特許 6370018 反応促進装置及び反応促進方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6370018

(24)【登録日】2018年7月20日

(45)【発行日】2018年8月8日

(54)【発明の名称】反応促進装置及び反応促進方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20180730BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 541A

【請求項の数】3

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2018-47828(P2018-47828)

(22)【出願日】2018年3月15日

(62)【分割の表示】特願2017-175026(P2017-175026)の分割

【原出願日】2017年9月12日

【審査請求日】2018年3月15日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構（ＡＭＥＤ）、「未来医療を実現する医療機器・システム研究開発事業 低侵襲がん診断装置開発プロジェクト」委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】508055157

【氏名又は名称】株式会社 マトリックス細胞研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100085394

【弁理士】

【氏名又は名称】廣瀬 哲夫

(74)【代理人】

【識別番号】100165456

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 佑子

(74)【代理人】

【識別番号】100206106

【弁理士】

【氏名又は名称】廣瀬 郁夫

(72)【発明者】

【氏名】関野 正樹

(72)【発明者】

【氏名】隣 真一

(72)【発明者】

【氏名】金子 美樹

(72)【発明者】

【氏名】桑波田 晃弘

(72)【発明者】

【氏名】松田 祐子

(72)【発明者】

【氏名】坂本 聡

(72)【発明者】

【氏名】日下部 守昭

【審査官】 西浦 昌哉

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０７２４５７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−０５９２８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２７９５８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５１０５６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−２３０６８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０２１２９９０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平０９−１１３５１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−２０７９３８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｇ０１Ｎ １／２８

Ｂ０３Ｃ １／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

プレート表面の所定範囲内に配された検体に、検出対象に特異的に結合する結合部と磁性体とを備えた磁性複合体を添加して、該磁性複合体を磁力によりプレート表面の検体に引き付けることで、磁性複合体の結合部と検出対象との特異的な結合反応を促進するにあたり、
前記磁性複合体をプレート表面の検体に引き付けるための磁石と、
プレート表面に検体が配される前記所定範囲と前記磁石の磁極面とを近接させる制御機構と、を備えた反応促進装置であって、
前記磁石の磁極面は、前記プレート表面の所定範囲より広くなっており、
前記磁石は、プレートに近接する磁極面が、中央ほどプレートに近接して端部ほどプレートから離間するよう傾斜していることで、前記プレートにおける検体が配される所定範囲では、中央部と端部のあいだで磁石によって印加される磁力の差が低減されるよう構成されていることを特徴とする反応促進装置。

【請求項2】

前記磁石は、複数の小磁石によって構成されており、該複数の小磁石は、磁石磁極面の中央に配されたものほど前記プレートに近接する一方、端部に配されたものほど前記プレートから離間して設けられていることを特徴とする請求項１記載の反応促進装置。

【請求項3】

プレート表面に検体を固定し、
該固定された検体に、検出対象に特異的に結合する結合部と、検出装置によって検出可能な磁性体とを備えた磁性複合体を添加して、
前記プレートの検体が固定された位置にプレートの裏面側から磁石を近接させて結合反応を促進する反応促進方法であって、
前記磁石は、プレートに近接する磁極面が、中央ほどプレートに近接して端部ほどプレートから離間するよう傾斜していることで、前記プレートにおける検体が配される所定範囲では、中央部と端部のあいだで磁石によって印加される磁力の差が低減されるよう構成されていることを特徴とする反応促進方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、検出対象への特異的な結合反応を磁気によって促進する反応促進装置及び反応促進方法に関する。

【背景技術】

【0002】

検出対象に対する特異的な結合反応を利用することで、採取した検体に検出対象が存在するか、存在する場合にはその位置、量等を確認することが広く行われている。この特異的な結合反応を促進する方法の１つとして、磁気免疫染色法が知られている。磁気免疫染色方法は、生体組織の検体を標識して対象を検出する方法であって、検出対象の抗原に特異的な抗体に蛍光性色素及び磁性粒子を複合した微粒子を用意し、この微粒子を懸濁した液体に検体を浸漬し、これに磁場を印加して微粒子を検体表面に集めることで、検出対象の抗原と微粒子の抗体との抗原抗体反応を促進し、迅速な免疫染色を可能とするものである（例えば、特許文献１、非特許文献１参照。）。

【0003】

磁気免疫染色法の手順の例は以下のとおりである。まず、薄片にした生体切片等の検体をスライドガラスに固定する。次に、検出対象の抗原に特異的な抗体と標識用の蛍光色素を磁性ビーズとともに複合化した微細粒子を含む、抗体付き蛍光磁気粒子懸濁液を検体の表面に滴下して、抗原抗体反応を行う。この際、スライドガラスの裏面（検体が固定されてる面の反対側の面）に磁石の磁極面を近接させることで、磁場を印加して反応を促進させる。その後、懸濁液を除去・洗浄し、スライドガラス上の蛍光を検出することで、蛍光の有無や強度、位置によって、検体中における検出対象の抗原についての情報を得ることができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特許第５４０１７２４号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Sakamoto S, Omagari K et al. “Magnetically Promoted Rapid Immunoreactions Using Functionalized Fluorescent Magnetic Beads: A Proof of Principle”, Clinical Chemistry, 60:4 2014 p.610-620

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

上記の磁気免疫染色法において、検体の薄片の大きさは直径５ｍｍ程度であることが多い。したがって、薄片をスライドガラス上に固定するに際して、毎回高精度に同じ位置に薄片を載置することは困難である。そして、従来の磁気免疫染色法では、検体が固定された位置によって抗原抗体反応の進行にむらが生じるため、検体を十分に染色できない場合や、反応が進んでいるかを都度確認しなければならない場合があるという問題がある。検体をスライド上の同位置に毎回固定させることができればこのような問題は回避できるが、そのような作業は作業者にとって負担が大きく、作業時間も長くなってしまう。

