特許 6367974 発酵大豆粕の向上した生産能を有するバチルス属菌株及びそれを用いて発酵大豆粕を製造する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6367974

(24)【登録日】2018年7月13日

(45)【発行日】2018年8月8日

(54)【発明の名称】発酵大豆粕の向上した生産能を有するバチルス属菌株及びそれを用いて発酵大豆粕を製造する方法

(51)【国際特許分類】

   A23L 11/00 20160101AFI20180730BHJP

   C12P 1/04 20060101ALI20180730BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20180730BHJP

   A23K 10/12 20160101ALI20180730BHJP

   A23K 10/37 20160101ALI20180730BHJP

【ＦＩ】

   A23L11/00 E

   C12P1/04 ZZNA

   C12N1/20 E

   C12N1/20 A

   A23K10/12

   A23K10/37

【請求項の数】9

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2016-566591(P2016-566591)

(86)(22)【出願日】2015年1月28日

(65)【公表番号】特表2017-506081(P2017-506081A)

(43)【公表日】2017年3月2日

(86)【国際出願番号】KR2015000900

(87)【国際公開番号】WO2015115790

(87)【国際公開日】20150806

【審査請求日】2016年7月26日

(31)【優先権主張番号】10-2014-0010729

(32)【優先日】2014年1月28日

(33)【優先権主張国】KR

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM11438P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM11471P

(73)【特許権者】

【識別番号】514199250

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダング コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100097456

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 徹

(72)【発明者】

【氏名】タエク ベオム キム

(72)【発明者】

【氏名】ソング フイ グウオン

(72)【発明者】

【氏名】ビ ナ キム

(72)【発明者】

【氏名】セオング ジュン チョ

(72)【発明者】

【氏名】キュング イル カング

(72)【発明者】

【氏名】セウング ウオン パルク

(72)【発明者】

【氏名】ヨウング ホ ホング

(72)【発明者】

【氏名】ミン ジュ パルク

【審査官】 鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−０５５８３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１３−００９５１２７（ＫＲ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２００８−００９５６５２（ＫＲ，Ａ）

【文献】 国際公開第９８／０１７１２７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０２５１７４８（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ２３Ｌ １１／００−１１／３０

Ａ２３Ｋ １０／００−１０／４０

Ｃ１２Ｎ １／００−１／３８

Ｃ１２Ｐ １／００−１／０６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

固体発酵により発酵大豆粕を製造する方法において、寄託番号ＫＣＣＭ１１４７１Ｐとして寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株を大豆粕に接種する段階を含むことを特徴とする発酵大豆粕の製造方法。

【請求項2】

下記段階を含む請求項１に記載の方法：
ａ）大豆粕に水分を添加して熱処理する段階；
ｂ）前記熱処理された大豆粕を冷却した後、バチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株を接種する段階； 及び
ｃ）前記大豆粕に接種されたバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株を固体培養して発酵大豆粕を得る段階。

【請求項3】

段階ａ）において水分が添加された大豆粕が３０〜８０％（ｖ／ｗ）の水分含量を有する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

段階ａ）の熱処理が、大豆粕を７０〜１３０℃で１０〜３０分間熱処理することである、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

段階ｂ）において大豆粕が３０〜５０℃に冷却される、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

段階ｂ）においてバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株が接種直後に１０^５〜１０^９ ＣＦＵ／ｇの菌数となるように接種される、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

段階ｃ）において固体培養が３０〜４５℃で１２〜４８時間行われる、請求項２に記載の方法。

【請求項8】

段階ｃ）で得られた発酵大豆粕を乾燥及び粉砕する段階をさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項9】

寄託番号ＫＣＣＭ１１４７１Ｐとして寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、発酵大豆粕の生産能が向上した新規なバチルス属（Bacillus sp.）菌株及びそれを用いて発酵大豆粕を製造する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、抗栄養因子の削除及びタンパク分解酵素活性に優れ、病原菌に対して高い抗菌活性を示しながら発酵過程中に粘液質生成能が低下し、発酵大豆粕の生産能が向上した新規なバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株、前記菌株を用いて発酵大豆粕を製造する方法、これから製造された発酵大豆粕、及びこれを含む飼料組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトに致命的な狂牛病などの疾病が飼料に添加される動物性タンパク質成分に起因した結果であると判定され、全世界的に飼料に添加される動物性タンパク質を植物性タンパク質に代替しようとする動きが急速に進められている。

【0003】

飼料市場において魚粉、肉骨粉または血漿のような動物性タンパク質の代替品として使用している植物性タンパク質原料の中で、最も大きな割合を占めているのが脱脂大豆粕（以下、「大豆粕」という）である。大豆粕は、大豆油を絞ったあとの残りかすを意味するものであり、豆かすとも呼ばれる。韓国において植物性タンパク質飼料源として用いられる大豆粕は、全飼料の６０％を占め、供給量は年間２００万トンに達している（２００４年、韓国単味飼料協会）。

【0004】

大豆粕は、乾燥物を基準として、タンパク質が５５〜５６重量％、可溶性炭水化物が１３〜１４重量％、不溶性炭水化物が２１〜２２重量％が含有されており、この他に１重量％程度の粗脂肪と４〜６重量％程度を含んでいる（非特許文献１）。

【0005】

一方、大豆粕には、多様な抗栄養因子（anti-nutritional factor、ANF）が含まれており、飼料として利用した場合、消化率が阻害されるという問題点がある（非特許文献２）。その中で代表的なものがトリプシン阻害因子（trypsin inhibitor、TI）であり、陸上動物において食餌TIは、トリプシン（trypsin）とキモトリプシン（chymotrypsin）の適切な酵素機能を阻害し、全タンパク質の利用性を低下させる。特に、このような抗栄養因子の影響は、仔家畜の場合に顕著に現れるため、仔家畜用飼料に添加される大豆粕の使用量を制限している。それ以外にも、血球凝集素であるヘマグルチニン（hemagglutinin）、家畜の下痢、腹痛を誘発するラフィノース、スタキオースなどのようなオリゴ糖、栄養成分の吸収を阻害する多糖類などが知られている。これらの一部は、熱処理により破壊されるが、この過程で大豆タンパク質が変性され、溶解度が減少し、リジン（lysine）などの必須アミノ酸が消失され得る。これに対し、最近では、大豆のタンパク質をより効率的に利用するために、抗栄養因子を除去して効率性を増大させる加工方法が開発されている。

