特許 6382488 側鎖結合を介する固相ペプチド合成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6382488

(24)【登録日】2018年8月10日

(45)【発行日】2018年8月29日

(54)【発明の名称】側鎖結合を介する固相ペプチド合成

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/06 20060101AFI20180820BHJP

   C07K 7/52 20060101ALI20180820BHJP

   C07K 14/62 20060101ALI20180820BHJP

   C07K 14/585 20060101ALI20180820BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20180820BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/06

   C07K7/52ZNA

   C07K14/62

   C07K14/585

   C07K14/47

【請求項の数】10

【外国語出願】

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2013-32164(P2013-32164)

(22)【出願日】2013年2月21日

(65)【公開番号】特開2014-162722(P2014-162722A)

(43)【公開日】2014年9月8日

【審査請求日】2015年12月7日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 刊行物名：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌｕｍｅ １８、第Ｓ１３４頁、発行年月日：２０１２年８月２１日、発行者名：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．、掲載アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／１０．１００２／（ＩＳＳＮ）１０９９−１３８７、に発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 集会名：３２ｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、開催場所：ギリシャ国アテネ ザ メガロン アテネ インターナショナル カンファレンス センター（エム．エー．アイ．シー．シー．）、開催日：２０１２年９月２日〜２０１２年９月７日、にて発表

(73)【特許権者】

【識別番号】513042676

【氏名又は名称】ケミカル アンド バイオファーマシューティカル ラボラトリーズ オブ パトラ エス．エー．

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100108903

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和広

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(72)【発明者】

【氏名】クレオメニス ケー．バルロス

【審査官】 上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００５／０８７７９４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５０１０５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−２３４７９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５１３１９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５１７０１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Tetrahedron Letters，１９９９年，40(25)，4663-4664

【文献】 Journal of Peptide Research ，１９９７年，50(2)，143-152

【文献】 Bulletin of the Chemical Society of Japan，１９７６年，49(8)，2259-67

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／０６

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式III〜VI：

【化1】

（式中、Pr¹は、Ｈ、又は樹脂に対して及び他の保護基に対してオルソゴナル（orthogonal）アミノ保護基であり；
Pr²は、Ｈ、又は樹脂に対してオルソゴナル（orthogonal）ヒドロキシル保護基であり；
R³及びR⁴は、それぞれ独立に、Ｈ又はC_1-10アルキルであり；
Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＶは、それぞれ独立の、オルト、メタ又はパラ位の置換基であり、そしてＨ、Cl、Ｆ、C_1-10アルキル及びC_1-10アルコキシから選択され；そして
Ｐは、ペプチドの固相合成のために適当な不溶性支持体又は不溶性リンカー−樹脂結合体である）
から選択される樹脂接合体。

【請求項2】

請求項１に記載の式III〜VIのいずれかの樹脂接合体の製造方法において、
ヒドロキシル含有アミノアルコールであって、当該アミノアルコールの側鎖の少なくとも１つにおいて保護されていないものを調製し、或いはヒドロキシルアミノアルコールの保護基を当該ヒドロキシルアミノアルコールの側鎖において選択的に脱保護し、そして次に、それを樹脂ハライドとの反応により適当な樹脂に取付け、ここで当該樹脂はトリチル型樹脂及びリンカー及びベンズヒドリル型樹脂から選択され；そして
未反応の樹脂ハライドをマスクするためにアルコール又はチオアルコールを添加する；
工程を含む方法。

【請求項3】

生物学的に活性な遊離の又は部分的に保護されたペプチド、環状ペプチド又はペプタイボル（peptaibol）の固相合成方法であり、固相ペプチド合成において、請求項１に記載の樹脂接合体を官能化された樹脂として使用することを含む方法。

【請求項4】

下記式：

【化2】

（式中、
Ａは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt及びMmtから選択されるアミノ保護基であり；
D-は、Ｄ−アミノ酸に従うアミノ酸のキラリティーを示し；
Ｂは、Trt、Mmt、Acm及びStBuから選択されるチオール保護基であり；
Ｃは、Ｈ又はBocであり；
Ｅは、Clt、Trt及びtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；そして
樹脂は、下記の式：

【化3】

（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＶは、それぞれ独立の、オルト、メタ又はパラ位の置換基であり、そしてＨ、Cl、Ｆ、C_1-10アルキル又はC_1-10アルコキシから選択され；そして
Ｐは、ペプチドの固相合成のために適当な不溶性支持体又は不溶性リンカー−樹脂接合体である）
で示される酸感受性樹脂である）
により表される部分的に保護されたペプチド。

【請求項5】

下記式：

【化4】

（式中、
Ａは、Ｈ、或いはFmoc、Boc、Trt、Nps、Mtt及びMmtから選択されるアミノ保護基であり；
D-は、Ｄ−アミノ酸に従うアミノ酸のキラリティーを示し；
Ｂは、Trt、Mmt、Acm及びStBuから選択されるチオール保護基であり；
Ｃは、Ｈ又はBocであり；
Ｅは、Clt、Trt及びtBuから選択されるヒドロキシ保護基であり；そして
樹脂は、下記の式：

