絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する。さらなる特定の実施形態において、本発明の誘導体は、セマグルチドの絶対的経口バイオアベイラビリティーの少なくとも1.5倍、好ましくは、少なくとも2.0倍、より好ましくは、少なくとも3.0倍、さらにより好ましくは、少なくとも4.0倍、または最も好ましくは、少なくとも5.0倍である絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する。

【0141】

経口バイオアベイラビリティーを試験する前に、本発明の誘導体は、例えば、WO2008/145728に記載されている製剤の任意の1つまたは複数を使用して、インスリン分泌性化合物の経口製剤の当技術分野において公知のように適切に製剤し得る。

【0142】

特定の実施形態において、本発明の誘導体は、非常に良好な胃腸での安定性を有する。胃腸での安定性は、ヒトからの、または関連性のある動物種、例えば、ミニブタ、LYDブタ、イヌ、もしくはラットからの胃腸系からの適切に希釈された抽出物との、生理学的に関連する条件下で、および生理学的に関連する期間の間の、誘導体のインキュベーションによってインビトロで決定し得る。誘導体を有効量の1種または複数種の関連性のある酵素阻害剤と共に合わせるときに、安定性はさらに改善し得る。インビトロでの胃腸での安定性は、当技術分野において公知の標準的方法を使用して測定し得る。本発明の誘導体の胃腸での安定性は好ましくは、セマグルチドと比較して、および/またはWO2011/080103A1の実施例2の誘導体と比較して、改善される。本発明の誘導体は好ましくは、これらの2種の比較化合物のいずれか1つまたは両方と少なくとも同じぐらい安定的であり、好ましくは、安定性は、これらの2種の比較化合物のいずれかの安定性と比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%;より好ましくは、少なくとも75%、少なくとも100%、少なくとも150%、少なくとも175%、または少なくとも200%改善する。

【0143】

生物物理学的特性
第4の態様によると、本発明の誘導体は、良好な生物物理学的特性を有する。これらの特性には、これらに限定されないが、物理的安定性および/または溶解性が含まれる。これらおよび他の生物物理学的特性は、タンパク質化学の当技術分野において公知の標準的方法を使用して測定し得る。特定の実施形態において、これらの特性は、天然GLP-1(配列番号1)と比較して改善されている。誘導体の変化したオリゴマー特性は、改善された生物物理学的特性に少なくとも部分的に関与し得る。

【0144】

本発明の誘導体のさらなる特定の実施形態は、実験のセクションの前の「特定の実施形態」および「さらなる特定の実施形態」と見出しがあるセクションにおいて記載されている。

【0145】

生成工程
ペプチド様GLP-1(7-37)およびGLP-1類似体の生成は、当技術分野で周知である。

【0146】

本発明の誘導体のGLP-1部分、すなわち、GLP-1(7-37)またはその類似体は、例えば、古典的ペプチド合成、例えば、t-BocもしくはFmoc化学または他の確立された技術を使用した固相ペプチド合成によって生成し得る。例えば、GreeneおよびWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999年、Florencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000年、および「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、編W.C. ChanおよびP.D. White、Oxford University Press、2000年を参照されたい。

【0147】

また、または代わりに、これらは、組換え法によって、すなわち、類似体をコードし、かつペプチドの発現を可能とする条件下で適切な栄養培地中でペプチドを発現することができる、DNA配列を含有する宿主細胞を培養することによって産生し得る。これらのペプチドの発現に適した宿主細胞の非限定的な例は、大腸菌(Escherichia coli)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、および哺乳動物のBHKまたはCHO細胞系である。

【0148】

非天然アミノ酸および/または共有結合で結合したN-末端モノまたはジペプチド模倣物を含む本発明のこれらの誘導体は、例えば、実験パートに記載されているように生成し得る。または例えば、Hodgsonら:「The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids」、Chemical Society Reviews、第33巻、第7番(2004年)、422〜430頁;および「Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues」という表題のWO2009/083549A1を参照されたい。

【0149】

いくつかの本発明の誘導体を調製する方法の具体例を、実験パートに含める。

【0150】

医薬組成物
本発明の誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル、および薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物は、当技術分野において公知のように調製し得る。

【0151】

「添加剤」という用語は、活性治療成分以外の任意の構成要素を広範に意味する。添加剤は、活性のない物質、不活性物質、および/または非医学的活性物質でよい。

【0152】

添加剤は、例えば、担体、ビヒクル、賦形剤、錠剤助剤として、ならびに/または活性物質の投与および/もしくは吸収を改善するための、様々な目的を果たし得る。

【0153】

様々な添加剤を有する医薬的活性成分の製剤は、当技術分野において公知である。例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例えば、第19版(1995年)、および任意のより最近の版を参照されたい)。

【0154】

添加剤の非限定的な例は、溶剤、賦形剤、緩衝液、保存剤、等張化剤、キレート剤、および安定剤である。

【0155】

製剤の例には、液体製剤、すなわち、水性製剤、すなわち、水を含む製剤が含まれる。液体製剤は、溶液剤または懸濁剤でよい。水性製剤は典型的には、少なくとも50%w/wの水、または少なくとも60%w/w、70%w/w、80%w/w、またはさらに少なくとも90%w/wの水を含む。

【0156】

代わりに、医薬組成物は、固体製剤、例えば、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥した組成物でよく、これはそのまま使用してもよく、またはこれに、医師もしくは患者が、溶剤および/もしくは賦形剤を使用前に加える。

【0157】

水性製剤におけるpHは、pH3〜pH10のいずれか、例えば、約7.0〜約9.5、または約3.0〜約7.0でよい。

【0158】

医薬組成物は、緩衝液を含み得る。緩衝液は、例えば、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、およびこれらの混合物からなる群から選択し得る。

【0159】

医薬組成物は、保存剤を含み得る。保存剤は、例えば、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、ブチルp-ヒドロキシベンゾエート、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、およびチメロサール、ブロノポル、安息香酸、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、p-ヒドロオキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(3p-クロロフェノキシプロパン-1,2-ジオール)、およびこれらの混合物からなる群から選択し得る。保存剤は、0.1mg/ml〜20mg/mlの濃度で存在し得る。

【0160】

医薬組成物は、等張剤を含み得る。等張剤は、例えば、塩(例えば、塩化ナトリウム)、糖または糖アルコール、アミノ酸(例えば、グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニン)、アルジトール(例えば、グリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)、ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)、およびこれらの混合物からなる群から選択し得る。任意の糖、例えば、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グルカン、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、αおよびβHPCDを含み、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、ならびにカルボキシメチルセルロース-Naを使用し得る。糖アルコールは、少なくとも1つの-OH基を有するC4〜C8炭化水素と定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールが含まれる。

【0161】

医薬組成物は、キレート剤を含み得る。キレート剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸、およびアスパラギン酸の塩、ならびにこれらの混合物から選択し得る。

【0162】

医薬組成物は、安定剤を含み得る。安定剤は、例えば、1種もしくは複数の酸化阻害剤、凝集阻害剤、界面活性剤、および/または1種もしくは複数のプロテアーゼ阻害剤でよい。

【0163】

「凝集物形成」という用語は、可溶性のままであり得るオリゴマー、または溶液から沈殿する大きな目に見える凝集物の形成をもたらす、ポリペプチド分子の間の物理的相互作用を意味する。液体医薬組成物の貯蔵の間のポリペプチドによる凝集物形成は、このポリペプチドの生物活性に悪影響を与えることが可能であり、医薬組成物の治療有効性の喪失をもたらす。さらに、凝集物の形成によって、注入システムを使用してポリペプチド含有医薬組成物が投与されたとき、管類、膜、またはポンプの閉塞などの他の問題をもたらし得る。

【0164】

医薬組成物は、組成物の貯蔵の間のペプチドの凝集物形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含み得る。「アミノ酸塩基」という用語は、1種もしくは複数のアミノ酸(メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニンなど)、またはその類似体を意味する。任意のアミノ酸は、その遊離塩基の形態でまたはその塩の形態で存在し得る。アミノ酸塩基の任意の立体異性体(すなわち、L、D、またはこれらの混合物)が存在し得る。

【0165】

ペプチドが、このような酸化の影響を受けやすい少なくとも1つのメチオニン残基を含むポリペプチドであるとき、メチオニン(または、他の含硫アミノ酸またはアミノ酸類似体)を加えて、メチオニンスルホキシドへのメチオニン残基の酸化を阻害してもよい。メチオニンの任意の立体異性体(LもしくはD)またはこれらの組合せを使用することができる。

【0166】

医薬組成物は、高分子ポリマーまたは低分子化合物の群から選択される安定剤を含み得る。安定剤は、例えば、ポリエチレングリコール(例えば、PEG3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ/ヒドロキシセルロースまたはその誘導体(例えば、HPC、HPC-SL、HPC-LおよびHPMC)、シクロデキストリン、イオウ含有物質、例えば、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノール、ならびに異なる塩(例えば、塩化ナトリウム)から選択し得る。

【0167】

医薬組成物は、これらに限定されないがメチオニンおよびEDTAなどのさらなる安定化剤(ポリペプチドをメチオニン酸化から保護する)、および非イオン性界面活性剤(ポリペプチドを冷凍-解凍または機械的剪断と関連する凝集から保護する)を含み得る。

【0168】

医薬組成物は、1種または複数の界面活性剤、例えば、界面活性剤、少なくとも1種の界面活性剤、または異なる界面活性剤を含み得る。「界面活性剤」という用語は、水溶性(親水性)パート、および脂溶性(親油性)パートから構成される任意の分子またはイオンを意味する。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および/または双性イオン性界面活性剤からなる群から選択し得る。

【0169】

医薬組成物は、1種または複数のプロテアーゼ阻害剤、例えば、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、および/またはベンズアミジンHClを含み得る。

【0170】

医薬組成物のさらなる任意選択の成分には、例えば、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、増量剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン)、ならびに/または双生イオン(例えば、アミノ酸、例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシンおよびヒスチジン)が含まれる。

【0171】

またさらに、医薬組成物は、例えば、WO2008/145728に記載されている製剤の任意の1つまたは複数を使用して、インスリン分泌性化合物の経口製剤の当技術分野において公知のように製剤し得る。

【0172】

投与された用量は、0.01mg〜100mgの誘導体、または0.01〜50mg、または0.01〜20mg、または0.01mg〜10mgの誘導体を含有し得る。

【0173】

誘導体は、医薬組成物の形態で投与し得る。誘導体は、それを必要としている患者に、いくつかの部位で、例えば、局所部位、例えば、皮膚または粘膜部位で;吸収を迂回する部位で、例えば、動脈中、静脈中、または心臓中;および吸収が関与する部位で、例えば、皮膚中、皮膚下、筋肉中、または腹部中に投与し得る。

【0174】

投与経路は、例えば、舌;舌下;口腔;口中;経口;胃内;腸内;経鼻;肺、例えば、細気管支、肺胞、もしくはこれらの組合せを通して;非経口、表皮;皮膚;経皮的;結膜;尿道;膣;直腸;および/または眼でよい。特定の実施形態において、投与経路は、経口による。

【0175】

組成物は、例えば、溶液剤;懸濁剤;乳剤;マイクロエマルジョン;多層乳剤;フォーム剤;膏薬;ペースト剤;貼付剤;軟膏剤;錠剤;コーティング錠剤;チューインガム;リンス;カプセル剤、例えば、硬質または軟質ゼラチンカプセル剤;坐剤;直腸用カプセル剤;ドロップ剤;ゲル剤;スプレー剤;散剤;エアゾール剤;吸入剤;点眼薬;眼病用軟膏剤;眼病用リンス;膣のペッサリー;膣のリング;膣用軟膏剤;注射液;インサイチュで変形する溶液剤、例えば、インサイチュでゲル化、硬化、沈殿し、インサイチュで結晶化するもの;輸液;またはインプラントとしていくつかの剤形で投与し得る。組成物は、例えば、安定性、バイオアベイラビリティー、および/または溶解性を改善するために、薬物担体または薬物送達系中にさらに配合し得る。組成物は、共有結合性、疎水性、および/または静電相互作用によって、このような系に結合し得る。このような配合の目的は、例えば、有害作用を減少させ、時間療法を達成し、かつ/または患者の薬剤服用順守を増加させることでよい。

【0176】

組成物はまた、制御放出、持続性放出、延長性放出、遅延放出、および/または持続放出の薬物送達系の製剤において使用し得る。

【0177】

非経口投与は、シリンジ、任意選択でペン様シリンジを用いて、または注入ポンプを用いて、皮下、筋内、腹腔内、または静脈内注射によって行ってもよい。

【0178】

組成物は、溶液剤、懸濁剤、もしくは散剤の形態で経鼻で投与してもよく、または組成物は、液体もしくは粉末スプレーの形態で肺に投与し得る。

【0179】

経皮的投与(例えば、無針注射によって、パッチ、例えば、イオン泳動的パッチから、または経粘膜的経路を介して、例えば、口腔から)は、またさらなるオプションである。

【0180】

組成物は、安定化した製剤でよい。「安定化した製剤」という用語は、増加した物理的および/または化学的安定性、好ましくは、両方を有する製剤を意味する。一般に、製剤は、(推奨される使用および貯蔵条件に従って)有効期限に到達するまで使用および貯蔵の間安定的でなくてはならない。

【0181】

「物理的安定性」という用語は、熱機械的応力への曝露、ならびに/または不安定な界面および表面(疎水性表面など)との相互作用の結果として、生物学的に不活性および/または不溶性の凝集物を形成するポリペプチドの傾向を意味する。水性ポリペプチド製剤の物理的安定性は、外観検査によって、および/または異なる温度での様々な期間の機械的/物理的応力(例えば、撹拌)への曝露の後の混濁度測定によって評価し得る。代わりに、物理的安定性は、分光学的薬剤、またはポリペプチドの立体配置的状態のプローブ、例えば、チオフラビンTまたは「疎水性パッチ」プローブを使用して評価し得る。

【0182】

「化学的安定性」という用語は、未変化のポリペプチドと比較して、減少した生物学的効力、および/または増加した免疫原性作用を潜在的に有する化学分解生成物の形成をもたらす、ポリペプチド構造における化学的(特に、共有結合性)変化を意味する。化学的安定性は、例えば、SEC-HPLC、および/またはRP-HPLCによって、異なる環境条件への曝露の後の様々な時点での化学分解生成物の量を測定することによって評価することができる。

【0183】

本発明による誘導体による治療はまた、例えば、抗糖尿病剤、抗肥満剤、食欲調節剤、降圧剤、糖尿病からもたらされる、またはそれと関連する合併症の治療および/もしくは予防のための薬剤、ならびに肥満症からもたらされる、またはそれと関連する合併症および障害の治療および/もしくは予防のための薬剤から選択される1種または複数のさらなる薬理学的活性物質と合わせてもよい。これらの薬理学的活性物質の例は、インスリン、スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド、グルコシダーゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト、DPP-IV(ジペプチジルペプチダーゼ-IV)阻害剤、糖新生および/またはグリコーゲン分解の刺激に関与する肝酵素阻害剤、グルコース取込みモジュレーター、脂質代謝を変化させる化合物、例えば、抗高脂血症剤、例えば、HMG CoA阻害剤(スタチン)、胃抑制ポリペプチド(GIP類似体)、食物摂取量を減少させる化合物、RXRアゴニスト、およびβ細胞のATP-依存性カリウムチャネルに対して作用する薬剤;コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、プロブコール、デキストロサイロキシン、ナテグリニド、レパグリニド;β-遮断薬、例えば、アルプレノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、プロプラノロールおよびメトプロロール、ACE(アンジオテンシン変換酵素)阻害剤、例えば、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、アラトリオプリル、キナプリルおよびラミプリル、カルシウムチャネル遮断薬、例えば、ニフェジピン、フェロジピン、ニカルジピン、イスラジピン、ニモジピン、ジルチアゼムおよびベラパミル、ならびにα-遮断薬、例えば、ドキサゾシン、ウラピジル、プラゾシンおよびテラゾシン;CART(コカインアンフェタミン制御転写物)アゴニスト、NPY(ニューロペプチドY)アンタゴニスト、PYYアゴニスト、Y2受容体アゴニスト、Y4受容体アゴニスト、混合Y2/Y4受容体アゴニスト、MC4(メラノコルチン4)アゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、TNF(腫瘍壊死因子)アゴニスト、CRF(コルチコトロピン放出因子)アゴニスト、CRF BP(コルチコトロピン放出因子結合タンパク質)アンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β3ア
ゴニスト、オキシントモジュリンおよび類似体、MSH(メラニン細胞刺激ホルモン)アゴニスト、MCH(メラニン形成細胞濃縮ホルモン)アンタゴニスト、CCK(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再取込み阻害剤、セロトニンおよびノルアドレナリン再取込み阻害剤、混合セロトニンおよびノルアドレナリン作動性化合物、5HT(セロトニン)アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH(甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン)アゴニスト、UCP2または3(脱共役タンパク質2または3)モジュレーター、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト(ブロモクリプチン、ドプレキシン)、リパーゼ/アミラーゼ阻害剤、RXR(レチノイドX受容体)モジュレーター、TRβアゴニスト;ヒスタミンH3アンタゴニスト、胃抑制ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニスト、ガストリンおよびガストリン類似体である。

【0184】

本発明による誘導体による治療はまた、グルコースレベル、および/または脂質恒常性に影響を与える手術、例えば、胃緊縛または胃バイパスと合わせてもよい。

【0185】

医薬品の適応症
本発明はまたは、医薬として使用するための本発明の誘導体に関する。

【0186】

特定の実施形態では、本発明の誘導体は、好ましくは全てがどちらにしても糖尿病に関連する、下記の医学的治療のために使用してもよい。

【0187】

(i)全ての形態の糖尿病、例えば、高血糖症、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、MODY(若年者の成人発症型糖尿病)、妊娠糖尿病の予防および/または治療、ならびに/あるいはHbA1Cの低下;

【0188】

(ii)糖尿病性疾患の進行(2型糖尿病の進行など)の遅延または予防、耐糖能異常(IGT)からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延、および/またはインスリンを必要としない2型糖尿病からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延;

【0189】

(iii)β細胞機能の改善、例えば、β細胞のアポトーシスの減少、β細胞機能および/またはβ細胞塊の増加、ならびに/あるいはβ細胞に対するグルコース感受性の回復;

【0190】

(iv)認知障害の予防および/または治療;

