特許 6367950 前立腺癌治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6367950

(24)【登録日】2018年7月13日

(45)【発行日】2018年8月1日

(54)【発明の名称】前立腺癌治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/10 20060101AFI20180723BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20180723BHJP

   A61K 38/09 20060101ALI20180723BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20180723BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180723BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20180723BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20180723BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/10ZMD

   A61K31/337

   A61K38/09

   A61K39/39

   A61P35/00

   A61P35/04

   A61P43/00 121

   !C07K7/08

   !C12N9/12ZNA

【請求項の数】10

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2016-541071(P2016-541071)

(86)(22)【出願日】2014年12月17日

(65)【公表番号】特表2017-501179(P2017-501179A)

(43)【公表日】2017年1月12日

(86)【国際出願番号】KR2014012502

(87)【国際公開番号】WO2015093854

(87)【国際公開日】20150625

【審査請求日】2016年8月26日

(31)【優先権主張番号】10-2013-0157456

(32)【優先日】2013年12月17日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2013-0159571

(32)【優先日】2013年12月19日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】514286826

【氏名又は名称】ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100164563

【弁理士】

【氏名又は名称】佐々木 貴英

(72)【発明者】

【氏名】キム サン チェ

【審査官】 茅根 文子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５２０２９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１０１１７３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５２４３９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第６０５９４０５（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 Cancer Immunol. Immunother.，２０１３年 ４月，Vol. 62，pp. 1041-1052

【文献】 日本臨牀，２０１１年，Vol. 69, Suppl. 5，pp. 531-537

【文献】 日本臨牀，２０１１年，Vol. 69, Suppl. 5，pp. 469-472

【文献】 Prostate，２０１３年 ５月，Vol. 73, No. 6，pp. 573-581

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８；４１／００−４５／０８

Ａ６１Ｋ ３１／３３７

Ａ６１Ｋ ３９／３９

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３５／０４

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｃ０７Ｋ ７／０８

Ｃ１２Ｎ ９／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

前立腺癌患者に投与し、前立腺癌の増殖または転移を抑制するための前立腺癌治療用組成物であって、
配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチド、又は
前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチド
を含み、
前記ペプチドは、前立腺癌を治療するための有効量で含まれ、
前記組成物は、ドセタキセル又は酢酸ロイプロリドと併用して投与される、
前記組成物。

【請求項2】

アジュバントと組み合わされて投与される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記アジュバントはサイトカインアジュバントを含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記サイトカインアジュバントは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

患者に投与され、ここで前記患者は、血清レベルにおいて、前記患者を含む全ての患者のエオタキシン及びＭＩＰ１αの平均濃度よりも少なくとも１０％高い、エオタキシン及びＭＩＰ１αの少なくとも１つの濃度（ｗ／ｖ）を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

ホルモン耐性を有する前立腺癌を治療するために使用される、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

抗癌剤である酢酸ロイプロリドと併用して使用され、アジュバントとしてのＧＭ−ＣＳＦと共に使用される、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物と、説明書とを含む、前立腺癌治療用キット。

【請求項9】

前記説明書は、前記前立腺癌治療用組成物が、ドセタキセル及び酢酸ロイプロリドから選択される抗癌剤と併用投与され、アジュバントと組み合わせて投与され、そして患者に投与され、ここで前記患者は、血清レベルにおいて前記患者を含む前立腺癌患者の平均エオタキシン濃度よりも少なくとも１０％高いエオタキシン濃度（ｗ／ｖ）を有する、という内容を含む、請求項８に記載のキット。

【請求項10】

前立腺癌患者における前立腺癌の増殖または転移を抑制するための前立腺癌治療用組成物を製造するための、配列番号１のアミノ酸配列から成るペプチド、又は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドの使用であって、前記組成物は、ドセタキセル又は酢酸ロイプロリドと併用して投与される、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、前立腺癌治療用組成物に係り、さらに具体的には、テロメラーゼに由来したペプチドを含む、前立腺癌細胞の増殖及び転移を抑制するのに効果的な前立腺癌治療用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

前立腺癌は、西欧男性に最も一般的に発見される癌であり、米国の場合、全体男性癌患者の１／３に達する多頻度腫瘍である。２００８年米国統計基準において、年間約１９万件の発病が報告され、そのうち１５％を上回る２９，０００人が前立腺癌で死亡すると知られている（Jemal et al., Cancer statistics, 58(2): 71-96, 2008）。

【0003】

国内の場合、前立腺癌の発生率は、１９８９年１．２％に過ぎなかったが、２００１年２．８％、２００５年には４．５％、２０１０年１０．７％と、急な増加勢を示しており、主要癌腫の年齢標準化発生率の変動が、１９９９年から２００７年まで１３．２％と、甲状腺癌の次に高くなっている。特に、男性の場合、現在の全体癌発生頻度５位に該当しており、それは、西欧化された食生活が原因であると推定される（癌センター、癌統計資料集、２０１２）。

【0004】

前立腺癌の治療法としては、ホルモン療法、外科療法、放射線療法、化学療法、及びそれらを併用する治療法が利用されている。ホルモン療法は、前立腺癌の増殖に関係するアンドロゲンの生産を抑制したり、その作用を抑制したりする方法であり、具体的には、男性ホルモンを生産する精巣の除去、下垂体に作用し、アンドロゲンを低下させるＬＨＲＨ類似体（luteinizing hormone releasing hormone analogue）やエストロゲン製剤の投与、抗アンドロゲン剤の投与などの方法を使用することができる。

【0005】

進行前立腺癌の治療法として、ホルモン療法が唯一に適用されている実情であるが、ホルモン療法を適用したほとんどの進行前立腺癌患者には、数年内にホルモン耐性ができ、持続的な治療に困難がある。従って、ホルモン療法に対する耐性を獲得した患者にも適用が可能な前立腺癌の治療法への必要性が提起されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】ＫＲ２００８−００８４８１８

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Jemal et al., Cancer statistics, 58(2): 71-96, 2008

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

それにより、本発明者らは、効果的に前立腺癌の治療方法を開発するために、鋭意努力した結果、テロメラーゼ由来ペプチド、またはそれと、ドセタキセルまたは酢酸ロイプロリドのような既存前立腺癌治療剤との併用投与を介して、有意性ある抗癌効能上昇を起こすことを確認し、本発明の完成に至った。

