特許 6373908 キャプチャータグを用いた、三リン酸化オリゴヌクレオチドの精製

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6373908

(24)【登録日】2018年7月27日

(45)【発行日】2018年8月15日

(54)【発明の名称】キャプチャータグを用いた、三リン酸化オリゴヌクレオチドの精製

(51)【国際特許分類】

   C07H 21/02 20060101AFI20180806BHJP

【ＦＩ】

   C07H21/02

【請求項の数】16

【外国語出願】

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2016-149059(P2016-149059)

(22)【出願日】2016年7月28日

(62)【分割の表示】特願2014-501597(P2014-501597)の分割

【原出願日】2012年3月28日

(65)【公開番号】特開2017-8071(P2017-8071A)

(43)【公開日】2017年1月12日

【審査請求日】2016年8月9日

(31)【優先権主張番号】11160032.6

(32)【優先日】2011年3月28日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】506266528

【氏名又は名称】ライニッシェ フリードリッヒ ヴィルヘルムス ウニヴェルジテート ボン

(74)【代理人】

【識別番号】100113376

【弁理士】

【氏名又は名称】南条 雅裕

(74)【代理人】

【識別番号】100179394

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬田 あや子

(74)【代理人】

【識別番号】100185384

【弁理士】

【氏名又は名称】伊波 興一朗

(72)【発明者】

【氏名】ルートヴィヒ ヤノシュ

(72)【発明者】

【氏名】ゴールデック マリオン

(72)【発明者】

【氏名】スプロート ブライアン

【審査官】 神谷 昌克

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５０２９７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０２８２１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５１３３５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第５９８１９８５（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 国際公開第２００９／０１４６１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 LEBEDEV A V，PREPARATION OF OLIGODEOXYNUCLEOTIDE 5'-TRIPHOSPHATES USING SOLID SUPPORT APPROACH，NUCLEOSIDES,NUCLEOTIDES AND NUCLEIC ACIDS，TAYLOR & FRANCIS，２００１年 １月 １日，V20 N4-7，P1403-1409

【文献】 IVAN ZLATEV，EFFICIENT SOLID-PHASE CHEMICAL SYNTHESIS OF 5'-TRIPHOSPHATES OF DNA,RNA AND THEIR ANALOGUES，ORGANIC LETTERS，米国，AMERICAN CHEMICAL SOCIETY，２０１０年 ５月２１日，V12 N10，P2190-2193

【文献】 MARTIN SCHLEE，RECOGNITION OF 5' TRIPHOSPHATE BY RIG-I HELICASE REQUIRES SHORT BLUNT 以下備考，IMMUNITY，２００９年 ７月 １日，V31 N1，P25-34，DOUBLE-STRANDED RNA AS CONTAINED IN PANHANDLE OF NEGATIVE-STRAND VIRUS

【文献】 SPROAT, B. S. et al.，Fast and simple purification of chemically modified hammerhead ribozymes using a lipophilic capture，Nucleic Acids Res，１９９９年，Vol.27, No.8，p.1950-1955

【文献】 BELLER, C. et al.，Helvetica Chimica Acta，２００５年，Vol.88, No.1，p.171-9

【文献】 KARIKO, K. et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications，１９８５年，Vol.128, No.2，p.695-8

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｈ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを調製する方法であって、

【化1】

［ここで、Ｖ_１、Ｖ_３およびＶ_５は、独立に、それぞれの場合において、Ｏ、ＳおよびＳｅから選択されて、
Ｖ_２、Ｖ_４およびＶ_６は、独立に、それぞれの場合において、ＯＨ、ＯＲ^１、ＳＨ、ＳＲ^１、Ｆ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^１、Ｎ（Ｒ^１）_２およびＢＨ_３⁻Ｍ^＋から選択されて、
Ｗ_１は、ＯまたはＳであり、
Ｗ_２は、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲ^２であり、
Ｗ_３は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ^２、ＣＨ_２、ＣＨＨａｌまたはＣ（Ｈａｌ）_２であり、ここで、前記「Ｈａｌ」はハロゲンを示し、
Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、Ｃ_２−６アシルまたは環状基から選択されて、それぞれ、場合により置換されており、
または、ここで２つのＲ^１は、それに結合したＮ原子とともに環を形成してよく、
Ｍ^＋はカチオンであり、
Ｘは、ＮＨ、ＮＲ^３、ＯまたはＳであり、
Ｚは、ＮＨ_２−Ｙ−ＸＨタイプの試薬におけるアミノ基を含む化学物質、クロロホルメート基、脂質残基、または、ビオチン、デスチオビオチン、ハプテンおよび抗原から選択される、非共有結合ペアの第一パートナー（ストレプトアビジン、アビジン、または抗体である、それらの相補結合パートナーに対して結合定数１０^−６ｌ／ｍｏｌまたはそれ未満を有する）である、キャプチャータグを表し、
Ｙは、前記キャプチャータグをＸに連結する結合またはリンカーを表し、および
ＯＮは、少なくとも４つのヌクレオチドビルディングブロックを含む、オリゴヌクレオチドを表す。］
以下のステップ：
（ａ） 式（ＩＩｂ）の化合物を得るために、式（ＩＩａ）の化合物を酸化剤と反応させるステップ、

【化2】

［ここで、Ｖ_１、Ｖ_３、Ｖ_５、Ｖ_４、Ｖ_６、Ｗ_１、Ｗ_２、Ｗ_３、およびＯＮは上記で定義される。］

【化3】

［ここで、Ｖ_１、Ｖ_３、Ｖ_５、Ｖ_２、Ｖ_４、Ｖ_６、Ｗ_１、Ｗ_２、Ｗ_３およびＯＮは上記で定義される。］
（ｂ）式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを含む反応産物を得るために、式（ＩＩｂ）の化合物を、式（ＩＩＩ）のキャプチャータグ剤と反応させるステップ、

【化4】

［ここで、Ｘ、Ｚ、およびＹは上記で定義される。］
および、
（ｃ） ステップ（ｂ）の反応産物を、前記キャプチャータグと相互作用可能なキャプチャー試薬と接触させるステップ、
［ここで、前記キャプチャー試薬は、標準的な逆相クロマトグラフィーの固相、疎水性基に対して親和性を有するクロマトグラフの材料、フッ素化基に対して親和性を有するクロマトグラフの材料、アルキニル部分を含むキャプチャー試薬、アジド部分を含むキャプチャー試薬、ストレプトアビジン、アビジン、および、抗体からなる群から選択され、
ここで、前記の接触させるステップは、前記反応産物中に含まれる他の種からオリゴヌクレオチド（Ｉ）の分離を可能にする条件下で行う。］
を含む、
方法。

【請求項2】

請求項１に記載の方法であって、Ｙが、
（i）ヘテロ原子またはヘテロ原子含有基を含む、アルキレンリンカーまたはアラルキレンリンカー；
（ii）Ｃ＝ＣまたはＣ≡Ｃ結合を含む、アルキレンリンカーまたはアラルキレンリンカー；および、
（iii）ヘテロ原子またはヘテロ原子含有基、および、Ｃ＝ＣまたはＣ≡Ｃ結合、を両方含む、アルキレンリンカーまたはアラルキレンリンカー、
からなる群から選択されるアルキレンリンカー、または、アラルキレンリンカーである、
方法。

【請求項3】

請求項２に記載の方法であって、
前記ヘテロ原子含有基が、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ＝ＯおよびＣ＝Ｓからなる群から選択される、
方法。

