特許 6382972 前立腺肥大治療用及びその予防用の組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6382972

(24)【登録日】2018年8月10日

(45)【発行日】2018年8月29日

(54)【発明の名称】前立腺肥大治療用及びその予防用の組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/10 20060101AFI20180820BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20180820BHJP

   A23L 33/18 20160101ALI20180820BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/10

   A61P13/08

   A23L33/18ZNA

【請求項の数】9

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2016-526017(P2016-526017)

(86)(22)【出願日】2014年10月23日

(65)【公表番号】特表2016-535740(P2016-535740A)

(43)【公表日】2016年11月17日

(86)【国際出願番号】KR2014010035

(87)【国際公開番号】WO2015060673

(87)【国際公開日】20150430

【審査請求日】2016年10月20日

(31)【優先権主張番号】10-2013-0126666

(32)【優先日】2013年10月23日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】514286826

【氏名又は名称】ジェムバックス アンド カエル カンパニー，リミティド

(73)【特許権者】

【識別番号】514286848

【氏名又は名称】キム サン チェ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】キム サン チェ

【審査官】 鳥居 福代

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５２０２９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１３５２６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５１９３８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５２４３９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１６−５２３２４８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ２３Ｌ ３３／１８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、又は前記アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するペプチドを含む前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物。

【請求項2】

希釈剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、着色剤、香料又は甘味剤からなる群から選択される一つ以上の添加剤を含むことを特徴とする、請求項１に記載の前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物。

【請求項3】

前記ペプチドを０．０１ｍｇないし１ｍｇ含むことを特徴とする、請求項１に記載の前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物。

【請求項4】

前記ペプチドを０．５６ｍｇ含むことを特徴とする、請求項１に記載の前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物。

【請求項5】

前記組成物は、薬学組成物であることを特徴とする、請求項１に記載の前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物。

【請求項6】

前記組成物は、食品組成物であることを特徴とする、請求項１に記載の前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物。

【請求項7】

請求項１ないし６のうちいずれか１項に記載の組成物を、治療を必要とする対象に投与することを特徴とする、前立腺肥大症を治療及び予防するための薬学組成物。

【請求項8】

前記組成物の１回投与時、０．００５ｍｇ／ｋｇないし０．０５ｍｇ／ｋｇを投与することを特徴とする、請求項７に記載の前立腺肥大症を治療及び予防するための薬学組成物。

【請求項9】

前記組成物を、総治療期間１２週間、毎２週間隔で１回ずつ全７回、すなわち、０週、２週、４週、６週、８週、１０週、１２週に１回ずつ投与し、１回の投与時、０．５６ｍｇの容量（４ｎｍｏｌペプチド／ｋｇ体重に該当）を投与することを特徴とする、請求項７に記載の前立腺肥大症を治療及び予防するための薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物に係り、さらに具体的には、テロメラーゼに由来するペプチドを含む組成物であって、前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

前立腺肥大症は、男性老人性疾患のうち最もありふれた疾病であり、下部尿路症状を伴う。関連症状は、４０歳から現れ始めるが、ほとんど５０歳後半から、臨床的な症状を起こす。前立腺肥大症は、生の質的低下による性機能障害を誘発し、それによる治療及び手術療法によって性機能に影響を及ぼす。

【0003】

前立腺肥大症の原因による過多増殖は、男性ホルモンに依存する。特に、男性ホルモンは、前立腺に対して、正常な細胞増殖に必要なだけではなく、細胞のアポトーシスを抑制することも行う。最も広く知られた前立腺肥大症の内因性原因としては、年齢と係わりがあると知られている。前立腺は、年が増えるほど大きくなり、正常な睾丸の機能が伴わなければならない。前立腺は、男性ホルモン依存的な器官であり、テストステロンは、前立腺の成長、分化、機能に重要な役割を行い、５αリダクターゼによって代謝されて生成されたジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）は、前立腺の成長と遺伝子の発現とを調節するのに重要な役割を行う。

【0004】

前立腺成長に関与する外因的要因としては、男性ホルモン、エストロゲン、グルココルチコイドなどがあり、食生活様式、及び周り環境などによる内分泌酵素と係わる物質がある。それら外因的要素の生理学的効果は、多様な種類のペプチド性成長調節因子を経由して示される。

【0005】

前立腺肥大症は、２０代初めから４０代後半まで、組織学的変化によって発生するが、このとき、男性ホルモンとエストロゲンとが共に相乗作用を行い、前立腺肥大症を誘発する。年齢が増えるほど、エストロゲン／ＤＨＴの比率が大きくなり、それによって、前立腺肥大が増大するとのことである。

【0006】

また一般的に、前立腺は、２０代初めまで成長した後５、０代までその大きさを維持するが、そのような均衡を維持するためには、内因性成長調節因子、伝達経路、細胞周期調節、並びに細胞分裂及び細胞死滅など非常に複雑な相互作用に依存する。そのような細胞周期調節因子に変形が生ずる場合、前立腺肥大症が誘発されもする。

【0007】

前立腺肥大症には、さまざまな因子のうち、遺伝的要因も非常に大きく作用するが、家族歴がある患者群では、前立腺肥大症が示される確率は、約６０％以上上昇すると報告されており、家族歴がある患者群において、５αリダクターゼ抑制剤による治療効果が低いと報告されている。それは、アンドロゲン非依存性経路によるものであると推定される。

【0008】

前立腺肥大治療方法としては、手術的な治療法以外に、内科的治療法が実施されているが、内科的治療法としては、患者の年齢、臨床的経過などの要因によって、薬物治療が行われている。

【0009】

最近、韓国を始めとして、全世界的に前立腺肥大症患者の増加勢が著しく、若い患者の発病率も上昇しており、多様な種類の薬物が治療法に試みされているが、副作用の問題によって使用に制限があった。

