特許 6374397 体重増加及び肥満の素因に対するバイオマーカーとしてのイソバレリルグリシン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6374397

(24)【登録日】2018年7月27日

(45)【発行日】2018年8月15日

(54)【発明の名称】体重増加及び肥満の素因に対するバイオマーカーとしてのイソバレリルグリシン

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20180806BHJP

   G01N 33/493 20060101ALI20180806BHJP

   G01N 27/62 20060101ALI20180806BHJP

   G01N 24/08 20060101ALI20180806BHJP

   G01N 24/00 20060101ALN20180806BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

   G01N33/493 A

   G01N27/62 V

   G01N24/08 510Q

   !G01N24/00 530B

   !G01N24/00 530L

【請求項の数】13

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2015-544429(P2015-544429)

(86)(22)【出願日】2013年11月25日

(65)【公表番号】特表2016-505821(P2016-505821A)

(43)【公表日】2016年2月25日

(86)【国際出願番号】EP2013074570

(87)【国際公開番号】WO2014086605

(87)【国際公開日】20140612

【審査請求日】2016年11月4日

(31)【優先権主張番号】12195490.3

(32)【優先日】2012年12月4日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】599132904

【氏名又は名称】ネステク ソシエテ アノニム

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100140888

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 欣乃

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100140453

【弁理士】

【氏名又は名称】戸津 洋介

(72)【発明者】

【氏名】マーティン， フランソワ‐ピエール

(72)【発明者】

【氏名】ブーランジュ， クレア エル．

(72)【発明者】

【氏名】モントリュー ロウラ， イヴァン

(72)【発明者】

【氏名】コッリーノ， セバスティアーノ

(72)【発明者】

【氏名】デュマ， マルク‐エマニュエル

(72)【発明者】

【氏名】ホームズ， エレイン

(72)【発明者】

【氏名】レッツィ， セルジュ アンドレ ドミニク

(72)【発明者】

【氏名】ニコルソン， ジェレミー

(72)【発明者】

【氏名】コッチャー， スニール

【審査官】 西浦 昌哉

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−２４７８６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０１６０２３７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０７９９３９３１（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 KIMURA, M. and YAMAGUCHI, S. et al.，Screening for fatty acid beta oxidation disorders Acylglycine analysis by electron impact ionization gas chromatography-mass spectrometry，JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B: BIOMEDICAL APPLICATIONS，NL，ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS，１９９９年 ８月 ６日，Vol.731/No.1，pp.105-110

【文献】 TOMLINSON, L. et al.，Cannabinoid Receptor Antagonist-Induced Striated Muscle Toxicity and Ethylmalonic-Adipic Aciduria in Beagle Dogs，Toxicological Sciences，Oxford University Press，２０１２年 ７月２１日，Vol.129/No.2 ，pp.268-279

【文献】 NEWGARD, C.B. et al.，A Branched-Chain Amino Acid-Related Metabolic Signature that Differentiates Obese and Lean Humans and Contributes to Insulin Resistance，Cell Metabolism，米国，Cell Press，２００９年 ４月 ８日，Vol.9/No.4，pp.311-326

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｇ０１Ｎ ２７／６２

Ｇ０１Ｎ ２４／０８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

イソバレリルグリシンである、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度を検出及び／又は定量化するための尿中バイオマーカー。

【請求項2】

高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する対象の確度を判定するための方法であって、
試験対象から前もって得られた尿試料のイソバレリルグリシンレベルを測定するステップと、
対象のイソバレリルグリシンレベルを予め決定された基準値と比較するステップと
を含み、
予め決定された基準値が、対照集団における尿の平均イソバレリルグリシンレベルに基づき、前記対照集団は、遺伝的背景、年齢及び平均健康状態が類似した少なくとも３人の群であり、
予め決定された基準値と比較した際の、試料におけるイソバレリルグリシンレベルの増大が、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の増大を示す、方法。

【請求項3】

尿試料において、ヘキサノイルグリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ロイシン、イソブチレート、アセテート、グアニドアセテート、ショ糖、酒石酸、馬尿酸及びヒドロキシフェニルアセチルグリシンからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーのレベルを測定するステップと、
少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの対象のレベルを予め決定された基準値と比較するステップと
をさらに含み、
予め決定された基準値が、正常な健常対照集団の尿試料における少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの平均レベルに基づき、
予め決定された基準値と比較した際の、尿試料におけるヘキサノイルグリシン、ロイシン、アセテート、イソブチレートのレベルの増大、並びに／又はトリメチルアミン−Ｎ−オキシド、グアニドアセテート、ショ糖、酒石酸、馬尿酸及び／若しくはヒドロキシフェニルアセチルグリシンのレベルの低下が、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の増大を示す、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

試料及び基準物において、^１Ｈ−ＮＭＲ及び／又は質量分析によってバイオマーカーのレベルが測定される、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項5】

高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の低下が、過体重及び／又は肥満と関係がある障害を発生させることに対する確度の指標である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

過体重及び／又は肥満と関係がある障害が、心血管代謝疾患及び／又は代謝制御不全である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

低体重、正常、過体重又は過肥の対象において行われる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

対象が、ヒト、又はネコ若しくはイヌなどの伴侶動物である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の低下が、ミトコンドリアの酸化経路の特異的な活性化がないことの指標である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の増大が、ミトコンドリアの酸化経路の特異的な活性化の指標である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ミトコンドリアの酸化経路が、β酸化、ブタノエート代謝及びロイシン異化からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項12】

対象が小児、１０代の若者、若年成人及び／又は過体重若しくは過肥になる危険性がある人である、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

対象の特定の群のための層別化した食事、又は特定の対象のための個別化された食事を考案するのに使用される、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に栄養及び健康の分野に関する。特に本発明は、食事誘導性体重増加に抵抗すること及び／又は食事誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度の診断を可能にする新規のバイオマーカー、その使用、並びに方法に関する。例えば、バイオマーカーはイソバレリルグリシンであり得る。このバイオマーカーは、対象における体重増加の危険性に対する生活様式の変化の影響を診断／モニタリングすることにも使用できる。

【背景技術】

【0002】

肥満は、２型糖尿病、脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）、癌、関節炎及び心血管疾患（ＣＶＤ）を含めたさらなる疾患を発生させる危険性を高めることから、２１世紀における最も重要な世界的な健康管理問題の１つになっている。肥満の病因は、遺伝的要因並びに高カロリーの食事、身体活動及び行動の不足のような環境的要因間の複雑な相互作用に起因する。腸の先天免疫系の成熟及び栄養素の消化／吸収のような様々な生理機能に関与している腸内微生物叢も、いくつかの代謝疾患の発生に影響し、肥満に大きな影響を与えるようである。したがって、こうした多因子性の原因のために、肥満になる個々の素因は様々である。

