特許 6367802 個体別の脳がん療法を選択する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6367802

(24)【登録日】2018年7月13日

(45)【発行日】2018年8月1日

(54)【発明の名称】個体別の脳がん療法を選択する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20180723BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20180723BHJP

   C07D 491/22 20060101ALI20180723BHJP

   C07D 487/22 20060101ALI20180723BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

   C12Q1/68ZNA

   C07D491/22

   C07D487/22

【請求項の数】4

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2015-529086(P2015-529086)

(86)(22)【出願日】2013年8月29日

(65)【公表番号】特表2015-529823(P2015-529823A)

(43)【公表日】2015年10月8日

(86)【国際出願番号】FI2013050834

(87)【国際公開番号】WO2014033367

(87)【国際公開日】20140306

【審査請求日】2016年6月3日

(31)【優先権主張番号】20125897

(32)【優先日】2012年8月30日

(33)【優先権主張国】FI

(73)【特許権者】

【識別番号】513323128

【氏名又は名称】トゥルン イリオピスト

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウェステルマルク、ユッカ

(72)【発明者】

【氏名】カウル、アマンプレート

【審査官】 西浦 昌哉

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０２３９２４４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１０７３７４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０８７９２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００７−０８２４３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PUUSTINEN, P. et al.，PME-1 Protects Extracellular Signal-Regulated Kinase Pathway Activity from Protein Phosphatase 2A-Mediated Inactivation in Human Malignant Glioma，Cancer Research，米国，American Association for Cancer，２００９年 ４月 １日，Vol.69/No.7，pp.2870-2877

【文献】 CHANG, F. et al.，Signal transduction mediated by the Ras/Raf/MEK/ERK pathway from cytokine receptors to transcription factors: potential targeting for therapeutic intervention，Leukemia，Nature Publishing Group，２００３年 ７月，Vol.17/No.7，pp.1263-1293

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

そのような療法を必要とする患者のために脳がん療法を選択するための方法であって、
ａ）罹患した脳組織から得た外科的又は生検試料中のＰＭＥ−１の発現レベルを評価するステップ；
ｂ）前記患者が感受性である脳がん療法を選択するための基準としてステップａ）で得られる結果を使用するステップ
を含み；
ここで、関連する非悪性組織と比較して増加したＰＭＥ−１発現は、前記患者がスタウロスポリン（ＳＴＳ）誘導体での単独療法に感受性でないが、前記患者がＳＴＳ誘導体及びＰＭＥ−１サイレンシング剤による併用療法に感受性であることを示し；
一方、インタクトなＰＭＥ−１発現が、前記患者がＳＴＳ誘導体によるがん療法に感受性であることを示し；
ここで、前記ＳＴＳ誘導体が、一般式（Ｉ）：

【化1】

（式中、
Ｒ’はＨ又はアルキルであり；
Ｒ１及びＲ２は、Ｈであるか、又は一緒にオキソを形成し；
Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ、ＯＨであるか、又は一緒にオキソを形成し：
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ６’、Ｒ７及びＲ８は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシルアルキル、アルコキシカルボニル又はモノ−及びジアルキルアミノからなる群から独立して選択され；
ＸはＣＨ_２又はＯであり；及び
ｎは０又は１である）；又は
式（ＩＩ）の化合物：

【化2】

であって；
前記ＰＭＥ−１サイレンシング剤が、小二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）、人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）前駆体、及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から選択されるＲＮＡｉ分子である、上記方法。

【請求項2】

式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物が以下の構造からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【化3】

及び

【化4】

【請求項3】

前記患者が、星状細胞腫、若年性の毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、グリア芽細胞腫、希突起膠細胞腫及び上衣細胞腫からなる群から選択される神経膠種を患っている、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項4】

前記ＲＮＡｉ分子が、配列番号５〜４０からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、個別化医療の分野に関する。より具体的には、本発明は、患者の罹患組織でのプロテオームプロファイルに基づいて個体別の脳がん療法を選択する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

個別化医療は、所与の疾患を発症する可能性、疾患の予後及び療法への感受性の正確な個体別の予測を可能にする各患者の遺伝子、ゲノム及び臨床情報を確認することを目指す、健康管理の比較的若い分野である。したがって、個別化医療は、より情報に基づいた医学的決定を下すこと、より優れた標的療法を選択すること、及び健康管理費用を低減することを可能にする。

【0003】

神経膠腫は、グリア細胞の特徴を提示する腫瘍細胞を有し、全ての脳腫瘍の約４２％を構成する、幅広いカテゴリーの原発性の脳及び脊髄の腫瘍である。アメリカがん学会によると、影響を受けるグリア細胞のタイプに従い、神経膠腫は３つのサブタイプ、すなわち星状細胞腫、希突起膠細胞腫及び上衣細胞腫に分けることができる。星状細胞腫は星状神経膠細胞から生じ、全ての脳腫瘍の約３５％を占める。一般に、星状細胞腫は正常な脳組織全体に広がるので、根治可能でない。星状細胞腫は、顕微鏡下で生検材料を検査する医者が使用する基準に従い、生検試料の顕微鏡検査に基づいて、低悪性度、中悪性度又は高悪性度に通常分類される。最高の悪性度の星状細胞腫は、最も一般的な成人悪性脳腫瘍であるグリア芽細胞腫と呼ばれる。多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）患者の平均生存は、診断後１４カ月未満である。

【0004】

神経膠腫の不均一なゲノム環境のために、将来の療法は、各患者の腫瘍の遺伝子型及びプロテオームプロファイルの個別化を必要とする可能性がある。実際、化学療法への応答と染色体プロファイルの間に明白な関係があるので、希突起膠細胞腫患者は個別化医療から既に利益を受けている（Ｃａｉｒｎｃｒｏｓｓら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、１９９８年、９０巻：１４７３〜１４７９頁）。