【0009】

従って、本発明の目的は、前立腺癌の増殖及び転移を抑制する効果を有する前立腺癌治療用組成物、及びそれを対象に投与する前立腺癌治療方法を提供するところにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド、前記アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するペプチド、またはそれらのペプチド断片を含む、前立腺癌患者に投与し、前立腺癌の増殖または転移を抑制するための前立腺癌治療用組成物を提供する。

【0011】

一実施形態において、前記組成物は、抗癌剤と併用して投与されてもよい。

【0012】

一実施形態において、前記抗癌剤は、化学療法剤としてのドセタキセルを含んでもよい。

【0013】

一実施形態において、前記抗癌剤は、酢酸ロイプロリドを含んでも良い。

【0014】

一実施形態において、前記組成物は、アジュバント（adjuvant）と組み合わされて投与されてもよい。

【0015】

一実施形態において、前記アジュバントは、サイトカインアジュバントを含んでもよい。

【0016】

一実施形態において、前記サイトカインアジュバントは、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）を含んでもよい。

【0017】

一実施形態において、前記組成物は患者に投与されてもよく、ここで患者は、血清レベルにおいて、前記患者を含む患者のエオタキシン及びＭＩＰ１αの平均濃度よりも少なくとも１０％高い、エオタキシン及びＭＩＰ１αの少なくとも１つの濃度（ｗ／ｖ）を有する。

【0018】

一実施形態において、前記組成物は、抗癌剤である酢酸ロイプロリドと併用して使用されてもよく、アジュバントは顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子であってもよい。

【0019】

一実施形態において、前記組成物は、ホルモン耐性を有する前立腺癌の治療のために使用されてもよい。

【0020】

本開示の他の態様は、前述の前立腺癌治療用組成物と説明書とを含む、前立腺癌治療用キットを提供する。

【0021】

一実施形態において、前記説明書は、前記前立腺癌治療用組成物が、ドセタキセル及び酢酸ロイプロリドから選択される抗癌剤と併用投与され、アジュバントと組み合わせて投与され、そして患者に投与され、ここで前記患者は、血清レベルにおいて前記患者を含む前立腺癌患者の平均エオタキシン濃度よりも少なくとも１０％高いエオタキシン濃度（ｗ／ｖ）を有する、という内容を含んでもよい。

【0022】

本開示の別の態様は、前立腺癌患者における前立腺癌を治療して、前立腺癌の増殖または転移を抑制するための方法であって、前立腺癌の治療を必要とする対象に前記前立腺癌治療用組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。

【0023】

本開示の別の態様は、前立腺癌患者における前立腺癌を治療して、前立腺癌の増殖または転移を抑制するための方法であって、患者に前記前立腺癌治療用組成物を投与することを含み、ここで前記患者は、血清レベルにおいて、前記患者を含む前立腺癌患者の平均エオタキシン濃度よりも少なくとも１０％高いエオタキシン濃度（ｗ／ｖ）を有する、前記方法を提供する。

【発明の効果】

【0024】

本発明によれば、前立腺癌治療のために、テロメラーゼ由来ペプチドを投与することにより、既存の抗癌治療効果を改善させることができる。

【0025】

さらに具体的には、本発明によれば、前立腺癌の治療時、ドセタキセルまたは酢酸ロイプロリドのような既存前立腺癌治療剤と、テロメラーゼ由来ペプチドとを併用投与することにより、それぞれの単独投与時と比較するとき、相乗作用的治療効果を有する前立腺癌治療用組成物及び治療方法が提供される。特に、ドセタキセルまたは酢酸ロイプロリドのような既存前立腺癌治療剤の単独投与で十分な抗癌効果を起こすことができない患者、及びホルモン耐性が生じた患者に有用な治療法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド（「ｐｅｐ１」）の癌細胞増殖抑制効果を調べるために、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）において、ＭＴＴアッセイを介して、ｐｅｐ１の濃度別に相対的な細胞増殖程度を示したグラフである。

【図2】配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド（「ｐｅｐ１」）の癌細胞増殖抑制効果を調べるために、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）において、ＭＴＴアッセイを介して、ｐｅｐ１の濃度別に相対的な細胞増殖程度を示したグラフである。

【図3】ｐｅｐ１とドセタキセルとの併用投与時の癌細胞増殖抑制効果を調べるために、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）において、ＭＴＴアッセイを介して、相対的な細胞増殖程度を示したグラフである。

【図4】前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）細胞異種移植モデルにおいて、ｐｅｐ１、及びｐｅｐ１と酢酸ロイプロリドとの併用投与時の効能を評価するために、濃度別にｐｅｐ１及び酢酸ロイプロリドを単独または併用投与した各実験群の癌増殖率（経時的な腫瘍体積）を測定したグラフである。

【図5】前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）細胞異種移植モデルにおいて、ｐｅｐ１とドセタキセルとの併用投与時の効能を評価するために、濃度別にｐｅｐ１及びドセタキセルを併用投与した各実験群の癌増殖率（経時的な腫瘍体積）を測定したグラフである。

【図6】前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）細胞異種移植モデルにおいて、ｐｅｐ１、並びにｐｅｐ１及び酢酸ロイプロリドの併用投与時の安全性を評価するために、濃度別にｐｅｐ１及び酢酸ロイプロリドを単独または併用投与した各実験群の日付別体重（body weight）を測定して示したグラフである。

【図7】トランスウェル移動分析を介して、ｐｅｐ１の投与時、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）の移動抑制程度を評価するために、細胞に、ｐｅｐ１を濃度別に投与した実験の結果を細胞移動数で示したグラフである。

【図8】トランスウェル移動分析を介して、ｐｅｐ１の投与時、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）の移動抑制程度を評価するために、細胞に、ｐｅｐ１を濃度別に投与した実験の結果写真である。

【図9】トランスウェル移動分析を介して、ｐｅｐ１及びドセタキセルの併用投与時、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）の移動抑制程度を評価するために、細胞にドセタキセルと共に、ｐｅｐ１を濃度別に投与した実験の結果を、細胞移動数で示したグラフである。

【図10】トランスウェル移動分析を介して、ｐｅｐ１及びドセタキセルの併用投与時、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）の移動抑制程度を評価するために、細胞に、ｐｅｐ１を濃度別に投与した実験の結果写真である。

【図11】トランスウェル移動分析を介して、ｐｅｐ１及びドセタキセルの併用投与時、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）の移動抑制程度を評価するために、細胞に、ｐｅｐ１を濃度別に投与した実験の結果写真である。

【図12】トランスウェル移動分析を介して、ｐｅｐ１及びドセタキセルの併用投与時、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）の移動抑制程度を評価するために、細胞に、ｐｅｐ１を濃度別に投与した実験の結果写真である。