【0003】

脂肪及び／又は炭水化物豊富なバランスの悪い食事の摂取は、脂肪組織並びに肝臓、筋肉及び心臓のような除脂肪組織におけるトリグリセリドの蓄積率の増大と関係がある。この異所的な脂肪沈着により誘導される脂肪毒性は、高トリグリセリド血、高血圧、高い空腹時血糖及びインスリン抵抗性（ＩＲ）のような様々な代謝障害にも相関している。それにもかかわらず、過体重又は過肥の人々の中には様々な代謝障害を発生させ得るものもあれば、一方で健康を保つものもある。例えば、体内の脂肪沈着の局在は、代謝障害の発生に影響する。心外膜脂肪は、アテローム生成促進的なアディポネクチンを放出し脂肪酸を処理する作用があるが、ヒトにおいてＣＶＤマーカーと正に相関していた。対照的に、肝内脂肪は、炎症及びインスリン抵抗性と関係があった。Ｗｉｌｄｍａｎらも、健康な中年女性における人種や民族の違いが、肥満及びＣＶＤを発生させる民族関連性素因に影響を及ぼす可能性がある、内臓及び皮下の脂肪組織における代謝活性の差と関係があることを強調した。結果として、個々の代謝状態を評価するため、及び代謝疾患の発生を効率的に予防するために、肥満関連の代謝障害を発生させる確度を早期に特定することが適切である。

【0004】

したがって、早期に、理想的には対象の体重が増える前に、脂肪が豊富な食事を消費する場合に体重が増加しそうな対象を特定することを可能にする方法を用いる技術を提供することが望ましいと予想される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本明細書における先行技術文献へのいかなる参照も、そうした従来技術が広く知られていること又は本分野において共通する一般的な知識の一部を形成することを認めるものとして考慮されないものとする。

【0006】

本発明の目的は、技術水準を向上させること、特に、高脂肪の食事に対して体重増加という形で応答する可能性があるか否かについて人々を効率的に早期に層別化することを可能にする方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、驚くべきことに本発明の目的が独立請求項の主題によって達成できることを見出した。従属請求項においてさらに、本発明の概念を発展させる。

【0008】

したがって本発明は、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度を診断するためのバイオマーカー、その使用及び方法を提供する。

【0009】

本明細書で使用する場合、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び類似の表現は、排他的又は網羅的な意味に解釈されないものとする。換言すれば、これらの表現は、「〜を含むが、限定されない」を意味することが意図される。

【0010】

本発明者らは、メタボノミクスアプローチを使用して、本発明の目的を達成した。今日では、メタボノミクスは、様々な要因、例えば環境、薬物、食事、生活様式、遺伝及びマイクロバイオームの要因の影響を含む代謝表現型を特徴づけるための、確立されたシステムアプローチと考えられている。生理的変化の可能性を示す遺伝子発現及びプロテオミクスのデータと異なり、細胞、組織及び臓器内での代謝物及び代謝物のダイナミックな濃度変化は、生理的調節プロセスの真のエンドポイントを表す。

【0011】

したがって、メタボノミクスアプローチは、様々な食事介入及び疾患発生に関連する段階的な代謝変化を調べることに適したアプローチである。最近、メタボロミクス及びリピドミクスに基づく発見は、疾患プロセスの理解を加速しており、メタボリックシンドロームに関連する無症候性障害の予防及び栄養管理に関する新規な手段を提供する。特に、「オミクス」データから、肥満及びインスリン抵抗性（ＩＲ）の発症に対する、エネルギー代謝（クレブス回路）、脂質及びアミノ酸のプロセシング並びに炎症シグナルの寄与が強く示された。

【0012】

経時的に採取した尿試料のプロトン核磁気共鳴（^１Ｈ ＮＭＲ）分光法と体重増加のモニタリングの組み合わせを使用して、本発明者らは、詳細に明らかにされたＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいて、高脂肪の食事によって誘導される段階的な体重増加に関する新規な代謝性バイオマーカーを特定した。この動物モデルは、同質遺伝子的な動物、すなわち、高脂肪誘導性体重増加分布に抵抗性又は高脂肪誘導性体重増加分布の傾向がある動物の中で、極端な表現型を示すことが周知である。本発明者らは、高脂肪の食事（ＨＦＤ）を与えたＣ５７ＢＬ／６マウスの、短期（７日）及び長期（６０日）の代謝適応を特徴づけし、ＨＦＤを与えたマウス、すなわち、高脂肪誘導性体重増加に抵抗性であるか又は高脂肪誘導性体重増加の傾向がある動物における表現型の変動性と関係がある特異的な代謝シグネチャーを確立した。メタボノミクスアプローチを使用して、本発明者らは、ミトコンドリアの代謝経路（脂肪酸β酸化、分枝鎖アミノ酸異化、ブタノエート代謝、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド経路及びクレブス回路）が、高脂肪給餌によって急速にアップレギュレートされることを示し、これは、ミトコンドリアの脂肪酸の飽和及びエネルギー代謝の機能障害を反映する可能性がある。

【0013】

本発明者らは、ＨＦＤ下の肥満抵抗性マウスは、脂肪酸の過負荷に対する保護的な機構であり得るミトコンドリアの酸化経路（β酸化、ブタノエート代謝及びロイシン異化）の特異的な活性化と関係があることを示すことができた。

【0014】

これらの結果により、肥満の発生におけるミトコンドリアの役割が強く示され、肥満のような代謝障害を発生させる確度は、本発明者らが特定したバイオマーカーの特定のセットを使用して、早期の代謝シグネチャーから決定が可能であると結論づけることができる。

【0015】

本発明者らは、高脂肪給餌の１週間後（７日）の尿の代謝応答によって、各個体に関する最終的な体重増加の予測（６０日）だけでなく、高脂肪誘導性体重増加に抵抗性であること又は高脂肪誘導性体重増加の傾向があることに対する動物の素因によって動物を層別化することも可能にすることを示すことができた。

【0016】

したがって本発明は、新規なバイオマーカーである、イソバレリルグリシンに関する。

【0017】

本発明は、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度を検出及び／又は定量化するための、尿中バイオマーカーとしてのイソバレリルグリシンの使用にさらに関する。

【0018】

同様に本発明は、高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度を検出及び／又は定量化するための、尿中バイオマーカーとしてのイソバレリルグリシンの使用にも関する。

【0019】

本発明は、対象において高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度を診断する方法であって、試験対象から前もって得られた尿試料のイソバレリルグリシンレベルを測定するステップと、対象のイソバレリルグリシンレベルを予め決定された基準値と比較するステップとを含み、予め決定された基準値が、対照集団における尿の平均イソバレリルグリシンレベルに基づき、予め決定された基準値と比較した際の、試料におけるイソバレリルグリシンレベルの増大が、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の増大を示す方法にも関する。同様に本発明は、対象において高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度を診断する方法であって、試験対象から前もって得られた尿試料のイソバレリルグリシンレベルを測定するステップと、対象のイソバレリルグリシンレベルを予め決定された基準値と比較するステップとを含み、予め決定された基準値が、対照集団における尿の平均イソバレリルグリシンレベルに基づき、予め決定された基準値と比較した際の、試料におけるイソバレリルグリシンレベルの低下又は無変化が、高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度の増大を示す方法にも関する。

