特許 6369839 植物における組換えタンパク質の過剰発現のための５’（５’−ＵＴＲ）に最適化されたリーダー機能を持つ人工ＤＮＡ配列と植物における組換えタンパク質の産生方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6369839

(24)【登録日】2018年7月20日

(45)【発行日】2018年8月15日

(54)【発明の名称】植物における組換えタンパク質の過剰発現のための５’（５’−ＵＴＲ）に最適化されたリーダー機能を持つ人工ＤＮＡ配列と植物における組換えタンパク質の産生方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20180806BHJP

   C12N 15/67 20060101ALI20180806BHJP

   C12N 15/82 20060101ALI20180806BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20180806BHJP

   A01H 1/00 20060101ALN20180806BHJP

   A01H 5/10 20180101ALN20180806BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/11ZNA

   C12N15/67 Z

   C12N15/82

   C12P21/02 C

   !A01H1/00 A

   !A01H5/10

【請求項の数】12

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2015-552194(P2015-552194)

(86)(22)【出願日】2014年1月15日

(65)【公表番号】特表2016-502864(P2016-502864A)

(43)【公表日】2016年2月1日

(86)【国際出願番号】IB2014058289

(87)【国際公開番号】WO2014111858

(87)【国際公開日】20140724

【審査請求日】2017年1月6日

(31)【優先権主張番号】UD2013A000002

(32)【優先日】2013年1月16日

(33)【優先権主張国】IT

(73)【特許権者】

【識別番号】515192678

【氏名又は名称】アディエンネ ファーマ アンド バイオテク ソシエタ アノニマ

(74)【代理人】

【識別番号】100134832

【弁理士】

【氏名又は名称】瀧野 文雄

(74)【代理人】

【識別番号】100060690

【弁理士】

【氏名又は名称】瀧野 秀雄

(74)【代理人】

【識別番号】100070002

【弁理士】

【氏名又は名称】川崎 隆夫

(74)【代理人】

【識別番号】100165308

【弁理士】

【氏名又は名称】津田 俊明

(72)【発明者】

【氏名】マルケッティ ステファノ

(72)【発明者】

【氏名】パッティ タマーラ

(72)【発明者】

【氏名】セッコ エリカ

【審査官】 池上 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５１４４３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５１６０３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 FRANCESCA DE AMICIS，TRANSGENIC RESEARCH，NE，KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS-PLENUM PUBLISHERS，２００７年 １月２０日，V16 N6，P731-738

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

５’−ＵＴＲのリーダー領域の人工ＤＮＡであって、
前記人工ＤＮＡは、植物における組換えタンパク質の発現を増加させるのに有効であり、
前記人工ＤＮＡは、５’→３’方向に沿って、Ｉｎｒイニシエータ部位とコザックまたはコザック様コンセンサス配列を含み、
前記人工ＤＮＡは、さらにＩｎｒイニシエータ部位と、コザックまたはコザック様コンセンサス配列との間に、それぞれ、互いに隣接するＣＡＡ要素の２つ以上のコピーから構成されるオリゴヌクレオチドによって形成される、複数のポリ（ＣＡＡ）または（ＣＡＡ）n領域、及び前記ポリ（ＣＡＡ）領域と同じ数であり、互いに隣接するＣＴ要素の２つ以上のコピーから構成されるオリゴヌクレオチドによって形成される、複数のポリ（ＣＴ）または（ＣＴ）m領域を含み、ここで
少なくとも一つ、任意にそれぞれ１つのポリ（ＣＡＡ）領域は、５’→３’方向でポリ（ＣＴ）領域と少なくとも一つのポリ（ＣＡＡ）領域の上流にあり、５’→３’方向でポリ（ＣＴ）領域と隣接しており、
ただし、前記人工ＤＮＡは、Ａ／Ｔリッチモチーフ、ＡＴＴトリヌクレオチド要素、ＣＴＧトリヌクレオチド要素、及びホモポリマー領域、すなわち３より多く、または４より多くの同一のヌクレオチドから構成される配列、を含まないことを特徴とする人工ＤＮＡ。

【請求項2】

ｎが整数であり、同一の又は異なるポリ（ＣＡＡ）領域から選ばれ、２以上、３から９の間、４から８の間、または５から７の間である請求項１に記載の人工ＤＮＡ。

【請求項3】

ｍが整数であり、同一の又は異なるポリ（ＣＴ）領域から選ばれ、２以上、または３から５の間である請求項１または２に記載の人工ＤＮＡ。

【請求項4】

２つのポリ（ＣＡＡ）領域と２つのポリ（ＣＴ）領域を含み、第１のポリ（ＣＡＡ）領域が第１のポリ（ＣＴ）領域の上流にあり、第２のポリ（ＣＡＡ）領域が前記第１のポリ（ＣＴ）領域の下流、かつ第２のポリ（ＣＴ）領域の上流にある請求項１〜３のいずれか一項に記載の人工ＤＮＡ。

【請求項5】

Ｉｎｒイニシエータ部位がＣａＭＶ３５Ｓの転写開始部位５’−ＡＣＡＣＧ−３’であるか、または、コンセンサス配列５’−ＹＹＡＮＷＹＹ−３’をもつＩｎｒイニシエータ部位であり、ここで
Ｙ＝Ｃ、Ｔ；
Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ；
Ｗ＝Ａ、Ｔ
である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の人工ＤＮＡ。

【請求項6】

配列番号１に示される配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の人工ＤＮＡ。

【請求項7】

配列番号２に示される配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の人工ＤＮＡ。

【請求項8】

コザックまたはコザック様コンセンサス配列が、翻訳開始コドンから３つ上流に位置する要素Ｒの存在を必要とする配列である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の人工ＤＮＡ。

【請求項9】

Ａ／Ｔリッチモチーフが、３より多く、または４より多くの、アデニン（Ａ）および／またはチミン（Ｔ）の任意の組合せのヌクレオチドから構成される領域または配列として定義づけられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の人工ＤＮＡ。

【請求項10】

前記人工ＤＮＡが、ＡＣＡＡＴＴＡＣ八量体を含まない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の人工ＤＮＡ。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の植物における組換えタンパク質の発現を増加させるのに有効な５’−ＵＴＲリーダー領域の人工ＤＮＡを含む発現ベクター。

【請求項12】

請求項１１に記載の発現ベクターを用いて植物を形質転換することを含む、植物における組換えタンパク質の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、植物における組換えタンパク質の過剰発現のための５’（５’−ＵＴＲ）に最適化されたリーダー機能を持つ人工ＤＮＡ配列と植物における組換えタンパク質の産生方法に関する。

【背景技術】

【0002】

植物における異種遺伝子の発現を改善するために採用し得る多くのアプローチがある。実際には、すべての要素は、転写および／または翻訳プロセスを調節して、遺伝子の発揮、または遺伝子発現の制御機能を発揮する。ｍＲＮＡの５’末端および３’末端に存在する非翻訳配列は、（５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲと呼ばれＵＴＲは「非翻訳領域」の略である）この例外ではなく、また実際に、適切な改変の好適な目標と考慮されなければならない、なぜならば、かなりの程度まで、それらは翻訳効率とｍＲＮＡ自体のターンオーバーを決定するからである。実際、大量の証拠が：
−ｍ７Ｇｐｐｐ（５’−ｃａｐ）５’末端に存在する構造ｍＲＮＡの末端は、リボソーム４０Ｓサブユニット（Franks and Likke-Andersen, 2008）に結合することができるｅＩＦ４Ｆ複合体を局在化するために不可欠である；
−そのｅＩＦ４Ｇ成分を介して、ｅＩＦ４Ｆ複合体は、ｍＲＮＡの３’末端に存在するポリ（Ａ）テールと、後半部分の循環構造を想定して相互作用する（Franks and Likke-Andersen, 2008）；
−ポリ（Ａ）テールとｅＩＦ４Ｆの複合体は、５’−ｃａｐ構造の酵素加水分解を減少させ、そのためモノ−リン酸５’末端において細胞質エキソヌクレアーゼによるｍＲＮＡの急速な分解を防止する（Franks and Likke-Andersen, 2008）；
−５’−ＵＴＲ配列は、５’−ｃａｐ構造、後半部分とｅＩＦ４Ｅの結合、リボソーム４０Ｓサブユニットの局在化、ポリソームの構成、４３Ｓ複合体の自発的解離速度、真正翻訳開始ＡＵＧコドンの認識に影響を与える要素を含む；
−５’ −ＵＴＲ配列はまた、特定の転写因子のためのＤＮＡへの結合部位を表す配列を含むため、上流のプロモーターの転写活性を変更することができる；
ことを証明する。

【0003】

したがって、リーダー領域とも呼ばれる５’−ＵＴＲは、組換えタンパク質の発現レベルを増加させるために、特にプラントエンジニアリングプログラムで考慮される必要があることは明らかである。

【0004】

しかし様々な理由のため、たとえ当業者であっても、高効率のリーダー配列を設計することは、全く容易ではない。第一に、同じゲノムまたは関連するゲノムに属する異なる遺伝子のリーダー領域間で観察される配列の大きな変異性が考慮されなければならない。この変異性は、リーダーに改善された特性を付与することができる潜在的なトラクト（tracts）を同定することを困難にし、５’−ＵＴＲトラクトを構成する他の要素または配列との相互作用の可能性を予測することを事実上不可能にする。第二に、リーダー領域の全体の長さは、１００〜１２０塩基対以内、好ましくは８０塩基対以内であるので、領域自体から４３Ｓ複合体の自発的解離の頻度を増加させない。これは、リーダートラクトの構築に実際に使われる要素の厳しい選択を課す。第三に、リーダー領域は、パリンドローム配列やＧ／Ｃに富むヌクレオチド組成を含まないため、ｅＩＦ４Ａの介入によって解消しない、転写における二次構造の形成を妨げる。最後に、配列の少数部分（約１０％）であるが、場合によっては顕著な部分は、自由に変更することができないが、Ｉｎｒイニシエータ部位とコザックモチーフまたは等価コザック様モチーフの様な必須機能要素を含む必要がある。