【図13】トランスウェル移動分析を介して、ｐｅｐ１及びドセタキセルの併用投与時、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）の移動抑制程度を評価するために、細胞に、ｐｅｐ１を濃度別に投与した実験の結果写真である。

【図14】トランスウェル移動分析を介して、ｐｅｐ１及びドセタキセルの併用投与時、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）の移動抑制程度を評価するために、細胞に、ｐｅｐ１を濃度別に投与した実験の結果写真である。

【図15】前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）細胞異種移植モデルにおいて、癌細胞移動と係わるｍＲＮＡマーカーであるＭＭＰ９の発現程度を、ｐｅｐ１ １０ｍｇ／ｋｇ、酢酸ロイプロリド０．１ｍｇ／ｋｇを投与した時及び対照群の別に示したグラフである。

【図16】前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）細胞異種移植モデルにおいて、癌細胞移動と係わるｍＲＮＡマーカーであるＭＭＰ２の発現程度を、ｐｅｐ１ １０ｍｇ／ｋｇ、酢酸ロイプロリド０．１ｍｇ／ｋｇを投与した時及び対照群別に示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本発明は、多様な変換を加えることができ、さまざまな実施例を有することができるが、以下、本発明についてさらに具体的に説明する。しかし、それは、本発明を特定の実施形態について限定するものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むものであると理解されなければならない。本発明の説明において、関連公知技術に係わる具体的な説明が、本発明の要旨を不明確にすると判断される場合、その詳細な説明を省略する。

【0028】

テロメア（telomere）は、染色体の末端に反復的に存在する遺伝物質であって、当該染色体の損傷や、他の染色体との結合を防止すると知られている。細胞が分裂するたびに、テロメアの長さは少しずつ短くなるが、一定回数以上の細胞分裂があれば、テロメアは非常に短くなり、その細胞は、分裂を止めて死ぬ。一方、テロメアを長くすれば、細胞の寿命が延長されると知られており、その例として、癌細胞では、テロメラーゼ（telomerase）という酵素が分泌され、テロメアが短くなることを防ぐために、癌細胞が死なずに、続けて増殖すると知られている。本発明者らは、テロメラーゼに由来するペプチドが前立腺癌の治療に効果的であるということを確認し、本発明の完成に至った。

【0029】

本発明の一側面において、テロメラーゼ由来ペプチドとして、下記配列番号１の１６個アミノ酸配列を有するペプチド（以下、「ｐｅｐ１」とする）、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼ、具体的には、ヒト（Homo sapiens）テロメラーゼに由来したペプチドを含む前立腺癌治療用組成物を提供する。

【0030】

配列番号１：ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫ

【0031】

本発明の一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列のペプチド、前述のペプチドのペプチド断片、または前述のペプチドのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するペプチドは、テロメラーゼ、具体的には、人間（Homo sapiens）テロメラーゼに由来したペプチドを含む。

【0032】

本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１のペプチド又はその断片と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列相同性を有するペプチドを含んでもよい。また、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１を含むペプチドまたはその断片と、少なくとも１個のアミノ酸、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、または少なくとも７個のアミノ酸が変化したペプチドを含んでもよい。本発明の一側面において、癌細胞増殖抑制用ペプチドは、３０個以下のアミノ酸から構成されてもよい。

【0033】

配列番号１に記載されたペプチドは、下記表１の通りである。下記表１の「名称」は、ペプチドを区別するために命名したものである。本発明の一側面において、配列番号２に記載されたペプチドは、ヒトテロメラーゼの全体ペプチドを示す。本発明の他の一側面において、配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の配列の断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼに含まれたペプチドのうち、当該位置のペプチドを選別して合成した「合成ペプチド」を含む。配列番号２は、全体テロメラーゼのアミノ酸配列を示したものである。

【0034】

【表1】

【0035】

本発明の一側面において、アミノ酸変化は、ペプチドの物理化学的特性を変更させる性質に属する。例えば、ペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を変更させ、最適のｐＨを変化させるようなアミノ酸変化が行われる。

【0036】

本明細書において「アミノ酸」というのは、自然にペプチドに統合される２２個の標準アミノ酸だけではなく、Ｄ−アイソマー及び変形されたアミノ酸を含む。それにより、本発明の一側面においてペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドでもある。一方、本発明の他の側面においてペプチドは、翻訳後の変形（post-translational modification）が行われた非標準アミノ酸なども含む。翻訳後の変形例は、リン酸化（phosphorylation）、糖化（glycosylation）、アシル化（acylation）（例えば、アセチル化（acetylation）、ミリストイル化（myristoylation）及びパルミトイル化（palmitoylation）を含む）、アルキル化（alkylation）、カルボキシル化（carboxylation）、ヒドロキシル化（hydroxylation）、糖化反応（glycation）、ビオチニル化（biotinylation）、ユビキチニル化（ubiquitinylation）、化学的性質の変化（例えば、ベータ除去脱イミド化、脱アミド化）及び構造的変化（例えば、二硫化物ブリッジの形成）を含む。また、ペプチドコンジュゲートを形成するための架橋剤（crosslinker）との結合過程で起こる化学反応によって生ずるアミノ酸の変化、例えば、アミノ基、カルボン酸基、または側鎖での変化のようなアミノ酸の変化を含む。

【0037】

本明細書に開示されたペプチドは、自然そのままの供給源から同定されて分離された野生型ペプチドでもある。一方、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１の断片であるペプチドと比較し、一つ以上のアミノ酸が置換、欠失及び／または挿入されたアミノ酸配列を含む、人工変異体でもある。人工変異体だけではなく、野生型ポリペプチドでのアミノ酸変化は、タンパク質のフォールディング（folding）及び／または活性に、有意の影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換を含む。保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ルシン、イソロイシン及びメチオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）の群の範囲内にある。一般的に、特異的活性を変更させないアミノ酸置換が、本分野に公知されている。最も一般的に発生する交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、並びにそれらと反対のものである。保存的置換の他の例は、次の表２の通りである。

【0038】

【表2】

【0039】

前記前立腺癌治療用組成物において、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを、０．０１ｇ／Ｌないし１ｋｇ／Ｌ、具体的には、０．１ｇ／Ｌないし１００ｇ／Ｌ、さらに具体的には、１ｇ／Ｌないし１０ｇ／Ｌの含量（ペプチド濃度）で含まれている。