【0010】

スルピリドは、２型ドーパミン受容体アンタゴニストであり、主に憂鬱症治療剤として利用される。ドーパミンは、アドレナリンとノルアドレナリンとの合成の時に生ずる中間産物であって、抑制性神経伝達物質である。スルピリドは、ドーパミンの受容体結合を阻害し、ドーパミン効果であるプロラクチンの分泌を抑制する機能も共に阻害されながら、血液内プロラクチンの濃度が上昇することになる。持続的なスルピリド投与によるプロラクチンの増加は、高プロラクチン血症を誘導する。

【0011】

プロラクチンは、前立腺の増殖と関連し、前立腺癌、並びにＢＰＨの発達及び調節に関係するということが報告されている。また、プロラクチンは、アンドロゲンと併用して、前立腺の増殖に相乗効果を示すと知られている。他のメカニズムとしては、プロラクチンがストレスホルモンとして作用し、５αリダクターゼの発現を増加させ、前立腺の増殖を誘導すると知られている。プロラクチンは、非ステロイド性因子の一種であり、前立腺の増大に関与し、前立腺肥大症誘発にも関与する。プロラクチン含量は、加齢によって増加し、一方、テストステロンレベルは低下する。それは、加齢によって、ヒトにおいて、プロラクチンが前立腺肥大を誘導するメカニズムに非常に重要であると報告されている。ラット及びヒトにおいて、プロラクチンが前立腺の増殖及び分化に関与するということが知られている。それによれば、プロラクチンが受容体を介して、シグナル伝達経路を経由して誘発されると見られる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】ＫＲ２０１１−００６２９４３Ａ

【特許文献2】ＫＲ２０１１−００５７０４９Ａ

【特許文献3】ＥＰ１０２０１９０Ａ３

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】ＭＣＣＯＮＮＥＬＬ，Ｊｏｈｎ Ｄ．，ｅｔ ａｌ．‘Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ ｏｎ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｍｏｎｇ ｍｅｎ ｗｉｔｈ ｂｅｎｉｇｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ’，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８，Ｖｏｌ．３３８，Ｎｏ．９，ｐｐ．５５７−５６３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

それにより、本発明者は、副作用を最小化させながらも、効果にすぐれる前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物を開発しようと鋭意努力した結果、本発明を完成するに至った。

【0015】

本発明者は、テロメラーゼ（配列番号２）に由来するペプチドが、前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物の治療及び予防に卓越な効果を有するということを発見し、本発明の完成に至った。

【0016】

本発明の目的は、前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物を提供するところにある。

【課題を解決するための手段】

【0017】

前記課題を解決するために、本発明によれば、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド（以下、「ＰＥＰ１」、「ＧＶ１００１」又は「ＧＶ」ともする）、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はその断片であるペプチドを含む前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物が提供される。

【0018】

本発明による前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物において、前記断片は、３個以上のアミノ酸によって構成された断片でもある。

【0019】

本発明による前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物において、前記ペプチドを０．０１ｍｇないし１ｍｇ、望ましくは、０．５６ｍｇの容量（４ｎｍｏｌペプチド／ｋｇ体重に該当）含んでもよい。

【0020】

本発明による前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物において、前記組成物は、薬学組成物でもある。

【0021】

本発明による前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物において、前記組成物は、食品組成物でもある。

【0022】

本発明の他の側面によれば、前述の前立腺肥大症治療用及びその予防用の組成物を、治療を必要とする対象に投与することを特徴とする前立腺肥大症を治療及び予防する方法が提供される。

【0023】

本発明による前立腺肥大症を治療及び予防する方法において、前記組成物投与は、週３回投与することでもある。

【発明の効果】

【0024】

本発明による配列番号１（ＰＥＰ１）の配列を有するペプチド、又は前記配列と８０％の相同性を有する配列を有するペプチド、又は断片であるペプチドを含む組成物は、副作用が少なく、前立腺肥大症の治療及び予防に優秀な効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】実験群の組織重量観察のために測定対象器官を分離する過程に係わる写真である。

【図2】ＰＥＰ１の前立腺肥大症治療に及ぼす影響を検証するための実験において、各実験群の腹側前立腺において、５αリダクターゼの発現に及ぼす影響を、ＲＴ−ＰＣＲを利用して測定した実験結果を示した電気泳動写真である。

【図3】ＰＥＰ１の前立腺肥大症治療に及ぼす影響を検証するための実験において、各群での精嚢の重さを測定した結果を示したグラフである。

【図4】ＰＥＰ１の前立腺肥大症治療に及ぼす影響を検証するための実験において、各群での前立腺重さを測定した結果を示したグラフである。

【図5】ＰＥＰ１を処理した前立腺肥大症動物モデルの実質細胞株（ＷＰＭＹ−１）における細胞増殖の程度を示したグラフである。

【図6】ＰＥＰ１を処理した前立腺肥大症動物モデルの上皮細胞株（ＲＷＰＥ−１）における細胞増殖の程度を示したグラフである。

【図7】ＰＥＰ１−ＦＩＴＣ（蛍光結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ））を使用して、前立腺肥大症動物モデルの実質細胞株（ＷＰＭＹ−１）において、アンドロゲン受容体に対するＰＥＰ１の結合能を測定して示したグラフである。

【図8】ＰＥＰ１−ＦＩＴＣ（蛍光結合体）を使用して、前立腺肥大症動物モデルの上皮細胞株（ＲＷＰＥ−１）において、アンドロゲン受容体に対するＰＥＰ１の結合能を測定して示したグラフである。

【図9】ＰＥＰ１が、前立腺肥大症動物モデルにおいて、前立腺肥大症が誘発されたときに増加する因子であるＰＣＮＡ（増殖性細胞核抗原）の発現に与える影響を測定した実験結果を示した電気泳動写真である。