【0020】

本発明のこのバイオマーカーは、対象の体重増加の危険性に対する生活様式の変化の影響を診断及び／又はモニタリングすることにも使用できる。これについては、生活様式の変化の前にバイオマーカーレベルを評価することができ、生活様式の変化の後に、得られたレベルを前記バイオマーカーのレベルと比較することができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1-1】ＨＦＤを与えたｎ＝５６のマウス集団における体重増加の変動性を示す図である。（Ａ）実験計画。（Ｂ）７日及び６０日のＨＦＤ給餌後のマウスの体重分布。（Ｃ）各時点での、肥満に対する非応答個体（ＮＲ）及び強い応答個体（ＳＲ）マウスの特定。数匹のＮＲ及びＳＲマウスを実験の２つの時点で又は全過程を通して観察する。（Ｄ）食事の前（ｔ０）、ＨＦＤ給餌の７日後（ｔ１）及び６０日後（ｔ２）での、対照（ｎ＝２４）、ＮＲ（ｎ＝３０）及びＳＲ（ｎ＝２９）マウスの体重のモニタリング。ｓ（ｎ＝平均±標準誤差、ノンパラメトリックなマンホイットニー検定に対するｐ値^＊＜０．０５、^＊＊＜０．００１、^＊＊＊＜０．０００１）。

【図1-2】ＨＦＤを与えたｎ＝５６のマウス集団における体重増加の変動性を示す図である。（Ａ）実験計画。（Ｂ）７日及び６０日のＨＦＤ給餌後のマウスの体重分布。（Ｃ）各時点での、肥満に対する非応答個体（ＮＲ）及び強い応答個体（ＳＲ）マウスの特定。数匹のＮＲ及びＳＲマウスを実験の２つの時点で又は全過程を通して観察する。（Ｄ）食事の前（ｔ０）、ＨＦＤ給餌の７日後（ｔ１）及び６０日後（ｔ２）での、対照（ｎ＝２４）、ＮＲ（ｎ＝３０）及びＳＲ（ｎ＝２９）マウスの体重のモニタリング。ｓ（ｎ＝平均±標準誤差、ノンパラメトリックなマンホイットニー検定に対するｐ値^＊＜０．０５、^＊＊＜０．００１、^＊＊＊＜０．０００１）。

【図2-1】食事を切り替えてから７日後及び６０日後における、ＨＦＤを与えた又はＬＦＤを与えたＣ５７ＢＬ／６マウスの^１Ｈ ＮＭＲ尿代謝プロファイルを示す図である。（Ａ）ＬＦＤを与えたマウス又は（Ｂ）ＨＦＤを与えたマウスからの尿の平均^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。（Ｃ）７日目におけるＬＦＤを与えたマウス及びＨＦＤを与えたマウスの尿代謝プロファイルのＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロット。（Ｄ）６０日目におけるＬＦＤを与えたマウス及びＨＦＤを与えたマウスの尿代謝プロファイルのＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロット。（Ｅ）ＯＰＬＳ−ＤＡ係数プロットから得られたヒートマップから、ＨＦＤを与えたマウスとＬＦＤを与えたマウスで有意に異なることが判明した代謝物が示された。代謝物の相関値を色コードで示す。（赤色の勾配は、ＨＦＤを与えたマウスと正に相関した代謝物に関し、青色の勾配は、負に相関した代謝物に関する）。

【図2-2】食事を切り替えてから７日後及び６０日後における、ＨＦＤを与えた又はＬＦＤを与えたＣ５７ＢＬ／６マウスの^１Ｈ ＮＭＲ尿代謝プロファイルを示す図である。（Ａ）ＬＦＤを与えたマウス又は（Ｂ）ＨＦＤを与えたマウスからの尿の平均^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。（Ｃ）７日目におけるＬＦＤを与えたマウス及びＨＦＤを与えたマウスの尿代謝プロファイルのＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロット。（Ｄ）６０日目におけるＬＦＤを与えたマウス及びＨＦＤを与えたマウスの尿代謝プロファイルのＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロット。（Ｅ）ＯＰＬＳ−ＤＡ係数プロットから得られたヒートマップから、ＨＦＤを与えたマウスとＬＦＤを与えたマウスで有意に異なることが判明した代謝物が示された。代謝物の相関値を色コードで示す。（赤色の勾配は、ＨＦＤを与えたマウスと正に相関した代謝物に関し、青色の勾配は、負に相関した代謝物に関する）。

【図3-1】ＮＲ及びＳＲマウスの特異的な代謝シグネチャーを示す図である。（Ａ）ＮＲマウス又は（Ｂ）ＳＲマウスからの尿の^１ＨＮＭＲスペクトルの平均。（Ｃ）７日目（Ｄ）及び６０日目におけるＮＲ及びＳＲマウスの尿代謝プロファイルのＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロット。（Ｅ）ＯＰＬＳ−ＤＡ係数プロットから得られたヒートマップから、ＮＲ及びＳＲマウスで有意に異なることが判明した代謝物が示された。代謝物の相関値を色コードで示す。（赤色の勾配は、ＳＲマウスと正に相関した代謝物に関し、青色の勾配は、負に相関した代謝物に関する）。

【図3-2】ＮＲ及びＳＲマウスの特異的な代謝シグネチャーを示す図である。（Ａ）ＮＲマウス又は（Ｂ）ＳＲマウスからの尿の^１ＨＮＭＲスペクトルの平均。（Ｃ）７日目（Ｄ）及び６０日目におけるＮＲ及びＳＲマウスの尿代謝プロファイルのＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロット。（Ｅ）ＯＰＬＳ−ＤＡ係数プロットから得られたヒートマップから、ＮＲ及びＳＲマウスで有意に異なることが判明した代謝物が示された。代謝物の相関値を色コードで示す。（赤色の勾配は、ＳＲマウスと正に相関した代謝物に関し、青色の勾配は、負に相関した代謝物に関する）。

【図4-1】ＢＣＡＡ、ブタノエート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド代謝、クレブス回路及びβ酸化に関与する代謝物の尿排泄パターンのマッピングを示す図である。バープロットは、０日目に対する７日目又は０日目に対する６０日目の代謝物統合物の平均比を標準誤差とともに示した。Ｙ軸は、ＬＦ、ＨＦ、ＮＲ及びＳＲマウスに対する平均値（任意単位）を示す。ＬＦとＨＦ又はＮＲとＳＲの平均比間の有意差は、ノンパラメトリックなマンホイットニー検定を用いて計算した：^＊＜０．０５、^＊＊＜０．００１、^＊＊＊＜０．０００１（平均値、標準誤差及びｐ値は補遺の表３及び４にある）。間接的な代謝反応を破線矢印で強調した。

【図4-2】ＢＣＡＡ、ブタノエート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド代謝、クレブス回路及びβ酸化に関与する代謝物の尿排泄パターンのマッピングを示す図である。バープロットは、０日目に対する７日目又は０日目に対する６０日目の代謝物統合物の平均比を標準誤差とともに示した。Ｙ軸は、ＬＦ、ＨＦ、ＮＲ及びＳＲマウスに対する平均値（任意単位）を示す。ＬＦとＨＦ又はＮＲとＳＲの平均比間の有意差は、ノンパラメトリックなマンホイットニー検定を用いて計算した：^＊＜０．０５、^＊＊＜０．００１、^＊＊＊＜０．０００１（平均値、標準誤差及びｐ値は補遺の表３及び４にある）。間接的な代謝反応を破線矢印で強調した。

