特許 6381033 前立腺癌と前立腺肥大を識別するための方法およびキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6381033

(24)【登録日】2018年8月10日

(45)【発行日】2018年8月29日

(54)【発明の名称】前立腺癌と前立腺肥大を識別するための方法およびキット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20180820BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20180820BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/574 B

   G01N33/543 541A

【請求項の数】5

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2014-540871(P2014-540871)

(86)(22)【出願日】2013年10月9日

(86)【国際出願番号】JP2013077495

(87)【国際公開番号】WO2014057983

(87)【国際公開日】20140417

【審査請求日】2016年9月23日

(31)【優先権主張番号】特願2012-226489(P2012-226489)

(32)【優先日】2012年10月12日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２３年度、独立行政法人科学技術振興機構、研究成果展開事業、研究成果最適展開支援プログラム、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504229284

【氏名又は名称】国立大学法人弘前大学

(73)【特許権者】

【識別番号】507219686

【氏名又は名称】静岡県公立大学法人

(74)【代理人】

【識別番号】100106611

【弁理士】

【氏名又は名称】辻田 幸史

(74)【代理人】

【識別番号】100087745

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 善廣

(74)【代理人】

【識別番号】100098545

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 伸一

(72)【発明者】

【氏名】大山 力

(72)【発明者】

【氏名】米山 徹

(72)【発明者】

【氏名】飛澤 悠葵

(72)【発明者】

【氏名】畠山 真吾

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 隆

(72)【発明者】

【氏名】左 一八

(72)【発明者】

【氏名】山口 真帆

【審査官】 吉田 将志

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−０５５１０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５２９１８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 木下タロウ，「糖鎖の生物機能の解明と利用技術」，URL(http://www.jst.go.jp/kisoken/crest/report/heisei17/pdf/a10/f01/s013.pdf)，２００５年，ＵＲＬ，http://www.jst.go.jp/kisoken/crest/report/heisei17/pdf/a10/f01/s013.pdf

【文献】 秋元晋，DPC-イムライズPSAキットの臨床的検討，泌尿器外科，日本，１９９５年１０月，Vol.8/No.10，939-943

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

前立腺癌と前立腺肥大を識別するためにフリーＰＳＡ量を測定する方法であって、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を含む分析試料と抗フリーＰＳＡ抗体を固定化した担体を接触させて担体に固定化した抗フリーＰＳＡ抗体にフリーＰＳＡを結合させた後、固定化した抗フリーＰＳＡ抗体にフリーＰＳＡが結合した担体と末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を接触させて担体に固定化した抗フリーＰＳＡ抗体に結合したフリーＰＳＡに末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を結合させ、末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量を測定し、得られた測定量を予め設定された前立腺癌と前立腺肥大のカットオフ値と比較すること、を含むフリーＰＳＡ量を測定する方法。

【請求項2】

ＰＳＡを含む分析試料が、血清、尿、前立腺組織抽出液、精液、膀胱洗浄液からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１記載の方法。

【請求項3】

抗フリーＰＳＡ抗体が抗ヒトフリーＰＳＡ特異的モノクローナル抗体（コンプレックスＰＳＡと反応しないもの）である請求項１記載の方法。

【請求項4】

担体が磁性粒子である請求項１記載の方法。

【請求項5】

抗フリーＰＳＡ抗体を固定化した担体と、末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を少なくとも含む前立腺癌と前立腺肥大を識別するためにフリーＰＳＡ量を測定する請求項１記載の方法を行うためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、前立腺癌と前立腺肥大を識別するための方法およびキットに関する。

【背景技術】

【0002】

前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：以下「Ｐｃａ」と略す）は男性の主要な死亡原因であることは周知の通りであり、前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：以下「ＰＳＡ」と略す）はＰｃａに対する最も重要な腫瘍マーカーとして認識されている（非特許文献１）。ＰＳＡは約３４ｋＤａの糖蛋白で、糖鎖はその約８％を占める。Ｐｃａの早期診断に対する血清ＰＳＡテストの有用性は既に多くの文献に記載されているが、Ｐｃａに罹患している男性と前立腺肥大（ｂｅｎｉｇｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ：以下「ＢＰＨ」と略す）に罹患している男性の間にはグレーゾーン（ｇｒａｙ ｚｏｎｅ）と呼ばれるＰｃａともＢＰＨともどちらとも言えない領域がある（非特許文献２）。そこで２つの病変を正確に区別するための試み、例えば、ＰＳＡ密度、ＰＳＡ勾配、フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡの比などを指標にした試みがこれまで実施されてきた。しかしながら、こうした方法では２つの病変を正確に区別することは困難である。そのため、現在の血清ＰＳＡテストはＰｃａに特異的ではなく、感度と特異度を共に満足させる適切なカットオフ値がないことが世界的な問題となっている。