【化5】

（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＶは、それぞれ独立の、オルト、メタ又はパラ位の置換基であり、そしてＨ、Cl、Ｆ、C_1-10アルキル又はC_1-10アルコキシから選択され；そして
Ｐは、ペプチドの固相合成のために適当な不溶性支持体又は不溶性リンカー−樹脂接合体である）
で示される酸感受性樹脂である）
により表される部分的に保護されたペプチド。

【請求項6】

前記ペプチドが、樹脂に結合したオクトレオチド（octreotide）である、請求項５に記載のペプチド。

【請求項7】

オクトレオチド（octreotide）の製造方法において、
請求項６に記載のペプチド樹脂接合体を、穏和な酸により処理し；そして
得られたペプチド溶液を、空気、過酸化水素、DMSO又はヨウ素から選択される適当な酸化剤を用いて酸化する；
ことを含んでなる方法。

【請求項8】

前記穏和な酸が、場合によってはスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸の溶液を含んで成る、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

オクトレオチド（octreotide）の製造方法において、
請求項６に記載のペプチド樹脂接合体を、穏和な酸により処理し；そして
脱保護し、精製し、凍結乾燥し、そして99％より高い純度のオクトレオチドを得る、
ことを含んでなる方法。

【請求項10】

前記穏和な酸が、ヨウ素を含むトリフルオロ酢酸の溶液を含んで成る、請求項９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はペプチドの合成に関する。

【発明の概要】

【0002】

要約
ポリマーに側鎖を介して取付けられたヒドロキシアミノ酸、ヒドロキシアミノ酸アミド、ヒドロキシアミノアルコール又はヒドロキシアミノ酸を含む小ペプチドを出発樹脂として使用する固相ペプチド合成により、高純度のペプチド及びぺプタイボル（peptaibol）が得られた。

【発明を実施するための形態】

【0003】

定義及び略号
「Hya」又は「ヒドロキシルアミノ酸」は、ヒドロキシル（-OH）基を含むアミノ酸を意味する。
Ｎ−末端又はアミノ末端は、ペプチド鎖中の最初のアミノ酸である。
Ｃ−末端又はカルボキシ末端は、ペプチド鎖中の最後のアミノ酸であり、下記のように示される。

【0004】

【化1】

【0005】

「Ｐ」又は「固体支持体」又は「樹脂」は、アミノ酸又はペプチドと反応又は連結するのに適当な官能基を含む不溶性材料を意味する。当該固体支持体又は樹脂は、当業界においてよく知られている。

【0006】

「アルキル」、例えばC_1-10-アルキル又はC_1-6-アルキルは、分岐した、または分岐していない、十分に飽和した非環式炭化水素基（すなわち、二重結合又は三重結合を含まない、炭素及び水素から構成される）を意味する。幾つかの態様において、アルキルは置換されていても置換されていなくてもよい。アルキルには、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ペンチル、へキシル、などが含まれるがこれらに限定されず、そして幾つかの態様においてはそれらのそれぞれは場合によっては置換されていてもよい。アルキル置換基には、C_1-3−アルコキシ、ハロゲン（F、Cl、Br又はI）、ニトロ、アミノ、-SH及び-OHが含まれるがこれらに限定されない。

【0007】

「取付け」は、不溶性支持体へのアミノ酸又はペプチド若しくはペプチド誘導体の連結（linking）を意味する。
「Hse」はホモセリンを意味し、「Hnv」はヒドロキシルノルバリンを意味する。
「SPPS」又は「固相ペプチド合成」は、本明細書に記載されているような樹脂の使用を伴うペプチドの合成を意味する。
「pNA」は４−ニトロアニリドを意味する。
「DME」はジメトキシエタンを意味する。

【0008】

「酸感受性樹脂」は、アミノ酸又はペプチドとの反応又は連結に適する官能基を含む不溶性材料又は樹脂を意味し、これらは酸性処理によりペプチドから開裂されることができる。
「酸感受性保護基」は、酸性処理により又は酸性条件下でアミノ酸又はペプチド若しくはペプチド誘導体から開裂されうる保護基を意味する。
「ペプタイボル」（Peptaibol）は、ペプチドであってそのＣ−末端位置にアミノ酸又はアミノ酸アミドではなくアミノアルコールを含むものを意味する。

【0009】

「段階的」（ステップ−バイ−ステップ；Step-by-step）は、ペプチド鎖中に含まれるアミノ酸のそれぞれが個別的に且つ逐次的に導入されるペプチド合成法を意味する。この方法は、中間精製工程を含んでも含まなくてもよい。
「保護されたペプチド」は、すべての官能基が保護基により保護されているか又はブロックされているペプチドを意味する。
「部分的に保護されたペプチド」は、少なくとも１個の官能基が保護基により保護されているか又はブロックされているペプチドを意味する。