【図10】ＰＥＰ１が、前立腺肥大症動物モデルにおいて、前立腺肥大症が誘発されたときに増加する因子であるＫｉ６７（ＭＫＩ６７）の発現に与える影響を測定した実験結果を示した組織免疫染色写真である。

【図11】ＰＥＰ１が、前立腺肥大症動物モデルにおいて、前立腺肥大症関連組織細胞に与える影響を観察した実験において、組織の上皮細胞をＨ＆Ｅ染色法で染色して結果を示した写真である。

【図12】ＰＥＰ１が、前立腺肥大症動物モデルにおいて、前立腺肥大症関連組織細胞に与える影響を観察した実験において、組織の上皮細胞をマッソントリクローム染色法で染色して結果を示した写真である。

【図13】ＰＥＰ１が、前立腺肥大症動物モデルにおいて、体重に与える影響を観察した実験において、動物モデルの体重変化を観察して示したグラフである。

【図14】ＰＥＰ１が、前立腺肥大症動物モデルにおいて、前立腺重さに与える影響を観察した実験において、動物モデルの前立腺重さの変化を観察して示したグラフである。

【図15】ＰＥＰ１が、立腺肥大症動物モデルにおいて、精嚢重さに与える影響を観察した実験において、動物モデルの精嚢重さの変化を観察して示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明は、多様な変換を加えることができ、さまざまな実施例を有することができるが、以下、本発明についてさらに具体的に説明する。しかし、それは、本発明を特定の実施形態について限定するものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むものであると理解されなければならない。本発明の説明において、関連公知技術に係わる具体的な説明が、本発明の要旨を不明確にすると判断される場合、その詳細な説明を省略する。

【0027】

テロメアは、染色体の末端に反復的に存在する遺伝物質であって、当該染色体の損傷や、他の染色体との結合を防止すると知られている。細胞が分裂するたびに、テロメアの長さは少しずつ短くなるが、一定回数以上の細胞分裂があれば、テロメアは非常に短くなり、その細胞は、分裂を止めて死ぬ。一方、テロメアを長くすれば、細胞の寿命が延長されると知られており、その例として、癌細胞では、テロメラーゼという酵素が分泌され、テロメアが短くなることを防ぐために、癌細胞が死なずに、続けて増殖すると知られている。本発明者らは、テロメラーゼに由来するペプチドが、前立腺肥大症の治療及び予防に効果的であるということを確認し、本発明を完成するに至った。

【0028】

本発明の一側面において、配列番号１のペプチド、配列番号１の断片であるペプチド、又は前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼ、具体的には、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）テロメラーゼに由来するペプチドを含む。

【0029】

本明細書に開示されたペプチドは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列相同性を有するペプチドも含む。また、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１を含むペプチド又はその断片と、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸、又は７個以上のアミノ酸が変化したペプチドと、を含んでもよい。

【0030】

本発明の一側面において、アミノ酸変化は、ペプチドの物理化学的特性を変更させる性質に属する。例えば、ペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を変更させ、最適のｐＨを変化させるようなアミノ酸変化が行われる。

【0031】

本明細書において「アミノ酸」というのは、自然にペプチドに統合される２２個の標準アミノ酸だけではなく、Ｄ−アイソマー、及び変形されたアミノ酸を含む。それにより、本発明の一側面においてペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドでもある。一方、本発明の他の側面においてペプチドは、翻訳後修飾が行われた非標準アミノ酸なども含む。翻訳後修飾の例は、リン酸化、糖化、アシル化（例えば、アセチル化、ミリストイル化及びパルミトイル化を含む）、アルキル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、糖化反応、ビオチニル化、ユビキチニル化、化学的性質の変化（例えば、ベータ除去脱イミド化、脱アミド化）及び構造的変化（例えば、二硫化物ブリッジの形成）を含む。また、ペプチド結合体を形成するための架橋剤との結合過程で起こる化学反応によって生ずるアミノ酸の変化、例えば、アミノ基、カルボン酸基、又は側鎖での変化のようなアミノ酸の変化を含む。

【0032】

本明細書に開示されたペプチドは、自然そのままの供給源から同定されて分離された野生型ペプチドでもある。一方、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１の断片であるペプチドと比較し、一つ以上のアミノ酸が置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む人工変異体でもある。人工変異体だけではなく、野生型ポリペプチドでのアミノ酸変化は、タンパク質のフォールディング及び／又は活性に、有意の影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換を含む。保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ルシン、イソロイシン及びメチオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）の群の範囲内にある。一般的に、特異的活性を変更させないアミノ酸置換が、本分野に公知されている。最も一般的に発生する交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、並びにそれらと反対のものである。保存的置換の他の例は、次の表１の通りである。

【0033】

【表1】

【0034】

ペプチドの生物学的特性における実在的な変形は、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シート又は螺旋立体構造の維持におけるそれらの効果、（ｂ）標的部位での前記分子の電荷又は疎水性の維持におけるそれらの効果、又は（ｃ）側鎖のバルク維持におけるそれらの効果がかなり異なる置換部を選択することによって行われる。天然残基は、通常の側鎖特性に基づいて、次のグループに区分される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

【0035】

非保存的置換は、それら部類のうち１つの構成員を他の部類に交換することによって行われる。ペプチドの適切な立体構造の維持と関連性のないいかなるシステイン残基も、一般的にセリンで置換され、前記分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋結合を防止することができる。逆に言えば、システイン結合を前記ペプチドに加え、その安定性を向上させることができる。

【0036】

ペプチドの他類型のアミノ酸変異体は、抗体のグリコシル化パターンが変化したものである。変化という意味は、ペプチドで発見された一つ以上の炭水化物残基の欠失、及び（又は）ペプチド内に存在しない一つ以上のグリコシル化部位の付加を示す。