【0005】

ＷＯ２００８／０８０９５４は、植物における組換えタンパク質の発現を増加させるのに使用できる配列５’−ＵＴＲ内部反復ＣＴ要素と繰り返しＣＡＡ要素の組み合わせを記載する。さらに、それはまた、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのイニシエータ部位（Ｉｎｒ）を有するポリ（ＣＡＡ）およびポリ（ＣＴ）の共存についても記載する、すなわち、カリフラワーモザイクウイルス（Guilley et al., 1982）および／またはＴＭＶΩリーダー（Gallie and Walbot, 1992）由来のＡＣＡＡＴＴＡＣ八量体の共存である。実際に、ＷＯ２００８／０８０９５４は、例えば、上記で引用した全ての要素を含むＬＬＴＣＫと呼ばれるリーダー配列について記載する：
１．効率的なｍＲＮＡキャッピングのためのＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子のＩｎｒ部位；
２．ＴＭＶΩリーダーの「翻訳エンハンサー」に類似するポリ（ＣＡＡ）領域（Gallie and Walbot, 1992）；
３．いくつかの植物リーダーと類似のＣＴ要素が豊富な配列（Bolle et al., 1996）；
４．ＴＭＶΩリーダーの八量体。

【0006】

ＷＯ２００８／０８０９５４のＬＬＴＣＫリーダーの効果は、比較のために市販のベクターに多数存在するＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子のリーダーを使用して、構成型ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でｕｉｄＡレポーター遺伝子（酵素βグルクロニダーゼのコーディング、ＧＵＳ）の発現レベルを決定することによって、タバコで評価された。ＬＬＴＣＫリーダーは、コントロールリーダーの８〜１２倍に相当するＧＵＳ酵素の濃度の増加を検出した。

【0007】

さらに、導入遺伝子、つまり植物の組換えタンパク質の発現のための５’−ＵＴＲトラクトの効率を高める必要がある。

【0008】

特に、従来技術と比較して、植物の導入遺伝子の発現のための５’−ＵＴＲトラクトの効率を高めるために、ＬＬＴＣＫが、転写と遺伝情報の翻訳プロセスに効果があることが知られている唯一の合成高効率のリーダーであることを考慮すると、それらを改善するための介入のためのモデルまたは出発点としてこのリーダーを考慮することが有用である。

【0009】

上述のように、ＷＯ２００８／０８０９５４は、繰り返しＣＴ要素と繰り返しＣＡＡ要素の組合せを提供し、より明らかなその組合せの優位性を生み出すことがきる一連の因子を特定する。

【0010】

選択的な用途（preferential application）は、各因子と関連している。特に重要なのは、ＴＭＶΩリーダーが保有する八量体モチーフＡＣＡＡＴＴＡＣの存在により与えられる、実際には、ＷＯ２００８／０８０９５４によると、効率的なリーダーは繰り返しＣＴモチーフを有する領域とＴＭＶΩリーダーの領域を接合することからもたらされる。

【0011】

ＷＯ２００８／０８０９５４で知られるΩリーダーの内部には、異なる種類の反復配列が見られる。そのような配列の一つは、必ずしも隣接しているわけではない１１回反復するＣＡＡトリヌクレオチドによって表現され、他の配列は３回反復する八量体ＡＣＡＡＴＴＡＣモチーフで表現される。

【0012】

これは、両方の配列は、転写後レベルで作用する、遺伝子発現の大きな増加を引き起こすことができることが実証されている。

【0013】

その八量体がＣＡＡトリヌクレオチドを含むが、遺伝子発現の増強は、ＣＡＡ単独ではなく全配列の存在に関連する。

【0014】

その八量体は、Ａ／Ｔリッチトラクト、すなわちＡＴＴトリプレットを順に含むＡＡＴＴＡを含むことが重要である。

【0015】

可能な優先的技術解決策として、ＷＯ２００８／０８０９５４の発明者らは、たとえＡＡＴＴＡ配列すなわち非標準翻訳開始部位ＡＴＴが含まれていたとしても、八量体配列ＡＣＡＡＴＴＡＣを維持することを示唆する。

【0016】

明らかに、彼らは、上記の八量体モチーフを含めることは、Ａ／Ｔリッチ配列及びそれと共に推定上の翻訳開始コドンの導入が必要だとしても、より重要であると信じている。ＷＯ２００８／０８０９５４の配列番号１（ＬＬＴＣＫ）において、他のＡ／Ｔリッチ配列はそれぞれ：
１．イニシエータ部位（ＴＡＴＴＴＴＴＡ）のすぐ下流；
２．ポリ（ＣＡＡ）（ＡＡＴＡ）トラクトの内側；
３．八量体（ＡＴＴＡ）を含む部位で、このトラクトの末端；
４．八量体（ＴＡＴＴＴ）のすぐ下流；
に位置していると強調されている。

【0017】

４のうち３つの配列は、八量体のようなトリプレットＡＴＴを有する。

【0018】

比較のために、Ａ／Ｔリッチ領域（下線部）とＡＴＴトリプレット（大きな文字）を強調表示している公知のＬＬＴＣＫリーダー；八量体モチーフに対応する太字のＡＣＡＡＴＴＡＣトラクトを示す。

【化1】

【0019】

我々は、の公知のＬＬＴＣＫ配列は、ポリ（ＣＴ）領域を有する任意のポリ（ＣＡＡ）領域との隣接を提供していないことを強調する。

【0020】

この場合も、彼らは、Ａ／Ｔリッチ領域内の非標準翻訳開始部位の存在を認識しているが、ＷＯ２００８／０８０９５４の発明者らは、ＬＬＴＣＫ様の効率的なリーダーの構築に使用する領域を提供する。

【0021】

実際に、Ａ／Ｔリッチ配列、上述したように特に１型と４型は、ＴＭＶΩリーダーではなく、Ωに代わる翻訳エンハンサーとして一般に使用されるＡＭＶリーダーの核に見いだされる。

【0022】

以下、比較のために、我々は、ＴＭＶΩリーダー（ａ）とＡＭＶリーダー（ｂ）が強調表示された、Ａ／Ｔリッチ領域（下線部）とＡＴＴトリプレット（大きな文字）の配列を示す。

【化2】

【0023】

リーダー内のｍＲＮＡの不要なポイントで翻訳プロセスの開始を誘導するのにＡＴＴトリプレットの実際の重要性に関して、真正翻訳開始コドン（ＡＴＧ）があることが、翻訳複合体によってそのように認識される適切なコンテキスト配列を必要とすることに留意する必要がある。適切なコンテキストは、ＡＴＴやＣＴＧのような非標準翻訳開始トリプレットの認識のために均等に存在することが必要であることは当業者にとって明らかである。

【0024】

しかし、トリプレットの認識コンテキストは、現時点では知られていないため、当業者が最先端の技術を評価することによって、仮にどのくらいの特定のトリプレットＡＴＴ（またはＣＴＧ）が、非標準翻訳開始部位を表すか確立することはできない。

【0025】

Ω、ＡＭＶ、またはそれらから誘導されるリーダーのいずれを使用するか決定する際に、重要な遺伝子発現のレベルにおけるΩリーダーやＡＭＶリーダーの包含による実験的に証明されたプラスの効果である、この証拠に直面する。

【0026】

しかしながら当業者は、リーダー内部のＡＴＴまたはＣＧＴトリプレットが実際に翻訳開始コドンとして解釈された場合には、プログラムされたタンパク質とは異なるタンパク質が産生され、機能的かつ構造的な生物学的同等性に問題を生ずる可能性があり、特に治療用途が意図されているタンパク質の場合には特に重要であることを知っている。

【0027】

主に医薬分野で活動するＷＯ２００８／０８０９５４の発明者らは、この潜在的なリスクを認識しており、全てのＡＴＴトリプレットを往復する距離に、それは常に３の倍数である、そしてリーダー配列の末端に向かってそれらに対する読み幅の終始コドン（ＴＡＧ）を配置することによって、それらの５’−ＵＴＲ配列を慎重に構築する。さらに巧みに、ＬＬＴＣＫ配列末端は、所望のコード配列の５’に非常に有用なクローニング部位を構成するのと同様に、ポリ（ＣＴ）領域の形成に寄与する、終止コドン（ＴＡＧ）を有する、ポリ（ＣＴ）領域の形成に寄与する、すぐ下流に位置する真正開始コドンの認識に有益な可能なコンテキストを作るという三重機能を有しているＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）のための制限部位によって代表される。

【0028】

他の当業者は異なる振る舞いをし、単に相対的にＡ／Ｔリッチな配列内のＡＴＴトリプレットを残す。

【0029】

実際には、それも真正読み幅（reading frame）からの発散位置にさえＡＴＴトリプレットを有するプログラムされた配列を有する合成リーダーが見いだされることは一般的である。

【0030】

上記より、先行する他の特許および刊行物のように、ＷＯ２００８／０８０９５４は：
１．５’−ＵＴＲ配列からＡ／Ｔリッチモチーフを除くことを教示していない、
２．オメガ由来またはＡＭＶ由来の５’−ＵＴＲ配列からＡＴＴトリプレットを除くことを教示していない、むしろ逆である、
３．ＡＴＴトリプレットを有するか否かという、Ａ／Ｔリッチモチーフの非存在下での遺伝子発現に有利なコンテキストを作成する方法を教示していない、
４．ＷＯ２００８／０８０９５４の実施例で使用しているＬＬＴＣＫリーダーに、より効率的な変異体を構築する方法を教示していない、
と結論付けることができる。

【0031】

このすべてを考慮すると、Ａ／Ｔリッチ配列とＡＴＴトリプレットを除く必要性は、全く示唆も推進もされていないし、技術水準により明示的でも暗黙的でもない、したがって、当業者にとって明白なものとは程遠い。