【0006】

現在、生産されている濃縮大豆タンパク質（soy protein concentrates）、分離大豆タンパク質（isolated soy proteins）または加水分解大豆タンパク質（hydrolized soy protein ）などのような大豆タンパク質加工品は、化学的処理または酵素的処理により生産されている。しかし、化学的処理方法は、生産単価が高く、製造過程中の熱処理、化学的処理、熱乾燥などにより、タンパク質の変性、水溶性アミノ酸の消失などが起き、実際のタンパク質の溶解度が低下するという問題点を有する。このため、化学的加工方法は、タンパク質の深刻な変性が起こらない程度で熱処理をするため、抗栄養因子のトリプシン阻害因子が大豆タンパク質内に相当量存在するようになる。

【0007】

このような化学的加工方法の問題点を解決する手段としてバチルス菌またはカビを利用した生物学的加工方法で発酵させた発酵大豆粕の製品が開発された（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。前記発酵処理加工方法は、発酵過程中に多数の抗栄養因子を除去することができ、さらにタンパク質や炭水化物を消化しやすい低分子の形に分解することができるため、消化吸収率に優れた高品質の飼料用タンパク素材を製造することができる。

【0008】

しかし、前記発酵処理加工方法は、一般的に、固体発酵を利用するが、固体発酵は好気的な状態と発酵の過程で生産される発酵熱を除去するために持続的に空気を吹き込まなければならない短所がある。また、前記発酵処理加工方法は、適正なレベル以上の抗栄養因子を除去するためには、４８時間以上の長い発酵時間を必要とする。このような長い発酵時間は、製麹機の回転率を低下させ、全体的な原価の上昇をもたらす。

【0009】

そこで、本発明者らは、発酵処理大豆粕の製造時の発酵時間を最大限に短縮するために、発酵大豆粕の生産に必要な優れた特性を有するバチルスサブチリスＴＰ６菌株（ＫＦＣＣ１１３４３Ｐ、国際寄託番号ＫＣＣＭ１１４３８Ｐ）を用いて固体発酵により発酵大豆粕を製造する方法を開発した（特許文献４）。前記方法は、抗栄養因子の除去活性及びタンパク質分解能力に優れたバチルスサブチリスＴＰ６菌株を用いて、従来の発酵大豆粕に比べて短い発酵時間にもかかわらず同等以上の品質を有する発酵大豆粕を製造することができる。

【0010】

しかし、前記方法は、大豆粕の発酵時に大腸菌やサルモネラ菌に汚染される場合、このような病原菌に対するバチルスサブチリスＴＰ６菌株の増殖抑制能が弱く、発酵過程中に、病原菌も共に増殖することになる問題点が発生し得る。

【0011】

そこで、本発明者らは、大豆粕の固体発酵に有用な改良された特性を有する発酵菌株を選抜するために鋭意研究、努力した結果、抗栄養因子の除去、タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性が優れながら、発酵過程中に粘液質生成能の低下したバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）Ｋ２Ｇ菌株を開発した。また、本発明者らは、前記菌株を用いて大豆粕を固体発酵させると、従来に比べて短縮された発酵時間内に大豆タンパク質の加水分解による低分子化及び粗タンパク含量の増加、トリプシン阻害因子の不活性化、非消化性多糖類のような抗栄養因子の含量の減少などにより、消化吸収率と飼料効率が増加した高品質の発酵大豆粕を製造することができることを確認することにより、本発明を完成した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】韓国特許登録第１０−０６４５２８４号公報

【特許文献2】韓国特許登録第１０−０４５９２４０号公報

【特許文献3】韓国特許登録第１０−０９２５１７３号公報

【特許文献4】韓国特許公開第１０−２０１１−００２７５３５号公報

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】ハン・インギュ、植物性タンパク質飼料、飼料加工学、先進文化社、67-107、1998

【非特許文献2】Li et al. J. Anim. Sci,. 68: 1790, 1990

【非特許文献3】Goto et al.Biosci.Biotechnol.Biochem,. 56：1031-1035.、1992

【非特許文献4】Abulto et al. J. Appl. Poult. Res. 7:189-195, 1998b

【非特許文献5】Parsons et al. J Anim Sci., 69: 2918-24, 1991

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明の目的は、発酵大豆粕の生産能が向上した新規なバチルス・アミロリケファシエンス菌株を提供することにある。

【0015】

本発明の他の目的は、前記バチルス・アミロリケファシエンス菌株を用いて固体発酵により発酵大豆粕を製造する方法を提供することにある。

【0016】

本発明のもう一つの目的は、前記方法により製造された発酵大豆粕を提供することにある。

【0017】

本発明のもう一つの目的は、前記発酵大豆粕を含む飼料組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0018】

前記目的を達成するための一つの態様として、本発明は、固体発酵による発酵大豆粕の製造に有用である新規なバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株（KCCM11471P）を提供する。

【0019】

本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株は、抗栄養因子除去活性、タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性に優れ、粘液質生成能が低下し、固体発酵により高品質の発酵大豆粕を製造することができることを特徴とする。

【0020】

具体的には、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株は、活性が強力なタンパク分解酵素を生産して大豆粕の消化を阻害するトリプシン阻害因子（ＴＩ）のような多様な多糖類抗栄養因子を不活性化させるだけでなく、高分子である大豆タンパク質を大部分加水分解して低分子化することにより、発酵大豆粕の消化吸収率を大幅に増加させることができる。

【0021】

また、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株は、大豆粕の構成成分のうち、炭水化物を用いて活発に生育しながら、菌体を構成するタンパク質に転換させるため、発酵大豆粕内の粗タンパク含量を相対的に増加させ、これは、高品質飼料の製造に重要な意味を有する。

【0022】

好ましい一実施例において、本発明は、固体発酵による発酵大豆粕の製造に有用に用いられる発酵菌株を選別するために、まず、多様な伝統的な発酵食品から１４種のタンパク分解酵素生成能に優れた菌株を分離する（表１を参照）。

【0023】

前記のように分離された１４種の菌株のうち、家畜に対して食中毒を起こす代表的な病原菌である大腸菌及びサルモネラ菌に対して最も優れた抗菌活性を示すＣＪ８２３菌株を選別する。

【0024】

選別されたＣＪ８２３菌株は、従来の固体発酵により発酵大豆粕を製造する方法において発酵菌株として用いられたバチルスサブチリスＴＰ６菌株（ＫＦＣＣ １１３４３Ｐ；非特許文献４）に比べて、大腸菌とサルモネラ菌に対して格段に優れた抗菌活性を示す（表２を参照）。

【0025】

また、ＣＪ８２３菌株は、実際の発酵過程中においてもサルモネラ菌の生育を効果的に抑制し、高品質の発酵大豆粕の製造に適していることが確認される（表３を参照）。

【0026】

このようにＣＪ８２３菌株は、タンパク分解酵素を高濃度で生産し、病原菌に対して優れた抗菌活性を示すが、発酵過程中に生産される酵素により原料大豆の糖質、タンパク質に由来するレバン型のフルクタン（levan form fructan）とポリグルタミン酸（polyglutamate）の重合により粘着性粘液質が生成される。このような粘液質の生成は、発酵大豆粕の大規模な生産時において発酵工程の制御、発酵物の移送などに問題をもたらし得る。

