特許 6368430 クロマトグラフィー用分離剤、クロマトグラフィーカラム、及びクロマトグラフィーによる分離方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6368430

(24)【登録日】2018年7月13日

(45)【発行日】2018年8月1日

(54)【発明の名称】クロマトグラフィー用分離剤、クロマトグラフィーカラム、及びクロマトグラフィーによる分離方法

(51)【国際特許分類】

   B01J 20/281 20060101AFI20180723BHJP

   B01J 20/286 20060101ALI20180723BHJP

【ＦＩ】

   B01J20/281 X

   B01J20/281 G

   B01J20/286

【請求項の数】16

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2017-522567(P2017-522567)

(86)(22)【出願日】2016年12月20日

(86)【国際出願番号】JP2016087973

(87)【国際公開番号】WO2017110819

(87)【国際公開日】20170629

【審査請求日】2017年4月25日

(31)【優先権主張番号】特願2015-254636(P2015-254636)

(32)【優先日】2015年12月25日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2016-78106(P2016-78106)

(32)【優先日】2016年4月8日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】591159251

【氏名又は名称】信和化工株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100113365

【弁理士】

【氏名又は名称】高村 雅晴

(74)【代理人】

【識別番号】100131842

【弁理士】

【氏名又は名称】加島 広基

(72)【発明者】

【氏名】福澤 興祐

【審査官】 高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１７６２１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０７−１０３９５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５０７１２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１４／０８７９３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０１５２８８０（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｂ０１Ｊ ２０／２８１

Ｂ０１Ｊ ２０／２８６

Ｇ０１Ｎ ３０／００−３０／９３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ジアミンで修飾された芳香環を含むシラン官能基で表面修飾された多孔質基材からなり、前記芳香環が前記多孔質基材と前記ジアミンの間に介在し、かつ、前記ジアミンが前記シラン官能基の末端に導入されたものである、クロマトグラフィー用分離剤。

【請求項2】

前記芳香環のメタ位又はパラ位が前記ジアミンで修飾されている、請求項１に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項3】

前記ジアミンが第２級アミンを含む、請求項１又は２に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項4】

前記ジアミンが炭素数２〜１７のアルキレンジアミンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項5】

前記ジアミンが−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（ＣＨ_２）_ｍＮＨ_２（式中、ｎは１〜１１、ｍは１〜６である）で表される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項6】

前記ジアミンが−ＣＨ_２ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＮＨ_２である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項7】

前記芳香環がベンゼン環である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項8】

前記シラン官能基に含まれる前記芳香環の数が１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項9】

前記シラン官能基が、該シラン官能基のケイ素と前記芳香環との間に、炭素数１〜６のアルキレン基又はオキシアルキレン基からなる連結基を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項10】

前記連結基が−（ＣＨ_２）_ｘ−（式中、ｘは１〜３である）で表される、請求項９に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項11】

前記連結基が−（ＣＨ_２）_２−である、請求項１０に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項12】

前記シラン官能基が下記式：

【化1】

で表される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項13】

前記多孔質基材が、多孔質無機粒子、多孔質無機バルク体、多孔質高分子粒子及び多孔質高分子バルク体からなる群から選択される少なくともいずれか１種である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項14】

前記多孔質基材が多孔質無機粒子又は多孔質無機バルク体であり、該多孔質無機粒子又は多孔質無機バルク体がシリカゲルである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤。

【請求項15】

筒状のカラム本体と、
前記カラム本体に充填又は形成される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤と、
を備えた、クロマトグラフィーカラム。

【請求項16】

請求項１〜１４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー用分離剤を用いて複数の物質の分離を行う工程を含む、クロマトグラフィーによる分離方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、クロマトグラフィー用分離剤、クロマトグラフィーカラム、及びクロマトグラフィーによる分離方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

クロマトグラフィー用分離剤は、クロマトグラフィーカラムに充填又は形成されることで固定相として機能する材料である。そのようなクロマトグラフィー用分離剤として、シリカゲルが広く用いられている。シリカゲルは物理的強度が高く、比表面積が大きいといった利点を有する。

【0003】

近年、クロマトグラフィー性能の向上を図るべく、シリカゲルの表面にアミノ基ないしアミン含有基を結合させた（すなわち表面修飾した）分離剤が知られている。例えば、特許文献１（ＵＳ２０１３／０３１９０８６Ａ１）及び特許文献２（ＵＳ２０１２／０２７３４０４Ａ１）には疎水性基とイオン性基をシリカゲルに固定化した分離剤が開示されており、イオン性基がアルキレン基を介したアミノ基やアルキル基で修飾されたアミノ基を含みうることが記載されている。特許文献３（ＵＳ４７５５２９４）には、短鎖のアルキレン基を介してジアミンをシリカゲルに固定化した分離剤が開示されている。特許文献４（ＵＳ４５６０７０４）には、ポリアミンをシリカゲルに固定化した分離剤が開示されている。特許文献５（ＵＳ４３４０４９６）及び特許文献６（ＵＳ４２９０８９２）には、短鎖のアルキレン基を介してジアミンをシリカゲルに固定化した分離剤が開示されている。