【0007】

このように反応にむらが生じる原因として、磁石が印加する磁力が一様でないことが挙げられる。磁気免疫染色においては、一般的に、円柱磁石のように磁性体を引き付ける磁極面が平坦な磁石が用いられている。しかし、このような磁石は、磁極面の中心部に対して端部の磁力が強くなっており、磁性体が端部に偏在してしまう。したがって、同じ時間抗原抗体反応をさせた場合であっても、磁極面の端部側ほど反応が促進される一方、中央部では反応が遅くなる傾向にあり、同一の検体を免疫染色させたとしても、固定された位置によって結果が異なってしまう場合がある。そこで、検体が固定された位置によって生じる反応のむらを低減して反応を促進する方法が望まれており、これらに本発明が解決せんとする課題がある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、上記の課題を解決するため鋭意創作されたものであって、請求項１の発明は、プレート表面の所定範囲内に配された検体に、検出対象に特異的に結合する結合部と磁性体とを備えた磁性複合体を添加して、該磁性複合体を磁力によりプレート表面の検体に引き付けることで、磁性複合体の結合部と検出対象との特異的な結合反応を促進するにあたり、前記磁性複合体をプレート表面の検体に引き付けるための磁石と、プレート表面に検体が配される前記所定範囲と前記磁石の磁極面とを近接させる制御機構と、を備えた反応促進装置であって、前記磁石の磁極面は、前記プレート表面の所定範囲より広くなっており、前記磁石は、プレートに近接する磁極面が、中央ほどプレートに近接して端部ほどプレートから離間するよう傾斜していることで、前記プレートにおける検体が配される所定範囲では、中央部と端部のあいだで磁石によって印加される磁力の差が低減されるよう構成されていることを特徴とする反応促進装置である。
請求項２の発明は、前記磁石は、複数の小磁石によって構成されており、該複数の小磁石は、磁石磁極面の中央に配されたものほど前記プレートに近接する一方、端部に配されたものほど前記プレートから離間して設けられていることを特徴とする請求項１記載の反応促進装置である。
請求項３の発明は、プレート表面に検体を固定し、該固定された検体に、検出対象に特異的に結合する結合部と、検出装置によって検出可能な磁性体とを備えた磁性複合体を添加して、前記プレートの検体が固定された位置にプレートの裏面側から磁石を近接させて結合反応を促進する反応促進方法であって、前記磁石は、プレートに近接する磁極面が、中央ほどプレートに近接して端部ほどプレートから離間するよう傾斜していることで、前記プレートにおける検体が配される所定範囲では、中央部と端部のあいだで磁石によって印加される磁力の差が低減されるよう構成されていることを特徴とする反応促進方法である。

【発明の効果】

【0009】

請求項１の発明とすることにより、磁石によって結合反応を促進するに際して、検体が配される所定範囲に印加される磁力が均一なものとなって、結合反応をむらなく促進可能な反応促進装置を提供することができる。
請求項２の発明とすることにより、傾斜した磁極面を複数の小磁石で構成できるため、傾斜した磁石の製造が容易になるとともに、傾斜の程度を小磁石の配置や選択によって調整可能となるため、最適な磁極面の形状とするための調整が容易なものとなる。
請求項３の発明とすることにより、磁石によって結合反応を促進するに際して、検体が配される所定範囲に印加される磁力が均一なものとなって、結合反応をむらなく促進可能とすることができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】反応促進装置の模式図であって、（Ａ）平面図、（Ｂ）正面図である。

【図2】第１実施形態の磁石の（Ａ）平面図、（Ｂ）正面図、（Ｃ）第１棒磁石と第２棒磁石を色分けした平面図、（Ｄ）第１棒磁石と第２棒磁石を色分けした（Ａ）のＤ−Ｄ端面図である。

【図3】第２実施形態の磁石の（Ａ）平面図、（Ｂ）正面図、（Ｃ）（Ｂ）のＣ−Ｃ断面図、（Ｄ）（Ａ）のＤ−Ｄ端面図である。

【図4】（Ａ）第３実施形態の磁石の正面図、（Ｂ）第３実施形態の第１変形例の磁石の正面図、（Ｃ）第３実施形態の第２変形例の磁石の平面図、（Ｄ）第３実施形態の第２変形例の磁石の正面図である。

【図5】磁性ビーズの構造を示す模式図である。

【図6】磁石により磁性ビーズを引き付ける状態を示す模式図であって（Ａ）検体に磁性ビーズを引き付ける状態、（Ｂ）残留した磁性ビーズを引き剥がす状態を示すものである。

【図7】各実施の形態の磁石を用いた実験例の結果を撮影した写真図をグレースケール表示したものであって、（Ａ）第１実施形態（揺動なし）、（Ｂ）第１実施形態（揺動あり）、（Ｃ）第２実施形態（揺動なし）、（Ｄ）第２実施形態（揺動あり）、（Ｅ）第３実施形態の第２変形例（揺動なし）、（Ｆ）平坦な円柱磁石（揺動なし）の実験例の結果である。

【図8】各実施の形態の磁石を用いた実験例の結果を撮影した写真図を誤差拡散によりディザリング処理したものであって、（Ａ）第１実施形態（揺動なし）、（Ｂ）第１実施形態（揺動あり）、（Ｃ）第２実施形態（揺動なし）、（Ｄ）第２実施形態（揺動あり）、（Ｅ）第３実施形態の第２変形例（揺動なし）、（Ｆ）平坦な円柱磁石（揺動なし）の実験例の結果である。

