特許 6373486 ゲル粒子測定方法及びその装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6373486

(24)【登録日】2018年7月27日

(45)【発行日】2018年8月15日

(54)【発明の名称】ゲル粒子測定方法及びその装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/49 20060101AFI20180806BHJP

   G01N 21/82 20060101ALI20180806BHJP

【ＦＩ】

   G01N21/49 Z

   G01N21/82

【請求項の数】14

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2017-507899(P2017-507899)

(86)(22)【出願日】2016年12月26日

(86)【国際出願番号】JP2016088741

(87)【国際公開番号】WO2017115754

(87)【国際公開日】20170706

【審査請求日】2017年3月13日

(31)【優先権主張番号】特願2015-256564(P2015-256564)

(32)【優先日】2015年12月28日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】511208737

【氏名又は名称】株式会社プロジェクトＫＢＦ

(74)【代理人】

【識別番号】100085040

【弁理士】

【氏名又は名称】小泉 雅裕

(72)【発明者】

【氏名】小幡 徹

(72)【発明者】

【氏名】右近 寿一郎

【審査官】 塚本 丈二

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−２５７１５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−１７０３２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５１０１６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−１２１４５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１７８２０６（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ １５／０２

Ｇ０１Ｎ １５／１４

Ｇ０１Ｎ ２１／４７−２１／５１

Ｇ０１Ｎ ２１／８２

Ｇ０１Ｎ ３３／５７９

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゲル化反応によって試料中の目的物質を粒子化したゲル粒子を測定するに際し、
有底の断面円形の筒状容器の周壁の少なくとも一部に光が入射される入射部を有し、測定対象である目的物質が含まれる試料及び前記目的物質のゲル化を生ずる試薬が含まれる溶液を収容する試料セルと、
前記試料セル内の前記試料及び前記試薬が含まれる混合溶液全体がゲル化するのを抑制するように前記混合溶液を連続的に撹拌する撹拌手段と、
前記試料セルの入射部の外部に設けられ、前記試料セル内の前記混合溶液に対してコヒーレントな光を照射させる光源と、
前記試料セルの入射部の外部で前記光源と同じ側に設けられ、前記試料セル内の前記混合溶液中で散乱した光のうち前記光源側の方向に戻る後方散乱光成分を検出する後方散乱光検出手段と、を用い、
前記試料セル内に前記混合溶液を収容した状態で前記撹拌手段にて前記混合溶液を連続的に撹拌する撹拌工程と、
前記撹拌工程を実施中に、前記試料セルの中心軸と前記光源からの光軸とを直交位置から傾けて配置し、かつ、前記光源からの光軸を、前記試料セルの中心軸から変位した位置を過ぎるように配置し、前記混合溶液に対して前記光源からの照射光を入射させ、当該光の照射光路の一部を含む前記後方散乱光検出手段に向かう光の検出光路に対して前記試料セルの表面にて反射される光の反射光路を異ならせ、前記混合溶液中で散乱した光成分を前記検出光路を経由して前記後方散乱光検出手段で捕捉する光分離工程と、
前記光分離工程を経て得られる前記後方散乱光検出手段の検出出力に基づいて散乱光の変動成分を計測し、前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相変化する時点につながる前記混合溶液内のゲル粒子の生成開始時点が少なくとも含まれるゲル粒子の生成状態を判別する計測工程と、
を備えることを特徴とするゲル粒子測定方法。

【請求項2】

請求項１に記載のゲル粒子測定方法において、
前記光分離工程は、前記光源からの照射光が前記試料セル内壁を通過した近接位置を焦点位置として収束することを特徴とするゲル粒子測定方法。

【請求項3】

ゲル化反応によって試料中の目的物質を粒子化したゲル粒子を測定するゲル粒子測定装置であって、
有底の断面円形の筒状容器の周壁の少なくとも一部に光が入射される入射部を有し、測定対象である目的物質が含まれる試料及び前記目的物質のゲル化を生ずる試薬が含まれる溶液を収容する試料セルと、
前記試料セル内の前記試料及び前記試薬が含まれる混合溶液全体がゲル化するのを抑制するように前記混合溶液を連続的に撹拌する撹拌手段と、
前記試料セルの入射部の外部に設けられ、前記撹拌手段にて前記混合溶液を撹拌中に、前記試料セル内の前記混合溶液に対してコヒーレントな光を照射させる光源と、
前記試料セルの入射部の外部で前記入射光源と同じ側に設けられ、前記試料セル内の前記混合溶液中で散乱した光のうち前記光源側の方向に戻る後方散乱光成分を検出する後方散乱光検出手段と、
前記試料セルの入射部に向かって前記光源からの照射光を入射するときに、前記試料セルの中心軸と前記光源からの光軸とを直交位置から傾けて配置し、かつ、前記光源からの光軸を、前記試料セルの中心軸から変位した位置を過ぎるように配置し、前記試料セル内の前記混合溶液中で散乱した光のうち前記光の照射光路の一部を含む前記後方散乱光検出手段に向かう光の検出光路と、前記試料セルの表面にて反射される光の反射光路とを異ならせるように前記試料セルの入射部表面を調整する光路調整手段と、
前記後方散乱光検出手段の検出出力に基づいて散乱光の変動成分を計測し、前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相変化する時点につながる前記混合溶液内のゲル粒子の生成開始時点が少なくとも含まれるゲル粒子の生成状態を判別する計測手段と、
を備えたことを特徴とするゲル粒子測定装置。

【請求項4】

請求項３に記載のゲル粒子測定装置において、
前記光路調整手段は、前記光源からの照射光が前記試料セル内壁を通過した近接位置を焦点位置として収束することを特徴とするゲル粒子測定装置。

【請求項5】

請求項３に記載のゲル粒子測定装置において、
前記光路調整手段は前記試料セルの入射部には前記光源からの照射光のうち前記入射部表面にて反射される反射光が前記後方散乱光検出手段に向かう方向とは異なる方向に向かうように予め成形された反射面を有することを特徴とするゲル粒子測定装置。

【請求項6】

請求項３に記載のゲル粒子測定装置において、
前記光源、前記後方散乱光検出手段及び前記光路調整手段を含む光学系は、前記光源から前記試料セルの入射部に向かって照射される光を透過し、かつ、前記混合溶液中で散乱した光のうち前記後方散乱光検出手段に向かう光の検出光路を前記光源からの照射光路に対し途中で分岐させる光路分岐部材を備えていることを特徴とするゲル粒子測定装置。

【請求項7】

請求項３に記載のゲル粒子測定装置において、
前記光源、前記後方散乱光検出手段及び前記光路調整手段を含む光学系は、前記光源からの照射光が前記試料セル内壁を通過した近接位置を焦点位置として収束する入射用の結像部材を有し、前記後方散乱光検出手段に向かう光が当該後方散乱光検出手段の検出面を共役焦点位置として収束する検出用の結像部材を有することを特徴とするゲル粒子測定装置。

【請求項8】

請求項３に記載のゲル粒子測定装置において、
前記光源、前記後方散乱光検出手段及び前記光路調整手段を含む光学系は、前記光源からの照射光が前記試料セル内壁を通過した近接位置を焦点位置として収束する入射用の結像部材を有し、前記後方散乱光検出手段に向かう検出光路の途中に絞り部材が配置され、前記後方散乱光検出手段に向かう光が絞り部材位置を共役焦点位置として収束する第１の検出用の結像部材を有すると共に、前記絞り部材を通過した光が前記後方散乱光検出手段の検出面を共役焦点位置として収束する第２の検出用の結像部材を有することを特徴とするゲル粒子測定装置。

【請求項9】

請求項３に記載のゲル粒子測定装置において、
前記光源、前記後方散乱光検出手段及び前記光路調整手段を含む光学系は、前記光源から前記試料セルに向かう光束を絞り部材を介して絞り込み、前記光束を、前記混合溶液中で散乱した光のうち前記後方散乱光検出手段に向かう光束よりも狭く設定することを特徴とするゲル粒子測定装置。

【請求項10】

請求項３に記載のゲル粒子測定装置において、
前記試料セルは恒温槽内に設けられていることを特徴とするゲル粒子測定装置。

【請求項11】

請求項３に記載のゲル粒子測定装置において、
試料セルは、それ自体又はその周囲に、前記光源からの照射光のうち前記混合溶液中で前記後方散乱光検出手段に向かう後方散乱光成分以外の透過又は前記試料セル内壁での散乱で生じる迷光成分が除去させられる迷光除去手段を備えていることを特徴とするゲル粒子測定装置。

【請求項12】

請求項３に記載のゲル粒子測定装置において、
前記計測手段による計測結果が表示される表示手段を備えていることを特徴とするゲル粒子測定装置。

【請求項13】

請求項３に記載のゲル粒子測定装置において、
前記混合溶液内で散乱した光のうち前記光源側の方向に戻る後方散乱光成分を検出する後方散乱光検出手段である第１の散乱光検出手段と、
前記混合溶液内で散乱した光のうち前記光源側の方向に戻る後方散乱光成分以外の散乱光成分を検出する第２の散乱光検出手段と、を備え、
前記計測手段は、前記第１の散乱光検出手段の検出出力の変動成分の計測結果に基づいて前記混合溶液内のゲル粒子の生成開始時点が含まれるゲル粒子の生成状態を判別し、
第１の散乱光検出手段及び第２の散乱光検出手段の検出出力又は第２の散乱光検出手段の検出出力の変動成分の計測結果に基づいて前記混合溶液内のゲル粒子の生成状態以外のゲル粒子の生成状態を判別することを特徴とするゲル粒子測定装置。

【請求項14】

請求項３に記載のゲル粒子測定装置において、
測定対象である目的物質がエンドトキシンであり、これをゲル化する試薬がカブトガニ血球由来又はこれと同等な生物血球由来の試薬であることを特徴とするゲル粒子測定装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ゲル化反応によって測定対象の試料中のエンドトキシンやβ−D−グルカンなどの目的物質を凝集する試薬を用いて粒子化して測定するゲル粒子測定方法及びその装置に係り、特に、ゲル粒子が出現し始める時点を高感度に測定することを企図したゲル粒子測定方法及びその装置に関する。

【背景技術】

【0002】

エンドトキシン（内毒素）と呼ばれるものは、主としてグラム染色に染まらない（グラム陰性）細菌類の菌体の膜成分の一部で、その成分はリポポリサッカライドと呼ばれる脂質多糖類、具体的には、リピドＡ（Lipid Ａ）と呼ばれる脂質と多糖鎖が２−ケト−３−デオキシオクトン酸（ＫＤＯ）を介して結合したリポ多糖（ＬＰＳ）であるが、そこに含まれるリピドＡ（Lipid Ａ）と呼ばれる脂質構造部分が、感染により人の体内に入ったときに細胞の受容体と結合して炎症を引き起こし、多くの場合様々な重篤な臨床症状を引き起こす。このように、エンドトキシンは、人において敗血症や菌血症という致死率の非常に高い臨床症状の原因となる物質であるため、体内に入ったエンドトキシンの推定をすることは臨床的に要求の高いことである。
また、医薬品（注射剤等）や医療用具（血管カテーテル等）、透析治療に用いる人工透析液はエンドトキシンによる汚染がないこと（パイロジェンフリー）が重要であり、細菌を用いて調製した医薬品（組み換えタンパク質、遺伝子治療に用いるＤＮＡ等）や食品添加物・化粧品などではエンドトキシンを適正に除去または制御することが不可欠になっている。

【0003】

このエンドトキシンの除去確認、あるいは救急医学における計測は、測定試料数の多さばかりでなく、救命治療という目的にかなった迅速性が求められている。
敗血症などの治療のため、エンドトキシン値を計ろうとする研究は古くよりなされ、カブトガニ（Limulus）のアメーバ状血球成分に含まれる因子群が、エンドトキシンに特異的に反応し、凝集塊となって傷口をふさぐという現象が発見されてから、このリムルスの水解物（Limulus Amebocyte Lysate；ＬＡＬ試薬又はリムルス試薬）を用いてエンドトキシンの定量をする試みがなされている。

【0004】

最初にリムルス試薬を使った測定法は、単に試料となる患者の血漿を混合して静置し、一定時間後に転倒して混合溶液のゲル化の有無を溶液が固まることで確認し、ゲル化を起こすための最大希釈率でエンドトキシン量を推定する所謂ゲル化法と呼ばれる半定量の測定法であった。
その後、ゲル化反応の過程における反応溶液の濁度増加に着目し、光学的な計測方法により、静置した混合溶液のゲル化反応に伴う濁度変化をもってエンドトキシン濃度を定量測定する比濁時間分析法が知られている。
また、リムルス試薬による反応過程の最終段階でコアギュロゲン（Coagulogen）がコアグリン（Coagulin）に転換するゲル化反応を合成基質に置き換え、その基質に発色色素を結合させた発色合成基質法も既に知られている。これは、例えば凝固過程における凝固前駆物質（コアギュロゲン：Coagulogen）の代わりに発色合成基質（Boc-Leu-Gly-Arg-p-ニトロアリニド）を加えることにより、その加水分解でp-ニトロアニリンが遊離され、その黄色発色の比色によりエンドトキシン濃度を測定するものである。尚、p-ニトロアニリン以外に蛍光色素などを用いた手法も知られている。

【0005】

ここで、従来におけるゲル化反応測定装置としては、例えば特許文献１〜３に示すものが挙げられる。
特許文献１は、比濁時間分析法を用いたゲル化反応測定装置に関するものであり、検体（試料）とリムルス試薬とを混合させた混合液の透過光強度の経時変化を測定し、所定時間における変化量から検体のエンドトキシン濃度を測定するものである。
また、特許文献２は、ゲル化反応により測定されるエンドトキシン等の物質の濃度を測定するゲル化測定装置に関するものであり、試料セル中で生成する個々のゲル粒子のレーザ光束による散乱光を受光する受光素子と、前記受光素子の散乱光検出出力に基づき、ゲル粒子の径と数を時系列的に計測する計測手段とを有するものである。
更に、特許文献３は、試料及び試薬が含まれる溶液を収容する試料セルと、混合溶液を撹拌する撹拌手段と、混合溶液に対してコヒーレントな光を照射させるコヒーレント光源と、試料セル内の混合溶液中を透過した光を検出する透過光検出手段と、透過光検出手段の検出出力に基づいて透過光の変動成分を計測する透過光変動計測手段と、透過光変動計測手段の計測結果に基づいて前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相転移するタイミングにつながる混合溶液内のゲル粒子の生成状態を少なくとも判別するゲル粒子生成判別手段と、を備えたゲル粒子測定装置と、を備えたものである。
特許文献１〜３はいずれも、レーザ光源からの照射光のうち試料セル内で散乱した光のうち、レーザ光源の設置された側とは異なる側、例えばレーザ光源とは反対側の前方に向かって透過した前方散乱光、あるいは、レーザ光源に対して側方に向かって散乱した側方散乱光を検出し、この検出結果に基づいて測定対象であるエンドトキシン濃度を測定しようとするものである。