【0010】

固相ペプチド合成は伝統的に、Ｃ−末端アミノ酸のそのα−カルボキシル官能基を介しての適当な固体支持体への取付け、及び段々に成長するペプチド鎖におけるアミノ酸残基の逐次的付加によるペプチドのアミノ末端方向へのペプチド鎖の延長により行われる。数十万の発表及び特許がこの方法及びペプチド医薬の製造へのその適用を記載している。

【0011】

Ｃ−末端カルボキシル官能基の取付けとは逆に、アミノ酸側鎖を介してのアミノ酸及びペプチドの適当な樹脂への取付け及びSPPSにおけるその応用が、非常に手短に、特に30未満の発表及び特許において記載されている。これらの発表の殆どが、Asp及びGluの側鎖カルボキシル官能基を介してのアミノ酸の取付けを記載している。

【0012】

本発明者の知識では、側鎖ヒドロキシル官能基を介してのアミノ酸の側鎖取付け及びペプチド合成における応用は限定されている：Fmoc-Hya-pNA（式A1）の側鎖取付け[A. Bernhardt, M. Drewello and M. Schutkowski, The solid-phase synthesis of side-chain-phosphorylated peptide-4-nitroanilides J. Peptide Res. 50, 1997. 143-152]及び短いニトロアニリド基質の合成のためのそれらの使用、環状ペプチド調製における応用のためのマイクロウエーブの助けによる２−クロロトリチル樹脂上でのFmoc-Hya-O‐アリルエステルの合成（式A2 [L. Rizzi, K. Cendic, N. Vaiana, S. Romeo, Alcohols immobilization onto 2-chlorotritylchloride resin under microwave irradiation, Tetrahedron Letters 52 (2011) 2808-2811 ]）、及びTyr-フェノキシ官能基のMitsunobu酸化還元アルキル化によるベンジル型の樹脂上に取付けられたFmoc-Tyr-O-メチルエステルの合成（式A3 [C. Cabrele, M. Langer and A. G. Beck-Sickinger, Amino Acid Side Chain Attachment Approach and Its Application to the Synthesis of Tyrosine-Containing Cyclic Peptides, J. Org. Chem. 1999, 64, 4353-4361]）及び短い環状ペプチドの合成のためのそれらの応用。

【0013】

本発明者の知識では、Hse及びHypの側鎖取付けは開示されていない。更に、保護されたペプチド、保護されたペプチドフラグメント並びに保護されたペプチドアミド及びぺプタイボル（peptaibol）の固相合成のための酸感受性樹脂上に側鎖取付けされたHyaの応用は報告されていない。

【0014】

【化2】

【0015】

固相ペプチド合成
１つの態様において、医薬的に興味あるペプチド酸、ペプチドアミド、及びペプタイボル（peptaibol）の改良された合成が提供される。

【0016】

【化3】

【0017】

本発明の１つの観点において、ヒドロキシアミノ酸をそのアミノ酸側鎖を介して、又は配列中にヒドロキシアミノ酸を含む小ペプチドをトリチル又はベンズヒドリル型の樹脂上に取付けて式Ｉ〜IVのアミノ酸−樹脂接合体又はペプチド樹脂接合体を生じさせることにより、ペプチドが高い収率及び純度で非常に効果的に製造された。ここで、式Ｉ〜IV中、Ｐは、固相ペプチド合成において使用される支持体から選択され、Pr¹は、Ｈ又はFmoc、Boc、Trt、Dde及びAllocから選択されるアミノ保護基であり、Pr²は、Trt、Clt、Mmt、Mtt、Dpm及びtBuから選択される酸感受性ヒドロキシ保護基であり、Hyaは、D- 若しくは L-Ser、Thr、Tyr、Hse、Hyp、Hnvなどから選択されるヒドロキシアミノ酸であり、そしてＡは、OH、OTrt、OClt、OMmt、OMtt、ODpm及びOtBuから選択される酸感受性アルコキシ基、NH₂、NHR¹、NR¹R²（ここで、R¹及びR²は独立に、アルキル基又は配列中に１〜10個のアミノ酸を含む保護された若しくは半保護されたペプチドである。

【0018】

他の態様において、本発明者は、天然のヒドロキシアミノ酸に由来するアミノアルコールから選択される式III〜VI（式中、Ｐ、Ｘ、Ｖ、Ｚ及びPr¹は上に定義したとおりであり、R³及びR⁴はアルキル、アリール又はアラルキル基であり、そしてPr²はトリチル、ベンズヒドリル又はベンジル型の酸感受性保護基である）の樹脂結合アミノアルコールを用いる固相合成によりペプタイボル（peptraibol）例えばオクトレオチド（octreotide）が得られたことを開示する。