【0003】

このような背景のもと、本発明者である大山らのグループは、精嚢液から精製したＰＳＡをＮ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｆで処理し、ＰＳＡのＮ型糖鎖を切り出してｍａｔｒｉｘ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ）ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＳ）によって解析することで、ＰＳＡの糖鎖として１９種類を同定し、ＰＳＡの糖鎖が非常に多様性に富んでいることを明らかにした（非特許文献３）。それ以前にＳｔａｍｅｙらのグループは、ＰＳＡの糖鎖としては２本鎖で末端にシアル酸がα（２，６）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖のみが発現していると報告していたが（非特許文献４）、末端のシアル酸はα（２，６）結合でのみでなくα（２，３）結合でガラクトースに結合しているものも約１０％存在することが大山らのグループによって明らかになった。その後、大山らのグループは、ＰＳＡを糖鎖のみでなく、ＰＳＡのペプチド配列を含む状態でＭＳ−ＭＳによって解析することで、ＰＳＡのＮ型糖鎖の末端シアル酸残基は、癌化に伴い、α（２，６）結合でよりもα（２，３）結合でガラクトースに結合するものが増加することを明らかにした（非特許文献５）。

【0004】

以上の知見に鑑みれば、末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するＰＳＡ量を指標にしてＰｃａとＢＰＨを識別することが可能であると考えられ、実際に、本発明者である大山が特許文献１において提案した末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するイヌエンジュレクチンを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、ＰｃａとＢＰＨを識別できることが確認されている。しかしながら、イヌエンジュレクチンを用いたアフィニティークロマトグラフィーによってＰｃａとＢＰＨを識別する方法は、これまでに提案されてきた方法と全く異なる方法として注目されるが、末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するＰＳＡ量はトータルＰＳＡ量のわずか１〜２％と極微量であるため、精度の高い識別を行うためには分析試料として血清を大量（１０ｍｌ程度）に必要とするという問題がある。また、使用するイヌエンジュレクチンは天然物からの抽出物であるため、ロット間での品質のばらつきが認められるという問題もある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第４５１４９１９号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｓｔａｍｅｙ ＴＡ，Ｙａｎｇ Ｎ，Ｈａｙ ＡＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９８７；３１７：９０９−９１６

【非特許文献2】Ｃａｔａｌｏｎａ ＷＪ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ １９９８；２７９：１５４２−１５４７

【非特許文献3】Ｏｈｙａｍａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００４；１４：６７１−６７９

【非特許文献4】Ｂｅｌａｎｇｅｒ Ａ，Ｖａｎ Ｈａｌｂｅｅｋ Ｈ，Ｇｒａｖｕｘｅｓ ＨＣ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ，１９９５；２７：１８７−１９７

【非特許文献5】Ｔａｊｉｒｉ Ｍ，Ｏｈｙａｍａ Ｃ，Ｗａｄａ Ｙ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８；１８：２−８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

そこで本発明は、少ない分析試料で高感度に再現性よくＰｃａとＢＰＨを識別する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定法によって分析試料中に含まれる末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量を測定することで、少ない分析試料で高感度に再現性よくＰｃａとＢＰＨを識別できることを見出した。

【0009】

上記の知見に基づいてなされた本発明のＰｃａとＢＰＨを識別するためにフリーＰＳＡ量を測定する方法は、請求項１記載の通り、ＰＳＡを含む分析試料と抗フリーＰＳＡ抗体を固定化した担体を接触させて担体に固定化した抗フリーＰＳＡ抗体にフリーＰＳＡを結合させた後、固定化した抗フリーＰＳＡ抗体にフリーＰＳＡが結合した担体と末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を接触させて担体に固定化した抗フリーＰＳＡ抗体に結合したフリーＰＳＡに末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を結合させ、末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量を測定し、得られた測定量を予め設定されたＰｃａとＢＰＨのカットオフ値と比較すること、を含むものである。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、ＰＳＡを含む分析試料が、血清、尿、前立腺組織抽出液、精液、膀胱洗浄液からなる群より選択される少なくとも１つであるものである。
また、請求項３記載の方法は、請求項１記載の方法において、抗フリーＰＳＡ抗体が抗ヒトフリーＰＳＡ特異的モノクローナル抗体（コンプレックスＰＳＡと反応しないもの）であるものである。
また、請求項４記載の方法は、請求項１記載の方法において、担体が磁性粒子であるものである。
また、本発明のＰｃａとＢＰＨを識別するためにフリーＰＳＡ量を測定する請求項１記載の方法を行うためのキットは、請求項５記載の通り、抗フリーＰＳＡ抗体を固定化した担体と、末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を少なくとも含むものである。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、少ない分析試料で高感度に再現性よくＰｃａとＢＰＨを識別する方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】実施例１における、Ｐｃａ患者とＢＰＨ患者の血清中の末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量の測定結果である（蛍光強度による）。