【図5】ランダムフォレスト解析によって評価した時の、ＮＲ及びＳＲの予測における代謝物の重要性及び頑健性を示す図である。表１：高脂肪誘導性体重増加における代謝物と体重増加の関係の要約。表２：体重増加抵抗性（ＮＲ）及び体重増加傾向（ＳＲ）のそれぞれにおける、選択された代謝物の経時的な倍数変化の要約。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明は、部分的にバイオマーカーに関し、ここでは、バイオマーカーはイソバレリルグリシンである。

【0023】

本明細書に記載の実験では、ＨＦＤを与えたマウスは、尿のイソバレリルグリシンの経時的な増大を示した。理論に拘束されることは望まないが、本発明者らは、クレブス回路のいくつかの中間体及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド経路の最終産物がＨＦＤマウスの尿で増大していることは、ミトコンドリア中のエネルギー過剰産生の証拠と考えることができると現在考えている。ミトコンドリア酸化経路の慢性的な増大は、ミトコンドリアにとって有害であり、酸化経路及びエネルギー代謝の機能障害につながると考えられる。さらに、過剰な遊離脂肪酸は脂肪組織及び除脂肪組織にトリグリセリドとして貯蔵され得、これは、臓器不全及び脂肪肝又は心血管疾患のような代謝疾患を促進する可能性がある。

【0024】

本発明者らは、イソバレリルグリシンが、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度を検出及び／又は定量化するための、体液のバイオマーカーとして使用できることを発見した。体液は尿でもよい。体液として尿を使用することは、定期的に、非侵襲的に、医療関係者の支持なしに尿を得ることができるという利点がある。

【0025】

この診断法はヒト又は動物の体外で行われる。典型的には、バイオマーカーの検出及び／又は定量化ステップは、試験対象から前もって得られた体液試料において行われる。

【0026】

本発明は高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度を定量化することを考慮して記載されているが、同じ方法が、高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度を定量化するのに使用することもできることは当業者に明らかである。当業者であれば理解していることであるが、バイオマーカーのレベルの増大が、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の増大の指標であるならば、バイオマーカーのレベルの低下が、高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度の増大に対する指標であり、逆もまた同じである。

【0027】

したがって本発明は、高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度を検出及び／又は定量化するための、尿中バイオマーカーとしてのイソバレリルグリシンの使用にも関していた。

【0028】

本発明は、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する対象の確度を診断する方法であって、試験対象から前もって得られた尿試料のイソバレリルグリシンレベルを測定するステップと、対象のイソバレリルグリシンレベルを予め決定された基準値と比較するステップとを含み、予め決定された基準値が、対照集団における尿の平均イソバレリルグリシンレベルに基づき、予め決定された基準値と比較した際の、試料におけるイソバレリルグリシンレベルの増大が、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の増大を示す方法にも関する。

【0029】

本発明は、高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する対象の確度を診断する方法であって、試験対象から前もって得られた尿試料のイソバレリルグリシンレベルを測定するステップと、対象のイソバレリルグリシンレベルを予め決定された基準値と比較するステップとを含み、予め決定された基準値が、対照集団における尿の平均イソバレリルグリシンレベルに基づき、予め決定された基準値と比較した際の、試料におけるイソバレリルグリシンレベルの低下が、高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度の増大を示す方法にも関する。

【0030】

試料として尿を使用することは、十分に確立された手法を使用して非侵襲的に尿を得ることができるという利点がある。次いで、実際の診断法は体外で行われる。

【0031】

試料のイソバレリルグリシンレベルは、当技術分野で既知の任意の手段によって検出及び定量化することができる。例えば、^１Ｈ−ＮＭＲ、質量分光測定法、例えばＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを使用することができる。他の方法、例えば他の分光学的な方法、クロマトグラフィー法、標識法又は定量的な化学的方法も同様に使用することができる。理想的には、試料のイソバレリルグリシンレベル及び基準値を、同じ方法によって測定する。

【0032】

予め決定された基準値は、対照集団における試験体液の平均イソバレリルグリシンレベルに基づいてもよい。対照集団は、遺伝的背景、年齢及び平均健康状態が類似した少なくとも３人、好ましくは少なくとも１０人、より好ましくは少なくとも５０人の群であってもよい。

【0033】

例えば本発明は、早期に、すなわち健康の危険性をもたらし得る体重増加の前に、対象を層別化することを可能にする。高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいかどうかを認識することによって、早期に、生活様式及び食事を適宜調節することができる。理想的には個別化された栄養管理を伴う適切な生活様式によって健康的な体格の維持を可能とし、その健康的な体格を取り戻すためのカロリー制限及び／又は運動療法に関して著しく努力しなければならないことを回避する。

【0034】

単独マーカーとしてのイソバレリルグリシンは、本発明の診断法のツールとして効果的であるが、診断がたった１つのマーカーではなくそれより多くのマーカーに依拠するならば、前記診断の質及び／又は予測力が向上する。

【0035】

したがって、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の増大を診断するための及び／又は高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度の増大を診断するための１つ又は複数の他のマーカーをイソバレリルグリシンと組み合わせて使用することができる。

【0036】

本発明者らは、驚くべきことに、他のバイオマーカーも、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の増大の検出及び／又は高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度の増大の診断に使用できることを見出した。

【0037】

そのようなものとして、本発明者らは、ヘキサノイルグリシン、ロイシン、イソブチレート、アセテートの尿中濃度の上昇、並びにトリメチルアミン−Ｎ−オキシド、グアニドアセテート、ショ糖、酒石酸、馬尿酸及びヒドロキシフェニルアセチルグリシンの尿中濃度の低下によって、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の増大を診断できることを確認した。

【0038】

したがって、本発明の方法は、尿試料において、ヘキサノイルグリシン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ロイシン、イソブチレート、アセテート、グアニドアセテート、ショ糖、酒石酸、馬尿酸及びヒドロキシフェニルアセチルグリシンからなる群から選択される少なくとも１つのさらなるバイオマーカーのレベルを測定するステップと、少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの対象のレベルを予め決定された基準値と比較するステップとをさらに含むことができ、ここでは、予め決定された基準値が、正常な健常対照集団の尿試料における少なくとも１つのさらなるバイオマーカーの平均レベルに基づき、予め決定された基準値と比較した際の、尿試料におけるヘキサノイルグリシン、ロイシン、イソブチレート、アセテートの増大、及びトリメチルアミン−Ｎ−オキシド、グアニドアセテート、ショ糖、酒石酸、馬尿酸及び／又はヒドロキシフェニルアセチルグリシンのレベルの低下が、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の増大を示す。したがって、予め決定された基準値と比較した際の、尿試料におけるヘキサノイルグリシン、ロイシン、イソブチレート、アセテートのレベルの低下、並びにトリメチルアミン−Ｎ−オキシド、グアニドアセテート、ショ糖、酒石酸、馬尿酸及び／又はヒドロキシフェニルアセチルグリシンのレベルの増大は、高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度の増大を示す。

【0039】

さらに、さらなるバイオマーカーは、^１Ｈ−ＮＭＲ又は質量分光測定法、例えばＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって検出及び定量化することができる。他の方法、例えば他の分光学的な方法、クロマトグラフィー法、標識法又は定量的な化学的方法も同様に使用することができる。

