特許 6367714 ヒトＯＸ４０に対する特異性を有する抗体分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6367714

(24)【登録日】2018年7月13日

(45)【発行日】2018年8月1日

(54)【発明の名称】ヒトＯＸ４０に対する特異性を有する抗体分子

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20180723BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20180723BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20180723BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180723BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180723BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180723BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180723BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180723BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20180723BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20180723BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/46

   C07K16/28ZNA

   C07K16/18

   C12N15/09 Z

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K39/395 D

   A61P37/08

   A61P37/06

   A61P29/00 101

   A61P19/02

   A61P11/06

   A61P11/00

   A61P1/04

   A61P3/10

   A61P37/02

   A61P13/12

   A61P21/04

   A61K39/395 N

   C12P21/00 Z

【請求項の数】47

【全頁数】43

(21)【出願番号】特願2014-540489(P2014-540489)

(86)(22)【出願日】2012年11月9日

(65)【公表番号】特表2015-506910(P2015-506910A)

(43)【公表日】2015年3月5日

(86)【国際出願番号】EP2012072325

(87)【国際公開番号】WO2013068563

(87)【国際公開日】20130516

【審査請求日】2015年10月23日

(31)【優先権主張番号】61/558,545

(32)【優先日】2011年11月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514232085

【氏名又は名称】ユーシービー バイオファルマ エスピーアールエル

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】アダムズ、ラルフ

(72)【発明者】

【氏名】バータ、パラーヴィ

(72)【発明者】

【氏名】ヘイウッド、サム フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】ハンフリーズ、デイヴィッド ポール

【審査官】 川口 裕美子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０３０１０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０９６４１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Lucy J. Holt et al.，Anti-serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs，Protein Engineering, Design & Selection，２００８年 ４月 ２日，vol. 21 no. 5，pp. 283.288

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＯＸ４０およびヒト血清アルブミンに結合する抗体融合タンパク質であって、
Ｎ末端から順に、第１重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ１）、ＣＨ１ドメイン、および第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）を含む重鎖と、
Ｎ末端から順に、第１軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）、ＣＬドメイン、および第２軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）を含む軽鎖とを含み、
Ｖ_Ｈ１およびＶ_Ｌ１が第１の抗原結合部位を形成し、かつＶ_Ｈ２およびＶ_Ｌ２が第２の抗原結合部位を形成するように、前記重鎖および軽鎖が配列しており、
前記第１の抗原結合部位により結合される抗原がヒトＯＸ４０であり、かつ前記第２の抗原結合部位により結合される抗原がヒト血清アルブミンであり、
前記重鎖の第１可変ドメイン（Ｖ_Ｈ１）が、ＣＤＲ−Ｈ１についての配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２についての配列番号２に示す配列、およびＣＤＲ−Ｈ３についての配列番号３に示す配列を含み、かつ前記軽鎖の第１可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）が、ＣＤＲ−Ｌ１についての配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２についての配列番号５に示す配列、およびＣＤＲ−Ｌ３についての配列番号６に示す配列を含み、
前記第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）が配列番号１１に示す配列を有し、かつ前記第２軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）が配列番号１２に示す配列を有し、
前記第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）および前記第２軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）がジスルフィド結合により連結されている、
抗体融合タンパク質。

【請求項2】

ＯＸ４０Ｌに対するＯＸ４０の結合をアンタゴナイズする、請求項１に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項3】

前記ＣＨ１ドメインと前記第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）との間にペプチドリンカーがある、請求項１または請求項２に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項4】

前記ＣＬドメインと前記第２軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）との間にペプチドリンカーがある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項5】

前記第１重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ１）が配列番号８に示す配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項6】

前記第１軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）が配列番号７に示す配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項7】

前記重鎖が配列番号１５に示す配列を含むか、またはそれからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項8】

前記軽鎖が配列番号１６に示す配列を含むか、またはそれからなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項9】

ヒトＯＸ４０およびヒト血清アルブミンに結合する抗体融合タンパク質であって、配列番号１５に示す配列を含む重鎖および配列番号１６に示す配列を含む軽鎖を有する、抗体融合タンパク質。

【請求項10】

請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質の重鎖および／または軽鎖をコードする単離したＤＮＡ配列。

【請求項11】

請求項１０に記載の１つまたは複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクターまたは発現ベクター。

【請求項12】

前記ベクターが、配列番号２２および配列番号２４に示す配列を含む、請求項１１に記載のベクター。

【請求項13】

請求項１１または請求項１２に記載の１つまたは複数のクローニングベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項14】

請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質の産生のための方法であって、請求項１３の宿主細胞を培養すること、および抗体融合タンパク質を単離することを含む方法。

【請求項15】

薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体の１つまたは複数と組み合わせて、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質を含む医薬組成物。

【請求項16】

少なくとも１つの他の活性成分をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

治療に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質または請求項１５もしくは請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

ＯＸ４０により媒介されるか、またはＯＸ４０レベルの増大と関連する病的障害の治療または予防のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質を含む医薬組成物。

【請求項19】

ＯＸ４０により媒介されるか、またはＯＸ４０レベルの増大と関連する病的障害の治療または予防のための薬剤の製造における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質の使用。

【請求項20】

前記病的障害が、アレルギー、ＣＯＰＤ、自己免疫疾患、関節リウマチ、喘息、移植片対宿主疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、狼瘡性腎炎、重症筋無力症、グレーブス病、移植拒絶反応、ヴェグナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、全身性硬化症、およびウイルス誘導肺炎症からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記病的障害が、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、喘息、移植片対宿主疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、狼瘡性腎炎、重症筋無力症、グレーブス病、移植拒絶反応、ヴェグナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、全身性硬化症、ウイルス誘導肺炎症、骨盤内炎症性疾患、ペーロニー病、セリアック病、腹膜炎、乾癬、血管炎、髄膜脳炎、自己免疫ブドウ膜炎、中央神経系および末梢神経系の免疫媒介炎症性障害、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、サルコイドーシス、強皮症、すい臓炎、および歯周炎からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記病的障害が、関節リウマチ、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、乾癬、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、ギランバレー症候群、アトピー性皮膚炎、グレーブス病、および特発性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項23】

前記病的障害が、関節リウマチである、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項24】

前記病的障害が、炎症性腸疾患である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項25】

前記病的障害が、クローン病、潰瘍性大腸炎及びセリアック病からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項26】

前記病的障害が、アトピー性皮膚炎である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項27】

前記病的障害が、乾癬である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項28】

前記病的障害が、全身性エリテマトーデスである、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項29】

前記病的障害が、Ｉ型糖尿病、ギランバレー症候群、グレーブス病、および特発性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項30】

前記病的障害が、アレルギーである、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項31】

前記病的障害が、喘息である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項32】

前記病的障害が、移植片対宿主疾患である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項33】

前記病的障害が、移植拒絶反応である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項34】

前記病的障害が、アレルギー、ＣＯＰＤ、自己免疫疾患、関節リウマチ、喘息、移植片対宿主疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、狼瘡性腎炎、重症筋無力症、グレーブス病、移植拒絶反応、ヴェグナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、全身性硬化症、およびウイルス誘導肺炎症からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。

【請求項35】

前記病的障害が、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、喘息、移植片対宿主疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、狼瘡性腎炎、重症筋無力症、グレーブス病、移植拒絶反応、ヴェグナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、全身性硬化症、ウイルス誘導肺炎症、骨盤内炎症性疾患、ペーロニー病、セリアック病、腹膜炎、乾癬、血管炎、髄膜脳炎、自己免疫ブドウ膜炎、中央神経系および末梢神経系の免疫媒介炎症性障害、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、サルコイドーシス、強皮症、すい臓炎、および歯周炎からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。

【請求項36】

前記病的障害が、関節リウマチ、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、乾癬、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、ギランバレー症候群、アトピー性皮膚炎、グレーブス病、および特発性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。

【請求項37】

前記病的障害が、関節リウマチである、請求項１９に記載の使用。

【請求項38】

前記病的障害が、炎症性腸疾患である、請求項１９に記載の使用。

【請求項39】

前記病的障害が、クローン病、潰瘍性大腸炎及びセリアック病からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。

【請求項40】

前記病的障害が、アトピー性皮膚炎である、請求項１９に記載の使用。

【請求項41】

前記病的障害が、乾癬である、請求項１９に記載の使用。

【請求項42】

前記病的障害が、全身性エリテマトーデスである、請求項１９に記載の使用。

【請求項43】

前記病的障害が、Ｉ型糖尿病、ギランバレー症候群、グレーブス病、および特発性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。

【請求項44】

前記病的障害が、アレルギーである、請求項１９に記載の使用。

【請求項45】

前記病的障害が、喘息である、請求項１９に記載の使用。

【請求項46】

前記病的障害が、移植片対宿主疾患である、請求項１９に記載の使用。

【請求項47】

前記病的障害が、移植拒絶反応である、請求項１９に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＯＸ４０の抗原決定基に対する特異性を有する抗体分子およびその抗体分子を含む組成物に関する。本発明はまた、抗体分子の治療的使用、組成物、および前記抗体分子を産生するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５、またはＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる）は、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、およびＣＤ４０を含むＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＯＸ４０の細胞外リガンド結合ドメインは、３つの全長システインリッチドメイン（ＣＲＤ）および部分的な４番目のＣ末端ＣＲＤで構成される（Ｂｏｄｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，２７，１９−２６）。

【0003】

ＯＸ４０のリガンドはＯＸ４０Ｌであり、３コピーのＯＸ４０が三量体リガンドに結合して、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ複合体を形成する（Ｃｏｍｐａａｎ ａｎｄ Ｈｙｍｏｗｉｔｚ，２００６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１４，１３２１−１３３０）。ＯＸ４０は膜結合型受容体である；しかしながら、可溶型アイソフォームも検出されている（Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚ，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５５，６７−７２）。可溶型の機能的重要性は現在知られていない。ＯＸ４０は休止Ｔ細胞上では発現されないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の連結後に、活性化されたＴ細胞上で一過性に発現される。ＯＸ４０のリガンドであるＯＸ４０Ｌは、ＴＮＦファミリーのメンバーであり、Ｂ細胞、マクロファージ、内皮細胞、および樹状細胞（ＤＣ）を含む、活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現される。

【0004】

ＯＸ４０は、主要な共刺激受容体であり、ＣＤ２８およびＯＸ４０の連続的な会合が最適なＴ細胞の増殖および生存に必要とされる。活性化されたＴ細胞上でＯＸ４０が連結すると、ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方に、サイトカイン産生および増殖の亢進がもたらされ（Ｇｒａｍａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６５，３０４３−３０５０，Ｂａｎｓａｌ−Ｐａｋａｌａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７２，４８２１−４２５）、進行中のＴｈ１およびＴｈ２の両応答に寄与がなされうる（Ｇｒａｍａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．，１６１，６５１０−６５１７，Ａｒｅｓｔｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，２８７４−２８８０）。ＯＸ４０共刺激は、免疫応答の初期エフェクター相を超えてＴ細胞の生存を延長し、エフェクターＴ細胞の死を阻害することによって記憶Ｔ細胞の数を増加させる。

【0005】

免疫の活性化が過度であるかまたは制御されない場合に、病的なアレルギー、喘息、炎症、自己免疫、および他の関連疾患が起こる可能性がある。ＯＸ４０は免疫応答を亢進するように機能するので、自己免疫および炎症性疾患を悪化させることがある。

【0006】

疾患モデルにおけるＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用の役割は、ＯＸ４０ノックアウトマウスで実証されてきた。多発性硬化症モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）では、疾患の臨床症状の軽減およびＣＮＳ内の炎症性浸潤の低下が、ＯＸ４０ノックアウトマウスで認められた（Ｃａｒｂｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４５，１−１１）。また、オボアルブミンでプライミングおよびチャレンジされたＯＸ４０ノックアウトマウスでは、肺炎症の縮小（好酸球増加の８０〜９０％減少）、粘液産生の低下、および気道過敏性の顕著な減弱が示された（Ｊｅｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９３，３８７−３９２）。マウスＯＸ４０リガンドに対するモノクローナル抗体は、関節リウマチのコラーゲン誘導関節炎モデル（Ｙｏｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０，２８１５−２８２３）、ＥＡＥ（Ｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６，２１０８−２１１５）、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス（Ｐａｋａｌａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４，３０３９−３０４６）、Ｔ細胞回復マウスにおける大腸炎（Ｍａｌｍｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６，６９７２−６９８１，Ｔｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８４，Ｇ５９５−Ｇ６０３）、および肺炎症モデル（Ｓａｌｅｋ−Ａｒｄａｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８，３１５−３２４，Ｈｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，３３，８６１−８６９）において、有益な効果を示している。ヒトＯＸ４０Ｌに対する抗体は、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）の肺炎症モデルにおいてプロファイリングされており、アレルゲンチャレンジ後、細気管支洗浄液における、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびエフェクター記憶Ｔ細胞のレベルの低下をもたらす（Ｓｅｓｈａｓａｙｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，１１７，３８６８−３８７８）。