【図2】同、測定結果に基づくＲＯＣ曲線である。

【図3】実施例２における、Ｐｃａ患者とＢＰＨ患者の血清中の末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量の測定結果（左）と、この測定結果に基づくＲＯＣ曲線（右）である。

【図4】実施例３における、Ｐｃａ患者とＢＰＨ患者の血清中の末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量の測定結果（左）と、この測定結果に基づくＲＯＣ曲線（右）である。

【図5】実施例４における、Ｐｃａ患者とＢＰＨ患者の血清中の末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量の測定結果である（ブランク試料の蛍光強度またはＨＬＴ試料の蛍光強度で補正したもの）。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明のＰｃａとＢＰＨを識別するための方法は、ＰＳＡを含む分析試料と抗フリーＰＳＡ抗体を固定化した担体を接触させて担体に固定化した抗フリーＰＳＡ抗体にフリーＰＳＡを結合させた後、固定化した抗フリーＰＳＡ抗体にフリーＰＳＡが結合した担体と末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を接触させて担体に固定化した抗フリーＰＳＡ抗体に結合したフリーＰＳＡに末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を結合させ、末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量を測定し、得られた測定量を予め設定されたＰｃａとＢＰＨのカットオフ値と比較することにより、カットオフ値よりも多い場合はＰｃａであるかその蓋然性が高く、少ない場合はＢＰＨであるかその蓋然性が高いと判定することによるものである。

【0013】

本発明において、ＰＳＡを含む分析試料としては、血清、尿、前立腺組織抽出液、精液、膀胱洗浄液などが挙げられる。その調製は自体公知の方法によって行えばよい。分析試料は少量であってよい。望ましくは１〜１０００μｌ、より望ましくは５〜５００μｌ、最も望ましくは１０〜１００μｌである。

【0014】

抗フリーＰＳＡ抗体を固定化した担体は、市販の抗フリーＰＳＡ抗体と担体を用いて自体公知の方法によって調製することができる。末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量を高感度で測定するため、抗フリーＰＳＡ抗体として、抗ヒトフリーＰＳＡ特異的モノクローナル抗体（コンプレックスＰＳＡと反応しないもの）を用いることが望ましい（例えばクローン２Ｅ２由来のものやクローン８Ａ６由来のものなどが市販されている）。担体は、磁性粒子やウェルプレートなどの抗体を固定化することができるものであればどのようなものであってもよいが、磁力によって容易に回収することができるので取扱い性に優れるという点において磁性粒子が望ましい。なお、本発明において「フリーＰＳＡ」はα１−アンチキモトリプシンなどの蛋白と結合していないＰＳＡを意味し、非蛋白結合型ＰＳＡや遊離型ＰＳＡとも称される（コンプレックスＰＳＡは蛋白と結合しているＰＳＡを意味する）。

【0015】

末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体は、末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖、即ち、Ｓｉａα（２，３）Ｇａｌ糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体であればどのようなものであってもよい。市販のものとしては本発明者である鈴木らのグループによって確立されたＨＹＢ４モノクローナル抗体（和光純薬社）が例示されるがこれに限定されるわけではない。