【0004】

また、アミノ基ないしアミン含有基の末端にベンゼン環等の芳香環を結合させた表面修飾シリカゲルも知られている。例えば、特許文献７（ＵＳ２０１４／０３１９０５７Ａ１）にはシリカゲルにアントラセンを固定化するため、アミノ基を有するアントラセンとシリカゲルに修飾されたエポキシドを反応させて合成した分離剤が開示されている。この分離剤は、アミノ基の相互作用よりも、末端の芳香環の相互作用により、不飽和化合物を分離するものと解される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】ＵＳ２０１３／０３１９０８６Ａ１

【特許文献2】ＵＳ２０１２／０２７３４０４Ａ１

【特許文献3】ＵＳ４７５５２９４

【特許文献4】ＵＳ４５６０７０４

【特許文献5】ＵＳ４３４０４９６

【特許文献6】ＵＳ４２９０８９２

【特許文献7】ＵＳ２０１４／０３１９０５７Ａ１

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Yuusuke Kawachi, et al., "Chromatographic characterization of hydrophilic interaction liquid chromatography stationary phases: Hydrophilicity, charge effects, structural selectivity, and separation efficiency", Journal of Chromatography A. 1218 (2011) pp.5903-5919

【発明の概要】

【0007】

本発明者は、今般、ジアミンで修飾された芳香環を含むシラン官能基で多孔質基材を表面修飾して、芳香環を多孔質基材とジアミンの間に介在させることで、選択性、保持力等の分離性能に全般的に優れたクロマトグラフィー用分離剤を提供できるとの知見を得た。

【0008】

したがって、本発明の目的は、選択性、保持力等の分離性能に全般的に優れたクロマトグラフィー用分離剤を提供することにある。

【0009】

本発明の一態様によれば、ジアミンで修飾された芳香環を含むシラン官能基で表面修飾された多孔質基材からなり、前記芳香環が前記多孔質基材と前記ジアミンの間に介在する、クロマトグラフィー用分離剤が提供される。

【0010】

本発明の他の一態様によれば、筒状のカラム本体と、前記カラム本体に充填又は形成される、上記クロマトグラフィー用分離剤とを備えた、クロマトグラフィーカラムが提供される。

【0011】

本発明の他の一態様によれば、上記クロマトグラフィー用分離剤を用いて複数の物質の分離を行う工程を含む、クロマトグラフィーによる分離方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1A】実施例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル１に対して行ったクロマトグラムである。

【図1B】比較例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル１に対して行ったクロマトグラムである。

【図2A】実施例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル２に対して行ったクロマトグラムである。

【図2B】比較例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル２に対して行ったクロマトグラムである。

【図3A】実施例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル３に対して行ったクロマトグラムである。

【図3B】比較例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル３に対して行ったクロマトグラムである。

【図4A】実施例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル４に対して行ったクロマトグラムである。

【図4B】比較例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル４に対して行ったクロマトグラムである。

【図5A】実施例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル５に対して行ったクロマトグラムである。

【図5B】比較例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル５に対して行ったクロマトグラムである。

【図6A】実施例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル６に対して行ったクロマトグラムである。

【図6B】比較例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル６に対して行ったクロマトグラムである。

【図7A】実施例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル７に対して行ったクロマトグラムである。

【図7B】比較例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル７に対して行ったクロマトグラムである。

【図8A】実施例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル８に対して行ったクロマトグラムである。

【図8B】比較例１で得られた分離剤を用いたＨＩＬＩＣモードでの分離をサンプル８に対して行ったクロマトグラムである。

【図9】実施例１、比較例１及び非特許文献１に開示される各種分離剤の各々を用いた場合による固定相ｐＨ効果の評価結果を示すグラフである。

【図10】実施例１と比較例１の各種評価項目についての結果を、非特許文献１に開示される各種分離剤の評価結果を含めた相対評価として示したレーダーチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

クロマトグラフィー用分離剤
本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、シラン官能基で表面修飾された多孔質基材からなる。このシラン官能基はジアミンで修飾された芳香環を含み、この芳香環が多孔質基材とジアミンの間に介在する。このような構成とすることで、選択性、保持力等の分離性能に全般的に優れたクロマトグラフィー用分離剤を提供することができる。芳香環を多孔質基材とジアミンの間に介在させることで、選択性、保持力等の分離性能が全般的に向上するメカニズムは必ずしも定かではないが、以下のように推察される。すなわち、ジアミンの存在自体が選択性や保持力等の分離性能の向上に寄与するところ、本発明の分離剤では他の官能基として芳香環をさらに有する。芳香環はππ相互作用を呈するため、ジアミンの呈する相互作用と相まって、分離剤全体として複数の相互作用を好都合に呈することができ、それらが優れた分離性能をもたらすものと考えられる。そのような優れた分離性能は、保持力、ＯＨ選択性、ＣＨ_３選択性、立体配置選択性、位置異性体選択性、分子形状選択性、アニオン交換性、固定相表面ｐＨ効果といった多岐にわたるものである。特に、本発明の分離剤の表面は親水性を呈するのが典型的である。このため、本発明の分離剤は、親水性固定相を用いるクロマトグラフィーであるＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー）や順相クロマトグラフィーに好適に使用可能であるが、それら以外のクロマトグラフィーにも使用可能である。