【0191】

(v)例えば、食物摂取量を減少させ、体重を低下させ、食欲を抑制し、満腹を誘発し;過食障害、神経性過食症、および/または抗精神病剤もしくはステロイドの投与によって誘発される肥満症を治療または予防し;胃運動性を低下させ;かつ/あるいは胃内容物排出を遅延させることによる、摂食障害、例えば、肥満症の予防および/または治療;

【0192】

(vi)糖尿病性合併症、例えば、末梢性ニューロパシーを含めたニューロパシー;ネフロパシー;あるいは網膜症の予防および/または治療;

【0193】

(vii)脂質パラメーターの改善、例えば、異脂肪血症の予防および/または治療、総血清脂質の低下;HDLの低下;小さく密なLDLの低下;VLDLの低下:トリグリセリドの低下;コレステロールの低下;HDLの増加;ヒトにおけるリポタンパク質(Lp(a))の血漿レベルの低下;インビトロおよび/またはインビボでのアポリポタンパク質(apo(a))の生成の阻害;

【0194】

(iix)心血管疾患、例えば、症候群X;アテローム性動脈硬化症;心筋梗塞;冠動脈心疾患;脳卒中、脳虚血;早期心臓疾患もしくは早期心血管疾患、例えば、左室肥大;冠動脈疾患;本態性高血圧症;急性高血圧性緊急症;心筋症;心臓不全;運動耐性;慢性心不全;不整脈;心律動異常;失神;アテローム性動脈硬化症;軽度の慢性心不全;狭心症;心臓バイパス再閉塞;間欠性跛行(閉塞性動脈硬化症);拡張機能障害;および/または収縮機能障害の予防および/または治療;

【0195】

(ix)胃腸疾患、例えば、炎症性腸症候群;小腸症候群、もしくはクローン病;消化不良;および/または胃潰瘍の予防および/または治療;

【0196】

(x)重篤疾患の予防および/または治療、例えば、危篤状態の患者、重篤疾患ポリネフロパシー(CIPNP)患者、および/または潜在的CIPNP患者の治療;重篤疾患またはCIPNPの発生の予防;患者における全身性炎症反応症候群(SIRS)の予防、治療および/または治癒;ならびに/あるいは入院の間に菌血症、敗血症、および/または敗血症性ショックを患う患者の可能性の予防または減少のため;ならびに/あるいは

【0197】

(xi)多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の予防および/または治療。

【0198】

特定の実施形態において、適応症は、(i)〜(iii)および(v)〜(iix)、例えば、適応症(i)、(ii)、および/もしくは(iii);または適応症(v)、適応症(vi)、適応症(vii)、および/もしくは適応症(iix)からなる群から選択される。

【0199】

他の特定の実施形態において、適応症は、(i)である。さらなる特定の実施形態において、適応症は、(v)である。またさらなる特定の実施形態において、適応症は、(iix)である。

【0200】

下記の適応症が、特に好ましい:2型糖尿病、および/または肥満症。

【0201】

特定の実施形態
下記は、本発明の特定の実施形態である:

【0202】

1.GLP-1ペプチドの誘導体であって、
ペプチドは、GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置において第1のK残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置において第2のK残基、およびGLP-1(7-37)と比較して最大で8個のアミノ酸の変化を含み、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、前記第1および第2のK残基に結合している2つの延長部分を含み、
延長部分は、Chem.2:
Chem.2:HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-^*
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、
リンカーは、
Chem.3a:^*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NR₁R₂]-CO-^*
を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、R₁およびR₂は、独立に、^*-Hまたは^*-CH₃を表し、wは、0〜5の範囲の整数である
誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
2.wが、0である、実施形態1の誘導体。
3.リンカーが、
Chem.4a:^*-NH-(CH₂)_q-CH(NR₁R₂)-CO-^*
を含む、実施形態1または2のいずれかの誘導体。
4. qが、3〜5の範囲の整数である、実施形態1〜3のいずれかの誘導体。
5. qが、4である、実施形態1〜4のいずれかの誘導体。
6.R₁およびR₂が、同一である、実施形態1〜5のいずれかの誘導体。
7.R₁およびR₂の両方が、^*-Hを表す、実施形態1〜6のいずれかの誘導体。
8.リンカーが、
Chem.3:^*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NH₂]-CO-^*を含む、実施形態1〜7のいずれかの誘導体。
9.リンカーが、
Chem.4:^*-NH-(CH₂)_q-CH(NH₂)-CO-^*を含む、実施形態1〜8のいずれかの誘導体。
10.Chem.3aが、リシンのジラジカルである、実施形態1〜9のいずれかの誘導体。
11.Chem.4aが、リシンのジラジカルである、実施形態1〜10のいずれかの誘導体。
12.Chem.3が、リシンのジラジカルである、実施形態1〜11のいずれかの誘導体。
13.Chem.4が、リシンのジラジカルである、実施形態1〜12のいずれかの誘導体。
14.リンカーが、
Chem.6:^*-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-^*
を含む、実施形態1〜13のいずれかの誘導体。
15.R₁およびR₂の両方が、^*-CH₃を表す、実施形態1〜14のいずれかの誘導体。
16.Chem.3aが、N^α,N^α-ジメチルリシン残基のジラジカル(6-アミノ-(S)-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル)である、実施形態1〜15のいずれかの誘導体。
17.Chem.4aが、リシンのジラジカルである、実施形態1〜16のいずれかの誘導体。
18.リンカーが、
Chem.6a:^*-NH-(CH₂)₄-CH(N(CH₃)₂)-CO-^*を含む、実施形態1〜17のいずれかの誘導体。
19.リンカーが、z回のChem.3aを含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1〜18のいずれかの誘導体。
20.リンカーが、z回のChem.4aを含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1〜19のいずれかの誘導体。
21.リンカーが、z回のChem.3を含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1〜20のいずれかの誘導体。
22.リンカーが、z回のChem.4を含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1〜21のいずれかの誘導体。
23.リンカーが、z回のChem.6aを含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1〜22のいずれかの誘導体。
24.リンカーが、z回のChem.6を含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1〜23のいずれかの誘導体。
25.zが、1である、実施形態1〜24のいずれかの誘導体。
26.zが、2である、実施形態1〜25のいずれかの誘導体。
27.zが2であるとき、2つのChem.3a、Chem.4a、Chem.3、Chem.4、Chem.6a、またはChem.6要素は、それぞれ、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜26のいずれかの誘導体。
28.リンカーが、
2×Chem.6:^*-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-^*
を含む、実施形態1〜27のいずれかの誘導体。
29.リンカーが、
2×Chem.6a:^*-NH-(CH₂)₄-CH(N(CH₃)₂)-CO-NH-(CH₂)₄-CH(N(CH₃)₂)-CO-^*を含む、実施形態1〜28のいずれかの誘導体。
30.それぞれ、Chem.3a、Chem.4a、Chem.3、Chem.4、Chem.6a、Chem.6、2×Chem.6、または2×Chem.6a要素が、そのCO-^*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、実施形態1〜29のいずれかの誘導体。
31. それぞれ、Chem.3a、Chem.4a、Chem.6、Chem.6a、Chem.3、Chem.4、2×Chem.6、または2×Chem.6aが、第1のリンカー要素である、実施形態1〜30のいずれかの誘導体。
32.リンカーが、第2のリンカー要素、Chem.12:
Chem.12:

【0203】

【化5】

【0204】

(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数である)を含む、実施形態1〜31のいずれかの誘導体。
33.kが、1である、実施形態32の誘導体。
34.nが、1である、実施形態32〜33のいずれかの誘導体。
35.第2のリンカー要素が、
Chem.13:

【0205】

【化6】

【0206】

である、実施形態32〜34のいずれかの誘導体。
36.Chem.13がm回含まれ、mが、0、もしくは1〜2の範囲の整数である、実施形態32〜35のいずれかの誘導体。
37.mが、0である、実施形態32〜36のいずれかの誘導体。
38.mが、1である、実施形態32〜36のいずれかの誘導体。
39.mが、2である、実施形態32〜36のいずれかの誘導体。
40.mが1と異なるとき、Chem.13要素が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態32〜39のいずれかの誘導体。
41.リンカーが、Chem.14の第3のリンカー要素を含む、実施形態1〜40のいずれかの誘導体。
Chem.14:

【0207】

【化7】

【0208】

42.Chem.14が、p回含まれ、pが、0、または1〜3の範囲の整数である、実施形態41の誘導体。
43.pが、0である、実施形態42の誘導体。
44.pが、1である、実施形態42の誘導体。
45.Chem.14が、L-Gluのジラジカルである、実施形態42〜44のいずれかの誘導体。
46.pが、0と異なり、かつ1と異なるとき、Chem.14要素が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態42〜45のいずれかの誘導体。
47.リンカーおよび延長部分が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜46のいずれかの誘導体。
48.リンカーおよびGLP-1ペプチドが、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜47のいずれかの誘導体。
49.リンカーが、第1または第2のK残基のε-アミノ基に結合している、実施形態1〜48のいずれかの誘導体。
50.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列にあり、その^*-NH末端において延長部分のCO-^*末端に結合しており、そのCO-^*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、Chem.14および2回のChem.6(Chem.14-2×Chem.6)からなる、実施形態1〜49のいずれかの誘導体。
51.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、Chem.14、2回のChem.13、および2回のChem.6(Chem.14-2×Chem.13-2XChem.6)からなり、その^*-NH末端において延長部分のCO-^*末端に結合しており、そのCO-^*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、実施形態1〜49のいずれかの誘導体。
52.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、Chem.14、2回のChem.13、およびChem.6(Chem.14-2XChem.13-Chem.6)からなり、その^*-NH末端において延長部分のCO-^*末端に結合しており、そのCO-^*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、実施形態1〜49のいずれかの誘導体。
53.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、Chem.14、および2回のChem.6a(Chem.14-2×Chem.6a)からなり、その^*-NH末端において延長部分のCO-^*末端に結合しており、そのCO-^*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、実施形態1〜49のいずれかの誘導体。
54.yが、奇数である、実施形態1〜53のいずれかの誘導体。
55.yが、偶数である、実施形態1〜53のいずれかの誘導体。
56.yが、9である、実施形態54の誘導体。
57.yが、11である、実施形態54の誘導体。
58.yが、10である、実施形態55の誘導体。
59.Chem.2が、Chem2aによって表される、実施形態1〜58および71〜76のいずれかの誘導体。
(i)Chem.2a:

【0209】

【化8】

【0210】

または(ii)Chem.2b:

