特許 6383403 β−３作動薬および中間体の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6383403

(24)【登録日】2018年8月10日

(45)【発行日】2018年8月29日

(54)【発明の名称】β−３作動薬および中間体の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 207/09 20060101AFI20180820BHJP

   C12P 17/10 20060101ALI20180820BHJP

   C07D 487/04 20060101ALI20180820BHJP

   C07C 215/30 20060101ALI20180820BHJP

   C12N 9/02 20060101ALN20180820BHJP

   C07B 61/00 20060101ALN20180820BHJP

【ＦＩ】

   C07D207/09

   C12P17/10

   C07D487/04 140

   C07C215/30

   !C12N9/02ZNA

   !C07B61/00 300

【請求項の数】18

【全頁数】36

(21)【出願番号】特願2016-501364(P2016-501364)

(86)(22)【出願日】2014年3月12日

(65)【公表番号】特表2016-515117(P2016-515117A)

(43)【公表日】2016年5月26日

(86)【国際出願番号】US2014023858

(87)【国際公開番号】WO2014150639

(87)【国際公開日】20140925

【審査請求日】2017年2月15日

(31)【優先権主張番号】61/791,247

(32)【優先日】2013年3月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】596129215

【氏名又は名称】メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100151448

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 孝博

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100185959

【弁理士】

【氏名又は名称】今藤 敏和

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】シユイ，フオン

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ジユウチーン

(72)【発明者】

【氏名】デスモンド，リチヤード

(72)【発明者】

【氏名】パーク，ジヨンハン

(72)【発明者】

【氏名】カリニン，アレクセイ

(72)【発明者】

【氏名】コスジエク，ビルジツト

(72)【発明者】

【氏名】ストロツトマン，ハレナ

(72)【発明者】

【氏名】リー，ホーンメイ

(72)【発明者】

【氏名】モンセツチ，ジヨハンナ

【審査官】 伊佐地 公美

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５１００２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５０７３６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５２７８４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０２５０８５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 XU, F. et al.，Organic Letters，２０１３年，Vol. 15, No. 6，pp. 1342-1345

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ

Ｃ０７Ｄ

Ｃ１２Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

化合物１−６：

【化1】

の製造方法であって、
（ａ−２）ＫＲＥＤ酵素の存在下に、化合物Ｉ−３：

【化2】

を還元して化合物Ｉ−４：

【化3】

を製造し；
（ｂ−２）触媒Ｄの存在下に、化合物Ｉ−４を化合物Ａ−１：

【化4】

とカップリングさせて、Ｉ−５（ａ）を製造し、次に酸によってイン・サイチュで脱保護することで、化合物Ｉ−５（ｂ）：

【化5】

を塩として得、ここで、触媒Ｄは、ＣｕＩ、ＣｕＢｒおよびＣｕＣｌから選択される触媒量の材料の存在下または非存在下での、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、ＰｄＣｌ_２、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロライド、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタンクロロパラジウム、１，３−ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパンジクロロパラジウム（ＩＩ）、１,１′−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンジクロロパラジウム（ＩＩ）および酢酸パラジウム（ＩＩ）／トリフェニルホスフィンよりなる群から選択されるものであり；
（ｃ−２）触媒Ｅの存在下に、化合物Ｉ−５（ｂ）を環化および還元して、Ｉ−６−１を介して化合物Ｉ−６：

【化6】

を製造することを含む方法であって、
ここで、Ｐ^１は、アシル（ＣＨ_３Ｃ（Ｏ）−）、ベンジル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンゾイル、カルボベンジルオキシ、３，４−ジメトキシベンジル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、４−ニトロベンゼンスルホニル、ｐ−メトキシベンジルカルボニルおよびｐ−トルエンスルホニルからなる群から選択され；
Ｙは、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒおよびトリフレートから選択され；
Ｒは、Ｈ、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリイソプロピルシリルおよびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルからなる群に限定され、
ここで、触媒Ｅは、白金／アルミナ、パラジウム／アルミナ、ロジウム／アルミナ、活性炭担持パラジウム、Ｐｄ（ＯＨ）_２−炭素、白金／アルミナ−バナジウム／炭素またはバナジウム酸塩、ラネーニッケル、ロジウム／炭素、ロジウム／アルミナ、白金／炭素、ルテニウム／炭素および酸化白金からなる群から選択され；そして
Ｒ^Ｎは、Ｐ^１またはＨである。

【請求項2】

化合物Ｉ−７：

【化7】

を製造する方法であって、
（ａ−２）ＫＲＥＤ酵素の存在下に、化合物Ｉ−３：

【化8】

を還元して、化合物Ｉ−４：

【化9】

を製造し；
（ｂ−２）触媒Ｄの存在下に、化合物Ｉ−４を化合物Ａ−１：

【化10】

とカップリングさせてＩ−５（ａ）を製造し、次にイン・サイチュで酸で脱保護して、化合物

【化11】

を塩として製造し；
（ｃ−２）触媒Ｅの存在下に、化合物Ｉ−５（ｂ）を環化および還元して、Ｉ−６−１を介して化合物Ｉ−６：

【化12】

を製造し；
（ｄ−２）カップリング剤および適宜に塩基の存在下に、化合物Ｉ−６を化合物Ａ−２：

【化13】

とカップリングさせて、化合物Ｉ−７：

【化14】

を製造することを含む方法であって、
ここで、Ｐ^１は、アシル（ＣＨ_３Ｃ（Ｏ）−）、ベンジル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンゾイル、カルボベンジルオキシ、３，４−ジメトキシベンジル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、４−ニトロベンゼンスルホニル、ｐ−メトキシベンジルカルボニルおよびｐ−トルエンスルホニルからなる群から選択され；
Ｘは、Ｎａ、ＬｉおよびＫから選択され；
Ｙは、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒおよびトリフレートから選択され；
Ｒは、Ｈ、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリイソプロピルシリルおよびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルからなる群に限定され；そして
Ｒ^Ｎは、Ｐ^１またはＨであり、そしてここで、
触媒Ｄ及び触媒Ｅは、請求項１に同じである。

【請求項3】

化合物Ｉ−６：

【化15】

の製造方法であって、
（ａ−１）溶媒、酸化剤および触媒Ａの存在下に、
化合物Ｉ−１：

【化16】

を反応させて、イン・サイチュでアルデヒドを形成し、次に、Ｘ−ＣＮおよびアンモニウム塩および保護試薬存在下に縮合することで、化合物Ｉ−２：

【化17】

を製造し、
ここで、触媒Ａは、ＴＥＭＰＯまたはＴＥＭＰＯ類縁体であり、ここで、ＴＥＭＰＯは、１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジンであり；
（ｂ−１）フェニルグリニャール試薬の存在下に、化合物Ｉ−２を反応させて、化合物Ｉ−３：

【化18】

を製造し；
（ｃ−１）ＫＲＥＤ酵素の存在下に、化合物Ｉ−３を還元して、化合物Ｉ−４：

【化19】

を製造し；
（ｄ−１）触媒Ｄの存在下に、化合物Ｉ−４を化合物Ａ−１：

【化20】

とカップリングさせてＩ−５（ａ）を製造し、次にイン・サイチュで酸で脱保護して、化合物Ｉ−５（ｂ）：

【化21】

を塩として製造し；
（ｅ−１）触媒Ｅの存在下に、化合物Ｉ−５（ｂ）を環化および還元することで、Ｉ−６−１を介して化合物Ｉ−６：

【化22】

を製造を含む方法であって
ここで、Ｐ^１は、アシル（ＣＨ_３Ｃ（Ｏ）−）、ベンジル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンゾイル、カルボベンジルオキシ、３，４−ジメトキシベンジル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、４−ニトロベンゼンスルホニル、ｐ−メトキシベンジルカルボニルおよびｐ−トルエンスルホニルからなる群から選択され；
Ｘは、ＮａおよびＫから選択され；
Ｙは、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒおよびトリフレートから選択され；
Ｒは、Ｈ、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリイソプロピルシリルおよびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルからなる群に限定され；そして
Ｒ^Ｎは、Ｐ^１またはＨであり、そしてここで、
触媒Ｄ及び触媒Ｅは、請求項１に同じである。

【請求項4】

段階（ａ−１）において、
溶媒が、テトラヒドロフラン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ＣＨ_２Ｃｌ_２、アセトニトリル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、メチル−テトラヒドロフラン、ヘキサン、ヘプタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メチルシクロペンチルエーテル、トルエンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択され；
酸化剤が、ＮａＯＣｌ、ＮａＣｌＯ_２、ヨードベンゼンジアセテート、過酸化水素、ピリジン・三酸化硫黄／トリエチルアミン／ジメチルスルホキシドおよびモファット変種、クロロクロム酸ピリジニウム、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド、スワン酸化もしくはその変種、過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム／Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキサイドからなる群から選択され；
触媒がＴＥＭＰＯまたはＴＥＭＰＯ類縁体である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