【0014】

また、本発明の分離剤にあっては、耐久性にも優れることも期待される。一般的にアミノプロピルが結合した分離剤はＨＩＬＩＣカラムとして知られているが、水溶液中ではアルキル鎖が短いとアミノ基がシリカゲル表面を溶かし劣化が早い。この点、多孔質基材（例えばシリカゲル）とジアミンとの間に芳香環を介在させることでジアミンが多孔質基材から遠くなる。また、単結合と異なり芳香環の可動域は小さいのでジアミンと多孔質基材の接触を避ける効果が期待でき、それによって分離剤の耐久性が上がることが期待される。

【0015】

本発明に用いられる多孔質基材は、シラン官能基で表面修飾可能なものであれば特に限定されず、クロマトグラフィー用分離剤（ないし固定相）として知られる公知各種の多孔質基材であることができる。多孔質基材の形態は多孔質であるかぎり特に限定されず、粒子状であってもよいし、モノリス等のバルク状であってもよい。すなわち、多孔質基材は多孔質粒子であってもよいし、多孔質バルク体であってもよい。典型的な多孔質基材は、多孔質無機粒子、多孔質無機バルク体、多孔質高分子粒子及び多孔質高分子バルク体からなる群から選択される少なくともいずれか１種であり、好ましくは多孔質無機粒子又は多孔質無機バルク体、特に好ましくは多孔質無機粒子である。多孔質無機粒子又は多孔質無機バルク体の例としては、シリカゲル、アルミナシリカゲル、その他表面に水酸基を有する各種セラミック粒子、及びシリカモノリスが挙げられ、特に好ましくはシリカゲルである。多孔質高分子粒子の例としては、セルロース粒子、アガロース粒子、その他表面に水酸基を有する多孔質高分子粒子が挙げられる。もっとも、シラン官能基で表面修飾された状態の多孔質基材にあっては水酸基が残存していてもよいし、水酸基がシリル化反応により消失していてもよい。

【0016】

多孔質基材はシラン官能基で表面修飾される。典型的には、多孔質基材の表面に存在する水酸基（例えばシリカゲルの場合はシラノール基）とシリル化剤とが反応することにより、シラン官能基が多孔質基材の表面に結合する。シラン官能基はジアミンで修飾された芳香環を含み、この芳香環が多孔質基材とジアミンの間に介在する。芳香環のメタ位又はパラ位がジアミンで修飾されているのが好ましく、芳香環のメタ位が修飾されたものと芳香環のパラ位が修飾されたものとの混合物であってもよい。

【0017】

ジアミンは第１級アミン、第２級アミン及び第３級アミンのいずれかを含みうるが、第２級アミンを含むのが好ましい。アミンは第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンの間で塩基性が異なるが、水溶液中では第２級アミンが最も塩基性が高く、選択性、保持力等の分離性能に特に寄与する。したがって、第２級アミンを含む２種類のアミン、すなわちジアミンをシラン官能基の末端（すなわち多孔質基材の表面から最も離れた位置）に導入するのが好ましい。

【0018】

ジアミンは炭素数２〜１７のアルキレンジアミンであるのが好ましく、より好ましくは炭素数２〜１３、さらに好ましくは炭素数２〜９、特に好ましくは炭素数２〜５、最も好ましくは炭素数２〜３のアルキレンジアミンである。特に好ましいジアミンは−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（ＣＨ_２）_ｍＮＨ_２（式中、ｎは１〜１１、好ましくは１〜９、より好ましくは１〜５、特に好ましくは１〜３、最も好ましくは１であり、ｍは１〜６、好ましくは１〜４、特に好ましくは１〜２、最も好ましくは２である）で表されるものである。したがって、最も好ましいジアミンは−ＣＨ_２ＮＨ（ＣＨ_２）_２ＮＨ_２である。

【0019】

芳香環はππ相互作用を呈することが可能ないかなる芳香環であってもよい。芳香環の例としては、ベンゼン環、ナフタレン環、及びアントラセン環が挙げられる。最も好ましい芳香環はベンゼン環である。好ましくは、シラン官能基に含まれる芳香環の数が１である。

【0020】

所望により、シラン官能基は、シラン官能基のケイ素と芳香環との間に、炭素数１〜６のアルキレン基又はオキシアルキレン基からなる連結基を含む。アルキレン基の例としては、メチレン基、ジメチレン基（エチレン基）、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、プロピレン基、及びエチルエチレン基が挙げられる。オキシアルキレン基の例としては、オキシメチレン基、オキシジメチレン基（オキシエチレン基）、オキシトリメチレン基、オキシテトラメチレン基、オキシペンタメチレン基、オキシヘキサメチレン基、及びオキシプロピレン基が挙げられる。アルキレン基又はオキシアルキレン基の炭素数は好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３、さらに好ましくは２である。典型的な連結基は−（ＣＨ_２）_ｘ−で表されるものであり、ｘは好ましくは１〜６、より好ましくは１〜３、さらに好ましくは２である。すなわち、特に好ましい連結基は−（ＣＨ_２）_２−である。