【0032】

さらに、全てのヌクレオチドの置換、欠失または付加はまた、予期しない動作でリーダーを生成することが潜在的に可能であり、５’−ＵＴＲ配列の任意の他の操作などのような除去の効果もまた、当業者にとって明白なものとは程遠い。

【0033】

従って、本発明は、新規かつ進歩性があり、新たな要素または新たな要素の組合せに恵まれた５’−ＵＴＲ変異体の合成を提案するものであり、そして技術水準を修飾かつ大幅に改善することが可能な有利な技術的解決策を構成する。本出願人は、これらおよびその他の目的および利益を得るために、本発明を考案、試験、及び具体化した。

【0034】

文中で特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、これら方法および材料を以下に実施例として記載する。紛争の場合は、本出願は、その定義を優先するものとする。材料、方法および実施例は単に例示の目的を持っており、限定的に理解されるものではない。

【発明の概要】

【0035】

本発明は、独立請求項に記載され特徴づけられており、従属請求項は本発明又は主要な発明的思想の変形例の他の特徴を示す。

【0036】

上記目的に応じて、本明細書は、植物のバイオテクノロジー分野に関し、特に、天然に存在しないので、本明細書、人工合成、及び知性の産物により適切に構成される人工リーダーを用いることにより遺伝的に改変された植物における組換えタンパク質の生産レベルの上昇に関する。

【0037】

ここで説明する実施形態のいくつかの形態は、植物における導入遺伝子の発現のための５’−ＵＴＲのリーダー領域の人工ＤＮＡに関する。本明細書の態様に係る人工ＤＮＡは植物における導入遺伝子の発現を増加させるのに有効であり、５’→３’方向に沿って、Ｉｎｒイニシエータ部位と５’末端および３’末端にそれぞれ対応するコザックまたはコザック様コンセンサス配列を含む。本明細書の態様による人工ＤＮＡはまた、Ｉｎｒイニシエータ部位とコザックまたはコザック様コンセンサス配列との間に、それぞれ互いに隣接するＣＡＡ要素の２つ以上のコピーから構成されるオリゴヌクレオチドによって形成される、複数のポリ（ＣＡＡ）または（ＣＡＡ）ｎ領域、及び前記ポリ（ＣＡＡ）領域と同じ数であり、互いに隣接するＣＴ要素の２つ以上のコピーから構成されるオリゴヌクレオチドによって形成される、複数のポリ（ＣＴ）または（ＣＴ）ｍ領域を含む、ここで、少なくとも一つ、任意にそれぞれ１つのポリ（ＣＡＡ）領域は、５’→３’方向でポリ（ＣＴ）領域の上流、すなわち５’位にあり、少なくとも一つのポリ（ＣＡＡ）領域は、５’→３’方向でポリ（ＣＴ）領域と隣接している。

【0038】

いくつかの実施形態では、人工ＤＮＡは、Ａ／Ｔリッチモチーフに関連付けることができない配列の存在を提供し、すなわち、Ａ／Ｔリッチモチーフの不存在を提供する。

【0039】

いくつかの実施形態では、本明細書の人工ＤＮＡにおけるＡ／Ｔリッチモチーフの不存在は、３より多く、または４より多くの、アデニン（Ａ）および／またはチミン（Ｔ）の任意の組合せのヌクレオチドから構成される区域または配列として定義づけられる。

【0040】

いくつかの実施形態では、人工ＤＮＡは、ＡＴＴトリヌクレオチド要素に関連付けることができない配列の存在を提供する、すなわちＡＴＴトリヌクレオチド要素の不存在を提供する。

【0041】

いくつかの実施形態では、人工ＤＮＡは、ＣＴＧトリヌクレオチド要素に関連付けることができない配列の存在を提供する、すなわちＣＴＧトリヌクレオチド要素の不存在を提供する。

【0042】

いくつかの実施形態では、人工ＤＮＡは、ホモポリマートラクト、すなわち３より多く、または４より多くの同一のヌクレオチドから構成される配列の不存在を提供する。

【0043】

いくつかの実施形態では、ｎの値は、ポリ（ＣＡＡ）領域と同一の値を選択可能、または、様々なポリ（ＣＡＡ）領域のために自主的に選択可能である、すなわち、異なるｎの値を、一つ以上の他のポリ（ＣＡＡ）領域に対する少なくとも一つのポリ（ＣＡＡ）領域のために選択することが可能である。

【0044】

いくつかの実施形態では、ｎは、２以上、３から９の間、４から８の間、または５から７の間の整数である。

【0045】

いくつかの実施形態では、少なくとも一つの（ＣＡＡ）領域において、ｎは７であり、例えば少なくとも二つのポリ（ＣＡＡ）領域において、ｎは７である。

【0046】

いくつかの実施形態では、ｍの値は、ポリ（ＣＴ）領域と同一の値を選択可能、または、様々なポリ（ＣＴ）領域のために自主的に選択可能である、すなわち、異なるｍの値を、一つ以上の他のポリ（ＣＴ）領域のｍの値に対する少なくとも一つのポリ（ＣＴ）領域のために選択することが可能である。

【0047】

いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、ｍの値は、２以上、または３から５の間の整数である。いくつかの態様によれば、少なくとも一つのポリ（ＣＴ）領域において、ｍは５である。他の態様によれば、少なくとも一つのポリ（ＣＴ）領域において、ｍは３である。可能な実施態様において、少なくとも一つのポリ（ＣＴ）領域において、ｍは５であり、他のポリ（ＣＴ）領域においてｍは３である。

【0048】

いくつかの実施形態では、人工ＤＮＡは、二つのポリ（ＣＡＡ）領域と二つのポリ（ＣＴ）領域を含み、うち一つのポリ（ＣＡＡ）領域は、一つのポリ（ＣＴ）領域と隣接してよく、他の一つのポリ（ＣＡＡ）領域は他の一つのポリ（ＣＴ）領域と隣接していなくてもよい。

【0049】

いくつかの実施形態では、第１のポリ（ＣＡＡ）領域が第１のポリ（ＣＴ）領域の上流にあり、第２のポリ（ＣＡＡ）領域が前記第１のポリ（ＣＴ）領域の下流、かつ第２のポリ（ＣＴ）領域の上流にある、すなわち第２のポリ（ＣＴ）領域は５’位である。

【0050】

いくつかの実施形態では、第１のポリ（ＣＡＡ）領域は、第１のポリ（ＣＴ）領域に隣接する。

【0051】

いくつかの実施形態では、第１のポリ（ＣＡＡ）領域は、第１のポリ（ＣＴ）領域に隣接しない。

【0052】

いくつかの実施形態では、第２のポリ（ＣＡＡ）領域は、第１のポリ（ＣＴ）領域に隣接する。

【0053】

いくつかの実施形態では、第２のポリ（ＣＡＡ）領域は、第１のポリ（ＣＴ）領域に隣接しない。

【0054】

いくつかの実施形態では、第２のポリ（ＣＡＡ）領域は、第２のポリ（ＣＴ）領域に隣接する。

【0055】

いくつかの実施形態では、第２のポリ（ＣＡＡ）領域は、第２のポリ（ＣＴ）領域に隣接しない。

【0056】

いくつかの実施形態では、第１のポリ（ＣＡＡ）領域において、ｎの値は７である、すなわち、７つのＣＡＡトリプレットを含む。

【0057】

いくつかの実施形態では、第２のポリ（ＣＡＡ）領域において、ｎの値は７である、すなわち、７つのＣＡＡトリプレットを含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、第１のポリ（ＣＴ）領域において、ｍの値は５である、すなわち、５つのＣＴジヌクレオチドを含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、第２のポリ（ＣＴ）領域において、ｍの値は３である、すなわち、３つのＣＴジヌクレオチドを含む。

【0060】

いくつかの実施形態では、第２のポリ（ＣＡＡ）領域と第２のポリ（ＣＴ）領域の間にＡＧ配列がある。いくつかの実施形態では、第２のポリ（ＣＡＡ）領域と第２のポリ（ＣＴ）領域の間にＡＧ配列のみがある。

【0061】

いくつかの実施形態では、Ｉｎｒイニシエータ部位がＣａＭＶ３５Ｓの転写開始部位であるか、または、コンセンサス配列５’−ＹＹＡＮＷＹＹ−３’をもつＩｎｒイニシエータ部位であり、
Ｙ＝Ｃ、Ｔ；
Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ；
Ｗ＝Ａ、Ｔ
である。

【0062】

いくつかの実施形態では、Ｉｎｒイニシエータ部位は５’−ＴＣＡＣＡＴＣ−３’である。

【0063】

いくつかの実施形態では、Ｉｎｒイニシエータ部位と第１のポリ（ＣＡＡ）領域との間に、５’→３’方向に沿って、ＡＡＧＴＴＴＣ配列がある。いくつかの実施形態では、Ｉｎｒイニシエータ部位と第一のポリ（ＣＡＡ）領域との間に、５’ →３’方向に沿って、ＡＡＧＴＴＴＣ配列のみがある。

【0064】

いくつかの実施形態では、人工ＤＮＡは、４０から１５０塩基対の間の長さを有する。

【0065】

いくつかの実施形態では、人工ＤＮＡが５０％未満のＧＣ含量を有する。

【0066】

いくつかの実施形態では、人口ＤＮＡは配列番号１に示す配列を含み、または、配列番号２に示す配列を含む。いずれの配列も添付の配列表に含まれる。

【0067】

いくつかの実施形態では、コザックまたはコザック様コンセンサス配列が、転写開始コドンから３つ上流に位置する要素Ｒ、３位のプリン、の存在を必要とする配列である。

【0068】

いくつかの実施形態では、本発明の人工ＤＮＡは、ＡＣＡＡＴＴＡＣ八量体を含まない。

【0069】

本明細書に記載するいくつかの実施形態は、植物の組換えタンパク質の発現を増加させるのに有効な、５’−ＵＴＲリーダー領域の人工ＤＮＡを含む発現ベクターに関する、特に例えば、本明細書によるとヒトタンパク質である。