【0006】

更に、ゲル化反応を利用した測定技術は、前述したエンドトキシンのみならず、β−D−グルカン（β−D−glucan）などの測定にも利用される。
β−D−グルカン（β−D−glucan）は真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。このβ−D−グルカンを測定することにより、カンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、まれな真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングなどで有効である。
このβ−D−グルカンの測定においても、カブトガニの血球抽出成分がβ−D−グルカンによってゲル化することが利用されており、上述したゲル化法や比濁時間分析法、発色合成基質法によって測定される。
エンドトキシンやβ−D−グルカンの測定手法には共通点があり、例えば略同様の測定ハードウェアを用い、カブトガニの血球抽出成分中からβ−D−グルカンが特異的に反応するFactor G成分を除くことによりエンドトキシンに選択的なゲル化反応や発色反応が測定でき、また、試料中のエンドトキシンに前処理により不活性化することにより、β−D−グルカンに選択的なゲル化反応や発色反応を測定することが可能である。

【0007】

【特許文献1】特開２００４−９３５３６号公報（発明の実施の形態，図３）

【特許文献2】国際公開ＷＯ２００８／０３８３２９号（発明を実施するための最良の形態，図１）

【特許文献3】国際公開ＷＯ２００９／１１６６３３号（発明を実施するための最良の形態，図１）

【特許文献4】特開２０１１−２５７１５６号公報（発明を実施するための最良の形態，図１）

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、従来のゲル化法、比濁時間分析法及び発色合成基質法にあっては、次のような不具合がある。
ゲル化法及び比濁時間分析法は、いずれもゲルが生成するのに低濃度では約９０分以上という長時間を要する。すなわち、反応溶液のゲル化時間は、測定対象の試料中の目的物質の濃度に比例するが、ゲル化法及び比濁時間分析法は共に感度の点から正確なゲル化開始時間などが検出できないため、ある程度のゲル化が進行するまでの時間から反応量を算出してゲル化時間の目安としている。
例えば比濁時間分析法を例に挙げると、比濁時間分析法は、試薬の調製により変化の始まる最初の濃度レベルの濁度と変化の行き着く濃度レベルの濁度については分かるが、夫々の変化の始まる時間や終わりの時間が分かり難く、最初と最後のレベルの間の一定レベルの変化到達（濁度の増加、通常最大反応量の８％濁度の進行を検出）を測ることで、ゲル化全体の変化観察に換えるということで定量法として確立されたものである。しかし、低濃度のエンドトキシンになると、系全体のゲル化が遷延し、それにつれて観測する濁度変化も遅くなることから測り難くなり、その分、感度が必然的に鈍くなってしまう。
従って、ゲル化法及び比濁時間分析法は共に救急を要する場合や多数の検体を測定するのに適した方法とは言い難い。更に、比濁時間分析法ではエンドトキシンとは無関係の非特異的濁りが生ずることがあり、測定精度に欠ける懸念がある。また、ゲル化法の測定限界濃度は３ｐｇ／ｍｌ、比濁時間分析法の測定限界濃度は１ｐｇ／ｍｌ程度である。
一方、発色合成基質法はゲル化法及び比濁時間分析法に比べて測定時間が約３０分程度と短時間であるが、臨床試料など天然物における測定では、混在する非特異的蛋白分解酵素による偽陽性反応が生ずる場合があり、特異度の高い測定を行うことが難しく、また、測定準備が煩雑であり、測定限界濃度も３ｐｇ／ｍｌと比濁時間分析法に劣る。

【0009】

また、例えば特許文献１に記載のゲル化反応測定装置は、試薬がエンドトキシンと反応して凝固する過程を観察する方法を採用するものであり、その凝固速度がエンドトキシン濃度に依存的であるということから作られた測定原理に基づき、ゲル化のために反応溶液を静止条件下で行うことが必要かつ十分な条件である。
しかしながら、可溶性蛋白の酵素混合溶液であるカブトガニ血球成分由来の試薬が、エンドトキシンと反応して不溶性蛋白質コアグリンを生成し、ゲル化するという反応は、溶液の均一性が反応進行と共に減少し、生化学的酵素反応系として一定条件を維持しているとは考え難く、比濁時間分析法の感度の悪さ、計測時間の長時間化、測定値の不安定さなどの要因になっていると推測される。
そのため、例えば特許文献３に示すように、反応溶液を均一にするように、当該反応溶液を連続的に撹拌する手法が採用された。この結果、反応は均一になり、かつ、迅速となった。一方、反応溶液全体のゲル化は阻止され、代わりに反応溶液中に生成するコアグリンが一定濃度に達すると、微小なゲル粒子として凝集することが見出された。幸い、この微小なゲル粒子が生成されるまでの時間もエンドトキシン濃度に依存的であることが判明し、レーザ光のようなコヒーレント光を照射してゲル粒子の散乱光を検出するまでの時間を計測することで、エンドトキシンを定量する手法（ＥＳＰ法：Endotoxin Scattering Photometry 法（登録商標））が既に提供されている。
ここで、両者の根本的な違いは、例えば特許文献１に示す比濁時間分析法がゲル化の進行を計測することを企図するのに対し、ＥＳＰ法はゲル化開始までの時間を計測することを企図するものである。つまり、ＥＳＰ法の測定終了点が比濁時間分析法の測定開始に相当するとも言える。

【0010】

また、粒子に対する散乱光は全方向に対して発生することから、ＥＳＰ法はそのどの散乱光を捉えてもよいが、大きく分けて前方散乱・側方散乱・後方散乱（試料セルへの光入射方向に対して０°、９０°、１８０°の方向の散乱）とすると、粒子のサイズと散乱光発生の方向を考えた場合、粒子が微小サイズでは、弱いが全方向に放射されるのに対し、粒子が大きくなるつれ、前方散乱が強くなっていく傾向が見られる。よって、検出することに関しては強い前方散乱が有利かも知れないが、粒子発生初期を早期に捉えるという観点からすれば、微小粒子で全方向に発生する微弱な散乱光を検出することが望ましい。
この場合、前方散乱や側方散乱は、反応溶液の散乱光吸収による信号の減衰や、反応溶液中の他の粒子に対する二次的な散乱光（多重散乱）の発生など、微小粒子発生初期の微弱な信号を捉えるには不利であり、その点、反応容器の光入射直下で捉えられ、反応溶液への減衰吸収が少ない後方散乱は有利である。
このような観点に基づいて、ゲル粒子の発生初期を早期に捉える方式として後方散乱光を検出する方式が既に特許文献４に開示されている。
この特許文献４は、試料及び試薬が含まれる溶液を収容する試料セルと、混合溶液を撹拌する撹拌手段と、混合溶液に対してコヒーレントな光を照射させる入射光源と、試料セルの外部で入射光源と同じ側に設けられ、試料セル内の混合溶液中で散乱した光のうち入射光源側の方向に戻る後方散乱光成分を検出する後方散乱光検出手段と、後方散乱光検出手段の検出出力に基づいて後方散乱光の変動成分を計測する散乱光変動計測手段と、散乱光変動計測手段の計測結果に基づいて混合溶液がゾル相からゲル相に相変化するタイミングにつながるゲル粒子の生成開始時点が少なくとも含まれるゲル粒子の生成状態を判別するゲル粒子生成判別手段と、を備えたものである。
ここでいう後方散乱光検出手段は、試料セル内の混合溶液中で散乱した光のうち入射光源側の方向に戻る後方散乱光成分を検出するものであればよいが、試料セルの近傍に後方散乱光検出手段を配置する態様では、入射光源からの光が試料セルに照射される領域の周囲に検出面を設けることで、試料セル内の混合溶液中で散乱した光のうち真の後方散乱方向の周辺にて散乱光成分を検出する方式が代表的である。このような検出方式では、試料セルの表面の法線に沿って光を照射すると、照射光の一部が試料セルの表面で反射されたとしても、当該反射光は真の後方散乱方向に向かうため、後方散乱光検出手段に試料セル表面からの反射光成分が採光されることは回避される。

【0011】

その後、本発明者らは、後方散乱光を検出する方式を更に検討し、試料セル内の混合溶液中で散乱した光のうち真の後方散乱方向に向かう散乱光成分を正確に検出することができれば、混合溶液中での散乱光減衰を最小限に抑えることができ、ゲル粒子の生成開始時点をより早期に且つ高感度に検出することが可能になる点で望ましいという結論に到達した。
しかしながら、真の後方散乱方向に向かう散乱光成分を検出するには、試料セル表面からの反射光成分を分離した状態で前述した散乱光成分を検出することが必要不可欠であり、どのようにこれを解決すべきかについて逐次検討が進められていた。

【0012】

本発明が解決しようとする技術的課題は、ゲル化反応により試料中の目的物質を測定するに当たり、ゲル粒子の生成開始時点に光照射による散乱光の検出を行い、その現象の発生する溶媒中で散乱光減衰を抑えて早期に且つ正確にゲル粒子の生成開始時点を計測することにある。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明の第１の技術的特徴は、ゲル化反応によって試料中の目的物質を粒子化したゲル粒子を測定するに際し、有底の断面円形の筒状容器の周壁の少なくとも一部に光が入射される入射部を有し、測定対象である目的物質が含まれる試料及び前記目的物質のゲル化を生ずる試薬が含まれる溶液を収容する試料セルと、前記試料セル内の前記試料及び前記試薬が含まれる混合溶液全体がゲル化するのを抑制するように前記混合溶液を連続的に撹拌する撹拌手段と、前記試料セルの入射部の外部に設けられ、前記試料セル内の前記混合溶液に対してコヒーレントな光を照射させる光源と、前記試料セルの入射部の外部で前記光源と同じ側に設けられ、前記試料セル内の前記混合溶液中で散乱した光のうち前記光源側の方向に戻る後方散乱光成分を検出する後方散乱光検出手段と、を用い、前記試料セル内に前記混合溶液を収容した状態で前記撹拌手段にて前記混合溶液を連続的に撹拌する撹拌工程と、前記撹拌工程を実施中に、前記試料セルの中心軸と前記光源からの光軸とを直交位置から傾けて配置し、かつ、前記光源からの光軸を、前記試料セルの中心軸から変位した位置を過ぎるように配置し、前記混合溶液に対して前記光源からの照射光を入射させ、当該光の照射光路の一部を含む前記後方散乱光検出手段に向かう光の検出光路に対して前記試料セルの表面にて反射される光の反射光路を異ならせ、前記混合溶液中で散乱した光成分を前記検出光路を経由して前記後方散乱光検出手段で捕捉する光分離工程と、前記光分離工程を経て得られる前記後方散乱光検出手段の検出出力に基づいて散乱光の変動成分を計測し、前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相変化する時点につながる前記混合溶液内のゲル粒子の生成開始時点が少なくとも含まれるゲル粒子の生成状態を判別する計測工程と、を備えることを特徴とするゲル粒子測定方法である。
本発明の第２の技術的特徴は、第１の技術的特徴を備えたゲル粒子測定方法において、前記光分離工程は、前記光源からの照射光が前記試料セル内壁を通過した近接位置を焦点位置として収束することを特徴とするゲル粒子測定方法である。

【0014】

本発明の第３の技術的特徴は、ゲル化反応によって試料中の目的物質を粒子化したゲル粒子を測定するゲル粒子測定装置であって、有底の断面円形の筒状容器の周壁の少なくとも一部に光が入射される入射部を有し、測定対象である目的物質が含まれる試料及び前記目的物質のゲル化を生ずる試薬が含まれる溶液を収容する試料セルと、前記試料セル内の前記試料及び前記試薬が含まれる混合溶液全体がゲル化するのを抑制するように前記混合溶液を連続的に撹拌する撹拌手段と、前記試料セルの入射部の外部に設けられ、前記撹拌手段にて前記混合溶液を撹拌中に、前記試料セル内の前記混合溶液に対してコヒーレントな光を照射させる光源と、前記試料セルの入射部の外部で前記入射光源と同じ側に設けられ、前記試料セル内の前記混合溶液中で散乱した光のうち前記光源側の方向に戻る後方散乱光成分を検出する後方散乱光検出手段と、前記試料セルの入射部に向かって前記光源からの照射光を入射するときに、前記試料セルの中心軸と前記光源からの光軸とを直交位置から傾けて配置し、かつ、前記光源からの光軸を、前記試料セルの中心軸から変位した位置を過ぎるように配置し、前記試料セル内の前記混合溶液中で散乱した光のうち前記光の照射光路の一部を含む前記後方散乱光検出手段に向かう光の検出光路と、前記試料セルの表面にて反射される光の反射光路とを異ならせるように前記試料セルの入射部表面を調整する光路調整手段と、前記後方散乱光検出手段の検出出力に基づいて散乱光の変動成分を計測し、前記混合溶液がゾル相からゲル相へ相変化する時点につながる前記混合溶液内のゲル粒子の生成開始時点が少なくとも含まれるゲル粒子の生成状態を判別する計測手段と、を備えたことを特徴とするゲル粒子測定装置である。

【0015】

本発明の第４の技術的特徴は、第３の技術的特徴を備えたゲル粒子測定装置において、前記光路調整手段は、前記光源からの照射光が前記試料セル内壁を通過した近接位置を焦点位置として収束することを特徴とするゲル粒子測定装置である。
本発明の第５の技術的特徴は、第３の技術的特徴を備えたゲル粒子測定装置において、前記光路調整手段は前記試料セルの入射部には前記光源からの照射光のうち前記入射部表面にて反射される反射光が前記後方散乱光検出手段に向かう方向とは異なる方向に向かうように予め成形された反射面を有することを特徴とするゲル粒子測定装置である。
本発明の第６の技術的特徴は、第３の技術的特徴を備えたゲル粒子測定装置において、前記光源、前記後方散乱光検出手段及び前記光路調整手段を含む光学系は、前記光源から前記試料セルの入射部に向かって照射される光を透過し、かつ、前記混合溶液中で散乱した光のうち前記後方散乱光検出手段に向かう光の検出光路を前記光源からの照射光路に対し途中で分岐させる光路分岐部材を備えていることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
本発明の第７の技術的特徴は、第３の技術的特徴を備えたゲル粒子測定装置において、前記光源、前記後方散乱光検出手段及び前記光路調整手段を含む光学系は、前記光源からの照射光が前記試料セル内壁を通過した近接位置を焦点位置として収束する入射用の結像部材を有し、前記後方散乱光検出手段に向かう光が当該後方散乱光検出手段の検出面を共役焦点位置として収束する検出用の結像部材を有することを特徴とするゲル粒子測定装置である。
本発明の第８の技術的特徴は、第３の技術的特徴を備えたゲル粒子測定装置において、前記光源、前記後方散乱光検出手段及び前記光路調整手段を含む光学系は、前記光源からの照射光が前記試料セル内壁を通過した近接位置を焦点位置として収束する入射用の結像部材を有し、前記後方散乱光検出手段に向かう検出光路の途中に絞り部材が配置され、前記後方散乱光検出手段に向かう光が絞り部材位置を共役焦点位置として収束する第１の検出用の結像部材を有すると共に、前記絞り部材を通過した光が前記後方散乱光検出手段の検出面を共役焦点位置として収束する第２の検出用の結像部材を有することを特徴とするゲル粒子測定装置である。