【0027】

そこで、本発明者らは、ＣＪ８２３菌株の酵素的／生理的特性はそのまま維持しながら粘液質の生成能の低下した変異株を開発するために、ＣＪ８２３菌株にＵＶを照射して突然変異を誘発する（図３を参照）。

【0028】

まず、２５４nmのＵＶをＣＪ８２３菌株に照射した後、脱脂乳含有選別培地からコロニーの形態及び粘液質の形成によるクリアーゾーン（clear zone）の形成可否に応じて１６種の変異株を選別する。選別された１６種の変異株を固体培養した後、タンパク分解酵素活性とγ-ＰＧＡ（Poly-γ-Glutamic Acid）の含量を分析し、タンパク分解酵素活性は最も高く、比較的に低いγ-ＰＧＡＡの含量を示すＵ３０４変異株を最終的に選別する（表４を参照）。

【0029】

最終的に選別されたＵ３０４変異株の同定のために一次的に糖利用性を分析した結果、Ｕ３０４変異株は、生化学的な特性上、バチルスサブチリス及びバチルス・アミロリケファシエンスと９８％の類似率を示すことが確認される（表５を参照）。

【0030】

また、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列分析の結果、Ｕ３０４変異株は、配列番号：１の１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列を有する。前記配列を根拠に公知菌株との配列相同性の比較及び系統分類学的な類縁関係を分析した結果、Ｕ３０４変異株は、バチルス・アミロリケファシエンスと９９．９２％の類似性を示し、系統樹で最も類縁関係が高いことが判明される（図５を参照）。

【0031】

これに対し、前記生化学的特性、配列相同性及び系統分類学的な類縁関係の分析結果を総合して、本発明によるＵ３０４変異株をバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇと命名した。

【0032】

本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株は、タンパク分解酵素を高濃度で生産し、大腸菌またはサルモネラ菌のような病原菌に対して優れた抗菌活性を示す親菌株の特性はそのまま維持し、かつ、ポリ−γ−グルタミン酸のような高分子物質の生成が著しく低下し、粘液質生成能の低下した改良菌株であり、固体発酵による発酵大豆粕の製造に非常に有用に用いられる。

【0033】

このような有用性を確認するために、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株の固体発酵による粗タンパク含量の変化を調べた結果、２４時間発酵すると、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株により発酵した大豆粕は、従来、大豆粕発酵菌株として知られているバチルスサブチリスＴＰ６菌株により発酵された大豆粕と同等レベル以上の粗タンパク含量を示すことを確認する（表６を参照）。

【0034】

また、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株の発酵による大豆粕内のトリプシン阻害因子（ＴＩ）の含量の変化を調べた結果、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株により１６時間発酵された大豆粕のＴＩの含量は、バチルスサブチリスＴＰ６菌株により２４時間発酵された大豆粕のＴＩの含量に相当することが示され、１６時間の発酵だけで同等なレベルの抗栄養因子の低減効果が達成されることが確認される（表７を参照）。

【0035】

前記結果は、固体発酵による発酵大豆粕の製造時、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株が、高品質のタンパク質飼料として粗タンパクの含量は高く、抗栄養因子の含量は低い発酵大豆粕を、従来に比べて短縮された発酵時間で製造することができることを意味する。このような発酵時間の短縮は、製麹機の回転率を高め、これは年間の生産可能な配置数の増加につながり、消費者に、より安価で高品質の発酵大豆粕を供給することができるという点で、本発明の優位性を確認することができる。

【0036】

そこで、本発明者らは、抗栄養因子除去活性、タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性に優れ、粘液質生成能が低下し、固体発酵による高品質の発酵大豆粕の製造に有用に用いられるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株をブダペスト条約の下、２０１３年１１月７日付で韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM）に寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１１４７１Ｐが与えられた。

【0037】

発明の別の態様において、本発明は、バチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株を用いて固体発酵により発酵大豆粕を製造する方法を提供する。

【0038】

具体的には、本発明による製造方法は、
ａ）大豆粕に水分を添加して熱処理する段階；
ｂ）前記熱処理された大豆粕を冷却した後、バチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株を接種する段階； 及び
ｃ）前記大豆粕に接種されたバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株を固体培養して発酵大豆粕を得る段階を含むことを特徴とする。

【0039】

段階ａ）は、原料である大豆粕に水分を添加して熱処理を行う段階であり、原料大豆粕は、固体発酵する前に、適量の水を直接噴霧、混合して水分含量を調節した後、一定の時間で熱処理することが望ましい。

【0040】

発明の好ましい実施例によると、前記段階ａ）おける水分は、大豆粕の水分含量が３０〜８０％（ｖ／ｗ）、好ましくは３０〜７０％（ｖ／ｗ）、さらに好ましくは４０〜６０％（ｖ／ｗ）となるように添加することが望ましい。前記水分含量の範囲の大豆粕は、低水分による発酵速度の遅延を防止し、大豆粕の移送及び発酵後の乾燥工程に多くの費用が要されるという問題点を改善するだけでなく、熱効率の面で好ましい。

【0041】

次いで、水分が添加された大豆粕を熱処理するが、熱処理の目的は、原料大豆粕中の雑菌を死滅させると共に大豆細胞壁を破壊し、タンパク質を変性させることにより、目的とする微生物が活発に生育できる環境を提供するためのことにある。熱処理は、当業界において公知となった多様な方法を利用することができるが、好ましくは、スチーム（steam）または過熱水蒸気（superheated steam）を用いて行われる。

【0042】

発明の好ましい実施例によると、段階ａ）の熱処理は、７０〜１３０℃のスチームで１０〜６０分間蒸煮したり、２００〜３００℃の過熱水蒸気で数秒〜数分の短時間で熱処理する。より好ましくは、７０〜１３０℃のスチームで１０〜３０分間蒸煮し、最も好ましくは８０〜１２１．１℃のスチームで１０〜３０分間蒸煮する。

【0043】

熱処理温度が低かったり、処理時間が短い場合には、雑菌の殺菌効果が低下し、その後の発酵工程が円滑に進まないという問題点があり、熱処理温度が高かったり、処理時間が長くなる場合には、大豆粕内のタンパク質の変性による消化率が減少し、最終製品の品質低下問題が発生する。したがって、このような問題点が発生しないように熱処理温度または処理時間を前記範囲内で採用することが望ましい。

【0044】

このような熱処理過程を通じて大豆粕に存在する汚染菌がほとんど死滅し、その後の工程である固体発酵が円滑に進められる化学的環境になる効果だけでなく、消化率を阻害するトリプシン阻害因子（ＴＩ）のような抗栄養因子がわずかに減少する効果も期待し得る。