【0005】

タンパク質ホスファターゼメチルトランスフェラーゼ１（ＰＭＥ−１）は、その発現が悪性のグリア芽細胞腫（ＧＢＭ）への低グレード星状細胞神経膠腫の進行と相関する、がん関連のタンパク質として同定された（Ｐｕｕｓｔｉｎｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９年、６９巻：２８７０〜２８７７頁）。ＰＭＥ−１はタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）と相互作用し、その阻害はヒト細胞形質転換の必要条件である（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｃｋ及びＨａｈｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００８年、１４巻：１５２〜１６０頁にレビューされている）。ＰＭＥ−１は、触媒ＰＰ２Ａｃサブユニットの上に保存されているロイシン３０９の脱メチル化のために必要とされるその酵素的メチルエステラーゼ活性を通して、ＰＰ２Ａ活性を阻害すると示唆されている（Ｊａｎｓｓｅｎｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２００８年、３３巻：１１３〜２１頁）。ＰＭＥ−１がＰＰ２Ａｃサブユニットの触媒裂溝に直接結合することを実証するＰＭＥ−１−ＰＰ２Ａ複合体の構造解析に基づいて、阻害の代替機構が提案された（Ｘｉｎｇら、Ｃｅｌｌ、２００８年、１３３巻：１５４〜１６３頁）。それにもかかわらず、神経膠腫及びそれらの化学療法抵抗性の発達におけるＰＭＥ−１の役割は、まだ決定されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

近年の研究は神経膠腫の処置における個別化された治療法のための可能な将来の標的としていくつかの候補分子を見出しているが、化学療法から利益を受ける可能性がある患者を前記療法に応答する可能性がない患者から識別するために使用することができるマーカーの同定及び解明の必要性も確認されている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、そのような療法を必要とする患者のために脳がん療法を選択する方法に関する。前記方法は、ａ）前記患者から得た試料中のＰＭＥ−１の発現レベルを評価するステップと；ｂ）前記患者が感受性である脳がん療法を選択するための基準としてステップａ）で得られる結果を使用するステップとを含む。

【0008】

一実施形態では、ＰＭＥ−１発現の増加は、前記患者がＳＴＳ誘導体による単独療法に感受性でないことを示す。

【0009】

別の実施形態では、ＰＭＥ−１発現の増加は、前記患者がＳＴＳ誘導体及びＰＭＥ−１サイレンシング剤による併用療法に感受性であることを示す。

【0010】

さらに別の実施形態では、インタクトなＰＭＥ−１発現は、前記患者がＳＴＳ誘導体によるがん療法に感受性であることを示す。

【0011】

さらなる実施形態では、前記ＳＴＳ誘導体は、以下に記載する一般式（Ｉ）を有する。

【0012】

さらなる実施形態では、前記患者は、神経膠腫、星状細胞腫、若年性の毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、グリア芽細胞腫、希突起膠細胞腫及び上衣細胞腫からなる群から選択される脳がんを患っている。

【0013】

本発明の他の態様、具体的な実施形態、目的、詳細及び利点は、以下の図面、詳細な説明及び例に示される。

【0014】

以下において、本発明は、添付された図面を参照して好ましい実施形態によってより詳細に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A】スクランブルｄｓＲＮＡ（Ｓｃｒ．）及びＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡ（ＰＭＥ−１）でトランスフェクトしたヒトグリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞におけるＰＭＥ−１発現のレベルを実証するウエスタンブロットを示す図である。

【図1B】スクランブル又はＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡで４８時間トランスフェクトし、次に異なる薬物／化学的阻害剤の指示された濃度でさらに２４時間処理した、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞でのアポトーシス性核断片化の量を示す図である。略記号：Ｃｈｌ Ｃｌ−塩化ケレリトリン、ＴＭＺ−テモゾロマイド、ＳＴＳ−スタウロスポリン。

【図1C】スクランブル又はＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡで４８時間トランスフェクトし、次にスタウロスポリン（ＳＴＳ）又は細胞死誘導リガンド、組換えＦａｓＬ又はＴＲＡＩＬの指示された濃度でさらに２４時間処理した、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞でのアポトーシス性核断片化の量を示す図である。

【図1D】スクランブルｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせた細胞と比較した、ＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせたＴ９８Ｇ細胞のアポトーシスの、増加させた濃度のスタウロスポリンによる用量依存的増加を示す図である。

【図1E】スクランブルｄｓＲＮＡ又はＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡのトランスフェクション及び指示された濃度のスタウロスポリンによる２日間の処理の後の、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成（ｃｏｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）能を表す図である。

【図1F】スクランブルｄｓＲＮＡ又はＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡのトランスフェクション及び指示された濃度のスタウロスポリンによる２日間の処理の後の、Ｕ１１８ＭＧグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成（ｃｏｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）能を表す図である。

【図2A】スタウロスポリン処理と組み合わせた３つの異なるＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡ、ＰＭＥ−１．１（配列番号１）、ＰＭＥ−１．２（配列番号２）及びＰＭＥ−１．３（配列番号３）によるアポトーシスの核断片化の誘導を表す図である。

【図2B】Ｔ９８Ｇ細胞でのスクランブルｄｓＲＮＡ（Ｓｃｒ．）及び３つの異なるＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡ（ＰＭＥ−１．１、すなわち配列番号１、ＰＭＥ−１．２、すなわち配列番号２及びＰＭＥ−１．３、すなわち配列番号３）のＰＭＥ−１サイレンシング活性を実証するウェスタンブロットである。