【0007】

ＯＸ４０発現の増大が、いくつかの自己免疫および炎症性疾患で認められている。これには、関節リウマチ患者の滑液から単離されたＴ細胞上のＯＸ４０発現の増大が含まれる（Ｂｒｕｇｎｏｎｉ Ｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．，３７，５８４−５８５；Ｙｏｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０，２８１５−２８２３；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，１９，３１７−３２０）。同様に、ＯＸ４０発現の増大は、潰瘍性大腸炎およびクローン病の患者に由来する胃腸組織（Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｕｔ，４５，８５６−８６３；Ｓｔｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，３０，５９４−５９９）および多発性硬化症患者の活動病変（Ｃａｒｂｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４５，１−１１）において認められている。ＯＸ４０Ｌもまた、ヒト気道平滑筋（ＡＳＭ）上に検出することができ、喘息患者のＡＳＭ細胞は、健康なドナーよりもＯＸ４０Ｌ連結に対してより大きい炎症応答を示し、喘息における、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ経路の役割が示される（Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１３，６８３−６８９；Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１５，３０２−３０８）。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の末梢血から単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞が、疾患活性に関連する、上昇したＯＸ４０レベルを発現することも報告されている（Ｐａｔｓｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５，２３５−２４２）。

【0008】

アレルギー、喘息、ならびに自己免疫および炎症に関連する疾患におけるＯＸ４０の役割を考慮すると、これらの疾患の治療への１つのアプローチは、抗ＯＸ４０Ｌ抗体またはアンタゴニスト性抗ＯＸ４０抗体の使用を介して、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌシグナル伝達を遮断することである。

【0009】

抗ＯＸ４０Ｌ抗体は記載されており、例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号パンフレットを参照されたい。数多くのアゴニスト性抗ＯＸ４０抗体が記載されているが、アンタゴニスト性抗ＯＸ４０抗体は、ほとんど知られていない。ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの間の相互作用を遮断する、ウサギのポリクローナル抗マウスＯＸ４０抗体が、Ｓｔｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１８３，９７９−９８９により産生された。ヒトＯＸ４０に結合するマウスモノクローナル抗体、１３１および３１５が、Ｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，２１８５−２１９５により産生された。

【0010】

完全ヒトアンタゴニスト性抗体が、国際公開第２００７／０６２２４５号パンフレットに記載されており、これらの抗体の最高親和性は、細胞表面に発現されたＯＸ４０（活性化されたＴ細胞）に対する、１１ｎＭの親和性であった。

【0011】

ヒト化アンタゴニスト性抗体が、国際公開第２００８／１０６１１６号パンフレットに記載されており、ＯＸ４０に対して最良の親和性を有する抗体は、０．９４ｎＭの親和性を有した。

【0012】

他の抗ＯＸ４０抗体が記載されており、それらには、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販されているマウスＬ１０６（米国特許第６，２７７，９６２号明細書）およびマウスＡＣＴ３５が含まれる。

【0013】

本発明者らは、以前に、国際公開第２０１０／０９６４１８号パンフレットにおいて、高親和性のアンタゴニスト性抗ＯＸ４０抗体について記載している。

【0014】

本発明者らはまた、以前に、国際公開第２０１０／０３５０１２号パンフレットにおいて、新規の多重特異性抗体融合分子について記載しており、これは、本明細書の以下においてＦａｂ−ｄｓＦｖとも呼ばれ、本明細書の図１に図示されている。同じ出願には、分子の半減期を延長するために使用することができる有用な抗アルブミン結合可変領域も提供されている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明では、これらのアルブミン結合可変領域を改良し、国際公開第２０１０／０９６４１８号パンフレットに記載の抗ＯＸ４０抗体とＦａｂ−ｄｓＦｖ型式で組み合わせている。本発明の新規二重特異性分子は、国際公開第２０１０／０９６４１８号パンフレットに以前記載されたＦａｂ’−ＰＥＧ分子と比較すると、本明細書に記載するいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのアッセイにおいて効力が改善されている。したがって、本発明は、ＯＸ４０により媒介されるか、またはＯＸ４０レベルの増大と関連する病的障害の治療または予防のための使用に適した、ヒトＯＸ４０およびヒト血清アルブミンの両方に結合する二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明の二重特異性抗体融合物（Ｆａｂ−ｄｓＦｖ型式）を示す。

【図2】本開示による抗体に関連する特定のアミノ酸またはＤＮＡ配列を示す。

【図3】本開示による抗体に関連する特定のアミノ酸またはＤＮＡ配列を示す。

【図4】本開示による抗体に関連する特定のアミノ酸またはＤＮＡ配列を示す。

【図5】本開示による抗体に関連する特定のアミノ酸またはＤＮＡ配列を示す。

【図6】本開示による抗体に関連する特定のアミノ酸またはＤＮＡ配列を示す。

【図7】本開示による抗体に関連する特定のアミノ酸またはＤＮＡ配列を示す。

【図8】本開示による抗体に関連する特定のアミノ酸またはＤＮＡ配列を示す。

【図9a】活性化されたヒトＣＤ４^＋ＯＸ４０^＋Ｔ細胞に対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８標識Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖの結合を示す。

【図9b】活性化されたヒトＣＤ４＋、ＯＸ４０＋ Ｔ細胞上における、５％ＨＳＡ存在下でのＡ２６ Ｆａｂ’、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖ、およびＡ２６ Ｆａｂ’−ＰＥＧの結合を示す。

【図10a】ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）のアレルゲン性抽出物に曝露されたＰＢＭＣからのサイトカイン産生に対するＡ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖの効果を示す。

【図10b】Ｈｕ−ＮＳＧマウスモデルにおける、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を阻害するＡ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖの能力を示す。

【図11a】Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖによる、ヒト活性化ＣＤ４^＋ＯＸ４０^＋Ｔ細胞に対するＯＸ４０Ｌ結合の阻害を示す。

【図11b】Ａ２６ Ｆａｂ’、Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、Ａ２６ Ｆａｂ’−ＰＥＧ、および２つの対照による、ヒト活性化ＣＤ４^＋ＯＸ４０^＋Ｔ細胞に対するＯＸ４０Ｌ結合の阻害を示す。

【図12a】Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖが、ヒト混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を阻害することを示す。

【図12b】Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖが、ヒトＭＬＲ中のＩＦＮ−ガンマの産生を阻害することを示す。

【図13】Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖが、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）のアレルゲン性抽出物による二次抗原再刺激後における、活性化された（ＣＤ２５＋）ＣＤ４＋ Ｔ細胞のパーセントを低下させることを示す。

【図14A】Ｈｕ−ＮＳＧモデルにおいて、細胞移入前に投与されたＦａｂ−ＦｖおよびＦａｂ−ＰＥＧが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を用量依存的に阻害することを示す。

【図14B】Ｈｕ−ＮＳＧモデルにおいて、細胞移入前に投与されたＦａｂ−ＦｖおよびＦａｂ−ＰＥＧが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を用量依存的に阻害することを示す。

【図14C】Ｈｕ−ＮＳＧモデルにおいて、細胞移入前に投与されたＦａｂ−ＦｖおよびＦａｂ−ＰＥＧが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を用量依存的に阻害することを示す。

【図14D】Ｈｕ−ＮＳＧモデルにおいて、細胞移入前に投与されたＦａｂ−ＦｖおよびＦａｂ−ＰＥＧが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を用量依存的に阻害することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

ヒト化ＣＡ０４４＿０００２６抗ＯＸ４０抗体は、本明細書ではＡ２６と呼ばれる。

【0018】

本明細書でＦａｂ−ｄｓＦｖと呼ばれる、本発明の抗体融合分子を、図１に図示する。本発明では、Ｆａｂ部分（第１の重鎖および軽鎖の可変領域および定常ドメインを含む）がヒトＯＸ４０に結合し、ｄｓＦｖ部分（ジスルフィド結合により連結された、第２の重鎖および軽鎖の可変領域を含む）がヒト血清アルブミンに結合する。具体的には、Ｆａｂ部分は、アンタゴニスト性抗ＯＸ４０抗体に由来するＣＤＲを含み、Ｆｖ部分は、ヒト化抗アルブミン抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含み、これらのアルブミン結合可変領域は、ジスルフィド結合により連結されている。

【0019】

したがって、本発明は、ヒトＯＸ４０およびヒト血清アルブミンに結合する二重特異性抗体融合タンパク質であって、
Ｎ末端から順に、第１重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ１）、ＣＨ１ドメイン、および第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）を含む重鎖と、
Ｎ末端から順に、第１軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）、ＣＬドメイン、および第２軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）を含む軽鎖とを含み、
Ｖ_Ｈ１およびＶ_Ｌ１が第１の抗原結合部位を形成し、かつＶ_Ｈ２およびＶ_Ｌ２が第２の抗原結合部位を形成するように、前記重鎖および軽鎖が配列しており、
具体的には、第１の抗原結合部位により結合される抗原がヒトＯＸ４０であり、かつ第２の抗原結合部位により結合される抗原がヒト血清アルブミンであり、
重鎖の第１可変ドメイン（Ｖ_Ｈ１）が、ＣＤＲ−Ｈ１についての配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２についての配列番号２に示す配列、およびＣＤＲ−Ｈ３についての配列番号３に示す配列を含み、かつ軽鎖の第１可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）が、ＣＤＲ−Ｌ１についての配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２についての配列番号５に示す配列、およびＣＤＲ−Ｌ３についての配列番号６に示す配列を含み、
第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）が配列番号１１に示す配列を有し、かつ第２軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）が配列番号１２に示す配列を有し、
第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）および第２軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）がジスルフィド結合により連結されている、二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。

【0020】

抗体可変ドメインの残基は、Ｋａｂａｔらにより考案された体系に従って慣用的に番号付けられる。この体系は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ（本明細書では、以後、「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記）」と記す）に示されている。この番号付け体系が、別に指示がない限り、本明細書で使用される。

【0021】

Ｋａｂａｔの残基命名は、アミノ酸残基の直鎖番号付けと必ずしも直接対応するとは限らない。実際の直鎖アミノ酸配列は、基本可変ドメイン構造のフレームワークまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）にかかわらず、構造成分の短縮または構造成分への挿入に対応する、厳密なＫａｂａｔ番号付けよりも少ないかまたは追加のアミノ酸を含有することがある。残基の正確なＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体について、「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列と抗体配列中の相同性残基のアライメントにより決定することができる。

【0022】

重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け体系によると、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）、および残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７））によると、ＣＤＲ−Ｈ１に相当するループは残基２６〜残基３２に拡大する。したがって、他に指示がない限り、本明細書で使用する「ＣＤＲ−Ｈ１」は、残基２６〜３５を指すことを意図し、これは、Ｋａｂａｔの番号付け体系とＣｈｏｔｈｉａの位相幾何学的なループ定義の組み合わせにより説明される。

【0023】

軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け体系によると、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、および残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。

【0024】

本発明の二重特異性融合タンパク質は、国際公開第２０１０／０９６４１８号パンフレットに以前記載された抗ＯＸ４０アンタゴニスト性抗体のＦａｂ断片を含む。本明細書で使用する用語「アンタゴニスト性」は、例えば、ＯＸ４０リガンドに対するＯＸ４０の結合を遮断または実質的に低減し、それによってＯＸ４０の活性化を阻害することによって、ＯＸ４０の生物学的シグナル伝達活性を阻害および／または中和することができる抗体融合タンパク質について記載する。

【0025】

ＯＸ４０に結合する抗体を同定するための抗体のスクリーニングは、ヒトＯＸ４０に対する結合を測定するアッセイおよび／またはＯＸ４０のそのリガンドであるＯＸ４０Ｌに対する結合を遮断する能力を測定するアッセイを使用して行うことができる。結合アッセイの例にはＥＬＩＳＡがあり、これは、具体的にはプレート上に固定された、ヒトＯＸ４０とヒトＦｃとの融合タンパク質を使用し、コンジュゲートされた二次抗体を用いて融合タンパク質に結合した抗ＯＸ４０抗体を検出する。遮断アッセイの例には、ヒトＣＤ４細胞上のＯＸ４０に対するＯＸ４０リガンド融合タンパク質の結合の遮断を測定する、フローサイトメトリーベースのアッセイがある。蛍光標識された二次抗体を使用して、細胞に対するＯＸ４０リガンド融合タンパク質の結合量を検出する。このアッセイでは、上清中の抗体がＯＸ４０に対するリガンド融合タンパク質の結合を遮断するので、シグナルの低下を調べる。遮断アッセイのさらなる例には、プレートにコーティングされたＯＸ４０リガンド融合タンパク質により媒介されるナイーブヒトＴ細胞の共刺激の遮断を、トリチウム標識チミジンの取り込みを測定することにより測定するアッセイがある。

【0026】

本発明では、可変領域はヒト化されている。ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体を含む）は、非ヒト種由来の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレットを参照のこと）。ＣＤＲ全体ではなくＣＤＲの特異性決定残基のみを移入すればよい場合もあることが認識されよう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照のこと）。ヒト化抗体は、場合によっては、ＣＤＲが由来した非ヒト種に由来する１つまたは複数のフレームワーク残基をさらに含んでもよい。

【0027】

本発明では、Ｖ_Ｈ１およびＶ_Ｌ１のＣＤＲは、国際公開第２０１０／０９６４１８号パンフレットに記載される、Ａ２６として知られる抗体に由来する。したがって、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質では、重鎖の第１可変ドメイン（Ｖ_Ｈ１）は、ＣＤＲ−Ｈ１についての配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２についての配列番号２または配列番号２３に示す配列、およびＣＤＲ−Ｈ３についての配列番号３に示す配列を含み、軽鎖の第１可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）は、ＣＤＲ−Ｌ１についての配列番号４または配列番号２４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２についての配列番号５に示す配列、およびＣＤＲ−Ｌ３についての配列番号６に示す配列を含む。