【0211】

【化9】

【0212】

60.2つの延長部分が、実質的に同一である、実施形態1〜59のいずれかの誘導体。
61.2つの延長部分が、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、実施形態1〜60のいずれかの誘導体。
62.2つのリンカーが、実質的に同一である、実施形態1〜61のいずれかの誘導体。
63.2つのリンカーが、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、実施形態1〜62のいずれかの誘導体。
64.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖が、実質的に同一である、実施形態1〜83のいずれかの誘導体。
65.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖が、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6の類似性;より好ましくは、少なくとも0.7の類似性、または少なくとも0.8の類似性;さらにより好ましくは、少なくとも0.9の類似性;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、実施形態1〜64のいずれかの誘導体。
66.比較する2つの化学構造が、フィンガープリント、例えば、a)ECFP_6フィンガープリント;b)UNITYフィンガープリント;および/またはc)MDLフィンガープリントとして表され、a)、b)およびc)のそれぞれについて、谷本係数が、2つのフィンガープリントの類似性を計算するために好ましくは使用される、実施形態60〜65のいずれかの誘導体。
67.第1のK残基が、K²⁶と示される、実施形態1〜66のいずれかの誘導体。
68.第2のK残基が、K³⁴と示される、実施形態1〜67のいずれかの誘導体。
69.GLP-1(7-37)(配列番号1)の18位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜68のいずれかの誘導体。
70.GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜69のいずれかの誘導体。
71.アミノ酸の変化の数が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜70のいずれかの誘導体。
72.GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムの使用によって同定される、実施形態1〜71のいずれかの誘導体。
73.GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムの使用によって同定される、実施形態1〜72のいずれかの誘導体。
74.アミノ酸の変化の数が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、実施形態1〜73のいずれかの誘導体。
75.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態72〜74のいずれかの誘導体。
76.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態72〜75のいずれかの誘導体。
77.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態72〜76のいずれかの誘導体。
78.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態72〜77のいずれかの誘導体。
79.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態72〜78のいずれかの誘導体。
80.ペプチドが、第1および第2のK残基以外のK残基を含まない、実施形態1〜79のいずれかの誘導体。
81.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)である、実施形態1〜80のいずれかの誘導体。
82.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体である、実施形態1〜80のいずれかの誘導体。
83.アミノ酸の変化が、GLP-1(7-37)(配列番号1)における下記の位置:7位、8位、22位、および/または30位に対応する1つまたは複数の位置にある、実施形態82の誘導体。
84.類似体が、下記の変化:Imp⁷、Aib⁸、E²²、および/またはE³⁰の少なくとも1つを含む、実施形態82〜83のいずれかの誘導体。
85.類似体が、lmp⁷を含む、実施形態82〜84のいずれかの誘導体。
86.類似体が、Aib⁸、およびH³⁴を含む、実施形態82〜85のいずれかの誘導体。
87.類似体が、E²²を含む、実施形態82〜86のいずれかの誘導体。
88.類似体が、E²²を含まない、実施形態82〜87のいずれかの誘導体。
89.類似体が、E³⁰を含む、実施形態82〜88のいずれかの誘導体。
90.ペプチドにおける変化の決定のために、ペプチドのアミノ酸配列を、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列と比較する、実施形態1〜89のいずれかの誘導体。
91.天然GLP-1(7-37)(配列番号1)における特定の位置に対応するペプチドにおける位置を決定するために、ペプチドのアミノ酸配列を、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列と比較する、実施形態1〜90のいずれかの誘導体。
92.ペプチドのアミノ酸配列と、GLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列との比較が、筆記および目視によって行われる、実施形態1〜91のいずれかの誘導体。
93.ペプチドのアミノ酸配列と、GLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列との比較が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって行われる、実施形態1〜92のいずれかの誘導体。
94.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態93の誘導体。
95.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態93〜94のいずれかの誘導体。
96.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態93〜95のいずれかの誘導体。
97.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態93〜96のいずれかの誘導体。
98.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態93〜97のいずれかの誘導体。
99.GLP-1(7-37)(配列番号1)の示した位置のいずれかに対応する位置を、筆記および目視によって同定する、実施形態93〜98のいずれかの誘導体。
100.GLP-1(7-37)(配列番号1)の示した位置のいずれかに対応する位置を、実施形態55〜62のいずれかにおいて26位および34位について記載されているように同定する、実施形態93〜98のいずれかの誘導体。
101.ペプチドが、最大で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜100のいずれかの誘導体。
102.ペプチドが、最大で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜101のいずれかの誘導体。
103.ペプチドが、最大で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜102のいずれかの誘導体。
104. ペプチドが、0(ゼロ)個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜103のいずれかの誘導体。
105.ペプチドが、最小で1個のアミノ酸の修飾を有する、実施形態1〜104のいずれかの誘導体。
106.ペプチドが、最小で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜105のいずれかの誘導体。
107.ペプチドが、最小で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
108.ペプチドが、1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜107のいずれかの誘導体。
109.ペプチドが、2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜108のいずれかの誘導体。
110.ペプチドが、3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜109のいずれかの誘導体。
111.変化が、たとえあるとしても、置換である、実施形態1〜110のいずれかの誘導体。
112.類似体が、a)式IのGLP-1類似体を含み、かつ/またはb)式IのGLP-1類似体
式I:Xaa₇-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Xaa₁₂-Thr-Ser-Asp-Xaa₁₆-Ser-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Glu-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Ala-Xaa₂₅-Lys-Xaa₂₇-Phe-Ile-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Leu-Xaa₃₃-Lys-Xaa₃₅-Xaa₃₆-Xaa₃₇-Xaa₃₈
であり、式中、
Xaa⁷は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル(Imp)、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン(desH)、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、N^α-アセチル-ヒスチジン、N^α-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa₈は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa_12-は、PheまたはLeuであり、
Xaa₁₆は、ValまたはLeuであり、
Xaa₁₈は、Ser、Val、またはLeuであり、
Xaa₁₉は、TyrまたはGlnであり、
Xaa₂₀は、LeuまたはMetであり、
Xaa₂₂は、Gly、Glu、またはAibであり、
Xaa₂₃は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa₂₅は、AlaまたはValであり、
Xaa₂₇は、GluまたはLeuであり、
Xaa₃₀は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa₃₁は、TrpまたはHisであり、
Xaa₃₃は、Valであり、
Xaa₃₅は、GlyまたはAibであり、
Xaa₃₆は、ArgまたはGlyであり、
Xaa₃₇は、GlyまたはArgであり、および
Xaa₃₈は、Ser、Gly、Ala、Glu、Pro、Arg、または存在しない、実施形態1〜111のいずれかの誘導体。
113.式Iのペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体である、実施形態112の誘導体。
114. 式Iのペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)である、実施形態112の誘導体。
115.Xaa₇が、HisまたはImp(desH)であり、Xaa₈が、AlaまたはAibであり、Xaa_12-が、Pheであり、Xaa₁₆が、Valであり、Xaa₁₈が、Serであり、Xaa₁₉が、Tyrであり、Xaa₂₀が、Leuであり、Xaa₂₂が、GlyまたはGlu、であり、Xaa₂₃が、Glnであり、Xaa₂₅が、Alaであり、Xaa₂₇が、Gluであり、Xaa₃₀が、AlaまたはGlu、であり、Xaa₃₁が、Trpであり、Xaa₃₃が、Valであり、Xaa₃₄が、Glnであり、Xaa₃₅が、Glyであり、Xaa₃₆が、Argであり、Xaa₃₇が、Glyであり、およびXaa₃₈が、存在しない、実施形態112〜114のいずれかの誘導体。
116.Xaa₇が、Hisである、実施形態112〜115のいずれかの誘導体。
117.Xaa₇が、Impである、実施形態112〜115のいずれかの誘導体。
118.Xaa₈が、Alaである、実施形態112〜117のいずれかの誘導体。
119.Xaa₈が、Aibである、実施形態112〜117のいずれかの誘導体。
120.Xaa₁₂が、Pheである、実施形態112〜119のいずれかの誘導体。
121.Xaa₁₆が、Valである、実施形態112〜120のいずれかの誘導体。
122.Xaa₁₈が、Serである、実施形態112〜121のいずれかの誘導体。
123.Xaa₁₉が、Tyrである、実施形態112〜122のいずれかの誘導体。
124.Xaa₂₀が、Leuである、実施形態112〜123のいずれかの誘導体。
125.Xaa₂₂が、Glyである、実施形態112〜124のいずれかの誘導体。
126.Xaa₂₂が、Gluである、実施形態112〜124のいずれかの誘導体。
127.Xaa₂₂が、Gluでない、実施形態112〜124のいずれかの誘導体。
128.Xaa₂₃が、Glnである、実施形態112〜127のいずれかの誘導体。
129.Xaa₂₅が、Alaである、実施形態112〜128のいずれかの誘導体。
130.Xaa₂₇が、Gluである、実施形態112〜129のいずれかの誘導体。
131.Xaa₃₀が、Alaである、実施形態112〜130のいずれかの誘導体。
132.Xaa₃₀が、Gluである、実施形態112〜130のいずれかの誘導体。
133.Xaa₃₁が、Trpである、実施形態112〜132のいずれかの誘導体。
134.Xaa₃₃が、Valである、実施形態112〜133のいずれかの誘導体。
135.Xaa₃₅が、Glyである、実施形態112〜134のいずれかの誘導体。
136.Xaa₃₆が、Argである、実施形態112〜135のいずれかの誘導体。
137.Xaa₃₇が、Glyである、実施形態112〜136のいずれかの誘導体。
138.Xaa₃₆が、存在しない、実施形態112〜137のいずれかの誘導体。
139.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化:
(i)8Aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または(iv)8Aib、22E、30E
を含む、実施形態1〜138のいずれかの誘導体。
140.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化:
(i)8Aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または(iv)8Aib、22E、30E
を有する、実施形態1〜139のいずれかの誘導体。
141.下記:
Chem.21、Chem.22、Chem.23、Chem.24、Chem.25、Chem.26、Chem.27、Chem.28、Chem.29、Chem.30、Chem.31、Chem.32、Chem.33、Chem.34、Chem.35、Chem.36、Chem.37、もしくはChem.38、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルから選択される、好ましくは、実施形態1〜140のいずれかによる化合物。
142.その名称によって特徴付けられ、本明細書において実施例1〜18の化合物の名称のそれぞれのリストから選択される化合物、好ましくは、実施形態141の化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
143.GLP-1活性を有する、実施形態1〜142のいずれかの誘導体。
144.GLP-1活性が、ヒトGLP-1受容体を活性化する能力を意味する、実施形態143の誘導体。
145.ヒトGLP-1受容体の活性化が、cAMP生成の効力としてインビトロのアッセイにおいて測定される、実施形態144の誘導体。
146.a)10000pM未満、好ましくは、8000pM未満、より好ましくは、5000pM未満、さらにより好ましくは、4000pM未満、または最も好ましくは、3000pM未満;
b)2000pM未満、好ましくは、1200pM未満、より好ましくは、1000pM未満、さらにより好ましくは、800pM未満、または最も好ましくは、600pM未満;
c)400pM未満、好ましくは、300pM未満、より好ましくは、200pM未満、さらにより好ましくは、150pM未満、または最も好ましくは、100pM未満;あるいは
d)80pM未満、好ましくは、60pM未満、より好ましくは、50pM未満、さらにより好ましくは、40pM未満、または最も好ましくは、30pM未満
のEC₅₀に対応する効力を有する、実施形態1〜145のいずれかの誘導体。
147.効力を、好ましくは、安定的なトランスフェクトされた細胞系、例えば、BHK467-12A(tk-ts13)を使用して、かつ/または、cAMPの決定のために、例えば、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づく、機能的受容体アッセイを使用して、ヒトGLP-1受容体を含有する培地、例えば、下記の組成の培地(最終のアッセイにおける濃度)50mMのTRIS-HCl;5mMのHEPES;10mMのMgCl₂、6H₂O;150mMのNaCl;0.01%Tween;0.1%BSA;0.5mMのIBMX;1mMのATP;1uMのGTPにおいて、cAMPの形成の刺激についてのEC₅₀として決定し、このアッセイにおいて、cAMPはより好ましくは、特異抗体を使用して捕捉され、かつ/またはさらにより好ましいアッセイは、AlphaScreen cAMPアッセイであり、最も好ましくは、実施例20において記載されているものである、実施形態146の誘導体。
148.ヒトGLP-1受容体の活性化が、インビトロのアッセイにおいて、レポーター遺伝子アッセイにおいて測定される、実施形態144〜145のいずれかの誘導体。
149.アッセイを、ヒトGLP-1受容体を発現しており、かつプロモーターにカップリングしたcAMP応答配列(CRE)のためのDNA、およびホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)のための遺伝子を含有する、安定的にトランスフェクトされたBHK細胞系において行う、実施形態148の誘導体。
150.アッセイインキュベーションが完了したとき、ルシフェリンを加え、発光を測定する、実施形態149の誘導体。
151.アッセイが、血清アルブミンの非存在下(0%HSA、最終アッセイ濃度)で行われる、実施形態148〜150のいずれかの誘導体。
152.アッセイが、1%血清アルブミンの存在下(HSA、最終アッセイ濃度)で行われる、実施形態148〜151のいずれかの誘導体。
153.細胞が、親細胞系としてBHK-ts13を伴うBHK細胞である、実施形態148〜152のいずれかの誘導体。
154.細胞が、クローンFCW467-12Aに由来する、実施形態148〜153のいずれかの誘導体。
155.細胞を、細胞培養培地において5%CO₂で培養し、一定分量とし、液体窒素中に貯蔵する、実施形態148〜154のいずれかの誘導体。
156.細胞培養培地が、10%FBS(ウシ胎仔血清)、1mg/mlのG418、240nMのMTX(メソトレキセート)および1%pen/strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)である、実施形態155の誘導体。
157.各アッセイの前に、細胞培養物の一定分量を吸い上げ、PBS中で2回洗浄し、その後、アッセイ緩衝液中で所望の濃度で懸濁する、実施形態148〜156のいずれかの誘導体。
158.96ウェルプレートのために、懸濁液を作製して、5×10³個の細胞/ウェルの最終濃度を得る、実施形態148〜157のいずれかの誘導体。
159.アッセイ緩衝液が、アッセイ培地中の2%オボアルブミン、0.2%Pluronic F-68および2%HSAからなる1%アッセイ緩衝液である、実施形態157〜158のいずれかの誘導体。
160.アッセイ緩衝液が、アッセイ培地中の2%オボアルブミンおよび0.2%Pluronic F-68からなる0%アッセイ緩衝液である、実施形態157〜158のいずれかの誘導体。
161.アッセイ培地が、DMEM w/oフェノールレッド、10mMのHepesおよび1×Glutamaxからなる、実施形態159〜160のいずれかの誘導体。
162.アッセイ手順が、下記のステップ
i)細胞ストックを、37℃の水浴中で解凍するステップ;
ii)細胞をPBS中で3回洗浄するステップ;
iii)細胞を計数し、アッセイ培地中で5×10³個の細胞/50μl(1×10⁵個の細胞/ml)に調節し、50μl分量の細胞を、アッセイプレート中の各ウェルに移すステップ;
iv)試験化合物および参照化合物のストックを、もしあれば、0%HSAアッセイのために0%アッセイ緩衝液、または1%HSAアッセイのために1%アッセイ緩衝液中で、0.2μMの濃度に希釈し、化合物を10倍に希釈し、適切な範囲の濃度(例えば:2×10^-7M、2×10^-8M、2×10^-9M、2×10^-10M、2×10^-11M、2×10^-12Mおよび2×10^-13M)を得て、各化合物のために、ブランクアッセイ緩衝液対照をまた含めるステップ;
v)50μl分量の化合物またはブランクを、三連で希釈プレートからアッセイプレートに移し、化合物を適切な濃度(例えば、下記の最終濃度:1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M、1×10^-12Mおよび1×10^-13M)で試験するステップ;
vi)アッセイプレートを5%CO₂インキュベーター中で37℃にて3時間インキュベートするステップ;
vii)アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で15分間静置するステップ;
ixx)100μl分量のルシフェリン(例えば、steadylite plus試薬)を、アッセイプレートの各ウェルに加えるステップ;
ix)各アッセイプレートを覆って光から保護し、室温で30分間振盪するステップ;
x)各アッセイプレートを、例えば、Packard TopCount NXT機器で読み取るステップ
を含む、実施形態148〜161のいずれかの誘導体。
163.TopCount機器からのデータを、所望の計算のために、GraphPad Prism5ソフトウェアに移す、実施形態162の誘導体。
164.三連のそれぞれについての値を平均化し、非線形回帰を行い、EC₅₀値を計算する、実施形態148〜163のいずれかの誘導体。
165.回帰が、(log(アゴニスト)対応答-バリアブルスロープ(4パラメーター))である、実施形態162〜164のいずれかの誘導体。
166.効力が、実施形態148〜165のいずれかにおいて記載されているように決定される、実施形態144〜145のいずれかの誘導体。
167.効力が、実施例21に記載されているように決定される、実施形態166の誘導体。
168.0%HSAで、
a)400pM未満、好ましくは、300pM未満、より好ましくは、200pM未満、さらにより好ましくは、150pM未満、または最も好ましくは、100pM未満;
b)80pM未満、好ましくは、60pM未満、より好ましくは、50pM未満、さらにより好ましくは、40pM未満、または最も好ましくは、30pM未満;あるいは
c)25pM未満、好ましくは、20pM未満、より好ましくは、15pM未満、さらにより好ましくは、10pM未満、または最も好ましくは、8.0pM未満のEC₅₀に対応する効力を有する、実施形態143〜167のいずれかの誘導体。
169.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の20倍以下である、実施形態148〜168のいずれかの誘導体。
170.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の15倍以下である、実施形態148〜169のいずれかの誘導体。
171.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の10倍以下である、実施形態148〜170のいずれかの誘導体。
172.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の5倍以下である、実施形態148〜171のいずれかの誘導体。
173.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の2.5倍以下である、実施形態148〜172のいずれかの誘導体。
174.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値より低い、実施形態148〜173のいずれかの誘導体。
175.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の0.75倍未満である、実施形態148〜174のいずれかの誘導体。
176.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の0.50倍未満である、実施形態148〜175のいずれかの誘導体。
177.おおよそ0.001%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC₅₀)が、
a)1000nM未満、好ましくは、500nM未満、より好ましくは、100nM未満、または最も好ましくは、50nM未満;
b)12nM未満、好ましくは、10nM未満、より好ましくは、250nM未満、またより好ましくは、6.0nM未満、さらにより好ましくは、5.0nM未満、または最も好ましくは、3.0nM未満;
c)2.0nM未満、好ましくは、1.0nM未満、さらにより好ましくは、0.80nM未満、または最も好ましくは、0.60nM未満; または
d)0.40nM未満、好ましくは、0.30nM未満、さらにより好ましくは、0.20nM未満、または最も好ましくは、0.10nM未満
である、実施形態1〜176のいずれかの誘導体。
178.ヒトGLP-1受容体の活性化が、GLP-1受容体結合親和性(IC₅₀)としておおよそ0.001%HSA(低アルブミン)の存在下で測定される、実施形態144の誘導体。
179.2.0%HSA(高アルブミン)の存在下での、GLP-1受容体結合親和性(IC₅₀)が、
a)1000nM未満、好ましくは、900nM未満、より好ましくは、800nM未満;
b)700nM未満、好ましくは、500nM未満、より好ましくは、300nM未満;あるいは
c)200nM未満、好ましくは、100nM未満、またはより好ましくは、50nM未満である、実施形態1〜178のいずれかの誘導体。
180.GLP-1受容体への結合親和性を、好ましくは、SPA結合アッセイを使用して、受容体からの¹²⁵I-GLP-1の移動によって測定する、実施形態177〜179のいずれかの誘導体。
181.GLP-1受容体を、安定的なトランスフェクトされた細胞系、好ましくは、ハムスター細胞系、より好ましくは、ベビーハムスター腎細胞系、例えば、BHK tk-ts13を使用して調製する、実施形態177〜180
のいずれかの誘導体。
182.IC₅₀値が、受容体からの¹²⁵I-GLP-1の50%を移動させる濃度として決定される、実施形態177〜181のいずれかの誘導体。
183.GLP-1受容体結合親和性(IC₅₀)が、実施例22に記載されているように決定される、実施形態177〜182のいずれかの誘導体。
184.セマグルチドの経口バイオアベイラビリティーより高い、経口バイオアベイラビリティー、好ましくは、絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する、実施形態1〜183のいずれかの誘導体。
185.リラグルチドの経口バイオアベイラビリティーより高い、経口バイオアベイラビリティー、好ましくは、絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する、実施形態1〜184のいずれかの誘導体。
186.誘導体が、db/dbマウスにおいて血中グルコースをインビボで低下させるのに有効である、実施形態1〜185のいずれかの誘導体。
187.誘導体が、db/dbマウスにおいて体重をインビボで低下させるのに有効である、実施形態1〜186のいずれかの誘導体。
188.ブタにおけるPD研究において、ビヒクル治療対照群と比較して、誘導体の単回用量のs.c.投与後の1日目、2日目、3日目、および/または4日目において食物摂取量を低減させる、実施形態1〜187のいずれかの誘導体。
189.用量が、0.3nmol/kg、1nmol/kg、3nmol/kg、10nmol/kgまたは30nmol/kg;好ましくは、3.0nmol/kgである、実施形態188の誘導体。
190.1日目の食物摂取量が、80%以下、好ましくは、60%以下、より好ましくは、50%以下、または最も好ましくは、40%以下であり、百分率が、対照群の食物摂取量に対するものである、実施形態188〜189のいずれかの誘導体。
191.2日目の食物摂取量が、80%以下、好ましくは、60%以下、またはより好ましくは、40%以下であり、百分率が、対照群の食物摂取量に対するものである、実施形態188〜190のいずれかの誘導体。
192.実施例25に記載されているように、研究を行い、データを収集および分析する、実施形態188〜191のいずれかの誘導体。
193.リラグルチドより延長性の作用プロファイルを有する、実施形態1〜192のいずれかの誘導体。
194.延長とは、関連する動物種、例えば、db/dbマウス、ラット、ブタ、および/または、好ましくは、ミニブタにおけるインビボでの半減期を意味し;誘導体を、i)s.c.、および/または、ii)i.v.;好ましくは、ii)i.v.で投与する、実施形態193の誘導体。
195.ラットにおけるi.v.投与後の末端半減期(T_1/2)が、セマグルチドの末端半減期(T_1/2)より高い、実施形態1〜194のいずれかの誘導体。
196.ラットにおけるi.v.投与後の末端半減期(T_1/2)が、セマグルチドの末端半減期より少なくともa)25%高く、b)50%高く、c)75%高く、d)100%高く(=2倍)、またはe)150%高い、実施形態1〜195のいずれかの誘導体。
197.ラットにおけるi.v.投与後の末端半減期(T_1/2)が、セマグルチドの末端半減期(T_1/2)の少なくとも2倍であり、好ましくは、少なくとも2 1/2倍である、実施形態1〜196のいずれかの誘導体。
198.例えば、実施例24に記載されているように、半減期をラットにおいてインビボの薬物動態研究において決定する、実施形態193〜197のいずれかの誘導体。
199.ミニブタにおけるi.v.投与後の末端半減期(T_1/2)が、
a)少なくとも8時間、好ましくは、少なくとも16時間、より好ましくは、少なくとも24時間、さらにより好ましくは、少なくとも32時間、または最も好ましくは、少なくとも40時間;
b)少なくとも50時間、好ましくは、少なくとも55時間、より好ましくは、少なくとも60時間、またはさらにより好ましくは、少なくとも65時間;または
c)少なくとも70時間、好ましくは、少なくとも75時間、より好ましくは、少なくとも80時間、一層好ましくは、少なくとも85時間、またはさらに一層好ましくは、90時間
である、実施形態1〜198のいずれかの誘導体。
200.ミニブタが、雄性Gottingenミニブタである、実施形態199の誘導体。
201.ミニブタが、7〜14カ月齢であり、好ましくは、16〜35kgの体重である、実施形態199〜200のいずれかの誘導体。
202.ミニブタを、個々に収容し、好ましくは、SDSミニブタ食餌を1日1回または2回摂食させる、実施形態199〜201のいずれかの誘導体。
203.少なくとも2週間の順化の後に、誘導体をi.v.で投与する、実施形態199〜202のいずれかの誘導体。
204.動物を投与の前に概ね18時間、および投与の後に0〜4時間絶食させ、全期間の間に水に自由にアクセスさせる、実施形態199〜203のいずれかの誘導体。
205.GLP-1誘導体が、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に、適切な濃度、好ましくは、20〜60nmol/mlで溶解している、実施形態199〜204のいずれかの誘導体。
206.誘導体の静脈内注射が、1〜2nmol/kgに対応する容量で与えられる、実施形態199〜205のいずれかの誘導体。
207.末端半減期(T_1/2)が、例えば、実施例23に記載されているように、ミニブタにおけるインビボの薬物動態研究において決定される、実施形態199〜206のいずれかの誘導体。
208.GLP-1(7-37)(配列番号1)の下記の類似体: (i)8Aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または (iv)8Aib、22E、30Eから選択されるGLP-1類似体の形態の中間生成物;または(i)、(ii)、(iii)、または(iv)の類似体のいずれか薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
209.GLP-1(7-37)(配列番号1)との比較が、筆記および目視によって行われる、実施形態208の類似体。
210.GLP-1(7-37)(配列番号1)との比較が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって行われる、実施形態208〜209のいずれかの類似体。
211.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態210の類似体。
212.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態208〜211のいずれかの類似体。
213.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態208〜212のいずれかの類似体。
214.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態208〜213のいずれかの類似体。
215.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態208〜214のいずれかの類似体。
216.(S)-2-ジメチルアミノ-6-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸;およびChem.39:

【0213】

【化10】

【0214】

から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
217.医薬品として使用するための、実施形態1〜207のいずれかによる誘導体、または実施形態208〜215のいずれかによる類似体。
218.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態1〜207のいずれかの誘導体、または実施形態208〜215のいずれかの類似体。
219.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防のため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための医薬の製造における、実施形態1〜207のいずれかの誘導体、または実施形態208〜215のいずれかの類似体の使用。
220.医薬的活性量の実施形態1〜207のいずれかに記載の誘導体、または実施形態208〜215のいずれかの類似体を投与することにより、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療もしくは予防するための、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。