段階（ａ−１）における保護基がｔ−ブチルオキシカルボニルである、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

段階（ａ−１）を、酢酸エチルまたは酢酸イソプロピルの存在下、３５℃から４５℃の温度で行う、請求項３に記載の方法。

【請求項7】

段階（ａ−１）において、化合物Ｉ−２は、亜硫酸水素付加物を介して製造することができる、請求項３に記載の方法。

【請求項8】

段階（ａ−２）におけるＫＲＥＤ酵素が、配列番号１で記載のアミノ酸配列またはその活性断片を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項9】

段階（ａ−２）が、補因子及び補基質を含む補因子再利用系のもとで反応され、ここで、補因子はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸からなる群から選択され、補基質は、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノールおよび２−オクタノールより選択される２級アルコールの群から選択される、請求項２に記載の方法。

【請求項10】

段階（ａ−２）における反応を、２−プロパノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソ−ブタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドおよびＮ−メチル−２−ピロリドンならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される溶媒中で行う、請求項２に記載の方法。

【請求項11】

段階（ａ−２）における反応を８より高いｐＨ範囲で行う、請求項２に記載の方法。

【請求項12】

段階（ａ−２）における反応を３０℃から５０℃の温度で行う、請求項２に記載の方法。

【請求項13】

段階（ｂ−２）における反応で使用される触媒が、触媒量のＣｕＩ、ＣｕＢｒまたはＣｕＣｌからなる群から選択される材料の存在下または非存在下で、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）、ＰｄＣｌ_２、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロライド、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタンクロロパラジウム、１，３−ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパンジクロロパラジウム（ＩＩ）、１,１′−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンジクロロパラジウム（ＩＩ）および酢酸パラジウム（ＩＩ）／トリフェニルホスフィンからなる群から選択される請求項２に記載の方法。

【請求項14】

段階（ｂ−２）における反応を、テトラヒドロフラン、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ＣＨ_２Ｃｌ_２、アセトニトリル、メチル−テトラヒドロフラン、メチルシクロペンチルエーテルおよびトルエンならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される溶媒の存在下に行う、請求項２に記載の方法。

【請求項15】

段階（ｂ−２）における反応生成物が、その固体ＨＣｌ塩として単離される請求項２に記載の方法。

【請求項16】

化合物Ｉ−５（ｂ）塩を、段階（ｃ−２）において、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ピリジン、ルチジン、Ｎ−メチルモルフィン、ｔ−ブトキシカリウム、ｔ−ブトキシナトリウム、ｔ−ブトキシリチウム、ＮａＨ、ナトリウムヘキサメチルジシラザン、リチウムヘキサメチルジシラザンおよびカリウムヘキサメチルジシラザンからなる群から選択される塩基と反応させて、分子内環化反応により化合物Ｉ−６−１を製造する請求項２に記載の方法。

【請求項17】

段階（ｃ−２）において、水素ガスおよび触媒の存在下に化合物Ｉ−６−１を化合物Ｉ−６に還元する請求項２に記載の方法。

【請求項18】

化合物Ｉ−５（ｂ）が化学構造：

【化23】

を有し、面間隔ｄでの下記の反射によりＸ線粉末回折によって特性決定される、化合物Ｉ−５（ｂ）の結晶性ＨＣｌ塩型。

【表1】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）バイオ触媒酵素を用いるβ−３作動薬および中間体の製造方法、ならびにバイオ触媒の使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

配列表、表またはコンピュータプログラムへの言及
配列表の写しが、作成日時２０１４年３月７日およびサイズ２．６８ｋｂのファイル名「２３１４６−ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」でＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットテキストファイルとして本願明細書と同時に提出されている。ＥＦＳ−Ｗｅｂによって提出された配列表は本明細書の一部であり、参照によって本明細書にその全体が組み込まれる。

【0003】

本願は、下記でより詳細に説明される式Ｉ−７のβ−３作動薬の効率的および経済的製造方法ならびにこれら作動薬の製造に使用可能な中間体化合物に関する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本願は、式Ｉ−７の化合物およびその中間体の多段階合成方法に関するものである。その多段階法では、ＫＲＥＤ酵素を用いる。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1】実施例１の化合物Ｉ−５（ｂ）の結晶性塩型の粉末Ｘ線回折パターンである。

【図2】実施例１の化合物Ｉ−７の遊離塩基無水Ｉ型の粉末Ｘ線回折パターンである。

【発明を実施するための形態】

【0006】

本明細書においては、化合物Ｉ−３からβ−３作動薬製造の重要な中間体である化合物Ｉ−６の製造方法を記載している。

【化1】

【0007】

第１の実施形態において、化合物Ｉ−３から化合物Ｉ−６への多段階反応は、次の段階：
（ａ−２）ＫＥＤ酵素の存在下に、化合物Ｉ−３：

【化2】

【0008】

を還元して化合物Ｉ−４：

【化3】

【0009】

を製造する段階；
（ｂ−２）触媒Ｄの存在下に、化合物Ｉ−４を化合物Ａ−１：

【化4】

【0010】

とカップリングさせて、化合物Ｉ−５（ａ）を製造し、次に、酸によってイン・ジツで脱保護することで、化合物Ｉ−５（ｂ）：

【化5】

【0011】

を塩として得る段階；
（ｃ−２）触媒Ｅの存在下に、化合物Ｉ−５（ｂ）を環化および還元して、Ｉ−６−１を介して化合物Ｉ−６を製造する段階：

【化6】

【0012】

を含み、
ここで、Ｐ^１は、Ａｃ、Ｂｎ、Ｂｏｃ、Ｂｚ、Ｃｂｚ、ＤＭＰＭ、ＦＭＯＣ、Ｎｓ、ＭｏｚおよびＴｓからなる群から選択され；そして
Ｙは、Ｃｌ、Ｉ、ＢｒおよびＯＴｆから選択され；そして
Ｒは、Ｈ、ＴＭＳ、ＴＥＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＩＰＳおよびＴＢＤＰＳからなる群から選択され；そして
Ｒ^Ｎは、Ｐ^１またはＨである。

【0013】

さらに、本明細書においては、多段階反応によって化合物Ｉ−３から化合物Ｉ−７を製造する方法について記載される。

【化7】

【0014】

第２の実施形態において、化合物Ｉ−３から化合物Ｉ−７への多段階反応は、次の段階：
（ａ−２）ＫＲＥＤ酵素の存在下に、化合物Ｉ−３：

【化8】

【0015】

を還元して、化合物Ｉ−４：

【化9】

【0016】

を製造する段階；
（ｂ−２）触媒Ｄの存在下に、化合物Ｉ−４を化合物Ａ−１：

【化10】

【0017】

とカップリングさせて化合物Ｉ−５（ａ）を製造し、次にイン・ジツで酸で脱保護して、化合物Ｉ−５（ｂ）：

【化11】

【0018】

を塩として製造する段階；
（ｃ−２）触媒Ｅの存在下に、化合物Ｉ−５（ｂ）を環化および還元して、Ｉ−６−１を介して化合物Ｉ−６：

【化12】

【0019】

を製造する段階；
（ｄ−２）カップリング剤および場合により塩基の存在下に、化合物Ｉ−６を化合物Ａ−２：

【化13】

【0020】

とカップリングさせて、化合物Ｉ−７：

【化14】

【0021】

を製造する段階を含み、
ここで、Ｐ^１は、Ａｃ、Ｂｎ、Ｂｏｃ、Ｂｚ、Ｃｂｚ、ＤＭＰＭ、ＦＭＯＣ、Ｎｓ、ＭｏｚおよびＴｓからなる群から選択され；そして
Ｘは、Ｎａ、ＬｉおよびＫから選択され；
Ｙは、Ｃｌ、Ｉ、ＢｒおよびＯＴｆから選択され；そして
Ｒは、Ｈ、ＴＭＳ、ＴＥＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＩＰＳおよびＴＢＤＰＳからなる群から選択され；そして
Ｒ^Ｎは、Ｐ^１またはＨである。