【図2C】スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトさせた細胞と比較した、ＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡ（ＰＭＥ−１．１、すなわち配列番号１、ＰＭＥ−１．２、すなわち配列番号２及びＰＭＥ−１．３、すなわち配列番号３）でトランスフェクトさせたＴ９８Ｇ細胞での残留ＰＭＥ−１レベルを示す上述のウェスタンブロット画像の濃度測定分析である。

【図2D】トランスフェクトされていない細胞と比較した、ＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせたＴ９８Ｇ細胞のアポトーシスの、増加させた濃度のスタウロスポリンによる用量依存的増加を示す図である。

【図3A】Ｔ９８Ｇ細胞の生存力に及ぼすＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡのトランスフェクション及びスタウロスポリン処理の影響を示す図である。

【図3B】Ｔ９８Ｇ細胞での活性カスパーゼ−３及び−７のレベルに及ぼすＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡのトランスフェクション及びスタウロスポリン処理の影響を示す図である。

【図3C】核断片化の量として測定される、ＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡ及びスタウロスポリンによって媒介されるアポトーシスに及ぼす、汎カスパーゼ阻害剤、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ処理の影響を示す図である。

【図4A】核断片化の量として測定される、ＰＭＥ−１ ｄｓＲＮＡ及びスタウロスポリンによって媒介されるアポトーシスに及ぼす、ＰＰ２Ａ阻害剤、オカダ酸によるＴ９８Ｇ細胞の前処理の影響を示す図である。

【図4B】スクランブルｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせた細胞と比較した、スタウロスポリン処理後のＰＭＥ−１特異的又はＣＩＰ２Ａ特異的ｄｓＲＮＡのアポトーシス誘導能の比較を示す図である。

【図4C】ヒトグリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞での、スクランブルｄｓＲＮＡ（Ｓｃｒ．）、ＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡ（ＰＭＥ−１）及びＣＩＰ２Ａ特異的ｄｓＲＮＡ（ＣＩＰ２Ａ）のＰＭＥ−１及びＣＩＰ２Ａサイレンシング活性を実証するウェスタンブロット画像である。

【図5A】スクランブル又はＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡによる４８時間のトランスフェクション、及び異なるスタウロスポリン誘導体／誘導体の指示された濃度によるさらなる２４時間の処理の後の、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞でのアポトーシス性核断片化の量を示す図である。

【図5B】スタウロスポリン誘導体、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａの指示された濃度による２日間の処理後の、スクランブル又はＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡでトランスフェクトしたＴ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成能を表す図である。

【図5C】スタウロスポリン（ＳＴＳ）、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａの指示された濃度による２日間の処理後の、スクランブル又はＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせたＵ２５１ＭＧグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成能を表す図である。

【図5D】スタウロスポリン（ＳＴＳ）、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａの指示された濃度による２日間の処理後の、スクランブル又はＰＭＥ−１特異的ｄｓＲＮＡをトランスフェクトさせたＵ８７ＭＧグリア芽細胞腫細胞のコロニー形成能を表す図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明は、問題の患者が感受性である脳がん療法を選択するために、神経膠腫細胞における、別のＰＰ２Ａ阻害剤タンパク質、ＣＩＰ２Ａではなく、ＰＭＥ−１の発現レベルを使用することができるとの意外な知見に基づく。一部の実施形態では、特定の小分子化学療法剤、すなわちスタウロスポリン（ＳＴＳ）誘導体へのそれぞれのがんの感受性を予測するために、ＰＭＥ−１発現レベルを使用することができる。

【0017】

さらに具体的には、今日では、インタクトなレベルのＰＭＥ−１発現を有する脳がん細胞が、ＳＴＳ誘導体による処置に対してＰＭＥ−１発現陽性の脳がん細胞と比較して統計学的に有意により良好に応答することが見出されている（例２）。したがって、ＳＴＳ誘導体による処置から利益を受ける可能性がある対象とそうでない対象を確認するための層別化基準として、脳がん患者から得た試料中のＰＭＥ−１の発現レベルを使用することができると想定される。

【0018】

本明細書で用いるように、用語「ＳＴＳ誘導体」は、それらに限定されないが式（Ｉ）の化合物及び任意のその立体異性体、ラセミ化合物、塩、溶媒和物又はプロドラッグを含む、ＳＴＳに構造的に類似している任意の化合物を指す。式（Ｉ）の化合物は、以下の一般構造：

【化1】

を有し、上式で、
Ｒ’は、Ｈ又はアルキルであり；
Ｒ’’は、Ｈ又はアルコキシであり；
Ｒ１及びＲ２は、Ｈであるか一緒にオキソを形成し；
Ｒ３及びＲ４は、独立してＨ、ＯＨであるか、又は一緒にオキソを形成し：
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ６’、Ｒ７及びＲ８は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシルアルキル、アルコキシカルボニル又はモノ−及びジアルキルアミノからなる群から独立して選択され；
Ｘは、ＣＨ_２又はＯであり；
ｎは、０又は１である。

【0019】

上で言及される用語「アルキル」には、直鎖状及び分枝状の両方のＣ_１〜６アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜３個の炭素原子を含有するＣ_１〜３アルキル基である。

【0020】

本明細書で用いるように、用語「アルコキシ」は、直鎖状及び分枝状の両方のＣ_１〜６アルコキシ基、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシなどを指す。一部の実施形態では、アルコキシ基は、１〜３個の炭素原子を含有するＣ_１〜３アルコキシ基である。