【0070】

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、
ｉ）天然または人工由来の胚乳特異的プロモーター、すなわち、５’位では、タンパク質の成熟型をコードする天然または人工由来のヌクレオチド配列；
ｉｉ）ここで説明する、植物における組換えタンパク質の発現を増加させるのに有効な５’−ＵＴリーダー領域の人工ＤＮＡ；
ｉｉｉ）胚乳の組織を構成するため、その組織の蓄積に有利に働く細胞の、小胞体のルーメン内部の組換えタンパク質を標的とするシグナルペプチドをコードする、天然または人工由来のヌクレオチド配列；
ｉｖ）目的のタンパク質の成熟型をコードする天然または人工由来のヌクレオチド配列；
ｖ）天然または人工由来の３’−ＵＴＲ領域
を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、プロモーターｉ）は、イネ（ＧｌｕＢ４）のグルテリン４の遺伝子のプロモーターである。

【0072】

いくつかの実施形態では、要素ｉｉｉ）のヌクレオチド配列は、小胞体内部のグルテリン４の前駆体を搬送するためにイネに用いられるシグナルペプチドをコードするＰＳＧｌｕＢ４配列である。

【0073】

いくつかの実施形態では、要素ｉｖ）のヌクレオチド配列は、酵素酸ベータグルコシダーゼの成熟ヒト形態をコードする配列である。

【0074】

いくつかの実施形態では、要素ｖ）の３’−ＵＴＲ領域は、ＮＯＳターミネーターまたはＧｌｕＢ４遺伝子のターミネーターである。

【0075】

ここで説明するいくつかの実施形態は、ここで記載する人工ＤＮＡ配列を含むプラスミドを保有する細菌株に関する、特に例えば、大腸菌（Escherichia coli）、 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）及びアグロバクテリウム・ゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を含む群から選択される種である。

【0076】

ここで説明するいくつかの実施形態は、宿主生物の種類に関わらず、ここで記載する人工ＤＮＡ配列を含む組換え細菌株に関する。

【0077】

ここで説明するいくつかの実施形態は、構成的プロモーター、特に例えば種子特異的な組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、位相依存性転写活性を有するプロモーター、葉緑体において活性なプロモーター、およびミトコンドリア中で活性なプロモーターを含む群から選択されたプロモーターの制御下で、ここで記載する人工ＤＮＡ配列を含む発現ベクターを有する形質転換植物細胞に関する。

【0078】

ここで説明するいくつかの実施形態は、そのメッセンジャーＲＮＡが本明細書で説明する人工ＤＮＡ配列を含むいかなるタンパク質の一過性発現を特徴とする植物に関する。一過性の発現により、我々は、ウイルスベクター、アグロインフィルトレーション、微粒子との衝撃、エレクトロポレーションによる前記タンパク質の産生を意味する。

【0079】

ここで説明するいくつかの実施形態は、本明細書で説明する人工ＤＮＡ配列を含む発現ベクターを有する安定的に形質転換された双子葉植物に関する。

【0080】

実施形態のいくつかの形態では、双子葉植物はナス科、ソラマメ亜科および／またはアブラナ科ファミリーに属する１つまたは複数の種を含む。

【0081】

ここで説明するいくつかの実施形態は、上記のような双子葉植物の子孫に関する。

【0082】

ここで説明するいくつかの実施形態は、本明細書で説明する人工ＤＮＡ配列を含む発現ベクターを有する形質転換された単子葉植物に関する。

【0083】

いくつかの実施形態では、単子葉植物は、例えば栽培イネ（Oryza sativa L.）、トウモロコシ（Zea mays L.）、大麦（Hordeum vulgare L.）および／または小麦（Triticum spp.）の様なイネ科（Poaceae）ファミリーに属する１種以上を含む。

【0084】

ここで説明するいくつかの実施形態は、上記のような単子葉植物の子孫に関する。

【0085】

いくつかの実施形態は、
−分子の生物工学的生産のための使用
−例えば、ウイルス、細菌または真菌病原体に対する耐性を誘導することを意図した、除草剤への耐性を誘導することを意図した、原料および派生製品の脂肪酸で改変された組成物を得るための、原料および派生製品の改変された栄養価を得るための、または燃料、ゴムおよび／またはバイオプラスチックを製造するための組換えタンパク質の合成のための使用
−産業用酵素と商業用タンパク質の合成のための使用
−医薬品用タンパク質の合成のための使用
−ヒトまたは動物用経口投与ワクチン、ヒトまたは動物用の注射可能なワクチン、リンパ管の腫瘍の治療に使用される、好ましくはイディオタイプ特異的な、患者に特異的な注射可能なワクチンからなる群から選択されるワクチンの合成のための使用
−二次代謝産物の生産に関与するタンパク質の合成のための使用
−形質転換された細胞の同定および／または選択における因子として、直接または間接的に使用可能なタンパク質の合成のための使用
からなる群から選択される使用のための、本明細書に記載の実施形態による人工ＤＮＡ配列に関する。

【0086】

ここで説明するいくつかの実施形態は、ここで説明する実施形態による発現ベクターを含むヒトタンパク質、例えば、特に、ヒトリソソーム酵素の発現のために形質転換された植物の種子に関する。

【0087】

ここで説明するいくつかの実施形態は治療、例えば特に酵素補充療法、あるいは以下の疾患、ゴーシェ病、ＩＩ型糖原病またはポンペ病、ファブリー病、Ｂ型ニーマン・ピック病、Ｉ、ＩＩ、ＩＶ型ムコ多糖症、に使用するための上述の植物の種子に関する。

【0088】

いくつかの実施形態は、本明細書に記載する発現ベクターを用いた植物の形質転換を含む、植物における組換えタンパク質の産生方法に関する。

【0089】

いくつかの実施形態では、植物の形質転換は、胚によって吸収されない胚乳におけるタンパク質の閉じ込めの達成に有効であり、種子の胚乳中の多量なタンパク質の存在が、種子の生存率と発芽速度に負の影響をもたらさないことを許容する。

【0090】

いくつかの実施形態では、この方法は、胚乳内部に蓄積され、植物の種子の胚乳内部にタンパク質を蓄積することを提供する。特に、例えば、タンパク質は、タンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶ）またはプロテインボディー（ＰＢ）内の胚乳内部に蓄積する。

【0091】

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、植物形質転換のために、直接的または間接的に使用される細菌株に導入される、ここで、細胞株は、大腸菌（Escherichia coli）、 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）及びアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を含む群から選択可能である。

【0092】

いくつかの実施形態では、形質転換された植物は、穀類である。

【0093】

いくつかの実施形態では、細菌株は、胚形成イネカルス（Oryza sativa ssp.japonica）の形質転換のために使用されている。

【0094】

いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、リソソーム酵素、具体的には例えば、ヒト酸性β−グルコシダーゼ、又は例えばヒト酸性α−グルコシダーゼである。

【0095】

いくつかの実施形態では、方法は、植物の種子の産業的処理を含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、植物の種子の産業的処理は、繊維成分、胚芽、及び糊粉層を含むタンパク質混入物を除去するために、形質転換された穀類植物から採取した成熟種子の殻を剥いて研磨することを提供する。

【0097】

いくつかの実施形態では、この方法は、得られたタンパク質の精製を含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、精製は、順番に、疎水性相互作用を有するクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及びゲルろ過を含む。

【0099】

いくつかの実施形態では、精製は、化学組成および／または構造および／または機能的が類似のクロマトグラフィー樹脂を適用すること、部分的に溶出パラメータを変更すること、及びカラムに溶出した画分を再充電するための通路を複製することを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0100】

本発明のこれらの及び他の特徴は、添付図面を参照しながら、非限定的な例として与えられ、実施形態のいくつかの形態の以下の説明から明らかになるであろう。

【図1】図１は、ｐＳＴＡＲＴとｐＳＴＡＲＴ−ＳＴＥで形質転換タバコ植物における４−ＭＵＧアッセイを用いて得られた値の分布を示す図である。

【図2】図２は、ＬＬＴＣＫリーダーとＳＴＥリーダーを有する植物において、ＧＣａｓｉタンパク質含有量、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価し、米粉のグラムあたりで発現したＧＣａｓｉのμｇ、の分布を示す図である。

【図3】図３Ａは、タバコｐＳＴＡＲＴ−ＳＴＥでの発現ベクターの図を示し、ここで：ＲＢＲ：ライトボーダーリピートＬＢＲ：レフトボーダーリピート３５ＳＣａＭＶ：カリフラワーモザイクウイルスのプロモーター３５ＳＧＵＳ：レポータータンパク質ＮＯＳｔｅｒ：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリン合成酵素のターミネーターである。図３Ｂは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（SｃａＩ部位から）とＳＴＥリーダーの一部を含む人工的合成領域を示す。

【図4】図４Ａは、イネｐＣＡＭＢＩＡ１３００／ＰＭＩ／ＧｌｕＢ４−ＬＬＴＣＫ／ＳＴＥ：：ＧＣａｓｉ：：ＧｌｕＢ４ｔｅｒでの発現ベクターの図を示し、ここで、ＲＢＲ：ライトボーダーリピートＬＢＲ：レフトボーダーリピートＧｌｕＢ４−ＬＬＴＣＫ：ＬＬＴＣＫリーダーを有するイネのグルテリン４プロモーターＧｌｕＢ４−ＳＴＥ：ＳＴＥリーダーを有するイネのグルテリン４プロモーターＧＣａｓｉ：ヒト酵素酸性β−グルコシダーゼ（ｈＧＣａｓｉ）をコードする遺伝子ＧｌｕＢ４ｔｅｒ：イネのグルテリン４ターミネーター３５Ｓｐｒｏ：ＣａＭＶ３５ＳプロモーターＰＭＩ：ホスホマンノースイソメラーゼをコードする遺伝子（形質転換植物の選択マーカー）３５Ｓｔｅｒ：ＣａＭＶの３５Ｓターミネーターである。図４Ｂ、４Ｃはそれぞれ、ＧｌｕＢ４プロモーターの最終部分（ＢｆｒＩ部位から）とＬＬＴＣＫ及びＳＴＥリーダーを含む人工合成領域を示す。