【0022】

さらに本明細書において、化合物Ｉ−１からβ−３作動薬を製造するための主要中間体である化合物Ｉ−６を製造する方法についても記載される。

【化15】

【0023】

第３の実施形態において、化合物Ｉ−１から化合物Ｉ−６への多段階反応は、次の段階：
（ａ−１）溶媒、酸化剤および触媒Ａの存在下に、
化合物Ｉ−１：

【化16】

【0024】

を反応させて、イン・ジツでアルデヒドを形成し、次にＸ−ＣＮおよびアンモニウム塩および保護試薬、Ｐ^１_２ＯまたはΡ^１Ｃｌ存在下で縮合することで、化合物Ｉ−２：

【化17】

【0025】

を製造する段階；
（ｂ−１）フェニルグリニャール試薬の存在下に、化合物Ｉ−２を反応させて、化合物Ｉ−３：

【化18】

【0026】

を製造する段階；
（ｃ−１）ＫＲＥＤ酵素の存在下に、化合物Ｉ−３を還元して、化合物Ｉ−４：

【化19】

【0027】

を製造する段階；
（ｄ−１）触媒Ｄの存在下に、化合物Ｉ−４を化合物Ａ−１：

【化20】

【0028】

とカップリングさせて、化合物Ｉ−５（ａ）を製造し、次にイン・ジツで酸で脱保護して、化合物Ｉ−５（ｂ）：

【化21】

【0029】

を塩として製造する段階；
（ｅ−１）触媒Ｅの存在下に、化合物Ｉ−５（ｂ）を環化および還元することで、Ｉ−６−１を介して化合物Ｉ−６：

【化22】

【0030】

を製造する段階を含み、
ここで、Ｐ^１は、Ａｃ、Ｂｎ、Ｂｏｃ、Ｂｚ、Ｃｂｚ、ＤＭＰＭ、ＦＭＯＣ、Ｎｓ、ＭｏｚおよびＴｓからなる群から選択され；そして
Ｘは、Ｎａ、ＬｉおよびＫから選択され；
Ｙは、Ｃｌ、Ｉ、ＢｒおよびＯＴｆから選択され；そして
Ｒは、Ｈ、ＴＭＳ、ＴＥＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＩＰＳおよびＴＢＤＰＳからなる群から選択され；そして
Ｒ^Ｎは、Ｐ^１またはＨである。

【0031】

一実施形態において、上記第１の実施形態に記載のように、段階（ａ−１）における溶媒は、ＴＨＦ、ＭＴＢＥ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ＭｅＣＮ、ＥｔＯＡｃ、ｉ−ＰｒＯＡｃ、Ｍｅ−ＴＨＦ、ヘキサン、ヘプタン、ＤＭＡｃ、ＤＭＦ、メチルシクロペンチルエーテル、トルエンおよび前記溶媒の２以上を含む混合物からなる群から選択される。ある好ましい実施形態において、段階（ａ−１）で使用される溶媒はＭｅＣＮである。別の実施形態において、酸化剤はＮａＯＣｌ、ＮａＣｌＯ_２、ＰｈＩ（ＯＡｃ）_２、過酸化水素、ピリジン・三酸化硫黄／Ｅｔ_３Ｎ／ＤＭＳＯおよび各種モファット変種（Ｋｅｔｏｎｅｓ： Ｄｉａｌｋｙｌ Ｋｅｔｏｎｅｓ． Ｐａｒｋｅｓ， Ｋｅｖｉｎ Ｅ． Ｂ． ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｓｔｅｗａｒｔ Ｋ． ｉｎ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ３， １９９５, Ｐａｇｅｓ １１１−２０４、編者：Ｋａｔｒｉｚｋｙ, Ａｌａｎ Ｒ．； Ｍｅｔｈ−Ｃｏｈｎ, Ｏｔｔｏ； Ｒｅｅｓ, Ｃｈａｒｌｅｓ Ｗａｙｎｅ, Ｅｌｓｅｖｉｅｒ, Ｏｘｆｏｒｄ, ＵＫ参照）、ＰＣＣ、ＤＣＣ、スワン酸化（塩化オキサリル−ＤＭＳＯ−トリアルキルアミン；Ｋｅｔｏｎｅｓ： Ｄｉａｌｋｙｌ Ｋｅｔｏｎｅｓ． Ｐａｒｋｅｓ， Ｋｅｖｉｎ Ｅ． Ｂ． ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｓｔｅｗａｒｔ Ｋ． ｉｎ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ３， １９９５, Ｐａｇｅｓ １１１−２０４、編者：Ｋａｔｒｉｚｋｙ, Ａｌａｎ Ｒ．； Ｍｅｔｈ−Ｃｏｈｎ, Ｏｔｔｏ； Ｒｅｅｓ, Ｃｈａｒｌｅｓ Ｗａｙｎｅ, Ｅｌｓｅｖｉｅｒ, Ｏｘｆｏｒｄ, ＵＫ参照）またはその変種、ＴＰＡＰ／ＮＭＯからなる群から選択される。

【0032】

別の実施形態では、上記第１の実施形態に記載の段階(ａ−１）の酸化は、ＴＥＭＰＯ／漂白剤／ＮａＢｒ、ＴＥＭＰＯ／トリクロロイソシアヌル酸、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ／ＴＢＡＣｌ、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ（これらに限定されるものではない）を含むＴＥＭＰＯおよびその変形形態を含む、触媒Ａを用いて行う。別の実施形態では、触媒Ａは、臭化物塩の存在下または非存在下でのＴＥＭＰＯまたはＴＥＭＰＯ類縁体である。別の実施形態では、好ましいＴｅｍｐｏ酸化組み合わせは、ＴＥＭＰＯ−漂白剤−臭化物塩およびＴＥＭＰＯ−ＰｈＩ（ＯＡｃ）_２である。別の実施形態では、ＴＥＭＰＯ−ＰｈＩ（ＯＡｃ）_２と、ＨＯＡｃおよび水などの別の添加剤との組み合わせを用いる。別の実施形態では、保護基はＢｏｃである。さらに別の実施形態では、（Ｂｏｃ）_２ＯによるＢｏｃ保護を、ＥｔＯＡｃまたはｉ−ＰｒＯＡｃを用い、約３５から約４５℃の温度で行う。

【0033】

あるいは、化合物Ｉ−２は、亜硫酸水素塩付加物を介して製造することができる。

【化23】

【0034】

一実施形態において、上記第１の実施形態に記載の段階（ｂ−１）における反応は、約−２０℃から約４０℃の温度で行う。別の実施形態において、上記第１の実施形態に記載の段階（ｂ−１）における反応は、約−１５℃から約５℃の温度で行う。

【0035】

別の実施形態において、上記第１の実施形態に記載の段階（ｂ−１）における反応は、ＴＨＦ、ＭＴＢＥ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、Ｍｅ−ＴＨＦ、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロペンチルエーテル、トルエンおよび前記溶媒のうちの２以上を含む混合物からなる群から選択される溶媒の存在下に行う。

【0036】

別の実施形態において、上記第１の実施形態に記載の段階（ｂ−１）におけるグリニャール試薬は、ＰｈＭｇＢｒまたはＰｈＭｇＣｌである。

【0037】

一実施形態において、上記第１、第２または第３の実施形態に記載の段階（ｃ−１またはａ２）におけるＫＲＥＤ酵素存在下での動的速度論的還元は、配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその活性断片を含むポリペプチドである。別の実施形態において、上記第１、第２または第３の実施形態に記載の段階（ｃ−１またはａ２）における反応は、約ｐＨ８より高いｐＨ範囲で行う。さらに別の実施形態において、上記第１、第２または第３の実施形態に記載の段階（ｃ−１またはａ２）における反応は、約１０±０．５のｐＨで行う。別の実施形態において、上記第１、第２または第３の実施形態に記載の段階（ｃ−１またはａ２）における反応は、約３０℃から約５０℃の温度範囲で行う。さらに別の実施形態において、上記第１、第２または第３の実施形態に記載の段階（ｃ−１またはａ２）における反応は、約４３℃から約４７℃の温度範囲で行う。

【0038】

上記第１、第２または第３の実施形態に記載の段階（ｄ−１またはｂ−２）で行われるソノガシラカップリング反応は、末端アルキンとアリールもしくはビニルハライドとのカップリングであり、パラジウム触媒、銅（Ｉ）共触媒またはアミン塩基を用いて行う（Ｓｏｎｏｇｏｓｈｉｒａ, Ｋ． Ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏパラジウム Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｎｅｇｉｓｈｉ, Ｅ．, Ｅｄ．； Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, ２００２；ｐｐ４９３−５２９参照）。一実施形態において、段階（ｄ−１またはｂ−２）におけるソノガシラ反応で使用される触媒Ｄは、ＣｕＩ、ＣｕＢｒおよびＣｕＣｌから選択される触媒量の材料の存在下または非存在下、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４、ＰｄＣｌ_２、（ＰＰｈ_３）_２ＰｄＣｌ_２、Ｐｄ（ｄｐｐｅ）Ｃｌ、Ｐｄ（ｄｐｐｐ）Ｃｌ_２、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２およびＰｄ（ＯＡｃ）_２／Ｐｈ_３Ｐまたは他の配位子からなる群から選択される。別の実施形態において、触媒組み合わせは、（ＰＰｈ_３）_２ＰｄＣｌ_２およびＣｕＩである。別の実施形態において、上記第１、第２または第３の実施形態に記載の段階（ｄ−１またはｂ−２）における反応は、ＴＨＦ、ＩＰＡ、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、ｎ−ＰｒＯＨ、ＮＭＰ、ＤＭＦ、ＤＭＡｃ、ＭＴＢＥ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ＭｅＣＮ、Ｍｅ−ＴＨＦ、メチルシクロペンチルエーテルおよびトルエン、および前記溶媒のうちの２以上を含む混合物、から選択される溶媒の存在下に行う。別の実施形態において、上記第１、第２もしくは第３の実施形態に記載の段階（ｄ−１またはｂ−２）における反応は、ＴＨＦおよびＩＰＡの混合物から構成される溶媒の存在下に行う。一実施形態において、カーバメート保護基の脱離のために上記第１、第２もしくは第３の実施形態に記載の段階（ｄ−１またはｂ−２）における反応で使用される酸は、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＴＦＡ、ＭｅＳＯ_３Ｈ、Ｈ_２ＳＯ_４、ｐ−トルエンスルホン酸、フェニルスルホン酸、カンファースルホン酸、ブロモ−カンファースルホン酸、および、ＲＳＯ_３Ｈ（ＲはＣ_１−６アルキル、アリールまたは置換されたアリールである。）などの他のスルホン酸から選択される。別の実施形態において、上記第１、第２もしくは第３の実施形態に記載の段階（ｄ−１またはｂ−２）における反応で使用される塩は、ＨＣｌである。さらに別の実施形態において、上記第１、第２もしくは第３の実施形態に記載の段階（ｄ−１またはｂ−２）における反応生成物は、固体ＨＣｌ塩として単離される。