【0016】

本発明の第９の技術的特徴は、第３の技術的特徴を備えたゲル粒子測定装置において、前記光源、前記後方散乱光検出手段及び前記光路調整手段を含む光学系は、前記光源から前記試料セルに向かう光束を絞り部材を介して絞り込み、前記光束を、前記混合溶液中で散乱した光のうち前記後方散乱光検出手段に向かう光束よりも狭く設定することを特徴とするゲル粒子測定装置である。
本発明の第１０の技術的特徴は、第３の技術的特徴を備えたゲル粒子測定装置において、前記試料セルは恒温槽内に設けられていることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
本発明の第１１の技術的特徴は、第３の技術的特徴を備えたゲル粒子測定装置において、試料セルは、それ自体又はその周囲に、前記光源からの照射光のうち前記混合溶液中で前記後方散乱光検出手段に向かう後方散乱光成分以外の透過又は前記試料セル内壁での散乱で生じる迷光成分が除去させられる迷光除去手段を備えていることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
本発明の第１２の技術的特徴は、第３の技術的特徴を備えたゲル粒子測定装置において、前記計測手段による計測結果が表示される表示手段を備えていることを特徴とするゲル粒子測定装置である。
本発明の第１３の技術的特徴は、第３の技術的特徴を備えたゲル粒子測定装置において、前記混合溶液内で散乱した光のうち前記光源側の方向に戻る後方散乱光成分を検出する後方散乱光検出手段である第１の散乱光検出手段と、前記混合溶液内で散乱した光のうち前記光源側の方向に戻る後方散乱光成分以外の散乱光成分を検出する第２の散乱光検出手段と、を備え、前記計測手段は、前記第１の散乱光検出手段の検出出力の変動成分の計測結果に基づいて前記混合溶液内のゲル粒子の生成開始時点が含まれるゲル粒子の生成状態を判別し、第１の散乱光検出手段及び第２の散乱光検出手段の検出出力又は第２の散乱光検出手段の検出出力の変動成分の計測結果に基づいて前記混合溶液内のゲル粒子の生成状態以外のゲル粒子の生成状態を判別することを特徴とするゲル粒子測定装置である。
本発明の第１４の技術的特徴は、第３の技術的特徴を備えたゲル粒子測定装置において、測定対象である目的物質がエンドトキシンであり、これをゲル化する試薬がカブトガニ血球由来又はこれと同等な生物血球由来の試薬であることを特徴とするゲル粒子測定装置である。

【発明の効果】

【0017】

本発明の第１の技術的特徴によれば、ゲル化反応により試料中の目的物質を測定するに当たり、ゲル粒子の生成開始時点に光照射による真の後方散乱方向に向かう散乱光の検出を行い、その現象の発生する溶媒中で散乱光減衰を抑えて早期に且つ正確にゲル粒子の生成開始時点を計測することができるほか、試料セルとして有底の断面円形の筒状容器をそのまま利用し、後方散乱光検出手段の検出対象から試料セルの表面からの反射光を除去することができる。
本発明の第２の技術的特徴によれば、ゲル化反応により試料中の目的物質を測定するに当たり、入射焦点位置若しくはその近傍で生成されたゲル粒子からの後方散乱光成分を、後方散乱光検出手段の検出面にピントが合った状態で結像することができる。
本発明の第３の技術的特徴によれば、ゲル化反応により試料中の目的物質を測定するに当たり、ゲル粒子の生成開始時点に光照射による真の後方散乱方向に向かう散乱光の検出を行い、その現象の発生する溶媒中で散乱光減衰を抑えて早期に且つ正確にゲル粒子の生成開始時点を計測することができるほか、試料セルとして有底の断面円形の筒状容器をそのまま利用し、後方散乱光検出手段の検出対象から試料セルの表面からの反射光を除去することが可能なゲル粒子測定方法を容易に具現化することができる。
本発明の第４の技術的特徴によれば、ゲル化反応により試料中の目的物質を測定するに当たり、入射焦点位置若しくはその近傍で生成されたゲル粒子からの後方散乱光成分を、後方散乱光検出手段の検出面にピントが合った状態で結像することが可能なゲル粒子測定方法を容易に具現化することができる。
本発明の第５の技術的特徴によれば、試料セルの入射部表面を工夫することで、後方散乱光検出手段の検出対象から試料セルの表面からの反射光を除去することができる。
本発明の第６の技術的特徴によれば、試料セル内の混合溶液中で散乱した光のうち後方散乱光検出手段に向かうものを、光源の存在に邪魔されることなく、後方散乱光検出手段に導くことができる。
本発明の第７の技術的特徴によれば、試料セルの入射部表面位置を焦点位置として収束する光学系に比べて、試料セルの内壁近傍にて生成されたゲル粒子からの散乱光情報を後方散乱光検出手段にて正確に検出することができる。
本発明の第８の技術的特徴によれば、試料セルの入射部表面位置を焦点位置として収束する光学系に比べて、試料セルの内壁近傍にて生成されたゲル粒子からの散乱光情報のみを後方散乱光検出手段にて正確に検出することができる。
本発明の第９の技術的特徴によれば、試料セル内の混合溶液中で散乱した光のうち後方散乱光検出手段に向かう光成分を、光源からの入射光に影響させることなく、後方散乱光検出手段に導くことができる。
本発明の第１０の技術的特徴によれば、恒温環境下でゲル化反応を安定的に進行させることができる。
本発明の第１１の技術的特徴によれば、後方散乱光検出手段にて後方散乱光成分以外の透過又は試料セル内壁での散乱で生じる迷光成分が誤検出される事態を有効に回避することができる。
本発明の第１２の技術的特徴によれば、計測手段の計測結果を目視することができる。
本発明の第１３の技術的特徴によれば、第２の散乱光検出手段を用いない態様に比べて、後方散乱光の変動成分に加えて、後方散乱光以外の（前方または側方）散乱光の変動成分をも計測可能であることから、混合溶液内のゲル粒子の生成開始時点に加えて他のゲル粒子の生成状態情報をより正確に判別することができる。
本発明の第１４の技術的特徴によれば、エンドトキシンの定量に適用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】（ａ）は本発明が適用されるゲル粒子測定装置の実施の形態の概要を示す説明図、（ｂ）は（ａ）中Ｂ−Ｂ線断面図である。

【図2】（ａ）はゲル化反応を模式的に示す説明図、（ｂ）はゲル化反応の進行工程Ｉ〜ＩＩＩを示す説明図、（ｃ）はゲル化反応の進行工程における反応時間と散乱光強度との関係を示す説明図である。

【図3】リムルス試薬を用いた際のエンドトキシンのゲル化反応過程を模式的に示す説明図である。

【図4】（ａ）はゲル粒子にコヒーレント光が照射されたときの散乱光の散乱方向を示す説明図、（ｂ）はゲル粒子の粒子径の変化に伴う散乱光の光度分布を示す説明図である。

【図5】実施の形態１に係るゲル粒子測定装置を示す説明図である。

【図6】実施の形態１に係るゲル粒子測定装置の試料セルの周辺構造を模式的に示す説明図である。

【図7】（ａ）は実施の形態１で用いられる試料セルを示す分解斜視図、（ｂ）はその断面説明図である。

【図8】（ａ）は実施の形態１で用いられる光路調整手法１を示す説明図、（ｂ）は実施の形態１で用いられる光路調整手法２を示す説明図である。

【図9】実施の形態１に係るゲル粒子測定装置のデータ解析処理の一例を示すフローチャートである。

【図10】（ａ）は実施の形態１で用いられる後方散乱光検出器の出力例を示す説明図、（ｂ）は（ａ）に示す出力例の散乱光強度分布の一例を示す説明図である。

【図11】（ａ）は既知のエンドトキシン濃度の試料に対して後方散乱測光によるゲル粒子の検出例を示す説明図、（ｂ）は（ａ）の結果を用いた検量線作成例を示す説明図である。

【図12】（ａ）（ｂ）は実施の形態１に係るゲル粒子測定装置の変形の形態１，２を示す説明図である。

【図13】（ａ）は実施の形態１に係るゲル粒子測定装置の変形の形態３を示す説明図、（ｂ）は（ａ）中Ｂ−Ｂ線断面図、（ｃ）は実施の形態１に係るゲル粒子測定装置の変形の形態４を示す説明図、（ｄ）は（ｃ）中Ｄ−Ｄ線断面図である。

【図14】実施の形態２に係るゲル粒子測定装置を示す説明図である。

【図15】（ａ）は実施の形態２で用いられるピンホールの作用を示す説明図、（ｂ）は実施の形態２で用いられる後方散乱光検出器の出力例を示す説明図である。

【図16】実施の形態３に係るゲル粒子測定装置を示す説明図である。

【図17】実施例１（後方散乱検出方式（ＢＳ））、比較例１（前方散乱検出方式（ＦＳ））に係るゲル粒子測定装置によるエンドトキシン濃度の異なる同一試料についてゲル化開始時間を夫々測定した結果を示す説明図である。

【図18】実施例２に係るゲル粒子測定装置の光学系の試料セルに対する焦点位置の変化に伴う後方散乱光検出器の出力変化例Ｉ，ＩＩを示す説明図で、（ａ）は出力変化例Ｉを、（ｂ）は（ａ）の散乱光強度の分布例を、（ｃ）は出力変化例ＩＩを、（ｄ）は（ｃ）の散乱光強度の分布例を夫々示す。

【図19】実施例２に係るゲル粒子測定装置の光学系の試料セルに対する焦点位置の変化に伴う後方散乱光検出器の出力変化例ＩＩＩ，ＩＶを示す説明図で、（ａ）は出力変化例ＩＩＩを、（ｂ）は（ａ）の散乱光強度の分布例を、（ｃ）は出力変化例ＩＶを、（ｄ）は（ｃ）の散乱光強度の分布例を夫々示す。

【図20】（ａ）は実施例２に係るゲル粒子測定装置の光学系の試料セルに対する焦点位置の変化に伴う後方散乱光検出器の出力変化例Ｖを示し、（ｂ）は（ａ）の散乱光強度の分布例を示す説明図である。

【発明を実施するための最良の形態】

【0019】

◎実施の形態の概要
図１（ａ）（ｂ）は本発明が適用された実施の形態に係るゲル粒子測定方法の概要を示す説明図である。
同図において、ゲル粒子測定方法は、ゲル化反応によって試料Ｓ中の目的物質を粒子化したゲル粒子Ｇを測定するに際し、少なくとも一部に光が入射される入射部を有し、測定対象である目的物質が含まれる試料Ｓ及び目的物質のゲル化を生ずる試薬Ｒが含まれる溶液を収容する試料セル１と、試料セル１内の試料Ｓ及び試薬Ｒが含まれる混合溶液Ｗ全体がゲル化するのを抑制するように混合溶液Ｗを連続的に撹拌する撹拌手段２と、試料セル１の入射部の外部に設けられ、試料セル１内の混合溶液Ｗに対してコヒーレントな光Ｂｍを照射させる光源３と、試料セル１の入射部の外部で光源３と同じ側に設けられ、試料セル１内の混合溶液Ｗ中で散乱した光のうち光源３側の方向に戻る後方散乱光成分を検出する後方散乱光検出手段４と、を用い、試料セル１内に混合溶液Ｗを収容した状態で撹拌手段２にて混合溶液Ｗを連続的に撹拌する撹拌工程と、撹拌工程を実施中に、混合溶液Ｗに対して光源３からの照射光Ｂｍを入射させ、後方散乱光検出手段４に向かう光の検出光路ＳＴに対して試料セル１の表面にて反射される光の反射光路ＤＴを異ならせ、混合溶液Ｗ中で散乱した光成分を後方散乱光検出手段４で捕捉する光分離工程と、光分離工程を経て得られる後方散乱光検出手段４の検出出力に基づいて散乱光の変動成分を計測し、混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相変化する時点につながる混合溶液Ｗ内のゲル粒子Ｇの生成開始時点が少なくとも含まれるゲル粒子Ｇの生成状態を判別する計測工程と、を備える。

【0020】

このような技術的手段において、本件の目的物質は、所定の試薬Ｒとの間でゲル化反応し、ゲル粒子Ｇが生成されるものであれば広く含む。例えばエンドトキシンやβ−D−グルカンが挙げられる。ここで、目的物質がエンドトキシンである場合には、これをゲル化する試薬Ｒとしては、代表的にはリムルス試薬（リムルス属のカブトガニ血球由来の試薬）が挙げられるが、これに限られず、タキプレウス属のカブトガニ血球由来の試薬や、これらと同等な生物血球由来の試薬でもよい。
また、試料セル１は、少なくとも一部に光が入射される入射部を有するものであればよく、その形状は円筒状周壁を有するものに限られず、多角形状周壁を有するものでもよい。
更に、撹拌手段２としては、試料Ｓ及び試薬Ｒが含まれる混合溶液Ｗに対して撹拌作用を与えるものであれば広く含み、内蔵して直接的に撹拌する態様は勿論のこと、エアによる撹拌作用を与えたり、振盪による撹拌作用を与えるなど適宜選定して差し支えない。
更にまた、光源３はコヒーレントな光を照射するものであればレーザ光源によるレーザ光に限られず、例えばナトリウムランプの光のような単色光をピンホールに通すことによっても作成可能である。また、光源３は試料セル１の外側近傍に設けられていてもよいし、試料セル１から離れた位置に設けられ、各種の光学部品（結像部材、反射部材、絞り部材、光ファイバなど）を介在させて試料セル１の入射部に導くようにすればよい。
また、後方散乱光検出手段４としては、光源３から試料セル１内に入射された光で試料Ｓ及び試薬Ｒが含まれる混合溶液Ｗ中で散乱した光のうち光源３側の方向に戻る後方散乱光成分を検出するものであればよい。この場合、後方散乱光検出手段４としては、試料セル１の外側近傍に設けてもよいが、試料セル１から離れた位置に光学部品を用いて導くようにしてもよい。