【0215】

本発明はまた、GLP-1類似体の誘導体であって、類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置において第1のK残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に対応する位置において第2のK残基、およびGLP-1(7-37)と比較して最大で8個のアミノ酸の変化を含み、誘導体は、それぞれ、第1および第2のリンカーを介して、それぞれ、前記第1および第2のK残基に結合している第1および第2の延長部分を含み、第1および第2の延長部分は、Chem.2:
Chem.2:HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-^*
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、第1および第2のリンカーは、Chem.3a:^*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NR₁R₂]-CO-^*
を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、R₁およびR₂は、独立に、^*-H(水素ラジカル)または^*-CH₃(メチル)を表し、wは、0〜5の範囲の整数である誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル、ならびに従属した実施形態として本明細書中に付け加えられている上記の実施形態2〜220のいずれかに関する。

【0216】

さらなる特定の実施形態
下記は、本発明のさらなる特定の実施形態である。
1.GLP-1ペプチドの誘導体であって、
ペプチドは、GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置において第1のK残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置において第2のK残基、およびGLP-1(7-37)と比較して最大で8個のアミノ酸の変化を含み、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、前記第1および第2のK残基に結合している2つの延長部分を含み、
延長部分は、Chem.2:
Chem.2:HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-^*
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、
リンカーは、
Chem.3:^*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NH₂]-CO-^*
を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、wは、0〜5の範囲の整数である
誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
2.Chem.3が、そのCO-^*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、実施形態1の誘導体。
3.リンカーが、z回のChem.3を含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態1または2の誘導体。
4.zが、1である、実施形態3の誘導体。
5.zが、2である、実施形態3の誘導体。
6.zが2であるとき、2つのChem.3要素は、アミド結合を介して相互結合している、実施形態3および5のいずれかの誘導体。
7.wが、0である、実施形態1〜6のいずれかの誘導体。
8.qが、4である、実施形態1〜7のいずれかの誘導体。
9.リンカーが、
Chem.4:^*-NH-(CH₂)_q-CH(NH₂)-CO-^*(式中、qは、3〜5の範囲の整数である)を含む、実施形態1〜8のいずれかの誘導体。
10.qが、4である、実施形態1〜9のいずれかの誘導体。
11.Chem.3、またはChem.4が、それぞれ、リシンのジラジカルである、実施形態1〜10のいずれかの誘導体。
12. リンカーが、
Chem.6:^*-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-^*を含む、実施形態1〜11のいずれかの誘導体。
13.リンカーが、
2xChem.6:^*-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-^*を含む、実施形態1〜12のいずれかの誘導体。
14.Chem.3、Chem.4、Chem.6、または2×Chem.6が、それぞれ、第1のリンカー要素である、実施形態1〜13のいずれかの誘導体。
15.リンカーが、第2のリンカー要素、Chem.12:

【0217】

【化11】

【0218】

(式中、kは、1〜5の範囲の整数であり、nは、1〜5の範囲の整数である)を含む、実施形態1〜14のいずれかの誘導体。
16.kが、1である、実施形態15の誘導体。
17.nが、1である、実施形態15〜16のいずれかの誘導体。
18.第2のリンカー要素が、
Chem.13:

【0219】

【化12】

【0220】

である、実施形態15〜17のいずれかの誘導体。
19.Chem.13が、m回含まれ、mが、0または1〜2の範囲の整数である、実施形態15〜18のいずれかの誘導体。
20.mが、0、1、または2である、実施形態10の誘導体。
21.mが、0である、実施形態19〜20のいずれかの誘導体。
22.mが、1である、実施形態19〜20のいずれかの誘導体。
23.mが、2である、実施形態19〜20のいずれかの誘導体。
24.mが1と異なるときに、Chem.13要素が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態19〜23のいずれかの誘導体。
25.リンカーが、Chem.14の第3のリンカー要素を含む、実施形態1〜24のいずれかの誘導体。
Chem.14:

【0221】

【化13】

【0222】

26.Chem.14が、p回含まれ、pが、0または1〜3の範囲の整数である、実施形態25の誘導体。
27.pが、0である、実施形態25の誘導体。
28.pが、1である、実施形態25の誘導体。
29.Chem.14が、L-Gluのジラジカルである、実施形態25〜28のいずれかの誘導体。
30.pが0と異なり、かつ1と異なるとき、Chem.14要素が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態25〜29のいずれかの誘導体。
31.リンカーおよび延長部分が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜30のいずれかの誘導体。
32.リンカーおよびGLP-1類似体が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜31のいずれかの誘導体。
33.リンカーが、第1または第2のK残基のε-アミノ基に結合している、実施形態1〜32のいずれかの誘導体。
34.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列にあり、その^*-NH末端において延長部分のCO-^*末端に結合しており、そのCO-^*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、Chem.14および2回のChem.6(Chem.14-2×Chem.6)からなる、実施形態1〜33のいずれかの誘導体。
35.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列にあり、その^*-NH末端において延長部分のCO-^*末端に結合しており、そのCO-^*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、Chem.14、2回のChem.13および2回のChem.6(Chem.14-2×Chem.13-2×Chem.6)からなる、実施形態1〜33のいずれかの誘導体。
36.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列にあり、その^*-NH末端において延長部分のCO-^*末端に結合しており、そのCO-^*末端においてペプチド類似体の第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、Chem.14および2回のChem.13およびChem.6(Chem.14-2×Chem.13-Chem.6)からなる、実施形態1〜33のいずれかの誘導体。
37.yが、奇数である、実施形態1〜36のいずれかの誘導体。
38.yが、偶数である、実施形態1〜36のいずれかの誘導体。
39.yが、9である、実施形態37の誘導体。
40.yが、11である、実施形態37の誘導体。
41.yが、10である、実施形態38の誘導体。
42.Chem.2が、

【0223】

【化14】

【0224】

によって表される、実施形態1〜41のいずれかの誘導体。
43.2つの延長部分が、実質的に同一である、実施形態1〜42のいずれかの誘導体。
44.2つの延長部分が、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、実施形態1〜43のいずれかの誘導体。
45.2つのリンカーが、実質的に同一である、実施形態1〜44のいずれかの誘導体。
46.2つのリンカーが、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、実施形態1〜45のいずれかの誘導体。
47.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖が、実質的に同一である、実施形態1〜46のいずれかの誘導体。
48.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖が、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、実施形態1〜47のいずれかの誘導体。
49.比較する2つの化学構造が、フィンガープリント、例えば、a)ECFP_6フィンガープリント;b)UNITYフィンガープリント;および/またはc)MDLフィンガープリントとして表され、a)、b)およびc)のそれぞれについて、谷本係数が好ましくは、2つのフィンガープリントの類似性を計算するために使用される、実施形態43〜48のいずれかの誘導体。
50.第1のK残基が、K²⁶と示される、実施形態1〜49のいずれかの誘導体。
51.第2のK残基が、K³⁴と示される、実施形態1〜50のいずれかの誘導体。
52.GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜51のいずれかの誘導体。
53.GLP-1(7-37)(配列番号1)の37位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜52のいずれかの誘導体。
54.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したアミノ酸の変化の数が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜53のいずれかの誘導体。
55.GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムの使用によって同定される、実施形態1〜54のいずれかの誘導体。
56.GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムの使用によって同定される、実施形態1〜55のいずれかの誘導体。
57.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したアミノ酸の変化の数が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムの使用によって同定される、実施形態1〜65のいずれかの誘導体。
58.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態56〜57のいずれかの誘導体。
59.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態57〜58のいずれかの誘導体。
60.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態57〜59のいずれかの誘導体。
61.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態57〜60のいずれかの誘導体。
62.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態57〜61のいずれかの誘導体。
63.類似体が、第1および第2のK残基以外のK残基を含まない、実施形態1〜62のいずれかの誘導体。
64.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)である、実施形態1〜63のいずれかの誘導体。
65.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体である、実施形態1〜63のいずれかの誘導体。
66.アミノ酸の変化が、GLP-1(7-37)(配列番号1)における下記の位置:7位、8位、22位、および/または30位に対応する1つまたは複数の位置にある、実施形態65の誘導体。
67.類似体が、下記の変化: Imp⁷、Aib⁸、E²²、および/またはE³⁰の少なくとも1つを含む、実施形態65〜66のいずれかの誘導体。
68.類似体が、Lmp⁷を含む、実施形態65〜67のいずれかの誘導体。
69.類似体が、Aib⁸を含む、実施形態65〜68のいずれかの誘導体。
70.類似体が、E²²を含む、実施形態65〜69のいずれかの誘導体。
71.類似体が、E²²を含まない、実施形態1〜69のいずれかの誘導体。
72.類似体が、E³⁰を含む、実施形態65〜71のいずれかの誘導体。
73.ペプチドにおける変化の決定のために、ペプチドのアミノ酸配列を、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列と比較する、実施形態1〜72のいずれかの誘導体。
74.天然GLP-1(7-37)(配列番号1)における特定の位置に対応するペプチドにおける位置の決定のために、ペプチドのアミノ酸配列を、天然GLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列と比較する、実施形態1〜73のいずれかの誘導体。
75.ペプチドのアミノ酸配列とGLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列との比較を、筆記および目視によって行う、実施形態1〜74のいずれかの誘導体。
76.ペプチドのアミノ酸配列とGLP-1(7-37)(配列番号1)のアミノ酸配列との比較を、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって行う、実施形態1〜75のいずれかの誘導体。
77.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態76の誘導体。
78.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態76〜77のいずれかの誘導体。
79.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態76〜78のいずれかの誘導体。
80.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態76〜79のいずれかの誘導体。
81.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態76〜80のいずれかの誘導体。
82.GLP-1(7-37)(配列番号1)の示された位置のいずれかに対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態76〜81のいずれかの誘導体。
83.GLP-1(7-37)(配列番号1)の示された位置のいずれかに対応する位置が、実施形態55〜62のいずれかにおいて26位および34位について記載されているように同定される、実施形態76〜82のいずれかの誘導体。
84.ペプチドが、最大で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜83のいずれかの誘導体。
85.ペプチドが、最大で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜84のいずれかの誘導体。
86.ペプチドが、最大で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜85のいずれかの誘導体。
87.ペプチドが、0(ゼロ)個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜86のいずれかの誘導体。
88.ペプチドが、最小で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜87のいずれかの誘導体。
89.ペプチドが、最小で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜88のいずれかの誘導体。
90.ペプチドが、最小で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜89のいずれかの誘導体。
91.ペプチドが、1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜90のいずれかの誘導体。
92.ペプチドが、2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜90のいずれかの誘導体。
93.ペプチドが、3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜90のいずれかの誘導体。
94.変化が、たとえあるとしても、置換である、実施形態1〜93のいずれかの誘導体。
95.a)式IのGLP-1類似体を含み、かつ/またはb)式IのGLP-1類似体であり、
式I:Xaa₇-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Xaa₁₂-Thr-Ser-Asp-Xaa₁₆-Ser-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Glu-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Ala-Xaa₂₅-Lys-Xaa₂₇-Phe-Ile-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Leu-Xaa₃₃-Lys-Xaa₃₅-Xaa₃₆-Xaa₃₇-Xaa₃₈、
式中、
Xaa₇は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル(Imp)、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン(desH)、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、N^α-アセチル-ヒスチジン、N^α-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa₈は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa₁₂は、PheまたはLeuであり、
Xaa₁₆は、ValまたはLeuであり、
Xaa₁₈は、Ser、Val、またはLeuであり、
Xaa₁₉は、TyrまたはGlnであり、
Xaa₂₀は、LeuまたはMetであり、
Xaa₂₂は、Gly、Glu、またはAibであり、
Xaa₂₃は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa₂₅は、AlaまたはValであり、
Xaa₂₇は、GluまたはLeuであり、
Xaa₃₀は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa₃₁は、TrpまたはHisであり
Xaa₃₃は、Valであり、
Xaa₃₅は、GlyまたはAibであり、
Xaa₃₆は、ArgまたはGlyであり、
Xaa₃₇は、GlyまたはArgであり、および
Xaa₃₈は、Ser、Gly、Ala、Glu、Pro、Arg、または存在しない、
実施形態1〜94のいずれかの誘導体。
96.式Iのペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体である、実施形態95の誘導体。
97.式Iのペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)である、実施形態95の誘導体。
98.Xaa₇が、HisまたはImp(desH)であり、Xaa₈が、AlaまたはAibであり、Xaa₁₂が、Pheであり、Xaa₁₆が、Valであり、Xaa₁₈が、Serであり、Xaa₁₉が、Tyrであり、Xaa₂₀が、Leuであり、Xaa₂₂が、GlyまたはGluであり、Xaa₂₃が、Glnであり、Xaa₂₅が、Alaであり、Xaa₂₇が、Gluであり、Xaa₃₀が、AlaまたはGluであり、Xaa₃₁が、Trpであり、Xaa₃₃が、Valであり、Xaa₃₄が、Glnであり、Xaa₃₅が、Glyであり、Xaa₃₆が、Argであり、Xaa₃₇が、Glyであり、Xaa₃₈が、存在しない、実施形95〜97のいずれかの誘導体。
99.Xaa₇が、Hisである、実施形態95〜98のいずれかの誘導体。
100.Xaa₇が、Impである、実施形態95〜98のいずれかの誘導体。
101.Xaa₇が、Alaである、実施形態95〜100のいずれかの誘導体。
102.Xaa₈が、Aibである、実施形態95〜100のいずれかの誘導体。
103.Xaa₁₂が、Pheである、実施形態95〜102のいずれかの誘導体。
104.Xaa₁₆が、Valである、実施形態95〜103のいずれかの誘導体。
105.Xaa₁₈が、Serである、実施形態95〜104のいずれかの誘導体。
106.Xaa₁₉が、Tyrである、実施形態95〜105のいずれかの誘導体。
107.Xaa₂₀が、Leuである、実施形態95〜106のいずれかの誘導体。
108.Xaa₂₂が、Glyである、実施形態95〜107のいずれかの誘導体。
109.Xaa₂₂が、Gluである、実施形態95〜107のいずれかの誘導体。
110.Xaa₂₂が、Gluでない、実施形態95〜108のいずれかの誘導体。
111.Xaa₂₃が、Glnである、実施形態95〜110のいずれかの誘導体。
112.Xaa₂₅が、Alaである、実施形態95〜111のいずれかの誘導体。
113.Xaa₂₇が、Gluである、実施形態95〜112のいずれかの誘導体。
114.Xaa₃₀が、Alaである、実施形態95〜113のいずれかの誘導体。
115.Xaa₃₀が、Gluである、実施形態95〜114のいずれかの誘導体。
116.Xaa₃₁が、Trpである、実施形態95〜115のいずれかの誘導体。
117.Xaa₃₃が、Valである、実施形態95〜116のいずれかの誘導体。
118.Xaa₃₅が、Glyである、実施形態95〜117のいずれかの誘導体。
119.Xaa₃₆が、Argである、実施形態95〜118のいずれかの誘導体。
120.Xaa₃₇が、Glyである、実施形態95〜119のいずれかの誘導体。
121.Xaa₃₈が、存在しない、実施形態95〜120のいずれかの誘導体。
122.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化:
(i)8Aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または(iv)8Aib、22E、30E
を含む、実施形態1〜121のいずれかの誘導体。
123.ペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化:
(i)8Aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または(iv)8Aib、22E、30E
を有する、実施形態1〜122のいずれかの誘導体。
124.下記:Chem.21、Chem.22、Chem.23、Chem.24、Chem.25、Chem.26、Chem.27、Chem.28、Chem.29、Chem.30、Chem.31、およびChem.32から選択される、好ましくは、実施形態1〜123のいずれかによる化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
125.好ましくは、実施例124の化合物であり、その名称によって特徴付けられ、本明細書において実施例1〜12の化合物の名称のそれぞれのリストから選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
126.GLP-1活性を有する、実施形態1〜125のいずれかの誘導体。
127.GLP-1活性が、ヒトGLP-1受容体を活性化する性能を意味する、実施形態126の誘導体。
128.ヒトGLP-1受容体の活性化が、cAMPの産生の効力として、インビトロのアッセイにおいて測定される、実施形態127の誘導体。
129.a)10000pM未満、好ましくは、8000pM未満、より好ましくは、5000pM未満、さらにより好ましくは、4000pM未満、または最も好ましくは、3000pM未満;
b)2000pM未満、好ましくは、1200pM未満、より好ましくは、1000pM未満、さらにより好ましくは、800pM未満、または最も好ましくは、600pM未満;
c)400pM未満、好ましくは、300pM未満、より好ましくは、200pM未満、さらにより好ましくは、150pM未満、または最も好ましくは、100pM未満;あるいは
d)80pM未満、好ましくは、60pM未満、より好ましくは、50pM未満、さらにより好ましくは、40pM未満、または最も好ましくは、30pM未満
のEC₅₀に対応する効力を有する、実施形態1〜128のいずれかの誘導体。
130.効力を、好ましくは、安定的なトランスフェクトされた細胞系、例えば、BHK467-12A(tk-ts13)を使用して、かつ/またはcAMPの決定のために、例えば、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づく、機能的受容体アッセイを使用して、ヒトGLP-1受容体を含有する培地、例えば、下記の組成の培地(最終のアッセイにおける濃度)50mMのTRIS-HCl;5mMのHEPES;10mMのMgCl₂、6H₂O;150mMのNaCl;0.01%Tween;0.1%BSA;0.5mMのIBMX;1mMのATP;1uMのGTPにおいて、cAMPの形成の刺激についてのEC₅₀として決定し、このアッセイにおいて、cAMPはより好ましくは、特異抗体を使用して捕捉され、かつ/またはさらにより好ましいアッセイは、AlphaScreen cAMPアッセイであり、最も好ましくは、実施例20において記載されているものである、実施形態129の誘導体。
131.ヒトGLP-1受容体の活性化が、インビトロのアッセイにおいて、レポーター遺伝子アッセイにおいて測定される、実施形態127〜128のいずれかの誘導体。
132.アッセイを、ヒトGLP-1受容体を発現しており、かつプロモーターにカップリングしたcAMP応答配列(CRE)のためのDNA、およびホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)のための遺伝子を含有する、安定的にトランスフェクトされたBHK細胞系において行う、実施形態131の誘導体。
133.アッセイインキュベーションが完了するとき、ルシフェリンを加え、発光を測定する、実施形態132の誘導体。
134.アッセイが、血清アルブミンの非存在下(0%HSA、最終アッセイ濃度)で行われる、実施形態131〜133のいずれかの誘導体。
135.アッセイが、1%血清アルブミンの存在下(HSA、最終アッセイ濃度)で行われる、実施形態131〜134のいずれかの誘導体。
136.細胞が、親細胞系としてBHK-ts13を伴うBHK細胞である、実施形態131〜135のいずれかの誘導体。
137.細胞が、クローンFCW467-12Aに由来する、実施形態131〜136のいずれかの誘導体。
138.細胞を、細胞培養培地において5%CO₂で培養し、一定分量とし、液体窒素中で貯蔵する、実施形態131〜137のいずれかの誘導体。
139.細胞培養培地が、10%FBS(ウシ胎仔血清)、1mg/mlのG418、240nMのMTX(メソトレキセート)および1%pen/strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)である、実施形態138の誘導体。
140.各アッセイの前に、細胞培養物の一定分量を吸い上げ、PBS中で2回洗浄し、その後、アッセイ緩衝液に所望の濃度で懸濁させる、実施形態131〜139のいずれかの誘導体。
141.96ウェルプレートのために、懸濁液を作製して、5×10³個の細胞/ウェルの最終濃度を得る、実施形態131〜140のいずれかの誘導体。
142.アッセイ緩衝液が、アッセイ培地中の2%オボアルブミン、0.2%Pluronic F-68および2%HSAからなる1%アッセイ緩衝液である、実施形態140〜141のいずれかの誘導体。
143.アッセイ緩衝液が、アッセイ培地中の2%オボアルブミンおよび0.2%Pluronic F-68からなる0%アッセイ緩衝液である、実施形態140〜141のいずれかの誘導体。
144.アッセイ培地が、DMEM w/oフェノールレッド、10mMのHepesおよび1×Glutamaxからなる、実施形態142〜143のいずれかの誘導体。
145.アッセイ手順が、下記のステップ
i)細胞ストックを、37℃の水浴中で解凍するステップ;
ii)細胞をPBS中で3回洗浄するステップ;
iii)細胞を計数し、アッセイ培地中で5×10³個の細胞/50μl(1×10⁵個の細胞/ml)に調節し、50μl分量の細胞を、アッセイプレート中の各ウェルに移すステップ;
iv)試験化合物および参照化合物のストックを、もしあれば、0%HSAアッセイのために0%アッセイ緩衝液、または1%HSAアッセイのために1%アッセイ緩衝液中で、0.2μMの濃度に希釈し、化合物を10倍に希釈し、適切な範囲の濃度(例えば、2×10^-7M、2×10^-8M、2×10^-9M、2×10^-10M、2×10^-11M、2×10^-12Mおよび2×10^-13M)を得て、各化合物のために、ブランクアッセイ緩衝液対照をまた含めるステップ;
v)50μl分量の化合物またはブランクを、三連で希釈プレートからアッセイプレートに移し、化合物を適切な濃度(例えば、下記の最終濃度:1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M、1×10^-12Mおよび1×10^-13M)で試験するステップ;
vi)アッセイプレートを5%CO₂インキュベーター中で37℃にて3時間インキュベートするステップ;
vii)アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で15分間静置するステップ;
ixx)100μl分量のルシフェリン(例えば、steadylite plus試薬)を、アッセイプレートの各ウェルに加えるステップ;
ix)各アッセイプレートを覆って光から保護し、室温で30分間振盪するステップ;
x)各アッセイプレートを、例えば、Packard TopCount NXT機器で読み取るステップ
を含む、実施形態131〜144のいずれかの誘導体。
146.TopCount機器からのデータを、所望の計算のために、GraphPad Prism5ソフトウェアに移す、実施形態145の誘導体。
147.三連のそれぞれについての値を平均化し、非線形回帰を行い、EC₅₀値を計算する、実施形態131〜146のいずれかの誘導体。
148.回帰が、(log(アゴニスト)対応答-バリアブルスロープ(4パラメーター))である、実施形態145〜147のいずれかの誘導体。
149.効力が、実施形態131〜148のいずれかにおいて記載されているように決定される、実施形態127〜128のいずれかの誘導体。
150.効力が、実施例21に記載されているように決定される、実施形態149の誘導体。
151.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の20倍以下である、実施形態131〜150のいずれかの誘導体。
152.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の15倍以下である、実施形態131〜151のいずれかの誘導体。
153.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の10倍以下である、実施形態131〜152のいずれかの誘導体。
154.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の5倍以下である、実施形態131〜153のいずれかの誘導体。
155.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の2.5倍以下である、実施形態131〜154のいずれかの誘導体。
156.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値より低い、実施形態131〜155のいずれかの誘導体。
157.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の0.75倍未満である、実施形態131〜156のいずれかの誘導体。
158.そのEC₅₀値が、セマグルチドについてのEC₅₀値の0.50倍未満である、実施形態131〜157のいずれかの誘導体。
159.GLP-1受容体結合親和性(IC₅₀)が、おおよそ0.001%HSA(低アルブミン)の存在下で、
a)500nM未満、好ましくは、250nM未満、より好ましくは、100nM未満、または最も好ましくは、50nM未満;
b)10nM未満、好ましくは、8.0nM未満、またより好ましくは、6.0nM未満、さらにより好ましくは、5.0nM未満、または最も好ましくは、3.0nM未満;
c)2.0nM未満、好ましくは、1.0nM未満、さらにより好ましくは、0.80nM未満、または最も好ましくは、0.60nM未満;あるいは
d)0.40nM未満、好ましくは、0.30nM未満、さらにより好ましくは、0.20nM未満、または最も好ましくは、0.10nM未満
である、実施形態1〜158のいずれかの誘導体。
160.ヒトGLP-1受容体の活性化が、おおよそ0.001%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC₅₀)として測定される、実施形態127の誘導体。
161.2.0%HSA(高アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC₅₀)が、
a)1000nM未満、好ましくは、800nM未満;
b)700nM未満、好ましくは、500nM未満、より好ましくは、300nM未満;あるいは
c)200nM未満、好ましくは、100nM未満、またはより好ましくは、50nM未満である、実施形態1〜160のいずれかの誘導体。
162.GLP-1受容体への結合親和性を、好ましくは、SPA結合アッセイを使用して、受容体からの¹²⁵I-GLP-1の移動によって測定する、実施形態159〜160のいずれかの誘導体。
163.GLP-1受容体が、安定的なトランスフェクトされた細胞系、好ましくは、ハムスター細胞系、より好ましくは、ベビーハムスター腎細胞系、例えば、BHK tk-ts13を使用して調製される、実施形態161の誘導体。
164.IC₅₀値を、受容体から¹²⁵I-GLP-1の50%を移動させる濃度として決定する、実施形態159〜163のいずれかの誘導体。
165.セマグルチドの経口バイオアベイラビリティーより高い経口バイオアベイラビリティー、好ましくは、絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する、実施形態1〜164のいずれかの誘導体。
166.リラグルチドの経口バイオアベイラビリティーより高い経口バイオアベイラビリティー、好ましくは、絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する、実施形態1〜165のいずれかの誘導体。
167.db/dbマウスにおいてインビボでの血中グルコースを低下させることにおいて有効である、実施形態1〜166のいずれかの誘導体。
168.db/dbマウスにおいてインビボでの体重を低下させることにおいて有効である、実施形態1〜167のいずれかの誘導体。
169.ブタにおけるPD研究において、ビヒクル治療対照群と比較して、誘導体の単回用量のs.c.投与後の1日目、2日目、3日目、および/または4日目において食物摂取量を低減させる、実施形態1〜168のいずれかの誘導体。
170.用量が、0.3、1.3、10または30nmol/kg、好ましくは、3.0nmol/kgである、実施形態169の誘導体。
171.1日目の食物摂取量が、80%以下、好ましくは、60%以下、より好ましくは、50%以下、または最も好ましくは、40%以下に低減する、実施形態169〜170のいずれかの誘導体。
172.2日目の食物摂取量が、80%以下、好ましくは、60%以下、またはより好ましくは、40%以下に低減する、実施形態169〜171のいずれかの誘導体。
173.実施例25に記載されているように、研究が行われ、データが編集および分析される、実施形態169〜172のいずれかの誘導体。
174.リラグルチドより延長性プロファイルの作用を有する、実施形態1〜173のいずれかの誘導体。
175.延長が、関連性のある動物種、例えば、db/dbマウス、ラット、ブタ、および/または、好ましくは、ミニブタにおけるインビボでの半減期を意味し、i)s.c.、および/または、ii)i.v.;好ましくは、ii)i.v.投与される、実施形態174の誘導体。
176.ラットにおけるi.v.投与後の末端半減期(T_1/2)が、セマグルチドの末端半減期より高い、実施形態1〜175のいずれかの誘導体。
177.ラットにおけるi.v.投与後の末端半減期(T_1/2)が、セマグルチドの末端半減期より少なくともa)25%高く、b)50%高く、c)75%高く、またはd)100%高い(=2倍)、実施形態1〜176のいずれかの誘導体。
178.ラットにおけるi.v.投与後の末端半減期(T_1/2)が、セマグルチドの末端半減期の少なくとも2倍である、実施形態1〜177のいずれかの誘導体。
179.半減期が、例えば、実施例24に記載されているように、ラットにおけるインビボの薬物動態研究において決定される、実施形態174〜178のいずれかの誘導体。
180.ミニブタにおけるi.v.投与の後の末端半減期(T_1/2)が、
a)少なくとも8時間、好ましくは、少なくとも16時間、より好ましくは、少なくとも24時間、さらにより好ましくは、少なくとも32時間、または最も好ましくは、少なくとも40時間;あるいは
b)少なくとも50時間、好ましくは、少なくとも55時間、より好ましくは、少なくとも60時間、さらにより好ましくは、少なくとも65時間である、実施形態1〜179のいずれかの誘導体。
181.ミニブタが、雄性Gottingenミニブタである、実施形態180の誘導体。
182.ミニブタが、7〜14カ月齢であり、好ましくは、16〜35kgの体重である、実施形態180〜181のいずれかの誘導体。
183.ミニブタを、個々に収容し、好ましくは、SDSミニブタ食餌を1日1回または2回摂食させる、実施形態180〜182のいずれかの誘導体。
184.少なくとも2週間の順化の後に、i.v.投与される、実施形態180〜183のいずれかの誘導体。
185.動物を投与の前に概ね18時間および投与の後に0〜4時間絶食させ、全期間の間に水に自由にアクセスさせる、実施形態180〜184のいずれかの誘導体。
186.GLP-1誘導体を、適切な濃度、好ましくは、20〜60nmol/mlまで、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に溶解する、実施形態180〜185のいずれかの誘導体。
187.誘導体の静脈内注射を、1〜2nmol/kgに対応する容量で与える、実施形態180〜188のいずれかの誘導体。
188.GLP-1(7-37)(配列番号1)の下記の類似体:(i)8aib;(ii)7Imp、8Aib;(iii)8Aib、22E;または(iv)8Aib、22E、30Eから選択されるGLP-1類似体の形態の中間生成物、または(i)、(ii)、(iii)、または(iv)の類似体のいずれかの薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
189.GLP-1(7-37)(配列番号1)との比較が、筆記および目視によって行われる、実施形態188の類似体。
190.GLP-1(7-37)(配列番号1)との比較が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムの使用によって行われる、実施形態188〜189のいずれかの類似体。
191.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態190の類似体。
192.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスを使用する、実施形態188〜191のいずれかの類似体。
193.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態188〜192のいずれかの類似体。
194.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態188〜193のいずれかの類似体。
195.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態188〜194のいずれかの類似体。
196.実施形態1〜195のいずれかによる誘導体、および薬学的に許容される添加剤を含む、医薬組成物。
197.医薬品として使用するための、実施形態1〜195のいずれかによる誘導体。
198.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/または予防において使用するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態1〜195のいずれかによる誘導体。
199.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療および/または予防するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための医薬の製造における、実施形態1〜195のいずれかによる誘導体の使用。
200.医薬的活性量の実施形態1〜195のいずれかによる誘導体を投与することにより、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療または予防するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。