【0039】

一実施形態において、上記第１、第２もしくは第３の実施形態に記載の段階（ｅ−１またはｃ−２）において、化合物Ｉ−５（ｂ）酸性塩を、Ｅｔ_３Ｎ、ｉ−Ｐｒ_２ＮＥｔ、ｉ−Ｐｒ_２ＮＨ、ピリジン、ルチジン、Ｎ−メチルモルフィン、ｔ−ＢｕＯＫ、ｔ−ＢｕＯＮａ、ｔ−ＢｕＯＬｉ、ＮａＨ、ＮａＨＭＤＳ、ＬｉＨＭＤＳおよびＫＨＭＤＳ（これらに限定されるものではない）から選択される塩基と反応させて、分子内環化反応により化合物Ｉ−６−１を製造する。

【化24】

【0040】

一実施形態において、塩基は、Ｅｔ_３Ｎ、ｉ−Ｐｒ_２ＮＥｔまたはｉ−Ｐｒ_２ＮＨである。別の実施形態において、塩基はｉ−Ｐｒ_２ＮＥｔである。

【0041】

一実施形態において、化合物Ｉ−６−１を、触媒の存在下に還元して化合物Ｉ−６とする。

【化25】

【0042】

Ｉ−６−１からＩ−６への変換の反応条件は、シス選択的水素化法を用いて制御することができる。一実施形態において、上記第１、第２もしくは第３の実施形態に記載の段階（ｅ−１またはｃ−２）のシス選択的水素化は、Ｐｔ／アルミナ、Ｐｄ／アルミナ、Ｒｈ／アルミナ、Ｐｄ／Ｃ、Ｐｄ（ＯＨ）_２−Ｃ、Ｐｔ／アルミナ−Ｖ／炭素またはバナジウム酸塩、ラネーＮｉ、Ｒｈ／Ｃ、Ｒｈ／Ａｌ、Ｐｔ／Ｃ、Ｒｕ／ＣおよびＰｔＯ_２からなる群から選択される触媒Ｅの存在下に行う。別の実施形態において、触媒ＥはＰｔ／アルミナである。

【0043】

別の実施形態において、段階（ｅ−１またはｃ−２）におけるＩ−６−１からＩ−６へのシス選択的水素化は、水酸基をイン・ジツで保護しジアステレオマー選択性を高めるヒドロキシル保護試薬の存在下に行う。保護試薬は、ＴＭＳＣｌ、ＨＭＤＳ、ＴＥＳＣｌ、ＴＩＰＳＣｌおよびＴＢＤＭＳＣｌから選択することができる。別の実施形態において、保護試薬はＴＭＳＣｌである。

【0044】

一実施形態において、上記第１、第２もしくは第３の実施形態に記載の段階（ｅ−１またはｃ−２）の水素化反応は、約１０℃から約７０℃で行う。別の実施形態において、上記第１、第２もしくは第３の実施形態に記載の段階（ｅ−１またはｃ−２）の水素化反応は、約２０℃から約５０℃で行う。さらに別の実施形態において、上記第１、第２もしくは第３の実施形態に記載の段階（ｅ−１またはｃ−２）の水素化反応は、約２０℃で次に約５０℃で段階的に行う。

【0045】

別の実施形態において、上記第１、第２もしくは第３の実施形態に記載の段階（ｅ−１またはｃ−２）の還元反応は、水素ガスの存在下に行う。別の実施形態において、水素ガスの圧力は、約１５から約４００ｐｓｉ（約０．１０から約２．７６ＭＰａ）の範囲である。さらに別の実施形態において、水素ガスの圧力は約５０から約１００ｐｓｉ（約０．３４から約０．６９ＭＰａ）の範囲である。

【0046】

Ｉ−６とＡ−２の間の反応は、カップリング試薬の存在下に行うことができる。好適なカップリング試薬には、ＣＤＩ、ＤＣＣ、ＥＤＣ、ＥＤＣメチオジド、Ｔ３Ｐ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよび混合無水物を含み、これらに限定されるものではない。別の実施形態において、カップリング剤は、ＤＣＣ、ＥＤＣまたはＥＤＣメチオジドである。さらに別の実施形態において、カップリング試薬はＥＤＣである。

【0047】

Ｉ−６とＡ−２との間の反応は、溶媒の存在下に行うことができ、その際に基質は、ＨＣｌ、ＭｅＳＯ_３Ｈ、Ｈ_２ＳＯ_４などの酸で処理して、２級ピロリジンアミンを選択的に保護する。好適な溶媒には、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、ｎ−ＰｒＯＨ、ＭｅＣＮ、ＤＭＦ、ＤＭＡｃ、ＮＭＰ、ＴＨＦ、ＥｔＯＡｃ、ＩＰＡｃまたはトルエンなどの水系および非水系の両方の溶媒を含み、これらに限定されるものではない。

【0048】

Ｉ−６とＡ−２との間の反応に、促進剤を用いることができる。好適な促進剤には、ＨＯＢＴおよびＨＯＰＯを含み、これらに限定されるものではない。

【0049】

Ｉ−６とＡ−２との間の反応についての好適なｐＨ値は、約２．５から約５．０、またはより具体的には約３．０から約４．０、またはさらにより具体的には約３．０から約３．５であることができる。そのｐＨは、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＩ、ＨＮＯ_３、Ｈ_２ＳＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＴＦＡおよびＭｅＳＯ_３Ｈなどの酸を用いて所望の範囲に調節することができる。一実施形態において、ｐＨは約３．０から約３．７である。別の実施形態において、ｐＨは約３．３から約３．５である。

【0050】

一実施形態において、上記第２または第３の実施形態に記載の段階（ｄ−２）における反応は、塩基の存在下に行う。さらに別の実施形態において、上記第２または第３の実施形態に記載の段階（ｄ−２）における反応は、ピリジンまたはピリジン塩の存在下に行う。ピリジン塩には、相当するＨＣｌ塩、Ｈ_２ＳＯ_４塩、Ｈ_３ＰＯ_４塩、ＨＢｒ塩、ＨＩ塩、ＨＮＯ_３塩またはＭｅＳＯ_３Ｈ塩を含み、これらに限定されるものではない。

【0051】

上記で挙げた第１、第２または第３の実施形態において、ＫＲＥＤ酵素には、配列番号１に記載のポリペプチド配列またはその活性断片を含む。

【0052】

上記で挙げた第１、第２または第３の実施形態において、ＫＲＥＤ酵素に加えて、補因子再利用系も存在する。好適な補因子再利用系には、配列番号１のポリペプチドのようなＫＲＥＤ酵素およびグルコースデヒドロゲナーゼ酵素を含み、これらに限定されるものではない。

【0053】

上記で挙げた第１、第２または第３の実施形態において、配列番号１に記載のポリペプチド配列を含むＫＲＥＤ酵素またはその活性断片および補因子再利用系が、Ｉ−３からＩ−４への還元において存在する。

【0054】

上記で挙げた第１、第２または第３の実施形態において、ＫＲＥＤ酵素に加えて、水素化物を供与することができる補因子分子も存在する。一実施形態において、補因子はＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨからなる群から選択される。

【0055】

上記で挙げた第１、第２または第３の実施形態において、ＫＲＥＤ酵素に加えて、補因子分子の再利用のために水素化物を提供することができる補基質分子も存在する。一実施形態において、補基質は、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノールおよび２−オクタノールを含む２級アルコールの群から選択され、これらに限定されるものではない。

【0056】

上記で挙げた第１、第２または第３の実施形態において、Ｉ−３からＩ−４への酵素的還元は、溶媒中で行う。好適な溶媒は、２−プロパノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソ−ブタノール、２−ペンタノール、２−ヘキサノール、２−ヘプタノール、２−オクタノール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡｃおよびＮＭＰならびにそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。一実施形態において、溶媒は２−プロパノールである。