【0021】

したがって、最も好ましいシラン官能基は下記式：

【化1】

で表されるものである。

【0022】

本発明の分離剤は、上述したようなシラン官能基を有するシリル化剤を用意して、このシリル化剤と多孔質基材（典型的にはその表面に存在する水酸基）とをシリル化反応させることにより作製することができる。シリル化反応は公知の条件に従って行えばよく、特に限定されるものではない。

【0023】

クロマトグラフィーカラム
本発明の分離剤を用いることで、クロマトグラフィーカラムを提供することができる。本発明によるクロマトグラフィーカラムは、筒状のカラム本体と、カラム本体に充填又は形成される本発明の分離剤とを備えたものである。カラム本体を構成する材料は特に限定されず、例えばステンレスやガラスなどが挙げられる。カラム本体の内径及び長さは用途に応じて適宜決定すればよく特に限定されない。分離剤の充填又は形成はいかなる手法により行ってもよい。例えば、カラム本体に粒子状の分離剤を詰め込んでもよいし、カラム本体（例えばキャピラリーチューブ）中にモノリス等のバルク状の多孔質基材（例えばモノリス型シリカゲル）を形成させてもよい。すなわち、本発明によるクロマトグラフィーカラムは、モノリス型キャピラリーカラムの形態としてもよい。

【0024】

クロマトグラフィーによる分離方法
本発明のクロマトグラフィー用分離剤或いはそれを含むクロマトグラフィーカラムを用いて複数の物質の分離を行うことができる。すなわち、本発明のクロマトグラフィーによる分離方法は、クロマトグラフィー用分離剤を用いて複数の物質の分離を行う工程を含む。すなわち、クロマトグラフィーの固定相として本発明の分離剤を用いる。一方、クロマトグラフィーに用いる移動相は、液体、気体、及び超臨界流体のいずれであってもよいが、液体又は超臨界流体が好ましい。すなわち、本発明の分離方法は、クロマトグラフィーの原理を利用したいかなる分離方法であってよく、化学分析手法としての各種クロマトグラフィーは勿論のこと、化学分析の前処理として化合物を分離又は濃縮するために用いられる手法の一つである固相抽出を含むものである。本発明の分離方法が採用可能なクロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、ガスクロマトグラフィー、及び超臨界クロマトグラフィーのいずれであってもよいが、液体クロマトグラフィー又は超臨界流体クロマトグラフィーが好ましい。液体クロマトグラフィーの分離モードは特に限定されず、順相クロマトグラフィー、ＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー）、逆相クロマトグラフィー等であってよいが、本発明の分離剤は親水性固定相としての性質を望ましく有しうることから、順相クロマトグラフィー又はＨＩＬＩＣ（順相クロマトグラフィーの一種）が特に好ましい。

【実施例】

【0025】

本発明を以下の例によってさらに具体的に説明する。

【0026】

実施例１
平均粒子径５μｍ、平均細孔径１２ｎｍ、比表面積３００ｍ^２／ｇの多孔質シリカゲル１０ｇをトルエン５０ｍＬに分散させ、アミノエチルアミノメチルフェネチルトリメトキシシランを８ｇ添加後、還流するまで加温し６時間反応させた。室温に冷却後、反応後のシリカゲルをろ過、洗浄し、減圧乾燥して下記一般式で表されるシラン官能基で表面修飾されたシリカゲルをクロマトグラフィー用分離剤として得た。

【化2】

【0027】

得られた分離剤を元素分析したところ、Ｃ：１１．６９％、Ｈ：１．６０％、Ｎ：２．１７％であった。

【0028】

比較例１
平均粒子径５μｍ、平均細孔径１２ｎｍ、比表面積３００ｍ^２／ｇの多孔質シリカゲル１０ｇをトルエン５０ｍＬに分散させ、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランを１１ｇ添加後、還流するまで加温し６時間反応させた。室温に冷却後、反応後のシリカゲルをろ過、洗浄し、減圧乾燥して下記一般式で表されるシラン官能基で表面修飾されたシリカゲルをクロマトグラフィー用分離剤として得た。

【化3】

【0029】

得られた分離剤を元素分析したところ、Ｃ：４．５３％、Ｈ：０．５６％、Ｎ：０．５７％であった。

【0030】

ＨＩＬＩＣモードにおけるクロマトグラフィー性能の評価
実施例１で得られた分離剤をステンレス製のカラム本体（カラム長：１００ｍｍ、カラム内径：４．６ｍｍ）に充填して、クロマトグラフィーカラムを得た。このクロマトグラフィーカラムに対して、ＨＩＬＩＣモードにおけるクロマトグラフィー性能の評価を、非特許文献１（Yuusuke Kawachi, et al., "Chromatographic characterization of hydrophilic interaction liquid chromatography stationary phases: Hydrophilicity, charge effects, structural selectivity, and separation efficiency", Journal of Chromatography A. 1218 (2011) pp.5903-5919、この文献は参照により本明細書に組み込まれる）に開示される評価手法に準じた手順で、様々なサンプルに対して行った。また、比較のため、比較例１で得られた分離剤を用いて上記と同様にして作製したクロマトグラフィーカラムを用いて、実施例１と同様の評価を行った。