【0040】

本明細書において、ペプチドの投与量、投与方法、投与周期などは、すでに当業界に周知されているので、各患者の状態によって、当業界に知られている基準によって投与することができる。具体的な投与量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、具体的には、０．１ｎｇ／ｋｇ／日ないし１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には、０．１μｇ／ｋｇ／日ないし１ｍｇ／ｋｇ／日、一層具体的には、１μｇ／ｋｇ／日ないし１００μｇ／ｋｇ／日、さらに一層具体的には、２μｇ／ｋｇ／日ないし５０μｇ／ｋｇ／日にもなるが、それらに制限されるものではなく、投与する対象の年齢、健康状態、合併症など多様な要因によっても異なる。

【0041】

本発明の一側面によるペプチドは、皮内投与を介して投与されてもよい。投与間隔は、２日間隔で１日１回投与され、時間が経ちながら、日にち間隔をさらに開けてもよい。第１週は、週３回（１，３，５日目）投与し、２，３，４，６週目に、それぞれ１回（８，１５，２２，３６日目）、その後４週ごとに１回投与する。１回投与量は、成人基準での投与時、０．１ないし３ｍｇでもある。投与量は、０．１ｍｇ以上、０．２ｍｇ以上、０．３ｍｇ以上、０．４ｍｇ以上、０．４５ｍｇ以上または０．５ｍｇ以上でもある。また、投与量は、３ｍｇ以下、２．５ｍｇ以下、２．０ｍｇ以下、１．５ｍｇ以下、１．０ｍｇ以下、０．９ｍｇ以下、０．８ｍｇ以下、０．７ｍｇ以下、０．６ｍｇ以下でもある。
本発明の他の一側面において、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチド；及びドセタキセルまたは酢酸ロイプロリドのような既存の前立腺癌治療剤；を有効成分として含む前立腺癌治療用組成物を提供する。
ドセタキセル（docetaxel）は、「タキセン」、「微小管阻害剤（antimicrotubule agent）」、「植物性アルカロイド（plant alkaloids）」に分類される抗癌剤であり、細胞分裂過程において、分裂と自家複製との機構である微小管（microtubule）が分離される過程を妨害することにより、癌細胞の増殖を抑制する。

【0042】

ロイプロリド（leuprolide）は、酢酸ロイプロリド（leuprolide aceatate）、「Leuprorellin」、「Leuplin（登録商標）」に分類されるホルモン遮断用前立腺癌治療剤である。性腺刺激ホルモン放出ホルモン作用剤系に属する９個のアミノ酸からなるペプチドであり、体内の性腺刺激ホルモンより数十倍強い活性を有しており、その受容体に強く結合することにより、受容体がそれ以上反応しないようにし、テストステロンのような性ホルモンの分泌を抑制させる作用を行い、抗癌効果を示す。

【0043】

ホルモン耐性が生じた前立腺癌に対してドセタキセルを利用した治療法が使用されているが、ホルモン耐性前立腺癌に対するドセタキセルの治療効能は、おおむね４０％ほどであると報告されている（Beer et al, Ann Oncol., 12: 1273〜1279, 2001）。ドセタキセルの投与量は、患者によって異なるが、６０ないし４００ｍｇ／ｍ²であり、一般的に、３週ごとに静脈内経路に、１時間かけて６０ないし１００ｍｇ／ｍ²の量が投与される（France Cavelli et al., Textbook of Medical Oncology, Martin Dunitz Ltd., p4623 (1997)）。

【0044】

現在ＦＤＡは、前立腺癌治療に、ドセタキセル単一療法や、副作用軽減を目的とするプレドニゾロン（prednisolone）複合療法を承認しているが、難治性前立腺癌を治療するためには、互いに異なるメカニズムを有する抗癌剤の複合療法が必要な実情である。

【0045】

実際、ｍＴＯＲ抑制剤であるラパマイシン（rapamycin）とドセタキセルとの併用時、多様な前立腺癌の増殖が効率的に抑制されたという報告があり、サリドマイド（thalidomide）類似体であるレナリドミド（lenalidomide）併用投与でも、有意性ある抗癌効能の上昇が報告されている（Liu et al., Chin Med J(Engl), 123(3): 356-60, 2010; Henly et al., Prostate, 72(8): 856-67, 2012）。

【0046】

前述の本発明によるペプチドと抗癌剤とが併用して常用された前立腺癌治療用組成物において、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドが、０．０１ｇ／Ｌないし１ｋｇ／Ｌ、具体的には、０．１ｇ／Ｌないし１００ｇ／Ｌ、さらに具体的には、１ｇ／Ｌないし１０ｇ／Ｌの含量（ペプチド濃度）で含まれ、ドセタキセルを、０．０１ｎｇ／ｍＬないし１００ｍｇ／ｍＬ、具体的には、０．１ｎｇ／ｍＬないし１０ｍｇ／ｍＬ、さらに具体的には、１ｎｇ／ｍＬないし１ｍｇ／ｍＬの含量で含んでもよいが、用量による効果の違いを示す場合、それらを適切に調節することができる。前記範囲、またはそれ以下の範囲で含む場合、本発明が意図した効果を示すのに適切であるだけではなく、組成物の安定性及び安全性をいずれも満足することができ、コスト対比の効果の側面でも、前記範囲で含むことが適切である。

【0047】

本発明の一側面によるペプチド及び／または抗癌剤は、アジュバントと組み合わされて投与されるものでもある。免疫学的観点から、アジュバントは、ターゲット抗原に対する免疫反応を刺激するために、ワクチンに添加されるものであるが、それ自体が免疫原性を提供するものではない。免疫反応刺激目的以外に、ワクチンの剤形安定化のために添加されるアジュバントもある。免疫学的アジュバントについては、当業界に周知されている［J Biomed Biotechnol. 2012; 2012: 831486. Published on line Mar 13, 2012］。免疫学的アジュバントは、アルミニウム塩のような無機アジュバントと、オイル系、ビロゾーム（virosome）、スクワランのような有機アジュバントと、を含む。有機アジュバントは、エマルジョン、微生物由来、合成アジュバント、サイトカインなどがあるが、それらに限定されるのではない。サイトカインアジュバントは、９種が知られている。例えば、成熟した顆粒球、及びマクロファージを活性化させる顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を有することができるが、それらは、Ｂ型肝炎、ＨＩＶ、癌ワクチンに主に使用される［J Biomed Biotechnol. 2012; 2012: 831486. Published on line Mar 13, 2012］。