【0045】

段階ｂ）は、前記のように熱処理した大豆粕を固体発酵が可能な温度に冷却した後、バチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株を接種する段階である。本発明において、大豆粕は熱処理が終結した後、自然冷却させるが、冷却速度を高めて過熱を防止し、均一に冷却するためにコンベヤー（conveyor）式の放冷気を利用した移送過程を経れば、簡単に行うことができる。

【0046】

発明の好ましい実施例によると、段階ｂ）において大豆粕は、３０〜５０℃に、より好ましくは３５〜４５℃に、最も好ましくは３７℃に冷却される。

【0047】

熱処理した大豆粕を冷却した後、製造した大豆粕の培地に本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株を培養した前培養液をそのまま、または適切に殺菌水で希釈し、できるだけ均一に接種することが望ましい。

【0048】

熱処理した大豆粕に接種する発酵菌株の量は、大豆粕の固体発酵を左右する重要な要因になる。熱処理した大豆粕への発酵菌株の接種量は、接種直後の菌数が１０^５〜１０^９ ＣＦＵ／ｇになるようにすることが望ましい。

【0049】

接種量が１０^５ ＣＦＵ／ｇ未満の場合には、種菌発酵液の所要量が少ない反面、大豆粕を発酵させるのに多くの時間が要され、製品の生産に要求される発酵時間が長くなり、雑菌汚染の可能性が高いという短所がある。一方、接種量が１０^９ ＣＦＵ／ｇを超える場合には、発酵時間は大幅に短縮することができるが、接種用種菌の生産が負担になるという短所がある。特に、用いる発酵菌株の生育特性と発酵装置の種類に応じて、発酵成績が大きく左右されるため、生産段階で菌株の特性を考慮し、接種量を適切に選定することが望ましい。

【0050】

段階ｃ）は、大豆粕に接種されたバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株を固体発酵させて発酵大豆粕を得る段階であり、例えば、充填層発酵器（packed-bed fermentor）を用いて発酵させる。

【0051】

充填層発酵器には、回分式通気培養装置、密閉式培養装置、連続式通気培養装置など多様な形式があり、大豆粕の固体発酵に有用なものであれば、その形式に制限なく本発明の方法に用いられ、生産規模に応じて適切な装置を選択して使用することが望ましい。

【0052】

発明の好ましい実施例によると、充填層発酵器にバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株を接種した大豆粕を５〜５０cmの厚さで載置し、２０〜５０℃で１２〜７２時間発酵させる。この時、大豆粕の充填層の厚さは、厚いほど好ましく、３０〜４５℃で１２〜４８時間発酵させることが好ましい。最も好ましくは、３７℃で２４時間発酵させることである。

【0053】

本発明の方法は、前記の段階ｃ）の後に得られた発酵大豆粕を低温低湿乾燥及び粉砕する段階をさらに含むことができる。

【0054】

発酵過程において大豆粕中の水分は、一部蒸発するが、発酵終了直後には、残存水分含量が２０〜５０％（ｖ／ｗ）とかなり高い。しかし、発酵大豆粕製品の最終的な水分含量は、１０〜１２％（ｖ／ｗ）が望ましいため、乾燥工程が必要である。

【0055】

また、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株を用いた固体発酵時に発酵大豆粕の状態が非常に良好であるが、部分的に若干弱く凝った塊を形成するため、乾燥した後、発酵大豆粕の粒子サイズが均一に粉砕する必要がある。

【0056】

乾燥及び粉砕は、当業界において公知となった多様な方法で行うことができるが、過度に高温で乾燥した場合には、発酵大豆粕中の生菌の大部分が死滅するため、注意しなければならない。好ましくは、生菌が死滅しない低温で乾燥しなければならず、低温低湿度の熱風で乾燥することが最も好ましい。粉砕過程は、発酵大豆粕を利用しようとする目的に応じて多様な大きさに粉砕してもよく、粉砕方法として好ましくは、ハンマーミル（hammer mill）を利用してもよい。

【0057】

前述した本発明の方法によりアミロリケファシエンスＫ２Ｇ菌株を用いて、大豆粕を固体発酵することにより、大豆粕に含有されたＴＩをはじめとして、各種抗栄養因子が減少し、タンパク質の加水分解及び低分子化により消化吸収率が向上し、粗タンパク含量が増加した発酵大豆粕が得られ、これは、飼料としての絶対的な価値が改善されたものとして、動物性タンパク質を代替し得る高品質のタンパク質飼料材料として利用価値が非常に高い。

【0058】

よって、発明の別の態様では、前記方法により製造された発酵大豆粕を含む飼料組成物を提供する。

【0059】

本発明による飼料組成物内の発酵大豆粕の含量は、適用される家畜の種類及び年齢、適用形態、目的とする効果などに応じて適宜に調節可能であり、例えば、１〜９９重量％、好ましくは１０〜９０重量％、さらに好ましくは２０〜８０重量％で用いることができるが、これらに限定されるものではない。

【0060】

本発明の飼料組成物は、投与のために発酵大豆粕以外に、さらにクエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸などの有機酸；リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、重合リン酸塩などのリン酸塩；ポリフェノール、カテチン、トコフェロール、ビタミンＣ、緑茶抽出物、キトサン、タンニン酸などの天然抗酸化剤のうち１種以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗インフルエンザ剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤または潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。

【0061】

また、本発明の飼料組成物は、補助成分としてアミノ酸、無機塩類、ビタミン、抗酸化剤、抗真菌剤、抗菌剤などのような各種補助剤及び粉砕または破砕された小麦、大麦、トウモロコシなどの植物性タンパク質飼料、血粉、肉粉、魚分などの動物性タンパク質飼料、動物性脂肪及び植物性脂肪のような主成分以外にも、栄養補充剤、成長促進剤、消化吸収促進剤、疾病予防剤と共に用いられる。

【0062】

本発明の飼料組成物を飼料添加物として用いる場合、前記飼料組成物をそのまま添加したり、他の成分と共に用いることができ、常法に従って適切に用いられる。飼料組成物の投与形態は、非毒性製薬上許容可能な担体と組み合わせて、即時放出または徐放性剤形に製造することができる。このような食用担体は、トウモロコシの澱粉、ラクトース、スクロース、プロピレングリコールであってもよい。高体型担体の場合には、錠剤、散剤、トローチ剤などの投与形態であってもよく、液状担体の場合には、シロップ剤、液体懸濁液剤、エマルジョン剤、溶液剤などの投与形態であってもよい。また、投与剤は、保存剤、潤滑剤、溶液促進剤、安定化剤を含有することができ、他の炎症性疾患改善剤及びウイルス予防上、有用な物質を含有することもできる。