【請求項4】

請求項１に記載の方法であって、Ｙが、
（i）ポリ−Ｃ_２−Ｃ_６−アルキレンオキシド；
（ii）ポリ−Ｃ_２−Ｃ_３−アルキレンオキシド；
（iii）数平均分子量が３０〜８００ｇ／ｍｏｌであるリンカー；および、
（iv）［−ＣＨ_２ＣＨＲ^４−Ｏ−］_ｎ（ｎ＝１〜１０、Ｒ^４は、ＨまたはＣ_１−６アルキル）であるリンカー、
からなる群から選択されるポリアルキレンオキシドリンカーである、
方法。

【請求項5】

請求項１に記載の方法であって、
Ｙが、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−［（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）］_３−である、
方法。

【請求項6】

請求項１に記載の方法であって、
Ｚが、コレステリルまたはトコフェリルから選択される脂質残基である、
方法。

【請求項7】

請求項１から６のいずれか１項に記載の方法であって、
三リン酸／三リン酸アナログ基は、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合していることを特徴とする、
方法。

【請求項8】

請求項７に記載の方法であって、
前記三リン酸／三リン酸アナログ基は、オリゴヌクレオチドの５’末端の糖の５’−ＯＨ基に結合していることを特徴とする、
方法。

【請求項9】

請求項１から８のいずれか一項に記載の方法であって、
さらに以下のステップ：
（ｄ） 式（ＩＶ）：

【化5】

［ここでＶ_１、Ｖ_３、Ｖ_５、Ｖ_２、Ｖ_４、Ｖ_６、Ｗ_１、Ｗ_２、Ｗ_３およびＯＮは、請求項１で定義される。］
のオリゴヌクレオチドを得るために、前記キャプチャータグを除去するステップを含むことを特徴とする、
方法。

【請求項10】

請求項１から９のいずれか一項に記載の方法であって、
前記オリゴヌクレオチドは、デゾキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドアナログから選択されることを特徴とする、
方法。

【請求項11】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法であって、
前記オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であることを特徴とする、
方法。

【請求項12】

請求項１１に記載の方法であって、
前記オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、そしてその二本鎖は、その遠位末端でループにより閉環しており、
ここで、前記ループは、ヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド構成要素を含むことを特徴とする、
方法。

【請求項13】

請求項１１または１２に記載の方法であって、
前記オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、そしてその二本鎖は、その近位末端が平滑末端であることを特徴とする、
方法。

【請求項14】

請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法であって、
前記オリゴヌクレオチドは、それに共有結合した細胞特異的な標的物質を含むことを特徴とする、
方法。

【請求項15】

請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記オリゴヌクレオチド（Ｉ）または（ＩＶ）は、ＲＩＧ−１のアクチベーターであることを特徴とする、
方法。

【請求項16】

式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを調製するためのキットであって、

【化6】

［ここで、Ｖ_１、Ｖ_３、Ｖ_５、Ｖ_２、Ｖ_４、Ｖ_６、Ｗ_１、Ｗ_２、Ｗ_３、Ｘ、Ｙ、ＺおよびＯＮは、請求項１から１５のいずれか一項に定義される。］
前記キットが：
（ａ） 式（ＩＩＩ）のキャプチャータグ剤、

【化7】

［ここで、Ｘ、ＺおよびＹは、請求項１から１５のいずれか一項に定義される。］
および、
（ｂ）請求項１〜１５のいずれかにおいて定義されるキャプチャータグと相互作用可能なキャプチャー試薬、
を含むことを特徴とする、
キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、キャプチャータグを用いた、三リン酸修飾オリゴヌクレオチドを調製する方法に関する。その方法は、医薬用途に適切な高い収率および純度での、三リン酸修飾オリゴヌクレオチドの合成および精製を可能にする。

【背景技術】

【0002】

Ｓｃｈｌｅｅら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００９、３１、２５−３４）は、一方の鎖に５’−Ｏ−三リン酸部分を有する平滑末端二本鎖ＲＮＡを示し、それは、ＲＩＧ−Ｉヘリカーゼを結合することにより、免疫系の強力な刺激として作用する。このように、高純度で、医薬用途に適切な三リン酸修飾オリゴヌクレオチドを調製するための、簡単で効率的な方法を提供する必要がある。

【0003】

三リン酸基またはそのアナログの、ヌクレオシド化合物の５’−ＯＨ基への結合は、当技術分野でよく知られている。Ｌｕｄｗｉｇ Ｊ．ら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、５４、６３１−６３５）は、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンをホスファイト化剤として使用してヌクレオシドの５’−Ｏ−三リン酸およびアナログを調製するための、溶液三リン酸化の方法（ａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を開示する。Ｇａｕｒ Ｒ．Ｋ．ら（１９９２、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３３、３３０１−３３０４）は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド５’−Ｏ−三リン酸およびそのＰ_α−チオアナログの合成のための、固相上での前記方法の使用を示す。米国特許第６，９００，３０８号は、潜在的な抗ウイルス化合物としての修飾ヌクレオシド５’−Ｏ−三リン酸の固相合成を開示し、そして、米国特許第７，２８５，６５８号、第７，５９８，２３０号、および第７，８０７，６５３号は、糖中に、核酸塩基中に、および三リン酸物質中に修飾を有する、ヌクレオシドの三リン酸アナログを開示する。

【0004】

ＷＯ９６／４０１５９は、キャップ化ＲＮＡまたはＲＮＡアナログ分子を生産するための方法を示し、ここで、ＲＮＡまたはＲＮＡアナログオリゴヌクレオチドは、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンまたはその環置換誘導体のようなホスファイト化剤と反応する。結果として生じる中間体は、リン酸またはピロリン酸、または、それらの塩と反応し、酸化または加水分解される。ニリン酸化または三リン酸化ＲＮＡまたはＲＮＡアナログは、活性化ｍ^７Ｇ三リン酸、二リン酸または一リン酸またはアナログと反応することによりキャップ化される。

【0005】

ＷＯ２００９／０６０２８１は、修飾オリゴリン酸部分を含む免疫刺激オリゴリボヌクレオチドアナログ、および、そのような化合物の調製のための方法を示す。この方法は、固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成を含み、適切な溶媒中および塩基存在下で、オリゴヌクレオチドの５’末端でヌクレオチドを２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンのようなホスファイト化剤と反応させて、ホスファイト化オリゴヌクレオチドをピロリン酸またはピロリン酸アナログと反応させて、オリゴヌクレオチドを酸化剤で酸化して、そして、前記オリゴヌクレオチドを脱保護して、三リン酸または三リン酸アナログ修飾オリゴヌクレオチドを生じさせる。

【0006】

ＷＯ９６／４０１５９で用いられるようなポリアクリルアミドゲル電気泳動は、小スケールの分離にのみ適用可能である。より長いオリゴリボヌクレオチドの、５’一リン酸化、二リン酸化、三リン酸化産物に関するイオン交換クロマトグラフィーの分離能は、制限される。要求される変性条件が、分離を煩わしい作業にして（Ｓｐｒｏａｔ、１９９９；Ｚｌａｔｅｖ、２０１０；ＷＯ２００９／０６０２８１）、さらに、産物は通常、ｎ−１、ｎ−２配列が混入しており、そして、それらの一リン酸および二リン酸は、不十分な純度をもたらす。ＲＩＧ−Ｉリガンドの正確な末端構造に対する感受性があるとすれば、これらの精製方法は、薬理学的適用に準最適であろう。

【0007】

二重の標的ストラテジー（ｓｉＲＮＡおよびＲＩＧリガンド）は、一般的な配列非依存性の精製方法を必要とする。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