【0048】

本明細書において言及されたアジュバントの適切な投与量は、すでに当業界に周知されているので、各患者の状態によって、当業界に知られている基準によって投与することができる。具体的な投与量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、具体的には、１μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には、１０μｇ／ｋｇ／日ないし１００ｍｇ／ｋｇ／日、一層具体的には、５０μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｍｇ／ｋｇ／日にもなるが、それらに制限されるものではなく、投与する対象の年齢、健康状態、合併症など多様な要因によっても異なる。

【0049】

例えば、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の場合、本明細書に開示されたペプチドの投与前、例えば、１分ないし１５０分前の時点、５ないし８０分前の時点、または１０ないし１５分前の時点に、成人基準で、７ないし７００ｍｇの投与量で皮内投与されてもよい。投与時間は、ペプチド投与前の１分以上前、３分以上前、５分以上前、７分以上前、８分以上前、９分以上前または１０分以上前に投与されてもよい。また、１５０分以下の前、１３０分以下の前、１１０分以下の前、１００分以下の前、９０分以下の前、８０分以下の前、７０分以下の前、６０分以下の前、５０分以下の前、４０分以下の前、３０分以下の前、２０分以下の前、または１５分以下前の時点に投与されてもよい。投与量は、７ｍｇ以上、１０ｍｇ以上、２０ｍｇ以上、３０ｍｇ以上、４０ｍｇ以上、５０ｍｇ以上、６０ｍｇ以上または７０ｍｇ以上でもある。また、投与量は、７００ｍｇ以下、６００ｍｇ以下、５００ｍｇ以下、４００ｍｇ以下、３００ｍｇ以下、２００ｍｇ以下、１００ｍｇ以下、９０ｍｇ以下または８０ｍｇ以下でもある。

【0050】

本発明の一側面による組成物は、ヒト、犬、ニワトリ、豚、牛、羊、ギニアピッグまたは猿を含む全ての動物に適用されてもよい。

【0051】

本発明の一側面における組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを有効成分として含む癌細胞増殖抑制用薬学組成物を提供する。本発明の一側面による薬学組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内または皮下などに投与される。

【0052】

経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質または硬質のカプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤または乳濁剤でもあるが、それらに制限されるものではない。非経口投与のための剤形は、注射剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁液剤、乳剤、坐剤、パッチまたは噴霧剤でもあるが、それらに制限されるものではない。

【0053】

本発明の一側面による薬学組成物は、必要によっては、希釈剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、着色剤、香料または甘味剤などの添加剤も含む。本発明の一側面による薬学組成物は、当業界の一般的な方法によって製造される。

【0054】

本発明の一側面による抗癌治療方法において、エオタキシン、ＭＩＰ１α及びＣＲＰなどのサイトカインの血清及び血漿のレベルを測定し、それを、癌の免疫学的治療法の施行いかんを判断するのに有用なバイオマーカーとして活用することができる。具体的には、同一疾病患者の患者群平均と比べ、血清レベルにおいて、エオタキシン及びＭＩＰ１αのうちいずれか１以上の濃度（ｗ／ｖ）が１０％以上高い対象に対して、選別的に免疫学的治療を進めることができるし、さらに具体的には、患者群において、血清エオタキシンレベルが一定レベル以上、例えば、２０ｐｇ／ｍＬ以上、４０ｐｇ／ｍｌ以上、８０ｐｇ／ｍｌ以上の患者のように、一定レベル以上のエオタキシンレベルを示す患者に対して、選別的に免疫学的治療を、既存抗癌治療と併行することができる。

【0055】

以下、実験例を挙げ、本発明の構成及び効果についてさらに具体的に説明する。しかし、以下の実験例は、本発明の理解の一助とするために例示の目的だけで提供されたものであるのみ、本発明の範疇及び範囲は、それらによって制限されるものではない。

【実施例】

【0056】

実施例１：ペプチドの合成、試薬、及び細胞株の準備
１．ペプチドの合成
配列番号１のペプチド（以下「ｐｅｐ １」とする）を従来に知られた固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ：solid phase peptide synthesis）によって製造した。具体的には、ペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Peptron、Ｉｎｃ．，大韓民国・大田）を利用して、Ｆｍｏｃ固相合成法を介して、Ｃ末端からアミノ酸一つずつカップリングすることによって合成した。次のように、ペプチドのＣ末端の最初のアミノ酸が樹脂に付着されたものを使用した。例えば、次の通りである：

【0057】

ＮＨ₂−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resin
ＮＨ₂−Ａｌａ−２−chloro−Trityl Resin
ＮＨ₂−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−２−chloro−Trityl Resin

【0058】

ペプチド合成に使用した全てのアミノ酸原料は、Ｎ−termがＦｍｏｃで保護（protection）され、残基はいずれも酸で除去される、Ｔｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｕ（ｔ−butyl ester）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−pentamethyl dihydro−benzofuran−５−sulfonyl）などで保護されたものを使用した。例えば、次の通りである：

【0059】

Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ、Ｔｒｔ−Mercaptoacetic acid。

【0060】

カップリング試薬（Coupling reagent）としては、ＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−Benzotriazole−１−yl）−１，１，３，３−tetamethylaminium hexafluorophosphate］／ＨＯＢｔ［Ｎ−Hydroxybenzotriazole］／ＮＭＭ［４−Methylmorpholine］を使用した。Ｆｍｏｃ除去は、２０％のＤＭＦ内で、ピペリジン（piperidine in ＤＭＦ）を利用した。合成されたペプチドをResinから分離し、残基の保護基除去には、切断カクテル（Cleavage Cocktail）［ＴＦＡ（trifluoroacetic acid）／ＴＩＳ（triisopropylsilane）／ＥＤＴ（ethanedithiol）／Ｈ₂Ｏ＝９２．５／２．５／２．５／２．５］を使用した。

【0061】

アミノ酸保護基が結合された出発アミノ酸が固相支持体に結合されている状態を利用して、ここに当該アミノ酸をそれぞれ反応させ、溶媒で洗浄した後、脱保護する過程を反復することにより、各ペプチドを合成した。合成されたペプチドを樹脂から切り取った後、ＨＰＬＣで精製し、合成いかんをＭＳで確認して凍結乾燥させた。

【0062】

本実施例に使用されたペプチドに対して、高性能液体クロマトグラフィ結果、全てのペプチドの純度は、９５％以上であった。

【0063】

ＰＥＰ １製造に係わる具体的な過程について説明すれば、次の通りである。
１）カップリング
ＮＨ₂−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resinで保護されたアミノ酸（８当量）と、カップリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶解させて添加した後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。

【0064】

２）Ｆｍｏｃ脱保護
２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in ＤＭＦ）を加え、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。