【0021】

また、本実施の形態においては、ゲル粒子測定方法は、前述した構成要素を用いて、撹拌工程、光分離工程を経て計測工程を実施するようにすればよい。
ここで、撹拌工程は、撹拌手段２にて試料セル１内の混合溶液Ｗ全体がゲル化するのを抑制するように連続的に撹拌することが必要であり、光分離工程、計測工程を実施する間は撹拌工程を継続することが必要である。
また、光分離工程については、図１（ｂ）に示すように、光源３から照射された光Ｂｍは試料セル１を透過する光Ｂｍ_１成分と、試料セル１の表面で反射される光Ｂｍ_０成分とがあり、試料セル１の表面で反射される光Ｂｍ_０の反射光路ＤＴを試料セル１内の混合溶液Ｗ中で散乱して後方散乱光検出手段４に向かう光Ｂｍ_２の検出光路ＳＴと異なるように分離するものであればその手段は適宜選定して差し支えない。
更に、計測工程は、後方散乱光検出手段４の検出出力に基づいて散乱光の変動成分を計測することを要し、例えば検出出力を平均化又はスムージングすると共にフィルタリング化する手法が挙げられる。更に、計測結果に基づいて、混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相変化する時点につながる混合溶液Ｗ内のゲル粒子Ｇの生成開始時点が少なくとも含まれるゲル粒子Ｇの生成状態を判別するものであればよい。ここで、「ゲル粒子Ｇの生成状態」とは、ゲル粒子Ｇの生成開始（出現）時点以外に、生成過程の変化、生成終了時点、生成量などを広く含み、「ゲル粒子Ｇの生成状態を判別する」とは、ゲル粒子Ｇの生成状態に関する情報を直接判別することは勿論、ゲル粒子Ｇの生成状態に基づいて判別可能な情報（例えば目的物質の定量情報）を判別することも含むものである。

【0022】

また、光分離工程の好ましい態様としては、検出光路ＳＴが光源３から試料セル１内に照射される光Ｂｍの照射光路ＡＴの一部を含むものが挙げられる。
光分離工程は、前述した反射光路ＤＴと検出光路ＳＴとを分離するものであればよく、光源３から試料セル１内に向かう光Ｂｍの照射光路ＡＴと後方散乱光検出手段４へ向かう検出光路ＳＴとが一致しない態様をも含むが、真の後方散乱方向に向かう散乱光成分を捕捉するという観点からすれば、検出光路ＳＴが照射光路ＡＴと同じ光路を経ることが好ましい。ここで、光源３と後方散乱光検出手段４とは通常異なる場所に設置される態様が多いが、この態様では、後方散乱光検出手段４による検出動作を可能にするには照射光路ＡＴの途中から検出光路ＳＴを分岐させることが必要である。但し、光源３と後方散乱光検出手段４とを一体化したデバイスを用いる態様ではこの限りではない。

【0023】

また、実施の形態に係るゲル粒子測定方法を具現化したゲル粒子測定装置の概要は以下の通りである。
図１（ａ）（ｂ）において、ゲル粒子測定装置は、ゲル化反応によって試料Ｓ中の目的物質を粒子化したゲル粒子Ｇを測定するものであって、少なくとも一部に光が入射される入射部を有し、測定対象である目的物質が含まれる試料Ｓ及び前記目的物質のゲル化を生ずる試薬Ｒが含まれる溶液を収容する試料セル１と、試料セル１内の試料Ｓ及び試薬Ｒが含まれる混合溶液Ｗ全体がゲル化するのを抑制するように混合溶液Ｗを連続的に撹拌する撹拌手段２と、試料セル１の入射部の外部に設けられ、撹拌手段２にて混合溶液Ｗを撹拌中に、試料セル１内の混合溶液Ｗに対してコヒーレントな光Ｂｍを照射させる光源３と、試料セル１の入射部の外部で光源３と同じ側に設けられ、試料セル１内の混合溶液Ｗ中で散乱した光のうち光源３側の方向に戻る後方散乱光成分を検出する後方散乱光検出手段４と、試料セル１の入射部に向かって光源３からの照射光を入射するときに、試料セル１内の混合溶液Ｗ中で散乱した光のうち後方散乱光検出手段４に向かう検出光路ＳＴと、試料セル１の表面にて反射される光Ｂｍ_０の反射光路ＤＴとを異ならせるように試料セル１の入射部表面を調整する光路調整手段５と、後方散乱光検出手段４の検出出力に基づいて散乱光の変動成分を計測し、混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相変化する時点につながる混合溶液Ｗ内のゲル粒子Ｇの生成開始時点が少なくとも含まれるゲル粒子Ｇの生成状態を判別する計測手段６と、を備えたものである。

【0024】

ここで、光路調整手段５としては、試料セル１の入射部表面を調整することで、光源３から試料セル１の入射部に照射される光のうち試料セル１の入射部表面の反射光路ＤＴと、試料セル１内の混合溶液Ｗ中で散乱した光のうち後方散乱光検出手段４に向かう検出光路ＳＴとを異ならせるものであれば適宜選定して差し支えない。
光路調整手段５の代表的態様としては以下のものが挙げられる。
代表的態様１としては、図１（ｂ）に示すように、試料セル１は少なくとも入射部が透過可能な有底の断面円形の筒状容器を有し、光路調整手段５は光源３からの光軸ｍを、筒状容器の中心軸Ｏから変位した位置を過ぎるように配置するものが挙げられる。
但し、光源３からの光軸ｍと、当該光軸ｍと平行で試料セル１の筒状容器の中心軸Ｏを通過する仮想光路との間の変位量については、試料セル１の外径や肉厚、更には、素材（光の屈折率）を考慮し、少なくとも光源３からの照射光Ｂｍの一部が試料セル１の周壁を透過することが可能なように選定することが必要である。つまり、前述した変位量につき大き過ぎた選定をしてしまうと、光源３からの照射光Ｂｍが試料セル１の入射部表面で全反射してしまう懸念があるので、これを避けるように選定するようにすればよい。
本例は、試料セル１が有底の断面円形の筒状容器である態様を前提とし、光源３からの光軸ｍを筒状容器の中心軸Ｏから変位した位置を過ぎるように配置すると、光源３から照射された光Ｂｍは筒状容器の表面の法線Ｈ方向に対して鋭角で交差する方向から入射するため、法線Ｈ方向を挟んで入射角度と略同じ角度をもって正反射する。このため、光源３から入射されて試料セル１の表面にて反射された光Ｂｍ_０は、後方散乱光検出手段４に向かう検出光路ＳＴとは異なる方向の反射光路ＤＴに向かう。
このとき、光源３からの照射光Ｂｍのうち試料セル１（筒状容器）表面にて反射された光Ｂｍ_０の反射光路ＤＴは試料セル１内の混合溶液Ｗ中で散乱した光のうち後方散乱光検出手段４に向かう光Ｂｍ_２の検出光路ＳＴと分離され、反射光路ＤＴの光が検出光路ＳＴに紛れる懸念は少ない。

【0025】

また、光路調整手段５の代表的態様２としては、試料セル１の中心軸Ｏと光源３の光軸ｍとを直交位置から傾けて配置する態様が挙げられる。本例は、試料セル１の断面形状を問わず、光源３の光軸ｍを含む水平面に対して試料セル１の表面から反射される反射光路ＤＴを傾斜配置するものである。この場合、試料セル１の傾斜角度としては、反射光路ＤＴと検出光路ＳＴとを分離する上で必要な角度を選定し、しかも、撹拌手段２による撹拌動作等を実現可能な範囲で適宜選定して差し支えない。
更に、光路調整手段５の代表的態様３としては、試料セル１の入射部には光源３からの照射光Ｂｍのうち入射部表面にて反射される反射光Ｂｍ_０が後方散乱光検出手段４に向かう方向とは異なる方向に向かうように予め成形された反射面を有する態様が挙げられる。本例は、試料セル１の入射部に所望の反射面を成形することで、試料セル１の入射部で反射される光を後方散乱光検出手段４に向かう検出光路ＳＴとは異なる方向の反射光路ＤＴへと導くものである。
更にまた、光路調整手段５の代表的態様１〜３についてはこれらを適宜組み合わせてもよいことは勿論である。

【0026】

本実施の形態では、光学系は、少なくとも光源３、後方散乱光検出手段４及び光路調整手段５を含むものであれば適宜選定して差し支えないが、光学系の好ましい態様としては以下のものが挙げられる。
光学系の好ましい態様１としては、光源３から試料セル１の入射部に向かって照射される光Ｂｍを透過し、かつ、混合溶液Ｗ中で散乱した光のうち後方散乱光検出手段４に向かう光Ｂｍ_２の検出光路ＳＴを光源３からの照射光路ＡＴに対し途中で分岐させる光路分岐部材７を備える態様が挙げられる。本例は、光源３から試料セル１に向かう照射光路ＡＴの途中に光路分岐部材７を配置したもので、光路分岐部材７としては、光源３からの光Ｂｍを透過させる機能と、試料セル１から後方散乱光検出手段４に向かう光Ｂｍ_２の検出光路ＳＴを光源３からの照射光路ＡＴから途中で分岐させる機能を有するものであればよい。この光路分岐部材７としては、例えば反射部材の一部に光源３からの光Ｂｍを透過させる孔を設けたり、一方からは光を透過し、他方からの光を反射させる光学部材を用いるようにすればよい。
また、光学系の好ましい態様２としては、光源３からの照射光Ｂｍが試料セル１内壁を通過した近接位置を焦点位置として収束する入射用の結像部材（図示せず）を有し、後方散乱光検出手段４に向かう光Ｂｍ_２が当該後方散乱光検出手段４の検出面を共役焦点位置として収束する検出用の結像部材（図示せず）を有する態様が挙げられる（図５に示す実施の形態１参照）。
本例は、光源３からの照射した光Ｂｍが試料セル１内壁を通過した近接位置を焦点位置として収束する態様であるため、焦点位置近傍のゲル粒子Ｇによって散乱した光は後方散乱光検出手段４に向かって当該後方散乱光検出手段４の検出面に共役焦点位置として収束する。このため、試料セル１の内壁近傍にて生成されたゲル粒子Ｇからの散乱光情報は後方散乱光検出手段４にピントの合った状態で検出される。

【0027】

更に、光学系の好ましい態様としては、光源３からの照射光Ｂｍが試料セル１内壁を通過した近接位置を焦点位置として収束する入射用の結像部材（図示せず）を有し、後方散乱光検出手段４に向かう検出光路ＳＴの途中に絞り部材（図示せず）が配置され、後方散乱光検出手段４に向かう光Ｂｍ_２が絞り部材位置を共役焦点位置として収束する第１の検出用の結像部材（図示せず）を有すると共に、絞り部材を通過した光が後方散乱光検出手段４の検出面を共役焦点位置として収束する第２の検出用の結像部材（図示せず）を有する態様が挙げられる（図１４に示す実施の形態２参照）。
本例は、光源３からの照射した光Ｂｍが試料セル１内壁を通過した近接位置を焦点位置として収束する態様であるため、焦点位置近傍のゲル粒子Ｇによって散乱した光は後方散乱光検出手段４に向かって絞り部材（例えばピンホール）位置を共役焦点位置として収束した後、絞り部材を通過した光が後方散乱光検出手段４の検出面を共役焦点位置として収束する。このため、試料セル１の内壁近傍にて生成されたゲル粒子Ｇからの散乱光は絞り部材を通過するが、その他の散乱光は絞り部材を通過せず、ゲル粒子Ｇからの散乱光のみが後方散乱光検出手段４にピントの合った状態で検出される。
また、光学系の好ましい態様４としては、光源３から試料セル１に向かう光束を絞り部材（図示せず）を介して絞り込み、光束を、混合溶液Ｗ中で散乱した光のうち後方散乱光検出手段４に向かう光束よりも狭く設定する態様が挙げられる。本例は、試料セル１内の混合溶液Ｗ中に絞った光束を照射させ、混合溶液Ｗ中で散乱して後方散乱光検出手段４に向かう光束を入射光の光束の周囲から導くものである。

【0028】

また、試料セル１の好ましい態様としては、ゲル化反応を恒温環境下で行うという観点からすれば恒温槽８内に設けられる態様が挙げられる。
更に、試料セル１の別の好ましい態様としては、それ自体又はその周囲に、光源３からの照射光Ｂｍのうち混合溶液Ｗ中で後方散乱光検出手段４に向かう後方散乱光成分以外の透過又は試料セル１内壁での散乱で生じる迷光成分が除去させられる迷光除去手段９を備えている態様が挙げられる。
本例は、試料セル１の入射部から入射された光が入射部と異なる試料セルの周壁（外壁、内壁）で反射散乱すると、その反射散乱光の一部が迷光として後方散乱光検出手段４に誤って捕捉される懸念があるため、このような検出に影響する迷光が生じない構成を採用することを企図したものである。ここで、迷光除去手段９としては、試料セル１の周壁に迷光成分が吸収可能な吸収部材を設けたり、試料セル１の内壁に迷光成分が乱反射可能な粗面を設けるなど適宜選定して差し支えない。
更にまた、計測手段６による計測結果を目視するという観点からすれば、計測手段６による計測結果が表示される表示手段１０を備えていることが好ましい。
また、本実施の形態では、前述した後方散乱光検出手段４を第１の散乱光検出手段とし、更に、前記混合溶液Ｗ内で散乱した光のうち光源３側の方向に戻る後方散乱光成分以外の散乱光成分を検出する第２の散乱光検出手段１１と、を備え、計測手段６は、第１の散乱光検出手段４の検出出力の変動成分の計測結果に基づいて混合溶液Ｗ内のゲル粒子Ｇの生成開始時点が含まれるゲル粒子Ｇの生成状態を判別し、第１の散乱光検出手段４及び第２の散乱光検出手段１１の検出出力又は第２の散乱光検出手段１１の検出出力の変動成分の計測結果に基づいて前述した以外のゲル粒子Ｇの生成状態を判別するようにしてもよい。
つまり、第１の散乱光検出手段４の検出出力の変動成分に基づいて混合溶液Ｗ内のゲル粒子Ｇの生成開始時点が含まれるゲル粒子Ｇの生成状態を判別し、これ以外のゲル粒子Ｇの生成状態については、第１の散乱光検出手段４と共に第２の散乱光検出手段１１の検出出力、あるいは、第２の散乱光検出手段１１の検出出力の変動成分に基づいて判別する。