【発明を実施するための形態】

【0101】

本発明の実施形態の種々の形態を詳細に参照する、その１つ以上の実施例が以下に記載される。各実施例は、本発明の例示として示され、その制限と理解してはならない。実施形態の一部であるという程度まで示され記載される特徴は、別の実施形態を生じさせるための他の複数の実施形態に採用される、または関連する、ことができる。本発明は全てのそのような変更および改変を含むものと理解される。

【0102】

さらに従来の技術と比較して、植物における導入遺伝子の発現のための５’−ＵＴＲ領域の効率を高めるための試みでは、ＷＯ２００８／０８０９５４に記載されるように、繰り返しＣＡＡトリヌクレオチド要素と繰り返しＣＴジヌクレオチド要素を含む人工ＤＮＡの配列、以下ＳＴＥ、ＳＴＥ配列またはＳＴＥリーダーという、が考案された、そしてそのＳＴＥ配列は、植物における組換えタンパク質の過剰発現のために最適化された。

【0103】

この新しく独創的なＳＴＥ配列は、２つの無関係な植物種で、かつ異なるプロモーター、ターミネーターおよびコード配列に関連して、遺伝子発現の増加をもたらしたことに留意すべきである。

【0104】

上述のように従来技術から出発して、出願人は、本明細書によるリーダーの新しいタイプ（type）を開発することを目的として他の実験を実施した。

【0105】

特に、出願人は、植物を攻撃する多くのウイルスは、５’−ｃａｐのないメッセンジャー、そして多くの場合はポリ（Ａ）テールもないメッセンジャーを産生すると考えた。この証拠により、出願人は、これらのウイルスで、５’（５’−ＵＴＲ）と３’（３’−ＵＴＲ）の非翻訳領域は、５’−ｃａｐ構造とポリ（Ａ）テールをそれぞれ機能的に置き換えることができる配列を有すると仮定した。これらの配列は、ウイルスメッセンジャーに欠かせないが、真核生物遺伝子、特に植物遺伝子のリーダー内部での重要性は低い可能性がある、なぜならそれらが産生するメッセンジャーは常に、５’−ｃａｐと、稀な例外を除いて、ポリ（Ａ）テールも有するからである。

【0106】

特に、出願人は、ウイルスのリーダーに必須だが、真核生物遺伝子のリーダーには必須ではない配列は、一以上のＡ／Ｔリッチ配列、例えば、番号１−４の内部ＬＬＴＣＫまたはその部分によってあらかじめ示された配列に対応するという仮説を立てた。そこで、Ａ／Ｔリッチ配列を完全に欠いている、よってΩ八量体領域とＡＴＴトリプレットを持たない合成リーダー配列を得ることを意図して、設計活動を開始した。新しいリーダーの形成において、トリヌクレオチドＣＴＧといかなるヌクレオチドの繰り返しによって形成されたホモポリマー領域を除外することもまた決定した。ＷＯ２００８／０８０９５４に対して実質的に変わらないリーダーの長さを保つために、Ａ／Ｔリッチ領域を繰り返しＣＡＡとＣＴモチーフに置き換えられた。ＳＴＥと呼ばれる得られた配列を、様々な状況で、ＷＯ２００８／０８０９５４の配列番号１の配列と比較した。

【0107】

出願人の仮説に合致していたが当業者に利用可能な技術常識から予測されることとは異なり、得られた結果は、Ａ／Ｔリッチ要素を排除し、それらを繰り返しＣＡＡとＣＴ要素に置き換えることは、例えこのＡ／Ｔリッチ要素が、翻訳エンハンサーとして一般的に使用されるウイルスリーダーの内部に保存されているとしても、リーダー間の比較実験において利用されるレポーター遺伝子の発現の有意な増加を常にもたらすことを確立した。ＷＯ２００８／０８０９５４のＬＬＴＣＫと比較して、本明細書の５’−ＵＴＲの新しいタイプは、産業分野で、効率的な異種タンパク質の生産、抽出、及び精製に関連する問題の解決のために有用なより良い技術的な解決策を表している。

【0108】

したがって、ここで説明した実施形態は、植物における組換えタンパク質の発現を増加させることに効果的な５’−ＵＴＲリーダー領域の人工ＤＮＡを提供する、それは５’→３’方向に沿って、複数のポリ（ＣＡＡ）または（ＣＡＡ）ｎ領域、およびポリ（ＣＡＡ）領域と同じ数の複数のポリ（ＣＴ）または（ＣＴ）ｍ領域を含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、各ポリ（ＣＡＡ）領域は、互いに隣接するＣＡＡ要素の２つ以上のコピーから構成されるオリゴヌクレオチドによって形成される。

【0110】

いくつかの実施形態において、各ポリ（ＣＴ）領域は、互いに隣接するＣＴ要素の２つ以上のコピーから構成されるオリゴヌクレオチドによって形成される。

【0111】

いくつかの実施形態において、少なくとも一つの、またはそれぞれ一つのポリ（ＣＡＡ）領域は、５’→３’方向に、ポリ（ＣＴ）領域の上流にある、そしてそれは５’位である。

【0112】

いくつかの実施形態において、少なくとも一つのポリ（ＣＡＡ）領域は、５’→３’方向で、ポリ（ＣＴ）領域に隣接する。

【0113】

いくつかの実施形態において、ｎは、ポリ（ＣＡＡ）領域から選択される同一または異なる、２以上、３から９の間、４から８の間、または５から７の間の整数である。例えば、ｎの値は、ポリ（ＣＡＡ）領域と同じにすることができ、例えば７とすることができる。

【0114】

いくつかの実施形態において、ｍは、ポリ（ＣＴ）領域から選択される同一または異なる、２以上または３から５の間の整数である。例えば、ｍの値は、ポリ（ＣＴ）領域の数と異なってよく、例えば、３または５とすることができる。

【0115】

一般に、互いに異なるｎとｍの値を選択することができるが、いくつかの実施形態は、同一のｎとｍの値が選択されてもよい場合を提供する。

【0116】

いくつかの実施形態では、二つのポリ（ＣＡＡ）領域と二つのポリ（ＣＴ）領域を提供しても良い。５’→３’方向にそって、第１のポリ（ＣＡＡ）領域が、前記第１のポリ（ＣＡＡ）領域に隣接する続く第１のポリ（ＣＴ）領域が、前記第１のポリ（ＣＴ）領域に隣接する、続く第２のポリ（ＣＡＡ）領域が、及び前記第２のポリ（ＣＡＡ）領域に隣接しない連続する第２のポリ（ＣＴ）領域が提供されうる。

【0117】

いくつかの実施形態では、ＳＴＥ配列は、ＷＯ２００８／０８０９５４に比した改善点である側面によって特徴付けることができ、より適合性のあるＳＴＥ配列を提供することを意図して以下の特徴の一つ以上に言及されている。真核生物の発現システムは、
１．Ａ／Ｔリッチモチーフ、すなわち、いかなるコンビネーションにおいても、３つ以上、必要に応じて４つ以上のアデニン（Ａ）及び／又はチミン（Ｔ）ヌクレオチドから構成される配列が存在しない。
２．ＡＴＴトリヌクレオチド要素が存在しない。
３．ＣＴＧトリヌクレオチド要素が存在しない。
４．ホモポリマー領域、すなわち３より多い、または必要に応じて４より多い同一のヌクレオチドの配列が存在しない。

【0118】

すなわち、本明細書に係る人工ＤＮＡは、以下の成分のいずれかが含まれていない：Ａ／Ｔリッチ要素、ＡＴＴトリヌクレオチド要素、ＣＴＧトリヌクレオチド要素、及びホモポリマー領域、すなわち、必要に応じて、３つより多い、または４つより多い同一のヌクレオチドから構成される配列。

【0119】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載された人工ＤＮＡ配列は、Ｉｎｒ部位を含んでもよい。Ｉｎｒ部位が上記ポイント１（Ａ／Ｔリッチモチーフの欠如）とポイント２（ＡＴＴトリヌクレオチド要素の欠如）の制限付きで、５’−ＹＹＡＮＷＹＹ−３’配列を有してもよく、ここで、Ｙ＝Ｃ、Ｔ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ；Ｗ＝Ａ、Ｔ；あるいは、Ｉｎｒ部位は、５’−ＡＣＡＣＧ−３’配列（ＣａＭＶ３５Ｓのためのイニシエータ部位）を有してもよい。

【0120】

いくつかの実施形態において、３’末端に、リーダー領域はまた、真正のＡＴＧ翻訳開始コドン（コザックまたはコザック様モチーフまたはコンセンサス配列）の認識に有利なヌクレオチドコンテキストを含んでもよい。コザックまたはコザック様モチーフまたはコンセンサス配列は、真正翻訳開始コドンを認識するための適切なコンテキストを識別するために、翻訳開始コドンの上流の３位にプリン（アデニン「Ａ」またはグアニン「Ｇ」）であるＲ元素の存在を必要とする。開始コドンの上流の３位（または位置−３）によって、我々は、その位置＋１に通常割当てられているＡＴＧコドンの要素「Ａ」の上流の３位のヌクレオチドを意味する。コザックまたはコザック様配列は、上述のように、例えば第２のポリ（ＣＴ）領域に連続して隣接していてもよい。

【0121】

また、いくつかの実施形態において、ここで説明するＳＴＥリーダー配列は、長さが４０から１５０塩基対の間に含まれ、および必要に応じて５０％未満のＧＣ含量を有することがでる。