【0225】

本発明はまた、GLP-1類似体の誘導体であって、類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置において第1のK残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置において第2のK残基、およびGLP-1(7-37)と比較して最大で8個のアミノ酸の変化を含み、誘導体は、それぞれ、第1および第2のリンカーを介して、それぞれ、前記第1および第2のK残基に結合している第1および第2の延長部分を含み、第1および第2の延長部分は、Chem.2:
Chem.2:HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-^*
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、第1および第2のリンカーは、
Chem.3:^*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NH₂]-CO-^*
を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、wは、0〜5の範囲の整数である誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル、
ならびに従属した実施形態として本明細書中に付け加えられている上記の実施形態2〜200のいずれかに関する。

【0226】

本発明はまた、以下に関する。
a).GLP-1ペプチドの誘導体であって、
ペプチドは、GLP-1(7-37)(配列番号1)の26位に対応する位置において第1のK残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に対応する位置において第2のK残基、およびGLP-1(7-37)と比較して最大で8個のアミノ酸の変化を含み、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、第1および第2のK残基に結合している2つの延長部分を含み、延長部分は、Chem.2:
Chem.2:HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-^*
(式中、yは、6〜13の範囲の整数である)であり、
リンカーは、Chem.3:
Chem.3:^*-NH-(CH₂)_q-CH[(CH₂)_w-NH₂]-CO-^*
を含み、qは、0〜5の範囲の整数であり、wは、0〜5の範囲の整数である
誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
b).Chem.3が、そのCO-^*末端においてGLP-1ペプチドの第1または第2のK残基のεアミノ基に結合している、実施形態a)の誘導体。
c).リンカーが、z回のChem.3を含み、zが、1〜2の範囲の整数である、実施形態a)〜b)のいずれかの誘導体。
d).wが、0である、実施形態a)〜c)のいずれかの誘導体。
e).qが、4である、実施形態a)〜d)のいずれかの誘導体。
f).リンカーが、
Chem.4:^*-NH-(CH₂)_q-CH(NH₂)-CO-^*を含み、qは、3〜5の範囲の整数である、実施形態a)〜e)のいずれかの誘導体。
g).リンカーが、
Chem.6:^*-NH-(CH₂)₄-CH(NH₂)-CO-^*を含む、実施形態a)〜f)のいずれかの誘導体。
h).yが、9、10、または11である、実施形態a)〜g)のいずれかの誘導体。
i).式IのGLP-1類似体を含み、
式I:Xaa₇-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Xaa₁₂-Thr-Ser-Asp-Xaa₁₆-Ser-Xaa₁₈-Xaa₁₉-Xaa₂₀-Glu-Xaa₂₂-Xaa₂₃-Ala-Xaa₂₅-Lys-Xaa₂₇-Phe-Ile-Xaa₃₀-Xaa₃₁-Leu-Xaa₃₃-Lys-Xaa₃₅-Xaa₃₆-Xaa₃₇-Xaa₃₈、
式中、
Xaa₇は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル(Imp)、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン(desH)、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、N^α-アセチル-ヒスチジン、N^α-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa₈は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa₁₂は、PheまたはLeuであり、
Xaa₁₆は、ValまたはLeuであり、
Xaa₁₈は、Ser、Val、またはLeuであり、
Xaa₁₉は、TyrまたはGlnであり、
Xaa₂₀は、LeuまたはMetであり、
Xaa₂₂は、Gly、Glu、またはAibであり、
Xaa₂₃は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa₂₅は、AlaまたはValであり、
Xaa₂₇は、GluまたはLeuであり、
Xaa₃₀は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa₃₁は、TrpまたはHisであり
Xaa₃₃は、Valであり、
Xaa₃₅は、GlyまたはAibであり、
Xaa₃₆は、ArgまたはGlyであり、
Xaa₃₇は、GlyまたはArgであり、および
Xaa₃₈は、Ser、Gly、Ala、Glu、Pro、Arg、または存在しない、
実施形態a)〜h)のいずれかの誘導体。
j).下記:Chem.21、Chem.22、Chem.23、Chem.24、Chem.25、Chem.26、Chem.27、Chem.28、Chem.29、Chem.30、Chem.31、およびChem.32から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
k).実施形態a)〜j)のいずれかによる誘導体、および薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物。
l).医薬品として使用するための、実施形態a)〜j)のいずれかによる誘導体。
m).全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/または予防において使用するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態a)〜j)のいずれかによる誘導体。
n).全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療および/または予防するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための医薬の製造における、実施形態a)〜j)のいずれかによる誘導体の使用。
o).医薬的活性量の実施形態a)〜j)のいずれかによる誘導体を投与することによって、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療または予防するため;ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β-細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。

【実施例】

【0227】

この実験パートは、略語のリストから開始し、本発明の類似体および誘導体を合成し特徴付けるための一般の方法を含むセクションが続く。次いで、特定のGLP-1誘導体の調製に関するいくつかの実施例が続き、最後に、これらの類似体および誘導体の活性および特性に関するいくつかの実施例が含まれる(薬理学的方法と見出しがあるセクション)。

【0228】

実施例は、本発明を例示する役割を果たす。

【0229】

略語の一覧
Aib:α-アミノイソ酪酸
AcOH:酢酸
API:活性医薬成分
AUC:曲線下面積
BG:血中グルコース
BHK:ベビーハムスター腎臓
BW:体重
Boc:t-ブチルオキシカルボニル
Bom:ベンジルオキシメチル
BSA:ウシ血清アルブミン
Bzl:ベンジル
CAS:化学情報検索サービス機関
Clt:2-クロロトリチル
コリジン:2,4,6-トリメチルピリジン
DCM:ジクロロメタン
Dde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DesH:デス-アミノヒスチジン(イミダゾプロピオン酸、Impともまた称してよい)
DIC:ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
DMEM:ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
EGTA:エチレングリコール四酢酸
FBS:ウシ胎仔血清
FCS:ウシ胎仔血清
Fmoc:9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HATU:(O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HBTU:(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HEPES:4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HFIP:1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール
HOAt:1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt:1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
HSA:ヒト血清アルブミン
IBMX:3-イソブチル-1-メチルキサンチン
Imp:イミダゾプロピオン酸(デス-アミノヒスチジン、DesHともまた称してよい)
i.v:静脈内
ivDde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
IVGTT:静脈内グルコース負荷試験
LCMS:液体クロマトグラフィー質量分析
LYD:Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS:MALDI-TOF MSを参照されたい
MALDI-TOF MS:マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析
MeOH:メタノール
Mmt:4-メトキシトリチル
Mtt:4-メチルトリチル
MTX:メソトレキセート
NMP:N-メチルピロリドン
OBz:ベンゾイルエステル
OEG:8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
OPfp:ペンタフルオロフェノキシ
OPnp:パラ-ニトロフェノキシ
OSu:O-スクシンイミジルエステル(ヒドロキシスクシンイミドエステル)
OtBu:tertブチルエステル
Oxyma Pure(登録商標):シアノ-ヒドロキシイミノ-酢酸エチルエステル
Pbf:2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PD:薬力学
Pen/Strep:ペニシリン/ストレプトマイシン
PK:薬物動態学
RP:逆相
RP-HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
RT:室温
Rt:保持時間
s.c.:皮下
SD:標準偏差
SEC-HPLC:サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
SEM:平均の標準誤差
SPA:シンチレーション近接アッセイ
SPPS:固相ペプチド合成
tBu:tertブチル
TFA:トリフルオロ酢酸
TIS:トリイソプロピルシラン
TLC:薄層クロマトグラフィー
Tos:トシレート(または、パラ-トルエンスルホニル)
Tris:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンまたは2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオール
Trt:トリフェニルメチル(トリチル)
Trx:トラネキサム酸
UPLC:超高速液体クロマトグラフィー

