特許 6383552 スフィンゴモナス属細菌の検出方法及びそのプライマー、生物処理槽の活性予測方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6383552

(24)【登録日】2018年8月10日

(45)【発行日】2018年8月29日

(54)【発明の名称】スフィンゴモナス属細菌の検出方法及びそのプライマー、生物処理槽の活性予測方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/689 20180101AFI20180820BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20180820BHJP

   C02F 3/12 20060101ALI20180820BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/689 ZZNA

   C12Q1/686 Z

   C02F3/12 P

【請求項の数】9

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2014-67275(P2014-67275)

(22)【出願日】2014年3月27日

(65)【公開番号】特開2015-188359(P2015-188359A)

(43)【公開日】2015年11月2日

【審査請求日】2017年3月24日

(73)【特許権者】

【識別番号】000006208

【氏名又は名称】三菱重工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100089118

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 宏明

(74)【代理人】

【識別番号】100118762

【弁理士】

【氏名又は名称】高村 順

(72)【発明者】

【氏名】中嶋 祐二

(72)【発明者】

【氏名】和田 恭子

(72)【発明者】

【氏名】小川 尚樹

(72)【発明者】

【氏名】中土 雄太

(72)【発明者】

【氏名】衣笠 敦志

【審査官】 伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−０２０４２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−２２０４９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００６／０８０５０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００２−１４２７７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−１１２４８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２７８６３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−１３６７９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０７２１６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０７２７３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−１６６８７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０１９５０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−１８３６６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−０８５５５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１４６３１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００１−１４９０７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０９９３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−１２０２７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−１２０２７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−１０１８９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−１３６３３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−１４９４００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−０４６０６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−１２３０９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−０８５５５２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
配列番号１で表される塩基配列を含むフォワードプライマーと、
配列番号２で表される塩基配列を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、スフィンゴモナス属細菌の検出方法。

【請求項2】

微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
配列番号３で表される塩基配列を含むフォワードプライマーと、
配列番号４で表される塩基配列を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、スフィンゴモナス属細菌の検出方法。

【請求項3】

微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
配列番号５で表される塩基配列を含むフォワードプライマーと、
配列番号６で表される塩基配列を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、スフィンゴモナス属細菌の検出方法。

【請求項4】

微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
配列番号７で表される塩基配列を含むフォワードプライマーと、
配列番号８で表される塩基配列を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、スフィンゴモナス属細菌の検出方法。

【請求項5】

配列番号１で表される塩基配列を含むフォワードプライマーと、
配列番号２で表される塩基配列を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするスフィンゴモナス属細菌検出用プライマー。

【請求項6】

配列番号３で表される塩基配列を含むフォワードプライマーと、
配列番号４で表される塩基配列を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするスフィンゴモナス属細菌検出用プライマー。

【請求項7】

配列番号５で表される塩基配列を含むフォワードプライマーと、
配列番号６で表される塩基配列を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするスフィンゴモナス属細菌検出用プライマー。

【請求項8】

配列番号７で表される塩基配列を含むフォワードプライマーと、
配列番号８で表される塩基配列を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするスフィンゴモナス属細菌検出用プライマー。

【請求項9】

洗濯排水を活性汚泥により処理した生物処理槽由来の試料を検出対象とし、
微生物を含むＤＮＡを鋳型とし、
配列番号１のフォードプライマーと配列番号２のリバースプライマーとの組合せの検出用ＰＣＲプライマー、配列番号３のフォワードプライマーと配列番号４のリバースプライマーとの組合せの検出用ＰＣＲプライマー、配列番号５のフォードプライマーと配列番号６のリバースプライマーとの組合せの検出用ＰＣＲプライマー、配列番号７のフォワードプライマーと配列番号８のリバースプライマーとの組合せの検出用ＰＣＲプライマー、
のいずれかを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を確認し、
一方、比較として大腸菌から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型とし、
配列番号１のフォードプライマーと配列番号２のリバースプライマーとの組合せの検出用ＰＣＲプライマー、配列番号３のフォワードプライマーと配列番号４のリバースプライマーとの組合せの検出用ＰＣＲプライマー、配列番号５のフォードプライマーと配列番号６のリバースプライマーとの組合せの検出用ＰＣＲプライマー、配列番号７のフォワードプライマーと配列番号８のリバースプライマーとの組合せの検出用ＰＣＲプライマー、
のいずれかを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られないことを確認し、
前記試料中の前記微生物を含むＤＮＡを鋳型とした前記ＰＣＲ産物の有無により、
前記生物処理槽の活性を予測することを特徴とする生物処理槽の活性予測方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、例えばプラント設備の作業員の作業服を洗浄した際に発生する排水を、生物処理によって浄化する生物処理装置の、生物処理槽の特定菌であるスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出方法及びスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌検出用プライマー、生物処理槽の活性予測方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