【0016】

ＰＳＡを含む分析試料と抗フリーＰＳＡ抗体を固定化した担体を接触させて担体に固定化した抗フリーＰＳＡ抗体にフリーＰＳＡを結合させる工程と、固定化した抗フリーＰＳＡ抗体にフリーＰＳＡが結合した担体と末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を接触させて担体に固定化した抗フリーＰＳＡ抗体に結合したフリーＰＳＡに末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を結合させる工程は、いずれも例えば、２℃〜５℃の温度条件で１０分間〜３時間行えばよい。末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量の測定は、例えばＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）サンドイッチ法やフローサイトメトリー法によって行うことができる。後者の場合、測定は例えば検出可能な蛍光標識を行った二次抗体を用いて行えばよいが、末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を蛍光標識して二次抗体を用いずに行うこともできる。なお、抗体の標識は検出可能なものであればどのようなものであってもよく、蛍光標識に限定されるわけではない。測定の際に必要に応じて、洗浄、精製、分画といった操作を行ってもよいことは言うまでもない。また、抗フリーＰＳＡ抗体を固定化した担体と、末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体は、ＰｃａとＢＰＨを容易かつ簡便に識別することができるように洗浄液などとともにキット化してもよい。

【0017】

こうして測定された末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量を予め設定されたＰｃａとＢＰＨのカットオフ値と比較することにより、カットオフ値よりも多い場合はＰｃａであるかその蓋然性が高く、少ない場合はＢＰＨであるかその蓋然性が高いと判定することができる。カットオフ値は、Ｐｃａに罹患している男性群の測定値とＢＰＨに罹患している男性群の測定値をもとに設定することができる。例えば蛍光標識を用いて測定する場合、カットオフ値は蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）として、測定条件などに応じて１〜１００００の範囲にある数値で設定することができる。

【実施例】

【0018】

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。

【0019】

参考例１：末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するＨＹＢ４モノクローナル抗体の作製
本発明による前立腺癌と前立腺肥大の識別に用いる末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を次の手順によって作製した。

【0020】

（１）抗原の調製
糖脂質であるＩＶ^３ＮｅｕＡｃｎＬｃ_４Ｃｅｒ（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１’Ｃｅｒ）を免疫原として使用した。

【0021】

（２）ハイブリドーマの作製
ＩＶ^３ＮｅｕＡｃｎＬｃ_４Ｃｅｒ（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１’Ｃｅｒ）２２８μｇをＥｔＯＨ１１４μｌに溶かし、超音波処理後、ＰＢＳ １８２０μｌを加えて、３７℃に加温した。その後、アジュバントとして酸処理したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ菌体膜画分をＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに懸濁した溶液５６８μｌを加えて３７℃、１０分間静置させた。この混合溶液２００μｌを０，４，７，１１，２１，２５日目にＣ３Ｈマウスに尾静脈内投与した。最終投与後３日目に、免疫したマウスの脾臓から調製したリンパ球をケーラーとミルシュタインの常法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）に従って、細胞融合に供した。融合相手の親細胞に、マウス骨髄腫細胞株であるＰＡＩ（ヒューマンサイエンス研究資源バンク、ＪＣＲＢ０１１３）を用い、融合剤としてはポリエチレングリコール４０００（メルク社）を用いた。このようにして融合した細胞は、ＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴のマイクロカルチャープレートに分注して培養した。約２週間後、コロニー陽性ウェルの培養上清中の抗体産生をＩＶ^３ＮｅｕＡｃｎＬｃ_４Ｃｅｒを抗原とするＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。スクリーニングは９６穴マイクロタイタープレート（ダイナテック社、ＩＭＭＵＬＯＮ １Ｂ）を用いて次のようにして行った。ＩＶ^３ＮｅｕＡｃｎＬｃ_４Ｃｅｒを９５％ＥｔＯＨで０．１ｎｍｏｌ／５０μｌに調製し、５０μｌ／ｗｅｌｌとなるように加えた。ブランクとなるウェルには９５％ＥｔＯＨ５０μｌを入れた。減圧下でＥｔＯＨを蒸発させ、抗原糖脂質を固相化後、１％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社、Ａ６７８４）含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−１）を２００μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、室温に１時間放置した。ＰＢＳ−１を除去後、ハイブリドーマ培養上清を５０μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、室温にて１時間反応させた。培養上清を除去後、ＰＢＳ１００μｌ／ｗｅｌｌでウェルを１回洗浄した。ＰＢＳ−１で１００００倍希釈した二次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＨＲＰ）溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、室温にて１時間反応させた。二次抗体溶液を除去後、ウェルをＰＢＳ１００μｌ／ｗｅｌｌで５回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質（Ｏ−フェニレンジアミン２ｍｇを８０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．６）５ｍｌ、３０％過酸化水素２μｌで溶解したもの）を１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように加えた。遮光放置して発色が見られたところで１Ｍ ＨＣｌ１００μｌ／ｗｅｌｌを加えて発色を停止させた。その後、測定波長４９２ｎｍ、対照波長６３０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。高い抗体産生能、良好な増殖能をもつ３つのハイブリドーマクローンが得られた（抗体産生陽性率：０．５％）。得られたクローンが産生する抗体のクラス（免疫グロブリンのタイプ）はすべてＩｇＧ３（κ）であった。以上のようにして選択されたハイブリドーマのうち、クローンＨＹＢ４由来のモノクローナル抗体がＳｉａα（２，３）Ｇａｌ糖鎖と特異的に反応した。