【図9】各実施の形態の磁石を用いた実験例の結果を撮影した写真図を単純白黒２色表示したものであって、（Ａ）第１実施形態（揺動なし）、（Ｂ）第１実施形態（揺動あり）、（Ｃ）第２実施形態（揺動なし）、（Ｄ）第２実施形態（揺動あり）、（Ｅ）第３実施形態の第２変形例（揺動なし）、（Ｆ）平坦な円柱磁石（揺動なし）の実験例の結果である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明の反応促進方法及び反応促進装置の第１の実施の形態について説明する。第１実施形態では、検体１として、生体組織の薄片を用い、この検体１はプレート２表面の所定範囲２ａ内に配される。そして、検出対象である抗原３に特異的に反応する抗体４と、磁性体５とを有する磁性複合体である磁性ビーズ６の懸濁液６ａをプレート２上の検体１に添加する。その後、プレート２の裏面側から磁石１０２によって磁性ビーズ６を検体１側に引き付けることで、抗原３と抗体４の抗原抗体反応が促進される。その後、磁性ビーズ６の懸濁液６ａを洗浄して抗原３と結合しなかった磁性ビーズ６を除去して、プレート２に残った磁性ビーズ６を標識として検出することにより、検体１に検出対象の抗原３が存在するか、存在する場合にはその位置や量などを確認することができる。このような抗原の検出としては、例えば、癌細胞に特有の抗原に特異的に結合する抗体を用いることで、検体１に癌細胞が存在するか否かを確認することができる。

【0012】

プレート２としては、例えばスライドガラスを用いることができる。もっとも、プレート２はスライドガラスに限られず、磁気を遮断して磁石１０２による磁性ビーズ６の引き付けを阻害するものでなければ、適宜のものとしてよい。そして、プレート２の所定範囲２ａ内に検体１が配される。この所定範囲２ａは検体１やプレート２の大きさに応じて適宜の範囲とすることができるが、検体１をプレート２に配するに際して、困難なく配することができる範囲とする。例えば、検体１が直径約５ｍｍの薄片である場合には、直径約２０ｍｍの円形範囲内であれば、困難無く配することができるため、この範囲を所定範囲２ａとすればよい。

【0013】

さらに、プレート２には、所定範囲２ａを示す印が施されていてもよい。この印は、例えば境界に溝を施したものや、境界線を印刷したもの、所定範囲内外で高低差を設けたものなど所定範囲を認識可能なものであれば、適宜のものとすることができる。

【0014】

磁性ビーズ６は、図５に示されるように、検出対象の抗原３に特異的に結合する結合部である抗体４と、磁性体５と、蛍光物質７と、を備えた磁性複合体である。磁性ビーズ６は、内部に磁性体５と蛍光物質７とが保持されており、外部表面に、抗体４が抗原３との抗原抗体反応が可能に固定されている。このような磁性ビーズ６と、その製造方法は公知であって、例えば上記特許文献１にも記載されており、適宜のものを採用することができる。

【0015】

蛍光物質７は、抗原抗体反応が起こったことを確認するための標識である。すなわち、蛍光物質７の存在により、最終的に懸濁液６ａを洗い流した後、プレート２を蛍光顕微鏡で観察することにより、検体１に検出対象の抗原３が存在するか否かや、その位置、量等を視認することができる。したがって、「結合反応の促進」という観点においては、磁性ビーズ６（磁性複合体）に蛍光物質７などの標識を加えることは必須ではない。また、標識としては蛍光によるものに限られず、例えば、抗原３に結合した磁性ビーズ６の磁気を検出することで、抗原３の有無を確認することもできる。また、蛍光物質７は抗体４に直接標識したものとしてもよいし、二次抗体を用いて標識してもよい。

【0016】

１０１は、上述の反応促進に用いられる反応促進装置であって、磁石１０２と、プレート２を保持する図示しないプレート保持部と、プレート保持部に保持されたプレート２に磁石１０２の磁極面１０５を所定条件で近接・離間させるよう制御する制御機構１０４と、を備えている。

【0017】

磁石１０２は、プレート２に近接する磁極面１０５を備えている。そして、図２に示されるように、磁石１０２は、第１棒磁石１０２ａと、第２棒磁石１０２ｂとが交互に隣り合うよう連続して配して構成されている。第１棒磁石１０２ａは、磁極面１０５側の磁極面１０５ａがＮ極である一方、第２棒磁石１０２ｂは、磁極面１０５側の磁極面１０５ｂがＳ極である。なお、図２（Ｃ）、（Ｄ）では、第１棒磁石１０２ａを黒塗りで表している。磁力線はＮ極からＳ極へと向かうため、このように第１、第２棒磁石１０２ａ、１０２ｂを交互に配することにより、磁石１０２の磁極面１０５では、第１棒磁石１０２ａのＮ極の磁極面１０５ａから、隣の第２棒磁石１０２ｂのＳ極の磁極面１０５ｂへと磁力線のループが完結することとなる（図２（Ｄ）参照）。これによって、磁極面１０５の端部で磁力が強くなることを防止でき、磁性ビーズの端部への局在を防ぐことができることとなる。

【0018】

第１、第２棒磁石１０２ａ、１０２ｂは、天地を逆にした同じ材質からなる棒磁石であり、例えば、磁極面１０５ａ、１０５ｂが２ｍｍ×２ｍｍの角柱状で、ネオジム磁石などの磁力の高い希土類磁石を用いることができる。第１、第２棒磁石１０２ａ、１０２ｂのそれぞれの磁極面１０５ａ、１０５ｂの面積は、小さい（すなわち、第１、第２棒磁石１０２ａ、１０２ｂの数が多い）ほどプレート２の所定範囲２ａ内で印加される磁場が均一になる。例えば、５ｍｍ程度の検体を免疫染色する場合には、上記２ｍｍ四方の磁極面を有する磁石とすることで、十分に均一な磁場が印加される。もっとも、磁極面１０５ａ、１０５ｂの面積が大きい（すなわち、第１、第２棒磁石１０２ａ、１０２ｂの数が少ない）場合であっても、従来の磁石を用いた場合に対しては、検体の配置による影響は低下する。