【0031】

なお、各サンプルの測定において、分離係数αを以下の通り算出した。先ず、サンプル注入時を０として、各サンプルに含まれるトルエン（これは分離剤に保持されない化合物である）の検出時間をｔ_０とする。そして、トルエンの次に検出されることになる化合物（以下、第１化合物という）の検出時間をｔ_１と、第１化合物の次に検出されることになる化合物（以下、第２化合物という）の検出時間ｔ_２とする。そして、第１化合物のキャパシティファクターｋ_１をｋ_１＝（ｔ_１−ｔ_０）／ｔ_０の式に従い算出する一方、第２化合物のキャパシティファクターｋ_２をｋ_２＝（ｔ_２−ｔ_０）／ｔ_０の式に従い算出する。最後に、分離係数αをα＝ｋ_２／ｋ_１の式により算出する。したがって、この分離係数αの値が大きいほど、第１化合物と第２化合物との分離性能が高いといえる。

【0032】

（１）保持力及びＯＨ選択性の評価（ＨＩＬＩＣモード）
サンプル１として、以下に示される３種類の化合物の混合物を用意した。

【化4】

【0033】

サンプル１においてトルエンはＨＩＬＩＣモードにおいて分離剤に保持されない化合物であり、それ故、他の化合物に対する分離剤の保持力の程度を評価するための参照指標となる（後述するサンプル２〜８においても同様の理由からトルエンが含まれている）。サンプル１において、２’−デオキシウリジン（２ｄＵ）とウリジン（Ｕ）は互いに極めて類似した化学構造を有しており、上記化学式中において丸で囲まれた部分が−Ｈ基であるか−ＯＨ基であるかにおいてのみ相違する。したがって、サンプル１に対する分離性能を評価することで、Ｕの保持時間から水素結合性の強さを示す保持力を評価することができ、α（Ｕ／２ｄＵ）の値によってＯＨ基の有無の違いを示すＯＨ選択性を評価することができる。

【0034】

クロマトグラフィーカラムを用いて、サンプル１に対するクロマトグラフィーを以下の分析条件で行った。
‐ サンプル１：トルエン１．０ｍｇ／ｍＬ、２’−デオキシウリジン（２ｄＵ）０．１ｍｇ／ｍＬ、及びウリジン（Ｕ）０．１ｍｇ／ｍＬ
‐ 移動相：２０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯ_２ＮＨ_４（ｐＨ４．７）／ＣＨ_３ＣＮ＝１０／９０
‐ 温度：３０℃
‐ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ
‐ 流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
‐ サンプル注入量：４．０μＬ

【0035】

【表1】

【0036】

実施例１におけるサンプル１のクロマトグラムを図１Ａに示す一方、比較例１によるサンプル１のクロマトグラムを図１Ｂに示す。表１から明らかなように、実施例１による分離剤を用いることで、Ｕの保持力は極めて大きいだけでなく、α（Ｕ／２ｄＵ）の値によって示されるＯＨ選択性も極めて高かった。Ｕの保持力が大きかった原因として実施例１の分離剤は２種類のアミンを有するため水素結合が強かったためと解される。また、実施例１の分離剤はアミン以外にベンゼン環を有し多様な相互作用が存在するため分離にも寄与したと考えられる。

【0037】

（２）ＣＨ_３選択性の評価（ＨＩＬＩＣモード）
サンプル２として、以下に示される３種類の化合物の混合物を用意した。

【化5】

【0038】

サンプル２において、５−メチルウリジン（５ＭＵ）とウリジン（Ｕ）は互いに極めて類似した化学構造を有しており、上記化学式中において丸で囲まれた部分における−ＣＨ_３基の有無においてのみ相違する。したがって、サンプル２に対する分離性能を評価することで、ＣＨ_３選択性を評価することができる。

【0039】

クロマトグラフィーカラムを用いて、サンプル２に対するクロマトグラフィーを以下の分析条件で行った。
‐ サンプル２：トルエン１．０ｍｇ／ｍＬ、５−メチルウリジン（５ＭＵ）０．１ｍｇ／ｍＬ、及びウリジン（Ｕ）０．１ｍｇ／ｍＬ
‐ 移動相：２０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯ_２ＮＨ_４（ｐＨ４．７）／ＣＨ_３ＣＮ＝１０／９０
‐ 温度：３０℃
‐ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ
‐ サンプル注入量：４．０μＬ
‐ 流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ

【0040】

【表2】

【0041】

実施例１におけるサンプル２のクロマトグラムを図２Ａに示す一方、比較例１によるサンプル２のクロマトグラムを図２Ｂに示す。表２から明らかなように、実施例１による分離剤を用いることで、α（Ｕ／５ＭＵ）の値によって示されるＣＨ_３選択性は高かった。

【0042】

（３）立体配置選択性の評価（ＨＩＬＩＣモード）
サンプル３として、以下に示される３種類の化合物の混合物を用意した。

【化6】

【0043】

サンプル３において、アデノシン（Ａ）とビダラビン（Ｖ）は互いに極めて類似した化学構造を有しており、上記化学式中において丸で囲まれた部分の立体配置においてのみ相違する。したがって、サンプル３に対する分離性能を評価することで、立体配置選択性を評価することができる。