【0022】

（３）ＨＹＢ４モノクローナル抗体の調製
（２）において得られたハイブリドーマ（クローンＨＹＢ４）を、７５ｃｍ２フラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ社、４３０７２０）を用いて、１０％（ｖ／ｖ）Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ニッスイ社、０５９１８）２５ｍｌ中、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で２日間前培養した。７５ｃｍ２フラスコ２本から細胞を回収し、Ｅ−ＲＤＦ培地（極東社、２６５００）１ｌに懸濁後、大量培養装置（スピンナーフラスコ）に移し、３７℃で４日間回転培養を行った。この培養液中にＳｉａα（２，３）Ｇａｌ糖鎖と特異的に反応するモノクローナル抗体が高濃度に含まれていた。クローンＨＹＢ４由来の培養液は、プロテインＡセファロースによるアフニティクロマトグラフィーで精製した。こうしてハイブリドーマ（クローンＨＹＢ４）から調製したＨＹＢ４モノクローナル抗体は、免疫グロブリンのタイプがＩｇＧ３で、分子量は約１５万ダルトンであった。こうして確立されたＨＹＢ４モノクローナル抗体は、和光純薬社から市販されている。

【0023】

実施例１：ＨＹＢ４モノクローナル抗体を用いたＰｃａとＢＰＨの識別（その１）
以下の手順によって行った。

【0024】

（１）担体への抗フリーＰＳＡ抗体の固定化
磁性ビーズであるＭａｇｐｌｅｘ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社）を担体として用い、その表面に抗フリーＰＳＡ抗体をＸＭＡＰ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔのマニュアルに従って固定した。具体的には、１．５ｍｌチューブに６．２５×１０^６個／５００μｌのＭａｇｐｌｅｘ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅを添加し、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で２分間、静置した。磁性ビーズ沈殿後、上清を吸引し、除去した。チューブへ５００μｌのＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１０秒間混合後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で２分間、静置した。磁性ビーズ沈殿後、上清を吸引し、除去した。再度チューブへ４００μｌのＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１０秒間混合した。次に５０μｌのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳと５０μｌのＥＤＣ溶液を添加し、１０秒間混合後、２０分間室温で放置した。Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で２分間、静置した。磁性ビーズ沈殿後、上清を吸引し、除去した。磁性ビーズを洗浄するため、５００μｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１０秒間混合後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で２分間、静置した。磁性ビーズ沈殿後、上清を吸引し、除去した。この洗浄操作を計３回繰り返した。２５μｇの抗ヒトフリーＰＳＡ特異的モノクローナル抗体（クローン２Ｅ２由来のコンプレックスＰＳＡと反応しない抗フリーＰＳＡ抗体）（フナコシ社）を１０００μｌのＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒに混合し、磁性ビーズの入ったチューブに添加した。室温で緩やかに混合（１５−３０ｒｐｍ）しながら２時間放置した。Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で２分間、静置した。磁性ビーズ沈殿後、上清を吸引し、除去した。磁性ビーズを洗浄するため、５００μｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１０秒間混合後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で２分間、静置した。磁性ビーズ沈殿後、上清を吸引し、除去した。この洗浄操作を計３回繰り返した。最後に１ｍｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１μｌあたり６２５０個の抗フリーＰＳＡ抗体を固定化したＭａｇｐｌｅｘ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅを調製し、使用するまで４℃で保存した。

【0025】

（２）Ｌｕｍｉｎｅｘシステムを用いた末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡの定量
（Ａ）定量対象者
トータルＰＳＡのレベルが２０．０ｎｇ／ｍｌ以下のＰｃａ患者７９名およびＢＰＨ患者９６名とし、それぞれの患者から血清を採取し、測定を行った。患者の組織病理学的診断は前立腺生検を行って確認した。患者の年齢、ＰＳＡ値、病理組織学的悪性度分類および臨床病期を表１に示す。