【0063】

本発明の飼料組成物は、哺乳類、家禽類、魚類及び甲殻類を含む多数の動物食餌、すなわち、飼料に適用することができる。商業的に重要な豚、牛、ヤギなどの哺乳類、象、ラクダなどの動物園の動物、犬、猫などの家畜に用いられる。商業的に重要な家禽類には、ニワトリ、アヒル、ガチョウなどが含まれ、マスやエビのような商業的に飼育される魚類及び甲殻類を含むことができる。

【0064】

本発明による飼料組成物は、家畜飼料に乾燥重量基準で１kg当たり約１０〜５００ｇ、好ましくは１０〜１００ｇの量で混合することができ、完全に混合した後、マッシュで供給したり、追加の加工工程を通じてペレット化、膨張化、押出工程を経ることが望ましい。

【発明の効果】

【0065】

本発明によるバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）Ｋ２Ｇ菌株（KCCM11471P）は、抗栄養因子除去活性、タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性に優れ、発酵過程中に低減した粘液質生成能を示すため、これを種菌として用いて大豆粕を固体発酵させると、大豆タンパク質の加水分解による低分子化及び粗タンパク含量の増加、トリプシン阻害因子の不活性化、非消化性多糖類のような抗栄養因子の含量の減少などにより、消化吸収率と飼料効率が増加した高品質の発酵大豆粕を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0066】

【図1】本発明により、タンパク分解酵素の高生産菌株を選別するための実施例１の結果を示したものである。

【図2】実施例１で選別されたタンパク分解酵素の高生産菌株の大腸菌とサルモネラ菌に対する生育阻害活性を測定した結果である。

【図3】本発明によるタンパク分解酵素の高生産菌株を対象に粘液質生成能が低下した変異株を選別する過程を示したものである。

【図4】本発明による変異株選別の過程でγ−ＰＧＡの含量の定性分析のために濃度勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果である。 レーンＭ：分子量マーカー レーン１：１ｇ／Ｌγ−ＰＧＡの標準物質 レーン２：０．５ｇ／Ｌγ−ＰＧＡの標準物質 レーン３：０．２５ｇ／Ｌγ−ＰＧＡの標準物質 レーン４：ＣＪ８２３菌株 レーン５：Ｕ３０４変異株 レーン６：Ｕ３０５変異株 レーン７：Ｕ３０６変異株 レーン８：Ｕ３０７変異株

【図5】前記過程により選別された変異株バチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇの系統分類学的な類縁関係を示す系統樹（phylogenic tree）である。

【図6】本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇを用いた固体発酵により得られた発酵大豆粕の加水分解化の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。レーンＭ：分子量マーカーレーン１：原料（生大豆粕）レーン２：ＴＰ６発酵２０時間レーン３：Ｋ２Ｇ発酵１６時間 レーン４：Ｋ２Ｇ発酵２０時間

【発明を実施するための形態】

【0067】

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に自明であろう。

【実施例】

【0068】

実施例１：タンパク分解酵素の高生産菌株の選別
本発明者らは、タンパク分解酵素の生成能に優れた菌株を分離するために、多様な伝統的な発酵食品（キムチ、味噌類、伝統的な地酒、塩辛など）から約３０００種の微生物を分離し、これらのうち同定を通じて確認された約１３０８種の飼料適合性（短尾飼料協会、プロバイオティクス）バチルス菌を中心にタンパク分解酵素の発現が高く、抗菌活性を有し、生育速度が速い多機能菌株を見出そうとした。

【0069】

具体的には、タンパク分解酵素の高生産菌株の選別は、２％（ｗ／ｖ）の脱脂乳（Difco、USA）が含有されたＹＭ寒天培地（yeast extract 3.0g、malt extract 3.0g、peptone 10.0g、agar 20.0g）で基質が分解されて生じるクリアーゾーンの大きさを比較して選別した（図１）。

【0070】

これから、選別されたタンパク分解酵素の高生産菌株をそれぞれＴＳＢ培地（enzymatic digest of casein 17.0g、enzymatic digest of soybean meal 3.0g NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5g、dextrose 2.5g、final pH 7.3±0.2 at 25℃）に接種した後、３７℃、２００ｒｐｍの条件で１２時間培養し、培養液を脱脂乳含有ＹＭ寒天培地に１．０μlずつ点滴（spotting）した。前記寒天培地を３７℃で１６時間培養した後、培地上に形成されたクリアーゾーンの直径を測定した。

【0071】

この時、従来の固体発酵により発酵大豆粕を製造する方法で発酵菌株として用いられたバチルスサブチリスＴＰ６（ＫＦＣＣ １１３４３Ｐ）を対照群として用いた（特許文献４）。

【0072】

【表1】

【0073】

前記表１に示されるように、１４種の菌株をタンパク分解酵素の高生産菌株で選別したが、これらは、全てバチルスサブチリスＴＰ６に比べて、より高いタンパク分解酵素活性を示すことが確認された。

【0074】

実施例２：病原菌の増殖抑制能を有する菌株の分離
家畜に対して食中毒を起こす代表的な病原菌である大腸菌及びサルモネラ菌の生育や増殖を抑制することができる菌株を分離し、発酵大豆粕の生産に適用してサルモネラ菌がない無毒性製品を開発するために、前記実施例１で分離した１４種のタンパク分解酵素の高生産菌株を対象に、病原菌に対する抗菌活性を測定した。

【0075】

病原菌に対する抗菌活性は、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhymurium ATCC14028）と大腸菌（E. coli KCCM11835）を対象に、ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｔｈｅ−ｌａｗｎ ｔｅｓｔ方法を用いて測定した。

【0076】

具体的には、１４種のタンパク分解酵素の高生産菌株のそれぞれをGYP培地（glucose 10.0g、yeast extract 8.0g、 polypeptone 2.0g、pH 7.0）に接種し、３７℃で１８０ ｒｐｍで１２時間液体培養した。前記タンパク分解酵素の高生産菌株の培養液１．５μlをサルモネラ・ティフィムリウムＡＴＣＣ１４０２８と大腸菌ＡＴＣＣ１１８３５のそれぞれが１×１０^５ ＣＦＵ／mlの個数で添加されたＧＹＰ寒天培地（glucose 10.0g、yeast extract 8.0g、polypeptone 2.0g、agar 15.0g、pH 7.0）に点滴した後、３７℃で１５時間、静置培養した。培地上に点滴したタンパク分解酵素の高生産菌株のコロニーの周囲に形成される生育阻害ゾーン（inhibition zone）のサイズを観察して活性力価を測定し、その結果を下記表２に示した。この時、バチルスサブチリスＴＰ６を対照群として用いた。