【0019】

なお、第１、第２棒磁石１０２ａ、１０２ｂは、角柱形状に限られず、円柱形状のものとしてもよい。また、必ずしも隣接している必要はなく、あいだに小さな間隙が存しているものであってもよい。このような磁石１０２としては、磁極面１０５の反対側で複数の棒磁石を一体に支持しているものが想定される。

【0020】

磁石１０２の磁極面１０５の広さは、プレート２内に検体１を配するに際して、作業者が困難なく配することができる程度の範囲を所定範囲２ａとして設定し、磁極面１０５が所定範囲２ａより大きいものとする。例えば、直径５ｍｍ程度の生体組織の薄片をスライドガラスの中央に固定する場合、直径約２０ｍｍの範囲内であれば、作業者が困難なく当該範囲内に固定できるため、磁石１０２の磁極面１０５を直径２２ｍｍ程度とすればよい。

【0021】

プレート保持部は、プレート２を所定位置に保持できるものであればよく、例えば平板上にプレート２を載置固定するものでもよいし、プレート２の端部を把持して固定するようなものでもよい。

【0022】

制御機構１０４は、プレート保持部に保持されたプレート２に、磁石１０２の磁極面１０５をプレート２の裏面側から近接させることにより、添加された懸濁液６ａの磁性ビーズ６を、検体１に引き付けるよう、磁石１０２を制御するものである。このように、磁石１０２の磁極面１０５をプレート２の裏面側に近接させた状態を近接状態といい、磁極面１０５を近接させる時間や距離は、磁石１０２の磁力や結合反応の反応速度などを考慮のうえ、適宜の設定とすることができる。例えば、プレート２の裏面１ｍｍ程度の位置で、１分間ほど近接させておく近接状態の設定とすることができる。また、制御機構１０４は、必ずしも磁石１０２を移動させるものではなく、磁石１０２にプレート２を近接させるものとしてもよい。

【0023】

制御機構１０４は、近接状態で磁石１０２を水平方向に揺動させる揺動機構を備えたものとしてもよい。揺動機構は、制御機構１０４によってプレート２に磁極面１０５を近接させるにあたり、近接状態への磁石の移動と共に水平方向に磁石１０２を揺動させるものであってもよいし、近接状態に磁石が移動した後に揺動開始するものであってもよい。揺動機構は、例えば毎秒１０往復程度で磁石１０２を水平方向に移動させるものとすることができる。磁石１０２の水平方向の移動は、単純な往復運動でもよいし、円運動としてもよい。また、揺動機構は磁石１０２ではなくプレート２（又はプレート保持機構）を揺動させることとしてもよいが、通常は磁石１０２を揺動させることが好ましい。すなわち、揺動機構は、プレート２に対して磁石１０５を相対的に揺動させるものであればよい。

【0024】

揺動機構による磁石１０２の揺動範囲（ストローク）は、第１棒磁石１０２ａ又は第２棒磁石１０２ｂの磁極面１０５ａ、１０５ｂの面積程度とすればよい。すなわち、磁石１０２を複数の第１、第２棒磁石１０２ａ、１０２ｂによって一体として構成させると、後述する図７（Ａ）のように各棒磁石の磁極面１０５ａ、１０５ｂの単位程度の広さで磁性ビーズ６の集積に濃淡模様が生じる。この濃淡模様は想定される検体１の大きさに対して十分に小さくすれば、均質な反応促進に影響を与えるものではないが、濃淡を解消してより均質なものとするために揺動機構によって磁石１０２を揺動させてもよい。この際、従来のような円柱磁石を用いた場合、例えば直径約２０ｍｍの所定範囲２ａ内で磁力の均一化を図ろうとすれば、ストロークを所定範囲２ａの直径と同じく２０ｍｍ程度とする必要がある。しかし、本実施形態の磁石１０２を用いた場合には、直径約２０ｍｍの範囲内で磁力のむらを減らすために揺動させるとしても、各棒磁石の磁極面１０５ａ、１０５ｂの径と同程度のストロークとすれば濃淡を解消して均質化することができる。つまり、揺動させる場合にストロークを小さくすることが可能であるため負荷が小さく、反応促進装置１０１の耐久性が向上することとなる。

【0025】

以上が反応促進装置１０１の基本的な構成である。続いて、反応促進装置１０１を用いた反応促進方法について具体例によって説明する。まず、生体から採取した検体１を、プレート２（スライドガラス）の上面の中央付近の所定範囲２ａ内に配置し、反応促進装置１０１のプレート保持部にプレート２を保持させる。その後、プレート２上の検体１を１０％ホルマリン水溶液に浸漬し、ホルマリン固定する。そして、純水で１５分検体１を洗浄してホルマリンを除去した後、スキムミルク／ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に浸漬してブロッキングをする。続いて、抗体４が固定された磁性ビーズ６の懸濁液６ａをプレート２上の検体１に滴下するとともに、制御機構１０４の制御によって磁石１０２をプレート２の所定範囲２ａの裏面側から約１ｍｍ程度の距離まで近接させて近接状態とし、磁性ビーズ６を磁気誘引させて検体１に引き付け、抗原３と抗体４の抗原抗体反応を促進する。磁石１０２は、１分程度の近接状態を経て、制御機構１０４の制御によってプレート２から離間する。その後、懸濁液６ａを除去して検体１をＰＢＳでリンス洗浄する。そして、蛍光顕微鏡を用いてプレート２上の検体１を蛍光観察することにより、蛍光が検出されれば検体１に検出対象の抗原３が存在することが確認でき、その蛍光強度や分布によって、抗原３の量や位置を確認できる。