【0037】

ペプチドのグリコシル化は、典型的にＮ連結されるか、あるいはＯ連結されたものである。Ｎ連結されているということは、炭水化物残基が、アスパラギン残基の側鎖に付着したことをいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除いた任意のアミノ酸）は、炭水化物残基をアスパラギン側鎖に酵素的に付着させるための認識配列である。従って、それらトリペプチド配列のうち一つがポリペプチドに存在することによって、潜在的なグリコシル化部位が生成される。Ｏ連結されたグリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースのうち一つを、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリン又はトレオニンに付着させることを意味するが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリシンを使用することもできる。

【0038】

ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、一つ以上の前述のトリペプチド配列を含むように、アミノ酸配列を変化させることによって便利に行われる（Ｎ連結されたグリコシル化部位の場合）。そのような変化は、一つ以上のセリン残基又はトレオニン残基を、最初の抗体の配列に付加するか、それら残基で置換することによって行われる（Ｏ連結されたグリコシル化部位の場合）。

【0039】

また、本発明の一側面による、配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の断片であるペプチド、又は前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、細胞内毒性が低く、生体内安定性が高いという長所を有する。本発明における配列番号１は、テロメラーゼ由来のペプチドであって、下記のように、１６個のアミノ酸からなるペプチドである。

【0040】

配列番号１：ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫ

【0041】

本発明の一側面においては、配列番号１のアミノ酸配列を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）ペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はその断片であるペプチドを有効成分として含む前立腺肥大症治療用及びその予防用組成物を提供する。

【0042】

本発明の一側面による組成物は、ヒト、イヌ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ギニアピッグ又はサルを含む全ての動物に適用される。

【0043】

本発明の一側面において組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はその断片であるペプチドを有効成分として含む前立腺肥大症治療用及びその予防用の薬学組成物を提供する。本発明の一側面による薬学組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内又は皮下などに投与される。

【0044】

経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質又は硬質のカプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤又は乳濁剤でもあるが、それらに制限されるものではない。非経口投与のための剤形は、注射剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁液剤、乳剤、坐剤、パッチ又は噴霧剤でもあるが、それらに制限されるものではない。

【0045】

本発明の一側面による薬学組成物は、必要によっては、希釈剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、着色剤、香料又は甘味剤などの添加剤も含む。本発明の一側面による薬学組成物は、当業界の一般的な方法によって製造される。

【0046】

本発明の一側面による薬学組成物の有効成分は、投与される対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその深刻度、投与経路又は処方者の判断によって異なる。そのような因子に基づいた適用量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、０．０１μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｇ／ｋｇ／日、具体的には、０．１μｇ／ｋｇ／日ないし１ｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には、１μｇ／ｋｇ／日ないし０．１ｇ／ｋｇ／日、一層具体的には、１μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｍｇ／ｋｇ／日、望ましくは、１μｇ／ｋｇ／日ないし１ｍｇ／ｋｇ／日、さらに望ましくは、０．００５ｍｇ／ｋｇないし０．０５ｍｇ／ｋｇ、最も望ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日にもなり、用量による効果の違いを示す場合、それを適切に調節することができる。成人の場合、１回投与時、０．１ｍｇないし１ｍｇ、望ましくは、０．４ｍｇないし０．６ｍｇの投与、特に、０．５６ｍｇの投与が望ましい。

【0047】

本発明の一側面による薬学組成物は、１日１回ないし３回投与されるが、それに制限されるものではない。

【0048】

本明細書に開示された組成物において、ペプチドの濃度は、当業界に公知されているところによって、一般的に決定される。例えば、本発明の一側面による組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はその断片であるペプチドを、０．０１ｇ／Ｌないし１ｋｇ／Ｌ、具体的には、０．１ｇ／Ｌないし１００／Ｌ、さらに具体的には、１ｇ／Ｌないし１０ｇ／Ｌの含量で含むが、用量による効果の違いを示す場合、それを適切に調節することができる。前記範囲で含む場合、本発明の意図した効果を示すのに適切なだけではなく、組成物の安定性及び安全性をいずれも満足することができ、費用対比での効果の側面でも、前記範囲で含むことが適切である。

【0049】

本発明の一側面において組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、又はその断片であるペプチドを有効成分として含む前立腺肥大症治療及びその予防の食品組成物を提供する。

【0050】

本発明の一側面による食品組成物の剤形は、特別に限定されるものではないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、液剤、固形製剤などに剤形化される。各剤形は、有効成分以外に、当該分野で一般的に使用される成分を、剤形目的又は使用目的によって、当業者が困難さなしに、適宜選定して配合することができ、他の原料と同時に適用する場合、相乗効果が起こることが可能である。

【0051】

本明細書において使用された用語は、特定具体例について説明するための目的だけに意図されたものであり、本発明を限定する意図ではない。名詞の前に個数が省略された用語は、数量を制限するものではなく、言及された名詞物品が一つ以上存在するということを示すのである。用語「含む」、「有する」及び「含有する」というのは、開かれた用語として解釈される（すなわち、「含むが、それに限定されるものではない」という意味）。

【0052】

数値範囲の言及は、単にその範囲内に属するそれぞれの別個の数値を個別的に言及することの代わりをする容易な方法であるために、そうではないということが明示されていない限り、各別個の数値は、まさしく個別的に明細書に言及されているように、本明細書に統合される。全範囲の終値は、その範囲内に含まれ、独立して組み合わせ可能である。

【0053】

本明細書に言及された全ての方法は、取り立てて明示されているか、あるいは文脈によって明白に矛盾しない限り、適切な手順によって遂行される。ある一実施例及び全ての実施例、又は例示的言語（例えば、「〜のような」）の使用は、特許請求の範囲に含まれていない限り、単に本発明をさらに良好に記述するためものであり、本発明の範囲を制限するものではない。明細書のいかなる言語も、いかなる非請求構成要素を、本発明の実施に必須なものであると解釈されることがあってはならない。取り立てての定義がない限り、本明細書に使用される技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野で当業者によって、一般的に理解されるような意味を有する。