【0040】

評価するバイオマーカーは全て、同じ技術によって評価することが理想的である。これらのバイオマーカーは、同時に評価してもよい。

【0041】

例えば、イソバレリルグリシンは、トリメチルアミン−Ｎ−オキシドとともに評価することができる。

【0042】

イソバレリルグリシンは、ヘキサノイルグリシンとともに評価することもできる。

【0043】

イソバレリルグリシンは、ロイシンとともに評価することもできる。

【0044】

イソバレリルグリシンは、アセテートとともに評価することもできる。

【0045】

イソバレリルグリシンは、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド及びヘキサノイルグリシンとともに評価することもできる。

【0046】

イソバレリルグリシンは、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヘキサノイルグリシン及びロイシンとともに評価することもできる。

【0047】

イソバレリルグリシンは、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヘキサノイルグリシン及びアセテートとともに評価することもできる。

【0048】

イソバレリルグリシンは、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヘキサノイルグリシン、アセテート及びロイシンとともに評価することもできる。

【0049】

イソバレリルグリシンは、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヘキサノイルグリシン、アセテート、ロイシン及びグアニドアセテートとともに評価することもできる。

【0050】

イソバレリルグリシンは、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヘキサノイルグリシン、アセテート、ロイシン、グアニドアセテート及び馬尿酸とともに評価することもできる。

【0051】

１つを超えるバイオマーカーを評価することの利点は、より多くのバイオマーカーを評価するほど、診断がより信頼できるようになることである。例えば、１、２、３、４、５、６又は７つを超えるバイオマーカーが、上記のように濃度の上昇又は低下を示す場合は、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗すること及び／又は高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度を検出及び／又は定量化するための予測力がより強い。

【0052】

イソバレリルグリシン及び場合により他のバイオマーカーに関する基準値は、試験対象から得られたイソバレリルグリシン及び場合により他のバイオマーカーのレベルを特徴づけるのに使用されるのと同じ単位を使用して測定されることが好ましい。したがって、イソバレリルグリシン及び場合により他のバイオマーカーのレベルが、μｍｏｌ／ｌ（μＭ）で示されるイソバレリルグリシン単位などの絶対値である場合は、基準値も、一般集団又は対象の選択対照集団における個体のμｍｏｌ／ｌ（μＭ）で示されるイソバレリルグリシン単位に基づく。

【0053】

さらに、基準値は単一のカットオフ値、例えば中央値又は平均でもよい。得られた体液試料のイソバレリルグリシン及び場合により他のバイオマーカーの基準値、例えば平均レベル、中央値レベル又は「カットオフ」レベルは、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｋｎａｐｐ，Ｒ．Ｇ．及びＭｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｃ．（１９９２）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．Ｗｉｌｌｉａｍ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｈａｒｕａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｐａ．に記載されているように、一般集団又は選択集団の個体の大規模試料をアッセイし、統計モデル、例えば陽性判定基準を選択するための予想値法又は最適な特異性（最も高い真陰性率）及び感度（最も高い真陽性率）を定義する受信者動作特性曲線を使用して確立することができる。

【0054】

当業者であれば理解していると予想されるが、正確な基準値の割り当て方は、例えば、性別、人種、遺伝形質、健康状態又は年齢によって変化する。

【0055】

本発明の方法では、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の低下は、過体重及び／又は肥満と関係がある障害を発生させることに対する確度の指標である。

【0056】

「過体重」は、成人については、ＢＭＩが２５〜３０の間であると定義される。「肥満指数」又は「ＢＭＩ」は、メートルでの身長の二乗で割ったｋｇでの体重の比を意味する。「肥満」は、動物、特にヒト及び他の哺乳動物の脂肪組織に貯蔵される天然エネルギーの蓄えが、ある種の健康状態又は死亡率の増加と関係があるポイントまで増大する状態である。「過肥」は、成人については、ＢＭＩが３０を越えると定義される。

【0057】

過体重及び／又は肥満と関係がある障害は、心血管代謝疾患及び／又は代謝制御不全であってもよい。

【0058】

本発明の方法は、例えば、食事誘導性体重増加に対する対象の感受性度を測定することを可能にする。したがって本方法は、現在、患者が、低体重、正常、過体重又は過肥であるかどうかに関係なく、高カロリーの、特に高脂肪の食事によって体重が増えることに対する患者の確度に従って、患者の層別化を可能にし得る。成人は、ＢＭＩが１８．５以下の場合、低体重と考えられる。

【0059】

本発明の方法は、低体重、正常、過体重又は過肥の対象において行うこともできる。特に、低体重、過体重又は過肥の対象において、本発明の方法は、対象の遺伝的素因を解明するのに役立ち得る。それに基づいて、理想的には、対象の全体的な健康状態及び生活様式のさらなる考慮の下で、健康状態を維持する又は取り戻すのに役立ち得る個別化された栄養療法を開発することができる。

【0060】

本発明の方法はヒトに限定されない。本発明の方法は、動物、例えば伴侶動物などでも使用することができる。ネコ又はイヌなどの伴侶動物を解析することができる。その解析に基づいて、良好な健康状態で伴侶動物が長生きするのに寄与する栄養療法を設計することができる。

【0061】

本出願で示される研究は、ＨＦ（高脂肪）誘導性肥満の発生に関する生理機構についての識見を提供し、特に、過肥の表現型の変動性に関連する特定の代謝適応を強調する。高脂肪の摂取は、ミトコンドリアの代謝経路の急速且つ一貫したアップレギュレーションを誘発し、エネルギーをより産生し、ミトコンドリアの脂肪酸の飽和を増大させる。ＨＦを与えたマウスの中で、肥満抵抗性（ＮＲ）マウスを特定し、このマウスは、ミトコンドリアの特定の代謝経路（β酸化、ブタノエート代謝及びロイシン異化）を特に活性化しており、エネルギー恒常性（ＬＦＤに匹敵するクレブス回路活性）を維持するようであった。したがって、発明者の結果は、ミトコンドリアの酸化経路の特異的な活性化は、エネルギー恒常性を保存すること及び燃料過負荷からミトコンドリアを保護することを可能にし得ることを示唆する。したがって、ミトコンドリアの役割は、肥満及びその関連する代謝障害の発生に極めて重要であるようである。したがって、ＨＦＤ給餌に対する不均一な適応の根底にある機構に関するこの包括的解析は、体重管理プログラム及び個別化された栄養的解決法に関して、新規且つ有望な見解を提供する。

【0062】

したがって、本発明の方法によって、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の低下又は高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度の増大を特定することができるならば、これは、ミトコンドリアの酸化経路の特異的な活性化がないことの指標であり得る。

【0063】

逆に、本発明の方法によって、高脂肪食誘導性体重増加に抵抗することに対する確度の増大、又は高脂肪食誘導性体重増加を起こしやすいことに対する確度の低下を特定することができるならば、これは、ミトコンドリアの酸化経路の特異的な活性化の指標であり得る。

【0064】

ミトコンドリアの酸化経路は、β酸化、ブタノエート代謝及びロイシン異化からなる群から選択することができる。

【0065】

本発明の方法は、素因の徴候を可視化する必要なしに対象の層別化を可能にするので、例えば、小児、１０代の若者、若年成人及び／又は過体重若しくは肥満になる危険性がある対象に適する。