【0065】

３）１及び２の反応を反復して行い、ペプチド基本骨格ＮＨ₂−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resin）を作った。

【0066】

４）切断（Cleavage）：合成が完了したペプチドResinに、切断カクテル（Cleavage Cocktail）を加え、ペプチドをResinから分離した。

【0067】

５）得られた混合物に、Cooling diethyl etherを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈澱させる。

【0068】

６）Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した後、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認して凍結させ、パウダーに製造した。

【0069】

２．試薬、及び材料の準備
実験のために使用した試薬、及び材料は、次の通りである。パウダー状態のｐｅｐ１は、０．２μｍフィルタで濾過された蒸溜水（０．２μｍ filtered sterile water）に溶かした後、−７０℃で分注（aliquot）して保管し、使用時にそれを溶かして使用し、ドセタキセルは、１００％ ＥｔＯＨに溶かした後、tween ８０及びＰＢＳで共に混合する方法で使用した。５−フルオロウラシル（５−fluorouracil）は、ＰＢＳに溶かして使用した。酢酸ロイプロリドは、ＰＢＳに直接溶かして使用した。

【0070】

３．細胞株の準備
実験に使用された細胞株であるＬＮＣａＰ細胞株は、ヒト前立腺癌転移性細胞であり、ＡＴＣＣ（American Type Cell Culture；Rockville，ＭＤ）から購入し、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute medium）を培地にして、１ないし２ｘ１０⁶／ｍｌになるように、３７℃に維持される５％ ＣＯ₂インキュベータで培養した。

【0071】

実施例２：ＬＮＣａＰ細胞株モデルでのｐｅｐ１の癌細胞増殖抑制測定
ｐｅｐ１の前立腺癌に対する効果を確認するために、ＬＮＣａＰ細胞株を使用して、ＭＴＴアッセイを実施した。癌細胞増殖抑制確認のために実験に使用した試薬、材料及び細胞株培養方法は、前記実施例１に記載されている通りである。使用されたＭＴＴアッセイ方法は、次の通りである。

【0072】

９６ウェルプレート（ＳＰＬ）において一定細胞数（３ｘ１０³／well）で培養したＬＮＣａＰ細胞株を、濃度別ｐｅｐ１（０，０．１，０．３，１，３，１０μＭ）、ドセタキセル（３ｎＭ）が含有された増殖培地で７２時間培養させた後、ＭＴＴ試薬を各ウェルに４０μｌずつ入れる。４時間反応させた後、ＤＭＳＯに溶かし、５７０ｎｍで吸光度を測定した。

【0073】

さらに、ｐｅｐ１の培養時間及び濃度を異にした反復実験を行った。９６ウェルプレート（ＳＰＬ）において一定細胞数（３ｘ１０³／well）で培養したＬＮＣａＰ細胞株を、濃度別にｐｅｐ１（０，０．０１，１，１０，３０μＭ）が含有された増殖培地で９６時間培養させた後、ＭＴＴ試薬を、各ウェルに４０μｌずつ入れる。４時間反応させた後、ＤＭＳＯに溶かし、５７０ｎｍで吸光度を測定した。

【0074】

実験結果の分析のために、さまざまな処置群間の平均をstudent’s ｔ−ｔｅｓｔで検定し、統計的有意性の基準は、ｐ＜０．０５（＊）またはｐ＜０．０１（＊＊）に設定した。

【0075】

前述のような方法で実施したＭＴＴ分析を介して、ｐｅｐ１の癌細胞増殖抑制効果を調べるために、ｐｅｐ１の濃度別に影響を測定した結果、ｐｅｐ１が、０μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ含有された各培地と比較するとき、ｐｅｐ１を１０μＭ含んだ培地で、統計的に有意な細胞増殖抑制効果が発生したということを確認することができた（図１参照）。さらなる反復実験結果でも、ｐｅｐ１が濃度依存的に細胞増殖を抑制するということを確認することができた（図２参照）。

【0076】

また、ドセタキセル３ｎＭ、及び濃度別にｐｅｐ１を含んだ各培地で実施したＭＴＴ分析でも、ドセタキセル３ｎＭと、３μＭ、１０μＭ、３０μＭのｐｅｐ１とを含んだ各培地でも、ドセタキセル３ｎＭと、０μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭのｐｅｐ１とを含んだ各培地と比較するとき、統計的に有意な細胞増殖抑制効果が発生した（図３参照）。それは、ドセタキセルと併用したときも、ｐｅｐ１が濃度依存的に細胞増殖抑制効果を示すということを意味する。

【0077】

実施例３：ＬＮＣａＰ細胞異種移植（xenograft）モデルにおけるｐｅｐ１投与時の癌細胞サイズ測定
ｐｅｐ１が投与されたとき、癌細胞サイズに及ぼす影響を測定するために実験を行った。

【0078】

下記の１）ないし７）の実験群に、ＬＮＣａＰ細胞を移植した。実験のために使用した試薬、材料及び細胞株培養方法は、前記実施例１に記載されている通りである。

【0079】

ＬＮＣａＰ細胞は、ヒト前立腺癌転移性細胞であり、ＡＴＣＣ（American Type Cel lCulture；Rockville，ＭＤ）から購入し、１０％ ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩを培地にして、１ないし２ｘ１０⁶／ｍｌになるように３７℃に維持される５％ ＣＯ₂インキュベータで培養した。

【0080】

実験動物：７個の実験群に、ＬＮＣａＰ細胞を移植した。ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕマウス（中央実験動物、ソウル、韓国から購入）５週齢雄を、各群別に、６匹＋余裕分５匹入手した後、１週間安定化させ、１匹当たりＬＮＣａＰ細胞１＊１０⁷cells（ＬＮＣａＰ細胞）を、１００μｌのＰＢＳに懸濁してわき腹に移植した後、２週間経過を見て、腫瘍を形成していないか、あるいは有意なほどにサイズが大きくない５匹を除き、６匹ずつ平均が同じになるように群分離を行い、下記に記載されているような７個の群に分け、２０日間薬物投与を実施した。癌体積は、カリパス（calipers）で測定し、体積計算は、次のところによる。