【0021】

本明細書で用いるように、用語「ヒドロキシアルキル」は、−ＯＨによって置換される前述のＣ_１〜６アルキル基のいずれかを指す。

【0022】

本明細書で用いるように、用語「アルコキシカルボニル」は、−ＣＯＯＨによって置換される前述のＣ_１〜６アルコキシ基のいずれかを指す。

【0023】

用語「アミノ」は、−ＮＨ_２を指す。

【0024】

用語「モノアルキルアミノ」には、アミノ基で置換された前述のアルキル基のいずれかを含む。

【0025】

用語「ジアルキルアミノ」は、２つのアミノ基で置換された前述のアルキル基のいずれかを指す。

【0026】

本明細書で用いるように、用語「立体異性体」は、空間でのそれらの原子の配向だけが異なる個々の分子の全ての異性体の一般用語である。それは、鏡像異性体及びお互いの鏡像でない１つを超えるキラル中心を有する化合物の異性体（ジアステレオマー）を含む。

【0027】

本明細書で用いるように、用語「キラル中心」又は「不斉中心」は、４つの異なる基が結合している炭素原子を指す。

【0028】

用語「鏡像異性体」は、その鏡像の上に重畳することができず、したがって光学的に活性である分子を指し、そこで、鏡像異性体は偏光面を一方向に回転させ、その鏡像は偏光面を反対側の方向に回転させる。

【0029】

用語「ラセミ化合物」は、鏡像異性体の等分の混合物を指し、光学的に不活性である。

【0030】

式（Ｉ）のＳＴＳ誘導体の非限定例には、以下のものが含まれる：
スタウロスポリン（ＳＴＳ）；化学名［９Ｓ−（９α，１０β，１１β，１３α）］−２，３，１０，１１，１２，１３−ヘキサ−ヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１１−（メチルアミノ）−９，１３−エポキシ−１Ｈ，９Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｇｈ：３’，２’，１’−ｌｍ］ピロロ［３，４−ｊ］［１，７］ベンゾジアゾニン−１−オン、ＣＡＳ番号６２９９６−７４−１：

【化2】

ＰＫＣ４１２、別名ミドスタウリン、４’−Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン又はＣＧＰ４１２５１；化学名［９Ｓ−（９α，１０β，１１β，１３α）］−Ｎ−（２，３，１０，１１，１２，１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９，１３−エポキシ−１Ｈ，９Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｇｈ：３’，２’，１’−ｌｍ］ピロロ［３，４−ｊ］［１，７］ベンゾジアゾニン−１１−イル）−Ｎ−メチルベンズアミド；ＣＡＳ番号１２０６８５−１１−２：

【化3】

Ｋ２５２ａ、別名ＳＦ２３７０；化学名９Ｓ，１０Ｒ，１２Ｒ）−２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−ヒドロキシ−９−メチル−１−オキソ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１０−カルボン酸メチルエステル；ＣＡＳ番号９９５３３−８０−９：

【化4】

ＵＣＮ−０１、別名７−ヒドロキシ−スタウロスポリン；化学名（９Ｓ）−２，３，１０，１１，１２，１３−ヘキサヒドロ−３α−ヒドロキシ−１０α−メトキシ−９−メチル−１１α−メチルアミノ−９β，１３β−エポキシ−１Ｈ，９Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｇｈ：３’，２’，１’−ｌｍ］ピロロ［３，４−ｊ］［１，７］ベンゾジアゾニン−１−オン；ＣＡＳ番号１１２９５３−１１−４：

【化5】

ＣＥＰ−７０１、別名レストールチニブ；化学名（９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ）−２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−ヒドロキシ−１０−（ヒドロキシメチル）−９−メチル−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１−オン；ＣＡＳ番号１１１３５８−８８−４：

【化6】

ＳＢ−２１８０７８；化学名９、１０、１１、１２−テトラヒドロ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１，３（２Ｈ）−ジオン；ＣＡＳ番号１３５８９７−０６−２：

【化7】

【0031】

本明細書において、「ＳＴＳ誘導体による処置に応答性」という表現は、「ＳＴＳ誘導体に感受性」及び「ＳＴＳ誘導体による処置に感受性」という表現と同等であり、ＳＴＳ誘導体が投与される患者でＳＴＳ誘導体が治療効果を潜在的に有することができることを意味する。

【0032】

本明細書で用いるように、用語「処置」及び「治療効果」は、疾患の完全治癒だけでなく、疾患又はそれに関連する症状の予防、軽減及び改善も指す。用語「処置」及び「療法」は、互換的に使用することができる。したがって、用語「がん療法」は、例えば、がん、腫瘍サイズ及び／又は転移数の進行の阻害又は安定化を含む。

【0033】

患者での治療効果は、がん関連の障害を処置する臨床分野の当業者に公知である任意の方法によって監視することができる。そのような方法には、断層撮影法及びがんマーカーの検出が含まれるが、これらに限定されない。

【0034】

本明細書において、用語「患者」は、脳がん療法を必要とするヒト又は動物対象を指す。したがって、本発明の方法は、ヒト及び獣医学への応用に適用可能である。

【0035】

本明細書において、用語「神経膠腫」は、グリア細胞から生じる原発性脳腫瘍を指し、星状細胞腫、例えば若年性毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、又はグリア芽細胞腫、希突起膠細胞腫及び上衣細胞腫を含む。