例えばプラント設備から排出される洗濯排水もしくは洗浄排水（以下、代表的に「洗濯排水」という）には、例えば洗剤、布繊維、脂肪分、炭水化物のような有機物質の他に、極微量の放射性物質が含まれている。そして、排水処理においては、放流規制値を満足させるために、これらの物質を除去し無害化しなければならない。

【0003】

従来、洗濯排水を無害化する処理方法としては、プラント設備から排出される洗濯排水を、生物処理槽に導入し、ここで活性汚泥と曝気混合し、得られた混合液を精密ろ過膜によって固液分離するようにしたプラント設備からの洗濯排水を効果的に処理できる洗濯排水の処理装置の提案がある（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００２−２１０４８６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ところで、従来の活性汚泥を用いる生物処理での活性汚泥運転監視は、排水処理能力で評価しており、例えば洗濯排水の場合はＣＯＤ（化学的酸素要求量：Chemical Oxygen Demand）値によっている。例えばその計測の一例であるＣＯＤ-Ｍｎ法では、例えば３００ｐｐｍの洗濯排水ＣＯＤ−Ｍｎを例えば２０ｐｐｍ以下の所定値にすることで確認している。
また、活性汚泥の評価は活性汚泥浮遊物質(ＭＬＳＳ:Mixed Liquor Suspended Solids)や酸素消費量、ｐＨなどの間接手法で行っている。

【0006】

このため、従来技術においては、生物処理における活性汚泥を構成している微生物の個々性能を用いて、生物処理設備の制御を行うことを狙った、迅速評価手法はなかった。

【0007】

この結果、排水処理プラントでの活性汚泥状況はいわゆる“成り行き”で運転している状況となり、突発的な不具合と、数時間から数日経過してから確認される生物処理能力低下（例えば停電等による曝気停止があると、生物処理能力が低下し、異物混入等による微生物死滅があると、生物処理能力が低下する。）への迅速対応（例えば、曝気量の増減、排水流入量削減等）は必ずしも適切に行われる状況になかった。この結果、不安定な生物処理プラントの運転となる、という問題がある。

【0008】

よって、洗濯排水における生物処理能力の低下を迅速に確認することができる技術の出現が切望されている。

【0009】

本発明は、前記問題に鑑み、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出方法及びスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌検出用プライマー、生物処理槽の活性予測方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上述した課題を解決するための本発明は、下記の特徴を有する。
（１） 微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出方法。
（２） 微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出方法。
（３） 微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ３−１）配列番号５で表される塩基配列、
（Ｆ３−２）配列番号５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ３−３）配列番号５で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ３−４）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ３−１）配列番号６で表される塩基配列、
（Ｒ３−２）配列番号６で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ３−３）配列番号６で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ３−４）配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出方法。
（４） 微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ４−１）配列番号７で表される塩基配列、
（Ｆ４−２）配列番号７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ４−３）配列番号７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ４−４）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ４−１）配列番号８で表される塩基配列、
（Ｒ４−２）配列番号８で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ４−３）配列番号８で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ４−４）配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出方法。
（５）（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌検出用プライマー。
（６）（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌検出用プライマー。
（７）（Ｆ３−１）配列番号５で表される塩基配列、
（Ｆ３−２）配列番号５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ３−３）配列番号５で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ３−４）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ３−１）配列番号６で表される塩基配列、
（Ｒ３−２）配列番号６で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ３−３）配列番号６で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ３−４）配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌検出用プライマー。
（８）（Ｆ４−１）配列番号７で表される塩基配列、
（Ｆ４−２）配列番号７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ４−３）配列番号７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ４−４）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ４−１）配列番号８で表される塩基配列、
（Ｒ４−２）配列番号８で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ４−３）配列番号８で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ４−４）配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌検出用プライマー。
（９） 前記（１）乃至（４）のいずれか一つに記載のスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出方法を用いて生物処理槽の活性を予測することを特徴とする生物処理槽の活性予測方法。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、本発明のスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌検出用プライマー、及びこれを用いたスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出方法により、洗濯排水中のスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌を迅速かつ特異的に検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、判定用ＤＮＡを用いた洗濯排水用活性汚泥主要微生物の検出の検出用プライマーを用いた特異性確認試験の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下に添付図面を参照して、本発明の好適な実施形態及び実施例を詳細に説明する。なお、この実施形態及び実施例により本発明が限定されるものではない。