【0230】

材料および方法
材料
α-ピコリンボラン複合体(CAS3999-38-0)
シアノ-ヒドロキシイミノ-酢酸エチルエステル(CAS3849-21-6)
N-α,N-β-ジ-Fmoc-L-2,3-ジアミノプロピオン酸(CAS201473-90-7)
3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシ安息香酸(CAS1421-49-4)
3,5-ジ-tert-ブチル安息香酸(CAS16225-26-6)
Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(CAS166108-71-0)
17-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-9-アザ-3,6,12,15-テトラオキサ-10-オン-ヘプタデカン酸(IRIS Biotech GmbH)
Fmoc-L-グルタミン酸1-tert-ブチルエステル(CAS84793-07-7)
2-(2-メトキシエトキシ)酢酸(CAS16024-56-9)
N-α,N-ε-ビス(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)-L-リシン(CAS78081-87-5)
1-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]ピペリジン-4-カルボン酸(CAS148928-15-8)
FMOC-8-アミノカプリル酸(CAS126631-93-4)
4-フェニル酪酸(CAS1716-12-7)
4-(4-ニトロフェニル)酪酸(CAS5600-62-4)
4-(4-クロロフェニル)酪酸(CAS4619-18-5)
FMOC-6-アミノヘキサン酸(CAS88574-06-5)
FMOC-12-アミノドデカン酸(CAS128917-74-8)
4-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204の実施例25、ステップ1および2に記載されているように調製)
4-(8-カルボキシ-オクチルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(M.p.:71〜72℃。

【0231】

【数1】

【0232】

(WO2006/082204の実施例25、ステップ1および2に記載されているように調製、メチル10-ブロモデカノエートをエチル9-ブロモノナノエートに置き換える(CAS28598-81-4))
4-(7-カルボキシ-ヘプチルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(

【0233】

【数2】

【0234】

(WO2006/082204の実施例25、ステップ1および2に記載されているように調製、メチル10-ブロモデカノエートをエチル7-ブロモヘプタノエートに置き換える(CAS29823-18-5))。

【0235】

化学的方法
このセクションは、2つに分かれる:一般の方法に関するセクションA(調製(A1);ならびに検出および特徴付け(A2))、ならびにセクションB(いくつかの特定の実施例の化合物の調製および特徴付けが記載されている)。

【0236】

A、一般の方法
A1、調製方法
このセクションは、固相ペプチド合成のための方法(アミノ酸の脱保護のための方法、樹脂からペプチドを切断する方法、およびその精製の方法を含めた、SPPS法)、ならびにこのように得られたペプチドを検出し特徴付けるための方法(LCMS、MALDI、およびUPLC法)に関する。ペプチドの固相合成は、場合によっては、ジペプチドアミド結合上で酸性条件下にて切断することができる基(これらに限定されないが、2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル、または2,4,6-トリメトキシベンジルなど)で保護されたジペプチドを使用することによって改善し得る。セリンまたはトレオニンがペプチド中に存在する場合、疑似プロリンジペプチドを使用し得る(例えば、Novabiochemから入手可能、W.R. Sampson(1999年)、J. Pep. Sci.、5、403をまた参照されたい)。使用されるFmoc保護されたアミノ酸誘導体は、推奨される標準であった:Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、または、Fmoc-Val-OHなど(例えば、Anaspec、Bachem、Iris Biotech、またはNovabiochemから供給)。これ以上特定されない場合、アミノ酸の天然L型を使用する。N末端アミノ酸は、αアミノ基においてBoc保護されていた(例えば、N末端においてHisを有するペプチドについて、Boc-His(Boc)-OH、またはBoc-His(Trt)-OH)。SPPSを使用するモジュールアルブミン結合部分結合の場合、下記の適切に保護された構造単位(これらに限定されないが、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-トラネキサム酸、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、テトラデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、または4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルなど)を使用した。下記で述べた全ての操作は、250μmolの合成スケールで行った。

【0237】

1.樹脂結合保護ペプチド骨格の合成
方法:SPPS_P
SPPS_Pを、樹脂充填に対して6倍過剰なFmoc-アミノ酸(300mMのHOAtまたはOxyma Pure(登録商標)を有するNMP中300mM)、例えば、低充填Fmoc-Gly-Wang(0.35mmol/g)を使用して、Protein Technologies(Tucson、AZ85714、U.S.A.)からのPrelude固相ペプチド合成機で250μmolスケールにて行った。NMP中の20%ピペリジンを使用して、Fmoc脱保護を行った。NMP中の3:3:3:4のアミノ酸/(HOAtまたはOxyma Pure(登録商標))/DIC/コリジンを使用して、カップリングを行った。脱保護およびカップリングステップの間に、NMPおよびDCMのトップ洗浄(7ml、0.5分、それぞれ2×2)を行った。カップリング時間は一般に、60分であった。これらに限定されないが、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Aib-OHまたはBoc-His(Trt)-OHを含めたいくつかのアミノ酸を、「二重カップリング」させた。これは、最初のカップリングの後(例えば、60分)、樹脂から液体を排出させ、さらなる試薬を加え(アミノ酸、(HOAtまたはOxyma Pure(登録商標))、DIC、およびコリジン)、混合物を再び反応させる(例えば、60分)ことを意味する。

【0238】

方法:SPPS_L
SPPS_Lを、樹脂充填に対して6倍過剰なFmoc-アミノ酸(300mMのHOAtまたはOxyma Pure(登録商標)を有するNMP中300mM)、例えば、低充填Fmoc-Gly-Wang(0.35mmol/g)を使用して、CEM Corp.(Matthews、NC28106、U.S.A.)からのマイクロ波ベースのLibertyペプチド合成機で250μmolまたは100μmolスケールにて行った。75℃までで30秒間、NMP中の5%ピペリジンを使用してFmoc脱保護を行ったが、樹脂から液体を排出させ、NMPで洗浄した後、Fmoc脱保護を、今回は75℃で2分間繰り返した。NMP中の1:1:1のアミノ酸/(HOAtまたはOxyma Pure(登録商標))/DICを使用して、カップリングを行った。カップリング時間および温度は一般に、75℃までで5分であった。より大きなスケールの反応のためにより長いカップリング時間、例えば、10分を使用した。ヒスチジンアミノ酸を、50℃で二重カップリングし、または前のアミノ酸に立体障害があった場合(例えば、Aib)、四重カップリングした。アルギニンアミノ酸をRTで25分間カップリングし、次いで、75℃に5分間加熱した。これらに限定されないがAibなどのいくつかのアミノ酸を、「二重カップリング」したが、これは最初のカップリング(例えば、75℃で5分)後に、樹脂から液体を排出させ、さらなる試薬(アミノ酸、(HOAtまたはOxyma Pure(登録商標))およびDIC)を加え、混合物を再び加熱する(例えば、75℃で5分)ことを意味する。脱保護およびカップリングステップの間に、NMP洗浄(5×10ml)を行った。

【0239】

方法:SPPS_A
保護されたペプチジル樹脂を、Fmoc保護基の脱保護のNMPおよびUVモニタリングにおけるHBTU(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)またはHATU(O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)を媒介するカップリングを用いる、メーカーが供給するFastMoc UVプロトコルを使用して、Applied Biosystems433ペプチド合成機でFmoc戦略に従って、3倍または4倍過剰なFmoc-アミノ酸で、250μmolまたは1000μmolスケールにて合成した。場合によっては二重カップリングを使用したが、これは、最初のカップリングの後に、樹脂から液体を排出させ、さらなるFmoc-アミノ酸および試薬を加えることを意味する。ペプチドアミドの合成のために使用される出発樹脂は、Rink-アミド樹脂および事前充填Wang(例えば、低充填Fmoc-Gly-WangもしくはFmoc-Lys(Mtt)-wang)、またはカルボキシC末端を有するペプチドについてクロロトリチル樹脂であった。使用された保護されたアミノ酸誘導体は、非天然アミノ酸、例えば、Fmoc-Aib-OH(Fmoc-アミノイソ酪酸)を例外として、ABI433A合成機に適した事前秤量したカートリッジ中で供給される標準的Fmoc-アミノ酸(例えば、Anaspec、またはNovabiochemから供給)であった。N末端アミノ酸を、αアミノ基においてBoc保護した(例えば、N-末端においてHisを有するペプチドについて、Boc-His(Boc)-OHまたはBoc-His(Trt)-OHを使用した)。配列中のリシンのεアミノ基を、アルブミン結合部分およびスペーサーの結合のための経路によって、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、またはBocで保護した。ペプチドの合成は、場合によっては、ジペプチドアミド結合上で酸性条件下にて切断することができる基(これらに限定されないが、2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル、または2,4,6-トリメトキシベンジルなど)で保護されたジペプチドを使用することによって改善し得る。セリンまたはトレオニンがペプチド中に存在する場合、疑似プロリンジペプチドの使用を使用し得る(例えば、Novobiochem2009/2010からのカタログ、もしくはより新しいバージョン、またはW.R. Sampson(1999年)、J. Pep. Sci.、5、403を参照されたい)。

【0240】

方法:SPPS_M
SPPS_Mは、手作業のFmoc化学を使用した保護されたペプチジル樹脂の合成を意味する。カップリング化学は、4〜10倍モル過剰の、NMP中のDIC/(HOAtまたはOxyma Pure(登録商標))/コリジンであった。カップリング条件は、室温で1〜6時間であった。NMP中の20〜25%ピペリジン(3×20ml、各10分)、それに続くNMP洗浄(4×20mL)によってFmoc脱保護を行った。

【0241】

2.側鎖の合成
脂肪二酸のモノエステル
トルエン中のBoc-無水DMAP t-ブタノールによるC8、C10、C12、C14、C16およびC18二酸の一晩の還流によって、主にt-ブチルモノエステルを得る。得られるのは、後処理後の一酸、二酸およびジエステルの混合物である。洗浄、ショートプラグシリカ濾過および結晶化によって、精製を行う。

【0242】

3.樹脂結合保護ペプチド骨格への側鎖の結合
アシル化がリシン側鎖上に存在するとき、アシル化されるリシンのεアミノ基を、延長部分およびリンカーの結合のための経路によって、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、またはBocで保護した。NMP中の2%ヒドラジン(2×20ml、各10分)、それに続くNMP洗浄(4×20ml)によって、Dde-脱保護またはivDde-脱保護を行った。DCM中の2%TFAおよび2〜3%TIS(5×20ml、各10分)、それに続くDCM(2×20ml)、DCM中の10%MeOHおよび5%DIPEA(2×20ml)、およびNMP(4×20ml)洗浄によって、またはヘキサフルオロイソプロパノール/DCM(75:25、5×20ml、各10分)による処理、続いて上記のような洗浄によって、Mtt-またはMmt-脱保護を行った。場合によっては、Mtt基を、Libertyペプチド合成機の自動化ステップによって除去した。室温で30分間ヘキサフルオロイソプロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール/DCM(75:25)によって、それに続くDCM(7ml×5)による洗浄、それに続くNMP洗浄(7m1×5)によって、Mtt脱保護を行った。延長部分および/またはリンカーは、樹脂結合ペプチドのアシル化によって、または保護されていないペプチドの溶液中のアシル化によって、ペプチドに結合させることができる。保護されたペプチジル樹脂への延長部分および/またはリンカーの結合の場合、結合は、SPPSを使用したモジュールおよび適切に保護された構造単位でよい。

【0243】

方法:SC_P
N-ε-リシン保護基を、上記のように除去し、上記のような適切に保護された構造単位を使用して、Preludeペプチド合成機による1つまたは複数の自動化ステップによってリシンの化学修飾を行った。二重カップリングを、SPPS_Pに記載されているようにカップリング毎に3時間行った。

【0244】

方法:SC_L
N-ε-リシン保護基を、上記のように除去し、上記のような適切に保護された構造単位を使用して、Libertyペプチド合成機による1つまたは複数の自動化ステップによってリシンの化学修飾を行った。二重カップリングを、SPPS_Lに記載されているように行った。

【0245】

方法:SC_A
N-ε-リシン保護基を上記のように除去し、SPPS_Aに記載されているように、適切に保護された構造単位を使用して、ABIペプチド合成機による1つまたは複数の自動化ステップによってリシンの化学修飾を行った。

【0246】

方法:SC_M1
N-ε-リシン保護基を、上記のように除去した。活性化された(活性エステルまたは対称性無水物)延長部分またはリンカー、例えば、オクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら、EP511600、樹脂結合ペプチドに対して4モル当量)を、NMP(25mL)に溶解し、樹脂に加え、室温で一晩振盪した。反応混合物を濾過し、樹脂をNMP、DCM、2-プロパノール、メタノールおよびジエチルエーテルで十分に洗浄した。

【0247】

方法:SC_M2
N-ε-リシン保護基を、上記のように除去した。延長部分を、NMP/DCM(1:1、10ml)に溶解した。活性化試薬、例えば、HOBtまたはOxyma Pure(登録商標)(樹脂に対して4モル当量)およびDIC(樹脂に対して4モル当量)を加え、溶液を15分間撹拌した。溶液を樹脂に加え、DIPEA(樹脂に対して4モル当量)を加えた。樹脂を室温で2〜24時間振盪した。樹脂をNMP(2×20ml)、NMP/DCM(1:1、2×20ml)およびDCM(2×20ml)で洗浄した。

【0248】

方法:SC_M3
活性化された(活性エステルまたは対称性無水物)延長部分またはリンカー、例えば、オクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら、EP511600)(ペプチドに対して1〜1.5モル当量)を、有機溶媒、例えば、アセトニトリル、THF、DMF、DMSOまたは水/有機溶媒の混合物(1〜2ml)に溶解し、10モル当量のDIPEAと一緒に、ペプチドの水溶液(10〜20ml)に加えた。延長部分上の保護基、例えば、tert-ブチルの場合、反応混合物を一晩凍結乾燥し、単離した粗ペプチドをその後脱保護した。tert-ブチル保護基の場合、トリフルオロ酢酸、水およびトリイソプロピルシランの混合物(90:5:5)にペプチドを溶解することによって脱保護を行った。30分後、混合物を真空中で蒸発させ、粗ペプチドを下記で記載するように分取HPLCによって精製した。

【0249】

4.結合した側鎖を有する、または有さない樹脂結合ペプチドの切断、および精製
方法:CP_M1
合成後、樹脂をDCMで洗浄し、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5または92.5/5/2.5)による2〜3時間の処理、それに続くジエチルエーテルによる沈殿によって、ペプチドを樹脂から切断した。ペプチドを適切な溶媒(例えば、30%酢酸など)に溶解し、アセトニトリル/水/TFAを使用するC18、5μMのカラム上での標準的RP-HPLCによって精製した。画分を、UPLC、MALDIおよびLCMS法の組合せによって分析し、適正な画分をプールし、凍結乾燥した。

【0250】

方法:CP_L1
合成後、樹脂をDCMで洗浄し、CEM Accent Microvawe切断システム(CEM Corp.、North Carolina)を使用することによってペプチドを樹脂から切断した。樹脂からの切断を、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)による処理、それに続くジエチルエーテルによる沈殿によって38℃で30分間行った。ペプチドを適切な溶媒(例えば、30%酢酸など)に溶解し、アセトニトリル/水/TFAを使用して、C18、5μMカラム上の標準的RP-HPLCによって精製した。画分を、UPLC、MALDIおよびLCMS法の組合せによって分析し、適正な画分をプールし、凍結乾燥した。

【0251】

A2、検出および特徴付けのための一般の方法
1.LC-MS法
方法:LCMS01v1
LCMS01v1は、Waters Acquity UPLCシステム、およびMicromassからのLCT Premier XE質量分析計からなる設定で行った。溶離液:A:水中の0.1%ギ酸、B:アセトニトリル中の0.1%ギ酸。分析は、適正な容量の試料(好ましくは、2〜10μl)を、AおよびBの勾配で溶出したカラムに注入することによってRTで行った。UPLC条件、検出器の設定および質量分析計の設定は、カラム:Waters Acquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mmであった。勾配:4.0分(代わりに、8.0分)の間、0.4ml/分で直線状の5%〜95%のアセトニトリル。検出:214nm(TUV(チューナブル紫外吸光検出器)からの類似体の結果)MSイオン化モード:API-ESスキャン:100〜2000原子質量単位(代わりに、500〜2000原子質量単位)、ステップ0.1原子質量単位。

【0252】

2.UPLC法
方法:UPLC02v1
RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H₂O、0.05%TFA;B:99.95%CH₃CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから95%A、5%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。

【0253】

方法:UPLC07v1
RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。215nmおよび254nmでのUV検出を、kinetex1.7u C18、100A、2.1×150mmカラム、60℃を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.045Mの(NH₄)₂HPO₄を有する90%水および10% CH₃CN、pH3.6、B:20%イソプロパノール、20%水および60%CH₃CNを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記のステップ勾配を使用した:2分に亘り35%Bおよび65%A、次いで、15分に亘り35%B、65%Aから65%B、35%A、次いで、3分に亘り65%B、35%Aから80%B、20%A、0.5ml/分の流量。