【0026】

【表1】

【0027】

（Ｂ）定量方法
９６穴白色プレート（ＷＨＡＴＭＡＮ社）の各ウェルに（１）において調製した１２５００個／２μｌの抗フリーＰＳＡ抗体固定化Ｍａｇｐｌｅｘ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅを添加した。Ｃａｒｂｏｆｒｅｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（フナコシ社）を５０μｌ添加し、磁性ビーズをブロッキングした後、各ウェルに分析試料である血清を２０μｌ添加し、１時間、４℃で放置後、磁性ビーズを１００μｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳＴ）で３回洗浄した。次に５０μｌのＨＹＢ４モノクローナル抗体を混合し、１時間、４℃で放置した。磁性ビーズを５０μｌのＴＢＳＴで３回洗浄後、５０μｌのＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ蛍光色素（ＰＥ）標識抗マウスＩｇＧ３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を混合し、４５分、室温で放置後、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローメトリーに９６穴白色プレートをセットし、各ウェルの蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定した。

【0028】

（Ｃ）定量結果
図１に示す。図１から明らかなように、Ｐｃａ患者の血清の蛍光強度は、ＢＰＨ患者の血清の蛍光強度よりも有意に高かった（Ｐ＜０．００１，Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−ｔｅｓｔ）。これは即ち、Ｐｃａ患者の血清中の末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量は、ＢＰＨ患者の血清中のそれより多いことを意味する。また、この定量結果からＲｅｌａｔｉｖｅ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ（ＲＯＣ曲線）により解析を行ったところ、ＭＦＩ値のｃｕｔｏｆｆ＝１２８．５で、感度０．８３５４、特異度０．７０８３、ＡＵＣ（曲線下面積：Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ）＝０．８４４５であった（図２）。

【0029】

（３）ＰｃａとＢＰＨの識別
（２）で設定したＭＦＩのカットオフ値を基準にして本発明の方法によってＰｃａとＢＰＨの識別を行ったところ、従来のＰＳＡ検査でＰｃａの疑いがあると判断された患者（１７７名）で針生検を施行してＢＰＨと診断された患者（９８名）のうちの約７５％（７３名）の患者についてＢＰＨと判定できた。以上の結果から、本発明によってＰｃａとＢＰＨを少ない分析試料で高感度に再現性よく識別できることがわかった。現在行われているＰｃａ診断法としての血清ＰＳＡテストではＰｃａとＢＰＨの識別は困難であり、ＰＳＡ値が４ｎｇ／ｍｌ以上の場合、前立腺に針を刺入する生検が必要となる。しかしながら、針生検を施行した患者のうちＰｃａと診断される患者は約２０％に過ぎず、結果として残りの約８０％の患者には本来不要であった針生検を施行せざるを得ないのが現状である。しかも針生検は侵襲的であり、出血や感染症などの重篤な有害事象を伴うことが懸念される。本発明によれば、ＰｃａとＢＰＨを少ない分析試料で高感度に再現性よく識別できるので、針生検の施行を必要とする症例の絞り込みが可能になるため、これまで困難であった非侵襲的なＰｃａ診断の実施ができる。

【0030】

実施例２：ＨＹＢ４モノクローナル抗体を用いたＰｃａとＢＰＨの識別（その２）
以下の手順によって行った。

【0031】

（１）担体への抗フリーＰＳＡ抗体の固定化
磁性ビーズであるＭａｇｐｌｅｘ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社）を担体として用い、その表面に抗フリーＰＳＡ抗体をＸＭＡＰ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔのマニュアルに従って固定した。具体的には、１．５ｍｌチューブに１．２５×１０^７個／１０００μｌのＭａｇｐｌｅｘ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅを添加し、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で２分間、静置した。磁性ビーズ沈殿後、上清を吸引し、除去した。チューブへ５００μｌのＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１０秒間混合後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で２分間、静置した。磁性ビーズ沈殿後、上清を吸引し、除去した。再度チューブへ４００μｌのＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１０秒間混合した。次に５０μｌのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳと５０μｌのＥＤＣ溶液を添加し、１０秒間混合後、２０分間室温で放置した。Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で２分間、静置した。磁性ビーズ沈殿後、上清を吸引し、除去した。磁性ビーズを洗浄するため、５００μｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１０秒間混合後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で２分間、静置した。磁性ビーズ沈殿後、上清を吸引し、除去した。この洗浄操作を計３回繰り返した。６２．５μｇの抗ヒトフリーＰＳＡ特異的モノクローナル抗体（クローン８Ａ６由来のコンプレックスＰＳＡと反応しない抗フリーＰＳＡ抗体）（Ａｂｃａｍ社）を５００μｌのＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒに混合し、磁性ビーズの入ったチューブに添加した。室温で緩やかに混合（１５−３０ｒｐｍ）しながら２時間放置した。Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で２分間、静置した。磁性ビーズ沈殿後、上清を吸引し、除去した。磁性ビーズを洗浄するため、５００μｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１０秒間混合後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で２分間、静置した。磁性ビーズ沈殿後、上清を吸引し、除去した。この洗浄操作を計３回繰り返した。最後に２ｍｌのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１μｌあたり６２５０個の抗フリーＰＳＡ抗体を固定化したＭａｇｐｌｅｘ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅを調製し、使用するまで４℃で保存した。