【0026】

上記方法により、理想的には抗原３の有無等を確認することができる。しかしながら、実際の操作においては、抗原３と結合しなかった磁性ビーズ６が吸着してプレート２の表面に残留していることがあり、蛍光を検出した場合に誤検出されるおそれがある。典型的には、磁性体５が強磁性体である場合に、磁性ビーズ６同士が結合して残留してしまった場合である。このような事態を避けるために、次の工程を行うことが望ましい。それは、反応後に検体１をＰＢＳでリンス洗浄した後、さらにＰＢＳに浸漬させ、磁石１０２を検体１が固定されているプレート２の表面側から近接させて非特異的に吸着した磁性ビーズ６を引き剥がして除去する工程である。

【0027】

磁性ビーズ６の引き剥がしに際しても磁石１０２を用いることにより、むらなく磁性ビーズ６を引き剥がして除去することができる。引き剥がしに用いられる磁石１０２は、制御機構１０４により移動制御されるものとすればよい。もっとも、必ずしも引き付けと引き剥がしとで同一の磁石１０２を用いる必要はなく、それぞれ別の磁石１０２を用いてもよいし、後述する他の実施形態の磁石と組み合わせて用いても良い。

【0028】

以上が基本的な構成の反応促進装置１０１を用いた反応促進方法を含んだ磁気免疫染色法であるが、反応促進装置１０１として、磁石１０２による反応促進の前後の工程を含んで自動化したものを更に説明する。

【0029】

まず、図１に示されるように、プレート２を収容するケース１０を用いる。ケース１０は、左右両端部にそれぞれ入液口１０ａ、排液口１０ｂが設けられた箱形状をしており、上面中央部には懸濁液６ａの注入口１０ｃが穿設されている。注入口１０ｃは、プレート２を内部に載置した際に、検体１が配される所定範囲２ａの上部に位置するようになっている。また、所定範囲２ａの上部は、ケース１０の上面が盛り下がってプレート２の表面に近接するようになっている。これによって、注入口１０ｃから注入された懸濁液６ａが少量で広く検体１に添加されるようになっている。

【0030】

そして、反応促進装置１０１は、ＰＢＳをケース１０内に充填・排出するためのポンプ１１０と、ポンプ１１０とケースの入液口１０ａとを接続する入液経路１１１と、ケースの排液口１０ｂに接続してケース内のＰＢＳ等を排出する排液経路とを備えている。その他に、懸濁液を自動的に注入する注入手段等、反応の自動化のための適宜の手段を備えたものとしてもよい。

【0031】

このような反応促進装置１０１を用いることにより、上記した磁気免疫染色のブロッキングや、ＰＢＳによるリンス洗浄といった工程も含めて自動化できるため、作業効率が向上する。

【0032】

続いて、反応促進装置１０１を使用することにより、むらのない反応促進ができることを確かめるための実験例とその結果について説明する。本実験例は、以下の手順で行われたものである。まず、プレート保持部にスライドガラスをプレート２として保持させ、スライドガラスの上面にスキムミルクで５０倍希釈した磁性ビーズ６を含む懸濁液６ａを約３００μｌ滴下する。その後、磁石１０２の磁極面１０５を、スライドガラスの裏面から１ｍｍほど離間した位置まで近接させ、３０秒静止させる。そして、その状態のスライドガラスを蛍光顕微鏡によって蛍光観察することで、磁性ビーズ６の集積具合を確認する。あわせて、対照実験として、磁石１０２に代えて磁極面が平坦な円柱形状の磁石を用いて同様の操作を行う。

【0033】

本実験例では、第１、第２棒磁石１０２ａ、１０２ｂはいずれも磁極面１０５ａ、１０５ｂが２ｍｍ×２ｍｍの角柱形状で、保持力が約９５５ｋＡ／ｍ、残留磁束密度が約１．３Ｔのネオジム磁石（株式会社相模化学金属製、ＮＦ４０）を用いた。そして、磁石１０２は、図２に図示されたとおりに第１、第２棒磁石１０２ａ、１０２ｂを隣接して配置し、一体としたものとした。また、磁性ビーズ６としては、多摩川精機株式会社製のＦＦビーズ（粒子径２００ｎｍ）を用いた。対照実験の円柱形状の磁石は、磁磁極面が直径２２ｍｍのネオジム磁石とした。

【0034】

図７（Ａ）、図８（Ａ）、図９（Ａ）（以下、「図７〜９（Ａ）」と表現し、（Ｂ）〜（Ｆ）についても同様とする。）は、上記の実験例によってスライドガラスに磁性ビーズ６を集積させた状態を蛍光顕微鏡で撮影した写真データである。図７〜図９（Ａ）は、いずれも同じ写真データを画像処理したものであり、図７（Ａ）はグレースケール、図８（Ａ）はディザリングを施した白黒２色表示、図９（Ａ）は単純白黒２色表示としたものである。図７（Ａ）及び図８（Ａ）では、白い箇所ほど蛍光が強く、したがって多くの磁性ビーズ６が集積していることを示している。また、図９（Ａ）では一定以上の蛍光強度の部分が白く表示されている。対照実験の結果の写真データが、同様に図７〜図９（Ｆ）に表されている。

【0035】

対照実験の結果では、図７〜図９（Ｆ）からも確認できるように、磁石の端部に沿ってリング状に蛍光が強くなっていた。すなわち、磁極面が平坦な円柱磁石を用いた場合には、磁極面の端部に磁性ビーズが偏在していることが確かめられた。一方、第１実施形態に基づく実験例の結果では、図７〜図９（Ａ）からも確認できるように、第１、第２棒磁石単位で格子状に蛍光が分布している。したがって、本実験例では、対照実験とは異なり磁性ビーズ６がリング状に偏在しておらず、磁極面１０５の全域に渡って均一に引き付けられて集積しているといえる。このことは、反応促進装置１によるむらのない反応促進が可能であることを示すものといえる。