【0028】

ＯＸ４０に結合し、ＯＸ４０活性を中和する抗体の能力をそれほど変化させることなく、本発明により提供されるＣＤＲに、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を施すことができることは、認識されよう。いかなるアミノ酸の置換、付加、および／または欠失の影響も、例えば、国際公開第２０１０／０９６４１８号パンフレットに記載の方法を使用して、ＯＸ４０の結合およびＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用の阻害を測定することによって、当業者が容易に試験することができる。したがって、本発明は、図２（ｃ）に示すＣＤＲＨ−１（配列番号１）、ＣＤＲＨ−２（配列番号２）、ＣＤＲＨ−３（配列番号３）、ＣＤＲＬ−１（配列番号４）、ＣＤＲＬ−２（配列番号５）、およびＣＤＲＬ−３（配列番号６）を含む、ヒトＯＸ４０に対する特異性を有する二重特異性抗体であって、例えば、１つまたは複数のＣＤＲにおいて、１つまたは複数のアミノ酸、例えば１つまたは２つのアミノ酸が、本明細書で下記に定義するような類似のアミノ酸などの別のアミノ酸に置換されている、二重特異性抗体を提供する。

【0029】

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、重鎖であって、この重鎖の第１可変ドメインが３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＨ−１の配列が、配列番号１に示す配列に対して少なくとも９０％の同一性または類似性を有し、ＣＤＲＨ−２が、配列番号２に示す配列に対して少なくとも９０％の同一性または類似性を有し、かつ／またはＣＤＲＨ−３が、配列番号３に示す配列に対して少なくとも９０％の同一性または類似性を有する、重鎖を含む。別の実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、重鎖であって、この重鎖の可変ドメインが３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＨ−１の配列が、配列番号１に示す配列に対して少なくとも９５％または９８％の同一性または類似性を有し、ＣＤＲＨ−２が、配列番号２に示す配列に対して少なくとも９５％または９８％の同一性または類似性を有し、かつ／またはＣＤＲＨ−３が、配列番号３に示す配列に対して少なくとも９５％または９８％の同一性または類似性を有する、重鎖を含む。

【0030】

「同一性」は、本明細書で使用する場合、アライメントされた配列の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。「類似性」は、本明細書で使用する場合、アライメントされた配列の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを示す。例えば、ロイシンはイソロイシンまたはバリンに置換可能である。多くの場合に互いに置換可能な他のアミノ酸としては、これらに限定されないが、
− フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
− リジン、アルギニン、およびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
− アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
− アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；および
− システインおよびメチオニン（イオウ含有側鎖を有するアミノ酸）
が挙げられる。同一性および類似性の程度は容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆ Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆ Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６，）。

【0031】

別の実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、軽鎖であって、この軽鎖の第１可変ドメインが３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＬ−１の配列が、配列番号４に示す配列に対して少なくとも９０％の同一性または類似性を有し、ＣＤＲＬ−２が、配列番号５に示す配列に対して少なくとも９０％の同一性または類似性を有し、かつ／またはＣＤＲＬ−３が、配列番号６に示す配列に対して少なくとも９０％の同一性または類似性を有する、軽鎖を含む。別の実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、軽鎖であって、この軽鎖の第１可変ドメインが３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲＬ−１の配列が、配列番号４に示す配列に対して少なくとも９５％または９８％の同一性または類似性を有し、ＣＤＲＬ−２が、配列番号５に示す配列に対して少なくとも９５％または９８％の同一性または類似性を有し、かつ／またはＣＤＲＬ−３が、配列番号６に示す配列に対して少なくとも９５％または９８％の同一性または類似性を有する、軽鎖を含む。

【0032】

一実施形態では、本発明により提供される二重特異性抗体融合タンパク質のＦａｂ部分は、配列番号１、２、３、４、５、および／もしくは６（図２（ｃ））またはその変異体の１つまたは複数を含む、ヒト化またはＣＤＲ移植抗体分子である。本明細書で使用する場合、用語「ＣＤＲ移植抗体分子」は、重鎖および／または軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖および／または軽鎖の可変領域フレームワークに移植された、ドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）由来の１つまたは複数のＣＤＲ（所望により、１つまたは複数の改変ＣＤＲを含む）を含有する抗体分子を指す。概要については、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９，１９９８を参照されたい。一実施形態では、ＣＤＲ全体を移入するのではなく、本明細書で上記に記載したＣＤＲのいずれか１つに由来する特異性決定残基の１つまたは複数のみを、ヒト抗体フレームワークに移入する（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照のこと）。一実施形態では、本明細書で上記に記載したＣＤＲの１つまたは複数に由来する特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移入する。別の実施形態では、本明細書で上記に記載したＣＤＲのそれぞれに由来する特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移入する。

【0033】

ＣＤＲまたは特異性決定残基を移植する場合、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、マウス、霊長類、およびヒトのフレームワーク領域を含む、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用することができる。適切には、本発明によるＣＤＲ移植抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域および上記に記載したＣＤＲまたは特異性決定残基の１つまたは複数を含む可変ドメインを有する。したがって、一実施形態では、可変ドメインがヒトアクセプターフレームワーク領域および非ヒトドナーＣＤＲを含む、中和ＣＤＲ移植抗体を提供する。

【0034】

本発明で使用することができるヒトフレームワークの例には、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、およびＰＯＭ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上記）がある。例えば、ＫＯＬおよびＮＥＷＭは重鎖に使用することができ、ＲＥＩは軽鎖に使用することができ、またＥＵ、ＬＡＹ、およびＰＯＭは重鎖および軽鎖の両方に使用することができる。あるいは、ヒト生殖細胞系配列を使用することができ；これらは、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／から入手可能である。

【0035】

本発明のＣＤＲ移植抗体では、アクセプターの重鎖および軽鎖は、必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、所望により、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでもよい。

【0036】

本発明の第１重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ１）に適したフレームワーク領域は、ＪＨ４を伴うヒト亜群ＶＨ３配列１−３ ３−０７に由来する。第１軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）の軽鎖に適したフレームワーク領域は、ＪＫ４を伴うヒト生殖細胞系亜群ＶＫ１配列２−１ １−０２に由来する。

【0037】

また、本発明のＣＤＲ移植抗体可変領域では、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のものと正確に同じ配列を有する必要はない。例えば、そのアクセプター鎖のクラスまたはタイプにより高頻度に存在する残基に、異常残基を変更してもよい。あるいは、アクセプターフレームワーク領域中の選択された残基を、ドナー抗体中の同じ位置に見出される残基に対応するように変更してもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４を参照のこと）。そのような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するために、必要最小限に抑えるべきである。変更する必要がありうるアクセプターフレームワーク領域中の残基を選択するためのプロトコールは、国際公開第９１／０９９６７号パンフレットに示されている。

【0038】

適切には、本発明の第１重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ１）では、アクセプター重鎖がＪＨ４を伴うヒトＶＨ３配列１−３ ３−０７を有する場合、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は、１つまたは複数のドナーＣＤＲに加えて、位置３７、７３、７８、または９４（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記）による）の少なくとも１つにドナー残基を含む。したがって、重鎖の第１可変ドメインの位置３７、７３、７８、および９４の少なくとも残基がドナー残基である二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。

【0039】

適切には、本発明の第１軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ１）では、アクセプター軽鎖がＪＫ４を伴うヒト亜群ＶＫ１配列２−１ １−０２を有する場合、軽鎖のアクセプターフレームワーク領域は、１つまたは複数のドナーＣＤＲに加えて、位置６４または７１の少なくとも１つにドナー残基を含む。したがって、軽鎖の第１可変ドメインの位置６４および７１の少なくとも残基がドナー残基である二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。

【0040】

ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち、ＣＤＲが元々由来した抗体からの残基である。

【0041】

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、重鎖であって、この重鎖の第１可変ドメイン（Ｖ_Ｈ１）が、図２（ｂ）の配列番号８に示す配列を含む重鎖を含む。

【0042】

ＯＸ４０に結合し、ＯＸ４０活性を中和する抗体融合タンパク質の能力をそれほど変化させることなく、本発明により提供される第１の重鎖および軽鎖の可変ドメインに、１つまたは複数のアミノ酸、例えば１つまたは２つのアミノ鎖の置換、付加、および／または欠失を施すことができることは、認識されよう。いかなるアミノ酸の置換、付加、および／または欠失の影響も、例えば、国際公開第２０１０／０９６４１８号パンフレットに記載の方法を使用して、ＯＸ４０の結合およびリガンドの遮断を測定することによって、当業者が容易に試験することができる。

【0043】

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、重鎖であって、この重鎖の第１可変ドメインが、図２（ｂ）の配列番号８に示す配列に対して少なくとも６０％の同一性または類似性有する配列を含む重鎖を含む。一実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質は、重鎖（Ｖ_Ｈ１）であって、この重鎖の第１可変ドメインが、配列番号８に示す配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性または類似性を有する配列を含む重鎖を含む。

【0044】

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、軽鎖であって、この軽鎖の第１可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）が、図２（ａ）の配列番号７に示す配列を含む軽鎖を含む。

【0045】

別の実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、軽鎖であって、この軽鎖の第１可変ドメインが、配列番号７に示す配列に対して少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含む軽鎖を含む。一実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質は、軽鎖であって、この軽鎖の第１可変ドメインが、配列番号７に示す配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性または類似性を有する配列を含む軽鎖を含む。

【0046】

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、重鎖であって、この重鎖の第１可変ドメイン（Ｖ_Ｈ１）が配列番号８に示す配列を含む重鎖と、軽鎖であって、この軽鎖の第１可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）が配列番号７に示す配列を含む軽鎖とを含む。

【0047】

本発明の別の実施形態では、抗体融合タンパク質は、重鎖および軽鎖であって、この重鎖の第１可変ドメインが、配列番号８に示す配列に対して少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含み、この軽鎖の第１可変ドメインが、配列番号７に示す配列に対して少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含む、重鎖および軽鎖を含む。適切には、抗体融合タンパク質は、重鎖であって、この重鎖の第１可変ドメインが、配列番号８に示す配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性または類似性を有する配列を含む重鎖と、軽鎖であって、この軽鎖の第１可変ドメインが、配列番号７に示す配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性または類似性を有する配列を含む軽鎖とを含む。

【0048】

本発明の二重特異性抗体融合タンパク質では、重鎖はＣＨ１ドメインを含み、軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかのＣＬドメインを含む。

【0049】

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、重鎖であって、この重鎖が配列番号１０に示す配列を含む重鎖と、軽鎖であって、この軽鎖が配列番号９に示す配列を含む軽鎖とを含む。

【0050】

ＯＸ４０に結合し、ＯＸ４０活性を中和する抗体の能力をそれほど変化させることなく、本発明により提供される抗体可変および／または定常ドメインに、１つまたは複数のアミノ酸、例えば１つまたは２つのアミノ鎖の置換、付加、および／または欠失を施すことができることは、認識されよう。いかなるアミノ酸の置換、付加、および／または欠失の影響も、例えば、国際公開第２０１００９６４１８号パンフレットに記載の方法を使用して、ＯＸ４０の結合およびＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用の遮断を測定することによって、当業者が容易に試験することができる。

【0051】

本発明の一実施形態では、抗体融合タンパク質は、重鎖であって、この重鎖のＶ_Ｈ１およびＣＨ１ドメインが、配列番号１０に示す配列に対して少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含む重鎖を含む。適切には、抗体融合物は、重鎖であって、この重鎖のＶ_Ｈ１およびＣＨ１ドメインが、配列番号１０に示す配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性または類似性を有する配列を含む重鎖を含む。

【0052】

一実施形態では、本発明による二重特異性抗体融合分子は、図２（ｄ）の配列番号９に示す配列を含む軽鎖を含む。

【0053】

本発明の一実施形態では、抗体融合タンパク質は、軽鎖であって、この軽鎖のＶ_Ｌ１およびＣＨ１ドメインが、配列番号９に示す配列に対して少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含む軽鎖を含む。例えば、抗体融合タンパク質は、軽鎖であって、この軽鎖のＶ_Ｌ１およびＣＬドメインが、配列番号９に示す配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性または類似性を有する配列を含む軽鎖を含む。

【0054】

本発明の二重特異性抗体融合タンパク質により結合される第２の抗原は、ヒト血清アルブミンである。この抗原は、第２の重鎖および軽鎖の可変ドメインから構成されるＦａｂ−ｄｓＦｖのＦｖ部分により結合される。本発明では、Ｖ_Ｈ２およびＶ_Ｌ２は、国際公開第２０１０／０３５０１２号パンフレットに記載される抗体の１つに由来し、その抗体の改良された、より多くのヒト移植片を表す。

【0055】

一実施形態では、第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）は、図３（ａ）の配列番号１１に示す配列を有する。

【0056】

一実施形態では、第２軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、図３（ｂ）の配列番号１２に示す配列を有する。