【0029】

次に、図１（ａ）（ｂ）に示すゲル粒子測定装置の作動について説明する。
先ず、ゲル化反応を図２（ａ）に模式的に示す。
同図において、試料Ｓの目的物質Ｓｔに対し特異的に反応する試薬Ｒが存在すると、試料Ｓ中の目的物質Ｓｔの濃度に依存した割合にて、その目的物質Ｓｔが試薬Ｒと特異的に反応する現象が起こる。この反応過程において、試薬Ｒは、目的物質Ｓｔの刺激を受けて所定の因子が活性化し、これに起因して所定の酵素が活性化するタイミングで例えば水溶性のタンパク質が酵素による分解反応にて不溶性のタンパク質に転換し、ゲル粒子Ｇの出現に至ることが起こる。
より具体的には、エンドトキシンを例に挙げて、エンドトキシンのゲル化反応過程を模式的に示すと、図３の通りである。
同図において、（１）に示すエンドトキシンの刺激が例えばリムルス試薬に伝わると、先ず（２）に示すように、因子Ｃ（Factor C）が活性化されて活性化因子Ｃ（Activated Factor C）となり、次いで、活性化因子Ｃの作用により、（３）に示すように、因子Ｂ（Factor B）が活性化されて活性化因子Ｂ（Activated Factor B）になる。この後、活性化因子Ｂの作用により、（４）に示すように、Pro-Clotting酵素がClotting酵素になり、（５）に示すように、このClotting酵素がCoagulogen（水溶性タンパク質）を分解してCoagulin（不溶性タンパク質）を生成させる。このCoagulin（不溶性タンパク質）は、この条件下で撹拌が行われると全体のゲル化が阻害されるに伴ってゲル粒子Ｇとして出現し、一方ここで静置すると（６）に示すように、溶液系全体が重合化・ゲル化を起こす。

【0030】

つまり、試料Ｓの目的物質Ｓｔがエンドトキシンである場合には、混合溶液Ｗに対して一定の撹拌状態を与えることで混合溶液Ｗ全体のゲル化を阻害しつつ、この状態で、リムルス試薬Ｒにエンドトキシンの刺激が伝わると、Clotting酵素の周りにCoagulin（不溶性タンパク質）のゲル粒子Ｇを産出させることが可能であり、Coagulin（不溶性タンパク質）がゲル粒子Ｇとして生成された後に、ゲル粒子Ｇが順次生成される反応過程を経ることが理解される。
また、リムルス試薬Ｒの反応の流れ（カスケード）にエンドトキシンの刺激が伝わる速度（リムルス反応速度）はエンドトキシン濃度に依存的であり、エンドトキシン濃度が高い程リムルス反応速度が速く、Coagulin（不溶性タンパク質）からなるゲル粒子Ｇの出現タイミングが早いことが見出された。
よって、散乱光変化を精度良く検出するようにすれば、ゲル粒子Ｇの生成開始時点として前記Coagulin（不溶性タンパク質）からなるゲル粒子Ｇの出現タイミングを把握することは可能であり、本実施の形態に係るゲル粒子測定装置の測定原理の基本である。
このようなゲル粒子測定装置の測定原理は、例えば従前のゲル化法や比濁時間分析法の測定原理（リムルス試薬Ｒによる反応過程において、静置した条件下、活性化されたClotting酵素の影響で最終的にゲル化するに至り、このゲル化する過程を濁度により定量測定する態様）とは全く相違するものである。

【0031】

ここで、ゲル粒子測定装置の測定原理を図２（ｂ）に模式的に示す。
本実施の形態のゲル粒子測定装置では、図２（ｂ）の工程Ｉに示すように、試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液の混合溶液Ｗにゲル粒子Ｇがない場合（混合溶液Ｗがゾル相である場合に相当）には、光源３（図１（ａ）参照）から試料セル１内に入射する照射光Ｂｍ_１はゲル粒子Ｇによって遮られることがないため、その照射光Ｂｍ_１がゲル粒子Ｇによって散乱することはなく、当然ながら光源３側の後方に戻る後方散乱光成分はない。このため、後方散乱光検出手段４にて検出される散乱光強度は略０に保たれる（図２（ｃ）Ｉ工程Ｐ_１参照）。
そして、図２（ｂ）の工程IIに示すように、試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液の混合溶液Ｗにゲル粒子Ｇが生成開始し始めた場合（混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相変化し始めた場合に相当）、例えばエンドトキシンの場合のCoagulin（不溶性タンパク質）のゲル粒子Ｇが産出し始めると、光源３から試料セル１内に入射された照射光Ｂｍ_１の一部は産出されたCoagulin（不溶性タンパク質）からなるゲル粒子Ｇの存在によって一部遮られるため、その照射光Ｂｍ_１の一部が散乱することになり、その散乱光のうち光源３側の方向に戻る後方散乱光Ｂｍ_２成分が後方散乱光検出手段４に検出されることになる。このため、後方散乱光検出手段４による検出出力が安定領域である０レベルから立ち上がり変化しようとする（図２（ｃ）II工程Ｐ_２参照）。この場合、照射光Ｂｍ_１の当たる試料セル１直後の後方散乱光Ｂｍ_２は、溶媒による減衰をほとんど受けずに検出される。
このとき、本例では、光源３から試料セル１への照射光Ｂｍ_１は、図１（ａ）（ｂ）に示すように、試料セル１内に入射される照射光Ｂｍ_１以外に、試料セル１の表面にて反射光Ｂｍ_０として反射されるが、本例では、光路調整手段５によって試料セル１の入射部表面を調整しているため、後方散乱光検出手段４に向かう後方散乱光Ｂｍ_２の検出光路ＳＴと、試料セル１表面からの反射光Ｂｍ_０の反射光路ＤＴとが異なるようになっている。このため、反射光Ｂｍ_０成分が後方散乱光検出手段４への検出光路ＳＴに紛れ込んで検出される懸念はない。
この後、図２（ｂ）の工程IIIに示すように、試料Ｓ及び試薬Ｒ溶液の混合溶液Ｗにゲル粒子Ｇの生成が次第に進行していく場合には、光源３から試料セル１内に入射した照射光Ｂｍ_３は順次生成される多くのゲル粒子Ｇの存在によって散乱度合が次第に増加することになり、後方散乱光検出手段４に検出される光源３側の後方に戻る後方散乱光Ｂｍ_３成分も次第に増加する。このため、後方散乱光検出手段４による検出出力が順次増加していき、後方散乱光検出手段４にて検出される散乱光強度は変化点Ｐ_２を境に順次立ち上がり変化していく（図２（ｃ）III工程Ｐ_３参照）。一方、ある程度強度が増加すれば、前方や側方散乱も、溶媒による減衰以上に強度が上がり検出されるようになる。しかし初期の散乱は減衰により検出されず、試料セル１直後での後方散乱検出が遅れる。
上述した実施の形態では、混合溶液Ｗ中に照射された照射光Ｂｍの後方散乱光の変動成分に基づいて、他方向の散乱に比べて有意に早く混合溶液Ｗがゾル相からゲル相へ相変化するタイミングにつながるゲル粒子Ｇの生成開始時点（図２（ｂ）II工程Ｐ_２に相当）を判別する態様が示されている。

【0032】

一般に、臨床試料におけるエンドトキシン測定の要請は、特に救命救急という目的の下では、簡便で早く測れることが第一に求められるゆえんである。
従来法の比濁時間分析法で問題になっていた事項である‘感度の悪さによる測り落とし’と、‘測定時間の長さによる不便さ’は、上述した測定方式でより確実に解消される。
つまり、本実施の形態に係るゲル粒子測定装置は、原理的に、均一に試料及びリムルス試薬からなる混合溶液を撹拌することで、均一な反応の下、混合溶液系全体としてではなく、局所での微小なゲル粒子を発生させ、それをレーザ光のようなコヒーレントな均一の光を当てることで散乱を起こさせ、それを検出することにより、エンドトキシンが加わったことによるゲル粒子の出現というゾル相からゲル相への相変化につながる相変化点を検出し、その相変化点に至るまでの時間を測ることにより、リムルス試薬におけるエンドトキシンの量を推量することが可能になるものである。
要約すれば、本実施の形態に係るゲル粒子測定装置は、混合溶液系全体の変化（ゲル化）を追うことなく、相変化を起こすまでのタイミング（ゲル粒子の生成開始時点）がエンドトキシンに依存的な反応であることに着眼して構成されたものであり、これにより、従来法の比濁時間分析法に比べて、エンドトキシンを早く検出することができるゆえんである。

【0033】

特に、本実施の形態では、散乱光のうち光源３側の後方に戻る後方散乱光成分に着眼しているが、この理由は以下の通りである。
一般に、図４（ａ）に示すように、粒子に例えばレーザ光等のコヒーレントな均一の光（コヒーレント光）が照射されたモデルを想定すると、コヒーレント光は粒子の存在によって散乱することは広く知られている。このような散乱現象において、粒子の大きさと散乱光の関係とについて調べたところ、単一光の入射によって生じる散乱光の強さ及び方向性は例えば図４（ｂ）に示すような関係が見られる。同図において、散乱現象としては、粒子に対して入射した光と同方向に発生する前方散乱、入射した光と直角方向に発生する側方散乱、そして入射光と反対の方向に発生する後方散乱がある。
このような散乱現象においては、発生するエネルギはさておき、粒子の大きさと散乱の方向を考えると、粒子が大きくなるほど前方散乱が主になり、粒子が小さいと後方散乱を含めた全方位への散乱が観察される。このような観察結果からすれば、大きな粒子を捉えるには前方散乱が有利と言える。一方、無の状態から発生し、成長するという現象の下、最初に発生する小さな粒子を早く捉えるためには、どの方向でもよいとはいえるが、エネルギが小さいことを考えると、粒子の存在する溶媒中における散乱光の減衰を考慮したときには、その減衰の少ない（溶媒の影響による吸収の少ない）後方散乱が適していると考えられる。
とりわけ、本実施の形態でのゲル粒子測定装置は、無から生成する粒子（ゲル化という相変化）を捉えるため、なるべく早く発生する微小な粒子を検出するという目的に、試料セルへの入射光照射直下での後方散乱によるゲル粒子検出は他のいかなる方向の散乱検出よりも優っているものと推測される。
このように、例えばリムルス試薬による相変化によって出現する微小粒子を、早く感度よく検出することを目的として、後方散乱による検出方式を採用することで前記相変化のタイミングをより測ろうとするものである。
要するに、微小粒子出現により発生する散乱光のうち後方散乱光成分を検出する方式は、同一反応においても小さな粒子を早く検出できることと、粒子の浮遊する溶媒による減衰無く散乱光を検出することができることの２つが優れている点である。

【0034】

以下、添付図面に示す実施の形態に基づいてこの発明をより詳細に説明する。
◎実施の形態１
本実施の形態１に係るゲル粒子測定装置は、試料Ｓとして目的物質としてエンドトキシンを含むものを対象とし、試薬Ｒとして目的物質であるエンドトキシンとゲル化反応を起こすものが用いられている。
−試薬−
本実施の形態においては、試薬Ｒは、エンドトキシンとの間でゲル化反応する試薬基剤を少なくとも含んでいればよいが、ゲル粒子Ｇの形成を促進するために、試薬基剤に粒子形成因子を添加するものが用いられている。
試薬基剤は、目的物質とゲル化反応する因子（酵素等）を含んでいればよい。例えば目的物質がエンドトキシンやβ−D−グルカンであれば代表的にはリムルス試薬が挙げられるが、リムルス試薬に限定されるものではなく、アメリカカブトガニ（Limulus）以外のカブトガニ類のアメーバ状血球成分に含まれる因子群がエンドトキシンやβ−D−グルカンに特異的に反応するものであれば、当該アメーバ状血球水解物を利用して試薬基剤を作製するようにしてもよいことは勿論である。
また、粒子形成因子は、試薬基剤に添加され、生物的に不活性であって試料Ｓに対して可溶性を有し且つ０．００２ないし１％の濃度で溶解すると共に、ゲル粒子Ｇに至る産物を凝集させる。尚、本願における粒子形成因子の濃度値は容量パーセント（ｖ／ｖ）で表記したものである。

【0035】

ここで、粒子形成因子の各要件の必要性について補足する。
先ず、試料Ｓに対して可溶性であることを要する。仮に、不溶性である場合には、ゲル粒子Ｇの生成開始時点を正確に把握する点で邪魔になる懸念があるからである。
また、粒子形成因子は、ゲル粒子Ｇに至る核となる産物（例えば酵素の産物）の凝集を促進させる凝集因子として働き、ゲル粒子Ｇの形成を促進する作用を奏するものであればよい。この場合、粒子形成因子としては、ゲル粒子Ｇの形成に至るリムルス反応最終産物コアグリンを一定サイズに集積させる作用を奏するものと推測される。つまり、粒子形成因子を加えると、時間の経過に伴って生じる不溶性蛋白質コアグリンの凝集を、無制限、無定型な大きさの様々な粒子サイズを生成するのではなく、所定範囲の粒子サイズ（例えば粒子サイズのレベルに対し小さいＳサイズに偏った範囲）に集中したゲル粒子Ｇに至る産物を生成し、これが凝集してゲル粒子Ｇに早期に至るものである。ここでいう‘所定範囲の粒子サイズ’とは凝集し易い比較的小サイズのものであればよく、ある範囲内に含まれていればよい。
そして、粒子形成因子は、０．００２〜１％の濃度であることを要する。この場合、０．００２％未満である場合には、ゲル粒子Ｇの形成は制御されず、小から大に至る粒子形成が発生し、結果的に形成が抑制される。一方、１％を超えると、過剰な粒子形成因子が加わり、コアグリン分子が分散して相互の作用が却って干渉し合う結果、逆に凝集反応が抑制される傾向が見られる。
更に、粒子形成因子は生物的に不活性であることを要する。これは、例えば生物的に活性がある因子では、因子の特性が活性に伴って変化するため、因子としての作用が不安定になるばかりか、試薬基剤による反応自体にも影響する懸念がある。
また、粒子形成因子の代表的態様としては、例えば可溶性の熱変性蛋白質が挙げられる。この熱変性蛋白質としては、血漿蛋白質類、酵素類、植物蛋白質類、卵白アルブミンなどを含む。例えば血漿蛋白質は希釈溶液を熱処理（例えば１２０℃・２０分高圧滅菌処理）することで可溶性の熱変性蛋白質として得られる。
更にまた、粒子形成因子としては、粒子形成という微小なゲル化の核となる物質であればよいため、必ずしも熱変性蛋白質である必要はなく、粒子形成因子としての別の代表的態様としては、生物由来の高分子又は石油高分子化学成分由来の多孔質微粒子が挙げられる。但し、これらについても、可溶性で且つ生物的に不活性であることを要する。
前記生物由来の高分子には、例えばセルロース、多糖類、糖蛋白質などが含まれ、また、石油高分子化学成分由来の多孔質微粒子には例えばナノパーティクル樹脂などが挙げられる。