【0122】

リーダー配列の一例は、配列番号１と呼ばれ、いくつかの形態によれば、
（１）５’−ＡＣＡＣＧＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣＴＡＧＡ−３’である。

【0123】

リーダー配列の一例は、配列番号２と呼ばれ、いくつかの形態によれば、
（２）５’−ＴＣＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣＴＡＧＡ−３’である。

【0124】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、例えば、配列番号１や配列番号２の様なリーダー配列は、例えばＣａＭＶの３５Ｓ（配列番号１、変異体１）、または真核生物遺伝子の典型的なコンセンサス配列を有するＩｎｒ部位、５’−ＹＹＡ⁺¹ＮＷＹＹ−３’、ここでＡ⁺¹が転写最初のヌクレオチドを表し、Ｙ＝Ｃ、Ｔ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ；Ｗ＝Ａ、Ｔ（配列番号２のＴＣＡＣＡＴＣ、変異体２）のような、５’末端にＩｎｒイニシエータ部位を有することができる。イニシエータ部位の下流に、ポリ（ＣＡＡ）およびポリ（ＣＴ）の拡張および代替ブロックが続き、例えば二回繰り返される。上述のように、さらに、ＡＴＧ開始コドンの認識を促進するために、コザックまたはコザック様配列は、例えば、３’末端（例えば、ＴＣＴＡＧＡに含まれても良い両変異体においてＸｂａＩのための制限部位に対応する）に存在することができる。

【0125】

ＷＯ２００８／０８０９５４に記載されリーダーのタイプと比較して、ここに記載の人工ＤＮＡ配列は、人工５’−ＵＴＲを製造するための新たな仕様を提供可能である。そのような仕様は、ＷＯ２００８／０８０９５４には記載されておらず、リーダー領域の正確な組成や構造の変更や、新しい優先的な用途に反映させることができる。

【0126】

変異物は、ＷＯ２００８／０８０９５４に記載されたＬＬＴＣＫ配列と、上記ＳＴＥリーダーの変異体例を比較することにより、実施例の方法で推定可能である。後者は、Ａ／Ｔリッチ要素として（ＡＵリッチ要素、ＡＲＥｓ）定義可能な配列も、代わりにＩｎｒ部位の下流のＬＬＴＣＫの内部及びＴＭＶΩリーダーの八量体の両側に存在するＡＴＴトリプレットも有しない。

【0127】

新しいＳＴＥリーダーのより大きな効率化を実証するために、新しいＳＴＥリーダーとＷＯ２００８／０８０９５４に記載されたＬＬＴＣＫ配列との比較を、タバコ（Nicotiana tabacum L.）やイネ（Oryza sativa L.）のような無関係の植物種における二つのレポーター遺伝子の発現レベルを分析して行った。

【0128】

タバコでは、考慮された遺伝子は、ｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）および遺伝的形質転換のために使用した構築物、すなわち、３５Ｓ−ＬＬＴＣＫ：：ｕｉｄＡ：：ＮＯＳｔｅｒ（ｐＳＴＡＲＴ）と３５Ｓ−ＳＴＥ：：ｕｉｄＡ：：ＮＯＳｔｅｒ（ｐＳＴＡＲＴ−ＳＴＥ）を、それぞれＬＬＴＣＫとＳＴＥによってｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）中に存在するリーダー配列を交換することによって得た（実施例１）。より正確にはそれは、置換され操作された、ＣａＭＶの（ＡＣＡＣＧ）のＩｎｒ ３５Ｓ領域の間に含まれる、両方の構築物に共通に保持された、及び制限部位ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）である、配列ｐＢＩ１２１であった。レポーター遺伝子の発現レベルは、かなりの感度、精度、速度、および実行の容易さによって特徴付けられる蛍光４−ＭＵＧアッセイ（Jefferson et al., 1987）を用いて評価した。具体的には、形質転換された植物におけるＧＵＳ遺伝子の発現を定量的評価するために、蛍光アッセイは、３枚の、完全に膨張した若葉をプレスして得られた粗タンパク質抽出物に対して行った。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の比活性の値は、タンパク質ｍｇ当たりに産生される４−ＭＵのミリモルで表され、ブラッドフォードアッセイを用いて算出された総タンパク質濃度に対して標準化した。図１は、降順で、２つの構築物で形質転換された植物上に得られたデータを示す（３枚の葉の抽出物のために記録された平均値）。

【0129】

図１に示すデータについて統計分析、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。結果を下記表１に示す。
表１：コンストラクト３５Ｓ−ＬＬＴＣＫ：：：ｕｉｄＡ：：ＮＯＳｔｅｒ及び３５Ｓ−ＳＴＥ：：ｕｉｄＡ：：ＮＯＳｔｅｒで形質転換された植物で得られた平均データについて実施したＡＮＯＶＡ

【表1】

【0130】

上記分析は、２つの分析対象集団（ｐＳＴＡＲＴとｐＳＴＡＲＴ−ＳＴＥ）の間の統計的有意差（Ｐ＜０．０５）の存在を示した。表１及び図１の共同試験より、ＳＴＥリーダーはｕｉｄＡ遺伝子の発現レベルの非限界的増加を引き起こすことを主張可能である。得られた平均値は、形質転換された植物の２つの集団に考慮される場合には、特に、ＳＴＥリーダーは、ＬＬＴＣＫに比べ約２．８倍、レポーター遺伝子ＧＵＳの発現レベルの増加をもたらす。

【0131】

タバコ（双子葉植物のクラスのモデル種）に見られた結果の確認として、広く生物工学分野で使用される穀物であるイネで実験を実施した。最初の種と同様に、比較試験は、他の要素と厳密に同様に、２つの発現構築物を用いて行った。特に、以下のベクターを比較した。
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００／ＰＭＩ／ＧｌｕＢ４−ＬＬＴＣＫ：：ＧＣａｓｉ：：ＧｌｕＢ４ｔｅｒ；
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００／ＰＭＩ／ＧｌｕＢ４−ＳＴＥ：：ＧＣａｓｉ：：ＧｌｕＢ４ｔｅｒ。

【0132】

しかし、イネにおいて、異なるタイプのリーダーの効果は、異なる制御要素を用いて、種子特異的発現のコンテキストでアッセイしたことを強調しなければならない。より正確には、イネ（ＧｌｕＢ４）のグルテリン４のプロモーター、及び対応するターミネーター（ＧｌｕＢ４ｔｅｒ）を使用した。レポーター遺伝子としては、ｈＧＣａｓｉ、すなわちヒト酵素酸ベータ−グルコシダーゼをコードする配列が選ばれた。組換えタンパク質の検出は、免疫学的アッセイ（ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ）を介してかなりの感度と精度で行うことが可能である。リーダー配列に関して、両方のベクターでＧｌｕＢ４のＩｎｒ部位を使用した、なぜなら、それは真核生物のコンセンサス配列ＹＹＡＮＷＹＹ内に入るからである。また、このウイルスは双子葉植物だけを攻撃するので、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのイニシエータ部位は、あまり適さない。

【0133】

各ベクターは、イネ var. ＣＲ Ｗ３（Hiei et al., 1994）の形質転換のためにエレクトロポレーションを使用して、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に挿入した。トランスジェニック植物の２つの集団は、それぞれ、５０個体からなる。各植物の成熟種子を回収し、総タンパク質抽出に使用した。得られたタンパク質抽出物をＧＣａｓｉ含量を評価するためにＤＡＳ−ＥＬＩＳＡで分析した。図２は、得られたデータの分布を示す。

【0134】

一元配置分散分析は、イネの２つの集団の間で見つかったレポーター遺伝子の発現の差は統計的に有意である（表２）であることを確立した。
表２：コンストラクトｐＣＡＭＢＩＡ１３００／ＰＭＩ／ＧｌｕＢ４−ＬＬＴＣＫ：：ＧＣａｓｉ：：ＧｌｕＢ４ｔｅｒ及びｐＣＡＭＢＩＡ１３００／ＰＭＩ／ＧｌｕＢ４−ＳＴＥ：：ＧＣａｓｉ：：ＧｌｕＢ４ｔｅｒで形質転換された植物で得られたデータについて実行したＡＮＯＶＡ

【表2】

【0135】

上記表２と図２のグラフから、ＳＴＥリーダーはＬＬＴＣＫリーダーよりも大きな発現レベルを与えることが明らかである。特に、ＳＴＥリーダーは、ＬＬＴＣＫのそれらの３．５倍のレポーターＧＣａｓｉ遺伝子の発現の増加をもたらす。

【実施例】

【0136】

（実施例１）：タバコｐＳＴＡＲＴ−ＳＴＥにおける発現ベクターの作製
ベクターｐＳＴＡＲＴ−ＳＴＥを作製産生するための出発点は、以前の研究（De Amics et al., 2007）で得られた発現ベクターｐＳＴＡＲＴであった。この最後のベクターは、オリジナルのベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の改変から得られた順に、ＬＬＴＣＫリーダー、ＧＵＳタンパク質をコードするレポーター遺伝子とＮＯＳターミネーターを有するＣａＭＶ３５Ｓプロモーターから構成されるなる発現カセットを有する。ｐＳＴＡＲＴ−ＳＴＥ（図３Ａ）を取得するために、ｐＳＴＡＲＴでＬＬＴＣＫリーダーはＳＴＥリーダーに置き換えられた。この目的のために、ＳＴＥリーダーの配列が追加された３５Ｓプロモーター（ＳｃａＩ部位から）の一部に対応する配列を、この場合配列番号１の例の形で人工的に合成した、合成された領域（７０２ｂｐ、図３（ｂ））は、制限酵素ＳｃａＩおよびＸｂａＩによる分解、ベクターの回復、及び新しい合成配列のＤＮＡリガーゼによるライゲーションによりｐＳＴＡＲＴに置き換えられた。