【0014】

＜スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出方法＞
［実施形態］
本実施形態のスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出方法（以下、本実施形態の検出方法ということがある。）は、試料中にスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌が存在していた場合には、ＰＣＲによってプライマー設計から期待される大きさのＰＣＲ産物が得られる。

【0015】

先ず、洗濯排水を生物処理する生物処理用の活性汚泥を、次世代シーケンサー（ロシュ社製「ＧＳ ＦＬＸ（商品名）」）を使い菌叢解析し、活性汚泥中に含まれる微生物叢の解析を行った。
その結果、この活性汚泥に含まれる優占属として、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属）とその近縁属であるＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属（この５つの微生物属は、以降では「スフィンゴモナス属の近縁属」と略する）を選抜し、シークエンスデータ（８７６データ）のアライメント配列を作成した。

【0016】

この作成したアライメント配列（配列番号１３）を「表１」に示す。表１は、スフィンゴモナス属及び近縁属の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子アライメント解析から得られた、コンセンサス配列（Ｂｉｏｅｄｉｔを使ってのコンセンサス配列自動作成結果）を得た後、このコンセンサス配列で、アライメント結果と比較して、共通性が希薄であるとして削除が必要な部分を削除した遺伝子配列である。
このアライメント配列を使って、検出用ＰＣＲプライマー(配列番号１〜１０)を求めた。このＰＣＲプライマーを「表２」に示す。

【0017】

【表1】

【0018】

【表2】

【0019】

本実施形態においては、多種多様な細菌の中からスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌を特異的に迅速に検出することが重要である。このため、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出用プライマー中のスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域は、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の染色体ＤＮＡの塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が高い塩基配列であることが好ましい。

【0020】

すなわち、本実施形態の検出方法は、微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、領域１のアンチセンス鎖と特異的にハイブリダイズするフォワードプライマーと、領域２のセンス鎖と特異的にハイブリダイズするリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行うことを特徴とする。

【0021】

フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。

【0022】

リバースプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｒ１−１）〜（Ｒ１−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。

【0023】

フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｆ２−１）〜（Ｆ２−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。

【0024】

リバースプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｒ２−１）〜（Ｒ２−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。

【0025】

フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｆ３−１）〜（Ｆ３−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ３−１）配列番号５で表される塩基配列、
（Ｆ３−２）配列番号５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ３−３）配列番号５で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ３−４）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。

【0026】

リバースプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｒ３−１）〜（Ｒ３−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｒ３−１）配列番号６で表される塩基配列、
（Ｒ３−２）配列番号６で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ３−３）配列番号６で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｒ３−４）配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。

【0027】

フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｆ４−１）〜（Ｆ４−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ４−１）配列番号７で表される塩基配列、
（Ｆ４−２）配列番号７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ４−３）配列番号７で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ４−４）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。

【0028】

リバースプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｒ４−１）〜（Ｒ４−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｒ４−１）配列番号８で表される塩基配列、
（Ｒ４−２）配列番号８で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ４−３）配列番号８で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｒ４−４）配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。

【0029】

尚、本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１重量％のＮ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％のフォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。
尚、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％のＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。

【0030】

より特異性に優れているため、フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）、（Ｆ２−１）〜（Ｆ２−４）、（Ｆ３−１）〜（Ｆ３−４）、（Ｆ４−１）〜（Ｆ４−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号１で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号５で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。
同様に、リバースプライマーとして用いられるプライマーは、前記（Ｒ１−１）〜（Ｒ１−４）、（Ｒ２−１）〜（Ｒ２−４）、（Ｒ３−１）〜（Ｒ３−４）、（Ｒ４−１）〜（Ｒ４−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号２、４、６又は８で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号６で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。