臨床用途の可能性のために、大スケールで５’−Ｏ−三リン酸化オリゴヌクレオチドおよびそのアナログを生産することが非常に望ましく、そして、便利な調製方法が非常に望ましい。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本願において、固相に結合した完全に保護されたオリゴヌクレオチドの５’−Ｏ−シクロ三リン酸中間体（図１参照）を、デシルアミンなどのキャプチャータグを用いて開環することができ、ＲＮＡの脱保護に安定な直鎖Ｐ_γタグ化種を得ることができることが示される。タグの特質は、キャプチャータグに特異的な試薬への、キャプチャータグ化三リン酸種の特異的な保持を与えるためのものであり、タグを含まない不純物からの容易な分離を可能にする。タグは続いて、必要に応じて除去することができる。その方法は、三リン酸部分のアナログ、例えば、β，γ−メチレン、フルオロメチレン、ジフルオロメチレンおよび、酸素原子を置換するイミノ基などを含むアナログを含むほどに拡張され得る。

【0010】

キャプチャータグ化方法の利点は、所望の種の改善された回収および単純な精製であり、例えばこれは、室温でＲＰ−ＨＰＬＣまたはアフィニティクロマトグラフィーにより、場合によりその後に適切な条件下でキャプチャータグを切断することによる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】キャプチャータグＺとしてデシル残基を用いた、本発明の方法の略概観を示す。

【図2】ｎ−デシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡ中間体を介した、ｐｐｐＲＮＡのＲＰ−ＨＰＬＣ精製を示す。 （Ａ）６５％のｎ−デシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡを含む、未精製反応混合物（ピーク１４分）； （Ｂ）単離されたｎ−デシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡ； （Ｃ）ｐｐｐＲＮＡ；ｐＨ＝３．８、Ｂからの６０分加水分解産物。 図２では、Ｘ軸は時間［分］を意味し、Ｙ軸は２６０ｎｍでの吸光度［ｍＡｕ］を意味する。 Ａでの保持時間１０分におけるブロードピークは、リン酸化されていない２４ｍｅｒの、より短い合成失敗の配列、少量のｐｐｐＲＮＡ加水分解産物、および２４ｍｅｒの５’−Ｈ−ホスホネート誘導体を含む。挿入は、この系におけるｐｐｐＲＮＡおよび５’−ＯＨ ＲＮＡの位置を示す。 カラム：ハミルトンＰＲＰ−１ ４．１×２５０ｍｍ、１０μｍ グラジエント：１−１００ ％ Ｂ ｉｎ １８ ｍｉｎ、Ａ＝０．０５Ｍ ＴＥＡＢ；Ｂ＝８０％メタノール ０．０５Ｍ ＴＥＡＢ

【図3】図２でのＨＰＬＣトレースＡ、ＢおよびＣにそれぞれ対応する、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル（Ｘ軸：質量［Ｄａ］）を示す。 （Ａ）ｎ−デシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡ（２４ｄ）、ｐｐｐＲＮＡ（２４ｃ）、５’−Ｈ−ホスホネートＲＮＡ（２４ｂ）および５’−ＯＨ−ＲＮＡ（２４ａ）の存在を示す、脱塩後の未精製反応混合物から記録されたスペクトル、および、ピーク１２〜２３として示される、より短い合成失敗の配列； （Ｂ）ＨＰＬＣ単離されたｎ−デシル−ＮＨｐｐｐＲＮＡ（Ｂ）から記録されたスペクトル、 （Ｃ）ｎ−デシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡのｐＨ＝３．８加水分解産物の直接のＥｔＯＨ沈殿から得られた、純粋なｐｐｐＲＮＡのスペクトル。

【図4】副産物２４ａ〜ｃの産生を説明する反応スキームを示す。

【図5】ホスホロアミデート結合の酸加水分解を介した、ｎ−デシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡのｐｐｐＲＮＡへの変換に関する経時変化を示す。

【図6】キャプチャータグ除去およびＮａ^＋塩としてのＥｔＯＨ沈殿の後に得られた、２１ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、２７ｍｅｒのｐｐｐＲＮＡ産物の典型的なＭＡＬＤＩスペクトル（Ｘ軸：質量［Ｄａ］）を示す。正確な質量ピークは、ｍ／ｚ ６９１１．６（Ａ）、ｍ／ｚ ７８２８（Ｂ）、ｍ／ｚ ８８０８．１（Ｃ）で観察され、そして、ｍ／ｚ ３４６２（Ａ）、ｍ／ｚ ３９１８（Ｂ）、４４０８（Ｃ）におけるピークは、それぞれ二重荷電ｐｐｐＲＮＡに起因する。同質のスペクトルが、１５〜４２ｍｅｒの範囲で、ヌクレオシドアナログと３’修飾を含む、様々な配列での５０よりも多い例において得られた。

【図7】Ａ：７ｍｍハミルトンＰＲＰ−１カラム上での、デシル−ＮＨｐｐｐＲＮＡ２１ｍｅｒの、１μｍｏｌスケール反応のセミ分取スケールの逆相ＨＰＬＣ精製を示す。 カラム：ハミルトンＰＲＰ−１ ７×２５０ｍｍ、１０μｍ 流速３ｍＬ／分。 グラジエント：１−８０ ％ Ｂ ｉｎ ５０ ｍｉｎ、Ａ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ；Ｂ＝８０％メタノール ０．１Ｍ ＴＥＡＢ。 ＢおよびＣ：セミ分取スケールの逆相ＨＰＬＣ精製を示し、特に、本発明の方法が、どのようにして準最適な合成および／または５’リン酸化の条件を対処することが可能なのかを示す。 全ての図において、Ｘ軸は容量［ｍｌ］であり、Ｙ軸は２６０ｎｍでの吸光度［ｍＡｕ］である。

【図8】特に好ましい、式（Ｉ）の修飾オリゴヌクレオチドを示す。

【図9】化合物Ｆ−ＴＡＧ−ｐｐｐＲＮＡおよびＮ３−ＴＡＧ−ｐｐｐＲＮＡの合成（Ａ）、およびＮ３−ＴＡＧ ＲＮＡを用いた、可逆的共有結合の固定化に関するストラテジー（Ｂ）を示す。

【図10】Ｆ−ＴＡＧ−ｐｐｐＲＮＡ（Ａ）、Ｎ３−ＴＡＧ−ｐｐｐＲＮＡ（Ｂ）のＭＡＬＤＩスペクトルを示す。

【図11】ｐｐｐＲＮＡおよび増加する鎖長のアルキル残基を有するｎ−アルキル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡの、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す： Ａ．ｐｐｐＲＮＡ、ＲＴ＝９．３分 Ｂ．ｎ−デシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡ、ＲＴ＝１３．８分、 Ｃ．ｎ−ドデシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡ、ＲＴ＝１５．５分 Ｄ．ｎ−テトラデシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡ、ＲＴ＝１７．３分 Ｅ．ｎ−オクタデシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡ、ＲＴ＝１９．７分

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明は、オリゴヌクレオチド三リン酸（キャプチャータグを含むそのアナログを含む）の合成および精製を示す。標準的な５’−ＯＨオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製に関して最も広く用いられる方法は、トリチル−ＯＮオリゴヌクレオチドの逆相クロマトグラフィーである。