【0019】

【化4】

【0020】

更に、本件発明者は、式Ｉ〜IVの樹脂の応用により調製されたペプチドは、ヒドロキシアミノ酸の側鎖ヒドロキシル官能基を介してトリチル型の樹脂上に取付けられる場合、穏和な酸性処理により当該樹脂から開裂されることができ、そしてこの場合tBu及びベンジル型の側鎖保護基はそのまま残ることを最初に開示する。１つの観点において、樹脂からの開裂は、１〜３％の酸溶液、例えばTFA、希釈HCl溶液による処理により、場合によっては溶剤中スカベンジャーを添加して生じさせる。１つの観点において、開裂は、溶剤、例えばDCM又はアセトン中で行うことができる。そのような部分的に保護されたペプチドは、溶液中又は固相上でのフラグメント縮合による更に長いペプチドの合成において有用であることが見出された。本発明の方法は、この明細書に記載される樹脂の応用の多様性を拡張し、そしてまた、得られる医薬ペプチド純度に有意な改良をもたらし、そして同時にそれらの合成のコストを実質的に低下させる。

【0021】

医薬的に興味ある若干のペプチドが、この明細書に記載される新規な方法の代表として、溶液中及び固相上での段階的（ステップ−バイ−ステップ）方法又はフラグメント縮合、あるいはそれらの組合せにより製造された。下記の例は代表例であり、他のペプチドへの応用はなんら限定されない。

【0022】

ランレオチド（Lanreotide）:
１つの態様において、ランレオチドは、下記に示すように、樹脂に結合したThr-アミドを用いた固相合成によって製造された。

【0023】

【化5】

【0024】

ヒトインスリンＢ鎖：
任意には、ヒトインスリンＢ鎖は、SPPSにより合成された。１つの観点において、合成は、４−メトキシベンズヒドリル樹脂を用いて、実施例に記載されるような樹脂に結合したThr-t-ブチルから始まる。任意には、合成はまた、固相上で１−８部分保護されたBoc-Phe-Val-Asn(Trt)-Gln(Trt)-His(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Gly-OH フラグメントを樹脂に結合した９−30フラグメントとの縮合により行うことができ、或いは部分的に保護された９−30フラグメントの樹脂からの開裂の後、１−８フラグメント及び９−30フラグメントの溶液中での縮合により行うことができる。

【0025】

【化6】

【0026】

サケカルシトニン:
任意には、サケカルシトニンは、樹脂に結合したFmoc-Thr-Pro-NH₂からの合成を開始することにより製造することができる。次に、ペプチド鎖はFmoc-アミノ酸を用いて延長される。

【0027】

【化7】

【0028】

任意には、樹脂に結合したサケカルシトニンは、２〜４フラグメントを用いて、上に示すように樹脂上での、又は下に示すように溶液中での、フラグメント縮合により製造される。

【0029】

【化8】

【0030】

オクトレオチド（Octreotide）:
他の態様において、オクトレオチドは、下に示すようにスレオニノール（threoninol ）の側鎖を介しての４−メトキシベンズヒドリル樹脂へのFmoc-threoninol-OTrt の取付け、それに続くFmoc-アミノ酸を用いてのオクトレオチド鎖の集合、及び最後に逐次的又は同時的Cys−酸化を用いる樹脂からのオクトレオチドの開裂により効率的に合成された。Fmoc-スレオニノール-OTrtは、適当な樹脂上のスレオニノールのヒドロキシメチル基を介して樹脂上に取付けられ得るFmoc-Thr(tBu)-オールに比べて非常に製造しやすい。この理由は、Fmoc-Thr(tBu)-オールの製造のための出発材料として使用されるH-Thr(OtBu)-オールが、樹脂上への側鎖を介してのスレオニノールの取付けに使用されるFmoc-スレオニノール-OTrtに比べて非常に製造しにくいからである。

【0031】

【化9】

【0032】

エキセナチド（Exenatide）:
他の例において、Fmoc-Ser-NH₂は、その側鎖を介してトリチル樹脂に取付けられ、そしてエキセナチドの合成のために使用される。この合成は、下記のように、穏和な酸性処理による樹脂からの、部分的の保護されたエキセナチドフラグメントの開裂の後に溶液中で又は固相上で、段階的（ステップ−バイ−ステップ）態様により、又はフラグメント縮合により、実施することができる。この方法によれば、多くのPro及びGly残基を含むペプチドの合成の間に典型的に生成される殆どの不純物が完全に回避され、そして高純度のペプチドが得られる。この方法はまた、当業界において知られている他の方法を用いるペプチドアミドリンカーからのペプチドの開裂から生ずる不純物の完全な回避を可能にする。上記の当業界で知られている方法は、ペプチドの収率及び純度を有意に低下させる。

【0033】

【化10】

【0034】

１つの観点において、エキセナチドは、部分的に保護されたペプチド12−39を樹脂から開裂させ、そしてそれを、下に示すように溶液中で、部分的に保護された１−11フラグメントと縮合させることにより製造することができる。或いは、フラグメント１−13及びフラグメント１４−39を用いて縮合を行い、保護されたエキセナチドを得ることができる。

【0035】

【化11】

【0036】

プラムリンチド（Pramlintide）:
この方法はまた、アミリン（amylin）ペプチドの製造においても非常に効果的に使用される。１つの観点において、アミリン又はその誘導体、例えばプラムリンチドのＣ−末端Ser、Thr又はTyr残基の１つを用いて側鎖の取付けを行うことができる。合成は、溶液中又は固相上での段階的（ステップ−バイ−ステップ）態様により又はフラグメント縮合により行うことができる。シュードプロリン（pseudoprolines）(Ψ, Mutter et al, Peptide Res. (1995 8, 145) を参照のこと）を成長中のペプチド鎖に導入することにより、合成が加速され、そして得られるペプチドの純度が改良される。