【0066】

このような危険性は、意識することによって食事及び生活様式の点から適切に対応でき、過体重又は肥満に起因する可能性がある後年の起こり得る危険性を排除することができる。

【0067】

したがって、本方法は、対象の特定の群のための層別化した食事、又は特定の対象のための個別化された食事を考案するのに使用することができる。

【0068】

本明細書に開示される本発明の全ての特徴を自由に組み合わせることができることを、当業者なら理解するであろう。特に、本発明の使用について説明している特徴は、本発明の方法と組み合わせることができ、逆もまた同じである。さらに、本発明の異なる実施形態について説明されている特徴を組み合わせることができる。

【0069】

本発明を例として説明してきたが、特許請求の範囲で定義された本発明の範囲から逸脱することなく、変形及び修正を行うことができることを理解されたい。

【0070】

さらに、特定の特徴に対して既知の均等物が存在する場合、そうした均等物は、具体的に言及されたのと同様に本明細書に組み込まれる。本発明のさらなる利点及び特徴は、図及び非限定的な例から明らかである。

【実施例】

【0071】

動物の取扱法及び試料調製
実験は、適切な国の指針の下で、Ｎｅｓｔｌｅ研究センター（ＮＲＣ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において行った。１２時間−１２時間の明暗管理下において個々のケージでマウスを維持し、全実験を通してマウスに自由に餌を与えた。合計で８０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、まず標準的なＣＨＤ（ベースライン３４３７）を数週間与え、この処理の後に最初の尿収集を行った（ｔ０）。次いで、マウスを２群に分けた。２４匹のマウスに、タンパク質、ビタミン、ミネラル及び炭水化物の割合が最初の標準的な食事と異なるＣＨＤ（低脂肪Ｄ１２４５０Ｂ、組成物は補遺の図を参照されたい）を与えた。５６匹の他のマウスに、炭水化物と脂肪のレベルを除いて、栄養組成物が第二のＣＨＤに匹敵するＨＦＤ（高脂肪Ｄ１２４９２）を与えた。これらの２つの群を、それぞれ対照群及びＤＩＯ群として特徴づけた。食事を切り替えてから７日（ｔ１）及び６０日後（ｔ２）後に、再度、尿試料を採取した。全ての試料を、解析するまで−８０℃で急速凍結した。ｔ０、ｔ１、ｔ２において全てのマウスの体重測定も行って、ＨＦＤと対照の両方の群において体重増加をモニターした。ＨＦＤ及びＬＦＤ並びにＮＲ及びＳＲにおける体重増加の違いを、ノンパラメトリック検定（ウィルコクソン−マンホイットニーのＵ検定）によって評価した。ｔ１及びｔ２において各マウスの食物摂取量（ＦＩ）も記録した。ＬＦＤを与えたマウスと経時的に比較して、ＨＦＤを与えたマウスにおいてＦＩの有意な低下がある。ＳＲマウスも、両時点においてＮＲマウスよりＦＩが高い。群間のＦＩの差は、ウィルコクソン−マンホイットニーのＵ検定によって計算した。
^１Ｈ ＮＭＲ分光法

【0072】

４０μｌの体積の尿を、アジ化ナトリウム（３ｍＭ）及びＴＳＰ（０．５ｍＭ）を含む２０μｌ緩衝液（ＮａＨＰＯ_４、０．６Ｍ ｐＨ＝７）に希釈した。遠心分離してから、直径が１．７ｍｍのＮＭＲ管に注射器を使用して試料を移した。次いで、６４Ｋのデータポイントで標準シーケンスを６４回スキャンすることによって、^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを６００．１３ＭＨｚの分光計で記録した。ＮＭＲ実験の温度は、３００Ｋに維持した。尿のスペクトルの処理は、ＴＯＰＳＰＩＮ２．０ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。各スペクトルについて、１Ｈｚの線幅拡大に対応する指数関数をＦＩＤに乗じてから、フーリエ変換器によってスペクトルに変換した。次いで、スペクトルの相及びベースラインを手動で補正した。化学シフトをδ０でのＴＳＰシグナルを使用して較正した。スペクトルの帰属は、ＳＴＯＣＳＹ（統計的全相関分光法）、スペクトルデータベース及び公表された帰属を使用して達成した。
データ処理及び多変量データ解析

【0073】

最終的に、スペクトルデータ（δ０．２〜δ９．５）をＭａｔｌａｂソフトウェア（バージョン、ｔｈｅ ｍａｔｈｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ、Ｎａｔｗｉｃｋ ＭＡ）にインポートし、２２Ｋのデータポイントに変換した。水の共鳴の前飽和に関連する変動性を排除するために、水のピーク（δ４．７〜５．０５）の共鳴を各スペクトルから除去した。次いで、^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを全範囲に対して標準化し、「単位分散」スケーリングを使用して、様々な多変量統計（ＰＣＡ、ＯＰＬＳ及びＯＰＬＳ−ＤＡ）を適用した。逆スケーリング法を使用してＯＰＬＳ回帰係数を示すことができた。このようにして、モデルの群識別に関与する各ＮＭＲ変数の分散の比率を推定することができる。最も高い係数値を有する代謝物を示すヒートマップを構築することによって、ＨＦＤ給餌に対する短期及び長期の代謝応答の比較が容易になる。ＨＦＤ／ＬＦＤ又はＳＲ／ＮＲを識別する代謝物の相関係数値を取得することによって、ヒートマップを作成した。０．３のカットオフを超える相関係数をカラーマップ（各代謝物における共分散の値による赤から青への勾配）によって示す。したがって、ヒートマップによって、肥満の発生に対する短期及び長期の代謝応答の比較が容易になる。
一変量データ解析

【0074】

ＬＦＤ、ＨＦＤ、ＮＲ及びＳＲ群において、食事を切り替えてから７日後及び６０日後のこれらの代謝物の尿排泄を評価するために、尿の１Ｈ ＮＭＲスペクトルに帰属可能な、β酸化、ＢＣＡＡ酸化、クレブス回路及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド経路由来の中間代謝物を統合した。ベースラインに従ってこれらの代謝物の尿排泄を標準化するために、各代謝物について、７日目及び６０日目での統合物を０日目（介入前の期間中）での統合物で割った。各代謝物について得られた比を、ノンパラメトリックなマンホイットニー検定を使用して、各時点のＬＦＤ、ＨＦＤ、ＮＲ及びＳＲ群の間で比較した。
主要な発見及び最重要点
ＨＦＤを与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける体重増加の変動性