【0077】

【表2】

【0078】

前記表２において、「−」または「＋」は、生菌阻害ゾーンの直径サイズを基準に、活性力価を決定したものであり、「−」は、抗菌または抗菌活性がないことを、「＋」は、 阻害ゾーンの直径サイズが１０．０５mm以下であることを、「＋＋」は、 阻害ゾーンの直径サイズが１０．０５〜１４．０５mmであることを、「＋＋＋」は、 阻害ゾーンの直径サイズが１４．０５〜１７．０５mmであることを、「＋＋＋＋」は、 阻害ゾーンの直径サイズが１７．０５mm以上であることを意味する。

【0079】

家畜において最も頻繁に発生する消化器性疾病の原因菌であるサルモネラ菌と大腸菌を対象にして選別された１４種のタンパク分解酵素の高生産菌株の抗菌スペクトルを調べた結果、ＣＪ８２３が最も優れた抗菌力を示すことが確認された。選別されたＣＪ８２３は、対照群であるバチルスサブチリスＴＰ６に比べて大腸菌（＋＋＋＋ ｖｓ． ＋）とサルモネラ菌（＋＋＋＋ ｖｓ． ＋＋）の両方に対して非常に高い抗菌活性を示した。

【0080】

実施例３：サルモネラ増殖抑制大豆粕適用の実験
前記実施例２の結果によると、寒天培地上でＣＪ８２３はサルモネラ菌に対して優れた抗菌活性を示した。しかし、実際の大豆粕発酵過程の中でもサルモネラ菌に対する増殖抑制力を表すかどうかを確認するために下記実験を行った。

【0081】

具体的には、ＣＪ８２３とサルモネラ・ティフィムリウムＡＴＣＣ１４０２８を、１００℃で３０分間蒸煮した大豆粕（水分４５％）に、それぞれ４．５×１０^７ ＣＦＵ／ｇと１．０×１０^３ ＣＦＵ／ｇの濃度で混合接種し、３７℃で２４時間恒湿が維持される条件で菌数の変化を観察した。この時、大豆粕にサルモネラ・ティフィムリウムを単独接種したものを対照群として、サルモネラ・ティフィムリウムとバチルスサブチリスＴＰ６を混合接種したものを比較群として使用した。

【0082】

菌株を接種してから発酵の開始前と、１２、１６及び２０時間の発酵経過後に一定量の大豆粕をとり、０．８％のNaCl滅菌溶液で希釈した後、ＸＬＤ寒天培地（yeast extract 3g、lactose 7.5 g、sucrose 7.5 g、xylose 3.5 g、L-lysine 5 g、ferric ammonium citrate 0.8 g、Phenol Red 0.08 g NaCl 5 g、sodium deoxycholate 2.5 g、sodium thiosulfate 6.8 g、agar 13.5 g、final pH：7.4±0.2 at 25℃）に１００μlを塗布してサルモネラ・ティフィムリウムのコロニーの数を測定し、その結果を下記表３に示した。

【0083】

両菌株間の比率値は、主発酵菌株であるＣＪ８２３が蒸煮した大豆粕で増殖する間に、サルモネラ・ティフィムリウムが汚染されるという仮定の下で測定したものであり、実際の汚染率は、発酵大豆粕の製造環境により変わり得る。

【0084】

【表3】

【0085】

前記表３に示されるように、サルモネラ・ティフィムリウム単独で接種した対照群は、培養時間が増加するにつれて菌数が着実に増加して、発酵２０時間経過後には３．１×１０^７ ＣＦＵ／ｇまで増加したのに対して、バチルスサブチリスＴＰ６と混合接種した比較群では、サルモネラ・ティフィムリウムの菌数が２．２×１０^４ ＣＦＵ／ｇレベルに抑制され、本発明によるＣＪ８２３と混合接種した実験群では、サルモネラ・ティフィムリウムの菌数がこれより減少して３．５× １０^２ ＣＦＵ／ｇレベルであった。

【0086】

前記結果から、本発明によるＣＪ８２３が、実際の発酵過程中でもサルモネラ菌の生育を効果的に抑制し、高品質の発酵大豆粕の製造に適していることが分かる。

【0087】

実施例４：変異株の選抜
前記実施例１〜３で選別されたＣＪ８２３は、タンパク分解酵素を高濃度で生産し、病原菌に対して優れた抗菌活性を示すが、発酵過程中に生産される酵素により原料大豆の糖質、大豆タンパク由来のレバン型のフルクタン（levan form fructan）とポリグルタミン酸（polyglutamate）の重合により粘着性粘液質が生成された。大規模な工業化の過程で、このような粘液質の過量生成は、撹拌を困難にして発酵物内の溶存酸素、温度などを制御するのに問題となり、移送を困難にするなどの問題が発生した。

【0088】

そこで、本発明者らは、ＣＪ８２３の酵素的／生理的特性はそのまま維持するか、または向上しながら粘液質の生成能の低下した変異株を開発するために、以下のようにＣＪ８２３にＵＶを照射して突然変異を誘発した。変異株の選別過程は、図３に示した通りである。

【0089】

まず、ＣＪ８２３をＴＳＢ寒天培地（ezymatic digest of casein 17.0g、 enzymatic digest of soybean meal 3.0g、NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5 g、dextrose 2.5 g、final pH: 7.3±0.2 at 25℃）に塗抹して３７℃で１２時間培養して菌株を活性化した。

【0090】

本培養は、予め準備したＴＳＢ培地（ezymatic digest of casein 17.0g、enzymatic digest of soybean meal 3.0g、NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5 g、dextrose 2.5 g、final pH：7.3±0.2 at 25℃）に種菌懸濁液を１％接種した後、３７℃、１８０ｒｐｍで振とう培養した。培養後、培養液を２５℃、８０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離して菌体と上清液を分離した後、菌体のみを取り、０．８％のＮａＣｌ殺菌溶液で洗浄した。洗浄後、回収された菌体をＵＶランプ（VIBER LOURMAT、115 V、60 Hzの）を用いて、２５４ｎｍの波長の紫外線を照射して人工突然変異させた。

【0091】

選別培地である２％の脱脂乳含有ＴＳＡ寒天培地（enzymatic digest of casein 15 g、enzymatic digest of soybean meal 5 g、NaCl 5 g、agar 15 g、final pH 7.3±0.2 at 25℃）に塗抹して３７℃で２０時間培養した。培養後、形成されたクリアーゾーンの大きさ（直径、mm）をキャリパー（Caliper、CD-20CPX、Mitutoyo、Kanagawa、Japan）で測定し、タンパク質分解活性の高い１６種の変異株を１次選抜した。

【0092】

次に、選抜された１６種の変異株を、それぞれ熱処理された大豆粕に接種し、２０時間培養し、これから得られた培養液を、２５℃で８０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離して菌体と上清液を分離した。分離された上清液のγ−ＰＧＡの含量は、非特許文献３（）に開示された方法に従って分離及び精製して凍結乾燥した後、回収されたγ−ＰＧＡの重量を測定した。