【0013】

本発明に示される方法は、５’三リン酸化オリゴヌクレオチドに関して同様の有効性を有する現実的な解決案を提供する。

【0014】

このように、本発明の要旨は、式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを調製する方法であって、

【化1】

［ここで、Ｖ_１、Ｖ_３およびＶ_５は、独立に、それぞれの場合において、Ｏ、ＳおよびＳｅから選択されて、
Ｖ_２、Ｖ_４およびＶ_６は、独立に、それぞれの場合において、ＯＨ、ＯＲ^１、ＳＨ、ＳＲ^１、Ｆ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^１、Ｎ（Ｒ^１）_２およびＢＨ_３⁻Ｍ^＋から選択されて、
Ｗ_１は、ＯまたはＳであり、
Ｗ_２は、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲ^２であり、
Ｗ_３は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ^２、ＣＨ_２、ＣＨＨａｌまたはＣ（Ｈａｌ）_２であり、
Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、Ｃ_２−６アシルまたは環状基から選択されて、それぞれ、場合により置換されており、
または、ここで２つのＲ^１は、それに結合したＮ原子とともに環を形成してよく、
Ｍ^＋はカチオンであり、
Ｘは、ＮＨ、ＮＲ^３、ＯまたはＳであり、
Ｚは、キャプチャータグを表し、
Ｙは、前記キャプチャータグをＸに連結する結合またはリンカーを表し、および
ＯＮは、少なくとも４つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログビルディングブロックを含む、オリゴヌクレオチドを表す。］
以下のステップ：
（ａ） 式（ＩＩｂ）の化合物を得るために、式（ＩＩａ）の化合物を酸化剤と反応させるステップ、

【化2】

［ここで、Ｖ_１、Ｖ_３、Ｖ_５、Ｖ_４、Ｖ_６、Ｗ_１、Ｗ_２、Ｗ_３、およびＯＮは上記で定義される。］

【化3】

［ここで、Ｖ_１、Ｖ_３、Ｖ_５、Ｖ_２、Ｖ_４、Ｖ_６、Ｗ_１、Ｗ_２、Ｗ_３およびＯＮは上記で定義される。］
（ｂ） 式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを含む反応産物を得るために、酸化化合物を、式（ＩＩＩ）のキャプチャータグ剤と反応させるステップ、

【化4】

［ここで、Ｘ、Ｚ、およびＹは上述される。］
および、
（ｃ） 前記反応産物中に含まれる他の種からオリゴヌクレオチド（Ｉ）の分離を可能にする条件下で、ステップ（ｂ）の反応産物を、前記キャプチャータグと相互作用可能な試薬と接触させるステップ、
を含む。

【0015】

場合により、その方法は、式（ＩＶ）のオリゴヌクレオチドを得るために、キャプチャータグを除去するステップ（ｄ）をさらに含み、

【化5】

ここでＶ_１、Ｖ_３、Ｖ_５、Ｖ_２、Ｖ_４、Ｖ_６、Ｗ_１、Ｗ_２、Ｗ_３およびＯＮは上述のとおりである。このステップは、例えば以下に詳細に記載するように、三リン酸部分の分解を生じさせない条件下で行われる。

【0016】

さらなる実施態様では、キャプチャータグは除去されないか、または、完全には除去されない。これらの実施態様では、そのようなタグ化オリゴヌクレオチドは、有用性、例えば医薬品としての有用性を有し得る。

【0017】

本願の文脈における用語「オリゴヌクレオチド」は、複数、例えば少なくとも４つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログビルディングブロックを含む化合物を包含する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは６〜１００のビルディングブロック、例えば、２０〜４０のビルディングブロックを含む。ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログビルディングブロックは、サブユニット間結合で連結された、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログのサブユニットを含んでよい。ヌクレオシドサブユニットは、デオキシリボヌクレオシドサブユニット、リボヌクレオシドサブユニットおよび／またはそれらのアナログ、特に、糖−および／または核酸塩基−修飾ヌクレオシドアナログを含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、非ヌクレオチドのビルディングブロックおよび／またはさらなる末端および／または側鎖の修飾を含んでよい。

【0018】

好ましい糖修飾サブユニットでは、リボヌクレオシドサブユニットの２’−ＯＨは、ＯＲ、Ｒ、ｈａｌｏ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２またはＣＮから選択される基で置換されており、ここで、Ｒは、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_２−６アルケニルまたはＣ_２−６アルキニルであり、ｈａｌｏはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。さらに好ましい糖修飾サブユニットでは、リボースは、例えば別の糖、例えばアラビノースなどのペントースによって、置換されてよい。この糖修飾は、２’−フルオロアラビノヌクレオシドサブユニットなどの、上述の２’−ＯＨ修飾と組み合わせてよい。なおさらに好ましい糖修飾サブユニットは、ロック化ヌクレオシド（ＬＮＡ）または２’，３’−セコ−ヌクレオシド（ＵＮＡ）を含む。好ましい核酸塩基修飾ヌクレオシドビルディングブロックでは、非標準的な、例えば非天然起源の核酸塩基が、標準的な核酸塩基の代わりに用いられる。非標準的な核酸塩基の例は、５位が修飾されたウラシルまたはシトシン、例えば５−（２−アミノ）プロピルウラシルまたは５−ブロモウラシル；ヒポキサンチン；２，６−ジアミノプリン；８位が修飾されたアデニンまたはグアニン、例えば８−ブロモグアニン；デアザヌクレオシド（ｄｅａｚａｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）、例えば７−デアザグアニンまたは７−デアザアデニン；またはＯ−およびＮ−アルキル化核酸塩基、例えばＮ^６−メチルアデニン、またはＮ^６，Ｎ^６−ジメチルアデニンである。さらに適切な核酸塩基アナログは、５−ニトロインドールのような、ユニバーサルな核酸塩基アナログから選択してよい。

【0019】

サブユニットの間の、サブユニット間結合は、ホスホジエステル結合または修飾結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、または当業者に知られる別の修飾結合であってよい。

【0020】

オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログから選択され得る。デゾキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのアナログは、少なくとも１つのデゾキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドサブユニットおよび少なくとも１つの修飾ヌクレオシドサブユニットおよび／または、例えば上述の少なくとも１つの修飾サブユニット間結合を含んでよい。オリゴヌクレオチドアナログはまた、その全体が修飾ヌクレオシドサブユニットから構成されてもよい。

【0021】

オリゴヌクレオチドは、一本鎖分子または二本鎖分子であってよい。二本鎖オリゴヌクレオチドは、完全または部分的相補鎖を含んでよい。二本鎖分子は、平滑末端であってよく、または、少なくとも１つの突出、例えば、５’または３’突出を含んでよい。存在するならば、突出は、好ましくは、分子の遠位末端（三リン酸／三リン酸アナログ基に関して）に位置する。二本鎖オリゴヌクレオチドはまた、ヘアピン構造を含んでよく、ここで、二本鎖は、その遠位末端（三リン酸／三リン酸アナログ基に関して）でループにより閉環している。ループは、ヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドビルディングブロック、例えば、トリ（エチレン）グリコールまたはヘキサ（エチレン）グリコールなどのエチレングリコール部分；プロパン−１，３−ジオール；ドデカン−１，１２−ジオール；または３，１２−ジオキサ−７，８−ジチアテトラデカン−１，１４−ジオールのような、ジオールに基づくビルディングブロックを含んでよい。

【0022】

好ましい実施態様では、二本鎖分子は、特にその近位末端（三リン酸／三リン酸アナログ基に関して）において、平滑末端である。

【0023】

オリゴヌクレオチドは、さらなる末端および／または側鎖修飾、例えば、それに共有結合する細胞特異的な標的物質を含んでよい。これらの物質は、細胞の、または細胞特異的な、取り込みを促進し得て、そして、例えば、脂質類、ビタミン類、ホルモン類、ペプチド類、オリゴ糖類およびそれらのアナログを含む。例えば、標的物質は、当業者に知られる方法により、修飾核酸塩基または非ヌクレオチドのビルディングブロックに結合されてよい。