【0036】

神経膠腫患者から得られる外科的又は生検検体は、ＰＭＥ−１の発現レベルについて分析するべき一般的な試料タイプである。一部の実施形態により、罹患脳組織から得られる外科的又は生検検体は、健常組織でのＰＭＥ−１の発現レベルとの間の比較を可能にするために、隣接する健常組織も含有する。組織試料中のＰＭＥ−１の発現レベルは、当技術分野で公知である任意の適する直接的又は間接的な検出方法によって判定することができる。そのような方法には、ＰＭＥ−１特異的抗体を使用する免疫組織化学が含まれるが、これに限定されない。そのような抗体は当技術分野で入手可能であり、当業者に公知のように、さらなる抗ＰＭＥ−１抗体を開発することができる。抗ＰＭＥ−１抗体結合の検出は、蛍光性、発光性、発色性、光度測定又は放射性の標識などの標識によって実施することができる。さらに、ＰＭＥ−１タンパク質発現のレベルは、ＰＭＥ−１のｍＲＮＡの発現レベルと相関することができ、当技術分野で公知のように例えばリアルタイムＰＣＲによって判定することができると想定される。

【0037】

用語「ＰＭＥ−１発現の増加」又は「ＰＭＥ−１発現が陽性」は、関連する非悪性組織と比較してＰＭＥ−１の有意に増加する発現を意味する。一部の実施形態では、前記有意な増加は統計的に有意である。ＰＭＥ−１発現レベルの差の有意性を評価する統計的方法は、当技術分野で容易に利用できる。

【0038】

一部の実施形態では、増加するとみなされるために、ＰＭＥ−１発現レベルは、対応する健常組織と比較して少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍である。

【0039】

本明細書において、用語「インタクトなＰＭＥ−１発現」は、罹患組織が対応する健常組織より有意に高いレベルのＰＭＥ−１を発現しないことを意味する。

【0040】

しかし一部の実施形態では、対応する非悪性組織と比較してＰＭＥ−１の発現はわずかに、すなわち１．５倍未満増加するかもしれないが、なおインタクトであるとみなすことができる。

【0041】

本発明の実施形態により、神経膠腫組織がＰＭＥ−１陽性である患者は、神経膠腫組織がインタクトなレベルのＰＭＥ−１を発現する対応する患者よりも、ＳＴＳ誘導体による処置から受ける利益が低い可能性がある。したがって、ＰＭＥ−１発現が陽性の患者のためには、ＳＴＳ誘導体による処置以外の治療レジメンが推奨される。

【0042】

他方、神経膠腫組織が強化されたＰＭＥ−１発現を示す患者は、転写レベル又は転写後レベルのいずれかでのＰＭＥ−１発現のサイレンシング、及びＳＴＳ誘導体による処置の併用から利益を受けることができると想定される。そのような併用療法は、同時に、逐次的に又は別々に投与することができる。一部の実施形態では、前記併用療法は、悪性組織の外科手術を含むことができる。

【0043】

ＰＭＥ−１発現をサイレンシングするための手段及び方法は、それに限定されずにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含めて当技術分野で容易に利用できる。ＲＮＡｉを媒介するのに適する小ＲＮＡの非限定例には、小二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）、人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）前駆体、及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が含まれる。ＰＭＥ−１特異的ｓｉＲＮＡ分子は、例えば、米国特許出願公開ＵＳ２００９／１８２１３４に開示され（配列番号５〜３４）、フィンランド特許出願ＦＩ２０１１５６４０はＰＭＥ−１特異的ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを開示する（配列番号３５〜４０）。当業者に公知である市販及び非市販のアルゴリズムを使用して、さらなるｄｓＲＮＡ分子を設計することができる。

【0044】

当技術分野で周知であるように、ＰＭＥ−１発現をサイレンシングする他の方法の例には、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）及びリボザイム技術の使用が含まれる。

【0045】

ＰＭＥ−１遺伝子発現をサイレンシングするために使用される分子のいずれも、当技術分野で公知である標準の方法によって改変することができる。

【0046】

本発明のさらなる実施形態により、神経膠腫組織がインタクトなレベルのＰＭＥ−１を発現する患者は、ＳＴＳ誘導体による単独療法から利益を受ける可能性がある。本明細書で使用するように、用語「単独療法」は、ＰＭＥ−１発現をサイレンシングしない、少なくとも１つのＳＴＳ誘導体による療法を指す。所望により、前記ＳＴＳ療法は、外科手術及び／又は任意の相乗的若しくは相加的な化学療法と組み合わせることができる。

【0047】

技術が進歩するに従って、発明の概念を様々な方法で実施することができることは、当分野の技術者に明らかになる。本発明及びその実施形態は、上記の実施例に限定されなく、請求項の範囲内で異なることができる。

【実施例】

【0048】

材料及び方法
真核生物の細胞培養及び小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクション：この試験のために、本発明者らはＴ９８Ｇ、Ｕ１１８ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ及びＵ８７ＭＧヒトグリア芽細胞腫細胞系を用いた。Ｔ９８Ｇ及びＵ２５１ＭＧ細胞はイーグルのＭＥＭ培地で、Ｕ１１８ＭＧはＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、Ｕ８７ＭＧはＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｇｉｂｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気内で培養し、培地には、１０％熱不活性化ＦＣＳ及びペニシリン（１００単位／ｍＬ）−ストレプトマイシン（１００Ａｇ／ｍＬ）を加えた。小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクションは、製造業者の指示に従って、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で実施した。リバーストランスフェクションが９６ウェルプレートで実施されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ｇｌｏ及びカスパーゼ−ｇｌｏアッセイを除いて、全ての実験でトランスフェクションはフォワードトランスフェクションプロトコルを用いて実施された。以下のｓｉＲＮＡ配列が用いられた：スクランブルされた（５’−ＧＵＡ ＡＣＡ ＡＵＧ ＡＧＡ ＧＣＡ ＣＧＧ Ｃ−３’；配列番号４）、ＰＭＥ−１（５’−ＧＧＡ ＡＧＵ ＧＡＧ ＵＣＵ ＡＵＡ ＡＧＣ Ａ−３’；配列番号１）、ＰＭＥ−１（５’−ＵＣＡ ＵＡＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ Ａ−３’；配列番号２）又はＰＭＥ−１（５’−ＡＧＧ ＵＣＡ ＡＧＡ ＡＵＣ ＣＵＧ ＡＡＧ Ａ−３’；配列番号３）。