【0057】

したがって、本発明は、ヒトＯＸ４０およびヒト血清アルブミンに結合する二重特異性抗体融合タンパク質であって、
Ｎ末端から順に、第１重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ１）、ＣＨ１ドメイン、および第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）を含む重鎖と、
Ｎ末端から順に、第１軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）、ＣＬドメイン、および第２軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）を含む軽鎖とを含み、
Ｖ_Ｈ１およびＶ_Ｌ１が第１の抗原結合部位を形成し、かつＶ_Ｈ２およびＶ_Ｌ２が第２の抗原結合部位を形成するように、前記重鎖および軽鎖が配列しており、
第１の抗原結合部位により結合される抗原がヒトＯＸ４０であり、かつ第２の抗原結合部位により結合される抗原がヒト血清アルブミンであり、
重鎖の第１可変ドメイン（Ｖ_Ｈ１）が、ＣＤＲ−Ｈ１についての配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２についての配列番号２に示す配列、およびＣＤＲ−Ｈ３についての配列番号３に示す配列を含み、かつ軽鎖の第１可変ドメイン（Ｖ_Ｌ１）が、ＣＤＲ−Ｌ１についての配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２についての配列番号５に示す配列、およびＣＤＲ−Ｌ３についての配列番号６に示す配列を含み、
第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）が配列番号１１に示す配列を有し、かつ第２軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）が配列番号１２に示す配列を有し、
第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）および第２軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）がジスルフィド結合により連結されている、
二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。

【0058】

好ましくは、ＣＨ１ドメインおよび第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）が、リンカーを介して連結され、ＣＬドメインおよび第２軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）も、リンカーを介して連結される。任意の適切なペプチドリンカー配列を使用することができ、これらは各鎖で同じであっても異なっていてもよい。適切なリンカーは、以前に、国際公開第２０１０／０３５０１２号パンフレットに記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。適切なリンカーの例を、図３（ｃ）および（ｄ）に示す。一実施形態では、ＣＨ１ドメインと第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）との間のリンカーは、図３（ｃ）の配列番号１３に示す配列を含むかまたはその配列からなる。一実施形態では、ＣＨ１ドメインと第２重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ２）との間のリンカーは、図３（ｃ）の配列番号１４に示す配列を含むかまたはその配列からなる。一実施形態では、ＣＬドメインと第２軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ２）との間のリンカーは、図３（ｄ）の配列番号１４に示す配列を含むかまたはその配列からなる。

【0059】

一実施形態では、軽鎖中のリンカーは、１５アミノ酸配列、具体的には、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）である。

【0060】

一実施形態では、重鎖中のリンカーは、１６アミノ酸配列、具体的には、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号３０）である。

【0061】

一実施形態では、本発明は、重鎖が図３（ｅ）に示す配列（配列番号１５）を含むかまたはその配列からなり、軽鎖が図３（ｆ）に示す配列（配列番号１６）を含むかまたはその配列からなる、二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。

【0062】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体融合タンパク質は、配列番号１５に示す配列に対して少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含む重鎖と、配列番号１６に示す配列に対して少なくとも６０％の同一性または類似性を有する配列を含む軽鎖とを含む。一般には、抗体融合物は、配列番号１５に示す配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性または類似性を有する配列を含む重鎖と、配列番号１６に示す配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性または類似性を有する配列を含む軽鎖とを含む。

【0063】

本発明の抗体融合分子は、高い結合親和性、具体的には、ヒトＯＸ４０に対してピコモル濃度の親和性を有し、ヒト血清アルブミンに対してナノモル濃度の親和性を有する。親和性は、単離した天然もしくは組換えＯＸ４０または血清アルブミンあるいは適切な融合タンパク質／ポリペプチドを使用し、国際公開第２０１００９６４１８号パンフレットにおいてＯＸ４０について、また国際公開第２０１０／０３５０１２号パンフレットにおいて血清アルブミンについて記載されるように、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）を含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して測定することができる。

【0064】

一例では、親和性は、国際公開第２０１０／０９６４１８号パンフレットに記載されるように、組換えヒトＯＸ４０の細胞外ドメインを使用して測定される。一例では、使用する組換えヒトＯＸ４０の細胞外ドメインは、二量体、例えばＦｃ融合二量体である。適切には、本発明の抗体融合分子は、単離したヒトＯＸ４０に対する結合親和性が約２００ｐＭ以下である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約１００ｐＭ以下である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約５０ｐＭ以下である。一実施形態では、本発明の抗体融合分子は、結合親和性が約４０ｐＭ以下である。

【0065】

本発明の抗体融合分子は、適切には、活性化されたＴ細胞の表面上に発現されたヒトＯＸ４０に対して高い結合親和性、例えば、ナノモル濃度またはピコモル濃度の親和性を有する。親和性は、活性化されたＣＤ４^＋ＯＸ４０^＋ヒトＴ細胞を使用し、国際公開第２０１００９６４１８号パンフレットに記載される方法を含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法も使用して測定することができる。具体的には、本発明の抗体融合分子は、細胞表面に発現されたヒトＯＸ４０に対する結合親和性が約２ｎＭであるかまたはそれより良好である。一例では、本発明の抗体分子は、細胞表面に発現されたヒトＯＸ４０に対する結合親和性が約１ｎＭであるかまたはそれより良好である。別の例では、本発明の抗体分子は、細胞表面に発現されたヒトＯＸ４０に対する結合親和性が約０．５ｎＭであるかまたはそれより良好である。別の例では、本発明の抗体分子は、細胞表面に発現されたヒトＯＸ４０に対する結合親和性が約０．２ｎＭであるかまたはそれより良好である。

【0066】

適切には、本発明の抗体融合分子は、単離したヒト血清アルブミンに対する結合親和性が約５０ｎＭ以下である。適切には、本発明の抗体融合分子は、単離したヒト血清アルブミンに対する結合親和性が約２０ｎＭ以下である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約１０ｎＭ以下である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約５ｎＭ以下である。一実施形態では、本発明の抗体融合分子は、結合親和性が約２ｎＭ以下である。

【0067】

本発明の抗体融合分子は、ヒト血清アルブミンならびにカニクイザル、マウス、およびラットの血清アルブミンに結合することができる。一実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質は、カニクイザル血清アルブミンに、５ｎＭ以下の親和性で結合する。一実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質は、マウス血清アルブミンに、５ｎＭ以下の親和性で結合する。

【0068】

本発明の抗体融合分子は、ヒトＯＸ４０およびヒト血清アルブミンに、同時に結合することができる。

【0069】

有利なことには、本発明の融合分子は、ＯＸ４０に対して高い親和性を有し、さらに、治療上有用になるのに十分なｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を有する。例えば、半減期は、７〜１１日など、５〜１５日の範囲である。

【0070】

ヒトＯＸ４０および／またはヒト血清アルブミンに対する、本発明により提供される抗体融合タンパク質の親和性を、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して変更することができることは認識されよう。したがって、本発明はまた、ＯＸ４０またはヒト血清アルブミンに対する親和性が改善されている、本発明の抗体分子の変異体に関する。そのような変異体は、ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３，１９９５）、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４−７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７−８８，１９９６）、および性別ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８−２９１，１９９８）を含む、いくつかの親和性成熟プロトコールにより得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（上記）は、これらの親和性成熟法について論じている。

【0071】

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合分子は、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの間の相互作用を遮断する。この相互作用を遮断する抗体の能力を測定するのに適した数多くのアッセイが、国際公開第２０１０／０９６４１８号パンフレットに記載されている。一実施形態では、本発明は、活性化されたヒトＣＤ４＋ＯＸ４０＋ Ｔ細胞に対するヒトＯＸ４０Ｌ（最終濃度２μｇ／ｍｌで試験）の結合を、０．５ｎＭ未満の濃度で５０％阻害することができる、ヒトＯＸ４０に対する特異性を有する抗体融合タンパク質を提供する。一実施形態では、アッセイで使用するヒトＯＸ４０Ｌは天然ヒトＯＸ４０である。一実施形態では、アッセイで使用するヒトＯＸ４０は組換えヒトＯＸ４０である。

【0072】

所望により、本発明で使用するための抗体は、１つまたは複数のエフェクター分子にコンジュゲートしてもよい。エフェクター分子が単一のエフェクター分子または本発明の抗体に結合させることができる単一部分を形成するように連結された２つ以上のそのような分子を含みうることは認識されよう。エフェクター分子に連結された抗体断片を得ることが所望される場合、この抗体断片は、抗体断片を直接またはカップリング剤を介してエフェクター分子に連結する、標準の化学的または組換えＤＮＡ手順により調製することができる。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートするための手法は当技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ｐｐ．６２３−５３；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８ ａｎｄ Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３を参照のこと）。具体的な化学的手順としては、例えば、国際公開第９３／０６２３１号パンフレット、国際公開第９２／２２５８３号パンフレット、国際公開第８９／００１９５号パンフレット、国際公開第８９／０１４７６号パンフレット、および国際公開第０３／０３１５８１号パンフレットに記載のものが挙げられる。あるいは、エフェクター分子がタンパク質またはポリペプチドである場合、連結は、例えば、国際公開第８６／０１５３３号パンフレットおよび欧州特許第０３９２７４５号明細書に記載されるような組換えＤＮＡ手順を使用して達成することができる。

【0073】

用語エフェクター分子は、本明細書で使用する場合、例えば、抗悪性腫瘍薬、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体もしくは抗体断片、合成または天然のポリマー、核酸およびその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその断片、放射性核種、具体的には放射性ヨウ素、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子、および蛍光化合物またはＮＭＲもしくはＥＳＲ分光法により検出可能な化合物などのレポーター基を含む。

【0074】

エフェクター分子の例としては、細胞に有害である（例えば、死滅させる）いかなる薬剤も含めて、細胞毒素または細胞傷害性薬剤を挙げることができる。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。

【0075】

エフェクター分子としてまた、これらに限定されないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリチアマイシンまたはデュオカルマイシン）、ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。

【0076】

他のエフェクター分子として、キレート化放射性核種、例えば、^１１１Ｉｎおよび^９０Ｙ、Ｌｕ^１７７、ビスマス^２１３、カリホルニウム^２５２、イリディアム^１９２、およびタングステン^１８８／レニウム^１８８；またはこれらに限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド、およびスラミンなどの薬物を挙げることができる。他のエフェクター分子として、タンパク質、ペプチド、および酵素が挙げられる。対象となる酵素としては、これらに限定されないが、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられる。対象となるタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドとしては、これらに限定されないが、免疫グロブリン、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス菌外毒素、またはジフテリア毒素、タンパク質、例えばインスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、または組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓剤または抗血管新生剤、例えばアンジオスタチンまたはエンドスタチン、あるいは生体応答調節剤、例えばリンホカイン、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、または他の増殖因子および免疫グロブリンが挙げられる。

【0077】

他のエフェクター分子として、例えば診断に有用な検出可能な物質を挙げることができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放射断層撮影に使用するため）、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断薬として使用するために抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、一般的には、米国特許第４，７４１，９００号明細書を参照されたい。適切な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジン、およびビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、およびフィコエリトリンが挙げられ；適切な発光物質としてはルミノールが挙げられ；適切な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；また適切な放射性核種としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、および^９９Ｔｃが挙げられる。

【0078】

エフェクター分子がポリマーである場合、一般的には、合成ポリマーであっても天然ポリマーであってもよく、例えば、場合によっては置換されている直鎖または分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン、またはポリオキシアルキレンポリマー、あるいは分岐または非分岐多糖、例えばホモまたはヘテロ多糖であってもよい。

【0079】

上述の合成ポリマー上に存在してもよい具体的な任意選択の置換基としては、１つまたは複数のヒドロキシ基、メチル基、またはメトキシ基が挙げられる。

【0080】

合成ポリマーの具体的な例としては、場合によっては置換されている直鎖または分岐鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）、またはそれらの誘導体、特に、場合によっては置換されているポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体が挙げられる。

【0081】

具体的な天然ポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、またはそれらの誘導体が挙げられる。

【0082】

「誘導体」は、本明細書で使用する場合、例えば、マレイミド等のチオール選択性反応基など、反応性誘導体を含むことを意図する。反応基は、ポリマーに直接連結されてもリンカーセグメントを介して連結されてもよい。そのような基の残基は、一部の実例では、抗体断片とポリマーとの間の連結基として、生成物の一部を形成することになることは認識されよう。

【0083】

ポリマーサイズは、所望されるように変更することができるが、一般的には、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば、２００００〜４００００Ｄａなど、５０００〜４００００Ｄａの平均分子量範囲である。

【0084】

一例では、適切なエフェクター分子は、抗体融合タンパク質中にある、任意の利用可能なアミノ酸側鎖または末端のアミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を介して結合することができる。そのようなアミノ酸は、抗体断片に天然に存在していても、または組換えＤＮＡ法を使用してその断片の中に操作されてもよい（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号明細書；米国特許第５，６６７，４２５号明細書；国際公開第９８／２５９７１号パンフレットを参照のこと）。

【0085】

本発明はまた、本発明の抗体分子の重鎖および／または軽鎖をコードする単離したＤＮＡ配列を提供する。適切には、ＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖または軽鎖をコードする。本発明のＤＮＡ配列は、例えば化学処理により生成する合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者に周知の方法により得ることができる。例えば、抗体の重鎖および軽鎖の一部またはすべてをコードするＤＮＡ配列を、決定されたＤＮＡ配列から、または対応するアミノ酸配列に基づいて、所望されるように合成することができる。

【0086】

アクセプターフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者に幅広く入手可能であり、それらの公知のアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。