【0036】

−ゲル粒子測定装置−
＜ゲル粒子測定装置の全体構成＞
本実施の形態において、ゲル粒子測定装置は図５及び図６に示すように構成されている。
同図において、ゲル粒子測定装置は、エンドトキシンを含む試料Ｓが注入される試料セル１００を有し、例えば試料Ｓの目的物質としてのエンドトキシンの濃度を試薬Ｒ（本例ではリムルス試薬に粒子形成因子を添加した試薬）を用いたゲル化反応にて測定するものである。
本例では、試料セル１００は、予め決められた測定ステージに設置されるが、ヒータ１１６付きの恒温槽１１５内に配置されて試料Ｓ及び試薬Ｒからなる混合溶液Ｗを一定の恒温環境（例えば３７℃）下におき、測定条件を一定にするようになっている。
また、符号１２０は試料セル１００内の混合溶液Ｗを撹拌するために試料セル１００内の磁性撹拌棒１２１を駆動する撹拌駆動装置であり、例えば混合溶液Ｗに対して一定の撹拌状態を与え、混合溶液Ｗを均一に撹拌しながら混合溶液Ｗ全体がゲル化するのを抑制するようになっている。
特に、本例では、撹拌駆動装置１２０は、試料セル１００内の底壁に内蔵された磁性体からなる撹拌棒（スターラーバー）１２１に対して磁力による撹拌力を作用させる撹拌駆動源（マグネチックスターラー）として構成されている。
更に、試料セル１００の周囲には試料セル１００内の混合溶液Ｗでのゲル化反応を測定するための光学系１３０が設けられている。

【0037】

＜試料セルの構成例＞
次に、本実施の形態で用いられる試料セル１００の構成例、及び、試料セル１００への撹拌棒１２１、試料Ｓの導入例を図７（ａ）（ｂ）に基づいて詳述する。
同図において、試料セル１００は、例えばガラス材料にて一体的に成形され且つ上部が開口した横断面円形の有底の筒状容器１０１からなり、その上部にフランジ部１０２を形成すると共に、このフランジ部１０２の下部にくびれ部１０３を形成し、フランジ部１０２及びくびれ部１０３には小径孔部１０４を形成し、この小径孔部１０４より大径の大径空間部１０５を内部に形成したものである。
そして、この試料セル１００内には、エンドトキシンを含む試料Ｓとゲル化反応を生ずる試薬１０６が例えば凍結乾燥粉末状にて予め無菌的かつ無エンドトキシン的（“エンドトキシンフリー”あるいは“パイロジェンフリー”と一般的にはいわれている）に収容されると共に、磁性材料を用いた撹拌棒１２１が予め収容される。
更に、この試料セル１００の小径孔部１０４にはゴム等の弾性材料からなる密封栓１０８が嵌め込まれている。この密封栓１０８は断面略Ｔ字状に成形されており、その頭部１０８ａが試料セル１００のフランジ部１０２に載置され、その脚部１０８ｂが小径孔部１０４に密接した状態で挿入されている。尚、密封栓１０８の脚部１０８ｂの一部には切欠１０８ｃが設けられている。
更にまた、試料セル１００のフランジ部１０２及び密封栓１０８の頭部１０８ａは例えばアルミニウム製のキャップ状の保持カバー１０９で覆われ、この保持カバー１０９は試料セル１００のフランジ部１０２の周壁に嵌り込み、密封栓１０８を外側から抱き込み保持するようになっている。そして、この保持カバー１０９の例えば中央には密封栓１０８の頭部１０８ａに面して孔部１０９ａが形成されている。

【0038】

また、試料セル１００は、図７（ａ）（ｂ）に示すように、筒状容器１０１の小径孔部１０４を開放した状態で試薬１０６及び撹拌棒１２１を収容し、この状態で、筒状容器１０１の小径孔部１０４を密封栓１０８で密封すると共に、この密封栓１０８を保持カバー１０９で覆うようにしたものである。
このような試料セル１００は、ゲル粒子測定装置の付属品や測定キットとしてユーザーに供給される。
そして、本態様の試料セル１００の筒状容器１０１への試料Ｓの導入例としては、例えば保持カバー１０９の孔部１０９ａを利用して密封栓１０８に注射針のような穿孔具（図示せず）にて穿孔し、この穿孔を通じて注入器（図示せず）にて試料Ｓを注入するようにしたものが挙げられる。更に、試料Ｓの導入を容易に行うため、筒状容器１０１内が大気圧に対して所定の負圧レベルを保つように密封栓１０８の密封仕様を設定してもよい。

【0039】

＜光学系の全体構成＞
本例では、光学系１３０は、図５に示すように、コヒーレントな光Ｂｍが照射されるレーザ光源１３１を有し、このレーザ光源１３１からの照射光Ｂｍをコリメータレンズ１３２を介して平行にした後、プリズム型ミラー１３３を経てレーザ光源１３１の光軸ｍの向きを略９０°変換することで、試料セル１００に向かってレーザ光源１３１からの照射光Ｂｍを案内するようにしたものである。そして、プリズム型ミラー１３３と試料セル１００との間の照射光路ＡＴのうち、プリズム型ミラー１３３の直後には絞り部材としてのピンホール１３４（孔径ｄ１：例えば２ｍｍ）が配置され、ピンホール１３４で絞られた光Ｂｍは結像レンズ１３５を介して試料セル１００の所定部位に収束するようになっている。
また、光学系１３０は、試料セル１００の外部でレーザ光源１３１と同じ側に後方散乱光検出器１４０を有している。この後方散乱光検出器１４０は、レーザ光源１３１からの照射光Ｂｍが試料セル１００内に入射したときに、試料セル１００内の混合溶液Ｗ中に生じたゲル粒子Ｇにて散乱した光のうち、レーザ光源１３１からの照射光路ＡＴ側に戻る後方散乱光成分を検出するものである。そして、レーザ光源１３１からの照射光路ＡＴのうち、ピンホール１３４と結像レンズ１３５との間には反射ミラー１４１が配置され、試料セル１００から後方散乱光検出器１４０に向かう後方散乱光は反射ミラー１４１にて略９０°光軸ｍを変換するように反射された後、結像レンズ１４２を介して後方散乱光検出器１４０の所定部位に収束する。
ここで、反射ミラー１４１にはピンホール１３４にて絞られた光Ｂｍがそのまま通過する孔部１４１ａ（孔径ｄ２＞ｄ１：例えば５ｍｍ）が予め形成されており、また、試料セル１００からの後方散乱光は入射焦点位置から周囲に拡散しながら結像レンズ１３５を透過して略平行光になって反射ミラー１４１に至ることになるが、反射ミラー１４１に至る後方散乱光Ｂｍ_２の光束は反射ミラー１４１の孔部１４１ａの孔径ｄ２に比べて十分に広く、反射光Ｂｍ_２のうち反射ミラー１４１の孔部１４１ａでの減衰量は極めて低い。

【0040】

＜光路調整手法１＞
本実施の形態では、試料セル１００は、図５及び図８（ａ）に示すように、横断面円形の筒状容器１０１を有しており、レーザ光源１３１からの照射光路ＡＴは筒状容器１０１の中心軸Ｏから変位した位置を過ぎるように設定されている。つまり、レーザ光源１３１からの照射光Ｂｍと平行で筒状容器１０１の中心軸Ｏを過ぎる仮想光路Ｌ_０に対し、レーザ光源１３１からの照射光路ＡＴがｙ＞０だけ変位した態様である。例えば筒状容器１０１の外径が１１．８ｍｍである態様でｙ＝２．５ｍｍである。
このとき、レーザ光源１３１からの照射光Ｂｍが水平面上で筒状容器１０１の表面の法線Ｈ方向に対して鋭角の角度αで交差する方向から入射すると、レーザ光源１３１からの照射光Ｂｍの一部Ｂｍ_１は筒状容器１０１の入射部表面を経て筒状容器１０１の周壁を屈折通過して混合溶液Ｗ内に入射し、前述した照射光Ｂｍの残りＢｍ_０は法線Ｈ方向を挟んで入射角度αと略同じ角度をもって正反射する。
一方、筒状容器１０１内に入射した照射光Ｂｍ_１は混合溶液Ｗ中で発生したゲル粒子Ｇに当たると散乱光として散乱し、散乱光のうち後方散乱光検出器１４０に向かう後方散乱光Ｂｍ_２成分が入射光Ｂｍ_１と略同じ光路を経て筒状容器１０１の周壁を屈折通過し、照射光路ＡＴと同じ光路を含む検出光路ＳＴへ向かって戻る。
この状態において、レーザ光源１３１から照射されて筒状容器１０１の表面にて反射された反射光Ｂｍ_０は後方散乱光検出器１４０に向かう検出光路ＳＴと異なる方向の反射光路ＤＴに向かうため、反射光Ｂｍ_０が検出光路ＳＴに紛れ込む懸念はない。
ここで、検出光路ＳＴと反射光路ＤＴとの間の角度（２α）については、筒状容器１０１の外径、肉厚や素材を考慮し、レーザ光源１３１からの照射光路ＡＴの変位量ｙに応じて適宜選定して差し支えない。

【0041】

＜光路調整手法２＞
本実施の形態では、試料セル１００は、図６及び図８（ｂ）に示すように、セルホルダ１１０によって保持されている。本例では、セルホルダ１１０は、鉛直方向に延びる支柱１１１と、試料セル１００が保持可能な保持部が予め形成されたホルダアーム１１２とを有し、支柱１１１には当該支柱１１１に交差する水平方向を揺動支点とする揺動軸１１３を介してホルダアーム１１２を揺動可能に支持し、ホルダアーム１１２の保持部に試料セル１００を保持させた後、ホルダアーム１１２を揺動軸１１３を中心に適宜揺動させ、揺動軸１１３と同軸に設けられた図示外の止め具にて所定の揺動位置にホルダアーム１１２を固定するようにしたものである。
このようなセルホルダ１１０を用いれば、ホルダアーム１１２を所定の揺動位置に固定することで、試料セル１００は鉛直軸ｚ_０に対して筒状容器１０１の中心軸Ｏをβだけ傾斜させた状態で配置される。
この場合、レーザ光源１３１からの照射光Ｂｍは、略水平方向から照射され、鉛直方向では試料セル１００の周壁表面の法線Ｈ方向に対してβだけ傾斜して入射するため、法線Ｈ方向を挟んで入射角度βと略同じ角度をもって正反射する。
この状態において、レーザ光源１３１から照射されて試料セル１００（筒状容器１０１）の表面にて反射された反射光Ｂｍ_０は、水平面に対して鉛直方向に２βの角度をもった反射光路ＤＴに向かうため、後方散乱光検出器１４０に向かう検出光路ＳＴに紛れ込む懸念はない。
ここで、試料セル１００の傾斜角度βについては、反射光路ＤＴと検出光路ＳＴとを正確に分離するという観点から試料セル１００の支持構造等に応じて適宜選定して差し支えない。
尚、本実施の形態では、セルホルダ１１０は揺動可能なホルダアーム１１２を用いた態様であるが、これに限られるものではなく、例えば恒温槽１１５を構成するヒータ付き加温ブロックに試料セル１００の収容部、レーザ光源１３１あるいは後方散乱光検出器１４０に通じる光路を設けるなど、加温ブロックそのものをセルホルダとして利用するようにしてもよい。

【0042】

＜焦点調整手法＞
本実施の形態では、光学系１３０で用いられる結像レンズ１３５，１４２の焦点調整は以下のように設定されている。
結像レンズ１３５は、レーザ光源１３１からの照射光Ｂｍが試料セル１００の周壁を通過した直後の位置を入射焦点位置Ｑ_１として収束するようになっている。ここで、入射焦点位置Ｑ_１と照射光Ｂｍが入射する試料セル１００の周壁表面位置との間の距離をｇ（図８（ａ）参照）とすれば、ｇは試料セル１００の周壁の肉厚寸法より大きく、かつ、試料セル１００の内壁面に近接するという条件で適宜選定するようにすればよい。例えば外径１１．８ｍｍで肉厚０．７ｍｍの試料セル１００である場合、ｇは１．０〜２．５ｍｍの範囲で選定するようにすればよい。詳細は実施例２にて後述する。
また、結像レンズ１４２は、後方散乱光検出器１４０に向かう照射光Ｂｍ_２が後方散乱光検出器１４０の検出面を共役焦点位置Ｑ_２として収束するようになっている。

【0043】

＜データ解析装置＞
図５及び図６において、符号１６０は後方散乱光検出器１４０からの検出出力を取り込み、例えば図９に示すデータ解析処理を実行するデータ解析装置、符号１７０はデータ解析装置１６０で解析された解析結果を表示するディスプレイである。
このデータ解析装置１６０はＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、Ｉ／Ｏインターフェースなどを含むコンピュータシステムにて構成されており、例えばＲＯＭ内に図９に示すデータ解析処理プログラムを予め格納しておき、後方散乱光検出器１４０からの検出出力に基づいてＣＰＵにてデータ解析処理プログラムを実行するものである。
尚、後方散乱光検出器１４０からの検出出力は例えば図示外の増幅器により電流電圧変換された後、ＡＤ変換器によりＡＤ変換され、データ解析装置１６０に取り込まれる。

【0044】

次に、本実施の形態に係るゲル粒子測定装置の作動について説明する。
本実施の形態において、図５及び図６に示すように、予め試薬Ｒが収容された試料セル１００にエンドトキシンを含む試料Ｓを注入した後、図示外のスタートスイッチをオン操作すると、ゲル粒子測定装置による測定シーケンスが開始される。
この測定シーケンスは、撹拌駆動装置１２０にて撹拌棒１２１が回転され、試料セル１００内の試料Ｓ及び試薬Ｒからなる混合溶液Ｗを撹拌する。このため、混合溶液Ｗ全体が均一に撹拌されると共に、混合溶液Ｗ全体としてはゲル化することが抑制される。
更に、測定シーケンスは、レーザ光源１３１からコヒーレントな光Ｂｍを試料セル１００内の混合溶液Ｗに照射し、混合溶液Ｗ中で散乱した光のうちレーザ光源１３１側の方向に向かう後方散乱光成分を後方散乱光検出器１４０にて検出すると共に、後方散乱光検出器１４０の検出出力をデータ解析装置１６０に取り込む。
このとき、レーザ光源１３１からの照射光Ｂｍは、図５及び図８（ａ）に示すように、コリメータレンズ１３２、プリズム型ミラー１３３を経た後に試料セル１００に向けて光軸変換され、しかる後に、ピンホール１３４にて外径ｄ１（本例ではｄ１＝２ｍｍ）の光束に絞られ、反射ミラー１４１の孔部１４１ａ（孔径ｄ２＞ｄ１：本例ではｄ２＝５ｍｍ）をそのまま通過し、結像レンズ１３５にて試料セル１００の予め決められた入射焦点位置Ｑ_１を収束点として試料セル１００に入射する。