【0054】

本発明の望ましい具体例は、本発明を実施するために発明者に知られた最適のモードを含む。望ましい具体例の変動は、先行する記載に触れれば、当業者に明白になるであろう。本発明者らは、当業者がかような変動を適切に利用するということを期待し、本発明者らは、本明細書の記載と異なる方式で本発明が実施されるということを期待する。従って、本発明は、特許法によって許容されているように、特許請求の範囲で言及された発明の要旨の均等物及び全ての変形を含む。さらに、全ての可能な変動内で、前述の構成要素のいかなる組み合わせも、ここで異なって明示されるか、あるいは文脈上明白に矛盾しない限り、本発明に含まれるものである。本発明は、例示的な具体例を参照して具体的に示されて記述されたが、当業者は、特許請求の範囲によって定義される発明の精神及び範囲を外れずとも、形態及びディテールにおいて、多様な変化が行われるということを十分に理解するであろう。

【0055】

以下、実施例及び実験例を挙げ、本発明の構成及び効果についてさらに具体的に説明する。しかし、下記の実施例及び実験例は、本発明に係わる理解の一助とするために、例示の目的にのみ提供されたものであり、本発明の範疇及び範囲は、それらによって制限されるものではない。

【実施例】

【0056】

実施例１：ペプチドの合成
配列番号１のペプチド（以下「ＰＥＰ １」とする）を従来に知られた固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）によって製造した。具体的には、ペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Ｐｅｐｔｒｏｎ、Ｉｎｃ．，大韓民国・大田）を利用して、Ｆｍｏｃ固相合成法を介して、Ｃ末端からアミノ酸一つずつカップリングすることによって合成した。次のように、ペプチドのＣ末端の最初のアミノ酸が樹脂に付着されたものを使用した。例えば、次の通りである：
ＮＨ_２−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジン
ＮＨ_２−Ａｌａ−２−クロロ−トリチルレジン
ＮＨ_２−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−２−クロロ−トリチルレジン

【0057】

ペプチド合成に使用した全てのアミノ酸原料は、Ｎ−ｔｅｒｍがＦｍｏｃで保護され、残基はいずれも酸で除去される、Ｔｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｕ（ｔ−ブチルエステル）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルホニル）などで保護されたものを使用した。例えば、次の通りである：
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ、Ｔｒｔ−メルカプト酢酸。

【0058】

カップリング試薬としては、ＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアンモニウム ヘキサフルオロホスフェート］／ＨＯＢｔ［Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール］／ＮＭＭ［４−メチルモルホリン］を使用した。Ｆｍｏｃ除去は、２０％のＤＭＦ中のピペリジンを利用した。合成されたペプチドをレジンから分離し、残基の保護基除去には、切断カクテル［ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）／ＥＤＴ（エタンジチオール）／Ｈ_２Ｏ＝９２．５／２．５／２．５／２．５］を使用した。

【0059】

アミノ酸保護基が結合された出発アミノ酸が固相支持体に結合されている状態を利用して、ここに当該アミノ酸をそれぞれ反応させ、溶媒で洗浄した後、脱保護する過程を反復することにより、各ペプチドを合成した。合成されたペプチドを樹脂から切り取った後、ＨＰＬＣで精製し、合成いかんをＭＳで確認して凍結乾燥させた。

【0060】

本実施例に使用されたペプチドに対して、高性能液体クロマトグラフィ結果、全てのペプチドの純度は、９５％以上であった。

【0061】

ＰＥＰ １製造に係わる具体的な過程について説明すれば、次の通りである。
１）カップリング
ＮＨ_２−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジンで保護されたアミノ酸（８当量）と、カップリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶解させて添加した後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。
２）Ｆｍｏｃ脱保護
２０％のＤＭＦ中のピペリジンを加え、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。
３）１及び２の反応を反復して行い、ペプチド基本骨格ＮＨ_２−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジン）を作った。
４）切断：合成が完了したペプチドレジンに、切断カクテルを加え、ペプチドをレジンから分離した。
５）得られた混合物に、冷ジエチルエーテルを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈澱させる。
６）Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した後、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認して凍結させ、パウダーに製造した。

【0062】

実施例２：前立腺肥大症誘発動物実験を通じるＰＥＰ１の前立腺肥大症に対する効能確認
１）前立腺肥大症誘発実験動物の準備
アンドロゲンとして、主に体内に作用するホルモンは、テストステロンである。しかし、前立腺の発達に関与するアンドロゲンにおいて最も影響力あるホルモンは、５αジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）であり、テストステロンと５αリダクターゼとが結合しながら生成される。ラットにおいて、スルピリドを３０日間４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与すれば、２型ドーパミン受容体を阻害し、体内のプロラクチン濃度を高め、高プロラクチン血症を誘導し、５αリダクターゼを活性化させ、テストステロンと反応し、シナジー（相乗）効果を示す。高プロラクチン血症によって生成されたＤＨＴは、前立腺の背部、腹部、側面、四肢（ｌｏｂｅ）のうち、側面四肢に相対的にさらに多くの重量増加を起こすと知られている。その事実に基づいて、次のように、前立腺肥大症誘発動物に対する、実施例１から用意されたＰＥＰ１単独、又は試験物質との併用の投与実験が進められた。成熟したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット（６週齢）を、第一実験動物センターから分けてもらい、１週間順化飼育した後（約７週齢、４９日齢）で試験に使用した。前立腺肥大症を誘導するために、スルピリド（４０ｍｇ／ｋｇ）を毎日１回３０日間経口投与した。全ての実験は、先行研究結果によって行われ（Ｖａｎ Ｃｏｐｐｅｎｏｌｌｅら、２００１）、試験物質投与は、全ての動物に対して、毎日午前１０時に投与を始めた。試験物質投与後、毎日動物の一般状態及び特異症状などを観察した。また、試験物質投与前、全動物の体重を測定した後で記録した。