【0044】

クロマトグラフィーカラムを用いて、サンプル３に対するクロマトグラフィーを以下の分析条件で行った。
‐ サンプル３：トルエン１．０ｍｇ／ｍＬ、アデノシン（Ａ）０．１ｍｇ／ｍＬ、及びビダラビン（Ｖ）０．１ｍｇ／ｍＬ
‐ 移動相：２０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯ_２ＮＨ_４（ｐＨ４．７）／ＣＨ_３ＣＮ＝１０／９０
‐ 温度：３０℃
‐ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ
‐ サンプル注入量：４．０μＬ
‐ 流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ

【0045】

【表3】

【0046】

実施例１におけるサンプル３のクロマトグラムを図３Ａに示す一方、比較例１によるサンプル３のクロマトグラムを図３Ｂに示す。表３から明らかなように、実施例１による分離剤を用いることで、α（Ｖ／Ａ）の値によって示される立体配置選択性は同等であった。

【0047】

（４）位置異性体選択性の評価（ＨＩＬＩＣモード）
サンプル４として、以下に示される３種類の化合物の混合物を用意した。

【化7】

【0048】

サンプル４において、３’−デオキシグアノシン（３ｄＧ）及び２’−デオキシグアノシン（２ｄＧ）は互いに極めて類似した化学構造を有しており、上記化学式中において丸で囲まれた部分の比較から分かるように、両者は位置異性体である。したがって、サンプル４に対する分離性能を評価することで、位置異性体選択性を評価することができる。

【0049】

クロマトグラフィーカラムを用いて、サンプル４に対するクロマトグラフィーを以下の分析条件で行った。
‐ サンプル：トルエン１．０ｍｇ／ｍＬ、３’−デオキシグアノシン（３ｄＧ）０．１ｍｇ／ｍＬ、及び２’−デオキシグアノシン（２ｄＧ）０．１ｍｇ／ｍＬ
‐ 移動相：２０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯ_２ＮＨ_４（ｐＨ４．７）／ＣＨ_３ＣＮ＝１０／９０
‐ 温度：３０℃
‐ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ
‐ サンプル注入量：４．０μＬ
‐ 流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ

【0050】

【表4】

【0051】

実施例１におけるサンプル４のクロマトグラムを図４Ａに示す一方、比較例１によるサンプル４のクロマトグラムを図４Ｂに示す。表４から明らかなように、実施例１による分離剤を用いることで、α（２ｄＧ／３ｄＧ）の値によって示される位置異性体選択性は同等であった。

【0052】

（５）分子形状選択性の評価（ＨＩＬＩＣモード）
サンプル５として、以下に示される３種類の化合物の混合物を用意した。

【化8】

【0053】

サンプル５において、４−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＰβＧｌｕ）及び４−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＰαＧｌｕ）は互いに極めて類似した化学構造を有しており、上記化学式中において丸で囲まれた部分の置換基の向き、すなわちアキシアル位又はエクアトリアル位に４−ニトロフェノキシ基が結合していることのみ相違する。したがって、サンプル５に対する分離性能を評価することで、分子形状選択性を評価することができる。

【0054】

クロマトグラフィーカラムを用いて、サンプル５に対するクロマトグラフィーを以下の分析条件で行った。
‐ サンプル５：トルエン１．０ｍｇ／ｍＬ、４−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＰβＧｌｕ）０．１ｍｇ／ｍＬ、及び４−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＰαＧｌｕ）０．１ｍｇ／ｍＬ
‐ 移動相：２０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯ_２ＮＨ_４（ｐＨ４．７）／ＣＨ_３ＣＮ＝１０／９０
‐ 温度：３０℃
‐ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ
‐ サンプル注入量：４．０μＬ
‐ 流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ

【0055】

【表5】

【0056】

実施例１におけるサンプル５のクロマトグラムを図５Ａに示す一方、比較例１によるサンプル５のクロマトグラムを図５Ｂに示す。表５から明らかなように、実施例１による分離剤を用いることで、α（ＮＰαＧｌｕ／ＮＰβＧｌｕ）の値によって示される分子形状選択性は同等であった。

【0057】

（６）アニオン交換性の評価（ＨＩＬＩＣモード）
サンプル６として、以下に示される３種類の化合物の混合物を用意した。

【化9】

【0058】

サンプル６において、ウリジン（Ｕ）とは異なり、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（ＳＰＴＳ）はカチオン性が高い化合物であり、アニオン交換によって分離剤に保持される傾向を有する化合物である。したがって、サンプル６に対する分離性能を評価することで、アニオン交換性を評価することができる。

【0059】

クロマトグラフィーカラムを用いて、サンプル６に対するクロマトグラフィーを以下の分析条件で行った。
‐ サンプル６：トルエン１．０ｍｇ／ｍＬ、ウリジン（Ｕ）０．１ｍｇ／ｍＬ、及びｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（ＳＰＴＳ）０．１ｍｇ／ｍＬ
‐ 移動相：２０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯ_２ＮＨ_４（ｐＨ４．７）／ＣＨ_３ＣＮ＝１０／９０
‐ 温度：３０℃
‐ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ
‐ サンプル注入量：４．０μＬ
‐ 流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ

【0060】

【表6】

【0061】

実施例１におけるサンプル６のクロマトグラムを図６Ａに示す一方、比較例１によるサンプル６のクロマトグラムを図６Ｂに示す。表６から明らかなように、実施例１による分離剤を用いることで、α（ＳＰＴＳ／Ｕ）の値によって示されるアニオン交換性は極めて高かった。特に、実施例１の分離剤が有する第２級アミンは第１級アミンや第３級アミンと比べて一般的に水溶液中の塩基性が最も強いとされており（すなわちＮＨ_３＜（ＣＨ_３）_３Ｎ＜ＣＨ_３ＮＨ_２＜（ＣＨ_３）_２ＮＨの順に塩基性が強い）、これが高いアニオン交換性に寄与したものと解される。

【0062】

（７）カチオン交換性の評価（ＨＩＬＩＣモード）
サンプル７として、以下に示される３種類の化合物の混合物を用意した。

【化10】

【0063】

サンプル７において、ウリジン（Ｕ）とは異なり、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルフェニルアンモニウムクロリド（ＴＭＰＡＣ）はアニオン性が高い化合物であり、カチオン交換によって分離剤に保持される傾向を有する化合物である。したがって、サンプル７に対する分離性能を評価することで、カチオン交換性を評価することができる。

【0064】

クロマトグラフィーカラムを用いて、サンプル７に対するクロマトグラフィーを以下の分析条件で行った。
‐ サンプル７：トルエン１．０ｍｇ／ｍＬ、ウリジン（Ｕ）０．１ｍｇ／ｍＬ、及びＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルフェニルアンモニウムクロリド（ＴＭＰＡＣ）０．１ｍｇ／ｍＬ
‐ 移動相：２０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯ_２ＮＨ_４（ｐＨ４．７）／ＣＨ_３ＣＮ＝１０／９０
‐ 温度：３０℃
‐ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ
‐ サンプル注入量：４．０μＬ
‐ 流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ

【0065】

【表7】

【0066】

実施例１におけるサンプル７のクロマトグラムを図７Ａに示す一方、比較例１によるサンプル７のクロマトグラムを図７Ｂに示す。図７Ａ、図７Ｂ及び表７から明らかなように、実施例１による分離剤を用いた場合、アニオン性の高い化合物であるＴＭＰＡＣの保持時間は参照指標のトルエンの保持時間とほぼ同様であり、ＴＭＰＡＣは分離剤に全く保持されないことが分かる。すなわち、本発明の分離剤はカチオン交換性を有しないことが分かる。

【0067】

（８）固定相表面ｐＨ効果（ＨＩＬＩＣモード）
サンプル８として、以下に示される３種類の化合物の混合物を用意した。

【化11】

【0068】

サンプル８において、テオフィリン（Ｔｐ）及びテオブロミン（Ｔｂ）は−ＣＨ_３基の位置が異なることよりｐＫａが異なる。塩基性固定相はＴｂからＴｐの順で溶出し、α（Ｔｐ／Ｔｂ）の値によって固定相表面ｐＨ効果を評価した。

【0069】

クロマトグラフィーカラムを用いて、サンプル８に対するクロマトグラフィーを以下の分析条件で行った。
‐ サンプル：トルエン１．０ｍｇ／ｍＬ、テオフィリン（Ｔｐ）０．１ｍｇ／ｍＬ、及びテオブロミン（Ｔｂ）０．１ｍｇ／ｍＬ
‐ 移動相：２０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯ_２ＮＨ_４（ｐＨ４．７）／ＣＨ_３ＣＮ＝１０／９０
‐ 温度：３０℃
‐ 検出：ＵＶ２５４ｎｍ
‐ サンプル注入量：４．０μＬ
‐ 流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ

【0070】

【表8】

【0071】

実施例１におけるサンプル８のクロマトグラムを図８Ａに示す一方、比較例１によるサンプル１のクロマトグラムを図８Ｂに示す。表８から明らかなように、実施例１による分離剤を用いることで、α（Ｔｐ／Ｔｂ）の値によって示される分離性能は極めて大きかった。すなわち、本発明の分離剤は塩基性固定相として極めて高い分離性能を有することが分かる。