【0032】

（２）Ｌｕｍｉｎｅｘシステムを用いた末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡの定量
（Ａ）定量対象者
トータルＰＳＡのレベルが１０．０ｎｇ／ｍｌ以下のＰｃａ患者１３８名およびＢＰＨ患者１７６名とし、それぞれの患者から血清を採取し、測定を行った。患者の組織病理学的診断は前立腺生検を行って確認した。患者の年齢、ＰＳＡ値、病理組織学的悪性度分類および臨床病期を表２に示す（表中、Ｎｏｎ−ＰＣａはＢＰＨ患者を意味する）。

【0033】

【表2】

【0034】

（Ｂ）定量方法
実施例１に記載の方法と同様の方法で行った。

【0035】

（Ｃ）定量結果
図３左に示す（図中、Ｎｏｎ−ＰＣａはＢＰＨ患者を意味する）。図３左から明らかなように、Ｐｃａ患者の血清の蛍光強度は、ＢＰＨ患者の血清の蛍光強度よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０００１，Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−ｔｅｓｔ）。これは即ち、Ｐｃａ患者の血清中の末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡ量は、ＢＰＨ患者の血清中のそれより多いことを意味する。また、この定量結果からＲｅｌａｔｉｖｅ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ（ＲＯＣ曲線）により解析を行ったところ、ＭＦＩ値のｃｕｔｏｆｆ＝１１３０で、感度９０．６％、特異度６４．２％、ＡＵＣ＝０．８４であった（図３右：Ｓ２，３ＰＳＡ）。これに対し、トータルＰＳＡ測定法はＡＵＣ＝０．６１、％フリーＰＳＡ測定法（フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡの比を指標にした方法）はＡＵＣ＝０．６０であった（図３右：図中、ＰＳＡはトータルＰＳＡ測定法、％ｆＰＳＡは％フリーＰＳＡ測定法を意味する）。よって、本発明の方法は感度９０％以上であってＡＵＣ＝０．８０以上であることは、本発明の方法がＰｃａとＢＰＨの識別精度に優れていることを裏付けるものであった。本発明の方法と、トータルＰＳＡ測定法および％フリーＰＳＡ測定法について、特異度、診断精度、陽性診断率、陰性診断率を比較した結果を表３に示す（表中、Ｓ２，３ＰＳＡは本発明の方法、ＰＳＡはトータルＰＳＡ測定法、％ｆＰＳＡは％フリーＰＳＡ測定法を意味する）。表３から明らかなように、本発明の方法によれば、特異度６０％以上、診断精度７０％以上、陽性診断率６０％以上、陰性診断率８０％以上でもって、ＰｃａとＢＰＨを識別できることがわかった。

【0036】

【表3】

【0037】

実施例３：ＨＹＢ４モノクローナル抗体を用いたＰｃａとＢＰＨの識別とイヌエンジュレクチンを用いたＰｃａとＢＰＨの識別の比較
以下の手順によって行った。

【0038】

（１）担体への抗フリーＰＳＡ抗体の固定化
実施例２に記載の方法と同様の方法で行った。

【0039】

（２）Ｌｕｍｉｎｅｘシステムを用いた末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡの定量
（Ａ）定量対象者
トータルＰＳＡのレベルが２０．０ｎｇ／ｍｌ以下のＰｃａ患者４８名およびＢＰＨ患者５４名とし、それぞれの患者から血清を採取し、測定を行った。患者の組織病理学的診断は前立腺生検を行って確認した。患者の年齢、ＰＳＡ値、病理組織学的悪性度分類および臨床病期を表４に示す（表中、Ｎｏｎ−ＰＣａはＢＰＨ患者を意味する）。