【0063】

２）試験物質及び投与用量
試験物質であるスルピリドはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、米国）から購入して試験に利用した。本研究陣は、高プロラクチン血症による前立腺肥大を誘導するために、スルピリド４０ｍｇ／ｋｇを、１日１回６０日間連続して腹腔投与した。スルピリドは、０．１Ｎ濃度塩酸（ＨＣｌ）溶液にまず溶解させた後、０．１Ｎ濃度水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を使用して、ｐＨ７．０で中和させる方法で、毎日試験物質投与前に製造した。併用投与群においては、スルピリドを腹腔投与した後、実施例１によって製造されたＰＥＰ１及びフィナステリドをそれぞれ投与した。ＰＥＰ１（０．０１、０．１、１及び１０ｍｇ／ｋｇ）は、毎日の使用時に製造して皮下注射した。フィナステリドは、１５％エタノール／トウモロコシ油（ｖ／ｖ）をベヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）にして毎日製造した。試験物質の投与用量は、０．５ｍｌ／ｋｇであって、毎日体重を測定して算出した。下記表２に示されているように、７個の群に対して、ＰＥＰ１の前立腺肥大症に対する効能を調べるために投与した。

【0064】

【表2】

【0065】

３）前立腺肥大症誘発実験動物に対するＰＥＰ１、及び試験物質投与実験後の動物組織の採取、保管及び重さ測定
試験物質を６０日間投与した後、２４時間で、全ての動物は、エーテルで麻酔した後、腹部大動脈から血液を採取して血清を分離した。分離した血清は、ホルモン分析のために−８０℃で保管した。

【0066】

全ての動物に対して、亀頭包皮分離（ＰＰＳ：ｐｒｅｐｕｃｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）の有無を検査した後、亀頭（Ｇｐ：ｇｌａｎｄ ｐｅｎｉｓ）、精嚢（ＳＶ：ｓｅｍｉｎａｌ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｎｇ ｇｌａｎｄｓ）、腹側前立腺（ＶＰ：ｖｅｎｔｒａｌ ｐｒｏｓｔａｔｅ）、クーパー腺（ＣｐＧ：ｃｏｗｐｅｒ’ｓ ｇｌａｎｄｓ）及びＬＡＢＣ（ｌｅｖａｔｏｒ ａｎｉ ｐｌｕｓ ｂｕｌｂｏｃａｖｅｒｎｏｓｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）などの副生殖腺を順に分離した。それぞれの細部分離過程は、ＯＥＣＤプロトコルによって実施した。

【0067】

亀頭（Ｇｐ）の分離は、図１に図示されているように、ピンセットで亀頭部位を取り、包皮の分離線に沿って切る。また、肺の場合は、図１に図示されているように、腹部筋肉層から膀胱を分離した後、脂肪層によって覆い包まれた肺の左右葉を露出させながら、膀胱をＳＶに向けて出した後、微細なピンセットで、肺の左右葉から脂肪を分離し、両手で微細なピンセットで、肺の左側葉を尿道から軽く引き出し、はさみで除去した後、鉗子で肺の右側葉を取り、尿道部から肺の左側葉を露出させて切り捨てる。凝固線を含んだＳＶの場合は、図１に図示されているように、筋肉、脂肪層及び腺（ｇｌａｎｄ）を区分するために、精嚢（ＳＶ）下に紙タオルを載せる。尿道と連結された輸精管が位置した精嚢（ＳＶ）の基底部（ｂａｓｅ）をクランプで固定し、精嚢を切除する間、液漏出を防止する。その後、脂肪を除去した後、関連付属器官を整理してクランプを除去した後、精嚢お皿に載せて重さを測定する。

【0068】

４）ＰＥＰ１の投与が、前立腺肥大症誘発実験動物の５αリダクターゼｍＲＮＡ発現に及ぼす影響
スルピリド及び試験物質をそれぞれ併用して６０日間投与した後、腹側前立腺を摘出し、５αリダクターゼの発現に及ぼす影響を、ＲＴ−ＰＣＲを利用して測定した。詳細には、腹側前立腺（ｖｅｎｔｒａｌ ｐｒｏｓｔａｔｅ、２５ｍｇ）から総ＲＮＡを分離し、ＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒを加えて再懸濁させた。その後、光学スペクトロメーターを利用してＲＮＡを定量した。最初の鎖ｃＤＮＡを、Ｔｏｒｒｅｓ及びＯｒｔｅｇａ（２００４）の方法によって合成した。ＰＣＲプロファイルは、変性９４℃（３０秒）、アニーリング５５℃（３０秒）、伸長７２℃（３０秒）、サイクル回数３０〜３５回で行った。そのとき、定量のための電気泳動時、対照群として、発現量が薬物によってあまり変わらないＧＡＰＤＨを使用した。その結果、スルピリド投与によって増加した５αリダクターゼの発現が、ＰＥＰ１投与群において、用量依存的に抑制効果が示され、高用量（ＧＶ１０、ＰＥＰ１を１０ｍｇ投与した群）群では、フィナステリドより抑制効果が高く示された（図２参照）。従って、ＰＥＰ１は、用量依存的に、前立腺肥大症に対して、５αリダクターゼ抑制による治療又は改善の効果を示すように見られる。

【0069】

５）ＰＥＰ１の投与が、前立腺肥大症誘発実験動物の臓器に及ぼす影響
下記表３には、ペプチドＰＥＰ１が、実験群の精嚢重さ、前立腺重さ、前立腺指数（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｉｎｄｅｘ）に及ぼす影響を示した。表３に示した前立腺指数は、体重／最終前立腺重量の算式によって計算されたものである。