【0137】

（実施例２）：プロモーターＧｌｕＢ４、リーダーＬＬＴＣＫとＳＴＥを有する発現ベクターの作製
リーダー配列ＬＬＴＣＫおよびＳＴＥは、人工的に合成した。特に、両方の場合において、合成領域は、イネのグルテリン４プロモータ（ＧｌｕＢ４）の末端部分に存在するＢｆｒＩ部位と、リーダー自身の３’末端（図４Ｂおよび４Ｃ）に存在するＸｂａＩ部位との間に含まれる配列に対応した。より正確には、この領域は、ＬＬＴＣＫの３２８塩基対（図１Ｂ）とＳＴＥ（図４Ｃ）の３１５塩基対と同等の結果となった。

【0138】

最終的な発現ベクターを製造するために、発現カセットの最終組立を可能にする二つのリーダーと並行して、一連の中間サブクローニング工程を実施した。最初のステップでは、天然のＧｌｕＢ４プロモーターの下流に存在するリーダーは、合成リーダーＬＬＴＣＫとＳＴＥで置き換えられた。出発点は、天然のリーダー（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ．ｎ°ＡＹ４２７５７１）と融合したグルテリン４のプロモーターを含む、ベクターｐＧＥＭ−Ｔ／ＧｌｕＢ４−ＮＡＴであった。ＧｌｕＢ４プロモーターの末端領域（ＢｆｒＩ部位から）と、天然のリーダーは、酵素ＢｆｒＩおよびＸｂａＩで分解されることにより除去され、新たな合成配列に置き換えられた。このように、二つの中間ベクター、ｐＧＥＭ−Ｔ／ＧｌｕＢ４−ＬＬＴＣＫ及びｐＧＥＭ−Ｔ／ＧｌｕＢ４−ＳＴＥが製造され、続いてＰＣＲ分析、酵素消化及び配列決定によって確認された。

【0139】

最終的な発現カセットは、ｐＵＣ１８／ＧｌｕＢ４ｔｅｒベクターからスタートして組立てられた。このベクターは、ＧｌｕＢ４−ＬＬＴＣＫ（またはＧｌｕＢ４−ＳＴＥ）複合体及びレポーター遺伝子を、それぞれ挿入するための２つの連続したサブクローニング工程により処理した。特に、第１のサブクローニング工程で、ｐＵＣ１８／ＧｌｕＢ４ｔｅｒは、ｐＧＥＭ−Ｔ／ＧｌｕＢ４−ＬＬＴＣＫとｐＧＥＭ−Ｔ／ＧｌｕＢ４−ＳＴＥベクターのそれぞれから抽出されたＧｌｕＢ４−ＬＬＴＣＫとＧｌｕＢ４−ＳＴＥを連結するために、制限酵素ＳｐｈＩおよびＸｂａＩで分解された。第２のサブクローニング工程で、中間ベクターｐＵＣ１８／ＧｌｕＢ４−ＬＬＴＣＫ：：ＧｌｕＢ４ｔｅｒとｐＵＣ１８／ＧｌｕＢ４−ＳＴＥ：：ＧＬＵＢ４ｔｅｒは、同じ酵素を用いてベクターｐＭＳ／ｈＧＣａｓｉから抽出されたレポーター遺伝子（ｈＧＣａｓｉ）を挿入するために、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで分解された。このようにして、完全に組立てられた発現カセットを含む２つのｐＵＣ１８ベクター、すなわち、ｐＵＣ１８／ＧｌｕＢ４−ＬＬＴＣＫ：：ＧＣａｓｉ：：ＧｌｕＢ４ｔｅｒとｐＵＣ１８／ＧｌｕＢ４−ＳＴＥ：：ＧＣａｓｉ：：ＧｌｕＢ４ｔｅｒを得た。

【0140】

最終的なベクターを生成するために、２つの発現カセットＧｌｕＢ４−ＬＬＴＣＫ：：ＧＣａｓｉ：：ＧｌｕＢ４ｔｅｒとＧｌｕＢ４−ＳＴＥ：：ＧＣａｓｉ：：ＧｌｕＢ４ｔｅｒは、例えば、別々のｐＵＣ１８からＥｃｏＲＩで二重消化して別々に抽出され、
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００／ＰＭＩ／ＧｌｕＢ４−ＬＬＴＣＫ：ＧＣａｓｉ：：ＧｌｕＢ４ｔｅｒ、及び
ｐＣＡＭＢＩＡｌ３００／ＰＭＩ／ＧｌｕＢ４−ＳＴＥ：ＧＣａｓｉ：：ＧｌｕＢ４ｔｅｒを構成するように（図４Ａ）、最終的な発現ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００／ＰＭＩでクローン化された。

【0141】

（実施例３）：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）により媒介されるニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）の遺伝的形質転換
ニコチアナ・タバカム栽培品種Xanthi（Nicotiana tabacum,cv.Xanthi）の遺伝的形質転換のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens Horschら（1985）のプロトコルを使用した。私たちは、簡単に全体の手順の主なステップを記述する。
種子の消毒

【0142】

形質転換に使用するためのタバコの種子の調製のために、次のプロトコルに従い、最初に殺菌が行われた。

【0143】

無菌の２ｍＬの試験管に少量の種子を入れる。９５％エタノール約１ｍＬを加る。２分間保持し激しく撹拌する。ピペットを用いて、エタノールを除去する。２％の塩酸１ｍＬを加える。２０分間インキュベートし、攪拌、除去して、１ｍＬの滅菌水を加える。このようにして種子を５回すすぐ。試験管内の最後のすすぎの水を残す。先端を無菌条件下で除去したロッドを使用して、一定量の種子と水を除去し、プレートまたはベビージャー内のＭＳ１０基質の上に置く。

【0144】

細菌学的ループまたはＬ字型に曲げたパスツールピペットを使用して、微妙種子を配布する。

【0145】

２８℃の気候室の内部に光の中にプレートを設置して発芽させた。

【0146】

Ａ．ツメファシエンス（A.tumefaciens）の形質転換
Ａ．ツメファシエンス（A.tumefaciens）を用いたＮ．タバカム（N.tabacum）の葉材料の形質転換は、以下の手順で行った。
・フードの下で、４−５×２ｍＬの試験管に１．８ｍＬの滅菌ＬＢブロスを満たす。滅菌した爪楊枝で、プレート上で増殖させた小さいが可視量の細菌コロニーを拾って、Ａ．ツメファシエンス（A.tumefaciens）を接種する、続いて、試験管内でそれを希釈し、激しく撹拌する。
・無菌のパンチを使用してタバコの葉（約１ヶ月齢の植物から）を取り、葉身から直径７ｍｍのディスクを作成する。ペンチを使って葉のディスクをＭＳ１０基質プレートに、プレート一枚当たり３０ディスクのせる。各細菌株あたり、少なくとも合計２００ディスクとする。決して感染させないディスク、及び常にＭＳ１０培地上にあるディスクをのせるための２つの対照プレートを準備する。
・ディスクを含むプレート上に、直前に細菌を植菌した試験管の内容物を注ぎ、Ａ．ツメファシエンス（A.tumefaciens）のディスクを感染させる。全てのディスクが濡れるように回転運動で軽くかき混ぜ、その後ピペットで余分な液体を除去する。ペンチを使用して、定期的にディスクを配置する。
・成長室で、２８℃の温度で、プレートを一晩、一定の光の中でインキュベートする。
・ＭＳ１０セフォタキシム５００ｍｇ／Ｌの基質の上に葉のディスクを移す。
・一定の光の中で、２４℃の温度で６日間インキュベートする。
・形質転換開始８日後、形質転換されたカルスの選択のためにＭＳ１０セフォタキシム５００ｍｇ／Ｌ−カナマイシン２００ｍｇの／Ｌの基質上に葉のディスクを移す。上記と同じ条件下で１４日間インキュベートする。
・キメラでない正常な外観の、少なくとも２枚の葉からなるシュートを切り取る。それらを、定着のための基質（ＭＳ０、セフォタキシム５００ｍｇ／Ｌ−カナマイシン２００ｍｇ／Ｌ−ＩＢＡ２ｍｇ／Ｌ）上に移す。
・水で根についた基質を優しく洗い流し、根付いた植物を成長させるため、鉢植え泥炭や水耕栽培システムに移植する。植物を、１６時間の採光と８時間の闇の光周期で２６〜３０℃の温度を維持した気候室に配置する。

【0147】

（実施例４）：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）により媒介されるオリザ・サティバ（Oryza sativa）の遺伝的形質転換
ＣＲ Ｗ３種のイネの形質転換のために、形質転換カルスが得られるまで、Hoge（イネ研究グループ、植物科学研究所、ライデン大学）とGuiderdoni（Ｂｉｏｔｒｏｐプログラム、ＣＩＲＡＤ、モンペリエ、フランス）によって修正されつつHieiら（1994）のプロトコルが使用された。その後の選択工程のためにDattaとDatta（2006）のプロトコルが使用された。私たちは今、簡単に全体の手順の主なステップを記述する。
イネの胚盤からの胚形成カルスの調製と開発