【0040】

【表4】

【0041】

（Ｂ）定量方法
（ｉ）ＨＹＢ４モノクローナル抗体を用いる場合
実施例１に記載の方法と同様の方法で行った。

【0042】

（ｉｉ）イヌエンジュレクチンを用いる場合
９６穴白色プレート（ＷＨＡＴＭＡＮ社）の各ウェルに（１）において調製した１２５００個／２μｌの抗フリーＰＳＡ抗体固定化Ｍａｇｐｌｅｘ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅを添加した。Ｃａｒｂｏｆｒｅｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（フナコシ社）を５０μｌ添加し、磁性ビーズをブロッキングした後、各ウェルに分析試料である血清を２０μｌ添加し、１時間、４℃で放置後、磁性ビーズを１００μｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳＴ）で３回洗浄した。次に５０μｌのビオチン標識イヌエンジュレクチン（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＭＡＡ：Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を混合し、１時間、４℃で放置した。磁性ビーズを５０μｌのＴＢＳＴで３回洗浄後、５０μｌのＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ蛍光色素（ＰＥ）標識ストレプトアビジン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を混合し、４５分、室温で放置後、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローメトリーに９６穴白色プレートをセットし、各ウェルの蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。

【0043】

（Ｃ）定量結果
図４左に示す（図中、Ｎｏｎ−ＰＣａはＢＰＨ患者、ＨＹＢ４は本発明の方法、ＭＡＡはイヌエンジュレクチンを用いた方法を意味する）。図４左から明らかなように、本発明の方法によれば、Ｐｃａ患者の血清の蛍光強度とＢＰＨ患者の血清の蛍光強度の違いを、２０μｌという少ない血清量で認識することができたが、イヌエンジュレクチンを用いた方法ではできなかった。また、この定量結果からＲｅｌａｔｉｖｅ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ（ＲＯＣ曲線）により解析を行ったところ、図４右から明らかなように、本発明の方法はＡＵＣ＝０．８５６１であった（Ｓ２，３ＰＳＡ ＨＹＢ４）。これに対し、イヌエンジュレクチンを用いた方法はＡＵＣ＝０．６２５６であり（Ｓ２，３ＰＳＡ ＭＡＡ）、トータルＰＳＡ測定法のＡＵＣ（０．５３０５：ＰＳＡ）と％フリーＰＳＡ測定法のＡＵＣ（０．６５８２：％ｆＰＳＡ）と大差がなかった。よって、本発明の方法は、イヌエンジュレクチンを用いた方法と比較して、少ない分析試料でもＰｃａとＢＰＨの識別精度が優れていることがわかった。

【0044】

実施例４：ＨＹＢ４モノクローナル抗体を用いたＰｃａとＢＰＨの識別のためのカットオフ値の設定
実施例２における本発明の方法によるＰｃａとＢＰＨの識別のためのカットオフ値を規格化するため、２７例の血清を含まない試料（ブランク試料：リン酸緩衝液）または８０例の健常者の血清（ＨＬＴ試料）について実施例２に記載の方法と同様の方法で測定した蛍光強度で分析試料である血清の蛍光強度を除算することによって比率で表した。結果を図５に示す。図５から明らかなように、ＨＬＴ試料では末端シアル酸残基がα（２，３）結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有するフリーＰＳＡが存在しないため、その蛍光強度はブランク試料の蛍光強度とほぼ同じであった。２７例のブランク試料の蛍光強度の平均値あるいは中央値または８０例のＨＬＴ試料の蛍光強度の平均値あるいは中央値でＰｃａ患者の血清の蛍光強度およびＢＰＨ患者の血清の蛍光強度を除算し、比率を求めた結果、検出感度９０％を満たすカットオフ値は表５の通りであり、Ｐｃａが疑われる患者の血清の蛍光強度をブランク試料の蛍光強度の平均値あるいは中央値またはＨＬＴ試料の蛍光強度の平均値あるいは中央値で除算した値がカットオフ値よりも高い場合はＰｃａであるであるかその蓋然性が高く、少ない場合はＢＰＨであるかその蓋然性が高いと判定することができることがわかった。

【0045】

【表5】

【産業上の利用可能性】

【0046】

本発明は、少ない分析試料で高感度に再現性よくＰｃａとＢＰＨを識別する方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】