【0024】

式（Ｉ）または（ＩＶ）のオリゴヌクレオチドは、三リン酸／三リン酸アナログ基を含む。この基において、Ｖ_１、Ｖ_３およびＶ_５は、独立に、Ｏ、ＳおよびＳｅから選択される。好ましくは、Ｖ_１、Ｖ_３およびＶ_５は、Ｏである。Ｖ_２、Ｖ_４およびＶ_６は、それぞれの場合において、独立に、ＯＨ、ＯＲ^１、ＳＨ、ＳＲ^１、Ｆ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^１、Ｎ（Ｒ^１）_２およびＢＨ_３⁻Ｍ^＋から選択される。好ましくは、Ｖ_２、Ｖ_４およびＶ_６は、ＯＨである。Ｒ^１は、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、Ｃ_２−６アシルまたは環状基、例えばＣ_３−８シクロ（ヘテロ）アルキル基、Ｃ_３−８シクロ（ヘテロ）アルケニル基、フェニルまたはＣ_５−６ヘテロアリール基であってよく、ここで、ヘテロ原子は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される。さらに、２つのＲ^１は、それに結合したＮ原子と一緒に環、例えば５員環または６員環を形成してよい。Ｒ^１はまた、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩなどのハロゲン、Ｏ（ｈａｌｏ）Ｃ_１−２アルキルおよび、環状基の場合は（ｈａｌｏ）Ｃ_１−２アルキルのような、置換基を含んでよい。Ｍ^＋は、無機または有機カチオン、例えばアルカリ金属カチオンまたはアンモニウムまたはアミンカチオンであってよい。

【0025】

Ｗ_１はＯまたはＳであってよい。好ましくは、Ｗ_１はＯである。Ｗ_２は、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲ^２であってよい。好ましくは、Ｗ_２はＯである。Ｗ_３は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ^２、ＣＨ_２、ＣＨＨａｌまたはＣ（Ｈａｌ）_２であってよい。好ましくは、Ｗ_３は、Ｏ、ＣＨ_２またはＣＦ_２である。Ｒ^２は、Ｒ^１に関して上述した基から選択してよい。ＨａｌはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであってよい。

【0026】

三リン酸／三リン酸アナログ基は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの末端に結合される。好ましくは、その基は、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合され、特に、その５’末端の糖の５’−ＯＨ基に結合される。

【0027】

本発明の方法のステップ（ａ）は、式（ＩＩａ）の環状Ｐ（Ｖ）−Ｐ（Ｖ）−Ｐ（ＩＩＩ）種と酸化剤との反応を含む。式（ＩＩａ）の化合物は、上記のＬｕｄｗｉｇら、１９８９、および上記のＧａｕｒら、１９９２により示される標準的な方法に従って、すなわち、オリゴヌクレオチドの５’末端ＯＨ基を、三官能性のホスファイト化剤、例えば２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンと、適切な条件下、例えば、ジオキサンまたはジクロロメタンのような適切な溶媒中で、塩基（ピリジンまたはジイソプロピルメチルアミン）存在下で反応させて、そして続けて、ピロリン酸（Ｗ_３＝Ｏ）または修飾ピロリン酸（Ｗ_３はＯではなく、例えばＣＨ_２、ＣＣｌ_２、ＮＨまたはＣＦ_２である）との反応により、得ることができる。好ましくは、ＤＭＦ中のピロリン酸または修飾ピロリン酸のトリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩が用いられる。結果として生じる環状Ｐ（ＩＩＩ）−Ｐ（Ｖ）中間体（ＩＩａ）はそれから、例えば、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド、（１０−カンファースルホニル）オキサジリジンのような過酸化物により、無水条件下で酸化される。あるいは、フェニルアセチルジスルフィド（Ｖ_２＝Ｓ）、またはボラン−ジイソプロピルエチルアミン複合体（Ｖ_２＝ＢＨ_３）をそれぞれ用いて、対応する式（ＩＩｂ）の環状５’三リン酸／三リン酸アナログをもたらすこともできる。これに関連する参考文献はＷＯ９６／４０１５９またはＷＯ２００９／０６０２８１にも引用されており、その内容は参照により本明細書中に援用される。

【0028】

反応ステップ（ａ）は、溶液中のオリゴヌクレオチドを用いて、または、固相、例えば有機樹脂またはＣＰＧなどのガラスに結合したオリゴヌクレオチドを用いて、おこなってよい。オリゴヌクレオチドは、保護基、例えば、当業者によく知られた、糖−または核酸塩基の保護基をさらに含んでよい。保護基の好ましい例は、ヌクレオシド間のホスホジエステルまたはホスホロチオエートに関して２−シアノエチル、リボース２’−ヒドロキシル基に関してｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、トリイソプロピルシリルオキシメチルまたはビス（アセトキシエトキシ）メチル、核酸塩基の環外アミノ基に関して４−ｔ−ブチルフェノキシアセチルまたはフェノキシアセチル、アセチル、イソブチリル、ベンゾイルである。さらに好ましくは、ステップ（ａ）は、固相結合オリゴヌクレオチドを用いて行われる。

【0029】

本発明の方法のステップ（ｂ）によれば、化合物（ＩＩｂ）は、式（ＩＩＩ）のキャプチャータグ剤と反応する。

【化6】

ここで、Ｘは、ＮＨ、ＮＲ^３、ＯまたはＳから選択される基である。Ｒ^３は、Ｒ^１に関して上記で定義されるとおりである。好ましくは、ＸはＮＨまたはＳである。

【0030】

キャプチャータグは、一連の妥当な実施例により、機能的に以下に定義される。一般的な規則は以下であり得る：
Ｚは、便利な精製が可能でなければならず、そして、ｐｐｐＲＮＡの安定性の要求と適合する条件下で除去可能でなければならない。

【0031】

Ｙは、化学結合またはリンカー、例えばアルキレン、好ましくはＣ_１−６アルキレンリンカー、さらに好ましくは、Ｃ_２−５アルキレンリンカー、またはアラルキレンリンカーを表し、場合により、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｃ＝ＯまたはＣ＝Ｓのような、ヘテロ原子またはヘテロ原子含有基を含み、および／または場合により、Ｃ＝ＣまたはＣ≡Ｃ結合を含む。

【0032】

別の好ましい実施態様では、リンカーは、ポリアルキレンオキシド、好ましくはポリ−Ｃ_２−Ｃ_６−アルキレンオキシド、さらに好ましくはポリ−Ｃ_２−Ｃ_３−アルキレンオキシドである。リンカーの数平均分子量は、３０〜８００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは４０〜４５０ｇ／ｍｏｌ、さらに好ましくは４０〜２５０ｇ／ｍｏｌの範囲であってよい。リンカーは、［−ＣＨ_２ＣＨＲ^４−Ｏ−］_ｎであってよく、ｎ＝１〜１０、好ましくはｎ＝１〜７、さらに好ましくはｎ＝２〜５、およびさらにより好ましくはｎ＝３であってよい。Ｒ^４は、ＨまたはＣ_１−６アルキルであってよい。
好ましい実施態様では、Ｒ_４はＨである。
特に好ましい実施態様では、リンカーは、式：

【化7】

を有する。

【0033】

反応ステップ（ｂ）は、溶液中のオリゴヌクレオチドを用いて、または、固相、例えば有機樹脂またはガラスに結合したオリゴヌクレオチドを用いて、おこなってよい。オリゴヌクレオチドは、上述の保護基をさらに含んでよい。さらに好ましくは、ステップ（ｂ）は、固相結合オリゴヌクレオチドを用いて行なわれる。

【0034】

本発明によるキャプチャータグＺは、キャプチャータグ、例えばオリゴヌクレオチド（Ｉ）を含む化合物を、キャプチャータグを含まない他の種から分離することが可能な条件下で、キャプチャー試薬と非共有結合的または共有結合的に相互作用可能な部分である。好ましくは、キャプチャー試薬は、固定化試薬または固定化されることが可能な試薬である。