【0254】

方法:UPLC06v1
RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。215nmおよび254nmでのUV検出を、kinetex1.7u C18、100A、2.1×150mmカラム、60℃を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.045Mの(NH₄)₂HPO₄を有する90%水および10%MeCN、pH3.6、B:20%イソプロパノール、20%水および60%CH₃CNを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記のステップ勾配を使用した:2分に亘り25%Bおよび75%A、次いで、15分に亘り25%B、75%Aから55%B、45%A、次いで、3分に亘り55%B、45%Aから80%B、20%A、0.5ml/分の流量。

【0255】

3.MALDI-MS法
方法:MALDI01v1
分子量を、マトリックス支援レーザー脱離およびイオン化飛行時間型質量分析を使用して決定し、MicroflexまたはAutoflex(Bruker)に記録した。α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸のマトリックスを使用した。

【0256】

B、特定の実施例の化合物
(実施例1)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem 21:

【0257】

【化15】

【0258】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
MALDI01v01:計算値m/z:4721 実測値m/z:4720
UPLC法:UPLC07v1:Rt=9.2分
UPLC法:UPLC02v1:Rt=7.8分

【0259】

(実施例2)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.22:

【0260】

【化16】

【0261】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
MALDI01v01:計算値m/z:5101.8 実測値m/z:5100.3
UPLC法:UPLC07v01:Rt=12.9分

【0262】

(実施例3)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Imp⁷,Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.23:

【0263】

【化17】

【0264】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
MALDI01v01:計算値m/z:4762.5 実測値m/z:4759.4
UPLC法:UPLC07v01:Rt=13.2分

【0265】

(実施例4)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.24:

【0266】

【化18】

【0267】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
MALDI01v01:計算値m/z:5087.8 実測値m/z:5086.1
UPLC法:UPLC07v01:Rt=12.6分

【0268】

(実施例5)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.25:

【0269】

【化19】

【0270】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
MALDI01v01:計算値m/z:5059.7 実測値m/z:5057.5
UPLC法:UPLC07v01:Rt=11.1分

【0271】

(実施例6)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.26:

【0272】

【化20】

【0273】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
MALDI01v01:計算値m/z:5358.2 実測値m/z:5356.2
UPLC法:UPLC07v01:Rt=11.3分

【0274】

(実施例7)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.27:

【0275】

【化21】

【0276】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
MALDI01v01:計算値m/z:5330.1 実測値m/z:5328.8
UPLC法:UPLC07v01:Rt=9.8分

【0277】

(実施例8)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.28:

【0278】

【化22】

【0279】

調整方法:SPPS_P;SC_L;SC_M1;CP_M1
LCMS法:LCMS01v01:m/z:実測値m/3 1692、m/4 1269、m/5 1016;Rt=2.17分
UPLC法:UPLC07v01:Rt=11.5分

【0280】

(実施例9)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸,Glu²²]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.29:

【0281】

【化23】

【0282】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
MALDI01v01:計算値m/z:5173.8 実測値m/z:5170.4
UPLC法:UPLC07v01:Rt=12.9分

【0283】

(実施例10)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸,Glu²²,Glu³⁰]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.30:

【0284】

【化24】

【0285】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
MALDI01v01:計算値m/z:5231.9 実測値m/z:5230.5
UPLC法:UPLC07v01:Rt=13.2分

【0286】

(実施例11)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.31:

【0287】

【化25】

【0288】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
MALDI01v01:計算値m/z:4749.5 実測値m/z:4749.6
UPLC07v01:Rt=11.4分

【0289】

(実施例12)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.32:

【0290】

【化26】

【0291】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
MALDI01v01:計算値m/z:4777.4 実測値m/z:4777.5
UPLC法:UPLC07v01:Rt=13.2分

【0292】

(実施例13)
N^ε26-[(2S)-6-[[(2S)-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-6-[[(2S)-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-2-(ジメチルアミノ)ヘキサノイル]-[Imp⁷,Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.33:

【0293】

【化27】

【0294】

調整方法:
実施例3における化合物(14500nmol)の10%NMP(3ml)を含有する2MのAcOH水溶液に、ホルムアルデヒド(25ul、37%)を加えた。混合物を10分間撹拌し、NMP(150ul)中のα-ピコリンボラン錯体の1M溶液を加えた。混合物を40分間撹拌した。完全な変換の後、pHを、1MのNaOHで約11.5に上げ、30分間撹拌した。次いで、pHを、1NのHClで7.4に調節した。溶液を45mlのH₂Oで希釈し、アセトニトリル/水/TFAを使用して、C18、5μMカラム上の標準的RP-HPLCによって精製した。画分をUPLC、MALDIおよびLCMS法の組合せによって分析し、適正な画分をプールし、凍結乾燥した。
UPLC法:UPLC02v1:Rt=9.1分
LCMS法:LCMS01v1:Rt=2.2分、m/z:1625 (m/3)、m/z:1219 (m/4)、m/z:975 (m/5)、m/z:813 (m/6)

【0295】

(実施例14)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸,Glu²²,Glu³⁰]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.34:

【0296】

【化28】

【0297】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
UPLC法:UPLC02v1:Rt=8.5分
MALDI01v1:計算値m/z:5203.9 実測値m/z:5204.3

【0298】

(実施例15)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸,Glu²²]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.35:

【0299】

【化29】

【0300】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
UPLC法:UPLC02v1:Rt=8.6分
MALDI01v1:計算値m/z:5145.8 実測値m/z:5146.6

【0301】

(実施例16)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(3-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(3-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.36:

【0302】

【化30】

【0303】

調整方法:SPPS_P;SC_M2;CP_M1
UPLC法:UPLC02v1:Rt=8.2分
LCMS01v1:Rt=1.7分、m/z 1574(m/3)、1181(m/4)、945(m/5)、788(m/6)

【0304】

(実施例17)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-[Imp⁷,Aib⁸]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.37:

【0305】

【化31】

【0306】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
UPLC法:UPLC01v1:Rt=12.56分
LCMS法:LCMS01v1:Rt=2.1分、m/z 1578(m/3)、1184(m/4)、947(m/5)

【0307】

(実施例18)
N^ε26-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]、N^ε34-[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.38:

【0308】

【化32】

【0309】

調整方法:SPPS_P;SC_P;CP_M1
UPLC法:UPLC01v1、Rt=12.08分
LCMS法:LCMS01v1:Rt=2.0分、m/z 1579(m/3)、1185(m/4)、948(m/5)

【0310】

(実施例19)
(S)-2-ジメチルアミノ-6-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸
Chem.39:

【0311】

【化33】

【0312】

Chem.39の化合物は、下記のように調製する(さらなる詳細は下記)。

【0313】

【化34】

【0314】

出発材料、(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-6-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸(Novabiochem F04-12-0069;28.0g、59.8mmol)を1,4-ジオキサン(800mL)に懸濁させ、塩化水素の1,4-ジオキサン(7.2M、500mL)溶液を加え、このように得られた懸濁液を室温で一晩撹拌した。次いで、これを濾過し、1,4-ジオキサンおよびジエチルエーテルで十分に洗浄し、その後、真空中で乾燥させた。(S)-2-アミノ-6-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸の塩酸塩を、白色の固体として得た。
収量:23.58g(96%)

【0315】

【数3】

【0316】

上記の反応からの生成物(13.1g、32.4mmol)およびホルムアルデヒドの水溶液(概ね35%、13.2mL)を、1,4-ジオキサン/メタノールの混合物(300mL、1:1)に溶解し、このように得られた溶液を0℃に冷却した。次いで、水酸化ホウ素ナトリウム(5.50g、145mmol)を、15分以内に3つのポーションで注意深く加え、酢酸(14.4mL)を加えることによって、反応混合物のpHをpH5.5に調節した。次いで、ホルムアルデヒド水溶液の第2のポーション(概ね35%、13.2mL)を、反応混合物中に加え、水酸化ホウ素ナトリウムの別の部分(5.50g、145mmol)を、3つのポーションで注意深く加えた。反応混合物を室温に温め、さらに60分間撹拌した。HPLC-MS分析によって、出発材料の完全な変換が明らかとなり、このように、反応物を、pH7.0まで10%炭酸水素ナトリウム水溶液(概ね20mL)を加えることによってクエンチした。次いで、反応混合物を塩化ナトリウムの飽和水溶液で希釈し、クロロホルム(5×500mL)で抽出した。所望の生成物(TLC)を含有する画分を集め、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。次いで、溶液を濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を暖かいクロロホルム(300mL)に溶解し、ジエチルエーテル/ヘキサンの混合物(2:1、700mL)を加えた。形成された沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、その後、真空中で乾燥し、表題化合物を白色の粉末として得た。
収量:14.26g
LC-MS(Sunfire、4.6mm×100mm、アセトニトリル/水35:65〜100:0+0.1%FA):Rt=3.71分
LC-MS m/z:397.4(M+H)+。

【0317】

上記の3つのバッチからの集めた粗生成物(36.5g)を、RP-カラムクロマトグラフィー(Cromasil C18、100Å、13μm、7.5×41cm、流量200mL/分、アセトニトリル/水20:80〜45:55、検出、UV220nm)に供した。生成物を含有する画分を集め、凍結乾燥した。(S)-2-ジメチルアミノ-6-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸を、白色微粉として得た。
収量:20.21g

【0318】

【数4】

【0319】

LC-MS(Sunfire、4.6mm×100mm、アセトニトリル/水35:65〜100:0+0.1%FA):Rt=3.11分
LC-MS m/z:397.2(M+H)+。

【0320】

この中間生成物は、実施例13の化合物ならびに同じリンカーを有する他の化合物の合成において使用し得る。
薬理学的方法

【0321】

(実施例20)
インビトロの効力(AlphaScreen-膜)
この実施例の目的は、GLP-1誘導体のインビトロでの活性または効力を試験することである。

【0322】

実施例1〜3のGLP-1誘導体の効力を、下記のように、すなわち、ヒトGLP-1受容体を発現している膜を含有する培地におけるサイクリックAMP(cAMP)の形成の刺激として決定した。

【0323】

原理
ヒトGLP-1受容体を発現している安定的なトランスフェクトされた細胞系、BHK467-12A(tk-ts13)からの精製した形質膜を、当該のGLP-1類似体または誘導体で刺激し、cAMP生成の効力を、Perkin Elmer Life SciencesからのAlphaScreenTM cAMPアッセイキットを使用して測定した。AlphaScreenアッセイの基本的原理は、内因性cAMPと外因的に加えたビオチン-cAMPとの間の競合である。cAMPの捕捉は、アクセプタービーズに結合している特異的抗体を使用することによって達成される。

【0324】

膜の細胞培養および調製
安定的なトランスフェクトされた細胞系および高発現しているクローンを、スクリーニングのために選択した。細胞を、5%CO₂で、DMEM、5%FCS、1%Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)および0.5mg/mlの選択マーカーG418中で増殖させた。概ね80%コンフルエンスの細胞を、PBSで2回洗浄し、Versene(エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩の水溶液)と共に収集し、1000rpmで5分遠心分離し、上清を除去した。さらなるステップは、全て氷上で行った。細胞ペレットを、10mlの緩衝液1(20mMのNa-HEPES、10mMのEDTA、pH=7.4)中でUltrathuraxによって20〜30秒間ホモジナイズし、20,000rpmで15分遠心分離し、ペレットを10mlの緩衝液2(20mMのNa-HEPES、0.1mMのEDTA、pH=7.4)に再懸濁させた。懸濁液を20〜30秒間ホモジナイズし、20,000rpmで15分遠心分離した。緩衝液2への懸濁、ホモジナイゼーションおよび遠心分離を1回繰り返し、膜を緩衝液2に再懸濁させた。タンパク質濃度を決定し、膜を使用するまで-80℃で保存した。

【0325】

アッセイは、フラットボトム96ウェルプレート(Costar、カタログ番号:3693)で行った。ウェル毎の最終容量は、50μlであった。

【0326】

溶液および試薬
Perkin Elmer Life SciencesからのAlphaScreen cAMPアッセイキット(カタログ番号:6760625M);抗-cAMPアクセプタービーズ(10U/μl)、ストレプトアビジンドナービーズ(10U/μl)およびビオチン化-cAMP(133U/μl)を含有。

【0327】

AlphaScreen緩衝液、pH=7.4:50mMのTRIS-HCl(Sigma、カタログ番号:T3253);5mMのHEPES(Sigma、カタログ番号:H3375);10mMのMgCl₂、6H₂O(Merck、カタログ番号:5833);150mMのNaCl(Sigma、カタログ番号:S9625);0.01%Tween(Merck、カタログ番号:822184)。下記を、使用前にAlphaScreen緩衝液に加えた(最終濃度を示す):BSA(Sigma、カタログ番号A7906):0.1%;IBMX(Sigma、カタログ番号I5879):0.5mM;ATP(Sigma、カタログ番号A7699):1mM;GTP(Sigma、カタログ番号G8877):1uM。
cAMP標準(アッセイにおける希釈係数=5):cAMP溶液:5μLのcAMP-ストック(5mM)+495μLのAlphaScreen緩衝液。

【0328】

AlphaScreen緩衝液中の適切な希釈系列を、cAMP標準、および試験するGLP-1類似体または誘導体、例えば、GLP-1化合物の下記の8つの濃度:(10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M、10^-13Mおよび10^-14M)、ならびに、例えば、10^-6〜3×10^-11の系列のcAMPについて調製した。

【0329】

膜/アクセプタービーズ
膜は、0.6mg/mlに対応する6μg/ウェルの濃度でhGLP-1/BHK467-12A細胞から調製した(ウェル毎に使用する膜の量は変化し得る)

【0330】

「膜なし」:AlphaScreen緩衝液中のアクセプタービーズ(15μg/ml、最終)。

【0331】

「6μg/ウェルの膜」:AlphaScreen緩衝液中の膜+アクセプタービーズ(15μg/ml、最終)。

【0332】

一定分量(10μl)の「膜なし」を、cAMP標準(二連ウェルにおいてウェル毎)、ならびに陽性および陰性対照に加えた。

【0333】

一定分量(10μl)の「6μg/ウェルの膜」を、GLP-1および類似体(二連または三連ウェルにおいてウェル毎)に加えた。

【0334】

陽性対照:10μlの「膜なし」+10μlのAlphaScreen緩衝液。

【0335】

陰性対照:10μlの「膜なし」+10μlのcAMPストック溶液(50μM)。

【0336】

ビーズは直接の光に対して感受性であるため、いかなる取扱いも、暗中(できるだけ暗く)で、または緑色の光の中であった。全ての希釈は氷上で行った。

【0337】

手順
1.AlphaScreen緩衝液を作製する。
2.GLP-1/類似体/cAMP標準をAlphaScreen緩衝液に溶解および希釈する。
3.ストレプトアビジンドナービーズ(2単位/ウェル)およびビオチン化cAMP(1.2単位/ウェル)を混合することによってドナービーズ溶液を作製し、暗中室温で20〜30分インキュベートする
4.cAMP/GLP-1/類似体をプレートに加える:ウェル毎に10μl。
5.膜/アクセプタービーズ溶液を調製し、これをプレートに加える:ウェル毎に10μl。
6.ドナービーズを加える:ウェル毎に30μl。
7.プレートをアルミホイルで包み、振盪機上でRTにて3時間(非常にゆっくりと)インキュベートする。
8.AlphaScreenで計数する。各プレートをAlphaScreenにおいて計数の前に3分間プレインキュベートする。

【0338】

結果
EC₅₀[pM]値を、Graph-Pad Prismソフトウェア(バージョン5)を使用して計算したが、下記のTable 1(表1)において示す。インビトロでの全ての誘導体の効力を確認した。

【0339】

【表1】

【0340】

2つを除いた全ての誘導体は、1200pM未満のEC₅₀に対応する良好なインビトロの効力を有した。

【0341】

比較のために、Journal of Medicinal Chemistry(2000年)、第43巻、第9号、1664〜669頁の表1における化合物番号13(ビス-C12-二酸でK^26、34においてアシル化されたGLP-1(7-37))は、1200pMのEC₅₀に対応するインビトロの効力を有した。

【0342】

(実施例21)
インビトロの効力(CREルシフェラーゼ;全細胞)
この実施例の目的は、インビトロでのGLP-1誘導体の活性、または効力を試験することである。インビトロの効力は、全細胞アッセイにおけるヒトGLP-1受容体活性化の尺度である。

【0343】

実施例3〜18のGLP-1誘導体の効力を、下記のように決定した。セマグルチドを、比較のために含めた。

【0344】

原理
インビトロの効力は、レポーター遺伝子アッセイにおけるヒトGLP-1受容体の応答を測定することによって決定した。アッセイは、ヒトGLP-1受容体を発現しており、かつプロモーターにカップリングしたcAMP応答配列(CRE)のためのDNA、およびホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)のための遺伝子を含有する、安定的にトランスフェクトされたBHK細胞系において行った。ヒトGLP-1受容体が活性化されるとき、これはcAMPの産生をもたらし、これによって、ルシフェラーゼタンパク質の発現をもたらす。アッセイインキュベーションが完了するとき、ルシフェラーゼ基質(ルシフェリン)を加えたが、酵素はルシフェリンをオキシルシフェリンに変換させ、生物発光を生じさせる。発光を測定し、アッセイについての読み出し情報であった。

【0345】

アルブミンへの誘導体の結合を試験するために、血清アルブミンの非存在下で、およびかなりより高い濃度の血清アルブミンの存在下(1.0%最終アッセイ濃度)でアッセイを行った。血清アルブミンの存在下でのインビトロの効力であるEC₅₀値の増加は、血清アルブミンへの親和性を示し、動物モデルにおける試験物質の延長性薬物動態プロファイルを予測する方法を表す。

【0346】

細胞培養および調製
このアッセイにおいて使用した細胞(クローンFCW467-12A/KZ10-1)は、親細胞系としてBHKTS13を伴うBHK細胞であった。細胞は、ヒトGLP-1受容体を発現しているクローン(FCW467-12A)に由来し、CREルシフェラーゼによるさらなるトランスフェクションによって確立し、現在のクローンを得た。

【0347】

細胞培養培地において5%CO₂で細胞を培養した。これらを一定分量とし、液体窒素中に貯蔵した。各アッセイの前に、一定分量を吸い上げ、PBS中で2回洗浄し、その後、所望の濃度でアッセイ特異的緩衝液に懸濁させた。96ウェルプレートのために、懸濁液を作製して、5×10³個の細胞/ウェルの最終濃度を得た。