【0057】

上記で挙げた第１、第２または第３の実施形態において、Ｉ−３からＩ−４への動的速度論的分割（ＤＫＲ）還元に好適な温度は、約０℃から約６０℃、またはより具体的には約３０℃から約５０℃、またはさらにより具体的には約４３℃から約４７℃の範囲である。一実施形態において、温度は約４５℃である。

【0058】

上記で挙げた第１、第２または第３の実施形態において、ＫＲＥＤ酵素を補因子再利用系と組み合わせて、ＮＡＤＰＨ補因子を用いて化合物Ｉ−３を還元して、化合物Ｉ−４を得る。Ｉ−３からＩ−４へのＫＲＥＤ触媒還元に好適な反応条件を、下記および実施例に提供する。

【0059】

上記で挙げた第１、第２または第３の実施形態において、ＫＲＥＤ酵素またはその活性断片は、固体支持体上に固定化することができる。一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼ活性を有するＫＲＥＤ酵素またはその活性断片を固体支持体に固定化して、配列番号１の基準ポリペプチドまたはその活性断片と比較して改善された活性、立体選択性および／または改善された他の特性が保持されるようにすることができる。そのような実施形態において、固定化ポリペプチドは、化合物Ｉ−３の基質またはその構造的類縁体の化合物Ｉ−４の生成物または相当する構造的類縁体（例えば、本明細書に記載の図式１の方法で示したもの）へのバイオ触媒変換を促進することができ、その反応が完了した後、容易に保持され（例えば、ポリペプチドが固定化された保持ビーズによって）、そしてその後の反応で再使用または再利用される。そのような固定化酵素法によって、さらなる効率およびコスト削減が可能となる。従って、本開示のＫＲＥＤ酵素またはその活性断片のいずれの使用方法も、固体支持体に結合または固定化された同じＫＲＥＤ酵素またはその活性断片を用いて行うことが可能であることがさらに意図される。

【0060】

酵素固定化方法は当業界で公知である。ＫＲＥＤ酵素は、非共有結合的にまたは共有結合的に結合することができる。酵素の固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）の結合および固定化の各種方法は当業界で公知であり、例えばＹｉ ｅｔ ａｌ．，″Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ω−ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７ ｏｎ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｂｅａｄｓ，″ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２（５）： ８９５−８９８ （Ｍａｙ ２００７）； Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， ″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ （Ｓ）−ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｏｒ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，″ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７６（４）：８４３−８５１ （Ｓｅｐｔ． ２００７）； Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，″Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ω−ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｏｌ−ｇｅｌ／ｃｅｌｉｔｅ ｍａｔｒｉｘ，″ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ， ６３： ３９−４４ （Ａｐｒ． ２０１０）； Ｔｒｕｐｐｏ ｅｔ ａｌ．，″Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＣＡＬ−Ｂ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｋｅｙ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｏ Ｏｄａｎａｃａｔｉｂ， ″Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ： ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ； Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｇ． Ｔ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （２００８）； Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ， ″Ｅｐｏｘｙ ｓｅｐａｂｅａｄｓ： ａ ｎｏｖｅｌ ｅｐｏｘｙ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｖｉａ ｖｅｒｙ ｉｎｔｅｎｓｅ ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ， ″Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ １８（３）：６２９−３４ （２００２）； ａｎｄ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃ． Ｍ． Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ （２００４）（それぞれの開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる。）に記載されている。

【0061】

本開示のＫＲＥＤ酵素を固定化する上で有用な固体支持体には、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を揺するポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢコポリマーまたはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂を含み、これらに限定されるものではない。本開示のＫＲＥＤ酵素を固定化するのに有用な固体支持体の例には、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）ＣおよびＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、例えば次の各種ＳＥＰＡＢＥＡＤ（登録商標）：ＨＰ２ＭＧ；ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ；ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含み、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、固体支持体は、カーボネート含有ビーズまたは樹脂であることができる。

【0062】

オキシドレダクターゼの種類に属するＫＲＥＤ酵素は、相当するラセミ体アルデヒドおよびケトン基質の立体特異的還元による相当するプロ立体異性体ケトン基質からの光学活性アルコールの合成に有用である。単離ケトレダクターゼは、ニコチンアミド補因子の存在を必要とする。水素および２個の電子が、還元されたニコチンアミド補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）から基質のカルボニル基に移動して、キラルアルコールの還元を行う。

【0063】

上記で挙げた第１、第２または第３の実施形態において、化合物Ｉ−７は、結晶性無水遊離塩基の形態で得られる。上記で挙げた第１、第２または第３の実施形態において、化合物Ｉ−７は、結晶性遊離塩基半水和物の形態で得られる。

【0064】

本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、指定数の炭素原子を有する分岐および直鎖の両方の飽和脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、Ｃ_１−６アルキルには、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、ｎ−プロピル（Ｐｒ）、ｎ−ブチル（Ｂｕ）、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ならびにイソプロピル（ｉ−Ｐｒ）、イソブチル（ｉ−Ｂｕ）、ｓｅｃ−ブチル（ｓ−Ｂｕ）、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルおよびイソヘキシルなどのそれらの異性体を含み、これらに限定されるものではない。

【0065】

本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、芳香族炭素環を指す。例えば、アリールには、フェニルおよびナフタリルを含み、これらに限定されるものではない。

【0066】

本願を通じて、下記の用語は、別段の断りがない限り、次に示した意味を有する。

【0067】

用語：意味
Ａｃ：アシル（ＣＨ_３Ｃ（Ｏ）−）
Ｂｎ：ベンジル
ＢＯＣ（Ｂｏｃ）：ｔ−ブチルオキシカルボニル
（Ｂｏｃ）_２Ｏ：ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート
ｔ−ＢｕＯＫ：カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド
ｔ−ＢｕＯＬｉ：リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド
ｔ−ＢｕＯＮａ：ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｃｂｚ：カルボベンジルオキシ
ＣＤＩ：１,１′カルボニルジイミダゾール
ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＫＲ：動的速度論的分割
ＤＭＡｃ：Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＰＭ：３，４−ジメトキシベンジル
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＡＢＣＯ：１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン
ｄｒ（Ｄｒ）：ジアステレオマー比
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ｅｅ：エナンチオ過剰
Ｅｔ：エチル
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＦＭＯＣ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート）
ＨＭＤＳ：ヘキサメチルジシラザン
ＨＯＢＴ：１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール
ＨＯＰＯ：２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキサイド
Ｉｍｍｏｂｅａｄ（商標）１５０Ａ：マクロ多孔性アクリルポリマーの非極性酵素キャリアビーズ
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール
ＫＨＭＤＳ：カリウムビス（トリメチルシリル）アミド
ＫＲＥＤ：ケトレダクターゼ
ＬＣ／ＭＳまたはＬＣ−ＭＡＳＳ：液体クロマトグラフィー質量スペクトラム
ＬＣＡＰ：液体クロマトグラフィー面積パーセント
Ｍｅ：メチル
ＭｏｚまたはＭｅＯＺ：ｐ−メトキシベンジルカルボニル
ＭＴＢＥ：メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル
ＮａＨＭＤＳ：ナトリウムヘキサメチルジシラジド
ＮＡＤＰ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ナトリウム塩
ＮＭＰ：Ｎ−メチル−２−ピロリドン
Ｎｓ：４−ニトロベンゼンスルホニル
ＯＴｆ：トリフレート
ＰＣＣ：クロロクロム酸ピリジニウム
５％Ｐｄ／Ａｌ_２Ｏ_３：５重量パーセント酸化アルミニウム担持パラジウム
５％Ｐｄ／Ｃ：５重量パーセント活性炭担持パラジウム
１０％Ｐｄ／Ｃ：１０重量パーセント活性炭担持パラジウム
ＰｄＣｌ_２：塩化パラジウム（ＩＩ）
（ＰＰｈ_３）_２ＰｄＣｌ_２：ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロライド
Ｐｄ（ｄｐｐｅ）Ｃｌ_２：１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタンクロロパラジウム
Ｐｄ（ｄｐｐｐ）Ｃｌ_２：１，３−ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパンジクロロパラジウム（ＩＩ）
Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２：１,１′−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンジクロロパラジウム（ＩＩ）
ＰｈＩ（ＯＡｃ）_２：ヨードベンゼンジアセテート
ＰｈＭｇＢｒ：フェニルマグネシウムブロマイド
（ＰＰｈ_３）_２ＰｄＣｌ_２：トリフェニルホスフェート・パラジウムクロライド
５％Ｐｔ／Ａｌ_２Ｏ_３：５重量パーセント酸化アルミニウム担持白金
Ｐｈ：フェニル
ｉ−ＰｒＯＡｃ：酢酸イソプロピル
ＰｒＯＨ：プロピルアルコール
ｉ−Ｐｒ_２ＮＥｔ：ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）
ｉ−Ｐｒ_２ＮＨ：ジイソプロピルアミン
５％Ｒｈ／Ａｌ_２Ｏ_３：５重量パーセント酸化アルミニウム担持ロジウム
Ｔ３Ｐ：プロパンホスホン酸無水物
ＴＢＡＣｌ：塩化テトラブチルアンモニウム
ＴＢＤＭＳ：ｔ−ブチルジメチルシリル
ＴＢＤＰＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル
ＴＢＤＭＳＣｌ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド
ＴＥＡまたはΕｔ_３Ｎ：トリエチルアミン
ＴＥＭＰＯ：１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン
ＴＥＳ：トリエチルシリル
ＴＥＳＣｌ：トリエチルクロロシラン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＩＰＳ：トリイソプロピルシリル
ＴＩＰＳＣｌ：トリイソプロピルクロロシラン
ＴＭＳ：トリメチルシリル
ＴＭＳＣｌ：トリメチルクロロシラン
ＴＰＡＰ／ＮＭＯ：過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム／Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキサイド
Ｔｓ：ｐ−トルエンスルホニル
ＸＲＰＤ：Ｘ線粉末回折。