【0037】

【化12】

【0038】

或いは、プラムリンチドの合成は、プラムリンチドの純度及び収率に関して同様の成功をもって、液相中で行うことができる。１つの態様において、Fmoc-Tyr-NH₂の側鎖を介して樹脂の結合した保護されたペプチドは、tBu−型の側鎖保護基をそのまま残して、穏和な酸性処理を用いてペプチド鎖の種々の位置で、樹脂から定量的に開裂させることができる。１つの例において、下に示すように、２−クロロトリチル樹脂上で調製された部分的に保護された１−10フラグメントが、部分的に保護された11−37フラグメントアミドと、段階的（ステップ−バイ−ステップ）態様で成功裏に縮合された。

【0039】

プラムリンチド（Pramlintide）:

【化13】

【0040】

テトラコサクチド（Tetracosactide）（ACTH 1-24）:
他の例において、下に示すように、ACTH 1-24が、樹脂に結合したFmoc-Tyr-Pro-OtBuから出発して段階的（ステップ−バイ−ステップ）方法により、或いは部分的に保護された１−10フラグメントを溶液中で11−24フラグメントと、又は樹脂の結合した11−24フラグメントと縮合させることにより効果的に調製された。

【0041】

【化14】

【0042】

ビバリルジン（Bivalirudin）:
他の例において、下に示すように、ビバリルジンが、樹脂に結合したFmoc-Tyr-Leu-OtBuから出発して、Fmoc-アミノ酸により段階的（ステップ−バイ−ステップ）態様でペプチド鎖を延長し、最後に脱保護し、そしてペプチドを樹脂から開裂させることにより、高収量で且つ高純度で製造された。

【0043】

或いは、ビバリルジンは、保護されたフラグメントを樹脂上で縮合させることにより、或いは４〜15アミノ酸残基を含む部分的に保護されたペプチドを樹脂から開裂させ、そしてそれを５〜16アミノ酸を含むビバリルジンフラグメントと溶液中で縮合させることにより得られた。部分的に保護された１−10ビバリルジンフラグメントと、樹脂に結合した部分的に保護された11−20ビバリルジンフラグメントとの、樹脂上でのフラグメント縮合によるビバリルジンの合成を下に記載する。

【0044】

【化15】

【実施例】

【0045】

実施例１. Fmoc-Thr(4-メトキシベンズヒドリルポリスチリル)-OtBuの調製

【化16】

【0046】

H-Thr-OtBuとFmoc-OSuとの常法に従う反応により調製した30 mmolのFmoc-Thr-OtBuを、20 g（30 mmol）の４−メトキシベンズヒドリルポリスチレン樹脂（CBL-Patrasの製品）及び60 mmolのDIPEAと、250 mlのTHF中で10時間、室温にて反応させた。次に、この混合物に60 mmolのメタノールを添加し、そしてこの混合物を更に４時間振盪した。樹脂を濾過し、そしてTHF/MeOH/DIPEA (85:10:5)により３回、DMFにより６回、IPAにより４回、DEEにより３回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.95 mmol/g 樹脂の負荷をもって、29 gの樹脂結合Fmoc-Thr-OtBuを得た。

【0047】

実施例２. Fmoc-Thr(4-メトキシベンズヒドリルポリスチリル)-O-Clt

【化17】

【0048】

H-Thr-OMeとTrt-Cl/Me₃SiCl及びDIPEAとの常法に従う反応により調製した30 mmolのTrt-Thr-OMeを、20 g（30 mmol）の４−メトキシ４’ポリスチリルベンズヒドリルブロミド樹脂（CBL-Patrasの製品）及び60 mmolのDIPEAと、250 mlのTHF中で10時間、室温にて反応させた。次に、この混合物に60 mmolのメタノールを添加し、そしてこの混合物を更に４時間振盪した。樹脂を濾過し、そしてTHF/MeOH/DIPEA (85:10:5)により３回、DCMにより３回、DCM中1% TFAにより３回、THFにより４回、THF/水/メタノール（70:15:15）中1N-LiOHにより３回、THF/水（75:25）により３回、DMFにより４回洗浄し、そして次に室温にて２時間、60 mmolのFmoc-OSu及び30 mmolのDIPEAと反応させ、DMFにより３回、DCMにより３回洗浄し、そして次に、室温にて３時間50 mmolのTrt-Cl及び50 mmolのDIPEAと反応させ、DMFにより４回、DEEにより６回洗浄し、そして一定重量に真空乾燥した。0.78 mmol/g樹脂の負荷をもって、32.3 gの樹脂結合Fmoc-Thr-OtBuを得た。