【0049】

化学的阻害剤及び薬剤：Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、塩化ケレリトリン（Ｃｈｌ Ｃｌ）、スニチニブ、タンデュチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａを含有する小さな阻害剤スクリーニングセットを、Ｂｉａｆｆｉｎ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ ＫＧから購入した。塩酸トポテカンは、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ＵＯ１２６、ＬＹ２９４００２、ＲＯ−３１−８２２０、ＧＯ６９７６及びＳＢ２１８０７８は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。スタウロスポリン（ＳＴＳ）、ＣＥＰ−７０１、ＵＣＮ−０１は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られた；Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのテモゾロマイド（ＴＭＺ）、アルシリアフラビンＡ及びＫ２５２ｃ；Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓからのレベッカマイシン及びＬＣ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのエンザスタウリン。汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、ＰＰ２Ａ阻害剤オカダ酸、並びに活性化剤セレン酸ナトリウム及びキシルロース−５−ホスフェートは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得られた。別のＰＰ２Ａ活性化剤ＦＴＹ７２０は、Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ヒト組換え体Ｆｃ−ＦａｓＬ融合タンパク質及びヒト組換え体イソロイシンジッパーＴＲＡＩＬ（ＴＲＡＩＬ）は、Ｊｏｈｎ Ｅｒｉｋｓｓｏｎ教授（Åｂｏ Ａｋａｄｅｍｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から寄贈された。供給業者によって推奨される通りに、全ての化学物質は水又はＤＭＳＯのいずれかで再構成した。

【0050】

ウェスタンブロット法及び抗体：培養及び処理された細胞を２×ＳＤＳ試料緩衝液／Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に溶解し、沸騰させ、１０％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。膜をブロックし、５％ミルク−ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で一次抗体の必要な希釈溶液及び二次抗体の１：５０００希釈溶液と一緒に必要な時間インキュベートし、強化化学発光（ＥＣＬ）によって発光させた。抗ＰＭＥ−１（クローンＨ−２２６）及び抗ＣＩＰ２Ａ（クローン２Ｇ１０−３Ｂ５）抗体（１：１０００希釈溶液）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗アクチン（クローンＡＣ−４０）抗体（１：１０，０００希釈溶液）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ウェスタンブロットの濃度測定分析は、ＭＣＩＤ画像アナライザーソフトウェアを用いて実施した。

【0051】

細胞生存力アッセイ：細胞生存力は、代謝活性のある生存可能な細胞の指標として細胞性ＡＴＰレベルを測定する、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイで判定した。ＣＴＧ試薬キットをＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から購入し、その推奨に従ってアッセイを実施した。アッセイは白色ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で実施し、発光はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ２プレートリーダーで測定した。

【0052】

カスパーゼ−３及び−７の活性の分析：カスパーゼ−３及び−７の活性は、カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）と命名された、カスパーゼ−３及び−７標的ペプチドＤＥＶＤを含有する基質を利用する発光に基づく方法で測定した。アッセイは製造業者の指示に従って白色ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で実施し、発光はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ２プレートリーダーで測定した。

【0053】

サブＧ０／Ｇ１画分推定によるアポトーシスアッセイ：ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色された断片化核を含有するサブＧ０／Ｇ１画分の百分率を、アポトーシス細胞の目安としてとった。３．５〜４×１０^４個の細胞を２４ウェルプレートに平板培養し、ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトさせ、次に新鮮な培地で試験化合物の指示濃度で処理した。２４時間の処理の後、浮遊細胞及び付着細胞の両方を遠心分離によって収集した。細胞ペレットは、ＰＢＳに４０ｍＭの三ナトリウムシトレート（Ｍｅｒｃｋ）、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する、４００μｌの低張ＰＩ緩衝液に再懸濁させ、暗室で１０分の間室温でインキュベートした。ＰＩで染色した核のフローサイトメトリー分析を実施し、記録したデータは、ＦＡＣＳｃａｎのフローサイトメーター及びソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をそれぞれ用いて分析した。

【0054】

汎カスパーゼ阻害剤を用いる実験では、トランスフェクションの１８時間後からＰＩ染色まで、３０μＭのＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫを含有する増殖培地に細胞を保った。

【0055】

コロニー形成アッセイ：６ウェルプレートに超低密度（４〜６×１０^３）で平板培養された細胞を、それらが小さなコロニーをつくるまで約７日の間増殖させた。製造業者の指示に従ってリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、次にこれらの細胞をスクランブル又はＰＭＥ−１のｓｉＲＮＡでトランスフェクトさせた。４８時間後に、化学薬剤の指示濃度による処理をさらに４８時間与えた。細胞コロニーをＰＢＳで洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、各々室温で１５分の間０．２％クリスタルバイオレット溶液（１０％エタノールで作製）で染色した。過剰な染色剤は、ＰＢＳによる反復洗浄によって除去した。プレートを乾燥させ、オリンパスＳＰ−６００ＵＺカメラ又はＥｐｓｏｎ ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ Ｖ７００スキャナで撮影し、ＩｍａｇｅＪで分析した。

【0056】

統計分析：試料平均の間の等しい分散を仮定する対応のないスチューデントのｔ検定を用いて、２群のデータの平均値間の差の有意水準を評価した。全てのｐ値は両側性であった。確率値ｐ＜０．０５のパラメータは統計的に有意なものとして表され、ｐ＜０．００１は非常に有意な差として表された。