【0070】

【表3】

【0071】

表３の結果をグラフで示したもの、すなわち、スルピリドを投与した後、前立腺肥大症が誘発された動物に、ＰＥＰ１及びフィナステリド（５ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ投与して精嚢の重さを観察した結果、ＰＥＰ１を高濃度（１０ｍｇ／ｋｇ）で投与した場合、精嚢の重さが対照群に比べて有意的に減少するということを確認することができた（図３参照）。また、スルピリドとＰＥＰ１とを併用投与した結果でも、精嚢と類似して、スルピリドによって前立腺肥大症が誘発された実験動物において、前立腺重さが有意的に減少するということを確認することができた（図４参照）。ｐ値は、０．０５以下であれば、有意であるということを示す。

【0072】

従って、実施例２の結果を介して、スルピリドによって前立腺肥大症が誘発された動物に対するＰＥＰ１の投与は、濃度依存的に、５αリダクターゼの発現減少、精嚢重さ減少、前立腺重さ減少の効果を示すということを確認することができる。それは、ＰＥＰ１の投与が、５αリダクターゼ発現、及び生殖器重さで示される前立腺肥大症疾患症状の治療及び改善に効果的であると見られる。

【0073】

実施例３：ＤＨＴによる前立腺実質細胞、及び上皮細胞の増殖変化確認を介したＰＥＰ１の前立腺肥大症に対する効能確認
１）実験細胞準備及び実験進行方式
テストステロンは、体内に注入されれば、５αリダクターゼによってＤＨＴの形態になり、前立腺細胞増殖を促進し、それにより、前立腺肥大症（ＢＰＨ）を誘発する。その事実に基づき、次のように、前立腺細胞株の細胞増殖抑制効果に対する、実施例１から準備されたＰＥＰ１投与実験が進められた。細胞株は、前立腺肥大動物モデルで得た前立腺の実質細胞株（ＷＰＭＹ−１）及び上皮細胞株（ＲＷＰＥ−１）を使用した。実験方法は、ＷＰＭＹ−１（２．５×１０^３細胞）とＲＷＰＥ−１（１×１０^４細胞）とを、９６ウェルに播種し、表４のような実験群を対象に、増殖変化を確認した。増殖変化確認は、培養液を吸引後、ＣＣＫ−８溶液を各ウェルに１０μＬずつ入れた後、１−４時間、４５０ｎｍで光学密度を測定する方式で進めた。

【0074】

２）測定結果及び効能確認
ＤＨＴを処理していないグループ（１−３グループ）間では、ＰＥＰ１を投与していないグループ（１グループ）と、投与した（２及び３グループ）グループとにおいて、目立つ違いが、実質細胞株（ＷＰＭＹ−１）及び上皮細胞株（ＲＷＰＥ−１）のいずれにおいても見られないということが分かった。ＤＨＴを処理したグループ（４−６グループ）間では、ＰＥＰ１を投与していないグループ（４グループ）と、投与した（５及び６グループ）グループとにおいて、有意的な違いを示し、ＰＥＰ１を処理したグループにおいて、確実な増殖抑制効果があるということが分かった（表４及び図５，６参照）。従って、ＤＨＴによる前立腺肥大症に影響を与える前立腺細胞増殖抑制に、ＰＥＰ１が効果があると見られる。

【0075】

【表4】

【0076】

実施例４：ＰＥＰ１のアンドロゲン受容体結合能確認及び前立腺肥大症抑制メカニズム確認
１）実験細胞準備及び実験進行方式
５αリダクターゼによって生成されたＤＨＴは、アンドロゲン受容体に結合し、前立腺細胞増殖を促進し、それにより、前立腺肥大症（ＢＰＨ）を誘発する。その事実に基づき、次のように、前立腺細胞株の細胞増殖抑制効果に対する、実施例１から準備されたＰＥＰ１投与実験が進められた。細胞株は、前立腺肥大動物モデルで得た前立腺の実質細胞株（ＷＰＭＹ−１）及び上皮細胞株（ＲＷＰＥ−１）を使用した。前立腺の実質細胞株（ＷＰＭＹ−１）及び上皮細胞株（ＲＷＰＥ−１）を、抗アンドロゲン受容体と、そのイソタイプ対照群として実験する対象群とにそれぞれ分けた後、それぞれの抗体と共に、１時間培養した実験群に、ＰＥＰ１−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）結合体を入れて競争テストを進め、その結果を蛍光値で測定した。蛍光値測定は、流細胞（フローサイトメトリー）分析法を使用した。

【0077】

２）測定結果及び効能確認
実質細胞株（ＷＰＭＹ−１）及び上皮細胞株（ＲＷＰＥ−１）それぞれに対して、抗アンドロゲン受容体イソタイプ対照群抗体をまず反応させた（抗体と競争させる）場合、（最右側ピーク）、抗アンドロゲン受容体抗体をまず反応させた（抗体と競争させる）場合（中央に位置したピーク）、及び２抗体いずれも入れず、ＦＩＴＣも結合させていない場合（最左側ピーク）に分け、その蛍光値を測定した（図７及び図８参照）。抗アンドロゲン受容体イソタイプ対照群抗体と競争した場合、ＰＥＰ１が抗アンドロゲン受容体と結合するので、ＰＥＰ１−ＦＩＴＣ結合体の蛍光発現率が上昇した結果が示された（ヒストグラムグラフのピークが右側に押される）。抗アンドロゲン受容体抗体と競争した場合、ＰＥＰ１の抗アンドロゲン受容体との結合力が低下し、蛍光発現率が低下した結果が示された（ヒストグラムグラフのピークが左に押される）。従って、ＤＨＴが抗アンドロゲン受容体と結合し、前立腺肥大症の誘導を防ぐＰＥＰ１の作用を見るとき、ＰＥＰ１がアンドロゲン受容体と直接結合することにより、前立腺肥大症に効果があると見られる。