【0075】

肥満の発生に対する食事の寄与を研究するために、６０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、固形飼料食（ＣＨＤ）を１週間の介入前期間中に与えた、続いて食事を切り替え、ＬＦＤ（ｎ＝２０）又はＨＦＤ（ｎ＝４０）をマウスに６０日間与えた。介入前の期間中及び食事を切り替えてから７日後及び６０日後に体重を測定した（図１−１ Ａ）。体重のモニタリングによって、実験を通して、ＬＦＤを与えたマウスと比較して、ＨＦＤを与えたマウスにおいて有意な体重増加が示された。特に、ＨＦＤを与えたマウスの平均体重は、対照マウスよりも、７日目において１．５ｇ（ｐ＝３．９×１０^−７）重く、６０日目において４．５ｇ（ｐ＝２．３６×１０^−８）重かった。体重分布によって、７日目のＨＦＤ群の間に強い不均一性も明らかになり（変動係数ＣＶ＝０．０５）、これは、６０日目においてさらにいっそう顕著であった（ＣＶ＝０．１２０）（図１−１ Ｂ）。この知見は、ＨＦＤ群内に強い表現型変動性が存在することを強調し、これらの過肥の亜表現型に関連する特異的な代謝シグネチャーが存在することを示唆する。

【0076】

ＨＦ給餌に対する「強い応答個体」（ＳＲ）及び「非応答個体」（ＮＲ）を特徴づけるために、７日及び６０日のＨＦ給餌後の体重増加（ＢＷＧ）に従ってマウス集団を層別化した。６０日目のＢＷＧ分布の上半分にいる３匹のＳＲマウスを除いては、ＢＷＧ分布の上３分の１及び下３分の１に一貫して存在するマウスを、それぞれＮＲマウス及びＳＲマウスと指定した。この閾値は、各群において十分な試料を得（ＮＲマウスｎ＝１０ ＳＲマウス＝１４）、強力な統計的検定を実施するために、及びこれら２群間の代謝シグネチャーの有意差を特定するために選択された。ＮＲマウス、ＳＲマウス及びＬＦを与えたマウスの経時的な平均体重曲線（図１−２ Ｄ）により、実験を通して、ＳＲマウスは、ＮＲマウス及びＬＦを与えたマウスよりも有意に体重が増加することが明らかになった。興味深いことに、７日目において、ＮＲ群とＬＦＤ群の間の体重に有意差はなかった（ｐ＝０．１０）が、６０日目において、体重の有意な変動が確認された（ｐ＝７．６７×１０^−５）。さらに、ＮＲマウスの体重増加曲線（回帰係数＝３．８５）は、ＬＦを与えたマウスと類似しており、これは、ＮＲマウスの体重増加の挙動は、経時的にＬＦマウスに匹敵し、一方ＳＲマウスは、より速く体重が増える傾向があることを強調する。強い応答個体及び非応答個体の亜群を定義するこの早期の及び持続性の体重増加曲線の変化は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける食事誘導性肥満（ＤＩＯ）に対する差次的な素因の存在を示唆する。したがって、本発明者らは、ＨＦＤを与えたマウスの体重増加曲線を早期の代謝プロファイルに基づいて予測する性能を、本研究において試験する。
尿の代謝プロファイリングは、高脂肪誘導性肥満に関連する持続性の代謝シグネチャーを指摘する。

【0077】

食事誘導性肥満の発生と関係がある特異的な代謝シグネチャーを調べるために、^１Ｈ ＮＭＲ分光法を使用して、食事介入の１週前、食事介入してから７日後及び６０日後の尿代謝プロファイルを得た（図２−２ Ａ、Ｂ）。次いで、ＯＰＬＳ−ＤＡモデルを使用して、ＬＦ及びＨＦを与えたマウスからの尿代謝プロファイルを各時点で比較した。１つの予測成分及びいくつかの直交成分を使用して、各モデルを計算した。Ｒ^２Ｙ及びＱ^２Ｙ適合度統計量によって、直交成分の最適な数を決定した。７日目（図２−２ Ｃ）及び６０日目（図２−２ Ｄ）のモデルに対するＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロットは、ＨＦ給餌と関係がある強い代謝変動が予測成分（Ｔｐｒｅｄ）に沿って強調されるが、縦軸は、第一の直交成分（Ｔｏｒｔｈ）が、食事非依存性の影響と関連する群内変動性を反映することを説明することを示した。

【0078】

各モデルについて、相関係数が最も高い代謝物を特定し、これらをＬＦマウスとＨＦマウスの間の尿の代謝変動を示すヒートマップ（図２−２ Ｅ）に要約する。特に、カルニチン、ヘキサノイルグリシン及びＢＣＡＡ酸化の中間体（イソバレリルグリシン、α−ケト−βメチルバレレート及びα−ケトバレレート）のレベルは、７日目及び６０日目にＨＦ群において有意に増大した。逆に、微生物のコリン代謝（トリメチルアミン（ＴＭＡ）及びトリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡＯ））から産生されるメチルアミン誘導体並びに腸内細菌によるフェニルアラニン分解の最終産物（フェニルアセチルグリシン）のレベルは、実験全体を通して、ＨＦ群間において低下した。特に、７日目と６０日目の間のＴＭＡＯの尿中レベルの変動度は、ＨＦＤ給餌下での、ＴＭＡからＴＭＡＯへの転換の時間依存的なシフトを示唆する。したがって、ＨＦＤ処理は、腸内微生物叢活性の有意な変化を示し得る。ＨＦＤ給餌に対する時間依存的な代謝適応は、７日間ＨＦを与えたマウスの尿中インドキシルスルファートの有意な低減にも特徴づけられた。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）経路の最終産物（Ｎ１−メチル−２−ピリドン−５−カルボキサミド：２ＰＹ、及びＮ１−メチル−４−ピリドン−３−カルボキサミド：４ＰＹ）も６０日間ＨＦを与えたマウスと正に相関した。イソバレリルグリシン、α−ケト−β−メチルバレレート及びα−ケトイソバレレートの排泄は、ＬＦＤを与えた群と比較して、ＨＦＤを与えた群において有意に且つ一貫して経時的に増大したので、これらは、定性的且つ安定的な、ＤＩＯのバイオマーカー候補を構成する。
ＮＲ及びＳＲマウスの尿の代謝プロファイリングは、肥満の傾向及び肥満抵抗性表現型に関連する特定の代謝適応を強調する。

【0079】

ＳＲ及びＮＲマウスの代謝プロファイルを確立することによって、体重増加における最も高い逸脱と関係がある代謝物を特定することができた。ＮＲとＳＲの間の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルデータを、ペアワイズＯＰＬＳ−ＤＡモデルを使用して７日目及び６０日目に比較した（図３−１ Ａ、Ｂ）。７日目（図３−２ Ｃ）及び６０日目（図３−２ Ｄ）のＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロットは、予測成分（Ｔｐｒｅｄ）に沿って、ＮＲ及びＳＲマウスの間の良好な識別を示した。縦軸は、強い肥満関連性応答に対する直交性の変動を説明する。興味深いことに、ＮＲとＳＲマウスの尿代謝プロファイルは食事の切り替え前に差がないことが確認され、これは、固形飼料食が与えられた場合、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは全て類似の表現型及び代謝型を有することを強調する。