【0035】

適切なキャプチャータグは、例えば長鎖、例えばデシルまたはオクタデシルなどの、Ｃ_８−２４、好ましくはＣ_{１３−２４}脂肪族アルキル残基、または、例えばコレステリルまたはトコフェリルなどの、他の脂質／脂溶性残基である。この場合、タグ化三リン酸物質は、標準的な逆相クロマトグラフィー、例えばＲＰ−ＨＰＬＣによって、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、固相上に捕捉して精製することができる。キャプチャータグはまた、ペルフルオロアルキル物質、例えば、４−（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシル）ベンジルまたは３−（ペルフルオロオクチル）プロピル残基であってよく、それは、Ｆｌｕｏｒｏｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から市販されるようなフルオラスアフィニティの支持体上で、修飾オリゴ三リン酸を特異的に捕捉する。

【0036】

別の実施態様では、キャプチャータグは、ビオチン、またはデスチオビオチンなどのビオチンアナログ、ハプテンまたは抗原のような、非共有結合の高親和性の結合ペアの第一パートナーであってよく、それは、ストレプトアビジン、アビジンまたは抗体などの高親和性の結合ペアの第二相補パートナーであるキャプチャー試薬と、高い親和性（例えば結合定数１０^−６ｌ／ｍｏｌまたはそれ未満）を有する。

【0037】

さらに別の実施態様では、キャプチャータグは、共有結合ペアの第一パートナーであってよく、それは、共有結合ペアの第二相補パートナーであるキャプチャー試薬と共有結合を形成してよく、ここで、共有結合は、可逆的または不可逆的結合であってよい。この実施態様では、ヒュスゲン（Ｈｕｓｉｇｅｎ）の３＋２環化付加反応（Ｃｕ（Ｉ）触媒の、いわゆる「クリック反応（ｃｌｉｃｋ−ｒｅａｃｔｉｏｎ）」、または、例えばシクロオクチン誘導体での重度の環歪みの開放により、Ｃｕ（Ｉ）イオン無しで進行する、その変異型）の場合において、キャプチャータグの構成要素Ｚは反応性化学物質であってよく、例えばアジドまたはアルキニル基であり、それぞれアルキニルまたはアジド部分などの相補反応基を含むキャプチャー試薬との共有結合的な反応を可能にする。そのような場合でのＺ−Ｙ−Ｘの具体例は、プロパルギルアミノであってよい。

【0038】

別の実施態様では、キャプチャータグの構成要素は、さらなる求核基、例えば、ＮＨ_２−Ｙ−ＸＨタイプの試薬での第二のアミノ基、を含む化学物質であってよい。オリゴヌクレオチドを固相に結合しながら、コレステロール、クロロフォルミエート（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｉａｔｅ）またはビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル類のような、広範囲の適切な求電子Ｚ試薬を、タグ基を導入するために用いることができ、したがって、タグ化反応の範囲を大いに拡張する。

【0039】

好ましい実施態様では、キャプチャータグは、長鎖アルキル残基、ペルフルオロアルキル物質、アジドまたはアルキニル基である。

【0040】

さらに、Ｙは、場合により、リンカー部分を介してＸを通じてγ−リンに結合された遊離スルフヒドリル部分を有する修飾三リン酸化オリゴヌクレオチドの回収を可能にするための、ジスルフィド結合を含んでよい。

【0041】

本発明のさらなる実施態様では、オリゴヌクレオチドは、異なる位置、例えば３’末端に、第二のキャプチャータグを有してよい。第一および第二のキャプチャータグは、好ましくは、極めて高純度の材料の回収を可能にするために、２つのオルトゴナル法による精製を可能にするように選択される。例えば、第一のキャプチャータグは、適切なクロマトグラフの支持体と相互作用する親油基であってよく、第二のキャプチャータグは、ストレプトアビジンと相互作用するビオチンであってよい。

【0042】

第二のキャプチャータグは、オリゴリボヌクレオチド合成に関する修飾ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｇｌａｓｓ ｓｕｐｐｏｒｔ）を用いて合成することにより、好適に導入され得る。

【0043】

本発明の方法のステップ（ｃ）は、反応産物中に含まれる他の種から、キャプチャータグを含むオリゴヌクレオチド（Ｉ）を分離することが可能な条件下で、ステップ（ｂ）の反応産物を、キャプチャータグＺと相互作用可能なキャプチャー試薬と接触させるステップを含む。ステップ（ｃ）の前に、固相結合オリゴヌクレオチド（Ｉ）は、固相から切断されて、脱保護されて、すなわち、保護基が部分的にまたは完全に除去される。キャプチャー試薬は、好ましくは、適切な支持体上、例えばクロマトグラフの支持体上に固定化される。キャプチャータグを含むオリゴヌクレオチド（Ｉ）を、キャプチャータグを含まない種から分離するために、ステップ（ｂ）からの反応産物は、固相から切断されて、脱保護されて、そして必要であれば、分離法、好ましくは、キャプチャータグＺとキャプチャー試薬との相互作用に基づくクロマトグラフ分離法が行われる。オリゴヌクレオチド（Ｉ）の純度は、未精製の材料に関しては配列の長さと複雑性によって通常２５〜７０％の範囲にわたるが、分離ステップの間に、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ以上に増加し得る。毒性試験に関しては、８５％より高い純度が望ましく、臨床試験の後期では、純度は、少なくとも９０〜９５％の範囲であるべきである。このように、本発明は、ヒト臨床試験に必要とされるような高純度のｐｐｐＲＮＡを得るための方法を提供する。

【0044】

ステップ（ｃ）では、キャプチャータグ、および、それと相互作用可能なキャプチャー試薬は、好ましくは、（ｉ）疎水性基またはフッ素化基、および、疎水性基またはフッ素化基に対して親和性を有するクロマトグラフの材料、例えば逆相の材料またはフルオラスアフィニティの支持体；（ｉｉ）非共有結合の高親和性の結合ペアの第一パートナーおよび非共有結合の高親和性の結合ペアの第二相補パートナー、（ｉｉｉ）共有結合ペアの第一パートナーおよび共有結合ペアの第二相補パートナー［ここで、第一および第二パートナーは共有結合を形成する。］から選択される。

【0045】

精製ステップ（ｃ）の後、キャプチャータグＺは、さらなるステップ（ｄ）において三リン酸修飾オリゴヌクレオチドから切断されてよく、タグの無いオリゴヌクレオチド（ＩＶ）を生じさせる。

【0046】

ステップ（ｄ）は、三リン酸最終産物の安定性の要求およびリボヌクレオチド間の結合の安定性の要求と、適合しなければならない。ＸがＮＨの場合は弱酸性条件による切断、ＸがＳの場合は銀イオンでの切断、Ｙ−Ｘ−Ｐが−Ｓ−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−Ｐを含む場合はチイランを除去するジチオスレイトールなどのチオールによる切断を含んでよい。

【0047】

さらなる実施態様では、特に、タグ化オリゴヌクレオチドが医薬用途に適切な場合に、キャプチャータグセットは、三リン酸修飾オリゴヌクレオチド上に完全にまたは部分的に残る。これらの実施態様では、試薬Ｚ−Ｙ−ＸＨは、ＲＩＧ−Ｉセンサーの構造的要求と機能的に適合する、Ｚ残基のサブグループから選択されなければならない。例えば、Ｚ＝デシル−オクタデシル、Ｙ＝リンク、ＸＨ＝ＮＨの組み合わせは、これらの要求を満たすことが知られている。

【0048】

本発明により生産される三リン酸／三リン酸アナログ修飾オリゴヌクレオチドは、それらの高い純度のため、特に医薬用途に適切である。特に好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド（Ｉ）または（ＩＶ）は、ＲＩＧ−１ヘリカーゼのアクチベーターである。適切なＲＩＧ−１アクチベーターの具体例は、上記のＳｃｈｌｅｅら、２００９に開示され、その内容は参照により本明細書中に援用される。