【0087】

分子生物学の標準的手法を使用して、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成手法を使用して、完全にまたは部分的に合成することができる。部位特異的突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手法を必要に応じて使用することができる。

【0088】

適切な配列の例を、図５（ａ）の配列番号２１；図５（ｂ）の配列番号２２；図６（ａ）の配列番号２３；図６（ｂ）の配列番号２４に提供する。配列番号２１のヌクレオチド１〜６３および配列番号２３の１〜６３は、シグナルペプチド配列ＯｍｐＡをコードするが、これは切断されて、本発明のアンタゴニスト性抗体融合分子を生じる。本発明はまた、配列番号２１または配列番号２２を含む、本発明の抗体融合タンパク質の重鎖をコードする単離したＤＮＡ配列を提供する。本発明はまた、配列番号２３または配列番号２４を含む、本発明の抗体融合分子の軽鎖をコードする単離したＤＮＡ配列を提供する。

【0089】

適切な配列の他の例を、図７（ａ）の配列番号２５：図７（ｂ）の配列番号２６；図８（ａ）の配列番号２７；図６（ｂ）の配列番号２８に提供する。配列番号２５のヌクレオチド１〜５７および配列番号２７の１〜６０は、マウス抗体Ｂ７２．３由来のシグナルペプチド配列をコードするが（Ｗｈｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１（６）４９９−５０５．）、これは切断されて、本発明のアンタゴニスト性抗体融合分子を生じる。本発明はまた、配列番号２５または配列番号２６を含む、本発明の抗体融合タンパク質の重鎖をコードする単離したＤＮＡ配列を提供する。本発明はまた、配列番号２７または配列番号２８を含む、本発明の抗体融合分子の軽鎖をコードする単離したＤＮＡ配列を提供する。

【0090】

本発明はまた、本発明の１つまたは複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクターまたは発現ベクターに関する。したがって、本発明の抗体融合タンパク質をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクターまたは発現ベクターを提供する。適切には、クローニングベクターまたは発現ベクターは、本発明の抗体分子の軽鎖および重鎖をそれぞれコードする２つのＤＮＡ配列を含む。適切には、本発明によるベクターは、配列番号２１および配列番号２３に示す配列を含む。配列番号２１のヌクレオチド１〜６３および配列番号２３の１〜６３は、ＯｍｐＡ由来のシグナルペプチド配列をコードする。

【0091】

ベクターを構築することができる一般的な方法、トランスフェクション法、および培養法が、当業者に周知である。これに関しては、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびｔｈｅ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに言及がある。

【0092】

また、本発明の抗体融合タンパク質をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列を含む、１つまたは複数のクローニングベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用することができる。細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、および他の微生物系を使用しても、真核生物、例えば哺乳動物の宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ細胞が挙げられる。

【0093】

本発明はまた、本発明による抗体融合分子の産生のための方法であって、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質の発現をもたらすのに適した条件下で、本発明のベクターを含有する宿主細胞を培養すること、および抗体分子を単離することを含む方法を提供する。

【0094】

重鎖および軽鎖の両方を含む生成物の産生のために、２つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクターと重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターを、細胞株にトランスフェクトすることができる。あるいは、軽鎖および重鎖のポリペプチドをコードする配列を含む、単一ベクターを使用してもよい。

【0095】

本発明の抗体融合タンパク質は、病的状態の治療および／または予防に有用であるため、本発明はまた、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体の１つまたは複数と組み合わせて本発明の抗体分子を含む、医薬組成物または診断組成物を提供する。したがって、薬剤製造のための、本発明の抗体融合タンパク質の使用を提供する。組成物は、薬学的に許容される担体を通常含む、滅菌医薬組成物の一部として通常供給されることになる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される補助剤をさらに含んでもよい。

【0096】

本発明はまた、医薬組成物または診断組成物の調製のための方法であって、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体の１つまたは複数と一緒に、本発明の抗体融合分子を添加および混合することを含む方法を提供する。

【0097】

抗体融合分子は、医薬組成物または診断組成物中の単独の活性成分であってもよく、あるいは他の抗体成分、例えば抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗Ｔ細胞抗体、抗ＩＦＮγ抗体、もしくは抗ＬＰＳ抗体、またはキサンチンなどの非抗体成分を含む他の活性成分を伴ってもよい。他の適切な活性成分としては、寛容を誘導することができる抗体、例えば抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ４抗体が挙げられる。

【0098】

さらなる実施形態では、本開示による抗体融合タンパク質または組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤、例えば、コルチコステロイド（プロピオン酸フルチカゾンなど）および／またはベータ−２−アゴニスト（サルブタモール、サルメテロール、もしくはフォルモテロールなど）または細胞成長および増殖の阻害剤（ラパマイシン、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈｍｉｄｅ）、メトトレキセートなど）または代替としてＣＤ２８および／もしくはＣＤ４０阻害剤と組み合わせて使用される。一実施形態では、阻害剤は小分子である。別の実施形態では、阻害剤は標的に特異的な抗体である。

【0099】

医薬組成物は、本発明の抗体融合タンパク質の治療有効量を適切に含む。用語「治療有効量」は、本明細書で使用する場合、標的疾患または症状を治療、寛解、または予防するために、あるいは検出可能な治療または予防効果を示すために必要とされる治療剤の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、通常げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、または霊長類における、細胞培養アッセイまたは動物モデルのいずれかにおいて、最初に評価することができる。また、動物モデルを使用して、投与の適切な濃度範囲および経路を決定することもできる。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。

【0100】

ヒト被験体に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、被験体の健康状態、被験体の年齢、体重、および性別、食餌、投与の時間および頻度、併用薬剤、治療に対する反応感度および忍容性／応答に依存することになる。この量は、ルーチンの実験作業により決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般的に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇになる。医薬組成物は、１用量当たり本発明の活性薬剤の所定量を含有する単位用量形態で好都合に提供することができる。

【0101】

組成物は、患者に個別に投与してもよく、または他の薬剤、薬物、またはホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次的に、または別々に）投与してもよい。

【0102】

本発明の抗体融合分子の投与用量は、治療される症状の性質、存在する炎症の程度、および抗体分子が予防的に使用されるのか既存の症状を治療するために使用されるのかに依存する。

【0103】

投与頻度は、抗体融合分子の半減期およびその効果の持続期間に依存することになる。抗体分子の半減期が短い場合には（例えば、２〜１０時間）、１日当たり１回または複数回投与することが必要となりうる。あるいは、抗体分子の半減期が長い場合には（例えば、２〜１５日）、１日１回、１週間に１回、またはさらには１もしくは２ヶ月に１回投与すればよいことになりうる。

【0104】

薬学的に許容される担体はそれ自体、組成物を投与される個体に、有害な抗体の産生を誘導してはならず、また有毒であってはならない。適切な担体は、大きく、徐々に代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子であってもよい。

【0105】

薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩などの鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、および安息香酸塩などの有機酸塩を使用してもよい。

【0106】

治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体をさらに含有してもよい。加えて、湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのような組成物中に存在してもよい。そのような担体により、医薬組成物を、患者による摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、および懸濁剤として製剤化することができるようになる。

【0107】

投与に適した形態には、例えば注射または点滴による、例えばボーラス注射または持続点滴による非経口投与に適した形態が含まれる。製剤は、注射または点滴用である場合、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンの形態をとってもよく、懸濁剤、保存剤、安定剤、および／または分散剤などの調合剤を含有してもよい。あるいは、抗体分子は、適切な滅菌液体により使用前に再構成するための乾燥形態であってもよい。

【0108】

ひとたび製剤化されたならば、本発明の組成物は、被験体に直接投与することができる。治療される被験体は動物であってもよい。しかしながら、１つまたは複数の実施形態では、組成物はヒト被験体への投与に適合する。

【0109】

適切には、本開示による製剤では、最終製剤のｐＨは、抗体または断片の等電点の値に類似することはなく、例えば、製剤のｐＨが７である場合、ｐＩは８〜９以上が適切となりうる。理論に拘束されたくはないが、これにより、安定性が改善した最終製剤が最終的に提供されうると考えられ、例えば、抗体または断片が溶液の状態に留まる。

【0110】

一態様では、有利なことには、本開示の融合分子は、全体として中性な分子に対応するｐＩを有しない。これにより、分子は凝集しにくくなる。

【0111】

本発明の医薬組成物は、これらに限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、国際公開第９８／２０７３４号パンフレットを参照のこと）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内、または直腸経路を含む、任意の数の経路により投与することができる。ハイポスプレーもまた、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる。典型的には、治療組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製することができる。注射前に液体ビヒクル中で溶液または懸濁液にするのに適した固体形態を調製してもよい。

【0112】

組成物の直接送達は、一般的には、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内への注射によって達成されるか、あるいは組織の間隙に送達されることになる。組成物はまた、病変部位に投与してもよい。投薬治療は、単回投与スケジュールであっても複数回投与スケジュールであってもよい。

【0113】

組成物中の活性成分が抗体分子であることは認識されよう。そのため、それは胃腸管中で分解を受けやすいであろう。したがって、胃腸管を使用する経路で、組成物を投与することになる場合、組成物は、分解から抗体を保護するが、ひとたび胃腸管から吸収されたならば、抗体を放出する薬剤を含有する必要がある。

【0114】

薬学的に許容される担体についての詳細な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。

【0115】

一実施形態では、製剤は吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。

【0116】

適切な吸入用調製物には、吸入用粉末、噴霧ガスを含有する計量エアゾール、または噴霧ガスを含有しない吸入用溶液が含まれる。活性物質を含有する、本開示による吸入用粉末は、もっぱら、上述の活性物質からなっても、または上述の活性物質と生理学的に許容される賦形剤との混合物からなってもよい。

【0117】

これらの吸入用粉末としては、単糖類（例えば、グルコースまたはアラビノース）、二糖類（例えば、ラクトース、スクロース、マルトース）、オリゴ糖類および多糖類（例えば、デキストラン）、多価アルコール類（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、またはこれらと互いとの混合物を挙げることができる。単糖類または二糖類は適切に使用され、ラクトースまたはグルコースは、具体的には、もっぱらではないが、その水和物の形態で使用される。

【0118】

肺中に沈着させるための粒子は、１〜９ミクロン、例えば０．１〜５μｍ、具体的には１〜５μｍなど、粒子サイズが１０ミクロン未満である必要がある。活性成分（抗体または断片など）の粒子サイズが、第一に重要である。

【0119】

吸入用エアゾールを調製するために使用することができる噴霧ガスは当技術分野で公知である。適切な噴霧ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン、またはイソブタンなどの炭化水素、およびメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン、またはシクロブタンの塩素化および／またはフッ素化誘導体などのハロ炭化水素の中から選択される。上述の噴霧ガスは、それら単独で使用しても、それらの混合物で使用してもよい。

【0120】

具体的には、適切な噴霧ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ、およびＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）およびＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）、ならびにそれらの混合物が具体的には適切である。

【0121】

噴霧ガス含有吸入用エアゾールはまた、共溶媒、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、滑沢剤、およびｐＨ調整手段など、他の成分を含有してもよい。これらの成分はすべて当技術分野で公知である。

【0122】

本発明による噴霧ガス含有吸入用エアゾールは、最大５重量％の活性物質を含有することができる。本発明によるエアゾールは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％、または０．５〜１重量％の活性成分を含有する。

【0123】

あるいは、肺への局所投与はまた、ネブライザー、例えばコンプレッサに連結されたネブライザー（例えば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｖａ．により製造された、Ｐａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒ）コンプレッサに連結されたＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（Ｒ）ネブライザー）などの装置を使用して、溶液または懸濁液の製剤を投与するのでもよい。

【0124】

本発明の抗体融合タンパク質は、溶液に分散させて、例えば、溶液または懸濁液の形態で送達させることができる。抗体融合タンパク質は、適切な生理溶液、例えば生理食塩水または他の薬理学的に許容される溶媒または緩衝液に懸濁させることができる。当技術分野で公知の緩衝液は、ｐＨが約４．０〜５．０になるように、水１ｍｌ当たり、０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、および０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有することができる。懸濁液に、例えば、凍結乾燥した抗体を使用してもよい。

【0125】

治療懸濁剤または溶液製剤はまた、１つまたは複数の賦形剤を含有してもよい。賦形剤は当技術分野で周知であり、緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、および重炭酸緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールが含まれる。溶液または懸濁液は、リポソームまたは生分解性マイクロスフェアに封入することができる。製剤は、一般的に、滅菌製造方法を使用して、実質的に滅菌の形態で提供される。

【0126】

これには、当業者によく知られた方法による、製剤に使用される緩衝溶媒／溶液の濾過、滅菌緩衝溶媒溶液中への抗体の無菌懸濁、および滅菌容器の中への製剤の調合による製造および滅菌が含まれうる。

【0127】

本開示による噴霧用製剤は、例えば、ホイル包装容器に充填された単回投与単位（例えば、密封されたプラスチック容器またはバイアル）として、提供することができる。各バイアルは、ある容量、例えば２ｍＬの溶媒／溶液緩衝剤中に単位用量を含有する。

【0128】

本明細書に開示する抗体融合タンパク質は、噴霧による送達に適する場合もある。

【0129】

本発明の抗体が遺伝子治療法の使用により投与されうることも想定される。これを達成するために、適切なＤＮＡ成分の制御下にある抗体分子の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、抗体鎖がＤＮＡ鎖から発現され、ｉｎ ｓｉｔｕで構築されるように、患者に導入する。