【0049】

実施例３. Fmoc-Throl(4-メトキシベンズヒドリルポリスチリル)-O-Clt
Ａ）Fmoc-スレオニノールから出発

【化18】

【0050】

350 mlのDCM中50 mmolの市販のFmoc-スレオニノール（CBL-Patras）を、55 mmolのモノマーClt-Cl及び55 mmolのDIPEAと、室温にて４時間反応させた。得られた混合物を通常通り水で抽出し、そしてDCM相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥しそして濾過した。生じた溶液に、30 gの４−メトキシ,４−ポリスチリルベンズヒドリルブロミド（CBL-Patras）及び50 mmolのDIPEAを添加し、そして生ずる混合物を室温にて４時間撹拌した。樹脂を濾過し、そしてDMFにより６回、IPAにより４回及びDEEにより４回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.82 mmol/gの負荷をもって、38.4 gの樹脂結合Fmoc-スレオニノールを得た。

【0051】

Ｂ）Trt-Thr(Resin)-OMeから出発

【化19】

【0052】

常法に従ってH-Thr-OMeとTrt-Cl/Me₃SiCl及びDIPEAとの反応により調製された30 mmolのTrt-Thr-OMeを、20 g (30 mmolの４−メトキシ４’−ポリスチリルベンズヒドリルブロミド樹脂（CBL-Patrasの製品）及び60 mmolのDIPEAと、250 mlのTHF中で、室温にて10時間反応させた。次に、この混合物に60 mmolのメタノールを添加し、そして混合物を更に４時間撹拌した。樹脂を濾過し、そしてTHF/MeOH/DIPEA (85:10:5)により３回、THFにより５回洗浄し、そしてTHF中30 mmolのLiBH₄と反応させた。

【0053】

次に、樹脂を濾過し、そしてTHFにより６回、DCMにより４回、DCM中１%TFAにより６回、DMF/DIPEA（97:3）により３回洗浄し、そして次に室温にて２時間、60 mmolのFmoc-OSu及び30 mmolのDIPEAと反応させ、DMFにより３回、DCMにより３回洗浄し、そして次に室温にて３時間、50 mmolのClt-Cl及び50 mmol DIPEAと反応させ、DMFにより４回、IPAにより６回及びDEEにより６回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.74 mmol/g樹脂の負荷をもって、34.7 gの樹脂結合Fmoc-Throl-O-Cltを得た。

【0054】

実施例４. Fmoc-Ser(トリチル樹脂)-NH₂
当業界において知られている標準的手順により調製された50 mmolのFmoc-Ser-NH₂を、0.5リットルのDCMに溶解した。この懸濁液に、30 gのトリチルクロリド樹脂（36 mmol）及び65 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて６時間撹拌した。次々と25 mlのメタノール及び30 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を、更に室温にて２時間撹拌した。次に、樹脂を濾過し、そしてDCM/MeOH/DIPEA（90:5:5）により３回、DMFにより５回、IPAにより４回、DEEにより４回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.71 mmol/gの負荷をもって、41.1 gのFmoc-Ser-NH₂-含有樹脂を得た。

【0055】

実施例５. Fmoc-Tyr(2-クロロトリチル樹脂)-NH₂
上記の手順に従って、50 mmolのFmoc-Tyr-NH₂及び30 gの2-CTCクロリド樹脂から、0.81 g Tyr/g樹脂の負荷をもって、43.7 gの樹脂を得た。

【0056】

実施例６. Fmoc-Hyp(4-メチルベンズヒドリル樹脂)-NH₂
上記の手順に従って、50 mmolのFmoc-Hyp-NH₂及び30 gの４−メチルベンズヒドリルブロミド樹脂から、0.49 g Hyp/g樹脂の負荷をもって、39.8 gの樹脂を得た。

【0057】

実施例７. Fmoc-Thr(4-メトキシベンズヒドリル樹脂)-Pro-NH₂
当業界において知られている標準的手順に従ってFmoc-Thr(tBu)-OHとH-Pro-NH₂とのカップリングにより調製された50 mmolのFmoc-Thr-Pro-NH₂を、0.5リットルDMEに溶解した。得られた溶液に、30 gの４−メトキシベンズヒドリルブロミド樹脂（45 mmol）及び65 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて６時間撹拌した。次に、25 mlのメタノール及び50 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて２時間撹拌した。次に樹脂を濾過し、そしてDME/MeOH/DIPEA（90:5:5）により３回、DMFにより５回、IPAにより４回、DEEにより４回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.77 mmol/gの負荷をもって、44.5 gのFmoc-Thr-Pro-NH₂含有樹脂を得た。

【0058】

実施例８. Fmoc-Tyr(2-クロロトリチル樹脂)-Pro-OtBu
当業界において知られている標準的手順に従って、50 mmolのFmoc-Tyr-Pro-OtBuを調製し、0.5リットルのDCMに溶解した。得られた溶液に、30 gの２−クロロトリチルクロリド樹脂（48 mmol）及び65 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて12時間撹拌した。次に、25 mlのメタノール及び50 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を更に２時間室温にて撹拌した。次に樹脂を濾過し、そしてDCM/MeOH/DIPEA（90:5:5）により３回、DMFにより５回、IPAにより４回、DEEにより４回洗浄し、そして一定重量まで真空乾燥した。0.64 mmol/gの負荷をもって、44.5 gのFmoc-Tyr-Pro-OtBu含有樹脂を得た。