【0031】

配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、１０７塩基対長のＰＣＲ産物が得られる。

【0032】

配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、２０５塩基対長のＰＣＲ産物が得られる。

【0033】

配列番号５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、２９２塩基対長のＰＣＲ産物が得られる。

【0034】

配列番号７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、２１１塩基対長のＰＣＲ産物が得られる。

【0035】

フォワードプライマーとして用いられるプライマー及びリバースプライマーとして用いられるプライマーは、いずれも、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域の５’端側に、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の染色体ＤＮＡとはハイブリダイズしないその他の塩基配列からなる領域を有していてもよい。当該その他の塩基配列としては、例えば、制限酵素認識配列等、ＰＣＲプライマーに一般的に付加される塩基配列が挙げられる。

【0036】

本実施形態の検出方法に供される微生物を含む試料は、特に限定されるものではないが、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌が含まれていることが期待される、又はそのおそれのある試料であることが好ましく、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌が含まれていることが期待される又はそのおそれのある試料であることがより好ましい。

【0037】

スフィンゴモナス属細菌は、菌の表層にスフィンゴ脂質を有し、疎水的雰囲気を有する表層で例えばＰＣＢ、クレオソート、ペンタクロロフェノール、除草剤のような有毒な有機化合物を取り込み、微生物のエネルギー源として利用するものである。

【0038】

従って、検査対象となる試料としては、洗濯排水を活性汚泥により処理した生物処理槽由来の試料を検査対象とすることが好ましい。
尚、検査対象である試料からのＤＮＡの抽出及び精製は、分子生物学の分野で公知の手法の中から適宜選択して用いることができる。

【0039】

本実施形態の検出方法は、特定のスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出用プライマーを用いる以外は、常法により実施することができる。すなわち、ＰＣＲに用いるポリメラーゼ、反応用バッファー、ｄＮＴＰ等の各種試薬は、当該技術分野で使用されている公知の試薬等を通常の態様で使用することができる。また、ＰＣＲの温度サイクル条件は、使用するポリメラーゼの特性及び用いるプライマーのＴｍ値等を考慮して適宜決定される。

【0040】

また、ＰＣＲ産物の検出も、分子生物学の分野で公知の手法の中から適宜選択して用いることができる。本実施形態の検出方法では、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出用プライマーを用いてＰＣＲを行うため、検査対象である試料にスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌が存在していた場合には、これらの試料中のＤＮＡを鋳型とした場合に、２００〜３００塩基長程度という検出が容易な大きさのＰＣＲ産物を得ることができる。このため、例えば、電気泳動法等の汎用されている簡便な手法により、ＰＣＲ産物を検出することができる。

【0041】

本実施形態の検出方法により、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌を迅速かつ特異的に検出することができる。このため、当該方法を用いることにより、生物処理槽の活性汚泥の活性化度合いを予測することができる。例えば、検査対象である金属片中のＤＮＡを鋳型とし、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出用プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られた場合には、当該生物処理槽は、活性が良好であると、予測することができる。

【0042】

すなわち、本検出方法により、例えば原子力設備や一般プラント設備等での例えば作業衣や使用布等を洗濯処理した洗濯排水を分解処理できるであろう、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌がどれくらい存在するかを迅速に確認することができる。

【実施例】

【0043】

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0044】

洗濯排水生物処理での菌叢解析（（ロシュ社製「ＧＳ ＦＬＸ（商品名）」））を実施し、活性汚泥中で優占種となる微生物を特定した。これら微生物と検出ＰＣＲプライマーとして、表１及び表２に示したＳＰＧ５〜ＳＰＧ１０を作成した。
これらのＰＣＲプライマーを使い、洗濯排水生物処理プラントから採取した汚泥試料と、別途培養した大腸菌（ＪＭ１０９）をテンプレートとしたＰＣＲを実施し、本発明の検出方法を行った。