【0130】

本発明はまた、炎症性疾患、例えば急性または慢性炎症性疾患の制御に使用するための抗体融合分子（またはそれを含む組成物）を提供する。適切には、抗体分子（またはそれを含む組成物）は、炎症性過程を軽減するかまたは炎症性過程を防止するために使用することができる。一実施形態では、活性化Ｔ細胞、具体的には、不適当な炎症性免疫応答に関与する、例えば、そのような応答の近傍／場所に動員される活性化Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで減少させる。

【0131】

活性化Ｔ細胞の減少とは、本明細書で使用する場合、治療前または治療なしと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセント、またはそれを超えるパーセントの減少でありうる。有利なことには、本発明による抗体、断片、または組成物による治療により、患者のＴ細胞（活性化していないＴ細胞）の全身レベルを低下させることなく、活性化Ｔ細胞のレベルを低下させることが可能になりうる。これにより、副作用が少なくなり、患者のＴ細胞枯渇をおそらく防止することができる。

【0132】

本発明はまた、ＯＸ４０により媒介されるか、またはＯＸ４０レベルの増大と関連する病的障害の治療または予防に使用するための本発明の抗体融合分子を提供する。病的症状は、例えば、感染（ウイルス、細菌、真菌、および寄生虫）、感染に関連する内毒素性ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、ＣＯＰＤ、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペーロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣嚢病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫ブドウ膜炎、中央神経系および末梢神経系の免疫媒介炎症性障害、例えば多発性硬化症、狼瘡（全身性エリテマトーデスおよび狼瘡性腎炎など）、およびギランバレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、サルコイドーシス、強皮症、ヴェグナー肉芽腫症、他の自己免疫障害、膵炎、外傷（外科手術）、移植片対宿主疾患、移植拒絶反応、虚血性疾患を含む心疾患、例えば心筋梗塞およびアテローム性動脈硬化症、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯膜炎、および低酸症からなる群から選択することができる。

【0133】

一実施形態では、本発明による抗体融合タンパク質は、アレルギー、ＣＯＰＤ、自己免疫疾患、関節リウマチ、喘息、移植片対宿主疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、狼瘡性腎炎、重症筋無力症、グレーブス病、移植拒絶反応、ヴェグナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、全身性硬化症、またはウイルス誘導肺炎症の治療に使用される。

【0134】

一実施形態では、本発明による抗体融合タンパク質は、アレルギー、ＣＯＰＤ、自己免疫疾患、関節リウマチ、喘息、移植片対宿主疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、狼瘡性腎炎、重症筋無力症、グレーブス病、移植拒絶反応、ヴェグナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、全身性硬化症、およびウイルス誘導肺炎症からなる群から選択される疾患の治療に使用される。

【0135】

本発明はまた、疼痛、具体的には炎症に付随する疼痛の治療または予防に使用するための本発明による抗体融合分子を提供する。

【0136】

一実施形態では、本開示の融合分子が作用する機序には、Ｔ細胞の増殖もしくは生存の１つもしくは複数の阻害、ＴＲｅｇ生成の増強、Ｂ細胞分化の低下、および／またはサイトカイン産生の低下が含まれる。

【0137】

本発明はさらに、ＯＸ４０により媒介されるか、またはＯＸ４０レベルの増大と関連する病的障害の治療または予防のための薬剤の製造における、本発明による抗体融合分子または組成物の使用を提供する。具体的には、病的障害は関節リウマチ、喘息、またはＣＯＰＤである。

【0138】

本発明はさらに、本明細書に記載する１つまたは複数の医学的徴候の治療または予防のための薬剤の製造における、本発明による抗体分子、断片、または組成物の使用を提供する。

【0139】

本発明の抗体融合分子または組成物は、ヒトまたは動物の体内におけるＯＸ４０の効果を低減することが所望される任意の治療において利用することができる。ＯＸ４０は、体内を循環していることも、または望ましくないほど高レベルで体内の特定の部位、例えば炎症部位に局在して存在することもある。

【0140】

一実施形態では、本発明の抗体融合分子またはそれを含む組成物は、例えば本明細書に記載するような炎症性疾患の制御のために使用される。

【0141】

本発明はまた、ＯＸ４０により媒介される障害に罹患しているかまたはそのリスクがあるヒトまたは動物の被験体を治療する方法であって、本発明の抗体融合分子またはそれを含む組成物の有効量を被験体に投与することを含む方法を提供する。

【0142】

一実施形態では、実質的に精製された形態で、具体的にはエンドトキシンおよび／または宿主細胞のタンパク質もしくはＤＮＡを含有しないかまたは実質的に含有しない、ヒトＯＸ４０およびヒト血清アルブミンに結合する精製二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。

【0143】

上記で使用される精製形態は、少なくとも９０％の純度、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９重量／重量％またはそれを超える純度を指すことを意図する。

【0144】

エンドトキシンを実質的に含有しないとは、抗体製剤１ｍｇ当たり１ＥＵ以下、例えば製剤１ｍｇ当たり０．５または０．１ＥＵのエンドトキシン含量を指すことを意図する。

【0145】

宿主細胞のタンパク質またはＤＮＡを実質的に含有しないとは、一般的に、抗体製剤１ｍｇ当たり４００μｇ以下、例えば１ｍｇ当たり１００μｇ、具体的には１ｍｇ当たり２０μｇの宿主細胞のタンパク質および／またはＤＮＡの含量を適宜指すことを意図する。

【0146】

本発明の抗体融合分子はまた、診断、例えばＯＸ４０が関与する疾患状態のｉｎ ｖｉｖｏ診断およびイメージングに使用することができる。

【0147】

有利なことには、本融合分子は、具体的に、スーパーアゴニストではなく、かつサイトカインストームを引き起こす可能性が低いので、適切な治療用量でのヒトへの投与について安全であると考えられる。

【0148】

スーパーアゴニストは、本明細書で使用する場合、ＴＣＲの会合がない状態でＴ細胞を拡大増殖させる抗体を指す。

【0149】

一実施形態では、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖにより、分裂指数が低下し、集団内で分裂に入っている細胞がほとんどないことが示される；この効果は、おそらくＯＸ４０を発現しているＮＫ細胞により媒介される。分裂指数は、もとの集団内の細胞が行った細胞分裂の平均数を表し、分裂していない細胞を含む。

【0150】

増殖指数は、応答する集団のみの増殖を反映し、一実施形態では、この尺度を使用するＡ２６ Ｆａｂ−Ｆｖの阻害効果は、相対的に低下する。

【0151】

本明細書の文脈における含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味することを意図する。

【0152】

技術的に適切である場合には、本発明の実施形態を組み合わせることができる。

【0153】

実施形態は、本明細書では、特定の特徴／要素を含むものとして記載される。本開示はまた、前記特徴／要素からなるかまたはそれらから本質的になる実施形態を分割するように拡張される。

【0154】

本発明を、以下の実施例において、例示のみを目的としてさらに説明し、添付する図にも言及する。

【実施例】

【0155】

図の詳細：
図１：本発明の二重特異性抗体融合タンパク質、Ｆａｂ−ｄｓＦｖと呼ばれる。
図２：
ａ）抗体Ａ２６の軽鎖Ｖ領域（配列番号７）
ｂ）抗体Ａ２６の重鎖Ｖ領域（配列番号８）
ｃ）抗体Ａ２６のＣＤＲＨ１（配列番号１）、ＣＤＲＨ２（配列番号２）、ＣＤＲＨ３（配列番号３）、ＣＤＲＬ１（配列番号４）、ＣＤＲＬ２（配列番号５）、およびＣＤＲＬ３（配列番号６）。
ｄ）抗体Ａ２６ Ｆａｂ成分の軽鎖（配列番号９）
ｅ）抗体Ａ２６ Ｆａｂ成分の重鎖（配列番号１０）
図３
ａ）抗アルブミンＦｖ成分６４５ｇＨ５の重鎖（配列番号１１）
ｂ）抗アルブミンＦｖ成分６４５ｇＬ４の軽鎖（配列番号１２）
ｃ）リンカー１（配列番号１３）
ｄ）リンカー２（配列番号１４）
ｅ）Ｆａｂ−ｄｓＦｖ重鎖（配列番号１５）
ｆ）Ｆａｂ−ｄｓＦｖ軽鎖（配列番号１６）
図４
ａ）６４５ｇ１重鎖可変ドメイン（配列番号１７）
ｂ）６４５ｇ１軽鎖可変ドメイン（配列番号１８）
ｃ）Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ ６４５ｇＨ１（配列番号１９）
ｄ）Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ ６４５ｇＬ１（配列番号２０）
図５
ａ）ＯｍｐＡリーダーを含むＦａｂ−ｄｓＦｖの重鎖をコードするＤＮＡ（配列番号２１）
ｂ）ＯｍｐＡリーダーを含まないＦａｂ−ｄｓＦｖの重鎖をコードするＤＮＡ（配列番号２２）
図６
ａ）ＯｍｐＡリーダーを含むＦａｂ−ｄｓＦｖの軽鎖をコードするＤＮＡ（配列番号２３）
ｂ）ＯｍｐＡリーダーを含まないＦａｂ−ｄｓＦｖの軽鎖をコードするＤＮＡ（配列番号２４）
図７
ａ）Ｂ７２．３リーダーを含むＦａｂ−ｄｓＦｖの重鎖をコードするＤＮＡ（配列番号２５）
ｂ）Ｂ７２．３リーダーを含まないＦａｂ−ｄｓＦｖの重鎖をコードするＤＮＡ（配列番号２６）
図８
ａ）Ｂ７２．３リーダーを含むＦａｂ−ｄｓＦｖの軽鎖をコードするＤＮＡ（配列番号２７）
ｂ）Ｂ７２．３リーダーを含まないＦａｂ−ｄｓＦｖの軽鎖をコードするＤＮＡ（配列番号２８）
図９ａは、活性化されたヒトＣＤ４^＋ＯＸ４０^＋Ｔ細胞に対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８標識Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖの結合を示す。
図９ｂは、活性化されたヒトＣＤ４＋、ＯＸ４０＋ Ｔ細胞上における、５％ＨＳＡ存在下でのＡ２６ Ｆａｂ’、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖ、およびＡ２６ Ｆａｂ’−ＰＥＧの結合を示す。
図１０ａは、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）のアレルゲン性抽出物に曝露されたＰＢＭＣからのサイトカイン産生に対するＡ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖの効果を示す。
図１０ｂは、Ｈｕ−ＮＳＧマウスモデルにおける、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を阻害するＡ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖの能力を示す。
図１１ａは、Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖによる、ヒト活性化ＣＤ４^＋ＯＸ４０^＋Ｔ細胞に対するＯＸ４０Ｌ結合の阻害を示す。
図１１ｂは、Ａ２６ Ｆａｂ’、Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、Ａ２６ Ｆａｂ’−ＰＥＧ、および２つの対照による、ヒト活性化ＣＤ４^＋ＯＸ４０^＋Ｔ細胞に対するＯＸ４０Ｌ結合の阻害を示す。
図１２ａは、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖが、ヒト混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を阻害することを示す。
図１２ｂは、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖが、ヒトＭＬＲ中のＩＦＮ−ガンマの産生を阻害することを示す。
図１３は、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖが、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）のアレルゲン性抽出物による二次抗原再刺激後における、活性化された（ＣＤ２５＋）ＣＤ４＋ Ｔ細胞のパーセントを低下させることを示す。
図１４は、Ｈｕ−ＮＳＧモデルにおいて、細胞移入前に投与されたＦａｂ−ＦｖおよびＦａｂ−ＰＥＧが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を用量依存的に阻害することを示す。

【0156】

ＤＮＡ操作および全般的方法
コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を形質転換およびルーチンの培養増殖に使用した。ＤＮＡ制限酵素および修飾酵素は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ．およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。プラスミドの調製は、Ｍａｘｉ Ｐｌａｓｍｉｄ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２１６５）を使用して行った。ＤＮＡシークエンシング反応は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｂｉｇ Ｄｙｅターミネーターシークエンシングキット（カタログ番号４３０４１４９）を使用して行い、ＡＢＩ ３１００自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で実行した。データは、プログラムＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅｃｏｄｅｓ）を使用して分析した。オリゴヌクレオチドは、ＳｉｍｇａまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。最初のＶ領域配列をコードする遺伝子は、ＤＮＡ２．０による自動合成アプローチにより構築し、オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発により移植バージョンを生成するように改変した。Ｆａｂ−Ｆｖの濃度は、プロテイン−ＧベースのＨＰＬＣ法により測定した。