【0036】

なお、図７〜図９（Ａ）の格子状の蛍光模様は、黒い円形状の部分が連続しているように見えるが、この黒い円形状の部分は隣接する第１、第２棒磁石１０２ａ、１０２ｂ同士の隣接部分に相当する。すなわち、第１、第２棒磁石１０２ａ、１０２ｂの磁極面１０５ａ、１０５ｂは、水平方向において黒い円形状の部分に囲まれた中心部を中心として位置している。

【0037】

また、揺動機構により磁石１０２を揺動させた場合の効果を確認するために、上記の実験例において、「磁石１０２の磁極面１０５を、スライドガラスの裏面から１ｍｍほど離間した位置まで近接させ、３０秒静止させる」工程を、「磁石１０２の磁極面１０５を、スライドガラスの裏面から１ｍｍほど離間した位置まで左右に２ｍｍのストロークで毎秒１０往復揺動させながら近接させ、３０秒間揺動させる」工程とした実験例を行った。この揺動についての実験例の結果を撮影した写真データが図７〜９（Ｂ）に示されている。揺動させた実験例の結果では、図７〜９（Ｂ）からも確認できるように、２ｍｍのストロークによる揺動であっても、磁極面１０５が近接した全域にわたって蛍光の濃淡がなくなっていた。

【0038】

次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。第２実施形態は、第１実施形態とは磁石の構造が異なることを除き、同様のものとすることができるため、その他の説明は省略する。第２実施形態の磁石２０２には、図３に示されるように、磁極面２０５に一様な凹凸が設けられている。磁石２０２は、複数の棒磁石から構成されており、第１棒磁石２０２ａと、第１棒磁石２０２ａより短尺な第２棒磁石２０２ｂとが連続して交互に隣り合って構成されている。そして、磁石２０２の磁極面２０５が凹凸形状になるように、第２棒磁石２０２ｂは、第１棒磁石２０２ａより所定距離だけ長尺方向中央側に入り込んで第１棒磁石２０２ａに隣接している。

【0039】

このように、磁石２０２の磁極面２０５を凹凸状にすることにより、磁極面２０５の中央部と端部とで磁力が均一に作用することとなって、検体１の染色がプレート２に配された位置の違いによるむらが生じにくくなる。また、揺動機構を設けた場合に、ストロークを第１又は第２棒磁石２０２ａ、２０２ｂの磁極面２０５ａ、２０５ｂと同程度とすればよい点は、第1実施形態と同様である。

【0040】

第２実施形態では、磁極面２０５に凹凸を設けるにあたり、磁石２０２としては長短複数の棒磁石から構成されるものとしたが、必ずしもこれに限られない。同じ長さの棒磁石を複数用いて磁極面２０５に凹凸を設けることとしてもよいし、凹凸は１つの磁石の磁極面２０５を凹凸形状に加工したものとしてもよい。また、凹凸の形状は、所定角度での傾斜を繰り返した鋸歯状のものとしてもよい。むらの少ない反応促進をするという観点からは、凹凸の形状は連続的で規則的な形状であることが好ましい。

【0041】

１つの凹部または凸部の平面視での大きさは、小さいほど印加される磁場が均一になるため、好ましい。例えば、５ｍｍ程度の検体を免疫染色する場合に、２ｍｍ四方の凹部と凸部を連続して繰り返した磁石とすることで、十分に均一な磁場が印加される。もっとも、各凹部、凸部の大きさが大きい場合であっても、凹凸がない従来の磁石を用いた場合に対しては、検体１の配置による影響は低下する。また、凹部の深さは、適宜のものとすることができるが、上記例の場合には、凹部が凸部に対して２ｍｍ程度凹んだものとすることができる。

【0042】

第２実施形態の反応促進装置においても、第１実施形態と同様の方法による実験例を行い、その結果を撮影した写真データが、図７〜９（Ｃ）（揺動なしの場合）、図７〜９（Ｄ）（揺動ありの場合）に表されている。第１棒磁石２０２ａと第２棒磁石２０２ｂは、磁極面２０５側で同極であり、２ｍｍの段差の凹凸を付けて図３に図示されたとおりに連続して隣接して配されたものである点で、本実験例は第１実施形態における実験例の条件と相異している。

【0043】

第２実施形態に基づく本実験例の結果では、図７〜９（Ｃ）からも確認できるように、近接した第１、第２棒磁石２０２ａ、２０２ｂの位置に対応するように蛍光が強い箇所と弱い箇所が互い違いになっていた。したがって、磁性ビーズ６が対照実験（図７〜９（Ｆ））とは異なり磁性ビーズ６がリング状に偏在しておらず、磁極面２０５の全域に渡って均一に引き付けられて集積しているといえる。このことは、反応促進装置１によるむらのない反応促進が可能であることを示すものといえる。また、図７〜９（Ｄ）から確認できるように、揺動機構により磁石２０２を揺動させた場合に、ストロークを小さくしても磁極面２０５が近接した全域にわたって蛍光の濃淡模様がなくなっていたことも第１実施形態の場合と同様である。

【0044】

なお、図７〜図９（Ｃ）では互い違いに白い円形状と黒い円形状とが連続しているが、白い円形状部分は凸部である第１棒磁石２０２ａ、黒い円形状部分は凹部である第２棒磁石２０２ｂが近接していた位置にそれぞれ対応している。

【0045】

本発明の第３の実施の形態について説明する。第３の実施の形態も、磁石３０２の構造が異なることを除き、第１実施形態と同様のものとすることができるため、その他の説明は省略する。本実施形態の磁石３０２は、図４（Ａ）に示すように、磁極面３０５が中央ほどプレート２に近接するとともに、端部ほどプレート２から離間するよう傾斜した放物面状に形成されている。