【0093】

タンパク分解酵素活性は、前記実施例１に記載された方法により測定し、γ−ＰＧＡの含量は、下記２種類の定性及び定量分析法を用いて測定した。

【0094】

まず、γ−ＰＧＡ活性の定性分析のために、前記で分離された上清液４０μlを５×染色緩衝液１０μlと混合した後、５〜２０％の濃度勾配ＳＤＳ−ポリアミドゲルにローディングして濃度勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、クマシー染色試薬で標準タンパク質を染色した後、脱色し、再度メチレンブルー（methylene blue）でポリ-γ-グルタミン酸を染色して定性評価した。

【0095】

その結果、図４に示されるように、レーン４のＣＪ８２３（親菌株）の上清液では、高分子のポリ−γ−グルタミン酸が検出されたが、レーン５のＵ３０４変異株の上清液では、高分子物質の生成能が非常に低下された一方、高いタンパク分解酵素活性を示すことを確認した。

【0096】

一方、γ−ＰＧＡの含量の定量分析は、固体発酵の上澄液に同量の蒸留水で希釈した後、２０，０００×ｇで２０分間遠心分離して得られた上澄液に６ ＭのＨＣｌでｐＨ３．０に調節した後、４℃で一日静置した。その後、２５，０００×ｇで３０分間再び遠心分離した後、沈殿体を回収した。沈殿体を１００〜２００倍の蒸留水に完全に溶解させた後、２５，０００×ｇで３０分間遠心分離して不純物を除去し、４℃で一日透析（dialysis）して塩を除去した。これを凍結乾燥してγ−ＰＧＡを回収し、これから得られた結果を下記表４に示した。

【0097】

【表4】

【0098】

表４に示されるように、変異株の大部分は、ＣＪ８２３に比べて低いγ−ＰＧＡの含量を示し、これらのうち、タンパク分解酵素活性は最も高く、かつ相対的に低いγ−ＰＧＡの含量を示すＵ３０４変異株を最終選抜した。特に、Ｕ３０４変異株は、対照群であるバチルスサブチリスＴＰ６より低いγ−ＰＧＡの含量を示しながら、それより３倍以上高いタンパク分解酵素活性を示した。

【0099】

最終選抜されたＵ３０４変異株は、タンパク分解酵素を高濃度で生産して病原菌に対して優れた抗菌活性を示す親菌株の特性はそのまま維持しながら、ポリ−γ−グルタミン酸のような高分子物質の生成は顕著に低下し、低いγ−ＰＧＡの含量を示し、粘液質生成能の低下したことを特徴とする。

【0100】

実施例５：Ｕ３０４変異株（Ｋ２Ｇ）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定及び系統樹解析
粘液質生成能の低下したＵ３０４変異株の同定のために、新たなＮＡ寒天培地に菌を接種し、３７℃で１６時間培養した。形成されたコロニーは、０．８％のＮａＣｌ滅菌溶液で希釈した後、６３種の乾燥培地及び生化学反応物で構成されたＢＣＬ ＩＤ ｃａｒｄ（bioMNitek Inc.、Hazewood、USA）に注入し、その結果は15分間隔でVITEK 2 Compact software（bioMVitek）に統合的に保存、分析され、１４時間後に同定が完了した。

【0101】

１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列による菌同定のために、汎用プライマー(universal primer)として配列番号２及び３の５１８Ｆ（5’- CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’）と８００R（5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3'）を利用するが、１６S ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅したお後、同定に重要な５０〜９００ｂｐ塩基配列を含む１,３３３ｂｐを ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１＋ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｄ（Applied Biosystems Inc./USA）を用いて解読した。１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列分析の結果、Ｕ３０４変異株は、配列番号：１の１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列を有する。

【0102】

遺伝子塩基配列との類似性は、ブラスト類似性調査プログラム（Blast similarity search program：National Institute of Biotechnology Information）と、多重配列整列を行った後、系統樹における位置を判別した（図５）。

【0103】

【表5】

【0104】

６３種類の生化学的検査の結果をバイテック２コンパクトソフトウェア（Vitec 2 Compact Software）で分析した結果、９８％の確率でバチルスサブチリス／バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus subtilis/amyloliquefacien）に分類された。また、図５に示されるように、系統図の解析の結果、Ｕ３０４変異株は、標準菌株であるバチルス・アミロリケファシエンス亜種。プランタルム（Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum）ＦＺＢ４２Ｔ（ＣＰ０００５６０）と最も近い近縁関係を示し、１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子配列相同性が９９．９２％（１３３２ ｂｐ／１３３３ ｂｐ）で確認された。

【0105】

これに対し、前記生化学特性と系統分類学的類縁関係の分析結果を総合し、本発明によるＵ３０４変異株をバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇと命名し、ブダペスト条約下で２０１３年１１月７日付で韓国微生物保存センター（Korean Culture of Microorganisms、KCCM）に寄託番号ＫＣＣＭ１１４７１Ｐとして寄託した。

【0106】

実施例６：バチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇを利用した大豆粕発酵時の発酵時間に応じた粗タンパク含量の変化

【0107】

本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇを利用した大豆粕発酵時の発酵時間に応じた粗タンパク含量の変化を調べるために、下記のような実験を行った。

【0108】

まず、大豆粕４００ｇの水分含量を４５％に合わせて１００℃で３０分間蒸煮し、４０℃以下に冷却させた。次いで、前記バチルス・アミロリケファシエンスＫ２ＧをＴＳＢ寒天培地（ezymatic digest of casein 17.0g、enzymatic digest of soybean meal 3.0g、NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5 g、dextrose 2.5 g、agar 15.0g、final pH: 7.3±0.2 at 25℃）に塗抹し、３７℃で１２時間培養して菌株を活性化させた。活性化させた菌株を０．８％のＮａＣｌ滅菌溶液９mlに約２白金（Ａ_{６６０ｎｍ}で０．２程度に希釈する）を懸濁し、この懸濁液を種菌として使用した。本培養は、予め準備した４０mlのＴＳＢ培地（ezymatic digest of casein 17.0g、enzymatic digest of soybean meal 3.0g、NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5 g、dextrose 2.5 g、final pH:7.3±0.2 at 25℃）に種菌懸濁液を１％で接種した後、３７℃で１８０ｒｐｍで振とう培養した。

【0109】

準備したバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇの培養液４０ml（5.0×10⁷ ｃｆｕ／ml）の水分含量を４５％に合わせて蒸煮した大豆粕に入れてよく混合した後、３７℃で２０時間恒湿が維持される条件で静置培養した。前記培養試料を、６０℃の乾燥機で水分含量が１０％以下になるまで乾燥した後、ケルダール装置（Kjeldahl system、Kjltec 2100）を用いて、各試料の粗タンパク含量を測定した。この時、発酵開始前と、発酵１２、１６及び２０時間経過後に粗タンパク含量を測定し、対照群としてバチルスサブチリスＴＰ６を使用した。それから測定された粗タンパク含量（％、水分１０％の補正）を下記表６に示した。この時、対照群としてバチルスサブチリスＴＰ６を使用した。