【0057】

結果
がん細胞の生存及び異なる化学薬剤への感受性におけるＰＭＥ−１の役割を研究するために、ＰＭＥ−１タンパク質レベルを有効に低減するために、ヒトグリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞をＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡで７２時間、一時的にトランスフェクトさせた（図１Ａ）。正常レベル又は低減されたレベルのＰＭＥ−１を含有するＴ９８Ｇ細胞（配列番号４に表すスクランブルｓｉＲＮＡ又は配列番号１に表すＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡでそれぞれトランスフェクトさせた細胞）を、セリン−トレオニンタンパク質キナーゼの広く特異的な阻害剤（Ｈ７、Ｈ８、Ｈ８９、塩化ケレリトリン、ＵＯ１２６、ＬＹ２９４００２、及びスタウロスポリン）、チロシンキナーゼ阻害剤（スニチニブ、タンデュチニブ、ラパチニブ及びバンデタニブ）、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ阻害剤（トポテカン）、並びに多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）の処置のために現在用いられているＤＮＡメチル化薬剤、テモゾロマイド（ＴＭＺ）を含む異なる化学薬剤で処理した。

【0058】

ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトさせたＴ９８Ｇ細胞に薬剤処理を２４時間与え、その後溶解し、それらの核は低張ヨウ化プロピジウム緩衝液を用いて染色した。溶解物は、断片化核のサブＧ０／Ｇ１画分の変化について、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって分析した（図１Ｂ）。核の凝縮及び断片化はアポトーシスの重要な生化学的特徴であり、サブＧ０／Ｇ１分析はアポトーシスの検出のために広く使われている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９８６、１９４（２）：３４７〜５０；Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１９９１、１２（４）：３２３〜３２９；Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００６、１：１４５８〜１４６１）。

【0059】

図１Ｂに例示されるように、インタクトなレベルのＰＭＥ−１を発現するＴ９８Ｇ細胞は、ＴＭＺ及びＳＴＳ以外の薬物による処置に良好に応答しなかった。しかし、誘導された核断片化の非常に高いレベルで判断されるように、ＰＭＥ−１の消失はＳＴＳへの細胞の感受性を著しく増加させた。ＰＭＥ−１の消失は、試験した全ての化学物質のアポトーシス誘導作用をある程度増加させたが、Ｈ７、スニチニブ、ＬＹ２９４００２及びＴＭＺの作用だけが中等度とみなされた。換言すると、大部分の化合物（図１Ｂ）、又は細胞死誘導リガンド、ＦａｓＬ（組換えＦｃ−ＦａｓＬ融合タンパク質）及びＴＲＡＩＬ（図１Ｃ）による細胞の処置は同じ傾向を示さなかったので、ＰＭＥ−１消失の相乗効果はＳＴＳに特異的であることが見出された。

【0060】

さらに、ＳＴＳは、スクランブルｓｉＲＮＡによるトランスフェクション細胞で細胞死を誘導しなかった濃度で、ＰＭＥ−１減少細胞で用量依存的にアポトーシスを誘導することが見出された（図１Ｄ）。しかし、５０ｎＭより高い濃度では、対照の（スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトさせた）Ｔ９８Ｇ細胞においてさえも、ＳＴＳは単独で細胞死を誘導し始めた。

【0061】

次に、ＳＴＳへのグリア芽細胞腫細胞の感受性に及ぼすＰＭＥ−１発現の作用を、Ｔ９８Ｇグリア芽細胞腫細胞及び別のグリア芽細胞腫細胞系Ｕ１１８ＭＧでのコロニー形成アッセイによって試験した。この実験のために、これらの細胞を小さなコロニーの形成まで６ウェルプレートで増殖させ、それらのコロニーは、次にスクランブル又はＰＭＥ−１のｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトさせ、続いて指示された濃度のＳＴＳでさらに４８時間処理した。コロニーをホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、画像をＩｍａｇｅ Ｊで分析した。インタクトなレベルのＰＭＥ−１を発現する細胞は、ＳＴＳ処置に良好に応答しなかったが、ＰＭＥ−１消失は細胞を感作し、コロニーのほとんど完全な喪失をもたらした（図１Ｅ及び１Ｆ）。類似した結果が、両方のグリア芽細胞腫細胞系で得られた。

【0062】

上の実験で使用したＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ（配列番号１）の配列特異的標的外作用の可能性を排除するために、３つの異なるＰＭＥ−１特異的ｓｉＲＮＡ配列（配列番号１〜３）をＴ９８Ｇ細胞にトランスフェクトさせ、ＳＴＳ処置の後にアポトーシス性核断片化を分析した（図２Ａ）。これらのＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡの有効性をウエスタンブロット法で測定し（図２Ｂ）、バンド強度を定量化してベータアクチンに対して標準化した（図２Ｃ）。全てのＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ配列は、グリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞をＳＴＳ媒介アポトーシスに感作させることができた。スクランブルｓｉＲＮＡのトランスフェクションに起因するあらゆる可能なバックグラウンド効果を排除するために、トランスフェクションされなかったＴ９８Ｇ細胞をＳＴＳの漸増濃度で処理し、これらの細胞でのアポトーシスの核断片化をＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ及び同じ濃度のＳＴＳを受けた細胞と比較した（図２Ｄ）。３０ｎＭより高い濃度のＳＴＳ単独で、限定量の細胞死が観察された。他方、ＰＭＥ−１が下方制御された細胞は、この実験で用いられた最も低い濃度でも、ＳＴＳ誘導細胞死に非常に感受性であった。