【0059】

実施例９. Fmoc-Tyr(2-クロロトリチル樹脂)-Leu-OtBu
当業界において知られている標準的手順に従って調製した50 mmolのFmoc-Tyr-Leu-OtBuを、0.5リットルのTHFに溶解した。得られた溶液に、30 gの2-CTCクロリド樹脂（48 mmol）及び65 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を60℃にて12時間撹拌した。次に、25 mlのメタノール及び50 mmolのDIPEAを添加し、そしてこの混合物を室温にて更に２時間撹拌した。次に樹脂を濾過し、そしてDCM/MeOH/DIPEA（90:5:5）により３回、DMFにより５回、IPAにより４回、DEEにより４回洗浄し、そして一定重量に真空乾燥した。0.64 mmol/gの負荷をもって、44.5 gのFmoc-Tyr-Leu-OtBu含有樹脂を得た。

【0060】

実施例10. ペプチド及び保護されたペプチドセグメントの固相合成
一般的手順
A1. 負荷された２−クロロトリチル樹脂の調製 一般的手順
２−クロロトリチルクロリド樹脂（CTC-Cl）（100 g;負荷1.6 mmol/g）（CBL-Patras）を、２Ｌのペプチド合成反応器に入れ、そして700 mLのジクロロメタン（DCM）：ジメチルホルムアミド（DMF）1:1により25℃にて30分間膨潤させる。樹脂を濾過し、そして500 mLのDCM中100 mmolのFmoc-アミノ酸及び300 mmolのジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の溶液を添加する。この混合物を25℃にて２時間窒素の下で撹拌する。

【0061】

次に、2-CTC樹脂の残っている活性部位を、10 mLのメタノール（MeOH）の添加及び１時間の反応により中和する。樹脂を濾過し、そして400 mLのDMFにより２回洗浄する。樹脂を濾過し、そしてDMF中25体積％のピペリジン500 mLにより30分間で２回洗浄する。次に樹脂を、500 mLのDMFにより４回処理する。樹脂を、500 mLのイソプロパノール（IPA）による３回の洗浄によって解膨潤する。樹脂を一定重量に乾燥する。この樹脂に、使用したアミノ酸のmmolの70〜95％が結合した。

【0062】

Ｂ． 固相合成 一般的プロトコール
パートＡ又は実施例１に記載したように、トリチル若しくはベンズヒドリル型の樹脂にエステル化された又は側鎖を介して取付けられた1.0ｇのアミノ酸又はペプチドを用いて、24℃にて固相合成を実施した。合成においては下記のプロトコールを使用した。

【0063】

B1. 樹脂の膨潤
樹脂を15 mlの反応器に入れ、そして7 mLのNMPにより２回処理し、次に濾過した。
B2. アミノ酸の活性化
アミノ酸（3.0当量）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（4.0当量）を秤り取り、そしてそれらの2.5体積を有するNMPに反応器中で溶解し、そして０℃に冷却した。次に、DICを添加し（3.0当量）、そしてこの混合物を15分間撹拌した。

【0064】

B3. カップリング
次に、B2で調製された溶液をB1の反応器に添加した。反応器を１体積のDCMにより１回洗浄し、そしてこの反応器に加え、これを25℃〜30℃において１〜３時間撹拌した。サンプルにおいてカイゼルテスト（Kaiser Test）を行うことにより、反応の完結を決定した。３時間後にカップリング反応が完結していない場合（カイゼルテスト陽性）、反応混合物を濾過し、そして活性化されたアミノ酸の新たな溶液を用いて再カップリングを行った。カップリングの完結の後、反応混合物を濾過し、そしてNMP（洗浄当たり５体積）により４回洗浄した。

【0065】

B4. Fmoc-基の除去
B3において得られた樹脂を濾過し、そして次に、25体積％のピペリジンを含む5 mLの溶液により30分間処理した。次にこの樹脂を５mLのNMPにより３回洗浄した。

【0066】

B5. ペプチド鎖の延長
各アミノ酸の導入の後、工程B1〜B5を、ペプチド鎖の完成まで反復した。
各個々のアミノ酸の導入のため次のFmoc-アミノ酸を使用した：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Hyp(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-D-Trp-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(Clt)-OH、Fmoc-Val-OH、Boc-D-Cys(Trt)-OH、Boc-His(Trt)-OH、Boc-Lys(Boc)-OH、Boc-D-2-Nal-OH、Boc-D-Phe-OH、Boc-Ser(tBu)-OH。