【0078】

実施例５：前立腺肥大症誘発動物モデルを介したＰＥＰ１の前立腺肥大症に対する生体内効果確認
１）実験動物の準備
本実施例は、６−８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６（ｎ＝１０／ｇｒｏｕｐ）マウスを利用し、マウスは、ソウル大学校医科大学実験動物室ＳＰＦ（特定病原体未感染）区域で飼育した。注射用テストエナント酸テストステロン（ＴＥ：エナント酸テストステロン、ＥＶＥＲ Ｐｈａｒｍａ Ｈｅｎａ ＧｍｂＨ、ドイツから購入）と、エストラジオールバレレート（吉草酸エストラジオール、ＥＶＥＲ Ｐｈａｒｍａ Ｈｅｎａ ＧｍｂＨ、ドイツから購入）とを、それぞれ５０ｍｇ、０．５ｍｇずつ７０μｌボリュームに合わせて混合し、マイクロ浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ ｐｕｍｐ，ＤＵＲＥＣＴ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国から購入）に入れた後、マウスを麻酔し、背部に移植した。ポンプは、浸透現象を利用して、時間当り０．１１μｌずつ２８日（２週間）間、徐々にホルモンをマウスに放出するように考案された。

【0079】

２）試験物質及び投与用量
試験物質としては、テストステロン及びフィナステリドを使用した。準備された動物モデルに、個体（２５ｇネズミモデル基準）当たり、頭部に、実施例１から準備したＰＥＰ１の場合、２５０μｇを毎日皮下投与し、フィナステリドの場合、２，５００μｇ（ＤＭＳＯ内又はシクロデキストリン内、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国から購入）を毎日皮下投与（注射）し、試験物質注入から２週間後（動物モデルに対するポンプ移植から４週間後）、血液を眼窩静脈から採取し、１４，０００ｒｐｍ、４℃、３０分間、遠心分離して血清を分離し、前立腺を摘出して液体窒素で凍らせ、−７０℃で保管するか、あるいは固定液で固定した。試験結果のための実験群を分ければ、下記表５の通りである。

【0080】

【表5】

【0081】

３）前立腺肥大症誘発因子の減少測定
前立腺肥大症誘発によって、前立腺組織においては、ＰＣＮＡ（複製に必須タンパク質）及びＫｉ６７（ＭＫＩ６７、細胞増殖に必須タンパク質）の発現が増加する。その事実に基づき、ＰＥＰ１が、前立腺肥大症誘発ネズミモデルにおいて、ＰＣＮＡ及びＫｉ６７の発現を抑制する効果を測定した。ＰＣＮＡは、前立腺組織から抽出した細胞において得たタンパク質を、２Ｄゲル電気泳動を使用して発現を測定し、Ｋｉ６７は、免疫染色検定法を使用して、組織における発現程度を測定した。測定結果、前立腺肥大症が誘発された動物の前立腺組織において増加したＰＣＮＡ及びＫｉ６７の発現が、ＰＥＰ１処理によって抑制されるということを確認した（図９及び図１０参照）。従って、ＰＥＰ１は、前立腺肥大症誘発因子の発現を抑制し、前立腺肥大症の治療及び改善に効果があると見られる。

【0082】

４）前立腺肥大症誘発関連組織の変化測定
前立腺肥大症は、前立腺の腺を構成している実質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）及び上皮細胞の異常増殖によって誘発されると知られている。その事実に基づき、ＰＥＰ１が、前立腺肥大症対象の前立腺組織に変化をもたらすということを調べるために、前立腺肥大症誘発動物モデルを対象にした組織学的分析を行った。一般的な組織の変化を見るために、Ｈ＆Ｅ染色法を使用して、炎症反応程度を確認するために、マッソントリクローム染色を行い、核形態をさらにはっきりと確認した。分析結果、対照群に比べ、前立腺肥大症を誘発した群においては、上皮細胞の層が厚くなる現象が、前立腺組織全般にかけて示されることを確認することができたが、ＰＥＰ１を投与した群においては、ほとんどの場合、上皮細胞の配列が対照群と類似して一列に押しなべて配列されており、それら細胞が集まって作る上皮の厚さも、前立腺肥大症誘発群に比べ、相対的に薄いということを確認することができた（図１１及び図１２参照）。従って、ＰＥＰ１は、前立腺肥大症誘発関連組織の変化を、前立腺肥大症が示されていない正常組織と類似するように戻して治癒する効果があると見られる。

【0083】

５）前立腺肥大症関連臓器の変化測定
前立腺肥大症は、前立腺及び精嚢の重量増加でも分かる。その事実に基づき、ＰＥＰ１が、前立腺肥大症の症状が直接示される臓器である前立腺と精嚢との重さに与える影響を調べるために、前立腺肥大症誘発動物モデルを対象に、体重、前立腺重さ、精嚢重さを測定した。測定結果を、表５での群別にグラフで示した（図１３，１４及び１５参照）。全体的な体重の変化は示されていないが、ホルモンを投与した群において、著しく増加した前立腺重さが、ＰＥＰ１を投与した群において有意的に減少し、それは、既存の前立腺肥大症治療剤であるフィナステリドを投与した群と比べるときも、類似した減少程度を示すので、ＰＥＰ１を投与した群の減少が、有意的であるということをさらに確認することができた。精嚢の場合にも、ホルモンを投与した群に比べ、ＰＥＰ１を投与した群において重さが減少する傾向を見せた。従って、ＰＥＰ１は、前立腺肥大症の症状が直接示される臓器の実質的な重さ減少にも、効果があると見られる。

【0084】

前記実施例においてＰＥＰ１は、前立腺肥大症誘発動物モデルを介した実験において、インビトロ及びインビボで観察した結果、前立腺肥大症関連誘発因子、ホルモン受容体、及び直接的な生殖器（臓器）に治療的に肯定的な効果を示すということが分かった。従って、ＰＥＰ１を利用した前立腺肥大症の治療及び改善、予防は、効果的であると見られ、さらには、前立腺肥大症の効果的な治療剤及び治療方法としての開発可能性が高いと見られる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]