【0110】

【表6】

【0111】

表６に示されるように、２４時間発酵を基準とした時、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇで発酵された大豆粕は、従来大豆粕発酵菌株として知られているバチルスサブチリスＴＰ６で発酵された大豆粕と同等以上のレベルの粗タンパク含量を示した。

【0112】

前記結果から、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇは、高品質のタンパク質飼料として発酵大豆粕の製造に有用に用いられることを確認した。

【0113】

実施例７：バチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇを利用した大豆粕発酵時の発酵時間によるＴＩの含量の変化

【0114】

本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇを利用した大豆粕発酵時の発酵時間に応じたトリプシン阻害因子（ＴＩ）の含量の変化を測定するために、下記のような実験を行った。

【0115】

具体的には、前記実施例６と同様に、大豆粕４００ｇを水４５％に合わせて、１００℃で３０分間蒸煮し、蒸煮された大豆粕にバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇを４．５×１０^７ ｃｆｕ／mlの濃度で接種した後、３７℃で２４時間恒湿が維持される条件で培養した。発酵開始前と、発酵１６、２０、及び２４時間経過後にＴＩの含量をＡＡＣＣ−７１−１０（American association of cereal chemists、1995）により測定し、それから測定されたＴＩの含量（mg／ｇ）を下記表７に示した。この時、対照群としてバチルスサブチリスＴＰ６を用いた。

【0116】

【表7】

【0117】

表７に示されるように、発酵１６時間経過後、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇで発酵された大豆粕はＴＩ含量０．３９mg／ｇを示したが、これは、従来大豆粕発酵菌株として知られているバチルスサブチリスＴＰ６で２４時間発酵された大豆粕のＴＩ含量に相当するものであり、１６時間の発酵のみで同等レベルの抗栄養因子の低減効果を示した。

【0118】

このような発酵時間の短縮は、製麹機の回転率を高め、これは年間生産可能な配置数の増加につながり、消費者に、より安価で高品質の発酵大豆粕を供給することができるという点で、本発明の優位性を確認することができる。

【0119】

実施例８：バチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇを利用した大豆粕発酵時大豆タンパク質の加水分解化の程度及びＫＯＨの溶解度の測定

【0120】

大豆粕は、タンパク質の含量が高い植物性飼料原料であるが、抗栄養因子及び消化吸収率が低いタンパク質の含有により、特に仔家畜の成長に不十分であるという欠点もある。このような欠点を改善する方法の一つが、微生物を利用した発酵を通じて加水分解されたペプチドの形で作成するか、または消化が容易に行われるように低分子量のタンパク質に分解することである。本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇはタンパク分解酵素の高生産菌株であり、それを用いて製造された発酵大豆粕は、前記菌株から分泌されたタンパク分解酵素により大豆タンパク質が分解されると予想された。

【0121】

これを確認するために、まず、本発明による発酵大豆粕の加水分解の程度を測定した。前記実施例６と同様に大豆粕４００ｇを水分４５％に合わせて、１００℃で３０分間蒸煮し、蒸煮された大豆粕にバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇを４．５×１０^７ ｃｆｕ／mlの濃度で接種し、３７℃で２４時間恒湿が維持される条件で培養した。それから、得られた培養液を２５℃で８０００ ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離して菌体と上清液を分離した。分離された上清液４０μlを５×染色緩衝液１０μlと混合した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）を行い、分子量に応じたタンパク質の移動相を確認した。電気泳動後、ポリアミドゲルをクマシーブリリアント試薬（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒ２５０）で染色し、組成物質のタンパク質組成と分子量を確認し、その結果を図６に示した。この時、対照群として生大豆粕とバチルスサブチリスＴＰ６で製造された発酵大豆粕を用いた。

【0122】

図６に示されるように、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇで製造された発酵大豆粕は、生大豆粕または他の菌株で製造された発酵大豆粕と比較してサイズが小さい分子の方にタンパク質の密度が偏っていることを確認することができる。ＳＤＳ−ポリアミドゲル上で、上のバンドが分子量の大きいタンパク質であり、下のバンドが分子量の小さいタンパク質を示す。前記結果から、同一の分子量である場合、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇを用いた発酵により大豆粕内の分子量の大きいタンパク質が分子量の小さいタンパク質に加水分解されたことを確認した。

【0123】

一方、従来のレポートによると、ＫＯＨ（potassium hydroxide）溶解度が８０％である大豆粕と、これより低い濃度（５５％〜６８％）の大豆粕を用いて、４回の肉鶏飼養試験を行った結果、ＫＯＨ溶解度が低い大豆粕を給与した肉鶏の体重、飼料摂取量及び飼料効率がＫＯＨ溶解度が８０％である大豆粕を給与した肉鶏に比べて有意に低かったり、低くなる傾向を示した（非特許文献４）。

【0124】

そこで、本発明による発酵大豆粕のＫＯＨ溶解度を文献（非特許文献５）に開示された方法に従って測定した。簡単に説明すると、前記のように準備された発酵大豆粕０．１ｇを０．２％のＫＯＨ溶液に添加し、２０分間混合した後、ろ過してろ液に対する窒素含量をケルダール装置で測定して溶解度を換算し、その結果を表８に示した。

【0125】

【表8】

【0126】

前記表８に示されるように、蒸煮された大豆粕では、ＫＯＨの溶解度が８０％から７０％まで低下する傾向を示したが、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇを用いた固体発酵が進むと共に、ＫＯＨの溶解度は再び８５％まで上昇した。前記結果は、本発明によるバチルス・アミロリケファシエンスＫ２Ｇから分泌されたタンパク分解酵素により大豆タンパクが分解されながら、ＫＯＨが上昇したと判断される。

【産業上の利用可能性】

【0127】

本発明によるバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）Ｋ２Ｇ菌株（ＫＣＣＭ１１４７１Ｐ）は、抗栄養因子除去活性、タンパク分解酵素活性及び病原菌に対する抗菌活性に優れ、発酵過程中に低下した粘液質生成能を示すため、これを種菌として用いて大豆粕を固体発酵させると、大豆タンパク質の加水分解による低分子化及び粗タンパク含量の増加、トリプシン阻害因子の不活性化、非消化性多糖類のような抗栄養因子の含量の減少などにより、消化吸収率及び飼料効率が増加した高品質の発酵大豆粕を製造することができる。

【0128】

【表9】

【0129】

【表10】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]