【0049】

別の実施態様では、本発明は、本発明による方法で得ることができる、式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドに関する。

【0050】

本発明のさらに別の要旨は、式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドを調製するためのキットの使用であって、

【化8】

［ここで、Ｖ_１、Ｖ_３、Ｖ_５、Ｖ_２、Ｖ_４、Ｖ_６、Ｗ_１、Ｗ_２、Ｗ_３、Ｘ、Ｙ、ＺおよびＯＮは、上記に定義される。］
前記キットは、
（ａ）式（ＩＩＩ）のキャプチャータグ剤

【化9】

［ここで、Ｘ、ＺおよびＹは、上記で定義される。］
および、
（ｂ）キャプチャータグと相互作用可能なキャプチャー試薬を含む。

【0051】

本発明のさらに別の要旨は、式（Ｉ）の修飾オリゴヌクレオチドであって、

【化10】

ここで、
Ｘは、ＮＨ、Ｏ、Ｒ−Ｏ−［Ｐ（Ｖ_１）Ｖ_２−Ｗ_１］_ｎまたはＲ−Ｏ−Ｐ（Ｖ_３）Ｖ_４−Ｗ_２−Ｐ−（Ｖ_１）Ｖ_２−Ｗ_１であり、
ｎは、１から１２、好ましくは１または２であり、
Ｙは結合であり、
Ｚは、Ｃ_１３−Ｃ_２４アルキル、ＱまたはＱＮＨＣ_２−Ｃ_２４アルキルであり、
Ｑは、Ｈ、アミノ酸、アミノ酸アナログ、Ｃ_１−Ｃ_２４アルキル、好ましくはＣ_１２−Ｃ_２４アルキル、ペプチドおよび脂質から選択され、
Ｒは、Ｃ_１−Ｃ_２４アルキル、Ｃ_２−Ｃ_２４アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_２４アルキニルおよび脂質であり、
Ｒは、Ｃ_１−Ｃ_２４アルキル、Ｃ_２−Ｃ_２４アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_２４アルキニル、Ｃ_２−Ｃ_２４アシルまたは環状基であり、および場合により置換されており、
そして、Ｖ_１、Ｖ_２、Ｖ_３、Ｖ_４、Ｖ_５、Ｖ_６、Ｗ_１、Ｗ_２、Ｗ_３およびＯＮは、請求項１から１１のいずれか一項に定義され、ここで、Ｖ_１、Ｖ_２、Ｖ_３、Ｖ_４、Ｖ_５、Ｖ_６、Ｗ_１、Ｗ_２およびＷ_３は、好ましくはＯである。

【0052】

本発明の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）の修飾オリゴヌクレオチドは、ＸがＮＨである。この実施態様は、好ましくは、ＺはＱであり、または、ＺはＱＮＨＣ_２−Ｃ_２４アルキルであり、ここで、特に好ましい実施態様では、Ｃ_２−Ｃ_２４アルキルは、Ｃ_２アルキルであり、および／またはＱはＨである。本発明により特定されるオリゴヌクレオチドの特に好ましい実施態様は、図８に示される。

【0053】

さらに、本発明は、以下の図および実施例によって、より詳細に説明される。

【実施例】

【0054】

（実施例１）デシルアミンキャプチャータグ精製ステップを用いた、５’三リン酸修飾オリゴヌクレオチドの調製。
実施例１で説明される反応スキームの概略を、図１に示す。

【0055】

ステップ１：アルゴン下で、１０ｍＬセプタムバイアル中の１ｍＬの乾燥ジオキサンに、２０３ｍｇ（１ｍｍｏｌ）の２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンを溶解する。

【0056】

ステップ２：脱トリチル化されて（ｄｅｔｉｔｒｙｌａｔｅｄ）十分にアセトニトリルで洗浄された完全保護ＲＮＡを含む合成カラムを、１２時間、真空で乾燥させる。アルゴン雰囲気下で、２ｍＬの３：１（ｖ／ｖ）無水ジオキサン／ピリジン溶液を繰り返し吸引および放出することにより、カラム内容物を、十分に洗浄する。

【0057】

ステップ３：バイアル中に、最初に２ｍＬの３：１（ｖ／ｖ）ピリジン／ジオキサンを、続いて乾燥ジオキサン中の１Ｍ ２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン溶液１００μＬを添加して、３：１（ｖ／ｖ）ジオキサン／ピリジン中の、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−２−オンなどのホスファイト化試薬の５０ｍＭ溶液を得る。穏やかに振とうすることにより、溶液をホモジナイズする。合成カラムを通して、バイアルから、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン溶液を吸引することにより、反応を開始する。

【0058】

固相保持ＲＮＡとの十分な接触および良好な混合を可能にするために、反応の間、合成カラムからの溶液を含む２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンを、繰り返し吸引および放出する。３０分の反応時間は、通常、２０〜４０ｎｔの範囲で、支持体結合オリゴマーの遊離５’−ＯＨ基のほぼ定量的な反応を与える。

【0059】

ステップ４：３０分の反応時間後、過剰のホスファイト化剤を含むジオキサン／ピリジン溶液を、廃棄容器中に放出して、新しいシリンジを、乾燥ＤＭＦ中０．５Ｍの（Ｂｕ_３ＮＨ）_２ピロリン酸１ｍＬと、２３８μＬ（１ｍｍｏｌ）の乾燥Ｂｕ_３Ｎとの、ボルテックス混合物で満たして、０．５Ｍの（Ｂｕ_３Ｎ）_４ピロリン酸溶液を得る。この溶液を、カラム内を押し通して、それにより、ジオキサン／ピリジン溶液を置き換える。非常に過剰のピロリン酸が、Ｐ（ＩＩＩ）−Ｐ（Ｖ）環状無水物ＩＩａへの中間体の定量的変換を確実なものにする。

【0060】

ステップ５：カラムを３ｍＬのＣＨ_３ＣＮで洗浄して、ＤＭＦおよび過剰のＰＰ_ｉを除去して、そして、カラムリアクターを乾燥ＣＨ_３ＣＮで満たす。

【0061】

ステップ６：２ｍＬの無水ＣＨ_３ＣＮ中に、３００μＬのｔ−ＢｕＯＯＨ（デカン中、５．５Ｍ溶液、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶解して、およそ０．７Ｍの均質な溶液を得る。酸化Ｐ（Ｖ）環状無水物ＩＩｂを得るために、合成支持体をこの溶液と１５分間接触させる。

【0062】

ステップ７：カラムを３ｍＬの乾燥ＣＨ_３ＣＮで洗浄して、過剰の過酸化物を除去して、そして、乾燥ＣＨ_３ＣＮでそれを満たす。

【0063】

ステップ８：アルゴン下で、１ｍＬの乾燥ＣＨ_３ＣＮ中に、３００μＬの乾燥デシルアミンを溶解して、その溶液を、カラム中の支持体と接触させる。デシルアミン溶液を、支持体を通して移動させる。アミン溶液とのＣＰＧの接触時間は、３分であるべきである。

【0064】

ステップ９：９ｍＬのアセトニトリルでカラムを十分に洗浄して、それから、カラム内容物を、そこにアルゴンを流すことにより乾燥させる。

【0065】

ステップ１０− 脱保護の第一ステージ：
２〜３回、支持体を通して、１ｍＬの脱保護溶液（４０％メチルアミン水溶液／濃アンモニア水溶液 １：１ ｖ／ｖ。ＡＭＡ試薬）を流す。３０分の接触後、溶液を新しいバイアル中に移す。支持体を、同量のＡＭＡ脱保護溶液で洗浄して、そして、洗浄液を合わせる。合わせた溶液および洗浄液を、１０分間６５℃で温める。氷上で冷却後、溶液を３００〜５００μＬの容量に濃縮して、それから、蒸発乾固する。