【0081】

［width²ｘlengthｘ０．５ｃｍ³］

【0082】

移植以後、ｐｅｐ１、及び陽性対照群に、酢酸ロイプロリド（positive control）を、下のような７個の実験群に分け、それぞれ毎日皮下注射で投与した。

【0083】

１）ＬＮＣａＰ移植対照群（vehicle）
２）ＬＮＣａＰ移植＋ｐｅｐ１ ０．０１ｍｇ／ｋｇ投与群
３）ＬＮＣａＰ移植＋ｐｅｐ１ ０．１ｍｇ／ｋｇ投与群
４）ＬＮＣａＰ移植＋ｐｅｐ１ １ｍｇ／ｋｇ投与群
５）ＬＮＣａＰ移植＋ｐｅｐ１ １０ｍｇ／ｋｇ投与群
６）ＬＮＣａＰ移植＋酢酸ロイプロリド０．１ｍｇ／ｋｇ投与群
７）ＬＮＣａＰ移植＋酢酸ロイプロリド０．１ｍｇ／ｋｇ＋ｐｅｐ１ ０．１ｍｇ／ｋｇ投与群

【0084】

また、ｐｅｐ１がドセタキセルと併用投与されたとき、癌細胞サイズに及ぼす影響を測定するために追加実験を行った。

【0085】

下記の８）ないし１３）の実験群に、ＬＮＣａＰ細胞を移植した。実験のために使用した試薬、材料及び細胞株培養方法は、前記実施例１に記載されている通りである。

【0086】

実験動物：６個の実験群に、ＬＮＣａＰ細胞を移植した。ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕマウス（中央実験動物、ソウル、韓国から購入）５週齢雄を、各群別に、６匹＋余裕分５匹を入手した後、１週間安定化させ、１匹当たりＬＮＣａＰ細胞１＊１０⁷cells（ＬＮＣａＰ細胞）を、１００μｌのＰＢＳに懸濁し、わき腹に移植した後、２週間経過を見て、腫瘍を形成していないか、あるいは有意なほどにサイズが大きくない５匹を除き、６匹ずつ平均が同じになるように群分離を行い、下記に記載されているような６個の群に分け、２０日間薬物投与を実施した。癌体積は、カリパスで測定し、体積計算は、次のところによる。

【0087】

［width²ｘlengthｘ０．５ｃｍ³］

【0088】

移植以後、ｐｅｐ１とドセタキセルとを、以下のような６個の実験群に分けてそれぞれ投与した。

【0089】

８）ＬＮＣａＰ移植対照群
９）ＬＮＣａＰ移植＋ドセタキセル２０ｍｇ／ｋｇ（週１回、腹腔内）投与群
１０）ＬＮＣａＰ移植＋ｐｅｐ１ ３０ｍｇ／ｋｇ（週３回、皮下）投与群
１１）ＬＮＣａＰ移植＋ｐｅｐ１ ３ｍｇ／ｋｇ＋ドセタキセル２０ｍｇ／ｋｇ投与群
１２）ＬＮＣａＰ移植＋ｐｅｐ１ １０ｍｇ／ｋｇ＋ドセタキセル２０ｍｇ／ｋｇ投与群
１３）ＬＮＣａＰ移植＋ｐｅｐ１ ３０ｍｇ／ｋｇ＋ドセタキセル２０ｍｇ／ｋｇ投与群

【0090】

その後、毎回飲水量、食餌摂取量、癌増殖率（短径、長径）を測定し、腫瘍重量（tumor weight/body weight）、大腿部筋肉重量を定量した。また、癌組織標本制作及びＰＣＮＡ（細胞増殖マーカー）／ＴＵＮＥＬ（自家死滅マーカー）染色を行った。

【0091】

実験結果分析のために、さまざまな処置群間の平均を、student’s ｔ−ｔｅｓｔで検定した。統計的有意性の基準は、ｐ＜０．０５（＊）またはｐ＜０．０１（＊＊）と設定した。

【0092】

前記実験群別の分析結果、ｐｅｐ１を、０．０１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇ濃度で投与した場合、有意性ある癌増殖抑制効果を示すことができなかったが、ｐｅｐ１を、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ濃度で投与した場合、陽性対照群である酢酸ロイプロリドより、さらに抑制効果が観察されるということを確認することができた（図４参照、図４において、Ｙ軸の単位は、腫瘍体積であり、ｍｍ³である）。それは、ｐｅｐ１が、ＬＮＣａＰ細胞で有意性ある癌増殖抑制効果があるということを、動物モデルでも確認することができるということを意味する。さらに、酢酸ロイプロリドと併用投与した７）群と、酢酸ロイプロリドを単独投与した６）群とを比較すれば、ｐｅｐ１が、酢酸ロイプロリドとの併用投与時にも、癌細胞サイズ抑制に効果があるということをさらに確認することができた。

【0093】

また、ｐｅｐ１とドセタキセルとを併用投与した追加実験分析結果、ドセタキセルとｐｅｐ１とを併用投与した場合、有意性ある抑制効果が観察されるということを確認することができた。特に、ｐｅｐ１を１０ｍｇ／ｋｇ投与し、ドセタキセルを２０ｍｇ／ｋｇ併用した実験群の場合、最終評価時点において、癌増殖の明らかな抑制効果が観察された（図５参照、図５において、Ｙ軸の単位は、腫瘍体積であり、ｍｍ³である）。それは、ｐｅｐ１がドセタキセルとの併用投与時にも、ＬＮＣａＰ細胞において、有意性ある癌増殖抑制効果があるということを動物モデルでも確認することができるということを意味する。

【0094】

実施例４：ＬＮＣａＰ細胞異種移植モデルにおけるｐｅｐ１投与時の体重変化測定
ＬＮＣａＰ異種移植モデルの腫瘍細胞増殖による体重変化を観察するために、実施例３で実験された１）ないし７）の実験群の体重を測定した。
実験群別に分析した結果、対照群（vehicle、実験群１））及び酢酸ロイプロリド単独及び併用投与群（実験群６及び７））と、ｐｅｐ１濃度別投与群（実験群２ないし５）との間に体重の急激な差が示されず、ｐｅｐ１投与の体内安定性を確認することができた（図６参照）。

【0095】

実施例５：ＬＮＣａＰ細胞株モデルにおけるｐｅｐ１の癌細胞移動性（migration）抑制測定
トランスウェル分析（trans-well assay）を介して、ｐｅｐ１が癌細胞移動性に及ぼす影響を評価した。

【0096】

癌細胞移動性評価のために使用した試薬、材料及び細胞株培養方法は、前記実施例１に記載されている通りである。使用された移動性分析（migration assay）方法は、次の通りである。

【0097】

ＬＮＣａＰ細胞株を、６ウェルプレートで一晩中培養し、濃度別にｐｅｐ１（０、１，１０，３０μＭ）を処理して２４時間培養した。その後、トランスウェルプレート（trans-well plate）に、１ｘ１０⁴／wellで接種（seeding）した。３時間後、ウェルの上部分（upper compartment）を除去し、下方に移動した細胞を固定、染色し、セル数を定量した。