【0157】

実施例１
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖにおける、６４５の異なるヒト化移植片の生成および分析
本発明者らは、以前に、国際公開第２０１０／０３５０１２号パンフレットにおいて、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ抗体型式（図１）（時として、本明細書では簡単にＦａｂ−Ｆｖと呼ばれる）および「６４５ｇＨ１ｇＬ１」として知られるヒト化抗アルブミン抗体について記載した。本発明者らはまた、以前に、国際公開第２０１０／０９６４１８号パンフレットにおいて、「Ａ２６」として知られるヒト化アンタゴニスト性抗ＯＸ４０抗体およびそのＰＥＧ化Ｆａｂ’断片の生成について記載した。ここで、本発明者らは、６４５ｄｓｇＨ５ｇＬ４として知られる抗体「６４５」の新規の改良されたヒト化移植片の生成、およびＦｖ成分にその移植片を、またＦａｂ成分に「Ａ２６」可変領域を組み込むＦａｂ−ｄｓＦｖ抗体分子の生成について記載する。Ａ２６の可変領域を、図２ａおよびｂ（配列番号７および８）に示す。Ａ２６の可変領域配列と定常領域配列を合わせて、図２ｄおよびｅ（配列番号９および１０）に示す。６４５ｇＨ１およびｇＬ１の配列を、図４（ａ）および（ｂ）（配列番号１７および１８）に示す。用語Ｆａｂ’−ＰＥＧまたはＡ２６ Ｆａｂ’−ＰＥＧを使用する場合、これは、国際公開第２０１０／０９６４１８号パンフレットに記載するＡ２６ Ｆａｂ−４０Ｋ ＰＥＧ’を指す。

【0158】

１．１．Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ１ｇＬ１）およびＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ５ｇＬ４）Ｇ４Ｓリンカープラスミドの構築
Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＬ１）軽鎖の全コード領域（配列番号２０）を、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターおよびＳＶ４０Ｅ ｐｏｌｙＡ配列の制御下にあるＵＣＢ哺乳動物発現ベクターにクローニングした。６４５ｄｓＦｖ（ｇＬ１）の軽鎖可変領域（配列番号１８）を、オーバーラッピングＰＣＲ法により６４５ｄｓＦｖ（ｇＬ４）（配列番号１２）に突然変異させた。Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ１）重鎖の全コード領域（配列番号１９）を、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターおよびＳＶ４０Ｅ ｐｏｌｙＡ配列の制御下にあるＵＣＢ哺乳動物発現ベクターにクローニングした。６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ１）の重鎖可変領域（配列番号１７）を、オーバーラッピングＰＣＲ法により６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ５）（配列番号１１）に突然変異させた。構築物をシークエンシングにより確認した。両方の構築物とも、図３（ｄ）の配列番号１４に示す３×Ｇ４Ｓリンカーを含有した。

【0159】

１．２．Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ１ｇＬ１）およびＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ５ｇＬ４）の哺乳動物発現
ＨＥＫ２９３細胞に重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミドを、製造業者の説明書に従い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトした。手短に言えば、２５μｇの重鎖プラスミドおよび２５μｇの軽鎖プラスミドを、１００μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎおよび１７００μｌのＯｐｔｉｐｒｏ培地と共に、室温で２０分間インキュベートした。次いで、この混合物を、５０ｍｌの懸濁液中の５０×１０^６ ＨＥＫ２９３細胞に加え、３７℃で振盪しながら６日間インキュベートした。６日後に、細胞を除去するために、１５００×ｇで１０分間遠心分離して、上清を集めた後、０．２２μｍの滅菌濾過を行った。

【0160】

１．３ Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ１ｇＬ１）およびＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ５ｇＬ４）のプロテイン−Ｇ精製
０．２２μｍで濾過した上清の約５０ｍｌを、１０ｋＤａ分子量のカットオフ膜およびスイングアウトローターでの４０００×ｇの遠心分離を装着したＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して、約２ｍｌに濃縮した。１．８ｍｌの濃縮した上清を、２０ｍＭリン酸塩、４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４で平衡化した１ｍｌのＧａｍｍａｂｉｎｄ Ｐｌｕｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに１ｍｌ／分で供した。カラムを、２０ｍＭリン酸塩、４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４で洗浄し、結合した物質を、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７で溶出した。溶出ピークを回収し、２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．５でｐＨを約ｐＨ７に調整した。ｐＨを調整した溶出液を、１０ｋＤａ分子量のカットオフ膜およびスイングアウトローターでの４０００×ｇの遠心分離を装着したＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して、２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４に濃縮およびダイアフィルトレーションした。

【0161】

１．４．Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ１ｇＬ１）およびＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ５ｇＬ４）のサイズ排除分析
プロテイン−Ｇで精製した試料を、サイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、ＰＢＳ ｐＨ７．４の定組成勾配、１ｍｌ／分で展開して、試料を分離した。ピーク検出を２８０ｎｍで行い、見かけの分子量を、既知分子量のタンパク質対溶出量の標準曲線と比較して算出した。６４５ｄｓＦｖのヒト化移植片をｇＨ１ｇＬ１からｇＨ５ｇＬ４に変更すると、ｄｓＦｖの熱安定性（データを示さず）も、ＨＳＡに対するｄｓＦｖの結合親和性（データを示さず）もまったく変化することなく、発現するＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのモノマーパーセントが５９％から７１％に増大した（１２％の増大）。

【0162】

実施例２
２．１ ＯＸ４０に結合するＡ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ（６４５ｇＨ５ｇＬ４）についてのＢＩＡｃｏｒｅ動力学
この実施例および以後のすべての実施例では、Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ ６４５ｇＨ５ｇＬ４は、配列番号１５（図３（ｅ））に示す重鎖配列、および配列番号１６（図３（ｆ））に示す軽鎖配列を有する、すなわち、重鎖は図３（ｃ）の配列番号１３に示すＧ４Ｓ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｓリンカーを含有した。

【0163】

ＢＩＡ（生体分子相互作用分析）を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。Ｆ（ａｂ’）_２断片特異的なＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２ Ｆｒａｇｍｅｎｔヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、アミンカップリング化学によって、約５０００反応単位（ＲＵ）の捕捉レベルまでＣＭ５センサーチップ上に固定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ランニング緩衝液として１０μＬ／分の流速で使用した。０．５μｇ／ｍＬのＡ２６ Ｆａｂ’または１μｇ／ｍＬのＡ２６Ｆａｂ−ｄｓＦｖの１０μＬ注入を、固定化抗ヒトＩｇ−ＧＦ（ａｂ’）_２による捕捉のために使用した。ヒトＯＸ４０を、種々の濃度（２５ｎＭ〜１．５６２５ｎＭ）にて、３０μＬ／分の流速で、捕捉されたＡ２６上で滴定した。１０μＬ／分の流速で、５０ｍＭ ＨＣｌを２×１０μＬ注入した後、５ｍＭ ＮａＯＨを５μＬ注入することにより、表面を再生した。標準手順に従って、バックグラウンドを除去した結合曲線を、Ｔ２００ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．０）を使用して分析した。フィッティングアルゴリズムにより動力学的パラメーターを決定した。

【0164】

【表1】

【0165】

２．２ アルブミンに結合するＡ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ（６４５ｇＨ５ｇＬ４）についてのＢＩＡｃｏｒｅ動力学
ＢＩＡ（生体分子相互作用分析）を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。Ｆ（ａｂ’）_２断片特異的なＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２ Ｆｒａｇｍｅｎｔヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、アミンカップリング化学によって、約５０００反応単位（ＲＵ）の捕捉レベルまでＣＭ５センサーチップ上に固定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ランニング緩衝液として１０μＬ／分の流速で使用した。０．７５μｇ／ｍＬのＦａｂ−Ｆｖの１０μＬ注入を、固定化抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）_２による捕捉のために使用した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、およびカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）血清アルブミン（ＣＳＡ）を、種々の濃度（５０ｎＭ〜６．２５ｎＭ）にて、３０μＬ／分の流速で、捕捉されたＦａｂ−Ｆｖ上で滴定した。１０μＬ／分の流速で、５０ｍＭ ＨＣｌを２×１０μＬ注入した後、５ｍＭ ＮａＯＨを５μＬ注入することにより、表面を再生した。標準手順に従って、バックグラウンドを除去した結合曲線を、Ｔ２００ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．０）を使用して分析した。フィッティングアルゴリズムにより動力学的パラメーターを決定した。

【0166】

【表2】

【0167】

２．３ ＯＸ４０およびアルブミンに同時に結合するＡ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ（６４５ｇＨ５ｇＬ４）の実証
Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖに対する、ヒトＯＸ４０およびヒト血清アルブミンの同時結合を評価した。Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖアルブミン結合についてのＢｉａｃｏｒｅ動力学のための方法で述べたようにセンサーチップ表面に、Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ構築物を捕捉した。５０ｎＭ ＨＳＡ、２５ｎＭ ＯＸ４０、または最終濃度が５０ｎＭ ＨＡＳおよび２５ｎＭ ＯＸ４０となる混合溶液を、捕捉されたＡ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ上で別々に滴定した。ＨＳＡ／ＯＸ４０混合溶液に対する結合応答は、個別の注入応答の合計に等しかった。これにより、Ｆａｂ−ｄｓＦｖはヒトＯＸ４０およびＨＳＡの両方に同時に結合できることが確認される。

【0168】

【表3】

【0169】

２．４ Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ（６４５ｇＨ５ｇＬ４）の細胞ベースの親和性
方法：
ヒト活性化ＣＤ４^＋ＯＸ４０^＋Ｔ細胞に対するＡ２６ Ｆａｂ−Ｆｖの結合
フィコール勾配上で分離することにより、ＰＢＭＣを単離し、４μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌにより、３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度で３日間活性化した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、磁気ビーズ（ヒトに対するＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キットＩＩ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ネガティブセレクションにより単離した。約１×１０^５細胞を、Ｆａｃｓ緩衝液（ＰＢＳ／０．２％ ＢＳＡ／０．０９％ ＮａＮ３）または５％ＨＳＡを添加したＦａｃｓ緩衝液のいずれかの中で、抗体の存在下、４℃でインキュベートした。抗体の最終濃度は、４８ｎＭ〜０．０００５ｎＭの範囲であった。細胞をＰＢＳ中で洗浄した後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、フローサイトメトリーにより分析した。２つの滴定データセット、すなわち、Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖによるデータセットと、非特異的な結合を測定するための、関係のない対照Ｆａｂ−Ｆｖによる第２のデータセットとを、両方の緩衝液条件で生成させた。結合した抗体のモル数を、異なるが既知量の蛍光色素から構成されるビーズの使用によって作成した標準曲線から内挿した値を使用して算出した。細胞およびビーズのフローサイトメトリー分析における幾何平均蛍光値を決定した。非特異的結合をＡ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ値から差し引き、こうして作成した特異的結合曲線を、１部位結合式を使用する非線形回帰（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標））により分析して、Ｋ_Ｄを決定した。

【0170】

細胞表面に発現した抗原に対するＡ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖの親和性を決定するために、活性化されたＣＤ４^＋ＯＸ４０^＋Ｔ細胞およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖを使用して飽和結合実験を行った。一連の抗体濃度にわたって平衡化した、受容体に対する抗体の特異的結合を使用し、結合曲線のいかなる時点においても、抗体の極めてわずかな割合のみが受容体に結合していると仮定して、Ｋ_Ｄを決定した。

【0171】

平衡結合は、以下の式を使用して記載される：

【化1】

受容体と抗体の結合速度＝ｋ_ｏｎ×［受容体_遊離］×［抗体_遊離］。
受容体−抗体複合体の解離速度＝ｋ_ｏｆｆ×［受容体−抗体］
平衡時には、結合速度と解離速度は等しく、結合等温線を記載する式を導出することができる；片対数プロット上で、結合はシグモイド状である。Ｋ_Ｄはｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎにより定義され、最大結合の半分が生じる濃度として結合曲線から算出することができる。

【0172】

活性化されたヒトＣＤ４^＋ＯＸ４０^＋Ｔ細胞に対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖの結合を、５−ｌｏｇ濃度範囲にわたりフローサイトメトリーにより測定した。Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖについての代表的な結合曲線を図９Ａに示す。５つの異なるドナーに由来する活性化細胞で得られた平均Ｋ_Ｄ値は、１４５ｐＭである。Ａ２６ Ｆａｂ、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖ、およびＡ２６ Ｆａｂ−ＰＥＧについての比較結合曲線を、図９Ｂに示す。グラフは、異なるドナーを各実験で使用する４回または５回の実験の平均を表す。

【0173】

フィコール勾配上で分離することにより、ＰＢＭＣを単離し、４μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌにより、３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度で３日間活性化した。これに続いて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、磁気ビーズ（ヒトに対するＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キットＩＩ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ネガティブセレクションにより単離した。約１×１０^５細胞を、Ｆａｃｓ緩衝液（ＰＢＳ／０．２％ ＢＳＡ／０．０９％ ＮａＮ３）または５％ＨＳＡを添加したＦａｃｓ緩衝液のいずれかの中で、抗体の存在下、４℃でインキュベートした。抗体の最終濃度は、４８ｎＭ〜０．０００５ｎＭの範囲であった。細胞をＰＢＳ中で洗浄した後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、フローサイトメトリーにより分析した。各Ａ２６型式に対するアイソタイプ対照抗体についての滴定データセットも作成して、非特異的結合を決定した。結合した抗体のモル数を、異なるが既知量の蛍光色素から構成されるビーズによって作成した標準曲線から内挿した値を使用して算出した。細胞およびビーズのフローサイトメトリー分析における幾何平均蛍光値を決定した。非特異的結合をＡ２６ Ｆａｂ−Ｆｖ値から差し引き、こうして作成した特異的結合曲線を、１部位結合式を使用する非線形回帰（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標））により分析して、Ｋ_Ｄを決定した。