【0066】

ステップ１１− ２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護基の除去：
３００μＬの乾燥ＥｔＯＨの添加および同時蒸発により残渣を乾燥して、ＴＨＦ中１Ｍの乾燥ＴＢＡＦ（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド）１ｍＬを添加して、きつく密閉して、１６時間、シェイカー上に置く。１Ｍの滅菌水性ＴＥＡＢ（トリエチルアンモニウムバイカーボネート）１ｍＬで反応を止めて、溶離液として滅菌水を用いて、ＮＡＰ^ＴＭ−２５（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）カラム上でそれを脱塩する。滅菌２μｍフィルターを通した濾過が、このステップで必要であり得る。ＵＶ吸収画分を合わせて、１５０μＬの容量に蒸発させて、１００ｍＬの１Ｍ ＴＥＡＢ ｐＨ８を添加して、そして、ＨＰＬＣ精製が行われ得るまで、溶液を−２０℃で凍結保存する。デシル−ＮＨｐｐｐＲＮＡ産物は、ｐＨ７〜８で数週間、−２０℃にて安定である。

【0067】

ステップ１２− ＨＰＬＣ精製：
ステップ１１からの１μｍｏｌスケールの反応混合物からの反応産物は、７×２５ｍｍのＰＲＰ−１カラム（ハミルトン）中にロードされた。精製は、流速３ｍＬ／分で５０分、０〜８０％のリニアグラジエントバッファーＢを用いて行なわれた。バッファーＡは１００ｍＭ ＴＥＡＢであり、バッファーＢは、メタノール／水 ８：２ ｖ／ｖ中の、１００ｍＭ ＴＥＡＢである。２７ｍｅｒの精製の、典型的な例を、図７Ａに示す。

【0068】

画分５および画分６が収集されて、ロータリーエバポレーター上で蒸発されて、乾燥メタノールとの数回の同時蒸発により脱塩される。残渣（約２００〜２５０ｎｍｏｌのデシル−ＮＨｐｐｐＲＮＡ）は水に溶解されて、スクリューキャップのエッペンドルフバイアル中に移された。

【0069】

ステップ１３− デシルアミンタグの除去：
１００ｎｍｏｌのデシル−ＮＨｐｐｐＲＮＡは、２ｍＬエッペンドルフチューブ中のｐＨ３．８脱保護バッファー４００μＬに溶解されて、密封されたチューブは、６０℃で７０分間温められた。これらの条件は、三リン酸部分の分解をせずにホスホロアミデート結合の定量的な切断をもたらす。それから、反応混合物は氷上で冷却されて、２５μＬの５Ｍ滅菌ＮａＣｌ溶液および１．２ｍＬの無水ＥｔＯＨが添加された。十分な混合後、ｐｐｐＲＮＡを沈殿させるために、溶液は−２０℃で一晩置かれた。沈殿物は、遠心分離により集められて、冷たいエタノールで洗浄されて、ＳｐｅｅｄＶａｃ上で乾燥されて、それから、５００ｍＬの滅菌水中に溶解されて、そして−２０℃で凍結保存された。

【0070】

【表1】

【0071】

また、類似の方法においても、５’三リン酸修飾オリゴヌクレオチドは、オクタデシルまたはコレステリルキャプチャータグを用いて、合成および精製された。

【0072】

（実施例２）非親油性キャプチャータグを用いた、三リン酸オリゴヌクレオチドの調製。
（Ｆ−ＴＡＧ−ｐｐｐＲＮＡおよびＮ_３−ＴＡＧ−ｐｐｐＲＮＡ）
非親油性の相互作用に基づく精製ストラテジーの有用性を示すために、ｐｐｐＲＮＡ誘導体Ｆ−ＴＡＧ−ＲＮＡおよびＮ３−ＴＡＧ−ＲＮＡが調製された（図９参照）。合成の全ステップは、図１のステップ８において、無水アセトニトリル中の４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１，１１−ヘプタデカフルオロウンデシルアミンの０．１Ｍ溶液２ｍＬを、反応時間を３時間に増加して、固相結合シクロ三リン酸の開環に用いて、Ｆ−ＴＡＧ−ＲＮＡを得たこと；および、乾燥アセトニトリル中の１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミンの０．１Ｍ溶液２ｍＬを３時間用いて、Ｎ_３−ＴＡＧ−ｐｐｐＲＮＡを得たことを除いて、実施例１で説明された方法と同一である。以下の脱保護ステップは、実施例１でＤｅｃＮＨｐｐｐＲＮＡに関して詳述されたものと同一である。

【0073】

Ｆ−ＴＡＧ−ＲＮＡおよびＮ３−ＴＡＧ−ＲＮＡの分析データ（図１０参照）：
（これらの実施例におけるＲＮＡ配列は、５’−ＧＡＣＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＵである。）

【表2】

【0074】

フルオラスタグを含むｐｐｐＲＮＡオリゴヌクレオチド（Ｆ−ＴＡＧ−ｐｐｐＲＮＡ）は、市販の「フルオラス」カートリッジ、または、全フッ素置換されたアルキル鎖間の強力な非共有結合の相互作用の活用を可能にするフルオラスＨＰＬＣカラムを用いて精製することができる。ガンマアジド修飾ｐｐｐＲＮＡ誘導体（Ｎ３−ＴＡＧ−ｐｐｐＲＮＡ）は、銅（Ｉ）触媒のアルキン−アジド環化付加反応（クリックケミストリー）のＲＮＡ適合版により、市販のプロピン修飾固相に共有結合することができる。樹脂結合の形態では、三リン酸化されていない副産物を除去するために変性条件を利用することができるので、この方法は、高度に構造化されたｐｐｐＲＮＡ配列の精製を可能にする。

【0075】

酸加水分解の際に、Ｆ−ＴＡＧ−ＲＮＡとＮ３−ＴＡＧ−ＲＮＡの両方は、図５に示すように、単純なＰ−Ｎアルキルアミドと同等の反応速度で、ｐｐｐＲＮＡ最終産物を放出する。

【0076】

（実施例３）増加する鎖長のｎ−アルキルキャプチャータグごとの、Ｔａｇ−ｐｐｐＲＮＡのＲＰ−ＨＰＬＣ溶出位置の変化。
実施例１で説明されたｎ−デシル−タグの他に、より長い鎖長（Ｃ_１２、Ｃ_１４、Ｃ_１８）を有する脂肪族ｎ−アルキル残基を、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製の間のＴａｇ−ｐｐｐＲＮＡ産物の保持時間を増大させるために用いることができ、タグを含まない不純物からの効率的な分離を可能にする。

【0077】

Ｎ−ドデシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡ、ｎ−テトラデシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡおよびｎ−オクタデシル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡは、実施例１で説明された方法に従って、ステップ８を変更して調製することができる：乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２中の、ｎ−アルキルアミン（ｎ−ドデシルアミン、ｎ−テトラデシルアミンまたはｎ−オクタデシルアミン）の０．１Ｍ溶液が調製されて、その溶液の２ｍＬがカラム中で支持体と接触させられる。アルキルアミン溶液は、支持体を通って往復する。３時間の接触時間の後、２ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２でのさらなる洗浄ステップが、次のワークアップステップを続ける前に必要とされる。

【0078】

分析データ：

【表3】

【0079】

図１１は、ｐｐｐＲＮＡと、増加する鎖長のアルキル残基を有するｎ−アルキル−ＮＨ−ｐｐｐＲＮＡの、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4a】

【図4b】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】