【0348】

材料
下記の化学物質を、アッセイにおいて使用した。Pluronic F-68(10%)(Gibco2404)、ヒト血清アルブミン(HSA)(Sigma A9511)、オボアルブミン(Sigma A5503)、DMEM w/oフェノールレッド(Gibco11880-028)、1MのHepes(Gibco15630)、Glutamax100×(Gibco35050)およびsteadylite plus(PerkinElmer6016757)。

【0349】

緩衝液
細胞培養培地は、10%FBS(ウシ胎仔血清)、1mg/mlのG418、240nMのMTX(メソトレキセート)および1%pen/strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)からなった。アッセイ培地は、DMEM w/oフェノールレッド、10mMのHepesおよび1×Glutamaxからなった。1%アッセイ緩衝液は、アッセイ培地中の2%オボアルブミン、0.2%Pluronic F-68および2%HSAからなった。0%アッセイ緩衝液は、アッセイ培地中の2%オボアルブミンおよび0.2%Pluronic F-68からなった。

【0350】

手順
1)細胞ストックを、37℃の水浴中で解凍した。
2)細胞をPBS中で3回洗浄した。
3)細胞を計数し、アッセイ培地中で5×10³個の細胞/50μl(1×10⁵個の細胞/ml)に調節した。50μl分量の細胞を、アッセイプレート中の各ウェルに移した。
4)試験化合物および参照化合物のストックを、0%HSA CREルシフェラーゼアッセイのために0%アッセイ緩衝液中で、およびHSA CREルシフェラーゼアッセイのために1%アッセイ緩衝液中で、0.2μMの濃度に希釈した。化合物を10倍に希釈し、下記の濃度:2×10^-7M、2×10^-8M、2×10^-9M、2×10^-10M、2×10^-11M、2×10^-12Mおよび2×10^-13Mを得た。各化合物のために、ブランクアッセイ緩衝液対照をまた含めた。
5)50μl分量の化合物またはブランクを、三連で希釈プレートからアッセイプレートに移した。化合物を、下記の最終濃度:1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M、1×10^-12Mおよび1×10^-13Mで試験した。
6)アッセイプレートを5%CO₂インキュベーター中で37℃にて3時間インキュベートした。
7)アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で15分間静置した。
8)100μl分量のsteadylite plus試薬を、アッセイプレートの各ウェルに加えた(試薬は、光感受性であった)。
9)各アッセイプレートをアルミ箔で覆って、これを光から保護し、室温で30分間振盪した。
10)各アッセイプレートをPackard TopCount NXT機器で読み取った。

【0351】

計算および結果
TopCount機器からのデータを、GraphPad Prismソフトウェアに移した。ソフトウェアは、各反復試験片についての値を平均化し、非線形回帰を行う。EC₅₀値をソフトウェアによって計算し、下記のTable 2(表2)において示す(pMで)。

【0352】

【表2】

【0353】

全ての誘導体は、0%HSAで200pM未満のEC₅₀に対応する良好なインビトロの効力を有した。

【0354】

比較のために、Journal of Medicinal Chemistry(2000)、第43巻、第9番、1664〜669頁の表1における化合物番号13(ビス-C12-二酸でK^26,34においてアシル化されたGLP-1(7-37))は、0%HSAで440pMのEC₅₀、1%HSAで3317pMのEC₅₀、および7.5の比(1%HSA/0%HSA)に対応するインビトロの効力を有した。

【0355】

(実施例22)
GLP-1受容体結合
この実験の目的は、GLP-1受容体へのGLP-1誘導体の結合、および結合がアルブミンの存在によってどのように潜在的に影響されるかを調査することである。これは、インビトロの実験で下記のように行われる。

【0356】

ヒトGLP-1受容体への、実施例1〜18のGLP-1誘導体の結合親和性を、受容体から¹²⁵I-GLP-1を移動させるGLP-1誘導体の能力によって測定した。アルブミンへの誘導体の結合を試験するために、低濃度のアルブミン(おおよそ0.001%-トレーサー中のその残留量に対応する)、および高濃度のアルブミン(2.0%を加える)でアッセイを行った。結合親和性、IC₅₀におけるシフトは、当該のペプチドがアルブミンに結合する指標であり、それによって動物モデルにおける当該のペプチドの潜在的な延長性の薬物動態プロファイルの予測となる。

【0357】

条件
種(インビトロ):ハムスター
生物学的エンドポイント:受容体結合
アッセイ法:SPA
受容体:GLP-1受容体
細胞系:BHK tk-ts13

【0358】

細胞培養および膜精製
安定的なトランスフェクトされた細胞系および高発現しているクローンを、スクリーニングのために選択した。細胞を、5%CO₂で、DMEM、10%FCS、1%Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)および1.0mg/mlの選択マーカーG418中で増殖させた。細胞(概ね80%コンフルエンス)を、PBS中で2回洗浄し、Versene(エチレンジアミン四酢酸テトラナトリウム塩の水溶液)と共に収集し、これに続いて、これらを1000rpmで5分間遠心分離によって分離した。細胞/細胞ペレットは、それに続くステップにおいて可能な範囲内で氷上に保持しなければならない。細胞ペレットを、適切な量の緩衝液1においてUltrathurraxで20〜30秒間ホモジナイズした(細胞の量によるが、例えば、10ml)。ホモジネートを、20000rpmで15分間遠心分離した。ペレットを10mlの緩衝液2に再懸濁させ(ホモジナイズし)、再遠心分離した。このステップを、もう1回繰り返した。このように得られたペレットを緩衝液2に再懸濁させ、タンパク質濃度を決定した。膜を、マイナス80℃で貯蔵した。
緩衝液1:20mMのNa-HEPES+10mMのEDTA、pH7.4
緩衝液2:20mMのNa-HEPES+0.1mMのEDTA、pH7.4

【0359】

結合アッセイ:
SPA:
試験化合物、膜、SPA-粒子および[¹²⁵I]-GLP-1(7-36)NH₂を、アッセイ緩衝液に希釈した。50ul(マイクロリットル)のHSA(2%HSAを含有する「高アルブミン」実験)、または緩衝液(0.001%HSAを含有する「低アルブミン」実験)を、Optiplateに加え、25ulの試験化合物を加えた。0.1〜0.2mgのタンパク質/ml(各膜調製のために好ましくは、最適化される)に対応する5〜10ugの膜タンパク質/試料を、加えた(50u1)。SPA-粒子(コムギ胚芽凝集素SPAビーズ、Perkin Elmer、#RPNQ0001)を、0.5mg/ウェル(50ul)の量で加えた。インキュベーションを、[¹²⁵I]-GLP-1]-(7-36)NH₂(49.880DPM、25ulに対応する最終濃度0.06nM)と共に開始した。プレートをPlateSealerで密封し、振盪しながら30℃で120分間インキュベートした。プレートを遠心分離(1500rpm、10分)し、Topcounterで計数した。

【0360】

アッセイ緩衝液:
50mMのHEPES
5mMのEGTA
5mMのMgC1₂
0.005%Tween20
pH7.4
HSAは、SIGMA A1653であった。

【0361】

計算
IC₅₀値は、受容体からの¹²⁵I-GLP-1の50%を移動させる濃度として曲線から読み取る。

【0362】

一般に、低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への結合は、低いIC₅₀値に対応して、できる限り良好(良好な効力)であるべきである。

【0363】

高アルブミン濃度でのIC₅₀値は、GLP-1受容体への誘導体の結合に対するアルブミンの影響の尺度である。公知のように、GLP-1誘導体はまた、アルブミンに結合する。これは一般に、血漿中のGLP-1誘導体の寿命を延長させる望ましい作用である。したがって、高アルブミンでのIC₅₀値は一般に、GLP-1受容体への結合と競合するアルブミン結合に起因する、GLP-1受容体への結合の減少に対応して、低アルブミンでのIC₅₀値より高い。

【0364】

結果
下記の結果を得た。

【0365】

【表3】

【0366】

全ての誘導体は、12.0nM未満のIC₅₀を有した(低アルブミン)。IC₅₀(高アルブミン)に関しては、3つを除いてこれらの誘導体は、1000nM未満のIC₅₀(高アルブミン)を有した。

【0367】

比較のために、Journal of Medicinal Chemistry(2000)、第43巻、第9番、1664〜669頁の表1における化合物番号13(ビス-C12-二酸でK^26,34においてアシル化されたGLP-1(7-37))は、17.7nMのIC₅₀(低アルブミン)、および908nMのIC₅₀(高アルブミン)を有した。

【0368】

(実施例23)
ミニブタにおける薬物動態学(PK)研究
この研究の目的は、ミニブタへのi.v.投与の後のGLP-1誘導体のインビボでの延長、すなわち、これらの作用時間の延長を決定することである。これは、当該の誘導体の末端半減期を決定する薬物動態学的(PK)研究において行われる。末端半減期とは一般に、最初の分布相の後に測定して、特定の血漿濃度を半減させるのにかかる期間を意味する。

【0369】

実施例3および6の誘導体は、PK研究A(下記を参照されたい)に供し、一方、実施例2および13の誘導体は、PK研究B(下記を参照されたい)に供した。

【0370】

研究A:雄性Gottingenミニブタは、Ellegaard Gottingen Minipigs(Dalmose、Denmark)から得て、概ね7〜14カ月齢および概ね16〜35kgの体重のものを研究において使用した。ミニブタを個々に収容し、SDSミニブタ食餌(Special Diets Services、Essex、UK)を1日1回または2回制限的に摂食させた。少なくとも2週間の順化の後、2つの永久中心静脈カテーテルを、各動物の下大静脈または上大静脈にインプラントした。動物は手術の後に1週間回復させ、次いで、連続的なGLP-1誘導体の投与の間の適切な洗い流し期間を伴う反復薬物動態研究のために使用した。

【0371】

動物に投与の前概ね18時間および投与の後0〜4時間絶食させたが、全期間の間に水に自由にアクセスさせた。

【0372】

GLP-1誘導体を、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に通常20〜60nmol/mlの濃度まで溶解した。化合物の静脈内注射(容量は通常1〜2nmol/kgに対応する、例えば0.033ml/kg)を、1つのカテーテルによって与え、投与後13日まで事前に定めた時点において血液を試料採取した(好ましくは、他のカテーテルによって)。血液試料(例えば0.8ml)をEDTA緩衝液(8mM)中で集め、次いで、4℃および1942Gで10分間遠心分離した。

【0373】

研究B:雄性Gottingenミニブタは、Ellegaard Gottingen Minipigs(Dalmose、Denmark)から得て、概ね5カ月齢および概ね9kgからの体重のものを、研究において使用した。ミニブタを、敷料としてわらを有する檻に収容し、各檻において6匹一緒にし、Altromin9023ミニブタ食餌(Chr.Petersen A/S、DK-4100Ringsted)を1日1回または2回制限的に摂食させた。ブタを、連続的なGLP-1誘導体の投与の間に適切な洗い流し期間を伴う反復薬物動態研究のために使用した。1週間の順化期間を与え、この間に、ミニブタを血液採取のためにあおむけに、およびi.v.投与のためにスリング中に固定されるように訓練した。動物の全ての取扱い、投与および血液採取は、訓練され熟練したスタッフによって行われる。

【0374】

動物を、投与の前に概ね18時間および投与の後に0〜4時間絶食させたが、全期間の間に水に自由にアクセスさせた。

【0375】

GLP-1誘導体を、通常20〜60nmol/mlの濃度まで、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に溶解した。化合物の静脈内注射(通常、2nmol/kg、例えば、0.1ml/kgに対応する容量)を、耳静脈に挿入したVenflonによって静脈内注射として与えたが、一方、動物を麻酔せずにスリング中に入れる。投与容量は0.1ml/kgであり、血液を投与後17日まで所定の時点において試料採取した(試料は頸静脈からシリンジで採取した)。血液試料(例えば、0.8ml)を、EDTA緩衝液(8mM)中に集め、次いで、4℃および2000Gで10分間遠心分離した。

【0376】

試料採取および分析(研究AおよびB):血漿を、ドライアイス上のMicronicチューブ中にピペットで移し、ELISAまたは同様の抗体をベースとするアッセイまたはLC-MSを使用してそれぞれのGLP-1化合物の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持した。個々の血漿濃度-時間プロファイルを、Phoenix WinNonLinバージョン6.2.(Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)でノンコンパートメントモデルによって分析し、このように得られた末端半減期(調和平均)を決定した。

【0377】

結果
実施例2、3、6、および13の化合物を試験したが、結果を下記のTable 4(表4)に示す。

【0378】

【表4】

【0379】

試験した全ての化合物は、50時間を十分に超える非常に良好な半減期を有した。

【0380】

比較のために、Journal of Medicinal Chemistry(2000)、第43巻、第9番、1664〜669頁の表1における化合物番号13(ビス-C12-二酸でK^26,34においてアシル化されたGLP-1(7-37))は、5時間の半減期を有した。

【0381】

(実施例24)
ラットにおける薬物動態学(PK)研究
この実施例の目的は、ラットにおけるインビボでの半減期を調査することである。

【0382】

ラットにおいてインビボの薬物動態研究を、下記に記載されているように、いくつかの実施例の化合物のGLP-1誘導体で行った。セマグルチドは、比較のために含めた。

【0383】

概ね400gの体重を有する同じ週齢雄性Sprague-DawleyラットをTaconic(Denmark)から得て、体重について単純な無作為化によって群毎に概ね4匹のラットで治療に割り当てた。

【0384】

GLP-1誘導体(概ね6nmol/ml)を、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に溶解した。化合物の静脈内注射(1.0ml/kg)を、意識のあるラットの尾静脈にシリンジで与えた。投与後5日間、血液を舌下静脈から試料採取した。血液試料(200μl)を、EDTA緩衝液(8mM)中に集め、次いで、4℃および10000Gで5分間遠心分離した。血漿試料を、それぞれのGLP-1化合物の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持した。

【0385】

GLP-1化合物の血漿濃度は、PoulsenおよびJensen、Journal of Biomolecular Screening、2007、第12巻、240〜247頁によってインスリンの決定について一般に記載されているように、発光酸素チャネリング免疫アッセイ(LOCI)を使用して決定した。ドナービーズは、ストレプトアビジンでコーティングし、一方、アクセプタービーズは、ペプチドの中央/C末端エピトープを認識するモノクローナル抗体とコンジュゲートさせた。N末端特異的な別のモノクローナル抗体を、ビオチン化した。3種の反応物を分析物と合わせ、2部位免疫複合体を形成させた。複合体を照射すると、ドナービーズから一重項酸素原子が放出し、これはアクセプタービーズ中に導かれ、化学発光を誘発したが、これをEnvisionプレートリーダーで測定した。光の量は、化合物の濃度と比例した。

【0386】

血漿濃度-時間プロファイルを、Phoenix WinNonLinバージョン6.2(Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を使用して分析し、半減期(T_1/2)を、各動物からの個々の血漿濃度-時間プロファイルを使用して計算した。

【0387】

結果
結果を、下記のTable 5(表5)において示す。

【0388】

【表5】

【0389】

全ての試験した化合物は、少なくとも10時間以上の半減期を有した。n=8ではあるが同じ設定において試験したセマグルチドの半減期は、11時間であった。

【0390】

(実施例25)
ブタにおける薬力学(PD)研究
この実験の目的は、ブタにおいて食物摂取量に対する実施例の化合物のカップリングの効果を調査することであった。これは下記のような薬力学(PD)研究において行い、食物摂取量を、ビヒクル治療対照群と比較して、単回用量のGLP-1誘導体の投与の1〜4日後に測定した。

【0391】

概ね3カ月齢、概ね30〜35kgの体重の雌性Landrace Yorkshire Duroc(LYD)ブタを使用した(群毎にn=3〜4)。動物は、動物施設への順化の間、概ね1週間、群で収容した。実験期間の間、動物を、個々の食物摂取量の測定のために、投与前少なくとも2日および全実験の間、個々の檻に入れた。動物に順化および実験期間の間の両方で常に、ブタ飼料(Svinefoder Danish Top)を自由に摂食させた。食物摂取量は、15分毎に飼料の重量をロギングすることによってオンラインでモニターした。使用したシステムは、Mpigwin(Ellegaard Systems、Faaborg、Denmark)であった。

【0392】

GLP-1誘導体を、0.3nmol/kg、1nmol/kg、3nmol/kg、10nmol/kgまたは30nmol/kgの用量に対応する、12nmol/ml、40nmol/ml、120nmol/ml、400nmol/mlまたは1200nmol/mlの濃度で、リン酸緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4)に溶解した。リン酸緩衝液は、ビヒクルの役割を果たす。動物に、1日目の朝にGLP-1誘導体またはビヒクル(投与容量0.025ml/kg)の単回皮下用量を投与し、投与後に食物摂取量を1日間測定する。投与の1〜4日後である各研究の最終日に、GLP-1誘導体の血漿曝露の測定のための血液試料を、麻酔した動物の心臓から採取する。動物はその後、ペントバルビトンの心臓内過剰投与によって安楽死させる。GLP-1誘導体血漿含量を、ELISAまたは同様の抗体をベースとするアッセイまたはLC-MSを使用して分析する。

【0393】

食物摂取量は、24時間の間隔(0〜24時間、24〜48時間、および48〜72時間)における平均±SEM食物摂取量として計算する。下記のTable 6(表6)において、食物摂取量は、同じ時間間隔におけるビヒクル群の食物摂取量の百分率として示す(投与量3.0nmol/kg)。

【0394】

ビヒクル群対GLP-1誘導体群における24時間の間隔における食物摂取量の統計的比較は、二元配置ANOVA反復測定、続いてボンフェローニ事後試験を使用して行う。

【0395】

結果
結果を、下記のTable 6(表6)において示す。

【0396】

【表6】

【0397】

試験した化合物は、食物摂取量の非常に満足のいく低減を示した。

【0398】

比較のために、Journal of Medicinal Chemistry(2000)、第43巻、第9番、1664〜669頁の表1における化合物番号13(ビス-C12-二酸でK^26,34においてアシル化されたGLP-1(7-37))は、同様に試験したとき、それぞれ、95%、96%、および103%の、0〜24時間、24〜48時間、および48〜72時間の食物摂取量(ビヒクルの%)を有した。

【0399】

本発明の特定の特徴を本明細書に例示および記載してきた一方で、多くの修正、置換、変化、および同等物がいまや当業者には思い当たるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲に入るものとして全てのこのような修正および変更を包含することを意図することが理解される。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]