【0046】

このように、磁極面３０５を中央ほどプレート２に近接する一方で端部ほどプレート２から離間するよう傾斜させることにより、プレート２の所定範囲２ａ内において、中央部と端部とで印加される磁力の差が低減されることとなる。通常の円柱状の磁石の場合には、中央部ほど磁力が弱く、端部ほど磁力が強くなる。これに対し、本実施形態の磁石３０２では、磁極面３０５を、中央部をプレート２に近接させる一方で端部ほどプレート２から離間させることで、磁極面３０５の端部で磁力が強くなってしまうことが無く、むらなく抗原抗体反応を促進することができる。

【0047】

磁極面３０５の放物面状の形状は、プレート２と磁石３０２との距離や磁石３０２の磁力等に基づき、適宜のものとすることができる。例えば、放物面の形状については、磁極面３０５の垂直方向をｚ（ｍｍ）、任意の水平方向をｘ（ｍｍ）としたときに、中央を原点として、ｚ＝−ｋｘ^２を満たす放物面形状とするに際して、検体１を配する所定範囲２ａを直径２０ｍｍの円形状とした場合に、ｋ＝０．０２〜０．０３程度にすると好適である。

【0048】

また、本実施形態では、第１、第２実施形態のような棒磁石単位での濃淡が生じないため、磁石３０２を揺動機構により揺動させる必要がなく、反応促進装置を長寿命化することができる。もっとも、万全を期するために揺動機構を備え、磁石３０２をプレート２に対して相対的に揺動させてもよい。

【0049】

また、第３実施形態の第１変形例として、図４（Ｂ）に示されるように、磁石４０２を複数の棒磁石４０２ａが隣り合って構成したものとしたものであって、磁極面４０５を第３の実施形態の放物面状の形状になるよう、中央の磁石ほどプレート２に近接するよう構成したものとしてもよい。棒磁石４０２ａは、角柱形状であって、磁極面４０５側の磁極はすべてそろっている。また、平面視の形状は図２（Ａ）と同様であり、磁極面４０５は平面視では全体として円形状となっている。もっとも、磁極面４０５は平面視で全体として矩形形状であってもよい。

【0050】

さらに、第３実施形態の第２変形例として、図４（Ｃ）、（Ｄ）に示されるように、磁石５０２を複数の扁平な第１円柱磁石５０２ａが重なって構成したものとしてもよい。この変形例では、複数の第１円柱磁石５０２ａが重なって積層しており、複数の第１円柱磁石５０２ａは平面視で同心円上に配されていて、上側（プレート２側）に配されるものほど直径が短くなっている。また、平面視で最外周の第２円柱磁石５０２ｂは、扁平ではなく軸芯方向に長尺な形状をしている。換言すると、第２円柱磁石５０２ｂの磁極面上に、扁平で上側のものほど小径な第１円柱磁石５０２ａが積み重なって磁石５０２が構成されている。これによって磁石５０２の磁極面５０５が中央ほどプレート２に近接して端部ほどプレート２から離間するよう傾斜するようになっている。なお、第２円柱磁石５０２ｂのような長尺な円柱は必須なものではなく、磁石５０２として、扁平な第１円柱磁石５０２ａのみを積層させて構成させたものとしてもよい。また、各第１円柱磁石５０２ａの厚さは、すべて等しくてもよいし、それぞれ異なったものとして、例えば全体として磁極面５０５が放物面となるようにしてもよい。

【0051】

これら第３実施形態の第１、第２変形例では、磁石４０２、５０２を複数の小磁石（棒磁石４０２ａ、第１円柱磁石５０２ａ）から構成さたものとして、磁石の中央に配された小磁石ほどプレート２に近接する一方、磁石の端部に配された小磁石ほどプレート２から離間して設けられていることとなる。このようにすることで、磁石の磁極面（４０５、５０５）の傾斜を容易に設けることができる。

【0052】

第３実施形態の第２変形例による反応促進装置においても、第１、第２実施形態と同様の方法による実験例を行い、その結果を撮影した写真データが、図７〜９（Ｅ）に表されている。なお、本実験例では、揺動機構による揺動はさせていない。複数の第１円柱磁石５０２ａが、平面視で図４（Ｃ）、正面視で図４（Ｄ）のように配されて、全体として中央ほどプレート２に近接し、端部ほどプレート２から離間するよう傾斜した磁極面５０５を形成している点で本実験例は第１、第２実施形態における実験例の条件と相違している。第１円柱磁石５０２ａは、いずれも厚さ（積層方向）１ｍｍで、プレート２に最も近接する最上部のものの磁極面の直径３ｍｍで、以下直径が４ｍｍずつ増加した第１円柱磁石５０２ａが７つ積層されている。すなわち、第１円柱磁石５０２ａは合計で８つ配されている。そして８つの積層した第１円柱磁石５０２ａの下に、磁極面が直径３５ｍｍで長尺な第２円柱磁石５０２ｂが配されている。したがって磁極面５０５としては、中央が端部に対して約８ｍｍプレート２に近接するよう傾斜している。第１、第２円柱磁石はいずれもネオジム磁石を用いた。

【0053】

実験例の結果、全体としてリング状に蛍光が強くなっているということはなく、全体としてほぼ一様に蛍光が観察された。このことは、図７〜９（Ｅ）からも、確認することができる。したがって、磁性ビーズ６が偏在していないということができる。このことは、本実施の形態による反応促進装置によれば、磁性ビーズ６を磁石５０２の磁極面５０５の全域に渡って均一に引き付けることができることを示しており、その結果として、むらのない反応促進が可能であることを示すものといえる。