【0148】

イネの形質転換は、胚盤由来の胚形成カルスを用いて行った。

【0149】

胚盤組織からカルスの増殖を誘導するために、以下の操作手順を使用した。
・イネの種子を剥いた（包頴の排除）
・潜在的な汚染物質病原体及びカルスの生成を妨げる腐生菌除去を除去するため、包頴無しの穀果を消毒した
ａ．最初の消毒処理において、剥いた種子を７０％エタノール溶液中で２分間放置した
ｂ．エタノール処理後、種子を、Ｔｗｅｅｎ２０洗浄剤を２滴加えた５％ナトリウム塩酸塩の溶液に移し、３０分間ゆっくり攪拌しながら保持した
ｃ．胚盤中のカルスの誘導を阻害し得るナトリウム塩酸塩の全ての痕跡を除去するために、それぞれ１５分間滅菌水で一連の洗浄が行われた
・最後の洗浄の後、種子を滅菌吸収紙の上で乾燥させた
・プレート当たり１２個の種子を、カルス（ＣＩＭ、カルス誘導培地）を誘導するために使用される基質の表面上に配置し、ペトリ皿（直径９０ｍｍ）中に２５ｍＬの容量で希釈した
・得られたプレートを暗所で、２１日間温度２８℃でインキュベートし、１週間インキュベーションした後、胚乳および細根が胚盤からカルスの発展を促進するために除去された（胚盤は少量で、一部が胚乳に含まれ、黄色であった）
・３週間インキュベーションした後、カルスは新鮮なＣＩＭの基質上に転写した、続いてカルス塊はメスを使わずに砕かれ、カルス上に自然なヒビができた
・継代培養をさらに１０日間続け胚形成カルスを成長させ、形質転換に適するようにした
カルスとＡ．ツメファシエンス(A.tumefaciens)ＥＨＡ１０５の共培養
１．形質転換に十分な量のＡ．ツメファシエンス(A.tumefaciens)を得るために、上記のプラスミドベクター（実施例２）を有する株をＬＢ寒天培地で３０℃で３日間インキュベートした。
２．アグロバクテリウムが成長したときに、細菌細胞層をこすり落として、３−５・１０⁹細胞／ｍＬに対応する約１．０のＯＤ₆₀₀が得られるまで、共培養培地液（ＣＣＭＬ）に懸濁した
３．最高のカルス、すなわち、直径が約２ｍｍで、小さく白っぽい色のものを、３５ｍＬの細菌懸濁液を含むペトリ皿に移して、１５分間液に浸し、攪拌した
４．その後、カルスを、滅菌吸収紙を使用して乾燥した
５．最大２０カルスを、共培養のための半固体基質（ＣＣＭＳ：co-cultivation medium solidified）を含有するハイエッジペトリ皿（Sarstedt社）に移した
６．カルスは、次いで、３日間２５℃の温度で、暗い環境でインキュベートした

【0150】

ＰＭＩマーカーシステムに基づいたカルスの選択
アグロバクテリウムとの胚形成イネカルスの共培養後、選択マーカーとしてＰＭＩ（ホスホイソメラーゼ）に基づく選択システムを用い、選択剤としてマンノースを使用して、形質転換された組織を選択した。この方法は、マンノースの濃度が増加しスクロースの濃度が減少することを含む培養基質を使用することを提供する。

【0151】

手順は次の通り：
・Ａ．ツメファシエンス(A.tumefaciens)との共培養から、マンノースを含まず３％のスクロースとを含むＰＳＭ（事前選択培地）基質上にカルスを移動し、２８℃の温度で暗所で１週間インキュベーションする。
・２％スクロースおよび１．５％のマンノースを含むＳＭＩ（選択培地Ｉ）基質上へカルスを移動し、２８℃の温度で暗所で２週間インキュベーションする。
・１％スクロースおよび２％マンノースを含むＳＭＩＩ（選択培地ＩＩ）基質上へカルスを移動し、２８℃の温度で暗所で２週間インキュベーションする。
・再生が続く。

【0152】

形質転換されたカルスからのイネ植物の再生
想定される形質転換された植物の再生は、ここで報告された手順に従って、形質転換カルスの適切なホルモン刺激により起きた。
１．選択した胚発生イネカルスを、0.５％スクロースおよび２．５％のマンノースを含むＰＲＭ基質（プレ再生培地）の入った高エッジペトリ皿上に移し、暗所で２８℃で２週間インキュベーションした。
２．ＰＲＭ基質上を通過した後、カルスはマンノースを含まないＲＭ基質（再生培地）上に移した、高エッジペトリ皿当たり最大で８−１０単位とした。植物は、３〜４週間、２８℃で、光で増殖させた。
３．植物がカルスから分離されるのに十分に増殖させ（高さ３ｃｍ以上）、それらを発根培地２５ｍｌ（ｒｍ）を含む培養チューブに移した。
４．チューブ内側の二次培養は、約３週間常に約２８℃で光の中で続けた。
５．再生処理の終了時に、植物は、泥炭に移し温室条件下で成長させた。
（実施例５）：４−ＭＵＧアッセイにより形質転換されたタバコの葉組織からの全タンパク質の抽出

【0153】

今説明した手順は、長時間ＧＵＳタンパク質の酵素活性を保持し、タバコの葉抽出物を生成し保持することができる。
・１．５ｍＬの試験管に、１５ｍｇＰＶＰ（ポリビニルピロリドン、ＭＷ＞４００００ｇ／ｍｏｌ）を秤量し、抽出緩衝液（表３を参照）２００μＬを加えてボルテックス撹拌し、４℃で少なくとも３０分間インキュベーションした
・Ｍｅｋｕ Ｐｏｌｌａｈｎｅプレスを用いて葉汁を抽出
・葉汁１００μＬを除去し、氷中ですべてを維持しながら、バッファーＰＶＰの混合物に加えた
・４℃で１１５００回転で１５分間遠心分離
・上清（〜２００μＬ）を除去し、新しい試験管に即座に移動する
・すぐに液体窒素を用いて凍結し、−８０℃で保存する

【表3】

【0154】

手順は、蛍光分析にかけ、全てのサンプルに区別なく適用した。各形質転換植物は、植物の先端部に存在する３葉（高度な拡張期）から採取した抽出物を使用して、３回分析した。
（実施例６）：蛍光４−ＭＵＧアッセイ

【0155】

形質転換された植物から得られたタンパク質の葉抽出物中のＧＵＳ酵素の含有量を評価するために、特定の蛍光アッセイを行った。使用される基質は、ＧＵＳ酵素の存在下で、蛍光化合物４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を生成する、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）であった。以下のプロトコルは、Jefferson（1987）によって示された標準的な手順から派生し、そしてプレートでアッセイを実行するように適合された。
・９６ウェルプレート（低結合、Sarstedt社）で、ＭＵＧ溶液（表４）１３０μＬに葉抽出物１０μＬを加えた
・３７℃で１時間インキュベーション
・反応液２０μＬを除去し、９６ウェル（サンプル当たりに少なくとも２回繰り返し）の不透明なプレートのＮａ₂Ｃ０₃０．２Ｍ（停止液）２３０μＬに迅速に加える
・不透明なプレートで４-ＭＵで検量線を引く（１ｍＭ、と連続する希釈液１：２、計４〜５点に対して）
・プレート蛍光光度計を使用して値を読む
・カーブフィッティングデータ解析（Ｐｒｏｍｅｇａ社）ソフトウェアを使用して結果を処理する。

【表4】

（実施例７）：形質転換イネの種子からの総タンパク質の抽出

【0156】

ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡを用いてアッセイされる総タンパク質の抽出物を得るために、以下のステップを含む抽出プロトコルを開発した。
・稲穂を各個体から採取する
・種の相対湿度が１４％になるまで、稲穂を約３日間乾燥した風通しのよい場所で乾燥した
・各ラインの種子４０個をランダムにサンプリング
・種子は、手動の脱穀機で剥いた
・サンプルを、ＭＭ２（Ｒｅｔｓｃｈ社）振動マイクロミルで、２０ヘルツの速度で２分間粉砕し、得られた小麦粉７０ｍｇを除去した
・小麦粉を抽出緩衝液（トリス塩酸５０ｍＭ、塩化ナトリウム０．５Ｍ、ｐＨ７．０）１ｍＬで乳鉢でホモジナイズした
・続いて、別途７ｍＬの同じ緩衝液で希釈
・連続して攪拌しながら４℃で１時間インキュベーション
・１ｍＬを除去し、４℃で、２００００回転で４０分間遠心分離した
・タンパク質を含む液相を回収し、−２０℃で保存した
（実施例８）：ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡアッセイ

【0157】

ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡアッセイは、二重免疫学的認識に基づいて、個々のタンパク質抽出物のＧＣａｓｉ含量を評価するために使用された。分析のため、サンプルを１：３０に希釈した。アッセイの主なステップを報告する。
・各ウェルに、２ｎｇ／μＬに希釈した抗ＧＣａｓｉ非結合ポリクローナル抗体（ＰＢＳをアジ化ナトリウム（０．０１％）で１：５に希釈）１００μＬを分配する
・プレートを４℃で一晩インキュベートする
・抗体を除去する
・各ウェルに、２５０〜３００μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳ＋ＢＳＡ ２．５％＋アジ化ナトリウム０．０１％）を分配する
・プレートを２５℃で２０分間インキュベートする
・ブロッキング溶液を除去する
・５０μＬ／ウェルの標準の希釈液（２００、１００、５０、２５ｐｇ／μＬ 市販のイミグルセラーゼ；サノフィ−ジェンザイム社製）、分析用サンプル、及び希釈液（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％＋１％ＢＳＡ）からなるコントロールサンプルを分配する
・プレートを攪拌しながら３７℃で３０分間インキュベートする
・３００μＬ／ウェル（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）でウェルを３回洗浄する；
・配布５０μＬ／ウェル ポリクローナル抗体抗ＧＣａｓｉの０．４ｎｇの／μＬ希釈液で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート；
・攪拌しながら３７℃で３０分間、プレートをインキュベートし；
・３００μＬ／ウェル（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０）の洗浄液でウェルを３回洗浄する
・ＴＭＢ溶液１００μＬ／ウェルを分配する
・プレートを２５℃で約１０分間インキュベートする
・１００μＬ／ウェルの停止液（塩酸１Ｍ）で反応を停止する
・プレートリーダーモジュラスＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて４５０ｎｍでプレートを読む
・標準の公知の濃度値を割り当てるカーブフィッティングデータ解析ソフトウェア（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてデータを処理する。試料の濃度値は、抽出物の実際の濃度を得るために採用した希釈係数を考慮しながら、４つのパラメータで線形曲線を用いて得た。

【0158】

参考文献
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【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]