【0174】

【表4】

【0175】

実施例３：Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖは、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）のアレルゲン性抽出物に曝露されたＰＢＭＣからのサイトカイン産生を調節する。
フィコール勾配上で分離することにより、アレルギーのボランティアからＰＢＭＣを単離し、精製したＰＢＭＣを、９６ウェル丸底プレートにおいて、ウェル当たり２００μＬの最終容積で、試験抗体（５０μｇ／ｍＬ〜０．０００５μｇ／ｍＬの濃度範囲）の存在下、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）のアレルゲン性抽出物に曝露した。３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度で６日間インキュベートした後、上清を回収し、ＭＳＤによりＩＬ−１３含量についてアッセイした。図１０（ａ）のグラフに、４人の中から１人の代表的なドナーの代表的なデータを示す。ここで、ＩＬ−１３産生の阻害に対する平均ＥＣ５０は０．８７ｎＭ（０．６ｎＭ〜１．０７ｎＭの範囲）であった。

【0176】

【表5】

【0177】

Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖは、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）のアレルゲン性抽出物による二次抗原再刺激後における、活性化された（ＣＤ２５^＋）ＣＤ４^＋Ｔ細胞のパーセントを低下させる。
アレルギー性ドナー由来のＣＤ４^＋Ｔ細胞を、抗体非存在下または１０μｇ／ｍｌのＡ２６ Ｆａｂ’ＰＥＧ、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖ、もしくは対照Ｆａｂ（Ａ３３ Ｆａｂ’）の存在下、２５μｇ／ｍｌのヤケヒョウヒダニのアレルゲン性抽出物（Ｇｒｅｅｒ）および自己由来のＡＰＣによりｉｎ ｖｉｔｒｏで７日間刺激した。細胞を洗浄し、３日間休止した後、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）の抽出物で先のように再刺激した（図１３）。３日後、細胞を洗浄し、表面のＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ２５について蛍光染色した。次いで、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ）上でフローサイトメトリーにより細胞を分析した。生きているリンパ球およびＣＤ３^＋ＣＤ４^＋発現に関して細胞をゲート制御した後、分析を行った。データは、平均値を含むｎ＝３ドナーを表す。ｎ．ｓ、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖ’を対照Ｆａｂと比較した（対応のある両側Ｔ検定を使用して有意性を評価した）。

【0178】

実施例４：Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖは、Ｈｕ−ＮＳＧマウスモデルにおいて、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を阻害する。
１×１０^７のヒトＰＢＭＣを腹腔内に移植する１日前に、０．０３、０．３、３、または３０ｍｇ／ｋｇのＡ２６ Ｆａｂ−Ｆｖをマウスにｓ．ｃ投与した。１４日後に、終末麻酔下で心穿刺によりマウスを出血させ、次いで、頸椎脱臼により屠殺した。次いで、血液中のヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋細胞の数を、ＦＡＣＳ分析により測定した（図１０（ｂ））。データ（ｎ＝１０）を平均±ＳＥＭとして表し、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉポスト検定と一元配置分散分析により統計分析を行った。値は％阻害±ＳＥＭを表す。結果を図１４に示す。Ｈｕ−ＮＳＧモデルにより、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖが、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトＴ細胞増殖を顕著に阻害することが実証され、Ｔ細胞媒介病態の阻害のための実行可能な治療候補物質としてＡ２６ Ｆａｂ−Ｆｖが支持される。加えて、Ｆａｂ−Ｆｖ型式は、Ｆａｂ’ＰＥＧ型式よりも低用量でより大きな効果をもたらした。ドナーＴ細胞のこの異種増殖応答の低下は、Ａ２６ Ｆａｂ−ＦｖがＧＶＨＤのための実行可能な治療になりうるという補強証拠を提供する可能性がある。

【0179】

実施例５：リガンド遮断能
細胞表面に発現したＯＸ４０と組換えＯＸ４０Ｌとの間の相互作用を遮断するＡ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖの能力を、フローサイトメトリーベースのリガンド遮断アッセイを使用して測定した。手短に言えば、活性化されたヒトＣＤ４^＋ＯＸ４０^＋Ｔ細胞を、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖの滴定と共にプレインキュベートした。続いて、組換えＯＸ４０Ｌを細胞に加え、Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖの存在下で結合させた。次いで、結合したＯＸ４０Ｌの割合を、標識二次試薬を使用して、フローサイトメトリーにより検出した。図１１は、３人の別個のドナーからのデータを合わせて表す阻害曲線を示し、Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖがＯＸ４０Ｌ結合を完全に遮断することができることを実証する。組換えＯＸ４０Ｌ結合の阻害に対する平均ＩＣ５０は０．４４ｎＭ（ｎ＝３ドナー）であった。

【0180】

方法：Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖによる、ヒト活性化ＣＤ４^＋ＯＸ４０^＋Ｔ細胞に対するＯＸ４０Ｌ結合の阻害
フィコール勾配上で分離することによりＰＢＭＣを単離し、４μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ）により、３７℃、５％ＣＯ_２、１００％湿度で３日間活性化した。次いで、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キットＩＩ）を使用して、ネガティブセレクションにより培養物からＣＤ４^＋Ｔ細胞を精製した。２×１０^５のＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ａ２６ Ｆａｂ−ｄｓＦｖ（最終濃度範囲１０μｇ／ｍＬ〜０．００００５６μｇ／ｍＬ（１３６．６ｎＭ〜０．０００７６５ｎＭ））の存在下、４℃で３０分間インキュベートした。ＯＸ４０Ｌ（ビオチン化ＣＤ２５２ ｍｕＣＤ８、Ａｎｃｅｌｌ）を最終濃度２μｇ／ｍＬに加え、４℃でさらに３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＰＥ標識ストレプトアバジン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とインキュベートした後、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用するフローサイトメトリーによる分析により、ＯＸ４０Ｌ結合を検出した。対応する非ＯＸ４０結合Ｆａｂ−ｄｓＦｖを、対照として使用した。非線形回帰（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標））により阻害曲線を分析して、ＩＣ_５０を決定した。３人の別個のドナーからのデータを合わせて表す阻害曲線を、図１１に示す。ここでデータポイントは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。

【0181】

Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖによる、ＯＸ４０に対する組換えＯＸ４０Ｌ結合の阻害についての平均ＥＣ５０は、０．４４５ｎＭであった。これに比較して、下記に示すように、Ｆａｂ−Ｆｖよりも、Ａ２６ Ｆａｂ’ＰＥＧは、リガンド遮断能がわずかに低く（ＥＣ５０＝０．７３９ｎＭ）、一方、Ａ２６ Ｆａｂ’は、わずかに大きな効力（ＥＣ５０＝０．２４２ｎＭ）を有していた。

【0182】

【表6】

【0183】

実施例６ヒト機能ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖの効果
ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ依存性細胞間相互作用に対するＡ２６ Ｆａｂ−Ｆｖの効果を、一連の抗原駆動ヒトリンパ球アッセイで評価した。これらのアッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏで生じることが予測される、Ｆｖ領域のアルブミン結合部位の飽和を保証するために、５％ヒト血清の存在下で行った。

【0184】

Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖは、混合リンパ球反応を阻害する
一方向同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、同種反応性Ｔ細胞の活性化および増殖のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルである（Ｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９６４，Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ドナーＴ細胞は、関係のないドナー刺激因子であるＰＢＭＣ上の同種ＭＨＣ抗原の認識によって活性化され、細胞増殖およびサイトカイン産生が生じる（Ｌｕｋａｃｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。Ｔリンパ球同種反応は、同種ＭＨＣ抗原および結合したペプチドの両方により駆動されることが示された（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＭＬＲ反応の大きさは、応答因子−刺激因子対間のＭＨＣミスマッチの程度と相関する（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＭＬＲ応答は、応答するドナー由来の細胞の増殖、ならびにＴｈ１（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−α）およびＴｈ２（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３）両方のＴ細胞由来サイトカインの産生をもたらす。ＭＬＲにおける正確なサイトカインプロファイルは、応答因子−刺激因子対に特異的であると考えられる（Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＭＬＲアッセイは、Ｔ細胞活性化経路の検討、免疫抑制剤のスクリーニング、および移植レシピエントにおけるドナー器官拒絶の可能性の予測のための研究に広範に使用されている（Ｂｒｏｍｅｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，２００１）。

【0185】

ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト同種反応性Ｔ細胞の活性化および増殖に対するＡ２６ Ｆａｂ−Ｆｖの効果を、Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，２０００により基本的に記載されるＭＬＲアッセイを使用して検討した。２人の関係のないドナーに由来するＰＢＭＣを、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖ、Ａ２６ Ｆａｂ’、またはＡ２６ Ｆａｂ’ＰＥＧの存在下または非存在下で同時培養し、細胞増殖を^３Ｈチミジン取り込みにより測定した。図１２に示すように、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖは、濃度依存的に細胞増殖を阻害し、ＥＣ_５０値は０．５６ｎＭ（４０．９ｎｇ／ｍＬ）であり、最大阻害は５５％（ｎ＝３ドナー対）であった。Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖは、Ａ２６ Ｆａｂ’ＰＥＧよりもわずかに効力が高く、表７に示すように、０．８８ｎＭのＥＣ_５０値を示すが、一方Ａ２６ Ｆａｂ’は０．２５ｎＭのＥＣ_５０値を示した。

【0186】

２人の関係のないドナーに由来するヒトＰＢＭＣを全血から単離した。一方のドナー由来の細胞をγ−照射により不活性化して、刺激因子集団を生成した。残りのドナー由来の細胞は、応答因子集団を形成した。刺激因子と応答因子の集団を、１：１の比（１ｘ１０^５細胞／ドナー）で混合し、Ａ２６ Ｆａｂ’、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖ、またはＡ２６ Ｆａｂ’ＰＥＧ（０．４ｎｇ〜２５μｇ／ｍＬ）の存在下で、６日間培養した。社内試薬のＣＡ１６２−０１２９７．１ Ｆａｂ−Ｆｖを、アイソタイプがマッチした対照として利用した。^３Ｈ−チミジン取り込み（０．５μＣｉ／ウェル）により６日目に細胞増殖を測定した。データは、生物試薬の非存在下における、応答因子＋刺激因子の応答に対する阻害パーセントとして示し、３人のドナー対に由来するデータを合わせたものである。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを使用して、ＥＣ_５０値を算出した。

【0187】

【表7】

【0188】

ヒトＭＬＲからの上清も分析して、サイトカイン産生に対するＡ２６ Ｆａｂ−Ｆｖの効果を検討した。図１２Ｂに示すように、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖは、ＭＬＲにおけるＩＦＮ−γの産生を顕著に平均８１％（ｎ＝３ドナー対）阻害した。２人の関係のないドナーに由来するヒトＰＢＭＣを全血から単離した。一方のドナー由来の細胞をγ−照射により不活性化して、刺激因子集団を生成した。残りのドナー由来の細胞は、応答因子集団を形成した。刺激因子と応答因子の集団を、１：１の比（１ｘ１０^５細胞／ドナー）で混合し、２５μｇ／ｍＬのＡ２６ Ｆａｂ’、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖ、もしくはＡ２６ Ｆａｂ’ＰＥＧ、または対照（Ａ３３ Ｆａｂ’もしくはＣＡ１６２．０１２９７．１）の存在下で、６日間培養した。上清を回収し、ＭＳＤアッセイによりＩＦＮ−γ含量についてアッセイした。阻害パーセントを抗体なしで培養した細胞と比較して算出した。グラフは、３人のドナーに由来するデータをプールして表す（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）。^＊＊＝ｐ＜０．０１；Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖを対照Ｆａｂ−Ｆｖと比較した（対応のある両側Ｔ検定を使用して有意性を評価した）。

【0189】

実施例７ ヒトＭＬＲにおける、ＮＫ細胞に対するＡ２６ Ｆａｂ−Ｆｖの結合
ＭＬＲ中のＮＫ細胞分裂に対するＡ２６ Ｆａｂ−Ｆｖの効果を検討した。Ｔリンパ球同種反応は混合リンパ球応答を駆動し、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖは、この系のＴ細胞分裂およびＩＦＮγ産生を顕著に阻害する。ＮＫ細胞分裂の阻害はまた、ＩＦＮγ産生の低下に寄与する可能性がある。ＣＦＳＥ標識応答細胞を使用して、ＮＫ細胞分裂の阻害を、分裂集団のＦＡＣＳ分析により実証した（データを示さず）。細胞分裂の２つの異なる尺度を示す。分裂指数は、もとの集団内の細胞が行った細胞分裂の平均数を表し、分裂していない細胞を含む；Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖにより、分裂指数が低下し、集団内で分裂に入っている細胞がほとんどないことが示される；この効果は、おそらくＯＸ４０を発現しているＮＫ細胞により媒介される。増殖指数は、応答する集団のみの増殖を反映し、この尺度を使用するＡ２６ Ｆａｂ−Ｆｖの阻害効果は、相対的に低下する。

【0190】

実施例８ ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける、Ａ２６ Ｆａｂ−Ｆｖについての平均Ｋ_Ｄ／ＥＣ_５０値

【0191】

【表8】

【0192】

本発明を例のみによって説明してきたが、これは決して限定することを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲内で、詳細を変更することができることは、当然理解されよう。本発明の各実施形態の好ましい特徴は、必要な変更を加える他の実施形態のそれぞれに関しても同様である。これらに限定されるものではないが、特許および特許出願を含む、本明細書に引用のすべての刊行物は、あたかも、それぞれ個々の刊行物が、具体的かつ個々に、完全に示されるかのように参照により本明細書に組み込まれるように指示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9a】

【図9b】

【図10a】

【図10b】

【図11a】

【図11b】

【図12a】

【図12b】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]