【0054】

以上本発明の各実施形態を説明したが、本発明はこれら実施形態や、具体的な数値、反応等に限定されるものではない。本発明の反応促進方法によって促進される特異的な結合は、抗原抗体反応に限られず、例えば、酵素と基質の結合や、ＤＮＡの相補的な結合、たんぱく質間の特異的な結合、核酸とたんぱく質間の特異的な結合、等の種々のものが挙げられる。

【0055】

また、磁力が「均一」であるということは、所定範囲内で完全に磁力が等しいことを意味せず、極端に一部の磁力が強くなってしまうことがなく、同程度に磁性ビーズ６を引き付けるという程度のものである。また、反応促進が「均質」であるということは、所定範囲２ａ内であれば検体１（又は磁性ビーズ６）の配置によらず、同程度の反応促進が可能という程度の意味である。

【0056】

叙述の如く構成された本発明の第１実施形態において、プレート２表面の所定範囲内２ａに配された生体組織の切片である検体１に、検出対象の抗原３に特異的に結合する抗体４と磁性体５とを備えた磁性ビーズ６を添加して、該磁性ビーズ６を磁力によりプレート２上の検体１に引き付けることで、磁性ビーズ６の抗体４と抗原３との特異的な抗原抗体反応を促進させることができる。そして、反応促進装置１０１は磁性ビーズ６をプレート２表面の検体１に引き付けるための磁石１０２と、プレート２の所定範囲２ａと磁石１０２の磁極面１０５とを近接させた近接状態とする制御機構１０４を備えている。また、磁石１０２の磁極面１０５は、プレート２の所定範囲２ａより広くなっており、磁石１０２は、磁極面１０５側の磁極面１０５ａがＮ極の第１棒磁石１０２ａと、磁極面１０５側の磁極面１０５ｂがＳ極の第２棒磁石１０２ｂが複数交互に隣り合って構成されている。このような磁石１０２の構成とすることにより、隣り合う第１棒磁石１０２ａの磁極面１０５ａから第２棒磁石１０２ｂの磁極面１０５ｂへと磁力線のループが完結することとなって、所定範囲２ａ内で印加される磁力が中央部と端部とで均質なものとなり、抗原３と抗体４の抗原抗体反応による結合反応をむらなく促進可能となる。

【0057】

また、第２実施形態においては、磁石２０２が長尺な第１棒磁石２０２ａと、短尺な第２棒磁石２０２ｂとが複数交互に隣り合って構成されていて、磁極面２０５に一様な凹凸が設けられている。これによって、各凹凸に端部が形成されることとなって、磁石２０２の磁極面２０５全体として、中央部と端部とで磁力が均質なものとなるため、所定範囲２ａ内で印加される磁力が中央部と端部とで均質なものとなり、抗原抗体反応をむらなく促進可能となる。

【0058】

そして、第３実施形態においては、磁石３０２の磁極面３０５が中央ほどプレート２に近接して端部ほどプレート２から離間するよう放物面形状に傾斜していて、所定範囲２ａでは、中央部と端部のあいだで磁石３０２によって印加される磁力の差が低減されるようになっている。これによって、近接状態では磁極面３０５の磁力が強い端部がプレート２から離間する一方、磁力が弱い中央部がプレート２に近接することとなって、端部抗原抗体反応をむらなく促進可能となる。

【0059】

さらに、第３実施形態の各変形例では、磁石４０２、５０２を複数の小磁石である棒磁石４０２ａや第１円柱磁石５０２ａで構成して、棒磁石４０２ａや第１円柱磁石５０２ａは、磁極面４０５、５０５の中央に配されたものほどプレート２に近接する一方、端部に配されたものほどプレート２から離間して設けられている。これによって、磁極面４０５、５０５の傾斜を、傾斜面を備えない複数の小磁石の組み合わせによって形成することができるため、磁石の製造が容易となるとともに、単一の磁石の磁極面を傾斜するよう加工する場合と比較して、むらのない反応促進をするために最適な傾斜形状の調整を、小磁石である棒磁石４０２ａ、第１円柱磁石５０２ａの配置や選択等によって調整可能であるため、調整が容易なものとなる。

【産業上の利用可能性】

【0060】

本発明は、磁気免疫染色などの、検出対象への特異的な結合反応を磁気によって促進する反応促進を用いる技術分野に利用可能である。

【符号の説明】

【0061】

１ 検体
２ プレート
２ａ 所定範囲
３ 抗原（検出対象）
４ 抗体（結合部）
５ 磁性体
６ 磁性ビーズ（磁性複合体）
７ 蛍光物質
１０１ 反応促進装置
１０２、２０２、３０２、４０２、５０２ 磁石
１０２ａ、２０２ａ 第１棒磁石
１０２ｂ、２０２ｂ 第２棒磁石
４０２ａ 棒磁石（小磁石）
５０２ａ 第１円柱磁石（小磁石）
１０４ 制御機構
１０５、２０５、３０５、４０５、５０５ 磁極面

【要約】

【課題】
磁気免疫染色法等の磁力を利用した反応促進方法において、検体が固定された位置によって生じる反応促進のむらを低減し、一様に反応を促進する方法と、かかる方法を実現するための反応促進装置を提供する。
【解決手段】
磁性複合体をプレート表面の検体に引き付けるための磁石３０２と、プレート表面に検体が配される所定範囲と磁石３０２の磁極面３０５とを近接させる制御機構と、を備えたものとし、磁石３０２の磁極面３０５は、プレート表面の所定範囲より広くなっており、磁石３０２はプレートに近接する磁極面３０５が、中央ほどプレートに近接して端部ほどプレートから離間するよう傾斜していることで、プレートにおける検体が配される所定範囲では、中央部と端部のあいだで磁石３０２によって印加される磁力の差が低減されるよう構成した。
【選択図】図４

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】