【0063】

ＰＭＥ−１減少細胞でＳＴＳによって誘導される細胞致死の特徴を調べるために、グリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞の生存力に及ぼすＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡとＳＴＳ処理とのこの二重組合せの影響を、細胞−力価−ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイによって先ず分析した（図３Ａ）。ＰＭＥ−１減少は多少細胞生存力を低減するが、同じ細胞がＳＴＳ処理も受けたときには細胞生存力の急激な低減があったので、結果はサブＧ０／Ｇ１分析と強く相関する。

【0064】

アポトーシスの別の生化学的特徴は、エフェクターシステイン−アスパラギン酸プロテアーゼカスパーゼー３及び７の活性化である。ＰＭＥー１減少単独は、カスパーゼ３／７の活性を２倍を超えて増加させることが見出され、それは、ＳＴＳ処理と組み合わせると６倍以上上昇し（図３Ｂ）、カスパーゼがアポトーシス誘導に関与することを示唆する。さらにカスパーゼ誘導の役割をさらに検証するために、ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ及びＳＴＳ処理を受けた細胞を実験期間中汎カスパーゼ阻害剤、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで処理し、アポトーシスを核断片化アッセイによって分析した（図３Ｃ）。本発明者らは、ＰＭＥ−１減少細胞でのＳＴＳ媒介アポトーシスの、カスパーゼ活性の阻害による完全な逆転を見出し、このアポトーシスがカスパーゼの誘導に完全に依存することが示唆された。

【0065】

次に、本発明者らが重視したのは、ＰＭＥ−１によって媒介される、ＳＴＳ誘導アポトーシスに対するグリア芽細胞腫細胞の抵抗性の背後にある可能な機構を調査することであった。ＰＭＥ−１の唯一の確立された直接標的はＰＰ２Ａであるので、それがＰＭＥ−１阻害の影響を元に戻し、したがって細胞生存を促進するはずであるとの推測により、ＰＰ２Ａの化学的阻害剤、オカダ酸（ＯＡ）を用いた。実際に、ＳＴＳ処理の前の２４時間のＯＡでグリア芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞の前処理は、ＰＭＥ−１ ｓｉＲＮＡ及びＳＴＳ媒介アポトーシスから細胞を用量依存的に救済するのに十分だった（図４Ａ）。これは、本発明者らが、これらのＰＰ２Ａ媒介アポトーシス作用がＰＭＥ−１に特異的であるか、他のＰＰ２Ａ阻害／調節タンパク質と共有されるかどうかをさらに調べることにつながり、ＳＴＳ処理に応じてグリア芽細胞腫細胞をアポトーシスに感作させるそれらの能力について、ＣＩＰ２Ａ及びＰＭＥ−１減少を比較した。ＣＩＰ２Ａ下方制御はアポトーシスを非常にわずかに増加させることを見出したので、それは、ＰＭＥ−１減少細胞（図４Ｂ）によって媒介されるような相乗作用とみなすことができず、これらの作用がＰＭＥ−１下方制御に特異的であるという考えを支えた。それらのそれぞれのｓｉＲＮＡによるＣＩＰ２Ａ及びＰＭＥ−１の有効な下方制御は、ウェスタンブロット法によって検証された（図４Ｃ）。

【0066】

上の全ての結果は、ＰＭＥ−１陽性のグリア芽細胞腫細胞がＳＴＳによる処置に良好に応答しないことを実証する。他方、インタクトなＰＭＥ−１発現を有するグリア芽細胞腫細胞は、ＳＴＳによって媒介されるアポトーシスに感受性である。

【0067】

ＳＴＳはキナーゼの広く特異的な阻害剤であることが文献で実証されているので、それは、臨床的に関連する治療薬とみなされていない。しかし、はるかにより特異的で、より少ない副作用を有し、現在異なる疾患の処置のために臨床試験中である、いくつかのＳＴＳ誘導体が知られている。そこで、本発明者らは、本発明者らの実験セットアップで、ＳＴＳを異なる濃度のその誘導体、ＰＫＣ４１２、Ｋ２５２ａ、ＲＯ−３１−８２２０、ＧＯ６９７６、ＳＢ２１８０７８、アルシリアフラビンＡ、Ｋ２５２ｃ、レベッカマイシン、エンザスタウリン、ＵＣＮ−０１又はＣＥＰ−７０１に交換した（図５Ａ）。驚いたことに、ＰＫＣ−４１２、Ｋ２５２ａ、ＵＣＮ−０１及びＣＥＰ−７０１が、ＳＴＳ自体よりさらに高いレベルで、ＰＭＥ−１減少グリア芽細胞腫細胞でアポトーシスを誘導することが可能なことが見出された。ＳＢ２１８０７８は、より高い濃度で中レベルのアポトーシスを誘導した。インタクトなレベルのＰＭＥ−１を発現するグリア芽細胞腫細胞は、試験したＳＴＳ誘導体のいずれにも応答しなかった。

【0068】

２つの活性薬剤、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａを用いるＴ９８Ｇ細胞でのコロニー形成アッセイも、上記の知見を補強する（図５Ｂ）。細胞系特異的作用を避けるために、アポトーシス感作薬剤、ＳＴＳ、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａの効力を、他のＰＭＥ−１減少グリア芽細胞腫細胞系Ｕ２５１ＭＧ及びＵ８７ＭＧでも試験した。全ての試験細胞系で、ＰＭＥ−１減少はＳＴＳ、ＰＫＣ４１２及びＫ２５２ａの細胞致死活性を強化したが、処理の組合せの効力には細胞型依存性の差があった（図５Ｃ及び５Ｄ）。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]