【0072】

参考のため、非特許文献１において評価結果が開示されている、以下に列挙される市販の分離剤における値（すなわちＴｐｋ、Ｔｂｋ及びα（Ｔｐ／Ｔｂ））を実施例１及び比較例１の値と並べて図９及び表９に示す。
‐ ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ（３．５μｍ，５μｍ，１５０×４．６ｍｍ．Ｉ．Ｄ）［Ｍｅｒｃｋ］，Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ ＨＩＬＩＣ（３μｍ，１５０×４．６ｍｍ．Ｉ．Ｄ）［ＮＡＧＥＬ］
‐ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ａｍｉｄｅ（３．５μｍ，１５０×４．６ｍｍ．Ｉ．Ｄ［Ｗａｔｅｒｓ］
‐ Ａｍｉｄｅ−８０（３μｍ，５μｍ，１５０×４．６ｍｍ．Ｉ．Ｄ）［Ｔｏｓｏｈ］
‐ ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａ（３μｍ，１００×２．１ｍｍ．Ｉ．Ｄ）［ＰｏｌｙＬＣ］
‐ ＰｏｌｙＨＹＤＲＯＸＹＥＴＨＹＬ Ａ（３μｍ，１００×２．１ｍｍ．Ｉ．Ｄ）［ＰｏｌｙＬＣ］
‐ ＣＹＣＬＯＢＯＮＤ Ｉ ２０００（５μｍ，２５０×４．６ｍｍ．Ｉ．Ｄ．）［Ａｓｔｅｃ］
‐ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｄｉｏｌ（５μｍ，１００×４．６ｍｍ．Ｉ．Ｄ）［Ｍｅｒｃｋ］
‐ Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｓｉ（１００×４．６ｍｍ．Ｉ．Ｄ）［Ｍｅｒｃｋ］
‐ Ｈａｌｏ ＨＩＬＩＣ（２．７μｍ，１５０×４．６ｍｍ．Ｉ．Ｄ）［ＡＭＴ］
‐ ＣＯＳＭＯＳＩＬ ＨＩＬＩＣ（５μｍ，１５０×４．６ｍｍ．Ｉ．Ｄ）［Ｎａｃａｌａｉ］
‐ Ｓｕｇａｒ−Ｄ（５μｍ，１５０×４．６ｍｍ．Ｉ．Ｄ）［Ｎａｃａｌａｉ］
‐ ＮＨ_２−ＭＳ（５μｍ，１５０×４．６ｍｍ．Ｉ．Ｄ）［Ｎａｃａｌａｉ］

【0073】

なお、図９に示されるＴｐｋ、Ｔｂｋ及びα（Ｔｐ／Ｔｂ）の意味は以下のとおりである。
‐ Ｔｐｋ：テオフィリン（Ｔｐ）のキャパシティファクター
‐ Ｔｂｋ：テオブロミン（Ｔｂ）のキャパシティファクター
‐ α（Ｔｐ／Ｔｂ）：Ｔｐを第２化合物、Ｔｂを第１化合物とした場合の分離係数

【0074】

【表9】

【0075】

図９に示される結果から明らかなように実施例１の分離剤にあっては、比較例１やその他の市販の分離剤と比較して、顕著に高い分離性能（すなわちα（Ｔｐ／Ｔｂ）＝２．４０）を示すことが分かる。すなわち、実施例１におけるα（Ｔｐ／Ｔｂ）＝２．４０の値は非特許文献１に開示される論文値と比較しても最も高い値であり、これは最も分離性能が高かったことを意味する。実施例１における高い分離性能は本発明による分離剤は相互作用が多様であることが原因であろうと考えられる。

【0076】

（９）ＨＩＬＩＣモードにおける総合評価
上記（１）〜（８）において評価された各種項目についての実施例１と比較例１の結果のレーダーチャートを図１０に示す。なお、図１０のレーダーチャートの各項目において１．００とされるべき基準は実施例１、比較例１及び非特許文献１に開示される各種分離剤の結果の中で最も高い評価のサンプルの評価結果に対応しており、それに対する相対評価を数値化したものが図１０に示される。図１０に示されるレーダーチャートから明らかなように実施例１において作製された分離剤の各種クロマトグラフィー性能は多くの評価項目で比較例１よりも大きく向上しており、その他の評価項目においても比較例１に匹敵する高い性能を発揮している。また、非特許文献１に開示される各種分離剤と比較した場合、実施例１の分離剤は、カチオン交換性は無いものの、広い観点から分離性能を発揮する点で全般的に優れた分離性能を発揮することが分かる。特に、実施例１の分離剤は２種類のアミンとベンゼン環を有するため、水素結合性ｋ（Ｕ）は大きくなったと考えられる。また、実施例１の分離剤は第２級アミンを有するため、アニオン交換性α（ＳＰＴＳ／Ｕ）は大きくなったと考えられる。さらに、実施例１の分離剤は２種類のアミン以外に、ベンゼン環を有し、それ故ππ相互作用も呈するため、多様な相互作用が分離性能の向上に寄与したものと考えられる。

【0077】

一方、比較例１の分離剤は疎水性の大きい第３級アミンが１種類と水酸基を有し、実施例１に比べ水素結合性ｋ（Ｕ）は小さくなったと考えられる。また、比較例１の分離剤は第３級アミンを有するが実施例１の第２級アミンよりも塩基性が小さいためアニオン交換性α（ＳＰＴＳ／Ｕ）は小さくなったと考えられる。図１０より、比較例１の分離剤におけるＯＨ選択性α（Ｕ／２ｄＵ）及び固定相表面ｐＨ効果α（Ｔｐ／Ｔｂ）は実施例１と比較して大幅に値が小さかった。比較例１の分離剤は水酸基及び第３級アミンの官能基しか持たないため、実施例１と比較して相互作用の種類の少なさが分離にも影響したのではないかと考えられる。

【0078】

なお、上記評価はＨＩＬＩＣモードにおいて行われたものであるが、本発明の分離剤は、ＨＩＬＩＣモードのみならず、順相モード等、他の分離モードによるクロマトグラフィーにおいても有用であるものと考えられる。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】