【0045】

ここで、レーザ光源１３１からの照射光Ｂｍが試料セル１００の入射部に入射した状況について補足すると、前述した照射光Ｂｍは、図８（ａ）に示すように、試料セル１００の周壁表面からの反射光Ｂｍ_０と、試料セル１００の周壁を屈折入射して試料セル１００内の混合溶液Ｗに入射する透過光Ｂｍ_１とに分かれる。尚、試料セル１００の周壁表面にて一部散乱する光成分もある。
この状態において、試料セル１００内の混合溶液Ｗ中にゲル粒子Ｇが生成されたとすると、透過光Ｂｍ_１はゲル粒子Ｇに当たって散乱し、その散乱光のうち後方散乱光Ｂｍ_２成分が試料セル１００の周壁の入射部側に戻り、主として透過光Ｂｍ_１の入射経路と同じ経路を経て照射光路ＡＴと同じ領域にある検出光路ＳＴへと出射される。
一方、試料セル１００の周壁表面での反射光Ｂｍ_０は、図８（ａ）（ｂ）に示すように、反射光路ＤＴに沿って反射されるが、この反射光路ＤＴは、水平面において検出光路ＳＴとは２αの角度を持ち、しかも、鉛直面において検出光路ＳＴとは２βの角度を持つため、反射光路ＤＴは検出光路ＳＴ（本例では照射光路ＡＴと同じ経路を含む）とは全く異なる方向に向かうものである。このため、試料セル１００の周壁表面で反射された反射光Ｂｍ_０成分が検出光路ＳＴに向かう後方散乱光Ｂｍ_２成分と渾然一体に紛れ込む懸念は全くない。

【0046】

このように、ゲル粒子Ｇからの後方散乱光Ｂｍ_２は、検出光路ＳＴを通じて後方散乱光検出器１４０へ向かうことになるが、ゲル粒子Ｇが結像レンズ１３５の入射焦点位置若しくはその付近で生成されたとすると、試料セル１００から出射した後方散乱光Ｂｍ_２はゲル粒子Ｇを起点として拡散放射することになり、レーザ光源１３１からの照射光Ｂｍの光束よりも広い光束になって結像レンズ１３５に到達する。そして、結像レンズ１３５に到達した後方散乱光Ｂｍ_２は結像レンズ１３５を通過することで略平行な結像レンズ１３５の口径に略対応した外径ｄ３（ｄ３＞＞ｄ１）の光束に変化した後、反射ミラー１４１に至り、反射ミラー１４１にて略９０°の光軸変換した後に、後方散乱光検出器１４０に向かう。
この状態において、後方散乱光Ｂｍ_２の検出光路ＳＴは照射光Ｂｍの照射光路ＡＴの途中から分離されるため、後方散乱光検出器１４０はレーザ光源１３１や反射ミラー１４１よりもレーザ光源１３１側にある光学部品（コリメータレンズ１３２、プリズム型ミラー１３３）とは無関係な場所に設置することが可能である。尚、反射ミラー１４１には孔部１４１ａが設けられているため、後方散乱光Ｂｍ_２の一部は孔部１４１ａを通じて損失することになるが、後方散乱光Ｂｍ_２が反射される反射ミラー１４１の反射面は孔部１４１ａに比べて十分に広いため、後方散乱光Ｂｍ_２の損失量は極わずかである。

【0047】

この後、反射ミラー１４１で反射された後方散乱光Ｂｍ_２は結像レンズ１４２に至り、結像レンズ１４２にて後方散乱光検出器１４０の検出面を共役焦点位置Ｑ_２として収束する。このため、入射焦点位置Ｑ_１若しくはその近傍に位置するゲル粒子Ｇからの後方散乱光Ｂｍ_２は後方散乱光検出器１４０の検出面にピントの合った状態で結像される。
ここで、後方散乱光検出器１４０の出力例を図１０（ａ）に示す。
同図において、ゲル粒子Ｇからの後方散乱光Ｂｍ_２は後方散乱光検出器１４０の検出面の略中央にピントが合った状態で出力される。また、試料セル１００表面からの乱反射光のごく一部は検出光路ＳＴに紛れ込むことはあり得るが、試料セル１００表面は結像レンズ１３５の入射焦点位置Ｑ_１とは距離ｇだけ離れているため、後方散乱光検出器１４０の検出面では試料セル１００表面からの乱反射光Ｂｍ_２’成分はゲル粒子Ｇからの後方散乱光Ｂｍ_２からは離れた箇所にピントが合っていない状態で出力される。
また、図１０（ａ）に示す出力例について、散乱光強度分布を測定したところ、図１０（ｂ）に示す結果が得られた。同図によれば、ゲル粒子Ｇからの後方散乱光Ｂｍ_２成分は、試料セル１００表面からの乱反射光Ｂｍ_２’成分に比べて強い強度を示すため、仮に、試料セル１００表面からの乱反射光Ｂｍ_２’成分が紛れていたとしても、これを除外して、ゲル粒子Ｇからの後方散乱光Ｂｍ_２を検出することは可能である。

【0048】

一方、試料セル１００内の混合溶液Ｗ中では、リムルス試薬にエンドトキシンの刺激が伝わり、図３に示すようなリムルス反応が起こり、混合溶液Ｗ全体のゲル化が抑制された状態で、ゲル粒子Ｇが順次生成されていく。
本実施の形態では、レーザ光源１３１からのコヒーレントな光Ｂｍの通過面積内にゲル粒子Ｇが例えば１個生成されたときに、混合溶液Ｗがゾル相からゲル相に変化する相変化点のタイミングにつながるゲル粒子Ｇの生成開始時点として把握されるものである。
このような反応過程において、データ解析装置１６０は、例えば図９に示すように、後方散乱光検出器１４０からの検出出力を散乱光量データ（デジタルデータ）として読み込んだ後、平均化・フィルタリング化処理を行って散乱光量データの変動成分を計測する。
次いで、散乱光量データの変動成分に基づいて、後方散乱光検出器１４０にて検出された散乱光量データの増加変化点（図２（ｃ）II工程Ｐ_２に相当）を抽出し、予め規定されている検量線を参照することによって試料Ｓのエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）を決定し、ディスプレイ１７０に表示する。
本例では、検量線は、エンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）と散乱光量データの増加変化点に至るまでの時間閾値との関係を示すものであり、散乱光量データの増加変化点に至る時間と検量線との相関に基づいてエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）が決定される。また、ディスプレイ１７０にはエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）以外に、散乱光量データの時系列データ、散乱光量データの変動成分の時系列計測データなどのデータが切り換え表示されるようになっている。

【0049】

＜検量線の作成例＞
ここで、本実施の形態で採用された検量線の作成例について説明する。
本実施の形態１に係るゲル粒子測定装置を用い、予め決められた実験条件を例えば以下のように定め、様々なエンドトキシン濃度（例えば１０・１・０．１ｐｇ／ｍｌ）のサンプル試料を添加したときのリムルス試薬に対して、ゲル粒子測定装置で後方散乱光検出器１４０による散乱光強度（散乱光量データ）の変化を調べたものである。
本例で用いられる実験条件は以下の通りである。
・レーザ光源１３１：赤色光又は青色光
・後方散乱光検出器１４０：フォトダイオード
・撹拌棒（スターラーバー）１２１の回転数：１０００ｒｐｍ
・恒温条件：３７℃
図１１（ａ）は、エンドトキシン濃度１０ｐｇ／ｍｌ、１ｐｇ／ｍｌ、０．１ｐｇ／ｍｌのサンプル試料に対する散乱光強度につき夫々の時間経過を追ってプロットしたものである。尚、図１１（ａ）の縦軸は散乱光強度Ｕ（グラフ中の最大散乱光強度スケールをＵｙで表記）、横軸は反応時間（グラフ中の最大反応時間スケールをｔｘ［例えば１００ｍｉｎ］で表記）を示す。
同図において、各条件の散乱光強度の変化は、いずれも略０の一定のレベルを維持する部分がある時間になって増加する傾向を示している。この散乱光強度の増加変化点はゲル粒子Ｇの生成開始時点（エンドトキシンを含むサンプル試料がゾル相からゲル相へと相変化するタイミング）に相当し、ゲル化開始時による増光を意味するものと想定される。
このゲル化開始時を求めるために、本実施の形態では、図１１（ａ）のグラフにおいて、マニュアルで、一定散乱光強度の部分を近似した直線（通常は０）と散乱光強度が増加傾斜していく変化部分を近似した直線との交点を求め、夫々ゲル化開始時間（反応時間）ｔ（１０）、ｔ（１）、ｔ（０．１）を求めた。
更に、本実施の形態では、図１１（ａ）のグラフから求めたゲル化開始時間ｔ（１０）、ｔ（１）、ｔ（０．１）の値を用いて検量線を作成するようにした（図１１（ｂ）参照）。
図１１（ｂ）において、検量線は、Ｘ軸をエンドトキシン濃度であるＥＴＸ濃度（ｌｏｇ変換）、Ｙ軸をゲル化開始時間として各ゲル化開始時間の値をプロットし、これらの値に対して最小自乗法による直線を描くことで求められるものである。このとき、各エンドトキシン濃度のサンプル試料に対するゲル化開始時間の値には直線関係が得られ、相関係数の高い相関が示される。

【0050】

本実施の形態では、試料セル１００はそれ自体又はその周囲に別途工夫を施していないが、これに限られるものではなく、以下のような変形の形態１，２のような構成を採用しても差し支えない。
◎変形の形態１，２
変形の形態１，２では、試料セル１００は、混合溶液Ｗ中で後方散乱光検出器１４０に向かう後方散乱光Ｂｍ_２成分以外の透過又は試料セル１００内壁での散乱で生ずる迷光成分が除去させられる迷光除去部材１５０を備えている。
変形の形態１では、迷光除去部材１５０は、例えば図１２（ａ）に示すように、試料セル１００の周囲を囲繞するように筒状カバー１５１を設置し、この筒状カバー１５１の内面を例えば黒色の光吸収材で覆うと共に、筒状カバー１５１の一部にはレーザ光源１３１からの照射光Ｂｍ及び後方散乱光検出器１４０に向かう後方散乱光Ｂｍ_２が通過する通孔１５２を開設するようにしたものである。
尚、本変形の形態では、試料セル１００は透過性のある材料にて構成されているが、試料セル１００内の混合溶液Ｗ中での光の透過をほとんど求めないため、試料セル１００のうちレーザ光源１３１からの照射光Ｂｍ及び後方散乱光検出器１４０への後方散乱光Ｂｍ_２が通過する箇所に対応した一部だけを透過性を有する入射部とし、試料セル１００の他の部位については非透過性の材料で構成したり、あるいは、非透過性の塗料を塗布するようにしてもよい。
更に、変形の形態２では、迷光除去部材１５０は試料セル１００の外部に設ける態様に限られるものではなく、例えば図１２（ｂ）に示すように、試料セル１００の内壁周面に迷光除去部材１５０として微小粗面１５５を形成し、この微小粗面１５５にてレーザ光源１３１から照射された照射光Ｂｍのうち迷光成分を乱反射させることで減衰させるようにしてもよい。
尚、本変形の形態では、迷光除去部材１５０を設けているが、必ずしも迷光除去部材１５０を用いる必要はなく、例えば予め迷光成分がどの程度影響するかを既知のエンドトキシン濃度のサンプル試料を用いて実測し、この実測値に基づいて例えば後方散乱光検出器１４０による検出出力から実測した迷光成分を補正するようにしてもよい。

【0051】

◎変形の形態３，４
本実施の形態では、試料セル１００の入射部表面の調整に関し、光路調整手法１，２を採用しているが、これに限られるものではなく、以下のような変形の形態３，４の光路調整手法３を採用してもよい。
先ず、変形の形態３では、光路調整手法３は、図１３（ａ）（ｂ）に示すように、例えば試料セル１００が断面円形状の筒状容器１０１を有する態様において、レーザ光源１３１からの照射光Ｂｍが入射される入射部に予め反射面１８０を成形し、その反射面１８０にて反射された反射光Ｂｍ_０の反射光路ＤＴが後方散乱光検出器１４０に向かう後方散乱光Ｂｍ_２の検出光路ＳＴとは異なるようにしてもよい。ここで、反射面１８０の角度については反射光路ＤＴに反射された反射光Ｂｍ_０が検出光路ＳＴに紛れ込まないように選定すればよい。
尚、本例において、光路調整手法１又は２を適宜組み合わせてもよいことは勿論である。
また、変形の形態４では、光路調整手法３は、例えば図１３（ｃ）（ｄ）に示すように、断面矩形状の筒状容器１８１を有する態様において、レーザ光源１３１からの照射光Ｂｍが入射される入射部に予め反射面１８０を成形し、その反射面１８０にて反射された反射光Ｂｍ_０の反射光路ＤＴが後方散乱光検出器１４０に向かう後方散乱光Ｂｍ_２の検出光路ＳＴとは異なるようにしてもよい。
尚、本例においては、光路調整手法３に加えて光路調整手法２を組み合わせてもよい。

【0052】

◎実施の形態２
図１４は実施の形態２に係るゲル粒子測定装置の全体構成を示す。
同図において、ゲル粒子測定装置の基本的構成は、実施の形態１と略同様であるが、実施の形態１と異なる光学系１３０を備えている。尚、実施の形態１と同様な構成要素については実施の形態１と同様な符号を付してここではその詳細な説明を省略する。
本実施の形態において、ゲル粒子測定装置は、実施の形態１と同様な試料セル１００、撹拌駆動装置１２０を備えている。
更に、光学系１３０は、実施の形態１と同様に、レーザ光源１３１、コリメータレンズ１３２、プリズム型ミラー１３３、ピンホール１３４、結像レンズ１３５、後方散乱光検出器１４０及び反射ミラー１４１（孔部１４１ａを具備）を備えているが、実施の形態１と異なり、反射ミラー１４１と後方散乱光検出器１４０との間の検出光路ＳＴ中に、複数（本例では３つ）の結像レンズ１４４〜１４６を配置し、第１の結像レンズ１４４と第２の結像レンズ１４５との間に孔径ｄ４のピンホール１４７を配置したものである。
そして、本例では、ピンホール１４７の孔径ｄ４（図１５（ａ）参照）は十分に小さい値、例えば１ｍｍ以下、好ましくは０．５ｍｍ以下のものが使用されている。
第１の結像レンズ１４４は、反射ミラー１４１にて反射された後方散乱光Ｂｍ_２をピンホール１４７位置（ピンホール１４７の光軸位置に相当）を共役焦点位置Ｑ_２１として収束するようにしたものである。
更に、第２の結像レンズ１４５は、共役焦点位置Ｑ_２１との間の距離を焦点距離とするもので、ピンホール１４７を通過した後方散乱光Ｂｍ_２を入射して平行光として出射させるものである。
更にまた、第３の結像レンズ１４６は、第２の結像レンズ１４５を通過した後方散乱光Ｂｍ_２を後方散乱光検出器１４０の検出面を共役焦点位置Ｑ_２２として収束するようにしたものである。