【0068】

下記の反応図式は、本明細書に記載の化合物の合成で使用される合成段階、試薬および条件を示すものである。本発明の主題である化合物Ｉ−７の合成は、１以上の同様の経路によって行うことができる。

【0069】

実施例１
化合物Ｉ−６およびＩ−７の製造
化合物Ｉ−６およびＩ−７は、図式１で下記に記載のように化合物Ｉ−１から製造することができる。

【0070】

注：括弧［ ］に入った化合物は、単離されていない中間体を指す。

【化26】

【0071】

図式１において、４−ペンチン−１−オール（Ｉ−１）から出発して、ＴＥＭＰＯ−ＰｈＩ（ＯＡｃ）_２酸化とそれに続くストレッカー反応（Ｎｉｔｒｉｌｅｓ： Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｌｉｐｈａｔｉｃ Ｎｉｔｒｉｌｅｓ． Ｎｏｒｔｈ, Ｍｉｃｈａｅｌ, Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ 有機 Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ, Ｖｏｌｕｍｅ ３, １９９５, ｐｐ．６１１−６４０、編者：Ｋａｔｒｉｚｋｙ, Ａｌａｎ Ｒ．； Ｍｅｔｈ−Ｃｏｈｎ, Ｏｔｔｏ； Ｒｅｅｓ, Ｃｈａｒｌｅｓ Ｗａｙｎｅ, Ｅｌｓｅｖｉｅｒ, Ｏｘｆｏｒｄ, ＵＫ参照）、およびイン・ジツでのＢｏｃ保護を介して、いずれの中間体も単離せずにＩ−２を製造した。化合物Ｉ−２は、固体として単離することができた。Ｉ−２をフェニルグリニャールで処理することで、ラセミ体ケトンＩ−３を得て、それを次に、酵素的（動的速度論的分割）ＤＫＲ還元条件下に、二つの立体中心が１段階で作られるようにして、光学的に純粋なアルコールＩ−４に選択的に変換した。次に、ソノガシラ反応とそれに続く脱保護を介してＩ−５を製造し、結晶性ＨＣｌ塩として単離した。温ＤＭＡｃ−ＴＨＦ中で、Ｉ−５ ＨＣｌ塩のヒューニッヒ塩基（ジイソプロピルエチルアミン；ケトン類： α，β−不飽和ケトン類． Ｅｂｅｎｅｚｅｒ、Ｗａｒｒｅｎ Ｊ． ａｎｄ Ｗｉｇｈｔ, Ｐａｕｌ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ, Ｖｏｌｕｍｅ ３, １９９５, ｐｐ．２０５−２７６、編者：Ｋａｔｒｉｚｋｙ, Ａｌａｎ Ｒ．； Ｍｅｔｈ−Ｃｏｈｎ, Ｏｔｔｏ； Ｒｅｅｓ, Ｃｈａｒｌｅｓ Ｗａｙｎｅ, Ｅｌｓｅｖｉｅｒ, Ｏｘｆｏｒｄ, ＵＫ参照）による処理によって、環化中間体Ｉ−６−１を得て、それをさらにＴＭＳＣｌで処理して、イン・ジツでＯＨを保護した。そうして、次にワンポット立体選択的水素化によって、所望のシス異性体を高収率で得た。最後に、Ｉ−６とピリミジノン酸Ａ−２のナトリウム塩とのＥＤＣカップリングによって、Ｉ−７の製造を完了した。詳細な実験条件を下記で説明する。

【0072】

段階１．化合物Ｉ−１からの化合物Ｉ−２の製造

【化27】

【0073】

オーバーヘッド撹拌機を取り付けた２５０ｍＬ三頸丸底フラスコに、４−ペンチン−１−オール（１−１）（１０ｇ、０．１１９ｍｏｌ）、アセトニトリル（１００ｍＬ）、水（０．５ｍＬ）、酢酸（１．０ｍＬ）およびＴＥＭＰＯ（０．９２ｇ、５．８ｍｍｏｌ）を入れた。冷水浴で内部温度を２０から２５℃に維持しながら、ヨードベンゼンジアセテート（３９．４ｇ、０．１２４ｍｏｌ）を、２．５時間かけて少量ずつ加えた。反応を室温で３．５時間熟成させた。その溶液を、次のストレッカー反応で直接用いた。

【0074】

オーバーヘッド撹拌機を取り付けた５００ｍＬ三頸丸底フラスコに、水（４０ｍＬ）、水酸化アンモニウム（２８重量％、４０ｍＬ）、酢酸アンモニウム（１１．４５ｇ、０．１４９ｍｏｌ）およびシアン化カリウム（９．６８ｇ、０．１４９ｍｏｌ）を入れた。撹拌して固体を溶解した後、内部温度を＜４０℃に維持しながら、上記の酸化からの粗アルデヒド溶液を滴下した。反応液を４５℃で７から１０時間撹拌した。

【0075】

内部温度を＜２５℃に維持しながら、アセトニトリルを減圧下に除去した。ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）を加えた。有機層を分離した。

【0076】

段階２．化合物Ｉ−２の結晶化
上記の粗有機溶液に、（ＢＯＣ）_２Ｏ（２６．０ｇ、０．１１９ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を３５から４０℃に徐々に昇温させ、３５から４０℃でさらに１４時間熟成させた。そのバッチを環境温度に冷却し、７．５重量％ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）を加えた。内部温度を３５から４５℃に維持しながら、分離された有機層について、減圧下に最終体積約３００ｍＬにヘプタンで溶媒切り換えを行った。得られたスラリーを２０℃で２時間熟成させてから濾過した。湿ったケーキをヘプタン（１００ｍＬ）で洗浄し、４０℃で真空乾燥機乾燥して、生成物化合物Ｉ−２ １８．３ｇを得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ５．０９（ｓ、ｂｒ、１Ｈ）、４．７４（ｓ、ｂｒ、１Ｈ）、２．４３（ｍ、２Ｈ）、２．０８（ｔ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．０４（ｍ、２Ｈ）、１．４７（ｓ、９Ｈ）。

【0077】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１５４．４、１１８．５、８１．４、７０．９、４１．８、３２．１、２８．４、１５．１。

【0078】

化合物Ｉ−２についての別途結晶化手順
分離された有機層を減圧下にて約５０ｍＬに濃縮し、それを次に、生成物（１２５ｍｇ）のシードを加えたヘプタン（３７５ｍＬ）のスラリーに、１５から２５℃で数時間かけて加えた。次に、そのバッチについて、内部温度を３０℃以下に維持しながら、減圧下に最終体積２５０ｍＬにヘプタンで溶媒切り換えした。得られたスラリーを２０℃で２時間熟成させてから、濾過した。湿ったケーキをヘプタン（１００ｍＬ）で洗浄し、４０℃で真空乾燥機乾燥して、生成物化合物Ｉ−２ １８．３ｇを得た。

【0079】

段階３．化合物Ｉ−２からの化合物Ｉ−３の製造

【化28】

【0080】

ＰｈＭｇＢｒの溶液（１モル濃度、「Ｍ」、ＴＨＦ中、１０６ｍＬ、０．１０６ｍｏｌ）に、−１０℃で、ＢｏｃアミノニトリルＩ−２（１０ｇ、０．０４８ｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）中溶液を２から３時間かけて滴下した。反応スラリーを０℃でさらに４時間熟成させた。反応混合物を、内部温度を２０℃以下に維持しながら、１０重量％クエン酸水溶液（１３５ｍＬ）に、−５℃から０℃で０．５から１時間かけて加えた。反応停止した二層溶液を環境温度で１時間撹拌し、層を分離した。有機層を１０％ブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層について共沸的に最終体積約６５ｍＬにイソプロパノールで溶媒交換した。その溶液を３５℃に加熱して、水（約２５ｍＬ）を加えた。バッチにシードを入れた。３５℃で３０分間熟成した後、水（６５ｍＬ）を１時間かけて滴下した。スラリーを３５℃でさらに３０分間熟成させ、環境温度に冷却した。バッチを数時間撹拌してから、濾過した。湿ったケーキを３０％イソプロパノール／水（４０ｍＬ）で洗浄した。窒素気流を用いる５０℃での真空乾燥機乾燥によって、化合物Ｉ−３を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ８．０２（ｍ、２Ｈ）、７．６１（ｍ、１Ｈ）、７．５０（ｍ、２Ｈ）、５．４７（ｍ、１Ｈ）、５．４２（ｍ、１Ｈ）、２．３７（ｍ、１Ｈ）、２．２７（ｍ、１Ｈ）、２．１５（ｍ、１Ｈ）、２．０１（ｔ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、１．７５（ｍ、１Ｈ）、１．４６（ｓ、９Ｈ）。