【0080】

群の分離に関与する代謝物を要約するヒートマップ（図３−２ Ｅ）は、短期間（７日）及び長期間（６０日）のＨＦ給餌中のＮＲ及びＳＲマウスに関する差次的な代謝プロファイルを示す。特に、ロイシン異化、β酸化及び短鎖脂肪酸産生に関与する特異的な代謝シグネチャーは、肥満の段階的変化と関係があった。実際には、ヘキサノイルグリシン、イソバレリルグリシン、ロイシン、アセテート及びイソブチレートが、全実験を通してＳＲマウスと負に相関した。これらの代謝物は、ＳＲマウスにおいて一貫してダウンレギュレートされていたので、肥満抵抗性表現型の安定的な候補マーカーを構成した。７日目及び６０日目におけるＳＲマウスとＮＲマウスの間での代謝プロファイルの比較は、表現型変動性と関係がある時間依存的な代謝シグネチャーも示した。アセテートのより少ない尿排泄が、７日のＨＦＤの後のＳＲマウスにおいて観察された。対照的に、ショ糖のより高い尿排泄が、同じ期間のＳＲマウスにおいて認められた。驚いたことに、タウリンは、ＨＦ給餌の７日後のＳＲマウスと正に相関し、６０日後のＳＲマウスと負に相関した。６０日のＨＦＤ後のＳＲマウスの尿代謝プロファイルはまた、クレアチン、グアニドアセテート、タルトレート、ヒップレート及びヒドロキシフェニルアセチルグリシンの増大を特徴とした。興味深いことに、ＤＩＯの定性的候補マーカーとして特徴づけられたヘキサノイルグリシン及びイソバレリルグリシンはまた、肥満抵抗性表現型の安定的な候補マーカーとしても特定された。これらの結果は、ミトコンドリアで起きているロイシン異化及びβ酸化はＨＦ給餌に強く影響を受け、それらの特異的な調節が肥満の発症に寄与し得ることを指摘した。
いくつかの代謝物の尿の排泄パターンは、ＨＦマウス及びＳＲマウスにおけるミトコンドリアの代謝の特異的な脱調節を指摘した。

【0081】

相補的一変量データ解析アプローチ（方法を参照）を用いて、ＨＦＤを与えたマウスにおけるミトコンドリア代謝の調節をさらに調べた。β酸化中間体：ヘキサノイルグリシン、カルニチン及びアシルカルニチンの尿排泄は、ＬＦを与えたマウスと比較してＨＦを与えたマウスの尿で一貫して増大し、これは、ミトコンドリアでの脂肪酸オーバーフローの増大及びβ酸化の活性化を示唆する。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド経路の最終産物（２ＰＹ、４ＰＹ）もＨＦＤ給餌後のマウスの尿で一貫して増大し、これは、β酸化及びペルオキシゾーム増殖因子のアップレギュレーションを示す。統合することによって、ＨＦを与えたマウスにおいて、ロイシン、バリン、イソロイシン並びにＢＣＡＡ異化の中間体（イソバレリルグリシン、α−ケト−βメチルバレレート及びα−ケトバレレート）が有意に且つ一貫して増大することが確かめられ、これは、ＨＦＤに関連したＢＣＡＡ異化のアップレギュレーションという仮説を支持する。ＬＦを与えたマウスと比較して、ＨＦＤから７日後のマウスにおいて、短期の尿中スクシネートの増大を本発明者らが観察したように、クレブス回路も、ＨＦを与えたマウスにおいてある程度調節され、ＨＦを与えたマウスの尿において一定であった。これらの結果は、バリン及びイソロイシンの異化がアップレギュレートされ、スクシニルＣｏＡの形成及び次のクレブス回路中間体の産生を誘導するという仮説を支持する。驚いたことに、他のクレブス回路中間体（シトレート、ｃｉｓ−アコニターゼ、α−ケトグルタレート）は、ＬＦを与えたマウスとＨＦを与えたマウスの間で有意差がなく、これは、ロイシン異化とアセチルＣｏＡを産生するβ酸化とクレブス回路の間の断絶を示唆する。特定の代謝調節は、他の代謝経路へのアセチルＣｏＡの流動の進路を変え得る。特に、ＨＦを与えたマウスの尿でのビニルアセチルグリシンレベル増大は、アセチルＣｏＡが、ブタノエート代謝及びビニルアセチルグリシンの形成に関連するアセトアセチルＣｏＡに再び向かうことを示唆する。これらの結果は、ＨＦＤは、エネルギー産生の増大につながり得る、ミトコンドリアの酸化経路及びクレブス回路のアップレギュレーションを誘導することを確証する。

【0082】

一変量データ解析によって、表現型変動性において、β酸化とＢＣＡＡ異化とクレブス回路の間の関連をより良く理解することもできるようになった。ＢＣＡＡ異化の中間体の統合によって、ＳＲマウス又はＬＦマウスと比較して、ＮＲマウスの尿においてイソバレリルグリシンのみが有意に高いことが示され、これは、肥満抵抗性マウスは、ロイシン異化の乱れだけと関係があったことを示す。ヘキサノイルグリシンは、全実験を通して、ＳＲマウスと比較してＮＲマウスの尿で有意に高かったが、カルニチン及びアシルカルニチンの尿排泄は、未変化のままであった。したがって、β酸化は、ＮＲマウスにおいて影響を受けるようであったが、ミトコンドリアへの脂肪酸の流れは、ＮＲマウスとＳＲマウスの間で一貫性がある。さらに、ＮＲマウスの尿においてビニルアセチルグリシンの有意な増大が観察され、アセチルＣｏＡがブタノエート代謝へ向けられることが示唆される。興味深いことに、７日のＨＦＤの後に、ＮＲマウスとＳＲマウスの間でクレブス回路活性の差は観察されなかった。６０日目では、ＳＲマウスの尿でスクシネートが有意に高く、これは、クレブス回路のアップレギュレーションを強調する。先に観察されたように、他のクレブス回路中間体（シトレート、α−ケトグルタレート、ｃｉｓ−アコニテート）の尿排泄はＮＲマウスとＳＲマウスの間で変化せず、これは、クレブス回路内での特異的な調節という仮説を支持する。本発明者らの結果は、長期間のＨＦＤの後、肥満傾向があるマウスは、クレブス回路の脱調節に特徴づけられるエネルギー代謝の機能障害と関係があることを示す。肥満抵抗性マウスにおけるβ酸化、ロイシン異化及びブタノエート代謝の急速な活性化は、エネルギー恒常性を維持することを可能にする脂肪酸オーバーフローに対する保護的な機構であり得る。

【0083】

強調された代謝物の体重増加との関係を、（^１Ｈ ＮＭＲ分光法で測定した時の）代謝物の尿中濃度、ベースライン（Ｔ０）からの倍数変化、及び（^１Ｈ ＮＭＲ分光法で測定した時の）尿クレアチンとの比を使用して評価した。食事の負荷に対する短期代謝応答（すなわちＴ７における）に基づいて、体重増加を予測する及びＮＲ又はＳＲとして個体を層別化する能力が重視された。表１に相関係数値を要約し、表２に一方倍数変化を報告する。より頑強なマーカーを選択するために、可変的な重要な特徴として、「アウトオブバッグ（ｏｕｔ−ｏｆ−ｂａｇ）」の％平均減少精度データを使用した。このようにして、対象の体重増加感受性（ＮＲ及びＳＲ表現型、図５）に従って、より良く対象を識別する変数を決定することができ、これによって、ＮＲ又はＳＲ表現型として対象を層別化するための最も頑強な代謝のマーカーとして、ヘキサノイルグリシン、イソバレロイルグリシン、ＴＭＡＯ及びアセテートが示された。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】