【0053】

本実施の形態によれば、ゲル粒子測定装置は実施の形態１と略同様に作動し、試料セル１００内のゲル粒子Ｇからの後方散乱光Ｂｍ_２は、結像レンズ１３５を経て平行光になり、反射ミラー１４１にて光軸変換され、後方散乱光検出器１４０に向かうことになるが、この後の作動が実施の形態１と異なる。
つまり、反射ミラー１４１にて反射された平行な後方散乱光Ｂｍ_２は、第１の結像レンズ１４４を通過してピンホール１４７位置を共役焦点位置Ｑ_２１として収束する。このとき、試料セル１００の入射焦点位置Ｑ_１若しくはこの近傍に生成されたゲル粒子Ｇからの後方散乱光Ｂｍ_２成分は、図１５（ａ）に示すように、ピンホール１４７の孔部１４７ａ（孔径ｄ４）位置で一旦結像することから、ピンホール１４７を通過する。しかしながら、例えば試料セル１００表面からの乱反射光のごく一部が検出光路ＳＴに紛れ込んだとしても、試料セル１００表面と入射焦点位置Ｑ_１との間が距離ｇだけ離れているため、試料セル１００表面からの乱反射光Ｂｍ_２’成分がピンホール１４７を通過することはできず、ピンホール１４７にて除去される。
この後、ピンホール１４７を通過した後方散乱光Ｂｍ_２成分は、第２の結像レンズ１４５にて平行光になり、第３の結像レンズ１４６を経て後方散乱光検出器１４０の検出面を共役焦点位置Ｑ_２２として収束する。このため、入射焦点位置若しくはその近傍に位置するゲル粒子Ｇからの後方散乱光Ｂｍ_２は後方散乱光検出器１４０の検出面にピントの合った状態で結像される。このとき、後方散乱光検出器１４０の出力例としては、図１５（ｂ）に示すように、ゲル粒子Ｇからの後方散乱光Ｂｍ_２は後方散乱光検出器１４０の検出面にピントが合った状態で画像Ｉｍとして出力され、試料セル１００表面からの乱反射光Ｂｍ_２’成分はピンホール１４７にて除去されることから、これが検出面に出力されることはない。
このため、本実施の形態によれば、実施の形態１に比べて、ゲル粒子Ｇからの後方散乱光Ｂｍ_２をより正確に検出することが理解される。

【0054】

◎実施の形態３
図１６は本発明が適用されたゲル粒子測定装置の実施の形態３の要部を示す。尚、実施の形態１と同様な構成要素については、実施の形態１と同様な符号を付し、その詳細な説明は省略する。また、図１６では、図６に図示したセルホルダ１１０やヒータ１１６は省略した。
同図において、ゲル粒子測定装置は、実施の形態１と略同様な試料セル１００、撹拌駆動装置１２０及び光学系１３０を備えているが、実施の形態１と異なり、試料セル１００の外部で例えば試料セル１００を挟んで後方散乱光検出器（第１の散乱光検出器に相当）１４０とは反対側に第２の散乱光検出器１９０を設置し、第１の散乱光検出器１４０のみならず、第２の散乱光検出器１９０の検出出力をデータ解析装置１６０に取込み、第１の散乱光検出器１４０による検出出力に基づいて実施の形態１と同様にゲル粒子Ｇの生成開始時点を判別すると共に、第２の散乱光検出器１９０による検出出力（前方散乱光出力）に基づいてゲル粒子Ｇの生成開始時点以外のゲル粒子Ｇの生成状態情報（例えばゲル粒子Ｇの生成量など）を判別するようにしたものである。
本例では、第２の散乱光検出器１９０において、後方散乱光成分以外の散乱光成分を検出するようにしているが、第２の散乱光検出器１９０には例えば透過光成分も合わせて検出される可能性があるため、データ解析にあたり、第２の散乱光検出器１９０の検出対象として透過光成分を除去したいという要請がある場合には、散乱光成分と透過光成分とは位相がずれることを利用して偏向フィルタ１９１を設置し、透過光成分を除去するようにすればよい。
また、このような偏向フィルタ１９１を用いない場合には、第２の散乱光検出器１９０は透過光成分が含まれた散乱光成分を検出することになるが、データ解析装置１６０側で透過光成分が含まれることを考慮して散乱光成分を解析するようにしてもよいし、あるいは、データ解析装置１６０側で透過光成分を除去するように補正した後に散乱光成分を解析するようにしてもよい。
尚、第２の散乱光検出器１９０は基本的に散乱光成分を単独若しくは透過光成分と共に検出するものであるが、例えば散乱光成分除去用の偏向フィルタを介在させるようにすれば、散乱光成分を含まない透過光成分だけを解析することも可能である。

【0055】

また、本例では、第１の散乱光検出器１４０による検出出力を用いてゲル粒子Ｇの生成開始時点を判別し、第２の散乱光検出器１９０を用いてゲル粒子Ｇの生成開始時点以外のゲル粒子Ｇの生成状態情報を判別するようにしているが、これに限られるものではなく、第１の散乱光検出器１４０及び第２の散乱光検出器１９０の両方の検出出力を用いてゲル粒子Ｇの生成開始時点以外のゲル粒子Ｇの生成状態情報を判別するようにしてもよい。この場合、第１の散乱光検出器１４０及び第２の散乱光検出器１９０の検出出力の差分情報を用いることにより、例えば散乱光と試料に由来する非特異的な濁度の増加や迷光の発生、または、試料溶媒に由来する散乱光の吸収による減衰の度合から試料溶媒の性質が検量出来ることになり、ゲル粒子Ｇの生成状態情報をより細かく解析することが可能である。
尚、本実施の形態では、第２の散乱光検出器１９０は、第１の散乱光検出器１４０に対して試料セル１００の反対側に設置されているが、これに限られるものではなく、第２の散乱光検出器１９０の設置箇所は第１の散乱光検出器１４０と異なる部位であれば任意の部位に設置して差し支えない。例えば第１の散乱光検出器１４０に対して試料セル１００の周囲方向に９０°偏倚した部位に設置するようにすれば、図４（ｂ）に示す側方散乱光を検出することが可能である。

【実施例】

【0056】

◎実施例１
実施例１は、実施の形態１に係るゲル粒子測定装置を用い、水又は全血溶液に既知濃度のエンドトキシンを添加した試料サンプルを複数用意し、各試料サンプルのエンドトキシン濃度と、測定されたゲル化開始時間との関係を調べたものである。
また、比較例１は、実施例１の性能評価を行うために、実施の形態３に係るゲル粒子測定装置の第２の散乱光検出器１９０のみを用い、実施例１と同様な各試料サンプルのエンドトキシン濃度と、測定されたゲル化開始時間との関係を調べたものである。
結果を図１７に示す。
ＢＳ（後方散乱検出方式）が実施例１の結果を、ＦＳ（前方散乱検出方式）が比較例１の結果である。尚、同図において、横軸はエンドトキシン濃度（ＥＴＸ濃度）ｐｇ／ｍｌ、縦軸はゲル化開始時間（ｍｉｎ）を示す。
同図によれば、実施例１の方が比較例１に比べて優位な測定結果を示した。
特に、その傾向はエンドトキシンが高濃度である場合よりも低濃度側で顕著であった。
その理由として考えられることは、エンドトキシンが低濃度側になるほどコアグリン産出速度が低下し、ゲル粒子形成に到達する時間が延び、かつ、ゲル粒子形成開始後の粒子成長が同様に遅れてくることで、検出までの時間が対数変化的に遅れることに由来する。
本実施例では、後方散乱検出方式を採用したため、ごく初期に生成されるゲル粒子を捉えられるが、比較例１の前方散乱検出方式では、後方散乱検出方式で検出可能なサイズから前方散乱検出方式で検出可能なサイズに至るまで対数的な反応変化を伴う更なるゲル粒子の成長が必要になり、しかも、エンドトキシンの低濃度域での反応は遅いため、ゲル化開始時間の検出までの差は対数的に遅れ、グラフ上平行な反応曲線として捉えられたと推測される。
例えば比較例１と実施例１との検出時間の差を実際にエンドトキシン濃度１０ｐｇ／ｍｌ前後で比較すると、数分の差であるが、極低濃度域０．０１ｐｇ／ｍｌでは、実施例１の方が６０から８０分の差として短縮された状態で現れ、迅速測定を目指すゲル粒子測定方法としてその優位性が明らかになった。

【0057】

◎実施例２
実施例２は、実施の形態１に係るゲル粒子測定装置を用い、図５に示す光学系１３０の結像レンズ１３５の入射焦点位置Ｑ_１と試料セル１００表面との位置関係（距離ｇ）を０．５ｍｍずつ変化させ、それぞれの場合における後方散乱光検出器１４０の検出結果を調べたものである。
試験条件
試料セル１００：外径１１．８ｍｍの円筒ガラス管（厚み０．７ｍｍ）
試料セル１００の入射部表面の調整量：ｙ＝２．５ｍｍ、β＝５°
試料サンプルのエンドトキシン濃度：１０．０ｐｇ／ｍｌ
レーザ光源１３１：照射強度１０ｍＷ（６２０ｎｍ）
ピンホール１３４：孔径２ｍｍ
結像レンズ１３５：焦点距離３０ｍｍ
反射ミラー１４１：孔径５ｍｍ
結像レンズ１４２：焦点距離１５０ｍｍ
結果を図１８〜図２０に示す。
図１８（ａ）はｇ＝０ｍｍ、つまり、結像レンズ１３５の入射焦点位置Ｑ_１が試料セル１００表面である条件での後方散乱光検出器１４０の出力例を示し、同（ｂ）はその散乱光強度分布を示す。
図１８（ｃ）はｇ＝０．５ｍｍの条件での後方散乱光検出器１４０の出力例を示し、同（ｄ）はその散乱光強度分布を示す。
図１９（ａ）はｇ＝１．０ｍｍの条件での後方散乱光検出器１４０の出力例を示し、同（ｂ）はその散乱光強度分布を示す。
図１９（ｃ）はｇ＝１．５ｍｍの条件での後方散乱光検出器１４０の出力例を示し、同（ｄ）はその散乱光強度分布を示す。
図２０（ａ）はｇ＝２．０ｍｍの条件での後方散乱光検出器１４０の出力例を示し、同（ｂ）はその散乱光強度分布を示す。

【0058】

図１８（ａ）（ｂ）によれば、結像レンズ１３５の入射焦点位置Ｑ_１が試料セル１００表面にある場合には、後方散乱光検出器１４０の出力例は散乱光強度の強い幅広の検出信号になっており、ゲル粒子からの後方散乱光成分の他に、試料セル１００表面からの乱反射光成分が含まれており、後方散乱光成分を試料セル１００表面からの乱反射光成分から分離して検出することは困難である。
また、図１８（ｃ）（ｄ）によれば、ｇ＝０．５ｍｍ（結像レンズ１３５の入射焦点位置Ｑ_１が試料セル１００の周壁内）の場合には、後方散乱光検出器１４０の出力例は散乱光成分が強くリング状に拡散した検出信号として得られる。本例の場合には、例えばゲル粒子からの後方散乱光成分の他に、試料セル１００表面からの乱反射光成分が含まれており、これら両者の散乱光成分を分離してゲル粒子からの後方散乱光成分を検出することは難しい。
更に、図１９（ａ）（ｂ）によれば、ｇ＝１．０ｍｍの場合には、後方散乱光検出器１４０の出力例は検出面の略中央にゲル粒子からの後方散乱光成分が強い強度分布の検出信号として得られ、その周辺の一部には試料セル１００表面からの乱反射光成分がごく弱い強度の検出信号として後方散乱光成分とは分離した状態で見受けられる。本例の場合には、結像レンズ１３５の入射焦点位置Ｑ_１が試料セル１００の周壁の直後であるため、入射焦点位置Ｑ_１若しくはその近傍で生成されたゲル粒子からの後方散乱光成分が後方散乱光検出器１４０の検出面にピントが合った状態で結像されていることが理解される。
よって、本例の場合には、後方散乱光検出器１４０によってゲル粒子からの後方散乱光成分が正確に検出されたものと言える。
また、図１９（ｃ）（ｄ）によれば、ｇ＝１．５ｍｍの場合には、後方散乱光検出器１４０の出力例は検出面の略中央にゲル粒子からの後方散乱光成分がｇ＝１．０ｍｍの場合よりも広い散乱光幅をもって分散した強度分布の検出信号として得られ、その周辺の一部には試料セル１００表面からの乱反射光成分がごくごく弱い強度の検出信号として後方散乱光成分とは分離した状態で見受けられる。つまり、本例の場合には、結像レンズ１３５の入射焦点位置Ｑ_１が試料セル１００の内壁直後から少し離れた態様になるため、試料セル１００の内壁直後でゲル粒子が生成された場合には、当該ゲル粒子からの後方散乱光成分が後方散乱光検出器１４０の検出面には幾分ピントがずれた状態で検出されているものと推測される。
更に、図２０（ａ）（ｂ）によれば、ｇ＝２．０ｍｍの場合には、後方散乱光検出器１４０の出力例は、ｇ＝１．５ｍｍの場合と略同様な検出信号として得られるが、ゲル粒子からの後方散乱光成分がｇ＝１．５ｍｍの場合よりも更に広い散乱光幅をもって分散した強度分布の検出信号として得られる。
このように、本実施例では、結像レンズ１３５の入射焦点位置Ｑ_１が試料セル１００の表面又は周壁内にあるときは、後方散乱光検出器１４０には乱反射光成分の検出信号が発生してゲル粒子からの後方散乱光成分を検出することが困難であるが、結像レンズ１３５の入射焦点位置Ｑ_１が１．０ｍｍ〜２．０ｍｍの場合にはゲル粒子からの後方散乱光成分を試料セル１００の表面からの乱反射光成分と分離した状態で検出することが可能であることが理解される。

【産業上の利用可能性】

【0059】

本発明は、リムルス試薬を用いたエンドトキシンやβ−D−グルカンなどを測定対象とするゲル粒子測定装置を始め、ゲル化反応によってゲル粒子が生成可能な目的物質を測定対象とする測定装置に広く適用される。
例えば血液凝固反応や抗原抗体反応において適用することが可能である。

【符号の説明】

【0060】

１…試料セル，２…撹拌手段，３…光源，４…後方散乱光検出手段（第１の散乱光検出手段），５…光路調整手段，６…計測手段，７…光路分岐部材，８…恒温槽，９…迷光除去手段，１０…表示手段，１１…第２の散乱光検出手段，Ｇ…ゲル粒子，Ｓ…試料，Ｒ…試薬，Ｗ…混合溶液，Ｂｍ…照射光，Ｂｍ_０…反射光，Ｂｍ_１…照射光（入射光、透過光），Ｂｍ_２…後方散乱光，ＡＴ…照射光路，ＤＴ…反射光路，ＳＴ…検出光路，Ｏ…試料セル中心軸，ｍ…照射光の光軸，Ｈ…法線

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】