【0081】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１９８．９、１５５．８、１３４．６、１３４．１、１２９．１、１２９．０、８３．３、８０．２、６９．６、５４．５、３２．９、２８．６、１５．２。

【0082】

段階４．化合物Ｉ−３からの化合物Ｉ−５の製造

【化29】

【0083】

テトラホウ酸ナトリウム・１０水和物（１８．７ｇ、４．９ｍｍｏｌ）の水（１リットル）中溶液に、環境温度で、５規定（「Ｎ」）ＮａＯＨを加えてｐＨ約１０とした。配列番号１を有するＤＫＲ酵素（２ｇ）を加え、緩やかに撹拌して溶解させた。β−ＮＡＤＰ−Ｎａ（０．２ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の水（２０ｍＬ）中溶液と次にフェニルケトンＩ−３（１００ｇ、０．３４８ｍｏｌ）のｉ−ＰｒＯＨ（１リットル）中溶液を環境温度で加えて、十分に混和した。バッチを４５℃で少なくとも２４時間撹拌した。バッチを環境温度に冷却し、ＭＴＢＥ（１リットル）を加えた。分離された水層をＭＴＢＥ（０．５リットル）およびｉ−ＰｒＯＨ（０．５リットル）で抽出した。合わせた有機層を水（１リットル）で洗浄した。分離された有機層を、内部温度を４５℃以下に維持しながら、減圧下に、最終体積約０．３リットルに共沸脱水した。得られた粗溶液を次の段階に直接用いた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：主要回転異性体：δ７．３４（ｍ、４Ｈ）、７．２８（ｍ、１Ｈ）、４．７５（ｓ、ｂｒ、１Ｈ）、４．７３（ｍ、１Ｈ）、３．８２（ｍ、１Ｈ）、３．２７（ｓ、１Ｈ）、２．２７（ｍ、２Ｈ）、１．９７（ｔ、Ｊ＝２．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．８３（ｍ、１Ｈ）、１．７２（ｍ、１Ｈ）、１．３７（３、９Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ｄ_６−ＤＭＳＯ）：主要回転異性体：δ１５６．７、１４１．９、１２８．５、１２７．９、１２６．５、８３．９、７９．９、７６．０、６９．１、５６．２、３０．６、２８．５、１５．７。

【0084】

その粗溶液に、ＴＨＦ（０．３リットル）を加え、次にｐ−ヨードニトロベンゼン（９０．４ｇ、０．３６３ｍｏｌ）を加えた。窒素で真空脱気した後、ビイソトリフェニルホスフィンパラジウム（ＩＩ）ジクロライド（２．４３ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）と次にＣｕＩ（１．３ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３６．７ｇ、０．３６３ｍｏｌ）を加えた。バッチを環境温度で３時間撹拌した。ｉ−ＰｒＯＡｃ（１リットル）を加えた。バッチを１０％ＮＨ_４Ｃｌ水溶液で２回（０．３リットルで２回）、１Ｎ ＨＣｌ（０．３リットル）および水（０．３リットル）で洗浄した。分離された有機層について、内部温度を４５℃以下に維持しながら、減圧下、共沸的にｉ−ＰｒＯＨに溶媒切り換えして、最終体積約０．６リットルでスラリーを得た。濃ＨＣｌ（３７％）を加え、バッチを６０℃で５時間撹拌した。スラリーを環境温度に冷却し、３時間熟成させてから濾過した。湿ったケーキを、ｉ−ＰｒＯＨ（０．２リットル）と次にＴＨＦ（０．２リットルで２回）で置換洗浄した。湿ったケーキを、ＴＨＦ（０．７６リットル）中、６０℃で４時間にわたりスラリー化した。そのスラリーを濾過し、ＴＨＦで置換洗浄した（０．２リットルで２回）。窒素気流を用いる４０℃での真空乾燥機乾燥によって、化合物Ｉ−５ ＨＣｌ塩を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：δ８．１９（ｍ、２Ｈ）、７．５５（ｍ、２Ｈ）、７．４７（ｍ、２Ｈ）、７．４１（ｍ、２Ｈ）、７．３６（ｍ、１Ｈ）、４．７１（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．５４（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．８８（ｍ、２Ｈ）。

【0085】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：δ１４８．６、１４２．０、１３３．７、１３１．６、１３０．１、１２９．９、１２８．２、１２４．７、９４．４、８１．５、７４．３、５７．９、２９．７、１６．８。

【0086】

結晶性ＨＣｌ塩型の化合物Ｉ−５（ｂ）は、面間隔ｄでの下記の反射によりＸＲＰＤによって特性決定することができる。

【表1】

【0087】

段階５．化合物Ｉ−５（ｂ）からの化合物Ｉ−６の製造

【化30】

【0088】

アミノアルコール・ＨＣｌ塩（Ｉ−５（ｂ））（１００ｇ、０．２８８ｍｏｌ）のＴＨＦ（５００ｍＬ）およびＤＭＡｃ（１００ｍＬ）中のスラリーに、内部温度を２５℃以下に維持しながら、窒素下、ｉ−Ｐｒ_２ＮＥｔ（１５１ｍＬ、０．８７ｍｏｌ）を滴下した。バッチを５５から６５℃で３から５時間撹拌し、０から１５℃に冷却した。ＴＭＳＣｌ（５５．３ｍＬ、０．４３３ｍｏｌ）を、内部温度を０から１５℃に維持しながら１時間かけて滴下した。さらに０．５から１時間後、ＭｅＯＨ（３５ｍＬ、０．８７ｍｏｌ）を０．５時間かけて滴下し、バッチをさらに０．５時間熟成させた。反応液を、Ｐｔ／Ａｌ_２Ｏ_３（５重量％、１５ｇ）のＴＨＦ（５００ｍＬ）中スラリーに環境温度で加えた。反応混合物を５０から１００ｐｓｉ（０．３４ＭＰａから０．６９ＭＰａ）のＨ_２で２０℃にて１８時間水素化し、次にさらに５０℃で６時間水素化した。次に、触媒をＳＯＬＫＡ−ＦＬＯＣ（登録商標）層での濾過によって除去し、ＴＨＦ（４００ｍＬ）で洗浄した。バッチ温度を２５℃以下に維持しながら、ＨＣｌ（０．６Ｎ、約１．２リットル）を滴下してｐＨ＝２とした。バッチを環境温度で１時間撹拌した。酢酸イソプロピル（３００ｍＬ）を加えた。所望の水層を分離し、酢酸イソプロピル（４００ｍＬ）を加えた。次に、５Ｎ ＮａＯＨ（約３０ｍＬ）を滴下してｐＨ＝１０に調節した。有機層を分離し、環境温度にて活性炭（Ｃｕｎｏ活性炭、１０ｇ）で１時間処理した。炭素を濾過によって除去し、濾液について体積約３５ｍＬにＩＰＡで溶媒切り換えを行った。バッチを５０℃に昇温させ、水（３０ｍＬ）を滴下した。次に、バッチに４２℃でシードを加え、追加の水（５０ｍＬ）を２時間かけて滴下した。添加後、バッチを１０℃に徐々に冷却し、さらに数時間熟成させてから濾過した。湿ったケーキを２５％ＩＰＡ／水（５０ｍＬ）で洗浄した。吸引乾燥によって、化合物Ｉ−６半水和物を得た。

【0089】

^１Ｈ ＮＭＲ（ｄ_６−ＤＭＳＯ）δ７．２７（ｍ、４Ｈ）、７．１７（ｍ、１Ｈ）、６．８１（ｄ、Ｊ＝８．１、２Ｈ）、６．４５（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）、５．０７（ｓ、ｂｒ、１Ｈ）、４．７５（ｓ、２Ｈ）、４．１８（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．０５（ｍ、２Ｈ）、２．４７（ｄｄ、Ｊ＝１３．０、６．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．４０（ｄｄ、Ｊ＝１３．０、６．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．５３（ｍ、１Ｈ）、１．３４（ｍ、１ＨＯ、１．２２（ｍ、２Ｈ）。

【0090】

^１３Ｃ ＮＭＲ（ｄ_６−ＤＭＳＯ）δ１４６．５、１４４．３、１２９．２、１２７．８、１２７．４、１２６．８、１２６．７、１１４．０、７６．８、６４．４、６０．１、４２．１、３０．２、２７．２。