【0067】

Ｃ. Ｎ−末端にFmoc-又はBoc-基を含むペプチド又は保護されたペプチドセグメントのCTC−樹脂からの酸性開裂のための一般的方法
上記B1〜B5において記載されたようにして製造された、樹脂の結合したぺプチド又はペプチドセグメントを、5 mLのNMPにより４回、５mlのIPAにより３回そして最後に７mlのDCMにより５回洗浄することにより、すべての残留NMP又は他の塩基性成分を完全に除去した。次に、樹脂を０℃に冷却し、DCMから濾過し、そして10 mLの１〜２％TFA/DCM溶液により２回、５℃にて処理した。次にこの混合物を０℃にて20分間撹拌し、そして濾過した。次に樹脂を10 mLのDCMにより３回洗浄した。

【0068】

次に、ロ液にピリジンを添加（TFAに対して1.3当量）してTFAを中和した。次に、DCM中の開裂溶液を同体積の水と混合する。生ずる混合物を減圧下で蒸留してDCMを除去する（28℃にて350 torr）。DCMの除去後にペプチド又はペプチドセグメントが沈殿する。次に、生ずるペプチドを水で洗浄し、そして15 Torrの真空の下で30〜35℃にて乾燥する。

【0069】

実施例11. Ｎ−末端が保護されたフラグメントと樹脂に結合したＣ−末端が保護されたフラグメントとの縮合による樹脂に結合した保護されたペプチドの合成
一般的手順
DMSO/DCM（95:5）中0.15 mmol/mlのＮ−末端が保護されたペプチドフラグメントの溶液に、0.2 mmolのHOBtを添加し、そして生ずる溶液を５℃に冷却する。次に、0.14 mmolのDICを添加し、そして混合物を15℃にて20分間撹拌し、そして次に0.1 mmolの樹脂結合Ｃ−末端フラグメントに加え、そして室温にて更に６時間撹拌する。縮合反応の完結をカイゼルテストによりチェックする。カイゼルテストが青色のままである場合、縮合を完結させるため第２の縮合を行った。

【0070】

実施例12. Ｎ−末端が保護されたフラグメントとＣ−末端が保護されたフラグメントとの溶液中での縮合による部分的に保護されたペプチドの合成
一般的手順
DCM中0.15 mmol/mlのＮ−末端が保護されたフラグメントの溶液に、0.2 mmolのHOBtを添加し、そして生ずる溶液を５℃に冷却する。次に、0.15 mmolのEDACを添加し、そしてこの混合物を15℃にて20分間撹拌し、そして次に0.15 mmolのＣ−末端が保護されたフラグメントに添加し、そして室温にて更に２〜５時間撹拌する。縮合反応の完結をHPLCによりチェックする。不完全な縮合が観察された場合には、追加分の0.015 mmolのEDACを添加し、そして室温にて更なる時間にわたって反応を続ける。

【0071】

実施例13. 樹脂からのペプチドの同時的開裂及び脱保護
一般的方法
上記のようにして製造された1.00 gの保護された樹脂結合ペプチドを、20 mLのTFA/DTT/水（90:5:5）により５℃にて３時間及び15℃にて１時間処理する。次に、樹脂を開裂溶液により３回洗浄し、そして次に、一緒にしたロ液を真空濃縮し、そして粗ペプチドをエーテルの添加により沈澱させ、エーテルにより数回洗浄し、そしてKOH上で一定重量まで真空乾燥する。

【0072】

実施例14. ペプチドの脱保護
一般的方法
上記のようにして製造された1.00 gの保護されたペプチドを、20 mLのTFA/DTT/水（90:5:5）により、５℃にて３時間及び15℃にて１時間処理した。生ずる溶液を真空濃縮し、そして次に、脱保護されたペプチドをジイソプロピルエーテルの添加により沈澱させ、そして10 mLのジイソプロピルエーテルにより３回洗浄した。生ずる固体を、KOHの下で一定重量まで真空乾燥（25℃、15 Torr）した。

【0073】

実施例15. 粗ペプチドの精製 ペプチドの単離
一般的手順
上記のようにして得られたペプチドの溶液を真空濃縮し、そして氷水及びエーテルを添加した。有機相を分離した後、ペプチドの残った水溶液をエーテルにより更に２回抽出し、そして生ずる溶液に窒素又はヘリウムを吹き込み、濾過しそして半調製用カラム10x25 cm, Lichrospher 100, RP-18, 12ミクロン（Merck）に直接付加した；Ａ相＝アセトニトリル中１％-TFA、Ｂ相＝水中１％-TFA；又はクロマシル（Kromasil）。精製されたペプチドを含むHPLC画分を真空濃縮してできるだけ多くの汚染アセトニトリルを除去し、そして標準的凍結乾燥プログラムを用いて凍結乾燥した。

【0074】

下に記載する実施例16〜23を、上記の手順を用いて実施して、下記にリストされた化合物を調製した。
実施例16. ランレオチド（Lanreotide）
実施例17. インスリンＢ−鎖
実施例18. サケカルシトニン
実施例19. オクトレオチド（Octreotide）
実施例20. エキセナチド（Exenatide）
実施例21. プラムリンチド（Pramlintide）
実施例22. テトラコサクチド（Tetracosactide）（ACTH 1-24）
実施例23. ビバリルジン（Bivalirudin）

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]