【0098】

また、ドセタキセルとの併用投与時の移動性を観察するための追加実験を行った。ＬＮＣａＰ細胞株を、６ウェルプレートで一晩中培養し、濃度別にｐｅｐ１（０，１，３，１０，３０μＭ）を処理して２４時間培養した。さらに、ドセタキセル（３ｎＭ）が含有された増殖培地で４８時間培養させた後、トランスウェルプレートに、１ｘ１０⁴／wellで接種した。３時間後、ウェルの上部分を除去し、下方に移動した細胞を固定、染色し、セル数を定量した。

【0099】

実験結果分析のために、多くの処置群間の平均を、student’s ｔ−ｔｅｓｔで検定した。統計的有意性の基準は、ｐ＜０．０５（＊）またはｐ＜０．０１（＊＊）に設定した。

【0100】

前述のような方法で実施したトランスウェル分析結果、ｐｅｐ１が含有されていない培地（０μＭ、control）では、癌細胞移動が増加したが、ｐｅｐ１（１μＭ、１０μＭ、３０μＭ）を共に処理した場合、癌細胞移動が統計的に有意なほど抑制されるということが分かった（図７及び図８参照）。図７及び図８において、controlは、ＬＮＣａＰ移植後、ｐｅｐ１処理を行っていない実験群である。

【0101】

また、ドセタキセルとの併用投与追加実験の分析結果、ドセタキセル（３ｎＭ）が含有された培地では、癌細胞移動が増加したが、ドセタキセル（３ｎＭ）が含有された培地に、ｐｅｐ１（３μＭ、１０μＭ、３０μＭ）を共に処理した場合、癌細胞移動が統計的に有意なほど抑制されるということが分かった（図９ないし図１４参照）。

【0102】

実施例６：ＬＮＣａＰ細胞株モデルにおけるｐｅｐ１の投与時の癌細胞移動性マーカー（ＭＭＰ９、ＭＭＰ２）のｍＲＮＡ発現程度測定
癌細胞の移動性を示すｍＲＮＡマーカーＭＭＰ９（matrix metalloproteinase−９）及びＭＭＰ２（matrix metalloproteinase−２）の発現を観察するために、ＬＮＣａＰ異種移植された組織において、相対的な発現程度を観察した（図１５及び図１６参照）。

【0103】

下記の１４）ないし１６）の実験群に、ＬＮＣａＰ細胞を移植した。実験のために使用した試薬、材料及び細胞株培養方法は、前記実施例１に記載されている通りである。
ＬＮＣａＰ細胞は、ヒト前立腺癌転移性細胞であり、ＡＴＣＣ（American Type Cel lCulture；Rockville，ＭＤ）から購入し、１０％ ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩを培地にし、１ないし２ｘ１０⁶／ｍｌになるように、３７℃に維持される５％ ＣＯ₂インキュベータで培養した。

【0104】

実験動物：３個の実験群に、ＬＮＣａＰ細胞を移植した。ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕマウス（中央実験動物、ソウル、韓国から購入）５週齢雄を、各群別に、６匹＋余裕分５匹入手した後、１週間安定化させ、１匹当たりＬＮＣａＰ細胞１＊１０⁷cells（ＬＮＣａＰ細胞）を、１００μｌのＰＢＳに懸濁し、わき腹に移植した後、２週間経過を見て、腫瘍を形成していないか、あるいは有意なほどにサイズが大きくない５匹を除き、６匹ずつ平均が同じになるように群分離を行い、下記に記載されているような３個の群に分け、２０日間薬物投与を実施した。

【0105】

移植以後、ｐｅｐ１、及び陽性対照群に、酢酸ロイプロリド（positive control）を、以下のような３個の実験群に分け、それぞれ毎日皮下注射で投与した。

【0106】

１４）ＬＮＣａＰ移植対照群（vehicle）
１５）ＬＮＣａＰ移植＋ｐｅｐ１ １０ｍｇ／ｋｇ投与群
１６）ＬＮＣａＰ移植＋酢酸ロイプロリド０．１ｍｇ／ｋｇ投与群

【0107】

実験結果分析のために、さまざまな処置群間の平均を、student’s ｔ−ｔｅｓｔで検定した。統計的有意性の基準は、ｐ＜０．０５（＊）またはｐ＜０．０１（＊＊）に設定した。

【0108】

３個の各実験群から採集した腫瘍組織からＲＮＡを抽出した後、抽出したＲＮＡにおいて、ＭＭＰ９及びＭＭＰ２のプリマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲの結果として増幅された各サンプルを、電気泳動法を使用して、２Ｄゲルに下げた後、蛍光染色を行い、その発現程度を測定した。ｍＲＮＡのＰＣＲを介した分析法は、一般的に周知の方法を介して遂行された。

【0109】

発現程度は、ＭＭＰ９の場合、対照群（vehicle）の場合を２と判読したものを基準に相対的な発現を示し（図１５参照）、ＭＭＰ２の場合、対照群（vehicle）の場合を３８と判読したことを基準に、相対的な発現を示した（図１６参照）。

【0110】

発現程度の比較結果ＭＭＰ９及びＭＭＰ２のいずれにおいても、対照群（vehicle）及び陽性対照群（leuprolide）に比べ、ｐｅｐ１を投与した腫瘍組織において、低い発現程度を示し、ｐｅｐ１が癌組織の癌細胞移動性減少に効果があるということが分かった。

【0111】

前記実施例２において、ｐｅｐ１は、単独投与時、及び既存抗癌剤との併用投与時、前立腺癌細胞株の増殖抑制効能を示した。実施例３及び５では、前立腺癌細胞株を移植された動物モデルにおいて、癌細胞サイズを小さくさせる効能（実施例３）、及び前立腺癌細胞の移動を抑制する効能（実施例５）も示した。実施例６では、前立腺癌の転移を示す癌細胞移動関連ｍＲＮＡマーカーの発現を抑制する効能も示した。さらに、実施例４においては、ｐｅｐ１の投与時、体重の急激な変化がないということが分かり、投与時に安定性もあるということが分かった。従って、結論として、ｐｅｐ１は、前立腺癌の増殖抑制、転移抑制にいずれも効能を有しながらも、安全であり、ｐｅｐ１を含んだ前立腺癌増殖抑制剤、転移抑制剤として使用可能であり、それを活用し、前立腺癌治療剤として可能性を有するといえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]