【0091】

段階６ａ．化合物Ａ−２の製造

【化31】

【0092】

段階６．化合物Ｉ−６および化合物Ａ−２からの化合物Ｉ−７の製造

【化32】

【0093】

Ｎ_２導入管、熱電対プローブを取り付けた三頸フラスコに、ピロリジン半水和物Ｉ−６（１０．３ｇ）、ナトリウム塩Ａ−２（７．８７ｇ）と、次にＩＰＡ（４０ｍＬ）および水（２４ｍＬ）を加えた。バッチ温度を３５℃以下に維持しながら、５Ｎ ＨＣｌ（１４．９ｍＬ）を２０分間かけてゆっくり加えて、ｐＨ＝３．３から３．５に調節した。固体ＥＤＣ塩酸塩（７．４７ｇ）を、３０分間かけて少量ずつ加えた。反応混合物を室温でさらに０．５から１時間熟成させ、アンモニア水（１４％）を滴下してｐＨ約８．６とした。バッチにシードを加え、さらに１時間熟成させて、スラリー床を形成した。残りのアンモニア水（１４％、合計５３．２ｍＬ）を６時間かけて滴下した。得られた粘稠スラリーを２から３時間熟成させてから、濾過した。濡れたケーキを、３０％ＩＰＡ（３０ｍＬ）、次に１５％ＩＰＡ（２０ｍＬで２回）および水（２０ｍＬで２回）で置換洗浄した。ケーキを終夜Ｎ_２下に吸引乾燥して、化合物Ｉ−７ １４．３ｇを得た。

【0094】

^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１０．４０（ｓ、ＮＨ）、７．９２（ｄ、Ｊ＝６．８、１Ｈ）、７．５０（ｍ、２Ｈ）、７．３２（ｍ、２Ｈ）、７．２９（ｍ、２Ｈ）、７．２１（ｍ、１Ｈ）、７．１６（ｍ、２Ｈ）、６．２４（ｄ、Ｊ＝６．８、１Ｈ）、５．１３（ｄｄ、Ｊ＝９．６、３．１、１Ｈ）、５．０８（ｂｒｓ、ＯＨ）、４．２２（ｄ、Ｊ＝７．２、１Ｈ）、３．１９（ｐ、Ｊ＝７．０、１Ｈ）、３．１６−３．０１（ｍ、３Ｈ）、２．６５（ｍ、１Ｈ）、２．５９−２．４９（ｍ、２Ｈ）、２．４５（ｂｒｓ、ＮＨ）、２．１６（ｄｄｔ、Ｊ＝１３．０、９．６、３．１、１Ｈ）、１．５８（ｍ、１Ｈ）、１．３９（ｍ、１Ｈ）、１．３１−１．２４（ｍ、２Ｈ）。

【0095】

^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ１６７．５２、１６５．８５、１５９．８３、１５４．５６、１４４．１９、１３６．４８、１３５．６６、１２９．１６、１２７．７１、１２６．７８、１２６．６２、１１９．０７、１１２．００、７６．７１、６４．３４、６１．０５、５９．６０、４２．２２、３１．２６、３０．１２、２７．０９、２３．８２。

【0096】

化合物Ｉ−７の結晶性遊離塩基無水Ｉ型について、面間隔ｄでの下記の反射によりＸＲＰＤによって特性決定することができる。

【表2】

【0097】

実施例２
化合物Ｉ−６から化合物Ｉ−７の製造
Ｎ_２導入管、熱電対プローブを取り付けた三頸フラスコに、ピロリジン半水和物Ｉ−６（１０．３ｇ）、ナトリウム塩Ａ−２（７．８７ｇ）と、次にＩＰＡ（４０ｍＬ）、ピリジン（０．４２ｍＬ）および水（２１ｍＬ）を加えた。バッチ温度を２５℃以下に維持しながら、５Ｎ ＨＣｌ（１４．９ｍＬ）を２０分間かけてゆっくり加えてｐＨ＝３．１から３．７に調節した。バッチを５から１０℃に冷却した。バッチ温度を１５℃以下に維持しながら、固体ＥＤＣ塩酸塩（７．５ｇ）を、３０分から１時間かけて少量ずつ加えた。反応混合物を５から１０℃でさらに０．５から１時間熟成させた。ＩＰＡ（８ｍＬ）および水（７ｍＬ）を室温で加えた。アンモニア水（１０％、約３．５ｍＬ）を滴下して、ｐＨ約７．９とした。バッチにシードを加え、さらに１時間熟成させて、スラリー床を形成した。追加のアンモニア水（１０％、３２ｍＬ）を６から１０時間かけて滴下した。得られた粘稠スラリーを２から３時間熟成させてから、濾過した。濡れたケーキを３０％ＩＰＡ（３０ｍＬ）と、次に１５％ＩＰＡ（２０ｍＬで２回）および水（２０ｍＬで２回）で置換洗浄した。ケーキを、終夜Ｎ_２下で吸引乾燥して、化合物Ｉ−７ １４．３ｇを得た。

【0098】

実施例３
ＫＲＥＤ酵素の固定化
リン酸ナトリウムカリウム（６．０９７ｇ、３．５ｍｍｏｌ）の水（３５ｍＬ）中溶液に、環境温度で、ＫＲＥＤ酵素（８７５ｍｇ）およびＮＡＤＰ（７０ｍｇ）を加え、ゆっくり撹拌しながら溶解させた。ポリメタクリル酸樹脂ＤＩＡＩＯＮ（商標名）ＨＰ２ＭＧ（ＭＩＴＳＵＢＩＳＨＩ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）（１０ｇ）を加えた。混合物を２５℃で少なくとも１６時間にわたりゆっくり撹拌した。樹脂から全溶液を排液した。濡れた樹脂を二塩基リン酸カリウム溶液で洗浄し、次に排液した。濡れた樹脂を４℃で保存した。

【0099】

ケトン還元手順
固定化したＫＲＥＤ酵素（１２０ｍｇ）を、固定化カーボネート（５０ｍｇ）を含む９０％ＩＰＡ／１０％水混合物に溶かしたケトン（５０ｍｇ）の溶液に加えた。混合物を２５℃で少なくとも２４時間撹拌した。バッチを濾過し、濃縮した。

【0100】

実施例４
樹脂Ｉｍｍｏｂｅａｄ（商標名）１５０Ａ（ＩＢ−１５０Ａ）によるＫＲＥＤ酵素の固定化
ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウムカリウム溶液（２０ｍＬ）に、環境温度で、配列番号１を有するＫＲＥＤ酵素（２ｇ）を加え、ゆっくり撹拌しながら溶解させた。樹脂ＩＢ−１５０Ａ（１０ｇ）（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ（商標名）（オランダ）から市販）を加え、２５℃で２４から４８時間熟成させた。樹脂を濾過して全溶液を除去し、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸ナトリウムカリウム溶液で３回洗浄し、乾燥させた。樹脂を４℃で用時まで保存した。

【0101】

固定化ＫＲＥＤ酵素によるケトン還元によるフェニルアルコールの製造
１リットルフラスコに、２５℃でＩＰＡ ３６０ｍＬおよび水４０ｍＬ、次にケトンＩ−３（２１ｇ、７３．１ｍｍｏｌ）および１，４−ジアザビシクロオクタン（４１．０ｇ、３６５ｍｍｏｌ）を加えた。全てが溶解するまで混合物を撹拌した。固定化した配列番号１（１０．５ｇ、５０重量％）をフラスコに加え、反応混合物をゆっくり撹拌しながら５０℃に加熱した。約２８時間熟成させ、反応では典型的には、変換率９８％、９９％ｅｅおよび１００：１Ｄｒが得られた。反応液を２５℃に冷却し、濾過して固定化配列番号１を除去し、ＩＰＡ １００ｍＬ（５倍体積）で洗った。回収した固定化配列番号１は、ケトン／ＤＡＢＣＯ ＩＰＡ／水溶液の新鮮な溶液に加え、変換および選択性についての規格に達する間は９回まで再利用することができる。固定化酵素を除去した後、粗反応溶液を共沸脱水して水を除去し、反応体積を約５倍体積ＩＰＡまで減じた。リン酸（５当量、ＤＡＢＣＯと１：１比）を２５℃で加え、得られたスラリーを４時間熟成させた。そのスラリーを濾過して、少なくとも９６％のＤＡＢＣＯ塩を溶液から除去した。フェニルアルコールの粗溶液を次の段階で直接用いた。

【0102】

以上、ある特定の実施形態を参照しながら、本発明について記載および説明したが、本発明の主旨および範囲を逸脱しない限りにおいて、各種の変更、修正および置き換えを行うことが可能であることは当業者には明らかであろう。従って、本発明は添付の特許請求の範囲によって定義され、そのような特許請求の範囲は妥当な限り広く解釈されるものである。

【0103】

配列番号１：

【化33】

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]