【0045】

具体的には、１μＬの鋳型ＤＮＡ溶液と、ＰＣＲ酵素（「ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（商品名）」；東洋紡社製）；『５μＬの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ』、『５μＬのｄＮＴＰ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２ｍＭ、終濃度０．２ｍＭ ｅａｃｈ）』、『２μＬのＭｇＳＯ₄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２５ｍＭ、終濃度１．０ｍＭ）』、『ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（１Ｕ／μＬ、終濃度１Ｕ／５０μＬ）』）と、１．５μＬのフォワードプライマー（１０μＭ、終濃度０．３μＭ）と、１．５μＬのリバースプライマー（１０μＭ、終濃度０．３μＭ）と、を添加し、さらに適量の水を添加して５０μＬの反応溶液を調製した。当該反応溶液をＰＣＲ装置（アスペック社製）にセットし、９４℃で１０分間の変性工程後、１サイクルが９４℃で１２０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で６０秒間を３０サイクル行い、その後６８℃で６０秒間の伸長工程を行い、４℃で保存する温度条件で、ＰＣＲを行った。

【0046】

ＰＣＲ後の各反応液を、４％の短フラグメント核酸分析用アガロース「ＮｕＳｉｅｖｅ（商品名）３：１アガロース；タカラバイオ社製）」にアプライし、電気泳動を行った後、当該アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した。

【0047】

図１に電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
図１中、レーン３はフォワードプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン４はフォワードプライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン５はフォワードプライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン６はフォワードプライマーとして配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。
尚、レーン１は、表３に示す環境中の全細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを対象とするユニバーサルプライマー（２７Ｆ（配列番号１１）、５１９Ｒ（配列番号１２））である。
レーン２はフォワードプライマーとして配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；
レーン７はフォワードプライマーとして配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。

【0048】

【表3】

【0049】

このＰＣＲプライマーを用いた判定の結果を「表４」に示す。

【0050】

【表4】

【0051】

表４及び図１に示すように、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌に共通する配列由来のプライマーを用いたレーン３〜６に２００〜３００塩基対長付近に１本のバンドが検出され、所定の塩基対長のＰＣＲ産物が得られたことが確認された。
一方で、レーン１，９ではバンドが薄く、これらのレーンではＰＣＲ産物があまり得られないことが確認された。
このレーンの中で、特にレーン５のＳＰＧ７のプライマー対は、２９２塩基対長付近に１本の明瞭な広がりが少ないバンドが検出され、所定の塩基対長のＰＣＲ産物が得られたことが確認された。
よって、このレーン５の配列番号５のフォワードプライマーと配列番号６のリバースプライマーによるプライマー対（ＳＰＧ７）がスフィンゴモナス属及びその近縁属の細菌の検出用プライマーとして、特に好ましいものとなる。

【0052】

［比較例］
大腸菌から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として用いた以外は、実施例と同様の方法で、菌の検出を行った。
図１のレーン８〜１４に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
図１中、レーン１０はフォワードプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１１はフォワードプライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１２はフォワードプライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１３はフォワードプライマーとして配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。
レーン８は、表３に示すユニバーサルプライマー（２７Ｆ、５１９Ｒ）である。
レーン９はフォワードプライマーとして配列番号９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１４はフォワードプライマーとして配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。なお、レーン１５は表３に示すユニバーサルプライマー（２７Ｆ、５１９Ｒ）で、水を用いたブランクある。

【0053】

図１に示すように、大腸菌から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌検出用プライマーを用いてＰＣＲを行った場合、ＰＣＲ産物が得られないことが確認された。

【0054】

このように、洗濯排水生物処理汚泥から抽出したゲノムではＤＮＡは、想定サイズのＤＮＡ断片の増幅が確認できたが、大腸菌ゲノムでは、ＤＮＡ断片の増幅は確認できなかった。これにより、配列番号１〜配列番号８はスフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌の検出に際して特異的なＰＣＲプライマーであると判断した。
この結果、本発明の検出方法によれば、スフィンゴモナス属細菌を特異的に検出できることが確認された。

【0055】

また、微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、スフィンゴモナス属細菌及びその近縁属細菌に特異的にハイブリダイズする配列１、３、５、７のいずれか一つのフォワードプライマーと、スフィンゴモナス属細菌に特異的にハイブリダイズする配列２、４、６、８のリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行う「スフィンゴモナス属細菌の検出方法」を用いて、洗濯排水を処理する生物処理槽の活性状態を予測する生物処理槽の活性予測方法を提供することができる。

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]